特許 5810356 キマーゼに対するアプタマー及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5810356

(24)【登録日】2015年10月2日

(45)【発行日】2015年11月11日

(54)【発明の名称】キマーゼに対するアプタマー及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20151022BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20151022BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20151022BHJP

   C12N 9/50 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20151022BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20151022BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20151022BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20151022BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20151022BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALN20151022BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 HZNA

   C12N15/00 A

   C12Q1/68 A

   C12N9/50

   A61P9/00

   A61P43/00 111

   A61K45/00

   A61K49/00 A

   A61P11/00

   A61P1/16

   A61P13/12

   A61P17/00

   A61P29/00

   A61P37/08

   A61K37/48

   !A61K31/7088

【請求項の数】17

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2011-518586(P2011-518586)

(86)(22)【出願日】2010年6月11日

(86)【国際出願番号】JP2010059953

(87)【国際公開番号】WO2010143714

(87)【国際公開日】20101216

【審査請求日】2013年5月28日

(31)【優先権主張番号】特願2009-140585(P2009-140585)

(32)【優先日】2009年6月11日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】505254175

【氏名又は名称】株式会社リボミック

(73)【特許権者】

【識別番号】000206956

【氏名又は名称】大塚製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100122688

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 健二

(74)【代理人】

【識別番号】100117743

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 美由紀

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(72)【発明者】

【氏名】中村 義一

(72)【発明者】

【氏名】金 玲

(72)【発明者】

【氏名】山▲崎▼ 聡子

(72)【発明者】

【氏名】池田 寿子

(72)【発明者】

【氏名】村口 正宏

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１８３３３８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Mol. Cell Biochem., 2008, Vol.310, p.159-166

【文献】 Eur. J. Cardiothorac. Surg., 2008, Vol.33, p.25-31

【文献】 Exp. Biol. Med., 2007, Vol.232, p.1213-1221

【文献】 Br. J. Pharmacol., 2005, Vol.145, p.424-431

【文献】 Drug Deliv. Syst., 2008, Vol.23, No.5, p.534-543

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｘ_１ＧＡＵＡＧＡＮ_１Ｎ_２ＵＡＡＸ_２（配列番号２１；式中、Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ_１及びＮ_２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである）で表されるヌクレオチド配列を含み、キマーゼに結合しキマーゼの活性を阻害するアプタマー。

【請求項2】

Ｎ_１Ｎ_２がＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ、ＧＴ又はＣＵである、請求項１記載のアプタマー。

【請求項3】

Ｘ_１及びＸ_２が共にＡ、もしくは共にＧである、請求項１記載のアプタマー。

【請求項4】

ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾または改変されている、請求項２または３記載のアプタマー。

【請求項5】

以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のアプタマー：
（ａ）配列番号４、１３、１４、２５、２６、３０〜３２、３４、３８〜５０、５３〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号４、１３、１４、２５、２６、３０〜３２、３４、３８〜５０、５３〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号４、１３、１４、２５、２６、３０〜３２、３４、３８〜５０、５３〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。

【請求項6】

アプタマーに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドが修飾または改変されている、請求項５記載のアプタマー。

【請求項7】

以下の（ａ’）、（ｂ’）又は（ｃ’）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のアプタマー：
（ａ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。

【請求項8】

以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含み、キマーゼに結合しキマーゼの活性を阻害するアプタマー：
（ａ）配列番号５、６、８、９、１１、１２、１５、１７〜２０、２２〜２４、２８、３３および５１のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号５、６、８、９、１１、１２、１５、１７〜２０、２２〜２４、２８、３３および５１のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号５、６、８、９、１１、１２、１５、１７〜２０、２２〜２４、２８、３３および５１のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。

【請求項9】

アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチド又は各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、請求項１記載のアプタマー。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマー及び、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物から選択される機能性物質を含む複合体。

【請求項11】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１０記載の複合体を含む医薬。

【請求項12】

循環器系疾患または線維症の予防もしくは治療用である、請求項１１記載の医薬。

【請求項13】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１０記載の複合体を含む診断薬。

【請求項14】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１０記載の複合体を含むキマーゼ検出用プローブ。

【請求項15】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１０記載の複合体を含む、キマーゼ精製用固相担体。

【請求項16】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１０記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの検出方法。

【請求項17】

請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１０記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの精製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キマーゼに対するアプタマー及びその利用方法などに関するものである。

【背景技術】

【0002】

ヒトキマーゼ（ＥＣ．３．４．２１．３９）はキモトリプシン様セリンプロテアーゼの一種で、肥満細胞の分泌顆粒中に貯蔵されている。肥満細胞が外的刺激を受けると脱顆粒を起こし、ヒトキマーゼは様々な炎症メディエーターと共に細胞外に放出される。放出されたヒトキマーゼは、基質である蛋白質やペプチドに含まれるフェニルアラニンやチロシンといった芳香族アミノ酸を特異的に認識し、そのアミノ酸に隣接するペプチド結合を切断する。ヒトキマーゼの代表的な基質として、アンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）が挙げられる。ヒトキマーゼはＡｎｇＩを切断し、血管収縮因子であるアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）を産生する。
哺乳類のキマーゼは系統学的にαとβの２つのサブファミリーに分類される。ヒトを含む霊長類の発現するキマーゼは一種類のみでαファミリーに属している。一方で、げっ歯類はαとβ両方のキマーゼを発現する。マウスの場合、複数の種類のキマーゼが知られているが、基質特異性や組織における発現様式から、βファミリーに属するｍｏｕｓｅ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ−４（ｍＭＣＰ−４）が最もヒトキマーゼに近いと考えられる。また、ハムスターでもβファミリーに属するｈａｍｓｔｅｒ ｃｈｙｍａｓｅ−１がそれに対応する。一方で、ヒトキマーゼと同じαファミリーに属するｍＭＣＰ−５やｈａｍｓｔｅｒ ｃｈｙｍａｓｅ−２はエラスターゼ様活性を持ち、基質特異性が異なる。
キマーゼはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の活性化に深く関係している。ＴＧＦ−βは上皮細胞や内皮細胞周辺の細胞外マトリックス中に潜在型（ｌａｔｅｎｔ−ＴＧＦ−β）として存在し、ｌａｒｇｅ ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＴＢＰ）を介して細胞外マトリックスに保持されている。必要に応じて細胞外マトリックスから放出され、活性化されたＴＧＦ−βは細胞の増殖分化、組織障害後の修復や再生に関与するとされ、生体にとって極めて重要なサイトカインである。また、そのシグナルの破綻は、様々な疾患の発症及び進展に繋がることも知られている。この過程において、キマーゼはｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−βの細胞外マトリックスからの遊離、及びｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−βから活性型ＴＧＦ−βへの変換反応へ関与すると考えられている。
キマーゼは線維症、循環器疾患、炎症、アレルギー疾患、臓器癒着など様々な疾患と関係していることが知られている。線維症とは肺や心臓、肝臓、腎臓、皮膚などで細胞外基質の代謝異常が起こり、結合組織タンパク質が過剰に沈着する病気である。例えば肺線維症では肺にコラーゲンなどの結合組織タンパク質が過剰に沈着し、肺胞が硬く縮んでしまい呼吸困難に陥る。肺の線維化は、大量のほこりに曝露することで起こる塵肺、抗がん剤などの薬物使用によって起こる薬剤性肺炎、アレルギー性肺炎、肺結核、膠原病のような自己免疫疾患などが原因で起こることがわかっている。一方で原因不明のケースも少なくない。
線維症の分子レベルでの発症機序は未だ十分に解明されていない。一般に正常な状態においては線維芽細胞の増殖やその機能は十分に制御されているが、炎症や外傷が重篤あるいは持続的であった場合には、組織修復機構が過剰に働き、線維芽細胞の異常増殖や結合組織タンパク質の過剰生産が起こる。このような現象を引き起こす因子としてＴＧＦ−βが知られている。その関与を示唆するものとして、線維症動物モデルに抗ＴＧＦ−β中和抗体を投与すると、コラーゲン発現が減少し、線維化が有意に抑制されることが報告されている。また、特発性肺線維症患者においては、ＴＧＦ−βやキマーゼ陽性肥満細胞の増加がみられる。
一方で、キマーゼが線維症に関係していることがモデル動物を用いた実験により示されている。ハムスターのブレオマイシン誘発性肺線維症モデルでは、キマーゼ活性の亢進、コラーゲンＩＩＩ ｍＲＮＡの発現増加、組織の線維化といった現象が、キマーゼ阻害剤により有意に減少する。マウスのブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおいても同様で、キマーゼ阻害剤投与により、キマーゼ活性の抑制、ヒドロキシプロリン量の減少といった効果が得られている。
以上より、キマーゼ阻害剤は線維症などのキマーゼと関係する疾患の予防薬又は治療薬として利用可能である。キマーゼ阻害剤としては低分子化合物であるＴＰＣ−８０６やＳＵＮ−１３８３４、ＳＵＮ−Ｃ８２５７、ＳＵＮ−Ｃ８０７７、ＪＮＪ−１０３１１７９５などが開発されている（特許文献１）。

【0003】

ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献２〜４）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０^１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別する方法である。使用されるＲＮＡは４０ヌクレオチド程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。
アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外タンパク質を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも標的分子に対して高い親和性や特異性を示す場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こりにくいとされる。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度の分子サイズであるため組織移行が起こりやすく、目的の部位まで薬物を送達させることがより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、部位選択的な化学修飾が可能であり、大量生産すればコストダウンを図ることができる。その他、長期保存安定性や熱・溶媒耐性もアプタマーの優位な特徴である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許公報６５００８３５号

【特許文献2】国際公開ＷＯ９１／１９８１３号パンフレット

【特許文献3】国際公開ＷＯ９４／０８０５０号パンフレット

【特許文献4】国際公開ＷＯ９５／０７３６４号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、キマーゼに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、キマーゼに対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。

【0007】

即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである：
［１］キマーゼに結合しキマーゼの活性を阻害するアプタマー。
［２］Ｘ_１ＧＡＵＡＧＡＮ_１Ｎ_２ＵＡＡＸ_２（配列番号２１；式中、Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ_１及びＮ_２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである）で表されるヌクレオチド配列を含む、［１］記載のアプタマー。
［３］Ｎ_１Ｎ_２がＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ、ＧＴ又はＣＵである、［２］記載のアプタマー。
［４］Ｘ_１及びＸ_２が共にＡ、もしくは共にＧである、［２］記載のアプタマー。
［５］ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾または改変されている、［３］または［４］記載のアプタマー。
［６］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］記載のアプタマー：
（ａ）配列番号４〜３４、３８〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号４〜３４、３８〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号４〜３４、３８〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［７］アプタマーに含まれる少なくとも１つのヌクレオチドが修飾または改変されている、［６］記載のアプタマー。
［８］以下の（ａ’）、（ｂ’）又は（ｃ’）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］記載のアプタマー：
（ａ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）、及び７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［９］アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［１］記載のアプタマー。
［１０］アプタマーに含まれる各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［１］記載のアプタマー。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
［１２］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［１１］記載の複合体。
［１３］［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含む医薬。
［１４］循環器系疾患または線維症の予防もしくは治療用である、［１３］記載の医薬。
［１５］［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含む診断薬。
［１６］［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含むキマーゼ検出用プローブ。
［１７］［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を含む、キマーゼ精製用固相担体。
［１８］［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの検出方法。
［１９］［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１１］又は［１２］記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの精製方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明のアプタマー及び複合体は、例えば線維症や循環器系疾患などのキマーゼに起因する種々の疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、キマーゼの精製及び濃縮、並びにキマーゼの検出及び定量に有用であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】配列番号４、５、１２〜１４、１８で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。

【図2】配列番号２２〜２７で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。

【図3】配列番号２８〜３４で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。

【図4】配列番号１２及び１３で表されるアプタマーがキマーゼに結合する様子を示す図である。４０Ｎは４０ヌクレオチドのランダム配列を含んだＲＮＡプールである。キャプチャー分子として、アプタマー又はネガティブコントロールの４０Ｎを固定化し、アナライトとしてヒトキマーゼを流した。測定はＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で行った。

【図5】配列番号３８〜４０、４３、４８で表される配列のアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。

【図6】配列番号４９、５１、５５〜５７で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号２１で表される共通配列を丸で示す。

【図7】配列番号１３、５５、５６で表されるアプタマーがキマーゼに結合する様子を示す図である。４０Ｎは４０ヌクレオチドのランダム配列を含んだＲＮＡプールである。チップ表面にキマーゼを固定化し、アナライトとしてアプタマー又はネガティブコントロールの４０Ｎを流した。測定はＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で行った。

【図8】キマーゼによるＬＴＢＰ−１分解と表９に含まれるアプタマーによるＬＴＢＰ−１分解阻害の様子をウェスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。レーン番号１、８、９、２３、３１はマーカー、レーン番号６、２１、２９はネガティブコントロール（阻害剤なし）、レーン番号７、２２、３０はキマーゼ不添加によるコントロールを示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、キマーゼに対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、キマーゼの活性を阻害し得る。

【0011】

アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、キマーゼに対して結合活性を有し、キマーゼの活性を阻害し得るアプタマーである。また本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。

【0012】

キマーゼは公知のセリンプロテアーゼの一つであり、肥満細胞の分泌顆粒内に貯蔵されている。キマーゼは、例えば生理活性ペプチドの産生・分解、細胞外マトリックスのリモデリング、サイトカインとのネットワーク、免疫等の肥満細胞が関与する様々な生体反応に深く関与している。本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するキマーゼに対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられるが、好ましくはヒトである。ヒトキマーゼのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＢ２６８２８で表されるものであるが、１〜数残基の変異が入ったものや、そのドメイン部分、ペプチド部分であってもよい。また、ヒトキマーゼの構造はモノマーだけでなくダイマーや多量体であってもよい。

【0013】

本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液中でキマーゼへ結合する。緩衝液としては特に限定されるものではないが、ｐＨが約５．０〜１０．０程度のものが好ましく用いられ、このような緩衝液としては、例えば後述する溶液Ａや溶液Ｃ（実施例１及び２参照）が挙げられる。本発明のアプタマーは、以下のいずれかの試験により検出可能な程度の強度で、キマーゼへ結合するものである。
結合強度の測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用いる。一つの測定方法としては、まずセンサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は約１０００ＲＵとする。アナライト用のキマーゼ溶液は０．２μＭに調製したものを２０μＬインジェクトし、キマーゼのアプタマーへの結合を検出する。３０もしくは４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してキマーゼが同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはキマーゼへの結合能を有すると判定することができる。
別の測定方法としては、まずセンサーチップにキマーゼを固定化する。固定化量は約４０００ＲＵとする。アナライト用のアプタマー溶液は０．０１μｇ／μＬに調製したものを２０μＬインジェクトし、アプタマーのキマーゼへの結合を検出する。３０もしくは４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してキマーゼが同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはキマーゼへの結合能を有すると判定する。

【0014】

キマーゼに対する阻害活性とは、キマーゼが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、キマーゼの機能の一つに、ペプチド鎖を加水分解することにより切断する酵素活性があるが、それを阻害するということである。酵素活性に対する基質として許容されるのは、生体内に存在する蛋白質や生理活性ペプチド（例えばＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−βなど）に限らず、それらのペプチドの一部のアミノ酸配列が含まれるペプチドに発色物質や蛍光物質が付加したペプチドも含まれる。発色物質や蛍光物質は、当業者に公知である。また、蛋白質や生理活性ペプチドの分解反応を介して起こる現象として、コラーゲンＩ／ＩＩＩの発現増加、ヒドロキシプロリン量の増加、ＩｇＥ発現増加などが挙げられるが、これらに対する抑制効果もキマーゼに対する阻害活性に含まれる。その他、キマーゼに対する好中球、単球、好酸球の遊走活性を阻害する活性も、キマーゼに対する阻害活性に含まれる。さらに、キマーゼにより誘導されるヒスタミン遊離促進、肥満細胞数の増加、血管透過性の増大、組織の線維化、炎症、血管新生、血管内膜肥厚などに対する抑制効果も、キマーゼに対する阻害活性に含まれる。

【0015】

キマーゼの基質とは、キマーゼにより加水分解を受け切断されるペプチドや蛋白質などを意味する。生体内に存在するキマーゼの基質としては、ＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β、ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、プロコラーゲン、プロコラゲナーゼ、フィブロネクチン、プロマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ｐｒｏ−ＭＭＰ−１）、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９、ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１（ＴＩＭＰ−１）、アポリポプロテインＡ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、ａｐｏＥ、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＬ−１β前駆体、ｂｉｇ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ｂｉｇ−ＥＴ−１）、ｂｉｇ−ＥＴ−２、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ＩＩＩ、ＩＬ−１８前駆体、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ、ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）、ｋａｌｌｉｄｉｎ、ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ、Ｃ３ａなどのペプチドや蛋白質が知られている。本明細書におけるキマーゼの基質としては、これらに限らず、それらの一部のアミノ酸配列としてキマーゼが特異的に認識するＰｈｅやＴｙｒなどのアミノ酸残基を含む人工的に設計されたモデルペプチドや、このようなペプチドに発色物質や蛍光物質が付加されたペプチドも含まれる。

【0016】

キマーゼの酵素活性をアプタマーが阻害するか否かは、以下の試験により評価することができる。例として三つの方法を以下に示す。

【0017】

一つめに、合成基質を用いる評価方法を示す。キマーゼの基質としては、例えばキモトリプシン様プロテアーゼの標準基質である４アミノ酸ペプチド、「Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ」を含んでなる、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（４−メチルクマリル−７−アミド基）（ペプチド研究所社製）を用いる。
アッセイには、９６ウェルプレート（Ｆ１６ Ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ、Ｎｕｎｃ社製）を用い、反応液量を１００μＬとし、緩衝液（溶液Ｃ；後述する実施例２参照）中で反応を行う。まず、核酸は溶液Ｃ中に調製したものを、５０μＬ用意する。そこに、溶液Ｃ中に調製した１ｍＭの基質を１０μＬ添加した後、プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間保温する。一方で、０．０５μｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを４０μＬ用意し、３７℃で５分間保温する。核酸及び基質からなる混合液に、キマーゼ溶液を加えて、酵素反応を開始させる。反応液を含むプレートを、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間、蛍光強度の変化を経時的に測定（励起波長 ３８０ｎｍ、検出波長 ４６０ｎｍ）する。キマーゼ活性により、基質から放出されるＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の蛍光増加の線形近似を求め、その傾きの値を初速度とする。コントロールとして、３０もしくは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む核酸プールを用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）において、同様に処理し測定を行う。核酸、阻害剤を含まない場合の反応初速度を酵素活性１００％とし、各被験物質の阻害率を算出し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ_５０）を求める。ＩＣ_５０が既知の阻害剤であるキモスタチンに比べて低い値を示すアプタマーを、優れた阻害活性を持つアプタマーであると判定する。

【0018】

二つめに、天然の基質を用いる評価方法を示す。キマーゼの天然の基質としては、例えばアンジオテンシンＩを用いる。ここでは、アンジオテンシンＩの分解により遊離するペプチド断片であるＨｉｓ−Ｌｅｕを蛍光誘導化し、その蛍光強度を定量的に測定する方法を説明する。
アッセイにおける酵素反応の溶液量は５０μＬとし、溶液Ｃ中で反応を行う。まず、０．３〜０．７５ｎｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製、もしくはｎａｔｉｖｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを５μＬ用意する。核酸は溶液Ｃ中に調製したものを、２５μＬ用意する。キマーゼ溶液５μＬと核酸溶液２５μＬを混和し、３７℃で５分間保温する。一方で、溶液Ｃ中に調製した１２５μＭアンジオテンシンＩ（ペプチド研究所社製）を２０μＬ用意し、３７℃で５分間保温する。キマーゼ及び核酸からなる混合液に、アンジオテンシンＩ溶液を加えて、酵素反応を開始させる。３７℃で９０分間反応させた後、氷冷した３０％トリクロロ酢酸溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させる。混合液全体を４℃、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清３０μＬを次の蛍光誘導化反応に用いる。
上記の上清３０μＬを９６ウェルプレート（ブラック、Ｃｏｓｔａｒ社製）に加え、各ウェルに対し、メタノールに溶解した２％ ｏ−フタルアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μＬと、０．３Ｍ ＮａＯＨ溶液１７０μＬを混和し、室温に１０分間放置する。その後、３Ｍ ＨＣｌ溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させる。プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの条件で蛍光強度を測定する。
なお、コントロールとして、配列番号５８を用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）で同様に処理し測定を行う。各条件において、反応時間０分における蛍光強度をブランクとする。キマーゼ酵素反応において、核酸を添加するかわりに溶液Ｃを同量添加した場合に検出される蛍光強度を１００％とし、各被験物質の阻害率を算出し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ_５０）を求める。ＩＣ_５０が既知の阻害剤であるキモスタチンに比べて低い値を示すアプタマーを、優れた阻害活性を持つアプタマーであると判定する。

【0019】

三つめに、細胞培養上清中に含まれる天然の基質を用いる評価方法を示す。ここではキマーゼの基質であるＬＴＢＰ−１の分解をウェスタンブロッティングにより検出する。凍結保存されたＮＨＬＦ細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を３７℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈにて急速融解後、培地（１０％ ＦＢＳ／Ｆ−１２）に懸濁する。遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去し、細胞を培地に再懸濁する。遠心分離された細胞に培地を加え全量を１０ｍＬとして、懸濁液を細胞培養用シャーレに移して３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養する。顕微鏡にて細胞の形態及び増殖状態を観察し、コンフルエントの状態になったところで無血清培地（０．２％ ＢＳＡ／Ｆ−１２）に交換する。培地交換から２日後に培養上清を採取し、分注して−３０℃で凍結保存する。
用時解凍したＮＨＬＦ培養上清４０μＬをチューブに分注し、溶液Ｃで希釈した核酸溶液を５μＬ添加する。ポジティブコントロールはキモスタチンを溶液Ｃで希釈し、同様に添加する。ネガティブコントロールは溶液Ｃのみ添加する。次に、溶液Ｅ（溶液Ｃ＋０．１％ ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したキマーゼを５μＬ添加する。コントロールとして、キマーゼを添加しないチューブを作製する。攪拌後３７℃で1時間インキュベーションし、等量の電気泳動用Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒと混合して反応を終了する。次に示すウェスタンブロッティングにより、サンプル中のＬＴＢＰ−１を検出する。
Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒと混合したサンプルを３分間煮沸し、５〜２０％アクリルアミドゲルに１０μＬのサンプルをアプライして電気泳動する。泳動終了後、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした後、フィルターを５％スキムミルク、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５％アジ化ナトリウムでブロッキングする。フィルターを２％ ＢＳＡ、ＰＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウムで２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＬＴＢＰ−１モノクローナル抗体と室温で一晩反応させる。フィルターを３回洗浄し、２次抗体溶液（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳに１００００倍希釈）と室温で２時間インキュベーションする。フィルターを５回洗浄し、化学発光基質で検出を行う。
ＬＴＢＰ−１のバンドの濃さおよび位置（分子量）から、キマーゼ不添加のウェルのバンドを陽性対照（＋）、ネガティブコントロールのウェルのバンドを陰性対照（−）とし、各被験物質の阻害活性の有無を目視で判定する。

【0020】

本発明のアプタマーは、キマーゼの任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されない。

【0021】

本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１０〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約３０ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。

【0022】

本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＯＭｅ基）、アミノ基（例、−ＮＨ_２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。

【0023】

本発明のアプタマーは、Ｘ_１ＧＡＵＡＧＡＮ_１Ｎ_２ＵＡＡＸ_２（配列番号２１；式中、Ｘ_１及びＸ_２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ_１及びＮ_２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである。但し、ウラシルはチミンであってもよい）で表される配列を有するアプタマーである。この配列を有するアプタマーは強くキマーゼに結合し、キマーゼの活性を阻害する。

【0024】

上記式中、Ｘ_１及びＸ_２として好ましくは、共にＡ、もしくは共にＧである。またＮ_１及びＮ_２として好ましくは、Ｎ_１Ｎ_２がＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ、ＧＴ又はＣＵである（但し、ウラシルはチミンであってもよい）。

【0025】

本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。

【0026】

本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一又は異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。

【0027】

本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一又は異なって、ヒドロキシル基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されるヌクレオチドであり得る。

【0028】

本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。

【0029】

尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置換は、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置換として読み替えられる。

【0030】

本発明のアプタマーはまた、
（ａ）配列番号４〜３４、３８〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ）配列番号４〜３４、３８〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（ｃ）配列番号４〜３４、３８〜５７、５９〜６５および６９〜７２のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；
であり得；或いは、本発明のアプタマーとしては、
（ｄ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ｃ）の複数の連結物、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物も含まれる。

【0031】

上記（ａ）のアプタマーだけでなく（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーも、キマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る。

【0032】

本発明のアプタマーはまた、
（ａ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）および７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）および７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（ｃ’）配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（９）、５６（１１）、５６（１２）、５６（１５）〜５６（５２）、６１（１）、６９（１）、６９（２）および７２（１）〜７２（８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；
であり得；或いは、本発明のアプタマーとしては、
（ｄ’）上記（ａ’）の複数の連結物、上記（ｂ’）の複数の連結物、上記（ｃ’）の複数の連結物、上記（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物も含まれる。さらに、本発明のアプタマーとしては、
（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれるアプタマーの一つ以上と（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）からなる群より選ばれるアプタマーの一つ以上とからなる連結物も含まれる。

【0033】

上記（ａ’）〜（ｄ’）および（ｅ）のアプタマーも、キマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る。

【0034】

上記（ｂ）および（ｂ’）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、アプタマーがキマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。

【0035】

上記（ｃ）および（ｃ’）において、「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。

【0036】

本明細書において、ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。

【0037】

上記（ｄ）、（ｄ’）および（ｅ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ_２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ_３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。上記（ａ）〜（ｄ）、（ａ’）〜（ｄ’）および（ｅ）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。

【0038】

本発明のアプタマーは、キマーゼに対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ_２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，５１３８−５１４５参照）。

【0039】

本発明のアプタマーはまた、キマーゼに対する結合活性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６及び／又は８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。
また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）ＣＨ_３、Ｐ（Ｏ）ＢＨ_３、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ_２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。

【0040】

改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照して行うことができる。

【0041】

本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により合成することができる。合成方法の一つはＲＮＡポリメラーゼを用いる方法である。目的の配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして既に公知の方法により転写することで目的のＲＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼを用いることでも合成することができる。目的の配列を有したＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして、既に公知の方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。これを既に公知の方法であるポリアクリルアミド電気泳動法や酵素処理法により一本鎖とする。修飾の入ったアプタマーを合成する場合は、特定の位置に変異を導入したポリメラーゼを用いることで伸長反応の効率を上げることができる。このようにして得られたアプタマーは公知の方法により容易に精製することができる。
アプタマーはアミダイト法もしくはホスホアミダイト法などの化学合成法によって大量合成することができる。合成方法はよく知られている方法であり、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（Ｖｏｌ．２）［１］Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（Ｅｄｉｔｏｒ：Ｙｕｋｉｏ Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｈｉｒｏｋａｗａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）などに記載のとおりである。実際にはＧＥヘルスケアーバイオサイエンス社製のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ１００やＯｌｉｇｏＰｒｏｃｅｓｓなどの合成機を使用する。精製はクロマトグラフィー等の自体公知の方法により行われる。
アプタマーはホスホアミダイト法などの化学合成時にアミノ基などの活性基を導入することで、合成後に機能性物質を付加することができる。例えば、アプタマーの末端にアミノ基を導入することで、カルボキシル基を導入したポリエチレングリコール鎖を縮合させることができる。
アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング相互作用など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。

【0042】

アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ， ３４６， ８１８−８２２； Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりして、選別条件を厳しくすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。

【0043】

ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であるが、そのことは標的物質の生理活性を阻害することを意味しない。キマーゼは塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられるが、特定の部位に強く結合するアプタマー以外はその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、ネガティブコントロールとして用いたランダム配列を含むＲＮＡはキマーゼに弱く結合するものの、キマーゼの酵素活性を阻害しなかった。

【0044】

このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するためのＳＥＬＥＸを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。

【0045】

ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では２３ヌクレオチドでも活性を保持しているアプタマーを得ることができた。

【0046】

アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換又は欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かなどを、ある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかは、既存のアッセイ系により確認することができる。

【0047】

得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。

【0048】

修飾に関しても、配列と同様に当業者であれば自由に設計又は改変可能である。

【0049】

以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、バルジ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。

【0050】

例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：

【0051】

【化1】

【0052】

〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。

【0053】

本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質としては、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド又はトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミド又はダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセート又はラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビン又はフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフール又はゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。

【0054】

本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。

【0055】

本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼの機能を阻害する活性を有し得る。上述のように、キマーゼは線維症や循環器系疾患と深く関わっている。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、線維症や循環器系疾患を伴う疾患を治療又は予防するための医薬として有用である。

【0056】

本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼに特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼ検出用プローブとして有用である。該プローブは、キマーゼのインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ＥＬＩＳＡ等に有用である。また、該プローブは、キマーゼが関与する疾患（線維症や循環器系疾患を伴う疾患等）の診断薬、検査薬、試薬等として有用である。

【0057】

また、そのキマーゼへの特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はキマーゼの分離精製用リガンドとして使用され得る。

【0058】

また、本発明のアプタマー及び複合体は、薬物送達剤として使用され得る。

【0059】

臓器又は組織の線維化が関与する疾患としては、肺線維症、前立腺肥大、心筋線維化、心筋線維症、筋骨格線維症、骨髄線維症、子宮筋腫、強皮症、外科手術後の癒着、手術後の瘢痕、熱傷性瘢痕、肥厚性瘢痕、ケロイド、アトピー性皮膚炎、腹膜硬化症、喘息、肝硬変、慢性膵炎、スキルス胃癌、肝線維症、腎線維症、線維性血管病、糖尿病の合併症である線維性微小血管炎による網膜症、神経症、腎症、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、遺伝性腎疾患、動脈硬化末梢動脈炎などが挙げられる。

【0060】

循環器系疾患としては、血管障害、大動脈瘤、腎不全、高血圧症、動脈硬化、心筋梗塞、心肥大、心不全、経皮経管冠動脈形成術などによる血管障害後の再狭窄、糖尿病性及び非糖尿病性の腎障害、末梢循環障害などが挙げられる。

【0061】

キマーゼは酵素活性を保有し、基質となる生理活性物質を切断する。その基質としては、例えばＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β、ＳＣＦ、プロコラーゲン、プロコラゲナーゼ、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９、ＩＬ−１β前駆体などが知られており、これら生理活性ペプチドの産生・分解反応を介して、細胞外マトリックスのリモデリング、サイトカインとのネットワーク、免疫、血管収縮といった生理作用を発揮する。一方、キマーゼそのものが肥満細胞を活性化したり、ヒスタミン遊離を促進したりする作用があり、炎症と関連深い。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、上記に挙げた基質に限定されるものではないが、キマーゼに許容される基質が媒介する生体機能に関係した疾患及びキマーゼそのものが関与する疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。

【0062】

本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

【0063】

本発明の医薬の投与経路としては特に限定されるものではないが、例えば経口投与、非経口投与が挙げられる。
経口投与に好適な製剤としては、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、水溶性物質の吸収を促進させるＣ１０等が挙げられる。

【0064】

また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）及び色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。

【0065】

非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。

【0066】

また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤の剤形としては、人工骨や生体分解性基材もしくは生体非分解性スポンジ、バッグなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態が挙げられる。あるいは薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等も徐放製剤に含む。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。
更に注射液剤、懸濁液剤や徐放製剤以外にも、経肺投与に適した吸入剤、経皮投与に適した軟膏剤なども可能である。
吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリン又はその誘導体等を適宜配合することができる。吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、本発明のアプタマー又は複合体を粉末状又は液状にして、吸入噴射剤及び／又は担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー又は複合体が、粉末状の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで吸入噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。

【0067】

界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分である本発明のアプタマーと混合し製剤化し使用する。

【0068】

本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。

【0069】

本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、キマーゼの精製、及びキマーゼの検出、定量に有用であり得る。

【0070】

本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。

【0071】

本発明はまた、キマーゼの精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はキマーゼを他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にキマーゼを吸着させ、吸着したキマーゼを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのキマーゼの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、キマーゼを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。キマーゼの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、ナトリウム塩（例、ＮａＣｌ）、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ_２）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、キマーゼの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｆｅｒ ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。

【0072】

本発明はまた、キマーゼの検出及び定量方法を提供する。特に本発明はキマーゼを他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）キマーゼを測定することを含み得る。キマーゼの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、ＰＥＴ等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるキマーゼ量の測定、キマーゼが関連する疾患の診断に有用であり得る。

【0073】

本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

【0074】

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。

【実施例】

【0075】

実施例１：キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（１）
キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５−５１０，１９９０）を参考にして行った。標的物質としてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた。担体へのキマーゼの固相化方法はＧＥヘルスケア社の仕様書に沿って行った。固相化量は、固相化前のキマーゼ溶液と固相化直後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、上清からはキマーゼのバンドは検出されず、使用したキマーゼのほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約１６７ｐｍｏｌのキマーゼが約３μＬの樹脂に固相化されたことになる。

【0076】

最初のラウンドで用いたＲＮＡ（４０Ｎ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭＴ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型としては、以下に示す４０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ７０ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。

【0077】

ＤＮＡ鋳型：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＣＧＴ−３’（配列番号１）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＧＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２）
プライマーＲｅｖ：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号３）

【0078】

ＤＮＡ鋳型（配列番号１）中のＮの連続は任意の組み合わせの４０個のヌクレオチド（４０Ｎ：それぞれのＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）であり、得られるアプタマー独特の配列領域を生じる。プライマーＦｗｄはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０^１４であった。

【0079】

キマーゼが固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、キマーゼに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ 塩化ナトリウム、５．４ｍＭ 塩化カリウム、１．８ｍＭ 塩化カルシウム、０．８ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。キマーゼに結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で１０分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは７Ｍ Ｕｒｅａ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．６）の混合液である。回収されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭＴ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。

【0080】

ＳＥＬＥＸを８ラウンド行った後に４４クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。それらクローンの一部の配列を配列番号４〜２０に示す。そのうち、配列番号４で表される配列は６配列存在した。配列番号５は２配列存在した。配列番号６〜２０で表される配列は１配列であった。配列番号６と８は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号４、１３、及び１４の配列には配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。配列番号２１で表される共通配列は４４クローン中９クローンに含まれていた。これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−３４１５，２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分がよく似たループ構造となった。配列番号４、５、１２〜１４、１８で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図１に示す。配列番号２１で表される共通配列を丸（○）で囲った。

【0081】

以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。また、配列中のＮ（Ｎ_１、Ｎ_２）はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕのうちの任意のヌクレオチドを示し、Ｘ（Ｘ_１、Ｘ_２）は共にＡ、もしくは共にＧを示す。

【0082】

配列番号４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＡＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＵＡＡＣＡＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号５：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＣＵＵＧＵＣＵＵＵＧＡＧＧＣＡＡＧＡＡＡＵＵＧＵＡＵＵＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号６：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＡＣＧＧＵＣＵＧＵＧＵＧＡＡＡＵＵＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＵＡＧＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号７：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＣＣＵＵＵＣＣＡＡＵＵＧＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＵＧＡＣＡＵＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号８：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＡＣＧＧＵＣＵＧＵＧＵＧＡＡＡＵＵＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＵＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号９：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＧＣＵＵＧＣＵＡＡＡＡＵＧＡＵＵＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１０：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＣＣＧＣＣＵＡＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＡＵＡＵＵＡＣＡＧＡＡＡＣＧＵＣＡＡＡＵＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１１：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＡＣＡＣＧＡＡＡＵＧＵＧＵＧＡＵＵＡＡＵＵＣＣＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＵＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１２：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＣＣＧＵＣＡＡＣＧＵＵＡＣＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＵＡＣＣＡＧＧＧＵＡＡＣＵＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１３：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＣＡＡＣＣＡＵＣＣＣＧＵＡＡＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＣＧＵＵＣＣＵＧＡＣＡＧＣＡＵＵＵＧＡＧＡＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１５：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＧＡＡＡＡＵＡＡＡＵＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＵＵＵＵＵＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１６：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＵＧＡＣＵＧＡＡＡＡＡＣＧＵＣＡＧＵＡＡＡＡＵＣＣＧＡＡＡＡＵＣＡＵＡＵＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１７：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＵＵＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＡＡＣＵＵＵＵＡＡＡＡＡＡＵＧＵＡＣＧＵＧＧＧＡＧＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１８：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＵＵＡＵＡＧＡＡＣＵＵＣＧＵＵＵＧＡＣＡＵＵＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号１９：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＡＣＵＧＣＡＡＵＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＵＵＣＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２０：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＡＡＡＵＣＡＧＣＵＧＡＵＵＵＧＵＡＡＵＵＵＵＵＵＵＡＣＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２１：
Ｘ_１ＧＡＵＡＧＡＮ_１Ｎ_２ＵＡＡＸ_２

【0083】

８ラウンドまで行った上記ＳＥＬＥＸを同様の条件で継続し、１１ラウンド目に９３クローンの配列を調べた。それらクローンの一部の配列を配列番号２２〜２７に示す。８ラウンド後の配列と同配列であったものとして、配列番号４で表される配列が２２配列、配列番号１４で表される配列が４配列存在した。これは配列番号２１で表される共通配列が濃縮されたことを意味する。また、配列番号５で表される配列が１配列存在した。その他に、配列番号２２で表される配列が３配列、配列番号２３及び２４で表される配列は２配列存在した。配列番号２５〜２７で表される配列は１配列であった。配列番号２２と１１は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号２６と４は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号２１で表される共通配列は９３クローン中３５クローンに含まれていた。１１ラウンドで新しく出現した配列中では、配列番号２５、及び２６の配列に配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。配列番号２２〜２７で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図２に示す。配列番号２１で表される共通配列の部分を丸（○）で囲った。それらは図１同様、全て特徴的なループ構造となった。

【0084】

以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。

【0085】

配列番号２２：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＧＡＣＡＣＡＡＡＡＵＧＵＧＵＧＡＵＵＡＡＵＵＣＣＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＵＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２３：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＵＡＵＧＵＡＣＵＣＣＧＵＣＣＵＧＡＣＡＡＡＡＵＧＵＣＡＡＵＧＡＣＡＡＡＣＧＵＵＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＣＵＵＣＡＵＡＧＵＡＧＡＡＵＧＵＵＧＧＵＵＵＣＵＡＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２５：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＧＣＵＧＡＣＵＣＣＡＡＵＧＣＡＣＡＣＧＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＣＧＵＵＧＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２６：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＧＡＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＵＡＡＣＡＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２７：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＧＵＣＡＵＣＧＧＵＵＧＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ

【0086】

上記８ラウンドのＳＥＬＥＸの後、標的物質としてＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いて、さらにＳＥＬＥＸを継続した。キマーゼ溶液を担体に加え、室温で３０分保持することで、キマーゼを担体に固相化した。固相化量は、固相化前のキマーゼ溶液と固相化直後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、上清からはキマーゼのバンドは検出されず、使用したキマーゼのほぼ全てが固相化されたことが確認された。約１００ｐｍｏｌのキマーゼが約３μＬの樹脂に固相化されたことになる。

【0087】

１１ラウンド目のプールをクローニングし、７９クローンの配列を決定した。それらクローンの一部の配列を配列番号２８〜３４に示す。上記８ラウンド後の配列と同配列であったものとして、配列番号４で表される配列が９配列、配列番号１９で表される配列が１配列存在し、上記１１ラウンド後の配列と同配列であったものとして、配列番号２７で表される配列が２配列存在した。その他に、配列番号２８で表される配列が４配列、配列番号２９で表される配列が２配列存在した。配列番号３０〜３４で表される配列は１配列であった。配列番号３０と３１は配列中の一塩基のみが異なる。配列番号３２は配列番号３１が一塩基欠失した配列である。配列番号２１で表される共通配列は７９クローン中１４クローンに含まれていた。１１ラウンドで新しく出現した配列中では、配列番号３０〜３２、及び３４の配列に配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。配列番号２８〜３４で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図３に示す。配列番号２１で表される共通配列の部分を丸（○）で囲った。配列番号２１で表される共通配列の部分は、配列番号３４で表されるクローン以外、全て図１同様の特徴的なループ構造となった。

【0088】

以下に配列番号２８〜３４で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。
配列番号２８：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＡＵＵＵＣＵＵＵＣＵＡＵＵＣＵＣＡＣＣＵＧＡＧＵＡＵＡＵＣＡＧＧＣＡＣＡＧＵＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号２９：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧＵＧＡＣＡＵＵＵＵＡＧＡＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３０：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＣＵＣＵＵＧＵＣＵＡＵＵＵＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３１：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＣＵＣＡＵＧＵＣＵＡＵＵＵＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３２：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＧＵＣＣＵＣＡＵＧＵＣＵＡＵＵＵＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３３：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＵＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＧＣＵＵＵＧＣＡＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
配列番号３４：
ＧＧＧＡＣＧＧＵＡＧＧＡＡＵＵＣＵＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＡＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＵＣＧＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ

【0089】

配列番号４〜２０と２２〜３４で表される核酸のキマーゼに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ ｄＴを１５００ＲＵ程度結合させた。リガンドとなる核酸は、３’末端に１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ Ａを付加し、ＴとＡのアニーリングによりＳＡチップに固定化した。流速２０μＬ／ｍｉｎで核酸を２０μＬインジェクトし、約１０００ＲＵの核酸を固定化した。アナライト用のキマーゼは０．２μＭに調製し、２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。

【0090】

測定の結果、測定した全ての配列がキマーゼと結合することがわかった（表１）。しかし、ネガティブコントロールとして用いた４０ヌクレオチドのランダム配列を含む１ラウンド目に使用した核酸プール（４０Ｎ）もキマーゼと弱い結合活性を示すことがわかった。そこで、表１では４０Ｎよりも結合活性が高いアプタマーを＋＋、４０Ｎと同等のものを＋で示した。また、配列番号１２及び１３で表されるアプタマーがキマーゼと結合する様子を示すセンサーグラムを図４に示す。
配列番号２１で表される共通配列の有無にかかわらず、４０Ｎよりも結合活性が高いものと、４０Ｎと同等なものが存在した。この共通配列を含む配列番号４、１３、１４、２５、２６、３０は４０Ｎよりも結合活性が高かったが、同様の共通配列を含む配列番号３１、３２、３４は４０Ｎと同等であった。配列番号２１の配列中に含まれるＮ_１Ｎ_２はＧＡ、ＧＵ、ＵＵ、ＣＵでよいことがわかった。配列番号２１の配列中に含まれるＸ_１とＸ_２は共にＡでよいことがわかった。

【0091】

【表1】

【0092】

表１：キマーゼに対する結合活性。“＋＋”はネガティブコントロールの４０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するもの、“＋”はネガティブコントロールの４０Ｎと同程度の結合のものを表す。ここで４０Ｎとは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、１ラウンド目に使用した核酸プールのことである。

【0093】

実施例２：キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（２）
ランダム配列が３０ヌクレオチドでプライマー配列が実施例１で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例１と同様のＳＥＬＥＸを行った。ＳＥＬＥＸの標的物質としてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。

【0094】

ＤＮＡ鋳型：５’−ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣ−３’（配列番号３５）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号３６）
プライマーＲｅｖ：５’−ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧ−３’（配列番号３７）

【0095】

ＤＮＡ鋳型（配列番号３５）中のＮの連続は任意の組み合わせの３０個のヌクレオチド（３０Ｎ：それぞれのＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）であり、得られるアプタマー独特の配列領域を生じる。プライマーＦｗｄはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０^１４であった。

【0096】

キマーゼが固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、キマーゼに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ｃで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ｃは１４５ｍＭ 塩化ナトリウム、５．４ｍＭ 塩化カリウム、１．８ｍＭ 塩化カルシウム、０．８ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。キマーゼに結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｄを加えて室温で１０分間攪拌することで回収した。ここで溶液Ｄとは、溶液Ｃに６Ｍグアニジン塩酸塩を加え、ｐＨ７．６に調製したものである。溶出操作は３回行った。回収されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭＴ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。
ＳＥＬＥＸ８ラウンド終了後に配列を調べたところ、まだ配列に収束は見られなかった。そこで、競合剤として２ｍｇ／ｍＬのへパリンを加えて１１ラウンドまで進めた。４０クローンの配列を決定したところ、収束が見られ、４０クローンすべての配列に配列番号２１で表される共通配列が含まれていた。これらのクローンの一部の配列を配列番号３８〜４８に示す。配列番号３８で表される配列は６配列存在し、配列番号３９で表される配列は２配列存在した。配列番号４０〜４８は１配列存在した。
配列番号３８〜４０、４３、４８で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図５に示す。図５中、配列番号２１で表される共通配列は丸（○）で囲んだ。配列番号２１で表される共通配列の多くは図１で示したものと同様の特徴的なループ構造を形成した。

【0097】

以下に配列番号３８〜４８で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。

【0098】

配列番号３８：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＧＡＵＣＵＧＧＣＵＧＧＣＧＣＡＵＵＡＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号３９：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＵＵＡＣＧＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＧＧＵＡＡＣＧＧＵＡＣＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４０：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＡＣＧＧＡＵＡＧＡＧＣＵＡＡＧＡＧＵＵＣＧＵＣＡＧＡＧＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４１：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＵＧＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＡＵＡＧＵＡＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４２：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＣＧＵＧＡＵＣＧＵＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４３：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＧＣＣＡＡＧＡＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＵＧＧＣＧＵＵＵＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４４：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＵＵＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＵＡＧＧＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４５：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＵＧＧＧＣＡＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＵＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４６：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＧＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＧＵＣＣＧＵＵＡＣＧＵＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４７：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＧＵＧＡＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ
配列番号４８：
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＵＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＵＣＡＣＡＵＡＣＡＧＵＣＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ

【0099】

配列番号３８〜４８で表される核酸のキマーゼに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。配列番号３８〜４８の評価においては、測定は実施例１で示した方法と同様の方法を用いて測定した。ランニングバッファーには溶液Ｃを用いた。測定の結果を表２に示す。
配列番号３８〜４８で表される核酸は３０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するアプタマーであることが示された。共通配列である配列番号２１に含まれるＸ_１及びＸ_２は共にＡもしくは、共にＧでよいことがわかった。これら共通配列に含まれるＮ_１Ｎ_２はＧＵ、ＧＣ、ＧＡ、ＵＵでよいことがわかった。

【0100】

【表2】

【0101】

表２：キマーゼに対する結合活性。“＋＋”はネガティブコントロールの３０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するものを表す。ここで３０Ｎとは３０ヌクレオチドのランダム配列を含む、１ラウンド目に使用した核酸プールのことである。

【0102】

実施例３：合成基質を用いたキマーゼ阻害活性の測定
配列番号４〜２０、２２〜３４、３８〜４８で表される核酸がキマーゼの酵素活性を阻害するかどうかを、下記の方法により評価した。キマーゼの基質としてキモトリプシン様プロテアーゼの標準基質である４アミノ酸ペプチドＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含むＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製）を選択した。ここでＳｕｃは保護基であるスクシニル基、ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミド基であり、フェニルアラニンのＣ末端側が切断されるとＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）が遊離する。このＡＭＣの蛍光を検出することで、キマーゼの酵素活性を測定することができる。アッセイには、９６ウェルプレート（Ｆ１６ Ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ、Ｎｕｎｃ社製）を用い、反応液量を１００μＬとし、溶液Ｃの緩衝液中で実施した。まず、核酸は溶液Ｃ中に０．００２７〜２μＭの濃度に段階希釈したものを、５０μＬずつ用意した。そこに、溶液Ｃ中に調製した１ｍＭの基質を１０μＬ添加した後、プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間保温した。一方で、０．０５μｇ（もしくは０．００５μｇ）のキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを４０μＬ用意し、３７℃で５分間保温した。核酸及び基質からなる混合液に、キマーゼ溶液を加えて、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は１６．７ｎＭ（もしくは１．６７ｎＭ）、最終基質濃度は１００μＭである。反応液を含むプレートを、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間（もしくは３０分間）、蛍光強度の変化を経時的に測定した（励起波長 ３８０ｎｍ、検出波長 ４６０ｎｍ）。キマーゼ活性により、基質から放出されるＡＭＣの蛍光増加の線形近似を求め、その傾きの値を初速度（Ｖ_ｍａｘ）とした。コントロールとして、３０Ｎもしくは４０Ｎ（３０個もしくは４０個の連続したヌクレオチド；Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）の核酸プールを用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）において、同様に処理し測定を行った。核酸、阻害剤を含まない場合の反応初速度（Ｖ_０）を酵素活性１００％とし、各被験物質の阻害率を次式を用いて算出した。
阻害率（％）＝（１−Ｖ_ｍａｘ／Ｖ_０）×１００
酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ_５０）を求めた。その結果を表３に示す。

【0103】

【表3】

【0104】

表３：キマーゼに対する阻害活性（ＩＣ_５０）。“＞０．５”は０．５μＭまで濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ_５０値は２〜３回測定の平均値を示す。

【0105】

ネガティブコントロールである３０Ｎもしくは４０Ｎは阻害活性を示さなかった（ＩＣ_５０＞０．５μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ_５０値は０．１μＭ〜０．２μＭの値を示した。
以上の結果より、表３に記載されたアプタマーの多くはキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．１μＭ以下のＩＣ_５０値を示したアプタマーは優れた阻害効果を示したと言える。配列番号２１で表される共通配列を含むアプタマーは全て阻害活性示した。またこの結果から、これら共通配列に含まれるＸ_１、Ｘ_２は共にＡもしくは、共にＧでよく、Ｎ_１Ｎ_２はＧＡ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＵ又はＣＵのどれでもよいことが示された。

【0106】

実施例４：アプタマーの短鎖化
配列番号４、１２、１３、１４で表されるアプタマーの短鎖化を行った。配列番号４、１３、１４で表されるアプタマーは配列番号２１で表される共通配列を含む。配列番号１２はこの共通配列を含まないアプタマーである。短鎖化した配列を配列番号４９〜５７に示す。配列番号４９、５１、５５〜５７で表されるアプタマーの二次構造予測を図６に示す。図６中、配列番号２１で表される共通配列を丸（○）で囲った。

【0107】

以下に配列番号４９〜５７で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。

【0108】

配列番号４９：
（配列番号４で表されるクローンを共通配列を含む２９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＣＣ
配列番号５０：
（配列番号４で表されるクローンを共通配列を含む３５ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＧＡＵＡＧＡＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＵＡＡＣ
配列番号５１：
（配列番号１２で表されるクローンを４５ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＣＧＵＵＡＣＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＵＡＣＣＡＧＧＧＵＡＡＣＵＡＡＡＣＡＵＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧ
配列番号５２：
（配列番号１２で表されるクローンを２６ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＣＣＧＵＡＵＡＵＡＣＣＡＧＧＧＵＡＡＣＵＡＡＡＣＧＧ
配列番号５３：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む４２ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＧＵＡＡＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＣＣ
配列番号５４：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む３６ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＵＡＡＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡ
配列番号５５：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む２９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＣＵＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＡＵＡＧ
配列番号５６：
（配列番号１３で表されるクローンを共通配列を含む２３ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＣ
配列番号５７：
（配列番号１４で表されるクローンを共通配列を含む２７ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＣＡＵＵＵＧＡＧＡＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＣＡＡＡＣＧＣ

【0109】

配列番号４９〜５７の核酸は全て化学合成により作製した。
これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により評価した。測定には、ＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用い、以下に示す方法で測定を行った。ＣＭ５チップのセンサーチップ表面に、アミンカップリングキットを使用し、約４０００ＲＵのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を固定化した。流速２０μＬ／ｍｉｎで、アナライトとして０．３μＭに調製した核酸を２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ｃを用いた。測定の結果を表４に示す。評価方法は実施例１と同様である。
その結果、配列番号５２以外の核酸がコントロールの４０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するアプタマーであることが示された（表４）。配列番号１３、５５、５６で表されるアプタマーがキマーゼと結合する様子を示すセンサーグラムを図７に示す。

【0110】

また、キマーゼ阻害活性の測定は、実施例３と同様の方法で行った。それぞれのＩＣ_５０値を表４に示す。
配列番号５２以外の核酸に強い阻害活性が認められた（表４）。配列番号５１と５２の結果より、共通配列を含まない配列番号１２で表されるアプタマーは４５ヌクレオチドに短鎖化したものでは活性を維持しているが、２６ヌクレオチドに短鎖化したものでは活性が消失することがわかった。
一方で、配列番号５６の結果より、共通配列を含む配列番号１３で表されるアプタマーはより短い２３ヌクレオチドの長さまで短鎖化できた。これは、配列番号２１で表される共通配列がキマーゼに対する結合及び阻害活性に重要であることを示している。
また、配列番号４９と５７も阻害活性を示したことより、共通配列に含まれるＮ_１Ｎ_２はＧＵに限らないこと、図６の配列番号５６のステム構造に含まれる配列はステム構造を維持する限り特に限定されないことが示された。
これらのアプタマーはキマーゼ阻害剤として使用可能であると考えられる。

【0111】

【表4】

【0112】

表４：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ_５０）。“＋＋”はネガティブコントロールの４０Ｎよりも有意にキマーゼに結合するもの、“＋”はネガティブコントロールの４０Ｎと同程度の結合のものを表す。ここで４０Ｎとは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、実施例１で使用した１ラウンド目の核酸プールである。“＞１”は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ_５０値は２〜３回測定の平均値を示す。

【0113】

ネガティブコントロールである４０Ｎは１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ_５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ_５０値は０．１μＭ〜０．２μＭの値を示した。
以上の結果より、表４に含まれる配列番号５２以外の核酸はキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．１μＭ以下のＩＣ_５０値を示した核酸は優れた阻害効果を示したと言える。

【0114】

実施例５：短鎖化したアプタマーの塩基の置換、欠損の効果
配列番号５６で表されるアプタマーに変異、欠損を導入し、結合活性及び阻害活性に対する影響を調べた。配列を配列番号５８〜６８に示す。

【0115】

以下に配列番号５８〜６８で示される各アプタマーのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し（例えば、Ｕ（Ｆ）と表記する場合、ウラシルのリボースの２’位がＦで修飾されることを示す）、Ｆはフッ素原子を示す。

【0116】

配列番号５８：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれる１３個の核酸塩基をランダムに配置した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５９：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＮ_２を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６０：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＮ_２を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６１：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＮ_１を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６２：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるＸ_１及びＸ_２を置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＧＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６３：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外に含まれる塩基配列を置換した配列）
ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＵ（Ｆ）ＡＧＣ（Ｆ）
配列番号６４：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外に含まれる塩基配列を置換した配列）
ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＵ（Ｆ）ＧＡＣ（Ｆ）
配列番号６５：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外に含まれる塩基配列を一部置換させ、一部欠損させた配列）
ＧＧＣ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６６：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるプリン塩基をピリミジン塩基に置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＣＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６７：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるプリン塩基をピリミジン塩基に置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＣＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６８：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるプリン塩基をピリミジン塩基に置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＵＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）

【0117】

配列番号５８〜６８の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかについて、実施例４と同様にして、表面プラズモン共鳴法により評価した。キマーゼに対する阻害活性の測定は、実施例３と同様に行った。測定結果を表５に示す。
その結果、表５に含まれる核酸のうち配列番号５９〜６５の核酸が強い結合力と阻害活性を保持していることがわかった。

【0118】

配列番号５８は、結合活性、阻害活性共に、実施例１や２で用いた４０Ｎ／３０Ｎと同程度まで低下したことから、配列番号２１で表される共通配列がキマーゼに対する結合及び阻害活性に重要であることが示された。またこの結果より、これ以降の実施例（実施例５〜９）においては、短鎖化したアプタマーのネガティブコントロールとして配列番号５８を用いることにした。
配列番号５９〜６１の結果より、共通配列に含まれるＮ_１及びＮ_２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくはＧＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＵＵであることが示された。配列番号６２の結果より、Ｘ_１及びＸ_２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくはＡまたはＧであり、より好ましくは共にＡもしくは共にＧであることが示された。
配列番号６３〜６５の結果より、共通配列以外に含まれるステム構造の塩基対配列は（例：図６の配列番号５６）、ステム構造を保つ限り任意のヌクレオチドであってよく、長さは３塩基対以上が好ましいことが示された。
配列番号６６〜６８の結果より、共通配列に変異を導入すると活性が低下することから、共通配列の重要性が改めて示された。

【0119】

【表5】

【0120】

表５：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ_５０）。結合活性において、“＋＋”はネガティブコントロールである配列番号５８よりも有意にキマーゼに結合するもの、“＋”はネガティブコントロールである配列番号５８と同程度の結合のものを表す。阻害活性において、“＞１”は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ_５０値は２回測定の平均値を示す。

【0121】

配列番号５８は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ_５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ_５０値は０．１μＭ〜０．２μＭの値を示した。以上の結果より、表５に記載のあるアプタマーのうち、配列番号５９〜６５で表されるアプタマーはキマーゼに対する強い阻害活性（ＩＣ_５０＜０．１μＭ）を有していることがわかる。

【0122】

実施例６：短鎖化したアプタマーの改変１
配列番号５６で表されるアプタマーのヌクレアーゼ耐性を高めるために、末端修飾した改変体、配列中のプリン塩基のリボースの２’位にＯ−メチル基あるいはＦ修飾を導入した改変体、その他に、ホスホロチオエートを導入した改変体を作製した。配列を配列番号５６（１）〜５６（１４）、５６（１７）〜５６（１９）に示す。また、配列番号５６で表されるアプタマーの共通配列に含まれるピリミジンヌクレオチドの修飾（２’−Ｆ；リボース２位のＦ修飾）を天然型（２’−ＯＨ）に置換した改変体を作製し、修飾の必要性について評価した。それらの配列を配列番号５６（１５）、５６（１６）に示す。

【0123】

以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を示す。また、各配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｄＴによる修飾を示し、ＰＥＧは４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコールによる修飾を示す。配列中におけるｓはヌクレオチド同士を結合するリン酸基がホスホロチオエート化されたことを示す。

【0124】

配列番号５６（１）：
（配列番号５６で表されるクローンの両末端にｉｄＴ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（２）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外の配列のうち三か所に修飾を導入した配列）
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（３）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列以外の配列のうち二か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（４）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（５）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち二か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（６）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（７）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（８）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（９）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１０）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１１）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１２）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１３）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧ（Ｆ）ＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１４）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所に修飾を導入した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１５）：
（配列番号５６で表されるクローンの９番目のヌクレオチドＵ（Ｆ）をＵに置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１６）：
（配列番号５６で表されるクローンの１５番目のヌクレオチドＵ（Ｆ）をＵに置換した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）ＵＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１７）：
（配列番号５６で表されるクローンの末端にＰＥＧとｉｄＴ修飾を導入した配列）
ＰＥＧ−ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ)−ｉｄＴ
配列番号５６（１８）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所のリン酸基をホスホロチオエート化した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（１９）：
（配列番号５６で表されるクローンの共通配列のうち一か所のリン酸基をホスホロチオエート化した配列）
ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）

【0125】

配列番号５６（１）〜５６（１９）の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかを、実施例４と同様にして、表面プラズモン共鳴法により評価した。結果を表６に示す。
その結果、配列番号５６（８）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）以外の核酸は、ネガティブコントロールである配列番号５８よりも有意にキマーゼに対する結合活性を示した。

【0126】

キマーゼに対する阻害活性の測定は、実施例３と同様の方法で行った。ＩＣ_５０値を表６に示した。配列番号５６（８）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）以外の核酸は、阻害活性の強弱はあるものの、これらのアプタマーに阻害活性があることがわかった。ＩＣ_５０値を比較すると、配列番号５６（１）〜５６（７）、５６（１１）、５６（１２）の阻害活性は配列番号５６とほぼ同程度に保持されていた。一方で配列番号５６（９）、５６（１５）、５６（１６）、５６（１７）の阻害活性は配列番号５６と比べて減弱し、配列番号５６（８）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）の阻害活性は消失することが示された。さらに、配列番号５６（１８）、５６（１９）の阻害活性は配列番号５６よりも向上することが示された。
配列番号５６（１）、５６（１７）の結果より、末端修飾による活性の影響は少ないことがわかった。配列番号５６（２）、５６（３）の結果より、ステム配列の修飾による活性の影響はないことが示された。共通配列に含まれるヌクレオチドに関しては、５６（４）〜５６（７）、５６（１１）、５６（１２）のように修飾しても阻害活性を保持できた場合と、配列番号５６（８）、５６（９）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）のように、修飾により阻害活性が低下（あるいは消失）した場合があった。

【0127】

以上より、配列番号５６で表されるアプタマーは安定性を向上させるため、少なくとも一つのヌクレオチドに修飾を導入したものであってもよいことがわかった。ヌクレオチドの修飾としては、２’−Ｏ−メチル修飾以外にも、例えば２’−アミノ修飾などが挙げられる。
一方で配列番号５６（１５）、５６（１６）の結果より、配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれるヌクレオチド修飾体（Ｕ（Ｆ））のうちいずれか（９番目もしくは１５番目）を天然型のリボヌクレオチド（Ｕ）にすると阻害活性が低下することがわかった。一般に、修飾体が含まれることでアプタマーのヌクレアーゼ耐性は向上する。したがって、共通配列に含まれるピリミジンヌクレオチド（配列番号５６で表されるクローンの９番目と１５番目のＵ）の少なくともどちらか一方は修飾体であることが好ましい。
また、配列番号５６（８）、５６（９）、５６（１０）、５６（１３）、５６（１４）の結果より、配列番号５６で表されるクローンの共通配列に含まれる天然のプリン塩基のうち、６番目のＡ、１１番目のＧ、１２番目のＡは修飾を導入すると阻害活性が低下するため、少なくともひとつは天然のリボヌクレオチドであることが好ましい。
その他に、配列番号５６（１８）、５６（１９）の結果より、糖残基の修飾以外にリン酸基の修飾として、少なくとも一か所にホスホロチオエートを導入すると阻害活性が向上することが分かった。

【0128】

【表6】

【0129】

表６：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ_５０）。結合活性において、“＋＋”はネガティブコントロールの配列番号５８よりも有意にキマーゼに結合するものを示し、“＋”はネガティブコントロールの配列番号５８と同程度に結合するものを示す。“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。“＞１”は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ_５０値は２回測定の平均値を示す。

【0130】

ネガティブコントロールである配列番号５８は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ_５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ_５０値は０．１μＭ〜０．２μＭの値を示した。

【0131】

以上の結果より、表６に含まれる核酸のうち、特に０．１μＭ以下のＩＣ_５０値を示したものは、キマーゼに対する強い阻害活性を有し、キマーゼ阻害剤として使用可能であることが示された。

【0132】

実施例７：短鎖化したアプタマーの改変２
実施例６の結果を踏まえて、配列番号５６で表されるアプタマーのさらなる改変を行った。２’−Ｏ−メチル基の導入、様々な末端修飾、ホスホロチオエートの導入、リボヌクレオチドのＤＮＡへの置換等について検討した改変体、またそれらの組み合わせによる改変体を作製した。配列を配列番号５６（２０）〜５６（４７）、６１（１）、６９、６９（１）、６９（２）、７０〜７４、７４（１）、７５〜７７、７７（１）、７７（２）、７８〜８２に示す。

【0133】

以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、大文字はＲＮＡを示し、小文字はＤＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を示す。また、各配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｄＴによる修飾を示し、ＰＥＧは４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコールによる修飾を示し、Ｃｈｏはコレステロールによる修飾を示し、Ｂはビオチンによる修飾を示す。Ｐｅｐｔｉｄｅ１はＰｈｅ−ＣｙｓがＣ末端側で、Ｐｅｐｔｉｄｅ２はＣｙｓ−ＰｈｅがＮ末端側で、それぞれジスルフィド結合を介して核酸の５’末端に結合していることを示す。配列中におけるｓはヌクレオチド同士を結合するリン酸基がホスホロチオエート化されたことを示す。

【0134】

配列番号５６（２０）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２１）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２２）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２３）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号５６（２４）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）ＡＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（２５）：
ｉｄＴ−ＧＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＡＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（２６）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（２７）：
ＰＥＧ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（２８）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（２９）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３０）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３１）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３２）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３３）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３４）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３５）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３６）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧｓＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３７）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧｓＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３８）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｓＡｓＧＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（３９）：
ＰＥＧ−ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（４０）：
ｉｄＴ−ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（４１）：
ｉｄＴ−ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（４２）：
Ｃｈｏ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（４３）：
Ｐｅｐｔｉｄｅ１−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（４４）：
Ｐｅｐｔｉｄｅ２−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（４５）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ＰＥＧ
配列番号５６（４６）：
Ｂ−ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（４７）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ−Ｂ
配列番号５６（４８）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号５６（４９）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ａＧ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（５０）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（５１）：
Ｂ−ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号５６（５２）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｇａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号６１（１）：
Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）
配列番号６９：
ＰＥＧ−Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号６９（１）：
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号６９（２）：
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号７０：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号７１：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）−ｉｄＴ
配列番号７２：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号７２（１）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号７２（２）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡｓＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号７２（３）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡｇｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号７２（４）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）ａＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号７２（５）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ａＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号７２（６）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ａＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ
配列番号７２（７）：
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ＰＥＧ
配列番号７２（８）：
Ｂ−ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔｔＡＧ（Ｍ）ａＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＡＧ（Ｍ）ｔＵ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ｃｃｃ−ｉｄＴ

【0135】

配列番号５６（２０）〜５６（５２）、６１（１）、６９、６９（１）、６９（２）、７０〜７２、７２（１）〜７２（８）の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がキマーゼと結合するかどうかについて、実施例４と同様にして、表面プラズモン共鳴法により評価した。結果を表７に示す。
その結果、すべての核酸（一部、未測定である核酸は除く）はネガティブコントロールよりも有意にキマーゼに結合した。
キマーゼに対する阻害活性の測定は、実施例３と同様に行った。ＩＣ_５０値を表７に示す。その結果、表７に含まれる核酸のすべてに強い阻害活性が認められた。
配列番号５６（２７）および５６（４５）の結果より、例えばＰＥＧのような末端修飾は５’末端、３’末端のいずれであってもよいことが示された。
また配列番号５６（４３）、５６（４４）、５６（４６）、および５６（４７）の結果より、末端修飾としては、実施例６で示したｉｄＴやＰＥＧ以外にペプチド、アミノ酸、あるいはビオチンなどの化合物であってもよいことがわかった。
さらに配列番号５６（２６）と６９（２）、５６（２７）と６９、そして５６（２８）と６９（１）の結果より、ｉｄＴやＰＥＧのような末端修飾はポリヌクレオチド鎖を介して結合させても阻害活性に影響がないことがわかった。このようなスペーサーとしては、任意のポリヌクレオチド鎖以外に、例えばアルキル型スペーサーを用いてもよい。
また一部のＦ体をＤＮＡ体にすることで阻害活性が向上することが分かった。

【0136】

【表7】

【0137】

表７：キマーゼに対する結合活性と阻害活性（ＩＣ_５０）。結合活性において、“＋＋”はネガティブコントロールの配列番号５８よりも有意にキマーゼに結合するものを示す。“ｎ．ｄ．”は未測定を表す。ＩＣ_５０値は２回測定の平均値を示す。

【0138】

ネガティブコントロールである配列番号５８は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性を示さなかった（ＩＣ_５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ_５０値は０．１μＭ〜０．２μＭの値を示した。

【0139】

以上の結果より、表７に含まれるすべての核酸はキマーゼに対する強い阻害活性を有し、キマーゼ阻害剤として使用可能であることが示された。

【0140】

以上、実施例１から７の結果をまとめると、キマーゼ阻害剤として有効なアプタマーは、特に以下の条件の一つ以上を満足するようなアプタマーであるといえる。
（１）配列番号２１で表される共通配列（Ｘ_１ＧＡＵＡＧＡＮ_１Ｎ_２ＵＡＡＸ_２）を含む。
（２）共通配列に含まれるピリミジンヌクレオチドは、天然型ヌクレオチドであってよいが、好ましくは一部のピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドまたはＤＮＡである。
（３）Ｎ_１Ｎ_２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくはＧＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＵＵ、ＣＵ又はＧＴである。
（４）Ｘ_１及びＸ_２は任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくは同一または異なって、ＡまたはＧであり、より好ましくは共にＡ、もしくは共にＧである。
（５）ステム構造の塩基対配列（例：図６の配列番号５６）は、ステム構造を保つ限り任意のヌクレオチドであってよいが、好ましくは長さが３塩基対以上である。
（６）一部のヌクレオチド（配列番号５６において、６番目のＡ、１１番目のＧ、１２番目のＡ）を除き、各ヌクレオチドは部分的に修飾されているか、または部分的にＤＮＡに置換されている。
（７）末端修飾が導入されている。
（８）ヌクレオチド間のリン酸基の一部が、ホスホロチオエート化されている。

【0141】

実施例８：アンジオテンシンＩを基質として用いたキマーゼ阻害活性の測定
本発明の核酸の阻害活性についてさらに評価するため、キマーゼの天然基質であるアンジオテンシンＩを用いて、下記の方法によりキマーゼの酵素活性を測定した。アンジオテンシンＩはキマーゼによりアンジオテンシンＩＩに変換され、その際にペプチド断片であるＨｉｓ−Ｌｅｕが遊離する。このペプチドＨｉｓ−Ｌｅｕはｏ−フタルアルデヒドにより蛍光誘導体化されるため、その蛍光強度を定量的に測定することが可能である。
アッセイにおける酵素反応の溶液量は５０μＬとし、溶液Ｃの緩衝液中で実施した。まず、０．３〜０．７５ｎｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、（ＳＩＧＭＡ社製）もしくはｎａｔｉｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製））を溶液Ｃ中に希釈したものを５μＬ用意した。ここでｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔとは酵母を用いて発現させたキマーゼであり、ｎａｔｉｖｅとはヒト皮膚肥満細胞から精製したキマーゼである。核酸は溶液Ｃ中に０．００２７〜２μＭの濃度で段階希釈したものを、２５μＬずつ用意した。キマーゼ溶液５μＬと核酸溶液２５μＬを混和し、３７℃で５分間保温した。一方で、溶液Ｃ中に調製した１２５ｍＭアンジオテンシンＩ（ペプチド研究所社製）を２０μＬ用意し、３７℃で５分間保温した。キマーゼ及び核酸からなる混合液に、アンジオテンシンＩ溶液を加えて、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は０．２〜０．５ｎＭ、最終基質濃度は５０μＭである。３７℃で９０分間反応させた後、氷冷した３０％トリクロロ酢酸溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させた。混合液全体を４℃、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清３０μＬを次の蛍光誘導化反応に用いた。
上記の上清３０μＬを９６ウェルプレート（ブラック、Ｃｏｓｔａｒ社製）に加え、各ウェルに対し、メタノールに溶解した２％ ｏ−フタルアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μＬと、０．３Ｍ ＮａＯＨ溶液１７０μＬを混和し、室温に１０分間放置した。その後、３Ｍ ＨＣｌ溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させた。プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。

【0142】

なお、コントロールとして、配列番号５８を用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）で同様に処理し測定を行った。各条件において、反応時間０分における蛍光強度をブランクとした。キマーゼ酵素反応において、核酸を添加するかわりに溶液Ｃを同量添加した場合に検出される蛍光強度を１００％とし、各被験物質の阻害率を次式を用いて算出した。
阻害率（％）＝［１−｛（被験物質の蛍光強度−被験物質のブランクの蛍光強度）／（被験物質を含まない場合の蛍光強度−被験物質を含まない場合のブランクの蛍光強度）｝］×１００

【0143】

酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ_５０）を求めた。その結果を表８に示す。

【0144】

【表8】

【0145】

表８：アンジオテンシンＩを基質として用いた場合のキマーゼに対する阻害活性（ＩＣ_５０）。ＩＣ_５０は一回測定の値を示す。

【0146】

ネガティブコントロールとして用いた配列番号５８は阻害活性を示さなかった（ＩＣ_５０＞１μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ_５０値は０．３５〜０．５μＭ（Ｎａｔｉｖｅ）、０．４５〜０．６μＭ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）の値を示した。ＰＥＧ結合アプタマーの活性はＰＥＧが結合していないアプタマーと比べて相対的に低い。これはＰＥＧ（分子量約４０，０００）がアプタマー（分子量約１０，０００）よりも大きいために起こることで、一般的によく見られる現象である。ＰＥＧを結合することでｉｎ ｖｉｖｏでの薬物体内動態が大きく改善されるので、ｉｎ ｖｉｔｒｏで薬効が多少低下してもｉｎ ｖｉｖｏで効果を示すことが期待できる。

【0147】

以上の結果より、表８に含まれるすべての核酸は、天然の基質であるアンジオテンシンＩを用いた場合でもキマーゼに対する強い阻害活性を有するため、アンジオテンシンが関与する各種疾患の予防および／または治療薬として期待される。

【0148】

実施例９：正常ヒト肺線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＮＨＬＦ）を用いたＬＴＢＰ−1分解阻害活性の測定
キマーゼは線維症を引き起こす重要な因子の一つであるＴＧＦ−βの活性化に深く関係している。ＴＧＦ−β活性化の過程において、キマーゼはＬＴＢＰ−１を分解することにより、細胞外マトリックス中に潜在型として存在するｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−βを遊離させ、さらに、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−βを活性型ＴＧＦ−βへ変換させる反応にも関与することが示唆されている。本発明に係わる核酸が、キマーゼによるＬＴＢＰ−１分解に対する阻害活性を有するかどうかを下記に示す方法で評価した。
凍結保存されたＮＨＬＦ細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を３７℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈにて急速融解後、培地（１０％ＦＢＳ／Ｆ−１２）に懸濁した。遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去し，細胞を培地に再懸濁した。培地で全量を１０ｍＬとして、細胞培養用シャーレに移して３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。顕微鏡にて細胞の形態及び増殖状態を観察し、コンフルエントの状態になったところで無血清培地（０．２％ＢＳＡ／Ｆ−１２）に交換した。培地交換から２日後に培養上清を採取し、分注して−３０℃で凍結保存した。
用時解凍したＮＨＬＦ培養上清４０μＬをチューブに分注し、溶液Ｃで５０μＭに希釈した核酸溶液を５μＬずつ添加した。ポジティブコントロールとしてはキモスタチンを溶液Ｃで希釈したものを用い、同様に添加した。ネガティブコントロールとしては溶液Ｃのみを用い、同様に添加した。次に、溶液Ｅ（溶液Ｃ＋０．１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したキマーゼを５μＬ添加した。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は１０ｎｇ／ｍＬ（０．３３ｎＭ）、最終核酸濃度は５μＭであった。コントロールとして、キマーゼを添加しないチューブを作製した。ピペッティングの後３７℃で1時間インキュベーションし、等量の電気泳動用Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒと混合して反応を終了した。次に示すウェスタンブロッティングにより、サンプル中のＬＴＢＰ−１を検出した。
Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒと混合したサンプルを３分間煮沸し、５〜２０％アクリルアミドゲルに１０μＬのサンプルをアプライして電気泳動した。泳動終了後、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした後、フィルターを５％スキムミルク、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５％アジ化ナトリウムでブロッキングした。フィルターを２％ＢＳＡ、ＰＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウムで２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＬＴＢＰ−１モノクローナル抗体と室温で一晩反応させた。フィルターを３回洗浄し、２次抗体溶液（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに１００００倍希釈）と室温で２時間インキュベーションした。フィルターを５回洗浄し、化学発光基質で検出を行った。
各被験物質の阻害活性の有無はＬＴＢＰ−１のバンドの濃さおよび位置（分子量）で判定した。分析は３回に分けておこなった。キマーゼ不添加のウェルのバンドを陽性対照（＋）、ネガティブコントロールのウェルのバンドを陰性（−）とし、各被験物質のウェルのバンドから阻害活性の有無を目視で判定した。ウェスタンブロッティングによる分析結果を図８に、阻害活性の判定結果を表９に示す。

【0149】

【表9】

【0150】

表９：ＬＴＢＰ−１分解に対する阻害活性の有無。“＋”はコントロールにおけるＬＴＢＰ−１のバンドと同程度の濃さのバンドが検出されたもの、“−”はネガティブコントロールのようにＬＴＢＰ−１のバンドが明確に検出されなかったものを表す。

【0151】

配列番号５８は阻害活性を示さなかった（−）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンは阻害活性を示した（＋）。表９に含まれる配列番号５８以外のアプタマーすべてに、ＬＴＢＰ−１分解に対する阻害活性が認められた。
以上の結果より、本発明に係わるアプタマーはキマーゼによるＬＴＢＰ−１分解を阻害することが分かった。従って、例えば線維症のようにＴＧＦ−βの活性化が関与する各種疾患の予防および／または治療に使用可能であることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0152】

本発明のアプタマー及び複合体は、循環器系疾患や線維症などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、キマーゼの精製及び濃縮、並びにキマーゼの検出及び定量に有用であり得る。

【0153】

本出願は、日本国で出願された特願２００９−１４０５８５を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]