特許 5823483 塩基性タンパク質タグに融合したプロセシング酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5823483

(24)【登録日】2015年10月16日

(45)【発行日】2015年11月25日

(54)【発明の名称】塩基性タンパク質タグに融合したプロセシング酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20151105BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20151105BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20151105BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20151105BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20151105BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20151105BHJP

   C12N 9/90 20060101ALI20151105BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20151105BHJP

   C07K 1/18 20060101ALI20151105BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20151105BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K19/00

   C12N9/02

   C12N9/10

   C12N9/14

   C12N9/88

   C12N9/90

   C12N9/00

   C07K1/18

   C12P21/02 C

【請求項の数】15

【外国語出願】

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2013-273080(P2013-273080)

(22)【出願日】2013年12月27日

(62)【分割の表示】特願2009-531860(P2009-531860)の分割

【原出願日】2007年10月12日

(65)【公開番号】特開2014-110792(P2014-110792A)

(43)【公開日】2014年6月19日

【審査請求日】2014年1月27日

(31)【優先権主張番号】06122266.7

(32)【優先日】2006年10月13日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】507383862

【氏名又は名称】ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100109726

【弁理士】

【氏名又は名称】園田 吉隆

(74)【代理人】

【識別番号】100101199

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 義教

(72)【発明者】

【氏名】シャウ， アラン， クリスチャン

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／１０８８２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Biotechnol., (2002), 96, [2], p.93-102

【文献】 Protein Express. Purif., (2006.05), 47, [1], p.234-240

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

好熱性細菌由来のリボソームタンパク質Ｌ９ファミリー由来のペプチド配列からなるタグをＮ末端に結合して含むプロセシング酵素であって、該タグは１５から２５０アミノ酸を有し、少なくとも１５％のＬｙｓ及びＡｒｇを含み、タグが９を超えるｐＩを有している、プロセシング酵素。

【請求項2】

タグがリンカー配列によってプロセシング酵素に結合している、請求項１に記載のプロセシング酵素。

【請求項3】

タグがシステイン残基を含まない、請求項１又は２に記載のプロセシング酵素。

【請求項4】

タグが、５０から２５０、７５から２００、１００から２５０、又は１００から２００のアミノ酸残基を含む、請求項１から３の何れか一項に記載のプロセシング酵素。

【請求項5】

タグ中のアミノ酸残基の１５％から５０％、２０％から５０％、３０％から５０％、４０から５０％又は３５％から５０％が塩基性アミノ酸残基Ｌｙｓ及びＡｒｇである、請求項１から４の何れか一項に記載のプロセシング酵素。

【請求項6】

タグが、
ＭＫＶＩＬＬＲＤＶＰＫＩＧＫＫＧＥＩＫＥＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＲＧＦＡＫＥＹＴＥＧＬＥＲＡＩＫＨＥＫＥＩＥＫＲＫＫＥＲＥＲＥＥＳＥＫＩＬＫＥＬＫＫＲＴＨＶＶＫＶＫＡＧＥＧＧＫＩＦＧＡＶＴＡＡＴＶＡＥＥＩＳＫＴＴＧＬＫＬＤＫＲＷＦＫＬＤＫＰＩＫＥＬＧＥＹＳＬＥＶＳＬＰＧＧＶＫＤＴＩＫＩＲＶＥＲＥＥ（配列番号：１０）；
ＭＫＶＩＬＬＥＰＬＥＮＬＧＤＶＧＱＶＶＤＶＫＰＧＹＡＲＮＹＬＬＰＲＧＬＡＶＬＡＴＥＳＮＬＫＡＬＥＡＲＩＲＡＱＡＫＲＬＡＥＲＫＡＥＡＥＲＬＫＥＩＬＥＮＬＴＬＴＩＰＶＲＡＧＥＴＫＩＹＧＳＶＴＡＫＤＩＡＥＡＬＳＲＱＨＧＩＴＩＤＰＫＲＬＡＬＥＫＰＩＫＥＬＧＥＹＶＬＴＹＫＰＨＰＥＶＰＩＱＬＫＶＳＶＶＡＱＥ（配列番号：４１）；
ＭＫＶＩＦＬＫＤＶＫＧＫＧＫＫＧＥＩＫＤＶＡＤＧＹＡＮＮＦＬＦＫＱＧＬＡＩＥＡＴＰＡＮＩＫＡＬＥＡＱＫＱＫＥＱＲＱＡＡＥＥＬＡＮＡＫＫＬＫＥＥＬＥＫＬＴＶＥＩＰＡＫＡＧＥＧＧＲＬＦＧＳＩＴＳＫＱＩＡＥＡＬＱＡＱＨＧＬＫＬＤＫＲＫＩＥＬＡＤＡＩＲＳＬＧＹＴＮＶＰＶＫＬＨＰＥＶＴＡＴＬＫＶＨＶＫＥＱＫ（配列番号：４２）；及び
ＭＫＶＶＬＬＫＤＶＳＫＩＧＫＫＧＥＩＫＮＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＫＧＬＡＬＥＡＴＰＲＶＬＫＲＬＥＡＥＫＲ−ＫＫＥＥＥＫＩＱＩＫＴＱＮＥＥＬＬＫＭＬＫＫＦＬＹＫＩＰＶＫＡＧＥＳＧＫＬＦＧＡＬＴＮＳＤＩＡＫＡＶＥＫＩＡＤＶＮＩＤＫＫＦＩＶＬＥＫＰＩＫＥＩＧＭＹＤＶＬＶＲＬＰＥＧＶＳＧＫＩＫＶＥＶＩＱＥＧＫＮ（配列番号：４３）
からなるペプチド配列群から選択される、請求項１から５の何れか一項に記載のプロセシング酵素。

【請求項7】

リンカー配列が、１から３０、１から２５、１から２０又は１から１５のアミノ酸残基を有する、請求項２から６の何れか一項に記載のプロセシング酵素。

【請求項8】

リンカー配列が、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：４７及び配列番号：４８からなる群から選択される、請求項７に記載のプロセシング酵素。

【請求項9】

オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼから選択される、請求項１から８の何れか一項に記載のプロセシング酵素。

【請求項10】

請求項１から９の何れか一項に記載のプロセシング酵素をコードする核酸コンストラクト。

【請求項11】

請求項１から９の何れか一項に記載のプロセシング酵素の作製方法において、
ｉ）請求項１から９の何れか一項に記載のプロセシング酵素を発現させ、
ｉｉ）発現されたプロセシング酵素を陽イオン交換カラムに充填し、
ｉｉｉ）適切な溶離剤でプロセシング酵素を溶離させる
ことを含む方法。

【請求項12】

プロセシング酵素が、ＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼ、ＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ、ＴＥＶ及びＲＨＤＶ ３Ｃプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

標的タンパク質前躯体を修飾する方法において、請求項１から９の何れか一項に記載のＮ末端にタグがつけられたプロセシング酵素を標的タンパク質前躯体と反応させ、標的タンパク質をプロセシング酵素から分離する工程を含む方法。

【請求項14】

Ｎ末端にタグがつけられたプロセシング酵素と標的タンパク質前躯体を、発現後に標的タンパク質の分離を可能にする適切な宿主中で同時発現させる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記宿主が、バチルス、ストレプトマイセス及び大腸菌の株から選択される、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は好熱性細菌由来のアルカリタンパク質タグを含んでなる新規なプロセシング酵素に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物宿主細胞中における組換えタンパク質の発現はヒト治療用タンパク質の工業的生産に広く使用されている。融合パートナーは標的タンパク質のＮ末端（又はＣ末端）に結合させられ、標的タンパク質の発現レベル、溶解性又は正しい折り畳み性を増加させ、下流のプロセシングでの容易な精製を可能にする。標的タンパク質からの融合パートナーの除去が普通は標的タンパク質の生物学的活性を保存するために必要である。融合タンパク質のプロセシングは、融合パートナーを切断して標的タンパク質を切り離すことのできる適切なプロテアーゼを使用して、発現後又は一又は複数の初期精製工程後の何れかで実施できる。融合パートナーを伴うか伴わない組換え標的タンパク質は、一又は複数の酵素工程を使用してある種の生物学的特徴を得るために翻訳後に修飾される必要がまたありうる。かかる修飾には、マンノース、フコース又はキシロース糖類での望まれないグリコシル化の除去又はグリコシル化の導入が含まれる。修飾にはまた脱アミド化、アミド化、メチル化、リン酸化、脱リン酸化、硫酸化、アセチル化又はアミノ基転移が含まれうる。

【0003】

下流のプロセシング工程のコストを減少させるためには、プロセシング酵素の生産が安価で、例えば多い量で発現させることができ、少ない数のクロマトグラフィー工程で精製できることが極めて重要である。更に、融合タンパク質の切断に使用されるプロセシング酵素を、標的タンパク質のプロセシング後に容易に除去できることが望ましい。プロセシング酵素を精製カラムに固定化することができることもまた有利になりうることである。

【0004】

本発明は、融合タンパク質からの融合パートナーの切断を含む標的タンパク質の修飾に十分に適合した新規なプロセシング酵素を提供する。更に、新規なプロセシング酵素はプロセシング工程後に標的タンパク質から容易に分離させることができる。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、本発明は、好熱性細菌由来の高度に塩基性のリボソームタンパク質から誘導されたＮ末端に結合したタグを含んでなるプロセシング酵素に関する。
これらのタグの幾つかは同時係属出願のＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１４９３に開示されている。

【0006】

タグは可溶型タグつきプロセシング酵素の高収率での発現を容易にする。タグはまた単一の陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程後に高い純度を可能にし、また標的タンパク質前躯体のプロセシング後にタグつきプロセシング酵素の容易な除去を可能にする。タグはまたタグつきプロセシング酵素に対する固定化剤(immobilizer)として陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを使用するオンカラムプロセシングを可能にする。

【0007】

「高度に塩基性」なる表現は、高い割合の塩基性アミノ酸残基Ｌｙｓ及びＡｒｇを有しているタンパク質を意味し、例えばタンパク質中のアミノ酸残基の全数の少なくとも約１５％である。
「リボソームタンパク質」とはあらゆる生物におけるｍＲＮＡ指向性タンパク質合成を触媒する粒子であるリボソームのペプチド又はポリペプチドサブユニットを意味する。リボソームタンパク質は、ＩｎｔｅｒＰｒｏ及びＰｒｏｓｉｔｅのようなドメインデータベースにおいて報告されているようなリボソームサインによりその配列に基づいて定義される。リボソームタンパク質を使用する利点は、それらが殆どは非常に陽性に荷電していることである。

【0008】

本発明の文脈において、「好熱性微生物」とは、約５０℃から約１００℃で最適に成長する生物を意味する。これは、一般に３０−３７℃の温度で最適に成長する中温菌と対照的である。「好熱性細菌」なる用語はこの文脈では超好熱性細菌もまた包含する。

【0009】

一実施態様では、タグはシステイン残基を含まない。
更なる実施態様では、タグは約１５から約２５０、約１５から約２２５、１５から約２００、約１５から約１７５、約１５から約１５０、１５から約７５、又は約１５から約５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約１５から約２５０のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約１５から約２００のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約１５から約１５０のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約１５から約１００のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約１５から約５０のアミノ酸残基を有する。

【0010】

更なる実施態様では、タグは、約２０から約１２０、約２０から約１００、約２０から約９０、約２０から約７５のアミノ酸残基又は約２０から約５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約２０から約１２０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約２０から約１００のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約２０から約９０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約２０から約７５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約２０から約５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約２５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約２２５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約２００のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約１７５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約１５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約１２５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約１００のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約５０から約７５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約７５から約２５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約７５から約２２５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約７５から約２００のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約７５から約１７５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約７５から約１５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約７５から約１２５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約７５から約１００のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約１００から約２５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約１００から約２２５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約１００から約２００のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約１００から約１７５のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約１００から約１５０のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約１００から約１２５のアミノ酸残基を含む。

【0011】

タグは典型的には少なくとも約１５％の塩基性アミノ酸残基を含み、精製タグは約１５から約５０％、約１５から約４５％、約１５から約４０、約１５から約３５％、約１５から約３０％、約１５から約２５％又は約１５から約２０％の塩基性アミノ酸残基を含みうる。
他の実施態様では、タグは約２０から約５０％、約２０から約４０％又は約２０から約３０％の塩基性アミノ酸残基を含む。

【0012】

他の実施態様では、タグは約４０％から約５０％の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは約４０％から約６０％の塩基性アミノ酸残基，ｌｙｓ及びａｒｇを含む。
一実施態様では、タグは１５から５０％の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは１５から４５％の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは１５から４０％の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは１５から３５％の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは１５から３０％の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは１５から２５％の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは１５から２０％の塩基性アミノ酸残基を含む。

【0013】

一実施態様では、タグは、例えばＰｒｏｓｉｔｅデータベースに記載されているようなリボソームタンパク質Ｌ９ファミリーから誘導される（Hulo N., Bairoch A., Bulliard V., Cerutti L., De Castro E.,Langendijk-Genevaux P.S., Pagni M., Sigrist C.J.A.“ The PROSITE database.” Nucleic Acids Res. 34:D227-D230（2006)。

【0014】

本発明の一実施態様では、タグは、次のものからなるペプチド配列群から選択される： ＭＳＫＴＩＶＲＫＮＥＳＩＤＤＡＬＲＲＦＫＲＡＶＳＫＴＧＴＬＱＥＶＲＫＲＥＦＹＥＫＰＳＶＲＲＫＫＫＳＥＡＡＲＫＲＫ（配列番号：１）；
ＭＧＫＫＴＶＧＶＫＫＲＬＡＫＡＹＫＱＮＲＲＡＰＶＷＩＴＶＫＴＫＲＳＶＦＧＳＰＫＲＲＨＷＲＲＳＫＬＫＶ（配列番号：２）；
ＭＫＲＴＹＱＰＳＲＲＫＲＫＲＴＨＧＦＬＡＲＫＲＴＰＧＧＲＲＶＬＫＮＲＲＲＫＧＲＷＲＬＴＶ（配列番号：３）；
ＭＧＫＧＤＲＲＴＲＲＧＫＩＷＲＧＴＹＧＫＹＲＰＲＫＫＫ（配列番号：４）；
ＭＡＫＶＫＭＫＴＮＲＳＡＡＫＲＦＫＶＴＡＫＧＫＩＫＲＷＫＳＧＧＡＨＹＮＴＫＫＳＳＫＲＫＲＨＬＲＫＨＴＹＶＫＤＮＭＬＫＨＶＫＡＬＬＫＥＦ（配列番号：５）；
ＭＰＫＨＳＫＲＹＬＥＡＲＫＬＶＤＲＴＫＹＹＤＬＤＥＡＩＥＬＶＫＫＴＡＴＡＫＦＤＥＴＩＥＬＨＩＱＴＧＩＤＹＲＫＰＥＱＨＩＲＧＴＩＶＬＰＨＧＴＧＫＥＶＫＶＬＶＦＡＫＧＥＫＡＫＥＡＬＥＡＧＡＤＹＶＧＡＥＤＬＶＥＫＩＥＫＥＧＦＬＤＦＤＶＡＩＡＴＰＤＭＭＲＩＩＧＲＬＧＫＩＬＧＰＲＧＬＭＰＳＰＫＳＧＴＶＴＱＥＶＡＥＡＶＫＥＦＫＫＧＲＩＥＶＲＴＤＫＴＧＮＩＨＩＰＶＧＫＲＳＦＤＮＥＫＬＫＥＮＩＩＡＡＩＫＱＩＭＱＭＫＰＡＧＶＫＧＱＦＩＫＫＶＶＬＡＳＴＭＧＰＧＩＫＬＮＬＱＳＬＬＫＥ（配列番号：６），
ＭＡＱＶＤＬＬＮＶＫＧＥＫＶＧＴＬＥＩＳＤＦＶＦＮＩＤＰＮＹＤＶＭＷＲＹＶＤＭＱＬＳＮＲＲＡＧＴＡＳＴＫＴＲＧＥＶＳＧＧＧＲＫＰＷＰＱＫＨＴＧＲＡＲＨＧＳＩＲＳＰＩＷＲＨＧＧＶＶＨＧＰＫＰＲＤＷＳＫＫＬＮＫＫＭＫＫＬＡＬＲＳＡＬＳＶＫＹＲＥＮＫＬＬＶＬＤＤＬＫＬＥＲＰＫＴＫＳＬＫＥＩＬＱＮＬＱＬＳＤＫＫＴＬＩＶＬＰＷＫＥＥＧＹＭＮＶＫＬＳＧＲＮＬＰＤＶＫＶＩＩＡＤＮＰＮＮＳＫＮＧＥＫＡＶＲＩＤＧＬＮＶＦＤＭＬＫＹＤＹＬＶＬＴＲＤＭＶＳＫＩＥＥＶＬＧＮＥＡＧＫＡＬＴＡ（配列番号：７），
ＭＲＹＥＹＶＰＬＫＤＱＹＥＫＥＩＶＰＡＬＭＫＥＦＮＹＫＮＩＨＱＶＰＫＬＶＫＩＶＩＮＭＧＩＧＥＧＳＲＮＹＤＬＩＥＲＨＡＮＥＬＡＫＩＴＧＱＫＰＩＶＴＲＡＲＫＳＩＳＮＦＫＩＲＫＧＭＰＩＧＬＫＶＴＬＲＧＡＲＭＹＮＦＬＹＫＬＩＮＩＶＬＰＫＶＲＤＦＲＧＬＤＰＮＳＦＤＧＲＧＮＹＳＦＧＬＳＥＱＬＶＦＰＥＬＮＰＤＥＶＲＲＩＱＧＭＤＩＴＩＶＴＴＡＫＴＤＱＥＡＲＲＬＬＥＬＦＧＭＰＦＫＲＧ（配列番号：８），
ＭＳＲＬＡＫＫＰＩＶＬＰＱＧＶＴＶＥＩＫＤＮＶＶＫＶＫＧＰＫＧＥＬＳＱＥＦＬＰＹＶＫＩＥＶＥＧＮＥＶＷＶＲＰＮＥＥＱＩＩＲＫＳＤＷＲＫＶＫＭＦＱＧＴＹＷＳＬＩＲＮＭＶＶＧＶＴＥＧＹＫＫＥＬＥＩＶＧＩＧＹＲＡＱＬＱＧＮＴＬＶＭＮＬＧＹＡＨＰＶＶＹＥＩＰＳＤＶＫＩＥＶＰＡＰＮＲＩＩＶＳＧＩＤＫＱＲＶＧＱＶＡＡＥＩＲＡＦＲＰＰＮＶＹＴＧＫＧＩＲＹＶＧＥＶＶＲＱＫＥＧＫＫＡ（配列番号：９），
ＭＫＶＩＬＬＲＤＶＰＫＩＧＫＫＧＥＩＫＥＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＲＧＦＡＫＥＹＴＥＧＬＥＲＡＩＫＨＥＫＥＩＥＫＲＫＫＥＲＥＲＥＥＳＥＫＩＬＫＥＬＫＫＲＴＨＶＶＫＶＫＡＧＥＧＧＫＩＦＧＡＶＴＡＡＴＶＡＥＥＩＳＫＴＴＧＬＫＬＤＫＲＷＦＫＬＤＫＰＩＫＥＬＧＥＹＳＬＥＶＳＬＰＧＧＶＫＤＴＩＫＩＲＶＥＲＥＥ（配列番号：１０），
ＭＬＴＲＱＱＫＥＬＩＶＫＥＭＳＥＩＦＫＫＴＳＬＩＬＦＡＤＦＬＧＦＴＶＡＤＬＴＥＬＲＳＲＬＲＥＫＹＧＤＧＡＲＦＲＶＶＫＮＴＬＬＮＬＡＬＫＮＡＥＹＥＧＹＥＥＦＬＫＧＰＴＡＶＬＹＶＴＥＧＤＰＶＥＡＶＫＩＩＹＮＦＹＫＤＫＫＡＤＬＳＲＬＫＧＧＦＬＥＧＫＫＦＴＡＥＥＶＥＮＩＡＫＬＰＳＫＥＥＬＹＡＭＬＶＧＲＶＫＡＰＩＴＧＬＶＦＡＬＳＧＩＬＲＮＬＶＹＶＬＮＡＩＫＥＫＫＳＥ（配列番号：１１），
ＭＡＲＹＦＰＶＱＫＴＴＭＩＫＰＥＥＶＥＲＫＷＹＶＶＤＡＳＧＫＶＬＧＲＬＡＴＲＩＡＫＩＬＭＧＫＨＫＰＮＹＴＰＨＶＤＴＧＤＹＶＩＶＶＮＡＤＫＶＶＬＴＧＫＫＬＤＱＫＶＹＹＷＨＳＧＹＰＧＧＬＫＳＬＴＡＲＱＭＬＥＫＨＰＥＲＬＩＷＬＡＶＫＲＭＬＰＫＮＲＫＧＲＫＭＬＫＲＬＫＶＹＡＳＰＥＨＰＨＱＡＱＫＰＥＰＩＥＬ（配列番号：１２），
ＭＲＬＥＤＬＲＰＴＰＧＡＭＫＫＲＫＲＶＧＲＧＰＧＳＧＨＧＫＴＳＧＲＧＨＫＧＱＫＡＲＧＳＧＫＶＨＩＷＦＥＧＧＱＴＰＬＱＲＲＬＰＫＲＧＦＫＮＩＮＫＫＶＹＡＶＶＮＶＫＶＬＥＥＲＦＥＡＮＥＥＶＴＰＥＫＬＩＥＲＫＩＩＫＤＬＫＤＧＶＫＩＬＧＤＧＥＬＴＫＰＬＶＶＫＡＨＡＦＳＫＳＡＶＥＫＩＥＳＡＧＧＫＡＥＶＩ（配列番号：１３），
ＭＲＨＲＶＫＲＨＫＬＧＲＹＧＳＨＲＫＳＬＬＲＮＬＳＲＥＩＶＥＨＧＳＩＶＴＴＴＡＫＡＫＡＬＫＴＦＭＤＫＬＶＳＫＡＩＥＡＡＴＴＤＤＲＡＲＳＶＨＬＲＲＱＩＮＡＶＬＧＤＲＲＬＴＮＫＬＶＤＥＩＡＫＮＹＶＧＲＲＧＧＹＶＲＶＬＲＩＧＦＲＲＧＤＡＡＥＭＳＬＶＱＬＶＥＡＳＳＱＥＧ（配列番号：１４），
ＭＤＨＬＶＫＩＩＥＫＫＹＥＫＫＥＩＰＤＦＲＰＧＤＴＶＲＶＨＶＫＶＩＥＧＤＲＥＲＴＱＶＦＥＧＩＶＩＡＫＲＧＳＧＩＮＫＴＦＴＶＲＲＩＧＳＨＧＶＧＶＥＲＩＦＰＶＨＳＰＶＶＥＫＩＥＶＶＲＫＧＫＶＲＲＡＫＬＹＹＬＲＮＶＲＧＫＩＲＩＫＥＲＲＤ（配列番号：１５），
ＭＲＶＫＲＡＶＨＡＫＫＫＲＫＫＹＬＫＡＡＫＧＹＲＧＡＬＳＲＲＹＫＬＡＫＱＭＹＶＲＳＫＷＹＳＹＶＧＲＫＱＫＫＲＤＭＲＫＬＷＩＴＲＩＮＩＡＡＲＮＥＧＬＫＹＳＥＬＩＨＧＬＫＬＡＧＶＳＩＮＲＫＭＬＳＥＬＡＶＮＤＰＥＡＦＫＥＹＶＫＩＡＫＥＡＬＡＳ（配列番号：１６），
ＭＬＹＡＩＶＥＴＡＧＲＱＹＲＶＥＥＧＫＩＬＹＴＥＫＱＫＤＹＳＰＧＤＥＩＶＦＤＲＶＶＦＶＲＫＤＧＥＶＬＶＧＫＰＹＶＥＧＡＫＶＶＧＫＶＬＥＨＡＫＡＲＫＶＫＴＶＫＹＲＰＲＫＮＳＫＶＥＫＧＨＲＱＷＹＴＡＩＫＩＥＫＩＥＬ（配列番号：１７），
ＭＫＱＥＫＬＳＬＨＤＶＬＩＲＰＩＩＴＥＫＡＬＩＬＲＥＱＲＫＹＶＦＥＶＮＰＬＡＮＫＮＬＶＫＥＡＶＥＫＬＦＮＶＫＶＥＫＶＮＩＬＮＭＫＰＫＰＫＲＲＧＩＦＥＧＫＴＲＳＷＫＫＡＶＶＴＬＫＥＧＹＴＩＫＥＬＥＧＥＨ（配列番号：１８），
ＭＡＨＫＫＳＧＧＶＡＫＮＧＲＤＳＬＰＫＹＬＧＶＫＶＧＤＧＱＩＶＫＡＧＮＩＬＶＲＱＲＧＴＲＦＹＰＧＫＮＶＧＭＧＲＤＦＴＬＦＡＬＫＤＧＲＶＫＦＥＴＫＮＮＫＫＹＶＳＶＹＥＥ（配列番号：１９），
ＭＫＡＳＥＬＲＮＹＴＤＥＥＬＫＮＬＬＥＥＫＫＲＱＬＭＥＬＲＦＱＬＡＭＧＱＬＫＮＴＳＬＩＫＬＴＫＲＤＩＡＲＩＫＴＩＬＲＥＲＥＬＧＩＲＲ（配列番号：２０），
ＭＰＫＫＬＫＩＫＬＶＫＳＰＩＧＹＳＷＤＱＫＤＴＶＫＲＬＧＬＫＫＬＮＱＶＶＩＫＤＤＬＰＱＩＲＧＭＩＲＫＶＫＨＬＶＥＶＥＥＩＥＥＧＧＳＮＡ（配列番号：２１），
ＭＰＫＶＫＴＮＲＳＡＡＫＲＦＲＩＴＫＮＧＫＩＭＲＮＨＡＹＲＳＨＫＴＧＫＫＲＲＮＡＬＲＡＬＲＫＫＤＶＶＳＳＡＤＫＮＲＶＬＲＬＬＧＫＫ（配列番号：２２），
ＭＧＱＫＶＨＰＲＧＦＲＬＧＬＳＡＤＷＱＡＫＷＦＮＥＫＮＹＫＥＷＬＬＥＤＥＥＩＲＫＩＩＫＮＫＹＹＨＡＧＩＳＥＩＹＶＥＲＰＤＡＥＲＩＮＩＴＶＫＴＡＲＰＧＩＩＩＧＲＫＧＳＥＩＴＳＬＲＥＥＬＥＲＫＦＮＲＲＶＶＩＮＩＥＥＩＫＴＰＥＬＤＡＱＬＶＡＥＳＩＡＳＲＩＥＫＲＡＳＹＫＶＡＭＫＲＡＩＭＮＡＭＲＫＧＡＱＧＩＫＶＭＶＡＧＲＬＧＧＡＥＩＡＲＲＥＷＹＬＲＧＲＬＰＬＱＫＩＫＡＩＩＤＹＧＴＡＴＡＷＴＫＹＧＴＩＧＩＫＶＷＩＹＫＧＤＡＤＩ（配列番号：２３），
ＭＥＴＱＧＶＭＫＥＩＱＹＥＥＦＥＥＫＩＩＥＩＲＲＴＳＫＶＴＫＧＧＫＮＬＳＦＲＶＶＡＩＶＧＮＫＮＧＫＶＧＬＧＩＧＫＡＲＥＶＰＥＡＩＲＫＡＩＳＡＡＫＲＮＩＶＥＶＰＶＩＮＧＴＩＰＨＥＶＩＧＲＱＤＡＳＫＶＬＬＫＰＡＡＰＧＴＧＩＩＡＧＧＴＶＲＡＶＶＥＬＡＧＩＱＮＩＬＴＫＳＬＧＳＴＮＰＬＮＬＡＬＡＴＭＮＧＬＫＮＬＬＤＰＲＫＶＡＫＬＲＤＩＳＶＥＥＶＦＫＧＶＲＲＥＮＮＡ（配列番号：２４），
ＭＶＳＬＤＰＥＫＫＮＥＩＩＫＥＦＱＩＨＥＮＤＴＧＳＶＥＶＱＩＡＬＬＴＡＲＩＫＨＬＴＥＨＬＲＫＨＰＫＤＦＨＳＲＲＧＬＭＫＭＩＧＲＲＲＫＭＬＫＹＬＲＨＫＫＰＥＶＹＲＥＬＩＡＫＬＧＩＲＫ（配列番号：２５），
ＭＧＲＳＲＫＫＧＰＹＶＤＲＫＬＬＥＫＩＲＫＬＮＥＴＧＥＫＫＶＩＫＴＷＳＲＡＳＭＩＩＰＥＭＶＧＨＴＩＡＶＹＮＧＭＫＨＩＰＶＹＩＴＥＮＭＩＧＨＲＬＧＥＦＡＰＴＲＲＦＧＧＨＡＤＫＫＡＫＫＧＥＬＫＫ（配列番号：２６）及び
ＭＰＮＩＫＳＡＫＫＲＶＲＶＳＥＫＲＲＬＲＮＫＡＹＫＴＦＦＫＮＲＩＫＥＶＬＫＡＩＥＮＫＥＰＫＥＶＶＬＥＬＴＲＫＡＱＡＡＩＤＫＡＶＳＫＧＶＩＨＫＮＱＧＡＲＲＫＡＲＬＦＥＫＶＮＥＹＬＲＴＬＥＴＴＱＥ（配列番号２７）。

【0015】

他の実施態様では、タグは次のものからなる群から選択される：
ＭＫＱＥＫＬＳＬＨＤＶＬＩＲＰＩＩＴＥＫＡＬＩＬＲＥＱＲＫＹＶＦＥＶＮＰＬＡＮＫＮＬＶＫＥＡＶＥＫＬＦＮＶＫＶＥＫＶＮＩＬＮＭＫＰＫＰＫＲＲＧＩＦＥＧＫＴＲＳＷＫＫＡＶＶＴＬＫＥＧＹＴＩＫＥＬＥＧＥＨ（配列番号：１８）及び
ＭＡＨＫＫＳＧＧＶＡＫＮＧＲＤＳＬＰＫＹＬＧＶＫＶＧＤＧＱＩＶＫＡＧＮＩＬＶＲＱＲＧＴＲＦＹＰＧＫＮＶＧＭＧＲＤＦＴＬＦＡＬＫＤＧＲＶＫＦＥＴＫＮＮＫＫＹＶＳＶＹＥＥ（配列番号：１９）。

【0016】

他の実施態様では、タグは次のものからなる群から選択される：
ＭＫＶＩＬＬＲＤＶＰＫＩＧＫＫＧＥＩＫＥＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＲＧＦＡＫＥＹＴＥＧＬＥＲＡＩＫＨＥＫＥＩＥＫＲＫＫＥＲＥＲＥＥＳＥＫＩＬＫＥＬＫＫＲＴＨＶＶＫＶＫＡＧＥＧＧＫＩＦＧＡＶＴＡＡＴＶＡＥＥＩＳＫＴＴＧＬＫＬＤＫＲＷＦＫＬＤＫＰＩＫＥＬＧＥＹＳＬＥＶＳＬＰＧＧＶＫＤＴＩＫＩＲＶＥＲＥＥ（配列番号：１０）；ＭＤＨＬＶＫＩＩＥＫＫＹＥＫＫＥＩＰＤＦＲＰＧＤ−ＴＶＲＶＨＶＫＶＩＥＧＤＲＥＲＴＱＶＦＥＧＩＶＩＡＫＲＧＳＧＩＮＫＴＦＴＶＲＲＩＧＳＨＧＶＧＶＥＲＩＦＰＶＨＳＰＶＶＥＫＩＥＶＶＲＫＧＫＶＲＲＡＫＬＹＹＬＲＮＶＲＧＫＩＲＩＫＥＲＲＤ（配列番号：１５）及びＭＳＫＴＩＶＲＫＮＥＳＩＤＤＡＬＲＲＦＫＲＡＶＳＫＴＧＴＬＱＥＶＲＫＲＥＦＹＥＫＰＳＶＲＲＫＫＫＳＥＡＡＲＫＲＫ（配列番号：１）。

【0017】

他の実施態様では、タグは次のものからなる群から選択される：
ＭＰＫＨＳＫＲＹＬＥＡＲＫＬＶＤＲＴＫＹＹＤＬＤＥＡＩＥＬＶＫＫＴＡＴＡＫＦＤＥＴＩＥＬＨＩＱＴＧＩＤＹＲＫＰＥＱＨＩＲＧＴＩＶＬＰＨＧＴＧＫＥＶＫＶＬＶＦＡＫＧＥＫＡＫＥＡＬＥＡＧＡＤＹＶＧＡＥＤＬＶＥＫＩＥＫＥＧＦＬＤＦＤＶＡＩＡＴＰＤＭＭＲＩＩＧＲＬＧＫＩＬＧＰＲＧＬＭＰＳＰＫＳＧＴＶＴＱＥＶＡＥＡＶＫＥＦＫＫＧＲＩＥＶＲＴＤＫＴＧＮＩＨＩＰＶＧＫＲＳＦＤＮＥＫＬＫＥＮＩＩＡＡＩＫＱＩＭＱＭＫＰＡＧＶＫＧＱＦＩＫＫＶＶＬＡＳＴＭＧＰＧＩＫＬＮＬＱＳＬＬＫＥ（配列番号：６）；
ＭＡＱＶＤＬＬＮＶＫＧＥＫＶＧＴＬＥＩＳＤＦＶＦＮＩＤＰＮＹＤＶＭＷＲＹＶＤＭＱＬＳＮＲＲＡＧＴＡＳＴＫＴＲＧＥＶＳＧＧＧＲＫＰＷＰＱＫＨＴＧＲＡＲＨＧＳＩＲＳＰＩＷＲＨＧＧＶＶＨＧＰＫＰＲＤＷＳＫＫＬＮＫＫＭＫＫＬＡＬＲＳＡＬＳＶＫＹＲＥＮＫＬＬＶＬＤＤＬＫＬＥＲＰＫＴＫＳＬＫＥＩＬＱＮＬＱＬＳＤＫＫＴＬＩＶＬＰＷＫＥＥＧＹＭＮＶＫＬＳＧＲＮＬＰＤＶＫＶＩＩＡＤＮＰＮＮＳＫＮＧＥＫＡＶＲＩＤＧＬＮＶＦＤＭＬＫＹＤＹＬＶＬＴＲＤＭＶＳＫＩＥＥＶＬＧＮＥＡＧＫＡＬＴＡ（配列番号：７），
ＭＳＲＬＡＫＫＰＩＶＬＰＱＧＶＴＶＥＩＫＤＮＶＶＫＶＫＧＰＫＧＥＬＳＱＥＦＬＰＹＶＫＩＥＶＥＧＮＥＶＷＶＲＰＮＥＥＱＩＩＲＫＳＤＷＲＫＶＫＭＦＱＧＴＹＷＳＬＩＲＮＭＶＶＧＶＴＥＧＹＫＫＥＬＥＩＶＧＩＧＹＲＡＱＬＱＧＮＴＬＶＭＮＬＧＹＡＨＰＶＶＹＥＩＰＳＤＶＫＩＥＶＰＡＰＮＲＩＩＶＳＧＩＤＫＱＲＶＧＱＶＡＡＥＩＲＡＦＲＰＰＮＶＹＴＧＫＧＩＲＹＶＧＥＶＶＲＱＫＥＧＫＫＡ（配列番号：９），
ＭＧＱＫＶＨＰＲＧＦＲＬＧＬＳＡＤＷＱＡＫＷＦＮＥＫＮＹＫＥＷＬＬＥＤＥＥＩＲＫＩＩＫＮＫＹＹＨＡＧＩＳＥＩＹＶＥＲＰＤＡＥＲＩＮＩＴＶＫＴＡＲＰＧＩＩＩＧＲＫＧＳＥＩＴＳＬＲＥＥＬＥＲＫＦＮＲＲＶＶＩＮＩＥＥＩＫＴＰＥＬＤＡＱＬＶＡＥＳＩＡＳＲＩＥＫＲＡＳＹＫＶＡＭＫＲＡＩＭＮＡＭＲＫＧＡＱＧＩＫＶＭＶＡＧＲＬＧＧＡＥＩＡＲＲＥＷＹＬＲＧＲＬＰＬＱＫＩＫＡＩＩＤＹＧＴＡＴＡＷＴＫＹＧＴＩＧＩＫＶＷＩＹＫＧＤＡＤＩ（配列番号：２３）及び
ＭＥＴＱＧＶＭＫＥＩＱＹＥＥＦＥＥＫＩＩＥＩＲＲＴＳＫＶＴＫＧＧＫＮＬＳＦＲＶＶＡＩＶＧＮＫＮＧＫＶＧＬＧＩＧＫＡＲＥＶＰＥＡＩＲＫＡＩＳＡＡＫＲＮＩＶＥＶＰＶＩＮＧＴＩＰＨＥＶＩＧＲＱＤＡＳＫＶＬＬＫＰＡＡＰＧＴＧＩＩＡＧＧＴＶＲＡＶＶＥＬＡＧＩＱＮＩＬＴＫＳＬＧＳＴＮＰＬＮＬＡＬＡＴＭＮＧＬＫＮＬＬＤＰＲＫＶＡＫＬＲＤＩＳＶＥＥＶＦＫＧＶＲＲＥＮＮＡ（配列番号：２４）。

【0018】

他の実施態様では、タグは次のものからなる群から選択される：
ＭＫＶＩＬＬＲＤＶＰＫＩＧＫＫＧＥＩＫＥＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＲＧＦＡＫＥＹＴＥＧＬＥＲＡＩＫＨＥＫＥＩＥＫＲＫＫＥＲＥＲＥＥＳＥＫＩＬＫＥＬＫＫＲＴＨＶＶＫＶＫＡＧＥＧＧＫＩＦＧＡＶＴＡＡＴＶＡＥＥＩＳＫＴＴＧＬＫＬＤＫＲＷＦＫＬＤＫＰＩＫＥＬＧＥＹＳＬＥＶＳＬＰＧＧＶＫＤＴＩＫＩＲＶＥＲＥＥ（配列番号：１０）；
ＭＫＶＩＬＬＥＰＬＥＮＬＧＤＶＧＱＶＶＤＶＫＰＧＹＡＲＮＹＬＬＰＲＧＬＡＶＬＡＴＥＳＮＬＫＡＬＥＡＲＩＲＡＱＡＫＲＬＡＥＲＫＡＥＡＥＲＬＫＥＩＬＥＮＬＴＬＴＩＰＶＲＡＧＥＴＫＩＹＧＳＶＴＡＫＤＩＡＥＡＬＳＲＱＨＧＩＴＩＤＰＫＲＬＡＬＥＫＰＩＫＥＬＧＥＹＶＬＴＹＫＰＨＰＥＶＰＩＱＬＫＶＳＶＶＡＱＥ（配列番号：４１）；
ＭＫＶＩＦＬＫＤＶＫＧＫＧＫＫＧＥＩＫＤＶＡＤＧＹＡＮＮＦＬＦＫＱＧＬＡＩＥＡＴＰＡＮＩＫＡＬＥＡＱＫＱＫＥＱＲＱＡＡＥＥＬＡＮＡＫＫＬＫＥＥＬＥＫＬＴＶＥＩＰＡＫＡＧＥＧＧＲＬＦＧＳＩＴＳＫＱＩＡＥＡＬＱＡＱＨＧＬＫＬＤＫＲＫＩＥＬＡＤＡＩＲＳＬＧＹＴＮＶＰＶＫＬＨＰＥＶＴＡＴＬＫＶＨＶＫＥＱＫ（配列番号：４２）；
ＭＫＶＶＬＬＫＤＶＳＫＩＧＫＫＧＥＩＫＮＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＫＧＬＡＬＥＡＴＰＲＶＬＫＲＬＥＡＥＫＲ−ＫＫＥＥＥＫＩＱＩＫＴＱＮＥＥＬＬＫＭＬＫＫＦＬＹＫＩＰＶＫＡＧＥＳＧＫＬＦＧＡＬＴＮＳＤＩＡＫＡＶＥＫＩＡＤＶＮＩＤＫＫＦＩＶＬＥＫＰＩＫＥＩＧＭＹＤＶＬＶＲＬＰＥＧＶＳＧＫＩＫＶＥＶＩＱＥＧＫＮ（配列番号：４３）及び
ＭＫＬＩＬＴＱＥＶＡＧＬＧＧＰＧＤＶＶＥＶＲＤＧＹＧＲＮＹＬＬＰＫＲＬＡＭＰＡＳＰＧＡＶＫＱＶＡＬＩＫＲＡＲＥＶＲＥＩＲＤＬＤＱＡＲＡＬＲＤＱＬＥＡＬＰＶＴＬＰＡＲＡＧＳＧＧＲＬＦＧＳＶＴＰＤＤＩＡＡＡＶＨＡＡＧＧＰＫＬＤＫＲＲＩＥＩＳＧＰＩＫＴＩＧＳＨＱＶＴＶＲＬＨＰＥＶＳＡＴＶＳＶＥＶＶＰＡＳ（配列番号：４４）。

【0019】

更なる実施態様では、タグは配列ＭＫＱＥＫＬＳＬＨＤＶＬＩＲＰＩＩＴＥＫＡＬＩＬ ＲＥＱＲＫＹＶＦＥＶＮＰＬＡＮＫＮＬＶＫＥＡＶＥＫＬＦＮＶＫＶＥＫＶＮＩＬＮＭＫＰＫＰＫＲＲＧＩＦＥＧＫＴＲＳＷＫＫＡＶＶＴＬＫＥＧＹＴＩＫＥＬＥＧＥＨ（配列番号：１８）を有している。
更なる実施態様では、タグは配列ＭＡＨＫＫＳＧＧＶＡＫＮＧＲＤＳＬＰＫＹＬＧＶＫＶＧＤＧＱＩＶＫＡＧＮＩＬＶＲＱＲＧＴＲＦＹＰＧＫＮＶＧＭＧＲＤＦＴＬＦＡＬＫＤＧＲＶＫＦＥＴＫＮＮＫＫＹＶＳＶＹＥＥ（配列番号：１９）を有している。

【0020】

更なる実施態様では、タグは配列ＭＤＨＬＶＫＩＩＥＫＫＹＥＫＫＥＩＰＤＦＲＰＧＤＴＶＲＶＨＶＫＶＩＥＧＤＲＥＲＴＱＶＦＥＧＩＶＩＡＫＲＧＳＧＩＮＫＴＦＴＶＲＲＩＧＳＨＧＶＧＶＥＲＩＦＰＶＨＳＰＶＶＥＫＩＥＶＶＲＫＧＫＶＲＲＡＫＬＹＹＬＲＮＶＲＧＫＩＲＩＫＥＲＲＤ（配列番号：１５）を有している。
更なる実施態様では、タグは配列ＭＫＶＩＬＬＲＤＶＰＫＩＧＫＫＧＥＩＫＥＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＲＧＦＡＫＥＹＴＥＧＬＥＲＡＩＫＨＥＫＥＩＥＫＲＫＫＥＲＥＲＥＥＳＥＫＩＬＫＥＬＫＫＲＴＨＶＶＫＶＫＡＧＥＧＧＫＩＦＧＡＶＴＡＡＴＶＡＥＥＩＳＫＴＴＧＬＫＬＤＫＲＷＦＫＬＤＫＰＩＫＥＬＧＥＹＳＬＥＶＳＬＰＧＧＶＫＤＴＩＫＩＲＶＥＲＥＥ（配列番号：１０）を有している。

【0021】

更なる実施態様では、タグは配列ＭＫＶＩＬＬＥＰＬＥＮＬＧＤＶＧＱＶＶＤＶＫＰＧＹＡＲＮＹＬＬＰＲＧＬＡＶＬＡＴＥＳＮＬＫＡＬＥＡＲＩＲＡＱＡＫＲＬＡＥＲＫＡＥＡＥＲＬＫＥＩＬＥＮＬＴＬＴＩＰＶＲＡＧＥＴＫＩＹＧＳＶＴＡＫＤＩＡＥＡＬＳＲＱＨＧＩＴＩＤＰＫＲＬＡＬＥＫＰＩＫＥＬＧＥＹＶＬＴＹＫＰＨＰＥＶＰＩＱＬＫＶＳＶＶＡＱＥ（配列番号：４１）を有している。
更なる実施態様では、タグは配列ＭＫＶＩＦＬＫＤＶＫＧＫＧＫＫＧＥＩＫＤＶＡＤＧＹＡＮＮＦＬＦＫＱＧＬＡＩＥＡＴＰＡＮＩＫＡＬＥＡＱＫＱＫＥＱＲＱＡＡＥＥＬＡＮＡＫＫＬＫＥＥＬＥＫＬＴＶＥＩＰＡＫＡＧＥＧＧＲＬＦＧＳＩＴＳＫＱＩＡＥＡＬＱＡＱＨＧＬＫＬＤＫＲＫＩＥＬＡＤＡＩＲＳＬＧＹＴＮＶＰＶＫＬＨＰＥＶＴＡＴＬＫＶＨＶＫＥＱＫ（配列番号：４２）を有している。

【0022】

更なる実施態様では、タグは配列ＭＫＶＶＬＬＫＤＶＳＫＩＧＫＫＧＥＩＫＮＶＳＤＧＹＡＲＮＹＬＩＰＫＧＬＡＬＥＡＴＰＲＶＬＫＲＬＥＡＥＫＲＫＫＥＥＥＫＩＱＩＫＴＱＮＥＥＬＬＫＭＬＫＫＦＬＹＫＩＰＶＫＡＧＥＳＧＫＬＦＧＡＬＴＮＳＤＩＡＫＡＶＥＫＩＡＤＶＮＩＤＫＫＦＩＶＬＥＫＰＩＫＥＩＧＭＹＤＶＬＶＲＬＰＥＧＶＳＧＫＩＫＶＥＶＩＱＥＧＫＮ（配列番号：４３）を有している。
更なる実施態様では、タグは配列ＭＫＬＩＬＴＱＥＶＡＧＬＧＧＰＧＤＶＶＥＶＲＤＧＹＧＲＮＹＬＬＰＫＲＬＡＭＰＡＳＰＧＡＶＫＱＶＡＬＩＫＲＡＲＥＶＲＥＩＲＤＬＤＱＡＲＡＬＲＤＱＬＥＡＬＰＶＴＬＰＡＲＡＧＳＧＧＲＬＦＧＳＶＴＰＤＤＩＡＡＡＶＨＡＡＧＧＰＫＬＤＫＲＲＩＥＩＳＧＰＩＫＴＩＧＳＨＱＶＴＶＲＬＨＰＥＶＳＡＴＶＳＶＥＶＶＰＡＳ（配列番号：４４）を有している。

【0023】

タグは当該プロセシング酵素中のＮ末端アミノ酸に直接又はリンカー基を介して結合されうる。かかるリンカー基は、多目的機能、つまり、プロセシング酵素へのタグの付着の容易化及びプロセシング酵素の正確な折り畳みを可能にするようにタグとプロセシング酵素を相対的に位置決めする機能を有しうる。リンカーはまたタグつきプロセシング酵素の精製に使用される精製マトリックスに好ましい形でタグを提示する機能も有しうる。

【0024】

リンカーは、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１４、１−１３、１−１２、１−１１、１−１０、１−９、１−８、１−７、１−６、１−５のアミノ、１−４又は１−３のアミノ残基を有しうる。
更なる実施態様では、リンカーは、２−３０、２−２５、２−２０、２−１５、２−１４、２−１３、２−１２、２−１１、２−１０、２−９、２−８、２−７、２−６、２−５又は２−４のアミノ酸残基を有しうる。

【0025】

更なる実施態様では、リンカーは、３−３０、３−２５、３−２０、３−１５、３−１４、３−１３、３−１２、３−１１、３−１０、３−９、３−８、３−７、３−６、３−５又は３−４のアミノ酸残基を有しうる。
更なる実施態様では、リンカーは、４−３０、４−２５、４−２０、４−１５、４−１４、４−１３、４−１２、４−１１、４−１０、４−９、４−８、４−７、４−６又は４−５のアミノ酸残基を有しうる。

【0026】

更なる実施態様では、リンカーは、５−３０、５−２５、５−２０、５−１５、５−１４、５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７又は５−６のアミノ酸残基を有しうる。
更なる実施態様では、リンカーは、６−３０、６−２５、６−２０、６−１５、６−１４、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８又は６−７のアミノ酸残基を有しうる。
更なる実施態様では、リンカーは、７−３０、７−２５、７−２０、７−１５、７−１４、７−１３、７−１２、７−１１、７−１０、７−９又は６−８のアミノ酸残基を有しうる。

【0027】

一実施態様では、リンカーは２０のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは１５のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは１２のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは１０のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは９のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは８のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは７のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは６のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは５のアミノ酸残基を有している。

【0028】

リンカー中のアミノ酸残基は任意のアミノ酸残基であり得、リンカーの意図された機能に応じて同じでも異なっていてもよい。
一実施態様では、リンカーは、リンカーを可撓性ある構造にするアミノ酸残基、例えば交互のＳｅｒ及びＧｌｙ残基を含むであろう。他のアミノ酸残基、つまりＡｌａ及びＬｅｕのようなアルファ螺旋構造を形成しうるアミノ酸は剛性構造を生じる。更に、ある種のアミノ酸残基、例えばＰｒｏはリンカーに構造的屈曲性を加える。

【0029】

リンカー基の非限定的な例は、ＳＳＳＧＳＳＧＳＳＧＳＳ（配列番号；２８）、ＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号：２９）、ＳＳＳＧＳＧＳＧ（配列番号：３０）、ＡＬＡＬＡＬＡ（配列番号：３１）、ＡＬＡＬＡＬＡＰＡ（配列番号：３２）、ＳＳＳＡＬＡＬＡＬＡ（配列番号：３３）；ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：３４）、ＳＳＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号：４７）及びＧＳＳＧＳＧＳ（配列番号：４８）である。

【0030】

一実施態様では、リンカーは配列ＳＳＳＧＳＳＧＳＳＧＳＳ（配列番号；２８）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号：２９）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＳＳＳＧＳＧＳＧ（配列番号：３０）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＡＬＡＬＡＬＡ（配列番号：３１）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＡＬＡＬＡＬＡＰＡ（配列番号：３２）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＳＳＳＡＬＡＬＡＬＡ（配列番号：３３）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：３４）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＳＳＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号：４７）を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ＧＳＳＧＳＧＳ（配列番号：４８）を有している。

【0031】

一実施態様では、上述のタグは、同じか又は異なっていてもよい二つのタグの組合せであってもよい。またタグは特に開示されたタグのアナログ(類似体)であってもよい。「アナログ」とは元の配列と比較して１０％までの変異を有する配列を意味する。かかる変異は、かかる変異がタグの元の機能を変化させない限り、付加、欠失又は付加又はその任意の組合せを含むであろう。

【0032】

一実施態様では、本発明は、タグが元のタグの切断型アナログであるタグつきプロセシング酵素を包含する。「切断型アナログ」なる表現は、Ｎ末端又はＣ末端からの元のアミノ酸残基の１０％までが欠失されており、但し切断型アナログが未修飾配列の機能を保持している元のタグの配列を包含するものである。
タグが二つのタグの組合せを含む場合、これらのタグは、一実施態様では、リンカーによって連結される。

【0033】

一実施態様では、二つのタグを連結するリンカーは、ＳＳＳＧＳＳＧＳＳＧＳＳ（配列番号；２８）；ＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号：２９）、ＳＳＳＧＳＧＳＧ（配列番号：３０）、ＡＬＡＬＡＬＡ（配列番号：３１）、ＡＬＡＬＡＬＡＰＡ（配列番号：３２）、ＳＳＳＡＬＡＬＡＬＡ（配列番号：３３）；ＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：３４）、ＳＳＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号：４７）及びＧＳＳＧＳＧＳ（配列番号：４８）からなる群から選択される。
本発明はここに開示されたタグ、リンカー及びプロセシング酵素の実施態様の任意の組合せをカバーする。

【0034】

一実施態様では、タグつきプロセシング酵素は次の群から選択されるタグ及びリンカーの組合せを含むＮ末端伸長を含む：配列番号：１及び配列番号：２８、配列番号：３及び配列番号：２８、配列番号：６及び配列番号：２８、配列番号：９及び配列番号：２８、配列番号：１０及び配列番号：２８、配列番号：１１及び配列番号：２８、配列番号：１２及び配列番号：２８、配列番号：１３及び配列番号：２８、配列番号：１５及び配列番号：２８、配列番号：１６及び配列番号：２８、配列番号：２０及び配列番号：２８、配列番号：２１及び配列番号：２８、配列番号：２４及び配列番号：２８、配列番号：２７及び配列番号：２８、配列番号：１８及び配列番号：２８、配列番号：１９及び配列番号：２８、配列番号：４１及び配列番号：２８、配列番号：４２及び配列番号：２８、配列番号：４３及び配列番号：２８、そして配列番号：４４及び配列番号：２８。

【0035】

一実施態様では、タグつきプロセシング酵素は次の群から選択されるタグ及びリンカーの組合せを含むＮ末端伸長を含む：配列番号：１及び配列番号：４７、配列番号：３及び配列番号：４７、配列番号：６及び配列番号：４７、配列番号：９及び配列番号：４７、配列番号：１０及び配列番号：４７、配列番号：１１及び配列番号：４７、配列番号：１２及び配列番号：４７、配列番号：１３及び配列番号：４７、配列番号：１５及び配列番号：４７、配列番号：１６及び配列番号：４７、配列番号：２０及び配列番号：４７、配列番号：２１及び配列番号：４７、配列番号：２４及び配列番号：４７、配列番号：２７及び配列番号：４７、配列番号：１８及び配列番号：４７、配列番号：１９及び配列番号：４７、配列番号：４１及び配列番号：４７、配列番号：４２及び配列番号：４７、配列番号：４３及び配列番号：４７、そして配列番号：４４及び配列番号：４７。

【0036】

一実施態様では、タグつきプロセシング酵素は次の群から選択されるタグ及びリンカーの組合せを含むＮ末端伸長を含む：配列番号：１及び配列番号：４８、配列番号：３及び配列番号：４８、配列番号：６及び配列番号：４８、配列番号：９及び配列番号：４８、配列番号：１０及び配列番号：４８、配列番号：１１及び配列番号：４８、配列番号：１２及び配列番号：４８、配列番号：１３及び配列番号：４８、配列番号：１５及び配列番号：４８、配列番号：１６及び配列番号：４８、配列番号：２０及び配列番号：４８、配列番号：２１及び配列番号：４８、配列番号：２４及び配列番号：４８、配列番号：２７及び配列番号：４８、配列番号：１８及び配列番号：４８、配列番号：１９及び配列番号：４８、配列番号：４１及び配列番号：４８、配列番号：４２及び配列番号：４８、配列番号：４３及び配列番号：４８、そして配列番号：４４及び配列番号：４８。

【0037】

一実施態様では、タグは配列番号：１０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３及び配列番号：４４からなる群から選択され、リンカーは、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：４７及び配列番号：４８からなる群から選択される。

【0038】

他の態様では、本発明は、タグをつけたプロセシング酵素の作製方法において、ｉ）好熱性細菌由来の高度に塩基性のタンパク質から誘導されたここに開示の実施態様の何れかに係るＮ末端タグを含むプロセシング酵素を適切な発現宿主中で発現させ、ｉｉ）発現されたタグをつけたプロセシング酵素を陽イオン交換カラムに充填し、ｉｉｉ）適切な溶離剤でタグをつけたプロセシング酵素を溶離させることを含む方法に関する。

【0039】

他の態様では、本発明は、標的タンパク質前躯体を修飾する方法において、本発明に係るタグがつけられたプロセシング酵素を標的タンパク質前躯体と反応させ、標的タンパク質をプロセシング酵素から分離する工程を含む方法に関する。
プロセシング酵素は典型的にはオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼから選択される。

【0040】

一実施態様では、プロセシング酵素は融合タンパク質を切断するために使用されるプロテアーゼである。
一実施態様では、プロセシングプロテアーゼは、アスパラギン酸、メタロ、セリン及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される。
更なる実施態様では、セリンプロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ（ＥＫ）、トロンビン、Ｘａ因子及びカリクレインが含まれる。

【0041】

一実施態様では、システインプロテアーゼは、コロナウイルス科、ピコルナウイルス、レトロウイルス科、アデノウイルス科又はフラビウイルス科の群のウイルスゲノムによってコードされる３Ｃプロテアーゼ及び２Ａプロテアーゼの群から選択される。他の好ましい実施態様には、ピコルナウイルス及びコロナウイルス科からの３Ｃ及び２Ａプロテアーゼが含まれる。

【0042】

更なる実施態様では、３Ｃプロテアーゼは、配列ＧＰＮＴＥＦＡＬＳＬＬＲＫＮＩＭＴＩＴＴＳＫＧＥＦＴＧＬＧＩＨＤＲＶＣＶＩＰＴＨ−ＡＱＰＧＤＤＶＬＶＮＧＱＫＩＲＶＫＤＫＹＫＬＶＤＰＥＮＩＮＬＥＬＴＶＬＴＬＤＲＮＥＫＦＲＤＩＲＧＦＩＳＥＤＬＥＧＶＤＡＴＬＶＶＨＳＮＮＦＴＮＴＩＬＥＶＧＰＶＴＭＡＧＬＩＮＬＳＳＴＰＴＮＲＭＩＲＹＤＹＡＴＫＴＧＱＣＧＧＶＬＣＡＴＧＫＩＦＧＩＨＶＧＧＮＧＲＱＧＦＳＡＱＬＫＫＱＹＦＶＥＫＱ（配列番号：３５）のヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ；配列ＳＴＬＥＩＡＧＬＶＲＫＮＬＶＱＦＧＶＧＥＫＮＧＣＶＲＷＶＭＮＡＬＧＶＫＤＤＷＬＬＶＰＳＨＡＹＫＦＥ−ＫＤＹＥＭＭＥＦＹＦＮＲＧＧＴＹＹＳＩＳＡＧＮＶＶＩＱＳＬＤＶＧＦＱＤＶＶＬＭＫＶＰＴＩＰＫＦＲＤＩＴＥＨＦＩＫＫＧＤＶＰＲＡＬＮＲＬＡＴＬＶＴＴＶＮＧＴＰＭＬＩＳＥＧＰＬＫＭＥＥＫＡＴＹＶＨＫＫＮＤＧＴＴＶＤＬＴＶＤＱＡＷＲＧＫＧＥＧＬＰＧＭＣＧＧＡＬＶＳＳＮＱＳＩＱＮＡＩＬＧＩＨＶＡＧＧＮＳＩＬＶＡＫＬＶＴＱＥＭＦＱＮＩＤＫＫＩＥＳＱ（配列番号：４５）のＡ型肝炎株１８ ３Ｃプロテアーゼ又は配列ＧＬＰＧＦＭＲＨＮＧＳＧＷＭＩＨＩＧＮＧＬＹＩＳＮＴＨＴＡＲＳＳＣＳＥＩＶＴＣＳＰＴＴＤＬＣＬＶＫＧＥＡＩＲＳＶＡＱＩＡＥＧＴＰＶＣＤＷＫＫＳＰＩＳＴＹＧＩＫＫＴＬＳＤＳＴＫＩＤＶＬＡＹＤＧＣＴＱＴＴＨＧＤＣＧＬＰＬＹＤＳＳＧＫＩＶＡＩＨＴＧＫＬＬＧＦＳＫＭＣＴＬＩＤＬＴＩＴＫＧＶＹＥ（配列番号：４６）のウサギ出血病ウイルス３Ｃ−様プロテアーゼから選択される。

【0043】

更なる実施態様では、プロテアーゼは植物ウイルス由来である。プロテアーゼは典型的には次の植物ウイルスファミリー由来である：ブロモウイルス科、パルティティウイルス科、ジェミニウイルス科、ポティウイルス科、トンブスウイルス科、コモウイルス科、ラブドウイルス科、レオウイルス科、ポティウイルス科、セキウイルス科及びブニヤウイルス科。

【0044】

一実施態様では、植物ウイルス由来のプロテアーゼは、アミノ酸配列ＧＥＳＬＦＫＧＰＲＤＹＮＰＩＳＳＴＩＣＨＬＴＮＥＳＤＧＨＴＴＳＬＹＧＩＧＦＧＰＦＩＩＴＮＫＨＬＦＲＲＮＮＧＴＬＬＶＱＳＬＨＧＶＦＫＶＫＮＴＴＴＬＱＱＨＬＩＤＧＲＤＭＩＩＩＲＭＰＫＤＦＰＰＦＰＱＫＬＫＦＲＥＰＱＲＥＥＲＩＣＬＶＴＴＮＦＱＴＫＳＭＳＳＭＶＳＤＴＳＣＴＦＰＳＳＤＧＩＦＷＫＨＷＩＱＴＫＤＧＱＣＧＳＰＬＶＳＴＲＤＧＦＩＶＧＩＨＳＡＳＮＦＴＮＴＮＮＹＦＴＳＶＰＫＮＦＭＥＬＬＴＮＱＥＡＱＱＷＶＳＧＷＲＬＮＡＤＳＶＬＷＧＧＨＫＶＦＭＶＫＰＥＥＰＦＱＰＶＫＥＡＴＱＬＭＮ（配列番号：３８)を持つ成熟タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼである。

【0045】

本発明に係るプロセシング酵素によって修飾された前躯体タンパク質から生産されうる標的タンパク質は、ヒトタンパク質及びそのアナログ、例えばアプロチニン、組織因子経路阻害剤、又は他のプロテアーゼ阻害剤、インスリン又はインスリンアナログ、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トランスフォーミング増殖因子α又はβ、血小板由来増殖因子、ＧＲＦ（成長ホルモン放出因子）、免疫グロブリン、ＥＰＯ、ＴＰＡ、プロテインＣ、血液凝固因子、例えばＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＶ及びＦＸＩＩＩ、エキセンディン−３、エキセンディン−４、及び酵素又はその機能的アナログから選択されうる。

【0046】

本発明の更なる態様では、標的タンパク質は、インスリンアンタゴニスト又はアゴニストペプチド、例えばＳ６６１又はペプチドホルモン、例えばアミリン又はその機能的アナログから選択される。
本発明の更なる態様では、標的タンパク質は、タンパク質の修飾に関連する酵素、例えばトランスグルタミナーゼ、トランスフェラーゼ及びラセマーゼから選択される。

【0047】

一実施態様では、本発明は、本発明に係るタグつきプロセシング酵素を使用してプロトランスグルタミナーゼ（ｐｒｏＴＧａｓｅ）からプロドメインを除去することに関する。
他の実施態様では、本発明は、タグつきＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼ、タグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ又はタグつきＲＨＤＶ３Ｃプロテアーゼでのプロトランスグルタミナーゼ（ｐｒｏＴＧａｓｅ）の切断方法に関する。この実施態様では、タグは、配列番号：１０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３又は配列番号：４４から選択され得、リンカーは、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：４７及び配列番号：４８からなる群から選択されうる。

【0048】

他の実施態様では、本発明は、タグつきＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼ、タグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ又はタグつきＲＨＤＶ３Ｃプロテアーゼでのヒト成長ホルモン又はそのアナログの融合パートナーの除去方法に関する。この実施態様では、タグは、配列番号：１０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３又は配列番号：４４から選択され得、リンカーは、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：４７及び配列番号：４８からなる群から選択されうる。

【0049】

他の実施態様では、本発明は、タグつきＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼ、タグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ又はタグつきＲＨＤＶ３Ｃプロテアーゼでのヒトアミリン又はそのアナログの融合パートナーの除去方法に関する。この実施態様では、タグは、配列番号：１０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３又は配列番号：４４から選択され得、リンカーは、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：４７及び配列番号：４８からなる群から選択されうる。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】Ｎ末端精製タグとして配列番号：１０、リンカーとして配列番号：２８、及びＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼとして配列番号：３５からなるｐＡＣＳＨ２３８プロセシング酵素をコードするｐＥＴ１１ａ誘導ベクターのベクターマップを開示する。ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩクローニング部位、並びにｌａｃＩコード配列、アンピシリン（ｂｌａ）コード配列、ｐＢＲ３２２複製起点、Ｔ７プロモーター領域、Ｔ７ターミネーター領域を示す。

【図2】２５℃で一晩ｐＡＣＳＨ２３９と共にインキュベートされたｐＡＣＳＨ２９４の抽出及び逆重畳積分質量スペクトルを開示する。１：１００の酵素：基質比において、Ｓ６６１ペプチド（４８０２．１Ｄａ）と放出されたタグ＋リンカー（１０１６８．４Ｄａ）が明らかに検出されている。インタクトな融合タンパク質は検出されず、これは、融合タンパク質がタグ部分とＳ６６１ペプチドに完全に切断されたことを示している。Ｙ軸は測定されたイオンの強度を示している。Ｘ軸は分子量をダルトン（Ｄａ）で示している。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本発明は、タンパク質を修飾して、例えば微生物宿主細胞において発現される融合タンパク質を切断するために使用することができる新規なプロセシング酵素を提供する。更に、本発明はかかるタグつきプロセシング酵素の効率的な発現及び精製のための方法を提供する。
本発明に係るプロセシング酵素は、高収率でのタグつきプロセシング酵素の可溶型発現を容易にし、単一の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を使用する効率的な精製並びに使用後のタグつきプロセシング酵素の簡単な除去を可能にするＮ末端融合タグを含む。

【0052】

タグはタグつきプロセシング酵素の溶解性とここではまた安定性を増加させる。これは、難溶性酵素が大なる反応容積、インキュベーション時間及びより特殊な反応条件を必要とするので、有利である。
タグはまた陽イオンカラムへの結合を容易にし、よってタグつきプロセシング酵素用の固定化剤として陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを使用するオンカラム切断を可能にする。

【0053】

本発明によって使用されるタグの幾つかは同時係属出願のＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１４９３に開示されている。
これらのタグは〜５０℃から水の沸点を超えるまでの範囲の至適温度で好熱性細菌株から誘導される。極めて高い温度で生存する株は超好熱菌又は好熱菌と呼ばれ、８０℃（１７６^。Ｆ）又はそれ以上の至適温度を有する。好熱性細菌は温泉、熱い土壌、地熱火道及び高温が存在する他の場所で天然に生じる。ＲＳ２１＿ＢＡＣＳＴ（配列番号：１）がクローニングされタグとして使用されたバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophillus)は例えば多くの土壌中において６５℃以上で増殖することが見出されている。高温で生存するために、これらの生物は中温菌のものよりもより安定な進化したタンパク質を有している。

【0054】

かかる好熱性細菌から誘導された本発明に係るタグは一般に可溶性で、高度に安定で、アミノ酸配列中に存在する多量のＡｒｇ及びＬｙｓ残基のために非常に塩基性のｐＩを有している。タグのｐＩは一般に９と１３．５の間である。一実施態様では、タグは約９を超えるｐＩを有している。他の実施態様では、タグは約９と１２．５の間を超えるｐＩを有している。他の実施態様では、タグのｐＩは約１０と約１２．５の間であり、更なる態様ではｐＩは約１０である。
可溶性はタンパク質の一般に高い表面電荷から得られると考えられている。

【0055】

本発明に係るプロセシング酵素は、組換え的に発現されたタンパク質をプロセシングして所望の修飾タンパク質を与えるために使用することができる。
プロセシング酵素は次の群の酵素から選択される：酸化／還元反応を触媒しうるオキシドレダクターゼ、官能基（例えばホスフェート基）を転移させうるトランスフェラーゼ、（ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼを含む）様々な結合の加水分解を触媒するヒドロラーゼ、加水分解と酸化以外によって結合を切断するリアーゼ、単一分子内の変化を触媒するイソメラーゼ、又は共有結合によって２つの分子を結合させるリガーゼ。
これらの酵素は野生型酵素であるか又はよく知られた変異誘発工程によって改変される変異体又はそのアナログでありうる。

【0056】

標的タンパク質からの融合パートナーの切断又は標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端のプロドメイン除去又はアミノ酸トリミングに使用できるタグつきプロテアーゼの例は、アスパラギン酸、メタロ、セリン及びシステインプロテアーゼである。
セリンプロテアーゼの非限定的な例には、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ（ＥＫ）、トロンビン、Ｘａ因子及びカリクレインが含まれる。
システインプロテアーゼの非限定的な例には、コロナウイルス科(Corona viridae)、ピコルナウイルス科(Picorna viridae)、レトロウイルス科(Retro viridae)、アデノウイルス科(Adeno viridae)又はフラビウイルス科(Flavi viridae)の群から得られるウイルスプロテアーゼが含まれる。更なる例には、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ−Ｄ型肝炎ウイルス、デングウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、重度の急性呼吸障害症候群ウイルス（ＳＡＲＳ)、メンゴウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ)、ヒト泡沫状ウイルス及びアデノウイルスからのプロテアーゼが含まれる。他の非限定的な例には、リーシュマニア属菌種のような細菌又はトリパノソーマ属菌種のような真核微生物から誘導されるシステインプロテアーゼが含まれる。

【0057】

一実施態様では、システインプロテアーゼは、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、アデノウイルス科又はフラビウイルス科の群のウイルスゲノムによってコードされる３Ｃプロテアーゼ及び２Ａプロテアーゼの群から選択される。他の好ましい実施態様には、ピコルナウイルス科及びコロナウイルス科由来の３Ｃ及び２Ａプロテアーゼが含まれる。システインプロテアーゼの他の例にはヒトカスパーゼ１−１０のようなカスパーゼが含まれる。
３Ｃプロテアーゼの概説は、Krausslich,H.G. & Wimmer,E. ,Viral proteinases, Annual Review of Biochemistry（1988) 57, 701-754に見出される。

【0058】

メタロプロテアーゼの非限定的な例には、マトリックスメタロプロテアーゼ、例えばマトリキシン(matrixins)又は膜結合メタロプロテアーゼ、例えばＭＴ１−ＭＭＰが含まれる。
他の実施態様にはアスパラギン酸プロテアーゼ、例えばペプシン及びカテプシン、例えばカテプシンＤ及びキモシンが含まれる。
酵素の他の例には、リパーゼ、ホスファターゼ、グリコシルヒドロラーゼ（例えば、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ)、キナーゼ、モノ又はジオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ及びホスファターゼが含まれる。

【0059】

タグつきプロセシング酵素によって修飾することができる標的タンパク質前躯体は任意のタンパク質であり得、例示的な例は、アプロチニン、組織因子経路阻害剤又は他のプロテアーゼ阻害剤、インスリン又はインスリンアナログ、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トランスフォーミング増殖因子α又はβ、血小板由来増殖因子、ＧＲＦ（成長ホルモン放出因子）、免疫グロブリン、ＥＰＯ、ＴＰＡ、プロテインＣ、血液凝固因子、例えばＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＶ及びＦＸＩＩＩ、エキセンディン−３、エキセンディン−４、及び酵素又はその機能的アナログである。

【0060】

標的タンパク質の他の例は、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β(ＴＧＦ-β)、上皮細胞成長因子(ＥＧＦ)、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、インターフェロン、プロ-ウロキナーゼ、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２、フォンウィルブランド因子、サイトカイン、例えば、インターロイキン(ＩＬ)１、ＩＬ-１Ｒａ、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１５、ＩＬ-１６、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-２０、ＩＬ-２１ ＩＬ-２１、ＩＬ-２２、ＩＬ-２３、ＩＬ-２４、ＩＬ-２５、ＩＬ-２６、ＩＬ-２７、ＩＬ-２８、ＩＬ-２９、ＩＬ-３０、ＩＬ-３１、ＩＬ-３２、又はＩＬ-３３のようなインターロイキン、ＧＭ-ＣＳＦのようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α、リンホトキシン-α、リンホトキシン-β、ＣＤ４０Ｌ、又はＣＤ３０Ｌ、プロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニン、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、トリプシン、パパイン、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はバトロキソビンのような酵素、オピオイド、例えばエンドルフィン、エンケファリン又は非天然オピオイド、ホルモン又はニューロペプチド、例えばカルシトニン、グルカゴン、ガストリン、副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)、コレシストキニン、黄体化ホルモン、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン、絨毛性性腺刺激、コルチコトロピン放出因子、バソプレッシン、オキシトシン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、リラキシン、プロラクチン、ペプチドＹＹ、ニューロペプチドＹ、膵臓(pancreastic)ポリペプチド、レプチン、ＣＡＲＴ(コカイン及びアンフェタミン調節転写物)、ＣＡＲＴ関連ペプチド、ペリリピン(perilipin)、ＭＣ-４のようなメラノコルチン(メラニン細胞刺激ホルモン)、メラニン濃縮ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、アドレノメデュリン、エンドセリン、セクレチン、アミリン、血管作用性小腸ペプチド(ＶＩＰ)、下垂体(pituary)アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(ＰＡＣＡＰ)、ボンベシン、ボンベシン様ペプチド、チモシン、ヘパリン結合タンパク質、可溶型ＣＤ４、視床下部放出因子及びメラノトニン(melanotonins)である。

【0061】

本発明の他の実施態様では、標的タンパク質はインスリンレセプターアゴニスト又はアンタゴニストペプチド又は他の細胞膜レセプターと相互作用するように設計された他のペプチドでありうる。
本発明の一実施態様は、本発明に係るタグつきプロセシング酵素と標的タンパク質前駆体の同時発現を含み、よって標的タンパク質前駆体のインビボプロセシングを容易にし、初期の精製工程中でのプロセシング酵素の除去を容易にする。

【0062】

本発明に係る方法によって生産される発現されたタグつきプロセシング酵素は、遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、機械的細胞破壊、例えば超音波処理又は圧力によるタグつきプロセシング酵素の放出、例えば硫酸アンモニウムのような塩による上清又は濾液のタンパク質様成分の沈殿を含む一般的な手順により培養培地から回収することができる。

【0063】

商業的供給者から入手可能な任意の適切な陽イオン交換マトリックスを本発明に係る方法において使用することができ、適切な陽イオン交換カラム材料の非限定的なリストは、ＳＰセファロース・ファースト・フロー、ＳＰセファロースＸＬ；ストリームラインＳＰ・ＸＬ、ストリームライン・ダイレクトＣＳＴ、オベリックス(Ｏｂｅｌｉｘ)ＳＰ、Ｓ−サポート・ウノスフィア、ＳＰセファロース高性能(Ｈｉｇｈ・Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、ソース(Ｓｏｕｒｃｅ)３０Ｓ及びトーヨーパール(Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ)ＳＰ６５０Ｓ ＴｏｓｏＨａａｓである。
プロセシング工程に続く工程、例えば融合タンパク質の切断は、第一工程におけるような陽イオン交換カラム精製を含みうる。切断に続く精製工程はまた他の精製手段、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを含みうる（例えばScopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照)。

【0064】

本発明に係るタグつきプロセシング酵素をコードする核酸コンストラクトは、ゲノム又はｃＤＮＡ由来のものが適しており、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば、J. Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)に従い、合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションにより、融合タンパク質の全体又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより、得ることができる。
またタグつきプロセシング酵素をコードする核酸コンストラクトは、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22（1981), 1859 - 1869に記載されたホスホアミダイト(phosphoamidite)法、又はMatthes等, EMBO Journal 3（1984), 801 - 805により記載された方法により合成的に調製することもできる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされて、適切なベクター中にクローニングされる。融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列はまた例えば米国特許第４６８３２０２号、Saiki等, Science 239（1988), 487-491又は上掲のSambrook等に記載されたような特定のプライマーを使用し、オーバーラップ伸長ＰＣＲによってスプライシングのようなポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。

【0065】

更に、核酸コンストラクトは、標準的な技術に従い、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来(適切な場合)の断片、全核酸コンストラクトの様々な部位に相当する断片をライゲーションすることにより調製される混合された合成及びゲノム、混合された合成及びｃＤＮＡ、又は混合されたゲノム及びｃＤＮＡ由来のものであってもよい。
タグつきプロセシング酵素をコードするＤＮＡ配列は、通常は、簡便に組換えＤＮＡ手順を施しうる任意のベクターであってもよい組換えベクター中に挿入され、多くの場合、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存する。よって、ベクターは自己複製可能なベクター、すなわちベクターは染色体外体として存在し、その複製が染色体複製とは独立であるベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組込まれ、それが組込まれた染色体(群)と共に複製されるものであってもよい。

【0066】

ベクターは、好ましくは、タグつきプロセシング酵素をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合している発現ベクターであってもよい。一般に、発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され、又は双方の要素を含むものであってもよい。「作用可能に結合する」なる用語は、セグメントが、意図される目的に合わせて機能するように、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を介して進行するように、配列されていることを示している。
タグつきプロセシング酵素の発現に使用される発現ベクターはクローニングされた遺伝子又はｃＤＮＡの転写を方向付けることが可能なプロモーターを含む。プロモーターは、選択の宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞と相同か又は異種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導されうる。

【0067】

細菌宿主細胞での使用に適したプロモーターの例には、バチルス・ステアロサーモフィルスのマルトゲン(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスのα-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンスのＢＡＮアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス(Bacillus pumilus)のキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージラムダＰ_Ｒ又はＰ_Ｌプロモーター、又は大腸菌での発現に使用されるプロモーター、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、ａｒａＢＡＤ、ｔａｃ、バクテリオファージＴ７及びｃｓｐＡが含まれる。
また、ベクターは、選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)をコードする遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキセート等の薬剤に対して耐性を付与するマーカー遺伝子を含んでいてもよい。

【0068】

また、タグつきプロセシング酵素をコードするＤＮＡ配列は、必要ならば、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter等, Science 222, 1983, pp. 809-814)又はＴＰＩ１(Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434)又はＡＤＨ３(McKnight等, The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099)ターミネーターに作用可能に結合していてもよい。発現ベクターはまたプロモーターの下流で融合ポリペプチド配列自体の挿入部位の上流に位置するＲＮＡスプライス部位のセットを含みうる。かかるＲＮＡスプライス部位はアデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。発現ベクターにまた含まれるものは挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルである。ポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０由来の初期又は後期ポリアデニル化シグナル(Kaufman及びSharp,同書)、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモンターミネーター(DeNoto等 Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981)が含まれる。発現ベクターはまたプロモーターとＲＮＡスプライス部位の間に位置する非コード化ウイルスリーダー配列、例えばアデノウイルス２三者間リーダー；及びエンハンサー配列、例えばＳＶ４０エンハンサーを含みうる。

【0069】

タグつきプロセシング酵素をコードするＤＮＡコンストラクトが導入される宿主細胞は、タグつきプロセシング酵素を生産可能な任意の細菌細胞でありうる。
細菌宿主細胞の例は、グラム陽性菌、例えばバチルス属の菌株、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス(coagulans)、バチルス・サーキュランス(circulans)、バチルス・ロータス(lautus)、バチルス・メガテリウム又はバチルス・チューリンゲンシスの菌株、又はストレプトマイセス属の菌株、例えばストレプトマイセス・リビダンス又はストレプトマイセス・ムリヌス(murinus)の菌株、又はグラム陰性菌、例えば大腸菌の株である。細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換、又はそれ自体知られている方法でコンピテント細胞を使用することによりなされてもよい(上揚のSambrook等を参照)。

【0070】

大腸菌等の細菌中でタンパク質を発現させる場合、タンパク質は、典型的には不溶性顆粒(封入体ともいう)として細胞質に保持されうるか、又は細菌性分泌配列によって細胞膜周辺腔に誘導されうる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収されて変性された後に、変性剤を希釈することによってポリペプチドが再折り畳みされる。後者の場合、標的タンパク質は、ｐｈｏＡ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＨ、ＯｍｐＰ、ＯｍｐＴ、ｌａｍｂ又はｐｅｌＢ（Erwania carotovora(軟腐病菌)由来）のような強いシグナルペプチド配列と共にクローニングされ得、ポリペプチドは、例えば超音波処理又は浸透圧ショックにより細胞を崩壊させて細胞膜周辺腔の内容物を放出させ、ポリペプチドを回収することによって細胞膜周辺腔から回収されうる。

【0071】

ついで、形質転換又は形質移入された宿主細胞は、タグつきプロセシング酵素の発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地中で培養され、その後、得られたペプチドの全て又は一部が培地から回収されうる。細胞培養に使用される培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の一般的な培地、例えば適切なサプリメントを含有する最小又は複合培地でありうる。適切な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は公開されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されうる。

【0072】

「アプリケーション」は精製カラムに充填される融合タンパク質を含んでいる試料を意味する。
「フロースルー」は精製カラムに結合しない宿主細胞タンパク質と汚染物質を含むアプリケーションの部分を意味する。
「主ピーク」は最も高いＵＶ強度を有し融合タンパク質を含む精製クロマトグラムにおけるピークを意味する。

【0073】

「ｍＡＵ」はミリ吸光度単位である。
「ＵＶ２８０強度」は、ミリ吸光度単位で測定される、タンパク質が吸収する２８０ｎｍの波長での吸光度である。
「ＵＶ２１４」は、ミリ吸光度単位で測定される、タンパク質が吸収する２１４ｎｍの波長での吸光度である。
「ＩＰＴＧ」はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドである。
「ＴＩＣ」は全イオン計数である。
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーである。
「タンパク質」なる表現はペプチドとポリペプチドの双方をカバーする。

【0074】

「標的タンパク質前駆体」は、標的タンパク質の前駆体であり、標的タンパク質を得るためにプロセシング酵素によってプロセシングされなければならないタンパク質である。例には、標的タンパク質を得るためにプロセシング酵素によって融合パートナーが除去されなければならない融合タンパク質、標的タンパク質を得るために翻訳後修飾（例えばグリコシル化）がプロセシング酵素によって除去されなければならないタンパク質、又は翻訳後修飾がプロセシング酵素によって付加されなければならないタンパク質、又は上記の組み合わせが含まれる。
「標的タンパク質」はその意図される形態に達するためにプロセシング酵素によってプロセシングされたタンパク質である。

【0075】

「ＳＯＥ ＰＣＲ」はオーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシングを意味する。
「ＬＣ−ＭＳ」は液体クロマトグラフィー質量分析を意味する。
「溶解度％」は宿主細胞可溶化物からの可溶性タンパク質の量を宿主細胞可溶化物からの可溶性＋不溶性融合タンパク質の量で割ったもの×１００として定義される。
「純度％」は対象タンパク質の量を、対象のタンパク質の量＋宿主細胞汚染物の量で割ったもの×１００として定義される。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。

【0076】

本文脈において、アミノ酸の３文字又は１文字標記は表１に示されるようなその一般的な意味で使用されている。明示的に示さない限り、ここに示すアミノ酸はＬアミノ酸である。更に、ペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端は、その他の記載がない限り、それぞれＮ末端及びＣ末端である。

【0077】

【0078】

ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、何らの方法においても本発明を限定するものと解すべきではない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
この発明は、適用される法律に容認される、ここに添付の特許請求の範囲に記載された主題事項の全ての変更例及び均等物を含む。

【実施例】

【0079】

実施例１
オーバーラップＰＣＲを使用するＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼコード配列の合成
成熟ヒトライノウイルス株１４（ＨＲＶ１４）３Ｃプロテアーゼのアミノ酸配列は次の通りである：
ＧＰＮＴＥＦＡＬＳＬＬＲＫＮＩＭＴＩＴＴＳＫＧＥＦＴＧＬＧＩＨＤＲＶＣＶＩＰＴＨＡＱＰＧＤＤＶＬＶＮＧＱＫＩＲＶＫＤＫＹＫＬＶＤＰＥＮＩＮＬＥＬＴＶＬＴＬＤＲＮＥＫＦＲＤＩＲＧＦＩＳＥＤＬＥＧＶＤＡＴＬＶＶＨＳＮＮＦＴＮＴＩＬＥＶＧＰＶＴＭＡＧＬＩＮＬＳＳＴＰＴＮＲＭＩＲＹＤＹＡＴＫＴＧＱＣＧＧＶＬＣＡＴＧＫＩＦＧＩＨＶＧＧＮＧＲＱＧＦＳＡＱＬＫＫＱＹＦＶＥＫＱ（配列番号：３５）
大腸菌中での発現のために最適化された配列番号：３５をコードするＤＮＡ配列及びコドンを生産した。成熟ＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼ合成遺伝子断片は、ＰＣＲの二つの逐次工程を使用するオーバーラップ伸長ＰＣＲ法により、スプライシングを使用して得た。第一のＰＣＲ反応では、１６のオーバーラッププライマー（８つの順方向及び８つの逆方向プライマー）を使用して、可撓性リンカーをコードする５末端領域を含む全ＨＲＶ１４配列を産生させた（配列番号：２８）。プライマーは〜５０ｂｐのサイズで、プライマー間のオーバーラップは〜２０ｂｐであった。第二のＰＣＲ反応では、それぞれＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩクローニング部位を有する末端順方向及び逆方向プライマーを使用し、鋳型として第一ＰＣＲ反応の産物を使用して全配列を増幅させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ系（Finnzymes)を使用した。第一ＰＣＲ反応は、本質的に製造者の指示書に従って好適な量の１６全てのプライマーを用いて次のようにして準備した。第一反応のためのＰＣＲ条件は次の通りであった；
９８℃３０秒（初期変性）
９８℃１０秒（変性）
５０℃３０秒（アニーリング）
７２℃１５秒（伸長）
１０サイクルの間
７２℃５分（最終伸長）

【0080】

第一反応からのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ溶液から、ＧＦＸ^ＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ及びＧｅｌ Ｂａｎｄ精製キット（ＧＥヘルスケア）を使用して直接精製した。
第二のＰＣＲ反応において、最も端部の順方向及び逆方向プライマーを使用して、第一反応からのＰＣＲ産物から全ＨＲＶ１４ ３Ｃコード配列を増幅させた。条件は、５５℃をアニール温度として使用し、２０サイクルを１０の代わりに使用したことを除いて、第一反応に対して記載したものと同じであった。
第二反応からのＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって判定され予想されたように〜６００塩基対のサイズを有している。ＰＣＲバンドをアガロースゲルから切除し、ＰＣＲ産物を、製造者の指示書に従ってＧＦＸ^ＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ及びＧｅｌ Ｂａｎｄ精製キット（ＧＥヘルスケア）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、製造者の指示書に従って確立されたＴＯＰＯクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミド中にサブクローニングし、ライゲーション産物を、プラスミド増幅のためにＴＯＰ１０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換させた。単離されたＴＯＰ１０クローンから得られたプラスミドのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ挿入断片の正しい配列をＤＮＡ配列決定によって証明した。

【0081】

異なった熱安定性アルカリタンパク質タグを持つＨＲＶ１４のｐＥＴ１１ａベクターへのライゲーション
ＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼコード領域を含むＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をＴＯＰＯプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から切除した。ついで、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を、異なったＮ末端熱安定アルカリタグをコードする挿入断片がリンカー及びプロテアーゼコード領域の５末端に結合するようにｐＥＴ１１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にライゲーションさせた。介在リンカーでＨＲＶ１４ ３ＣプロテアーゼのＮ末端に融合した異なったタグをコードする１６のｐＥＴ１１ａベクターを図１に示すようにして生産した。
ＤＮＡ配列の検証を制限酵素切断及び／又はＤＮＡ配列決定によって実施した。
次のタグつき酵素を生産した：

【0082】

タグつきＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼの発現
異なったＮ末端タグを有するＨＲＶ１４３ＣプロテアーゼをコードするｐＥＴ１１ａベクターコンストラクトを、熱ショック又は化学薬品ベースの標準的方法によってＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）大腸菌株に形質転換させた。形質転換した細胞を、１５０マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンと３４マイクログラム／ミリリットルのクロラムフィニコールを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地寒天板で一晩増殖させた。アンピシリンとクロラムフィニコールを含む液体ＬＢ培地を培養皿から播種し、３７℃、２４０ｒｐｍで振盪フラスコで培養した。培地に０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えてタンパク質の誘導を開始した後、ＯＤ_６００：〜０．４−０．８に達したときに温度を３０℃まで低下させた。３時間の誘導後に得られた最終ＯＤ_６００は、１．６−２．８の範囲であった。細胞を遠心分離によって収集した。誘導細胞及び未誘導細胞、並びに誘導細胞の可溶型及び不溶型画分（２５ｍＭのＮａＰＯ_４,ｐＨ７からなるバッファー中での超音波処理及び遠心分離によって得た）を含むペレットの可溶化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、ＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼ変異体の発現レベルと溶解性を評価した。発現レベルには差が観察されたが、非常に高い溶解性（〜８０％又はそれ以上）がＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼの殆どのタグ付き型について観察された。

【0083】

配列番号：１９（ｐＡＣＳＨ２３９）のタグがＮ末端についたＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼの精製：
ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼの細胞培養ペレット（４０ｍｌの培養から）を、ｐＨ７の２５ｍＭのＮａＰＯ_４を含むバッファー中での超音波処理によって破壊した。細胞細片を１００００ｇの遠心分離によって遠心沈殿させた。上清を、ＡＫＴＡエクスプローラー１００精製システム（ＧＥヘルスケア）を使用して実施した精製前に滅菌濾過した。５ｍｌのカラム容積のプレパックＳＰセファロースＦＦ Ｈｉトラップカラム（ＧＥヘルスケア）を、次のバッファーを使用する３ｍｌ／分の流量での分離に使用した：
バッファーＡ： ５０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７＋１ｍＭのＥＤＴＡ
バッファーＢ： ５０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７＋１ＭのＮａＣｌ＋１ｍＭのＥＤＴＡ

【0084】

カラムは最初に７カラム容量のバッファーＡに対して平衡にした。アプリケーションの充填後に、７カラム容量のバッファーＡを使用する洗浄によって未結合タンパク質を除去した。２０カラム容積に対して０−１００％バッファーＢの線形勾配を使用して、カラムからｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼを溶離させた。融合タンパク質は０．４−０．５ＭのＮａＣｌの塩濃度でカラムから溶離させた。幾らかのタンパク質がフロースルーにおいて失われた。しかしながら、ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼは単一の陽イオン交換クロマトグラフィー工程で、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準法によって決定して高純度（〜８５−９０％）まで精製することができた。ＬＣ−ＭＳによって、溶離されたｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼが予想された分子量を有していることがまた証明された。

【0085】

配列番号：１０（ｐＡＣＳＨ２３８）のタグがＮ末端についたＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼの精製：
ｐＡＣＳＨ２３９に対して記載したようにして８０ｍｌの細胞培養物からのｐＨ７の２５ｍＭのＮａＰＯ_４中で超音波処理した細胞培養ペレットから、精製の準備ができた上清を調製した。ＳＰセファロースＦＦプレパック５ｍｌＨｉトラップカラム（ＧＥヘルスケア）にアプリケーションを充填した。流量は３ｍｌ／分であり、精製に使用したバッファーは：
バッファーＡ： ５０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７
バッファーＢ： ５０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７ ＋ １ＭのＮａＣｌ
であった。
カラムは最初に７カラム容量のバッファーＡに対して平衡にした。７カラム容量のバッファーＡを使用する洗浄工程において未結合試料を除去し、２０カラム容積に対して０−１００％バッファーＢの線形勾配を使用して、カラムからｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼを溶離させた。
ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼは〜０．２ＭのＮａＣの濃度でカラムから溶離させた。ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼとは対照的に、ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼの主要な部分がこれらの精製条件でカラムに結合した。ＬＣ−ＭＳによって、溶離されたプロテアーゼが予想された分子量を有していることがまた証明された。第一の精製工程の回収率はｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼと比較すると４倍高く、純度はＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して〜９０％であった。

【0086】

配列番号：１９タグつきＨＲＶ１４＿３Ｃプロテアーゼ（ｐＡＣＳＨ２３９）の活性の評価
修飾ＨＲＶ１４ ３Ｃ切断部位ＳＳＳＧＧＳＥＶＬＦＱ（配列番号：３６）を持つ介在リンカーを有するＳ６６１インスリンレセプターアンタゴニストペプチドを含む融合タンパク質（ｐＡＣＳＨ２９４）を切断するために、ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼの活性を、異なった量のプロテアーゼを使用して推定した。
Ｓ６６１ペプチドは次の配列を有している：
ＧＳＬＤＥＳＦＹＤＷＦＥＲＱＬＧＧＧＳＧＧＳＳＬＥＥＥＷＡＱＩＱＣＥＶＷＧＲＧＣＰＳＹ（配列番号：３７）。
ｐＡＣＳＨ２９４融合タンパク質基質とｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼの匹敵するタンパク質濃度を、ＨＰＬＣクロマトグラムの解析からのＵＶ２１４ｎｍの吸光度ピーク面積の積分によって計算した。酵素と基質を２００ｕＬの反応容積で混合し、異なった基質に対する酵素の比（濃度に従って調節）を使用して５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む切断バッファー中で２５℃にて６又は１２時間、インキュベートした。ＬＣ−ＭＳ実験は、Ｓ６６１ペプチド（配列番号：３７）と放出されたタグ（配列番号：１９）＋リンカー（配列番号：３６）だけが、１：１００の酵素対基質比を使用して１２時間のインキュベーション後に観察されたことを示している（図２）。非常に少量の融合タンパク質だけが１：２００の比を使用して１２時間後に残った。従って、該結果は、１：１００−１：２００の酵素／基質比が一晩のインキュベーションでｐＡＣＳＨ２９４融合タンパク質を完全にプロセシングするために十分であることを示している。

【0087】

消化中に存在している放出Ｓ６６１ペプチドは、続いて、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム(HiTrap Qセファロース・ハイ・パーフォーマンス, 1 ml, GE Healthcare）を使用して９８％を越える純度まで精製しうる。バッファー及び一般的精製条件は、ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼの精製に対して記載された通りであった。Ｓ６６１ペプチドはこのカラムに結合したが、ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼは溶離勾配内でカラムから如何なる塩濃度でも溶離せず、フロースルー画分のＬＣ−ＭＳ分析によって判断されるフロースルーにおいて観察されただけであった。よって、ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼは第二の精製工程において標的タンパク質から効果的に除去された。

【0088】

配列番号：１０タグつきＨＲＶ１４＿３Ｃプロテアーゼ（ｐＡＣＳＨ２３８）の活性の評価
同一量のｐＡＣＳＨ２３８又はｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼを用いて、併行実験において、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌからなるバッファー中のｐＡＣＳＨ２９４基質をプロセシングした。１：２５又は１：５０の酵素：基質比を二種の酵素に対して評価した。３０℃での３時間のインキュベーション後に放出されたＳ６６１インスリンレセプターアンタゴニストペプチドの量は、二種の酵素に対して正確に同じであり、Ｎ末端に付着したタグが異なったサイズであるにもかかわらず、それらが統一の特異的活性を有していることを示している。ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼと同様に、ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼは陰イオン交換カラムに結合せず、よってそれが標的タンパク質前躯体の消化に続いて適切な精製によって効果的に除去されうることを示している。

【0089】

実施例２
タグつきタバコエッチウイルスプロテアーゼのクローニング
成熟タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼは次のアミノ酸配列を有している：
ＧＥＳＬＦＫＧＰＲＤＹＮＰＩＳＳＴＩＣＨＬＴＮＥＳＤＧＨＴＴＳＬＹＧＩＧＦＧＰＦＩＩＴＮＫＨＬＦＲＲＮＮＧＴＬＬＶＱＳＬＨＧＶＦＫＶＫＮＴＴＴＬＱＱＨＬＩＤＧＲＤＭＩＩＩＲＭＰＫＤＦＰＰＦＰＱＫＬＫＦＲＥＰＱＲＥＥＲＩＣＬＶＴＴＮＦＱＴＫＳＭＳＳＭＶＳＤＴＳＣＴＦＰＳＳＤＧＩＦＷＫＨＷＩＱＴＫＤＧＱＣＧＳＰＬＶＳＴＲＤＧＦＩＶＧＩＨＳＡＳＮＦＴＮＴＮＮＹＦＴＳＶＰＫＮＦＭＥＬＬＴＮＱＥＡＱＱＷＶＳＧＷＲＬＮＡＤＳＶＬＷＧＧＨＫＶＦＭＶＫＰＥＥＰＦＱＰＶＫＥＡＴＱＬＭＮ（配列番号：３８）
安定化変異（Ｓ２１９Ｖ）を持つＴＥＶ配列を含む挿入断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ系（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩクローニング部位をそれぞれ含む順方向及び逆方向プライマー及び既存のＴＥＶ（Ｓｅｒ２１９Ｖａｌ）コードプラスミドを鋳型として用いて、標準的ＰＣＲ法によって得た。ＰＣＲ産物の５’端は可動性リンカーをコードする配列（配列番号：２８）を含んでいた。

【0090】

ＰＣＲ産物をＧＦＸ精製（ＧＥヘルスケア）し、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従い、かつ実施例１に記載したようにしてＴＯＰＯベクター中にサブクローニングした。ＴＯＰＯプラスミドからのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ挿入断片の正しいＴＥＶコード配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。正しい挿入断片をＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ酵素でＴＯＰＯプラスミドから切除し、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターの熱安定性アルカリタグをコードする挿入断片の３’端に融合させた。次のコンストラクトを作製した：

【0091】

タグつきＴＥＶプロテアーゼ変異体の発現
ｐＡＣＳＨ３０７、ｐＡＣＳＨ３０８及びｐＡＣＳＨ３０９プロテアーゼコードプラスミドをＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）大腸菌株中に形質転換させた。形質転換細胞を、１５０マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンと３４マイクログラム／ミリリットルのクロラムフィニコールを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地寒天プレートで一晩増殖させた。アンピシリンとクロラムフィニコールを含む液体ＬＢ培地を培養プレートから播種し、振盪フラスコで３７℃、２４０ｒｐｍで培養した。温度を、ＯＤ_６００：〜０．４−０．５に達したときに３０℃に低下させた。この温度への３０分の適合化後、培養培地に０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えることによって、タンパク質誘導を開始させた。３時間の誘導後に得られた最終ＯＤ_６００は１．６の範囲であった。細胞を遠心分離によって収集した。誘導細胞及び非誘導細胞、並びに誘導された細胞の可溶性及び不溶性画分を含むペレットの可溶化物（１０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７からなるバッファー中での超音波処理及び遠心分離によって得られた）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、ＴＥＶプロテアーゼ変異体の発現レベル及び溶解性を評価した。発現レベルは３種全てのコンストラクトに対して同様であった。溶解性は、配列番号：１０のタグつきＴＥＶ変異体（〜７０％）（ｐＡＣＳＨ３０７）に対して最も高いと推定された。

【0092】

ｐＡＣＳＨ３０７プロテアーゼの精製
２５ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７中で超音波処理された培養ペレット（８０ｍｌの培養から）からの滅菌濾過上清からｐＡＣＳＨ３０７プロテアーゼの精製を、ＡＫＴＡエクスプローラー１００システム（ＧＥヘルスケア）を使用し、実施例１にｐＡＣＳＨ２３８に対して記載したバッファー及び条件を正確に用いて実施した。分離をＨｉＴｒａｐ ＳＰセファロースＦＦ５ｍｌカラムで実施したとき、約０．２５ＭのＮａＣｌでピークが明らかに溶離した。ピークの最高点からの画分のＬＣ−ＭＳ分析により、このコンストラクトに対して正確に予想された分子量が得られ、主ピークの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析によって判断して〜８５−９０％であった。

【0093】

配列番号：１０のタグつきＴＥＶプロテアーゼ（ｐＡＣＳＨ３０７）の活性の評価
ｐＡＣＳＨ３０７プロテアーゼの活性を、同じＮ末端タグ（配列番号：１９）を持つが、タバコエッチウイルス切断認識部位ＳＳＳＧＧＳＥＮＬＹＦＱ（配列番号：３９）を含むリンカーを持つ実施例１に記載されたような、Ｓ６６１インスリンアンタゴニストペプチド（配列番号：３７）を含む融合タンパク質（ｐＡＣＳＨ２４８）を切断するために、異なった量のプロテアーゼを用いて、推定した。消化実験を、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む切断バッファー中で実施した。ＬＣ−ＭＳ実験は、１：１の酵素対基質比での８時間のインキュベーション後に、Ｓ６６１ペプチドの主要な部分がｐＡＣＳＨ２４８融合タンパク質から切り離されたことを示している。これは、タグつきＴＥＶプロテアーゼが活性な酵素として発現され精製され、ｐＡＣＳＨ２４８融合タンパク質から配列番号：１９のタグを除去するために使用できることを証明している。

【0094】

実施例３
ｐｒｏＴＧａｓｅのクローニングと発現
トランスグルタミナーゼ（ｔＧＡＳＥ）遺伝子は、シグナルペプチドとプロドメインに成熟ｔＧＡＳＥ配列が続いてなる。ｐｒｏｔＧＡＳＥ（シグナルペプチドは伴わないがＮ末端Ｍｅｔ残基は伴う）を、標準的な方法論を用い、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡからＰＣＲによって調製した。プロドメインを変更した結果、ＨＲＶ１４ ３Ｃ切断部位が成熟ｔＧＡＳＥ配列のＧｌｙ５３−Ｐｒｏ５４Ｎ末端伸展の丁度前に含められた。ｐｒｏｔＧＡＳＥ配列を、標準的なクローニング技術を使用して、ｐＥＴ１１ａベクター（ｐＮＮＣ１３０）中にクローニングしたところ、このプラスミドによってコードされたタンパク質は次の配列を有していた（成熟ｔＧＡＳＥ配列は残基５５で始まる）：
ＭＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳＡＧＰＳＦＲＡＰＬＥＶＬＦＱＧＰＤＳＤＤＲＶＴＰＰＡＥＰＬＤＲＭＰＤＰＹＲＰＳＹＧＲＡＥＴＶＶＮＮＹＩＲＫＷＱＱＶＹＳＨＲＤＧＲＫＱＱＭＴＥＥＱＲＥＷＬＳＹＧＣＶＧＶＴＷＶＮＳＧＱＹＰＴＮＲＬＡＦＡＳＦＤＥＤＲＦＫＮＥＬＫＮＧＲＰＲＳＧＥＴＲＡＥＦＥＧＲＶＡＫＥＳＦＤＥＥＫＧＦＱＲＡＲＥＶＡＳＶＭＮＲＡＬＥＮＡＨＤＥＳＡＹＬＤＮＬＫＫＥＬＡＮＧＮＤＡＬＲＮＥＤＡＲＳＰＦＹＳＡＬＲＮＴＰＳＦＫＥＲＮＧＧＮＨＤＰＳＲＭＫＡＶＩＹＳＫＨＦＷＳＧＱＤＲＳＳＳＡＤＫＲＫＹＧＤＰＤＡＦＲＰＡＰＧＴＧＬＶＤＭＳＲＤＲＮＩＰＲＳＰＴＳＰＧＥＧＦＶＮＦＤＹＧＷＦＧＡＱＴＥＡＤＡＤＫＴＶＷＴＨＧＮＨＹＨＡＰＮＧＳＬＧＡＭＨＶＹＥＳＫＦＲＮＷＳＥＧＹＳＤＦＤＲＧＡＹＶＩＴＦＩＰＫＳＷＮＴＡＰＤＫＶＫＱＧＷＰ（配列番号４０）。

【0095】

ｐＮＮＣ１３０プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換させ、１５０マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養した。アンピシリンを含む液体ＬＢ培地を、一晩培養した寒天プレートから播種し、ＯＤ_６００が〜０．８になるまで３７℃で２４０ｒｐｍにて培養した。３０℃への２０分の適応化後、０．１ｍＭのＩＰＴＧで発現を誘導させた。４時間のタンパク質の誘導後、およそ２の最終ＯＤ_６００で細胞を収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、大部分のｐｒｏｔＧＡＳＥが、１０ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ８を含むバッファー中での超音波処理と細胞片の遠心分離後に得られた上清中の可溶型画分中に見出されたことを示している。

【0096】

ｐｒｏｔＧＡＳＥの精製：
２００ｍｌの誘導細胞培養物からの細胞ペレットを４０ｍｌの１０ｍＭ ＮａＰＯ_４バッファー（ｐＨ８）に溶解させた。超音波処理と１００００ｇでの遠心分離後に、上清を滅菌濾過し、最終アプリケーション容積を１０ｍＭのＮａＰＯ_４バッファー（ｐＨ８）で５０ｍｌに調整した。
精製は、３ｍｌ／分の流量と次のバッファーを使用して実施例１及び２に記載された機器を使用して実施した：
バッファーＡ： ２５ｍＭのＮａＰＯ_４バッファー ｐＨ８．０
バッファーＢ： ２５ｍＭのＮａＰＯ_４バッファー ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ
５ｍｌのＱセファロース高性能（ＨＰ）ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア）を、バッファーＡを用いて７カラム容積（ＣＶ）に平衡化した。ｐｒｏｔＧＡＳＥを含むアプリケーションをカラムに充填し、未結合試料を１０ＣＶでバッファーＡを用いて洗浄した。３０カラム容量で０−１００％のバッファーＢの線形勾配を使用してｐｒｏｔＧＡＳＥを溶離させた。ｐｒｏｔＧＡＳＥを含むピークは、およそ０．０５ＭのＮａＣｌ濃度でカラムから溶離させられた。集められた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ｐｒｏｔＧＡＳＥの同一性を、タンパク質の予想された理論質量に非常に近い質量を与えたＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。

【0097】

ｐＡＣＳＨ２３８又はｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼを使用するプロドメインの除去
ｐｒｏｔＧＡＳＥを含む第一精製工程からの画分をプールし、バッファーを、ダイアフィルトレーションのためにＶｉｖａｓｐｉｎ２０（１００００ＭＷＣＯ）（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）を使用し、５０ｍＭのトリスＨＣ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含む切断バッファーに代えた。精製したｐｒｏｔＧＡＳＥとｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼの量を、ＨＰＬＣクロマトグラムからのＵＶ２１４ｎｍの吸光度ピーク面積を推定することによって調整した。異なった酵素対基質比（１：１０、１：５０、１：１００及び１：２００）を用いた切断試験を、２５℃で一晩、切断バッファー中に１ｍＭのＤＴＴを含めるか含めないで実施した。実験は、ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼが、１：２００の酵素基質比と切断バッファー中に１ｍＭのＤＴＴを使用してプロドメインを完全に除去（してＧｌｙ−Ｐｒｏ伸長成熟ｔＧＡＳＥを取得）することができたことを示している。放出された成熟ｔＧＡＳＥ及びｐｒｏｔＧＡＳＥの質量はＬＣ−ＭＳを使用して決定した。
同様な試験で、ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼはｐｒｏｔＧＡＳＥからプロドメインを効果的に切断することができることがまた見出された。

【0098】

成熟ｔＧＡＳＥの精製
ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼでの消化後に得られたＧｌｙ−Ｐｒｏ伸長成熟ｔＧＡＳＥを２５ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ６）、１ｍＭのＤＴＴ（バッファーＡ）中で４８ｍｌまで希釈し、次のバッファーを使用して５ｍｌのＳＰセファロース高性能（ＨＰ）ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア）で分離した：
バッファーＡ： ２５ｍＭのＮａＰＯ_４バッファー ｐＨ６．０＋１ｍＭのＤＴＴ
バッファーＢ： ２５ｍＭのＮａＰＯ_４バッファー ｐＨ６．０＋１ｍＭのＤＴＴ＋０．５ＭのＮａＣｌ
精製を、３ｍｌ／分の流量と３０カラム容量に対して０−１００％のバッファーＢからの線形勾配溶離を使用して、実施した。
精製物からのＵＶ２８０クロマトグラムは、一つの主ピークがおよそ０．１ＭのＮａＣｌ濃度でＳＰセファロースＨＰカラムから溶離させられたことを示していた。ＬＣ−ＭＳ分析により、溶離されたタンパク質が成熟ｔＧＡＳＥと同一であることが確認された。ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼは、Ｎ末端に融合した配列番号：１９のタグの高電荷のため、成熟ｔＧＡＳＥよりも更に遅くカラムから溶離され、よって、第二の精製工程後に標的タンパク質から効果的に除去されうる。

【0099】

実施例４
オーバーラップＰＣＲを使用するＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼの合成：
成熟Ａ型肝炎株１８（ＨＡＶ１８）３Ｃプロテアーゼのアミノ酸配列は次の通りである： ＳＴＬＥＩＡＧＬＶＲＫＮＬＶＱＦＧＶＧＥＫＮＧＣＶＲＷＶＭＮＡＬＧＶＫＤＤＷＬＬＶＰＳＨＡＹＫＦＥＫＤＹＥＭＭＥＦＹＦＮＲＧＧＴＹＹＳＩＳＡＧＮＶＶＩＱＳＬＤＶＧＦＱＤＶＶＬＭＫＶＰＴＩＰＫＦＲＤＩＴＥＨＦＩＫＫＧＤＶＰＲＡＬＮＲＬＡＴＬＶＴＴＶＮＧＴＰＭＬＩＳＥＧＰＬＫＭＥＥＫＡＴＹＶＨＫＫＮＤＧＴＴＶＤＬＴＶＤＱＡＷＲＧＫＧＥＧＬＰＧＭＣＧＧＡＬＶＳＳＮＱＳＩＱＮＡＩＬＧＩＨＶＡＧＧＮＳＩＬＶＡＫＬＶＴＱＥＭＦＱＮＩＤＫＫＩＥＳＱ（配列番号：４５）。
成熟ＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ遺伝子のコドン最適化ＤＮＡ断片を、ＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼに対して実施例１に記載されたようにして、ＰＣＲの二つの連続工程を含むオーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシングを使用して、得た。正しい配列を有する最終の断片は、５’端ＸｈｏＩ及び３’端ＢａｍＨＩ部位を有しており、これにより、配列番号：１０コード化部がリンカー及びプロテアーゼコード領域の５末端に結合するように、ｐＥＴ１１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのライゲーションが可能になった。

【0100】

配列番号：１０のタグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ（ｐＡＣＳＨ３６２）の発現
Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）大腸菌株中での発現を、本質的に実施例１に記載されているようにして実施した。配列番号：１０タグつきＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼと同様な発現レベルが達成可能であり、少なくとも８０％のタンパク質が細胞破壊及び遠心分離後に可溶型画分中にあった。

【0101】

配列番号：１０のタグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ（ｐＡＣＳＨ３６２）の精製
ｐＡＣＳＨ２３９プロテアーゼの細胞培養ペレット（８０ｍｌの培養から）を、ｐＨ７の２５ｍＭのＮａＰＯ_４を含むバッファー中での超音波処理によって破壊した。細胞片を１００００ｇの遠心分離によって遠心沈殿させた。上清を、ＡＫＴＡエクスプローラー１００精製システム（ＧＥヘルスケア）を使用して実施した精製前に滅菌濾過した。５ｍｌのカラム容積のプレパックＳＰセファロースＦＦ Ｈｉトラップカラム（ＧＥヘルスケア）を、次のバッファーを使用する３ｍｌ／分の流量での分離に使用した：
バッファーＡ： ５０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７
バッファーＢ： ５０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７＋１ＭのＮａＣｌ
カラムは最初に７カラム容量のバッファーＡに対して平衡にした。アプリケーションの充填後に、７カラム容量のバッファーＡを使用する洗浄によって未結合タンパク質を除去した。２０カラム容積に対して０−１００％バッファーＢの線形勾配を使用して、カラムからｐＡＣＳＨ３６２プロテアーゼを溶離させた。ｐＡＣＳＨ３６２プロテアーゼは０．２−０．３ＭのＮａＣｌの塩濃度でカラムから溶離させた。ｐＡＣＳＨ３６２プロテアーゼの主な部分はこれらの精製条件でカラムに結合した。溶離されたｐＡＣＳＨ３６２プロテアーゼの純度は、単一の陽イオン交換クロマトグラフィー工程後に、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準法によって決定して〜８５−９０％であると推定された。ＬＣ−ＭＳによって、溶離されたプロテアーゼが予想された分子量を有していることがまた証明された。

【0102】

配列番号：１０のタグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ（ｐＡＣＳＨ３６２）の活性の評価
タグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼ（ｐＡＣＳＨ３６２）を用いて、Ｎ末端タグ（配列番号：１９）及び修飾ＨＡＶ１８ ３Ｃ切断部位ＳＳＳＧＧＳＥＬＲＴＱ（配列番号：４９）を持つ介在リンカーを備えたＳ６６１インスリンレセプターアンタゴニストペプチド（配列番号：３７）を含むｐＡＣＳＨ３６０融合タンパク質をプロセシングした。
１：１０又は１：５０の酵素対基質比のｐＡＣＳＨ３６２プロテアーゼ及びｐＡＣＳＨ３６０融合タンパク質を、３７℃での７時間のインキュベーション後にＬＣ−ＭＳによって評価した。放出されたＳ６６１ペプチドを表す断片が、実施例１におけるように、双方の比に対して観察され、タグつきＨＡＶ１８酵素が活性であることが示された。

【0103】

実施例５
タグつきウサギ出血病ウイルス３Ｃ様プロテアーゼのクローニング
サーマス・サーモフィラス、ジオバチルス・コーストフィラス(Geobacillus kaustophilus)、サーモシフォ・メラネシエンシス(Thermosipho melanesiensis)、ＢＩ４２９及びアシドサーマス・セルロリティカス(Acidothermus cellulolyticus)１１Ｂから由来するリボソームタンパク質Ｌ９ファミリーからのタンパク質タグの精製は大腸菌発現に対してコドン最適化され、GENEART GmbH, Regensburg, ドイツから合成遺伝子として得た。タグをコードする遺伝子断片は５’端ＮｄｅＩ部位と３’端ＸｈｏＩ部位を有していた。ウサギ出血病ウイルス３Ｃ様プロテアーゼ（ＲＨＤＶ）をコードする３’端ＢａｍＨＩ部位及び５’端ＸｈｏＩ部位を有するコドン最適化断片がまた得られた（GENEART GmbH, Regensburg，ドイツ）。

【0104】

次のＲＨＤＶプロテアーゼを産生させるために、次のコンストラクトをｐＥＴ１１ａ大腸菌発現ベクター中で標準的なクローン化技術によって構築した：

【0105】

タグつきウサギ出血病ウイルス３Ｃ様プロテアーゼの発現
ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株での発現を、本質的に実施例１に記載されているようにして実施した。非常に類似した発現レベルが４種全てのコンストラクトに対して得られ、上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定して溶解度は約８０％−９０％であり、ペレットは細胞破壊及び遠心分離後に取り出された。
配列番号：４１，４２，４３及び４４のタグつきＨＡＶ１８ ３Ｃプロテアーゼの精製
タグつきＲＨＤＶプロテアーゼのそれぞれの細胞培養ペレット（８０ｍｌの培養から）を超音波処理によって破壊した。既に記載されたものと同じバッファー及び条件を使用して、上清を調製し、予め充填されたＳＰセファロースＦＦ５ｍｌカラム（ＧＥヘルスケア）を使用して分離した。
捕捉工程後のプロテアーゼの回収量の比較の際に、配列番号：４１のタグを含むｐＡＣＳＨ４３３プロテアーゼの場合に最善の結果が得られ、これは残りの変異体の場合よりも〜２−３．５倍のカラム上のタンパク質に結合した。

【0106】

実施例６
ｐｒｏｔＧＡＳＥ（ｐＮＮＣ１３０）又はｐＡＣＳＨ２９４（Ｓ６６１融合タンパク質）とタグつきＨＲＶ１４ ３Ｃプロテアーゼ変異体の同時発現
ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）プラスミドよりも少ないコピー数を有しており、該プラスミドから生産されたタンパク質の量はｐＥＴ１１ａプラスミドより低くなければならない。更に、プラスミドは、ｐＥＴ１１ａとは異なった選択マーカー（クロラムフィニコール耐性）を含んでおり、同じ宿主株におけるこれら二つのプラスミドの維持及び同時発現を可能にする。ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼの発現に対してｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターを、またｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼによってプロセシングされうるＳ６６１融合タンパク質（ｐＡＣＳＨ２９４）又はｐｒｏｔＧＡＳＥ（ｐＮＮＣ１３０）の発現に対してｐＥＴ１１ａベクターを使用して、タグつきプロセシング酵素を使用する標的タンパク質前躯体のプロセシング方法が実施可能かどうかを評価した。
ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼをコードするｐＥＴ１１ａプラスミドの断片（実施例１）及び開始コドンの上流のベクター骨格の一部をＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いて切除し、ＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミド骨格（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にライゲーションした。

【0107】

ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼを発現するｐＡＣＹＣＤｕｅｔ１プラスミドを、ｐｒｏｔＧＡＳＥ（ｐＮＮＣ１３０）をコードするｐＥＴ１１ａプラスミドかＳ６６１融合タンパク質（ｐＡＣＳＨ２９４）の何れかと共にＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。よって、ある株はｐｒｏｔＧＡＳＥと共にｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼ（ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１プラスミド由来）を同時発現でき、他の株はＳ６６１融合タンパク質（ｐＡＣＳＨ２９４）と共にｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼを発現する。
同時発現株を、ｐｒｏｔＧＡＳＥ又はＳ６６１融合タンパク質の何れかだけを発現するコントロール株と平行して、１５０マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンと３４マイクログラム／ミリリットルのクロラムフィニコールを含むＬＢ培地で培養した。発現条件は実施例１において、ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼに対して記載した通りであった。３０℃での３時間の発現後、同時発現株とそのコントロールを収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、同時発現は、コントロールと比較して誘導ｐｒｏｔＧＡＳＥ又はＳ６６１融合タンパク質に対して、より低い分子量を生じたことが明らかになった。ｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼ／ｐｒｏｔＧＡＳＥ同時発現株からのＳＤＳゲルバンドに存在している切断された誘導タンパク質は、ゲル内（in-gel）消化後の標準的な質量分析ベースの方法を使用してｔＧＡＳＥと同定された。従って、結果は、同時発現されたｐＡＣＳＨ２３８プロテアーゼが、ｐｒｏｔＧＡＳＥからプロドメインを、Ｓ６６１融合タンパク質からインビボで配列番号：１９の精製タグを切断することができたことを示している。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]