【実施例】
【0089】
一般的に記載してきた本発明は、本発明のある態様および具体例の単に説明の目的で含め、断じて本発明を限定される意図ではない以下の実施例を参照してより容易に理解することができる。他の態様、利点および修飾は特許請求の範囲内のものである。
【0090】
(実施例1)クローニングおよび蛋白質発現
全てのDNA操作は標準的な技術、特にPCRを用いるクローニング、PCR−ベースの突然変異誘発手法、および標準的な制限消化および連結を用いて行った。配列決定がLark technologies Ltd,Saffron Walden,UKによって行った。全ての蛋白質はE.coliにおいて発現させ、1mg/mlのリソソームを用いる溶解および2ないし3の凍結解凍サイクルに続いてIM NaCl中で精製した。Ni−NTA樹脂はQiagenから購入した。
増幅反応
個々の増幅反応についての条件は以下に供する詳細な記載で記載する。一般に、反応は、SYBR Green色素を含めることによって、なおよりしばしばは、我々が開発したプローブ−ベースのアプローチの使用によって、リアルタイムでモニターした(Piepenburg et al.2006参照)。この場合、プローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーによって近接挟まれた内部テトラヒドロフラン残基(脱塩基部位ミメティック)を含有する第三のDNAプライマーである。増幅されたDNAに対するハイブリダイゼーションに対してこのプローブは、反応に含めた酵素であるエンドヌクレアーゼIV(Nfo)またはエキソヌクレアーゼIIIのエンド核酸分解活性に対する基質となる。
【0091】
本明細書中に記載された蛍光プローブの配列は以下の通りである:
【0092】
【化2】
ここに、(T)はdT−TAMRAであり、(F)はdt−フルオレセインであり、(H)はTHFであり、(q1)はdT−BHQ1であり、(q2)はdT−BHQ2であり、(q3)はdT−DDQ1である。Nfo酵素は200ng/μlで用いたが、ほとんどの全てのプローブ−ベースの実験は65ng/μlのエンドヌクレアーゼIIIを使用した。励起/検出は485/525nm(SYBR GreenまたはプローブBsFlc)または530/575nmにおけるものであった(SATamra1/2)。測定は30ないし45秒毎に行った。蛍光プローブデータを水対照で正規化し、プレ−増幅ベースラインを調整した。一般に、正規化された蛍光の読みの対数をプローブ−ベースの実験についての時間に対してプロットした。
増幅プライマー:
【0093】
【化3】
【0094】
【化4】
クローンは、T6ファージ、Rb69ファージ、Aeh1ファージ、またはファージKVP40を用いるPCRによって構築した。
図1は、ミオウイルスからの多様な組換えマシーナリーをコードする新規なクローンの模式的レイアウトを示す。修飾されたpET21+プラスミド(Novagen)を用い、ヘキサヒスチジンタグをPCRプライマーに作製して、N末端(UvsY蛋白質)において、またはC末端(UvsXおよびgp32蛋白質)においてタグをイン−フレームでコードさせた。整列および後の考察において、アミノ酸残基の数とは、関連データベースに記載されている天然蛋白質における位置をいう。UvsYの場合には、6つのヒスチジン、および用いたクローンにおけるこれに先行するメチオニンがある。
【0095】
(実施例2)多様なレコンビナーゼ蛋白質の一次配列整列
T4 UvsおよびE.coli RecAの一次配列整列
(Expasyプロテオミックスサーバーを介してアクセスした)ウェブ−ベースのツールNAFFTを用いて、
図2に示したように、T4 UvsおよびE.coli RecAの位置維持ポリペプチド配列を整列させた。この整列は生成させ、かつ他の箇所で議論したものと合致した。E.coli RecAの既知の結晶構造に基づき、注目する3つの領域、すなわち、ATP結合および加水分解に関与するWalker Aモチーフ、モバイルDNA結合ループ1、およびモバイルDNA結合ループ2配列の位置をボックスに入れる。整列下で、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性(*)、保存された置換(:)、または半−保存置換(.)を示す。
同等T4 UvsX残基の重ね合わせおよび標識を備えたRecA構造のモデル
RecAヌクレオ蛋白質フィラメントのモデルは、CN3DおよびNCBIデータベース、PDBエントリー1N03(関連引用Vanloock MS et al.,Structure 2003 Feb;1(2)187−96)からダウンロードされたデータセットを用いて作成した。
図2中の整列を用い、T4 UvsX残基の推定位置を、注目するUvsXアミノ酸の可能な位置および相互に対するそれらの近接性についての洞察を供するにおけるエクササイズとしてRecA構造にマッピングした。
図3は、一次配列整列に基づく同等T4 UvsX残基の重ね合わせおよび標識を備えたRecA構造のモデルを示す。
図3Aは、結合したDNAの近似的ロケーションである中央穴を備えたモデルRecAフィラメントの軸を見下ろすスクリーンショットを示す。Walker AモチーフおよびモバイルDNA結合ループの近似的ロケーションは単一サブユニットについて示され、それは核酸に面する表面にある。
図3Bおよび3Cは、2つのズームドショットが、ATPが(A)に示された表面に結合した領域から取った。T4 UvsX残基G60、S64、S67、F69、G70、H195、およびM208の推定位置を
図3に示す。また、モバイルDNA−結合ループ2の始まりおよび終わりの近似的ロケーションも示される。これらのアミノ酸はこのモデルで示されるように正確に位置させることは、RecA および UvsXの間のかなりの多様性を仮定するとありそうにないが、しかしながら、これらの近似は、おそらくは、本明細書中における研究についての意義ある有用性のものである。
T4 および T6 g32および UvsY蛋白質の一次配列整列
(Expasyプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた)ウェブ−アクセスツールMAFFTを用いて、
図4に示すように、T4およびT6、gp32およびUvsY蛋白質の一次ポリペプチドの配列を整列させた。この整列により、これらの蛋白質の間の唯一の小さな差が明らかとなった。UvsY蛋白質は唯2つの高度に保存的置換を有した。整列の下では、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性(*)、保存された置換(:)、または半−保存置換(.)を示す。
多様なUvsX蛋白質の一次配列整列
(Expasyプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた)ウェブ−ベースのツールMAFFTを用いて、
図5に示したように、T4、T6、ファージ133、Rb69、Aehl、Ae65、KVP40、Rb43、PSSM2、およびPSSM4 UvsX蛋白質の一次ポリペプチド配列を整列させた。注目するいくつかの配列の領域、すなわち、DNA結合および加水分解に関与するWalker Aモチーフ(または、「P−ループ」)、モバイルDNA結合ループ1、およびモバイルDNA結合ループ2をボックスに入れた。議論するある残基は、強調した。T4およびT6 UvsXの間の全てのアミノ酸の差を太文字で示す。整列下で、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性(*)、保存された置換(:)、または半−保存置換(.)を示す。
多様なUvsY蛋白質の一次配列整列
(Expasyプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた)ウェブ−ベースのツールMAFFTを用いて、
図6に示すように、T4、T6、ファージ133、Rb69、Aehl、KVP40、Rb43、PSSM2、およびPSSM4 UvsX蛋白質の一次ポリペプチド配列を整列させた。この整列において、PSSM4配列はゲノムDNAの自分自身の翻訳、ポリペプチド配列からの最初の43残基を誤って見掛け上省略するNCBIエントリーに由来した。整列下で、記号は全てのホモログの間のアミノ酸同一性(*)、保存された置換(:)、または半−保存置換(.)を表す。
多様なgp32蛋白質の一次配列整列
(Expasyプロテオミックスサーバーを介してアクセスされた)ウェブ−ベースのツールMAFFTを用いて、
図7で示すように、T4、T6、Rb69、Aehl、KVP40、Rb43、PSSM2、およびPSSM4 gp32蛋白質の一次ポリペプチド配列を整列させた。この整列において、PSSM2配列は、ゲノムDNAの自分自身の翻訳、ポリペプチド配列から最初の25残基を見掛け上誤って省略するNCBIエントリーに由来した。整列下で、記号は、全てのホモログの間のアミノ酸同一性(*)、保存された置換(:)または半−保存置換(.)を表す。また、矢印によって、T4 gp32における亜鉛の配位に関連する残基の位置も示される。また、配列の上方の線によって、シアノファージgp32蛋白質には存在せず、かつT4 gp32の亜鉛原子におけるように協働結合に関連する共通の配列FKRK(またはRb43におけるFKRQ)が示される。シアノファージgp32蛋白質における配位残基の欠如は、これらの蛋白質は活性のために亜鉛、コバルト、ニッケル等のような金属を必要としないであろうことを示唆する。KVP40金属−結合領域の再組織化状態は、この蛋白質が亜鉛には結合できないが、むしろ異なる金属に結合できないが、むしろ異なる金属原子に結合できることを示唆し、あるいは成長の間における亜鉛についての改変された要件、あるいは競合体金属原子による置換攻撃に対する改変された感受性を示すことができる。
【0096】
(実施例3)異種成分を用いるRPA反応におけるT4 UvsXに代えて置換されたT6 UvsX
RPA反応は、その配列が示されたプライマーRs8179145−2およびRs8179145−3を用いて構成した。標的DNAはヒトゲノムDNAであって、反応条件は以下の通りであった:100mM酢酸カリウム、50nMトリスアセテートpH8.3、50mMホスホクレアチン、3mMP ATP、200μM dNTP、300nM Rs8179145−2プライマー、300nM Rs8179145−3プライマー、150ng/μL T4またT6 UvsX、1000ng/ng/μL T4 gp32、40ng/μL T4UvsY、42コピーのヒトゲノムDNA、5% Carbowax 20M、および32ng/μL Bsuポリメラーゼ。90分後に、Qiagen
PCR産物クリーンアップカラムを通す遠心を介して試料を精製した。精製された試料は臭化エチジウム染色アガロースゲルで分析した。ヒト遺伝子座Rs817945からの予測されたアンプリコンサイズは205bpであった。
図8に示されるゲル上のアスタリスクは、予測されるバンドの位置、205bpを示し、マーカーバンドの位置は左側に示す。
図8に示すように、T6 UvsXは異種成分を用いるRPA反応においてT4 UvsXに代えて効果的に置換することができる。
【0097】
RPA反応を確立して、SYBR Green色素を用い、プライマーJ1およびK2を用い、以下の条件下でT6およびT4 UvsXのキネティクスを比較した:50mM
トリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、T4またはT6の120ng/μl UvsX、30ng/μl UvsY、900ng/μl gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、5% Carbowax 20M、300nM増幅プライマー、SYBR Greenのストックからの1:50,000希釈(Invitrogen)。反応を96−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、周期的に頂部−読み取りプローブから測定を行った。試料は標的(水)を含有しないか、または標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの50または5000コピーを含有した。試料はT4またはT6 UvsXいずれか、およびレコンビナーゼを含有し、標的の存在は脚注に示す。各試料は二連で実行した。
【0098】
陽性シグナルは60分間のインキュベーションの間に全ての試料で発生し、シグナルの時間の増加は予測される非−標的試料におけるよりも標的−含有試料において早かった。
図9に示すように、シグナル増加が最初に検出された時刻はT4およびT6試料の間で同様であった。しかしながら、曲線は異なる傾きおよび最終最大でもって作成された。T6はより鋭くないシグナルの蓄積およびより高くない最終シグナルを与えた。
【0099】
また、RPA反応を確立して、蛍光プローブを用い、プライマーorfx45a(120nM)およびsccii35IV(480nM)を用い、以下の条件下でT6およびT4 UvsXのキネティクスを比較した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlのクレアチンキナーゼ(Roche)、T4またはT6の120ng/μl UvsX、30ng/μl UvsY、900ng/μl Bsuポリメラーゼ、5% Carbowax 20M、120nM蛍光プローブSATamra2。エキソヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含めた。反応を384−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージに備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的(水)を含有せず、標的配列を含有するMRSA3(mecl)ゲノムDNAの100または1000コピーいずれかを含有した。試料はT4またはT6 UvsX、およびレコンビナーゼのいずれかを含有し、標的の存在は脚注に示す。各試料は二連で実行した。
【0100】
陽性シグナルは90分のインキュベーションの間に鋳型陽性試料で発生し、シグナル増加の時刻は最高標的−含有試料で最も早かった。
図10に示すように、シグナル増加が最初に検出された時刻は、特に、1000コピー資料についてT4およびT6試料の間で同様であったが、曲線は異なる傾きおよび最終最大を伴って発生した。T6はより鋭くないシグナルの蓄積、およびより高くない最終シグナルを与えた。
【0101】
(実施例4)作成されたT6 UvsX蛋白質構築体
修飾されたpET21+ベクター中にT6 UvsXを含有する親プラスミドクローンは、標準的なPCR突然変異誘発プロトコルを用いて改変した。推定構造エレメントに対するコーディング領域/一次ポリペプチド配列の関連の模式的レイアウトを
図11の頂部に示す。模式図でボックスとして示される3つの領域、Walker Aモチーフ、DNA結合ループ1およびDNA結合ループ2に対して修飾を行った。いくつかの領域およびアミノ酸は標的であって、これらはクローンに与えられた名称の次の下側模式図に示される。数字は野生型T6 UvsX蛋白質中のアミノ酸の位置をいい、よって、H66Sは、野生型T6中のアミノ酸66として存在するヒスチジンがセリンに改変されたことを意味する。
図11の左側には、RPAアッセイでテストした場合にこのクローンから生じた蛋白質の一般的活性の単純な図を示す。
T6 UvsX H66Sおよび野生型T6 UvsXの比較
RPA反応を確立して、プライマーJ1(120nM)およびK2(480nM)を用い、以下の条件下でT6 UvsX H66Sおよび野生型T6 UvsXを比較した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50mg/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、120ng/μl UvsXのT4またはT6 UvsX H66S、45ng/μl T4 UvsY、900ng/μl T4 gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、5% Carbowax 20M、120nM蛍光プローブBsFlc。エキソヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含めた。反応を384−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの100または1000コピーいずれかを含有した。試料はT4またはT6 UvsX H66S、およびレコンビナーゼのいずれかを含有し、標的の存在は
図12において脚注に示す。各試料は二連で実行した。
【0102】
T6 UvsX H66Sの配列は以下の通りである:
【0103】
【化5】
【0104】
図12に示すように、90分のインキュべーションの間に陽性シグナルが試料中で発生し、シグナル増加の時刻は最高標的−含有試料において最も早かった。シグナルは、特に、1000コピー試料について、T6 UvsX H66S−含有試料においてより早く、曲線は最終最大を生じた。この実験に基づくと、T6 UvsX H66Sは野生型T6 UvsXよりもこれらのアッセイにおいて良好に実行されたと結論された。しかしながら、この系を用いるシグナル蓄積の傾きは2つの蛋白質の間で同様であり、従って、T6 UvsX H66SはこのアッセイにおいてはT4 UvsXの活性を正確に再現するようではない。
T6 UvsXの他の突然変異体のキネティック挙動
RPA反応は、突然変異体T6 UvsX成分を用い、プライマーJ1(120nM)およびK2(480nM)を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、T6またはT6 UvsX H66Tの120ng/μlまたはT6 UvsX M71F/S72GまたはT6 UvsX S164V/A166S、45ng/μl T4 UvsY、1000ng/μl T4gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、6% Carbowax 20M、120nM蛍光プローブBsFlc。エンドヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含めた。反応を384−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は水、または脚注に示したように標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの200コピーを含有した。
図13に示すように、90分のインキュベーションの間にいくつかの試料において陽性シグナルが発生した。シグナルはT6 UvsX S164V/A 166S、次いで、野生型試料において最も早く発生した。シグナルがT6 Uvs H66T試料においてかなり遅く蓄積し、T6 UvsX M71F/S72G試料においてシグナルは蓄積しなかった。T6 UvsX S164V/A166Sはこれらのアッセイにおいてよく実行されたが、いくつかのより遅い実験では、野生型T6 UvsXに対してほとんどまたは全く差は見出されなかったと結論された。さらに、T6 UvsX H66Tは貧弱な活性を有し、T6 UvsX M71F/S72Gは不活性であると結論された。
【0105】
T6 UvsX S164V/A166Sの配列は以下の通りである:
【0106】
【化6】
【0107】
(実施例5)Rb69成分を用いるRPA
RPA反応はRb69成分を用い、プライマーJ1およびK2を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、100ng/μl UvsXのRb69、20ないし100ng/μl Rb69 UvsY、400ng/μl Rb69 gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、7% Carbowax 20M、300nM増幅プライマー、SYBR
Greenのストックからの1:50,000希釈(Invitrogen)。反応は384−ウェルプレート中の氷上で確立され、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に実験を行った。試料は標的(対照−水)を含有せず、または標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの2500コピーを含有した。試料は変化させる濃度のRb69 UvsYを含有し、用いる量は脚注に示す。
【0108】
図14に示すように、90分のインキュベーションの間に全ての試料において陽性シグナルが発生し、シグナル増加の時点は、60ng/μl異常のRb69 UvsYの濃度についての理想的な要件の基礎となるより高い量のUvsYを含有する試料においてより早かった。対照試料は60ng/μlのUvsYを含有するが、標的DNAを欠如する陽性試料と同一の条件下で行った。この実験は、Rb69成分を使用して、感受性活特異的増幅系を構成することができる。
【0109】
(実施例6)Aeh1成分を用いるRPA
RPA反応はAeh1成分を用い、プライマーJ1(120nM)およびK2(480nM)を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、200ng/μl Aehl UvsX、80ng/μl Aehl UvsY、500ng/μl Aehl gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、7%PEG化合物、120nM蛍光プローブBsFlc。エキソヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含めた。反応は384−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は、
図15に示された脚注に示されたように、水、標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの10、100または1000コピーいずれかを含有した。
塩滴定
また、RPA反応はAeh1成分テスト塩滴定を用い、プライマーJ1およびK2を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpHXX、60または80または100または120または140または160mMの酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMのリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlのクレアチンキナーゼ(Roche)、150ng/μl UvsXのAeh1、50ng/μl Aehl UvsY、500ng/μl Aehl gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、7% Carbowax 20M、300nM増幅プライマー、SYBY Greenのストックからの1:50,000 希釈(Invitrogen)。反応を384−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの2000コピーを含有した。
【0110】
図16に示すように、90分のインキュベーションの間に全ての試料において陽性シグナルが発生した。この実験は、Aeh1成分を首尾よく使用して、広い範囲の塩濃度にわたってDNAを増幅することができることを示唆する。
T4と比較したAeh1
RPA反応を確立して、プライマーorfx45a(100ng/μl)およびsccii35IV(500ng/μl)を用い、以下の条件下でAeh1増幅をT4増幅系と比較した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、200ng/μl Aehl UvsX、80ng/μl Aehl、UvsY、500ng/μl Aehl gp32、70ng/μl、Bsuポリメラーゼ、7%PEG化合物(Sigma)、120nM蛍光プローブSATamura2。あるいは以下の組換え成分以外は同様な条件下で比較した:120ng/μl T4 UvsX、30ng/μl T4 UvsYおよび900ng/μl T4 gp32。エキソヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含めた。反応は384−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は、脚注に示すように、水、標的配列を含有するMRSAゲノムDNAの10または1000コピーを含有した。
図17に示すように、見積られた10コピーが供された場合に、シグナルはいずれの組換え系でも検出されなかった。より後の実験に基づくと、本実験で用いたDNA希釈は妥協したものであって、よって、現実のコピー数は予測されたものよりも有意に低いと考えられた。
図17に示すように、Aeh1組換え系はT4よりも遅く検出閾値に到達し、本実験においてはより低い全シグナル強度を達成する。
Aehl UvsXおよびUvsYは異種gp32を用いて増幅することができる。
【0111】
RPA反応はプライマーJ1およびK2を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlのクレアチンキナーゼ(Roche)、200ng/μl UvsXのAeh1、100ng/μl Aehl UvsY、300ng/μl Aehl gp32または500ng/μl Rb69 gp32または700ng/μl T4 gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、7%Carbowax 20M、300nM増幅プライマー、SYBR Greenのストックからの1:50,000希釈(Invitrogen)。反応は384−ウェルプレート中の氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの2000コピーを含有した。
【0112】
図18で示すように、シグナルは全ての試料で発生し、これは、DNA増幅が全ての場合に起こったことを示す。最速かつ最強のシグナルはAehl gp32を使用した場合に発生し、次いで、Rb69 gp32、次いで、T4 gp32であった。gp32分子の相対的有効性は注意深く解釈すべきである。というのは、それらは同一濃度で使用したのではなかったからである。
【0113】
(実施例7)異種反応成分を用いるRPA
RPA反応は、ヒトゲノムDNAからの大まか300塩基対デュプレックス産物を増幅するプライマーApo300およびApoB4を用いて確立した。以下の条件を使用した:50mMトリスアセテートpH8.3、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、200ng/μl UvsXのKVP40、AehlまたはRb69、示された32ng/μl UvsYのKVP40、AehlまたはT4、600ng/μl Rb69 gp32またはT4 gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、5%Carbowax 20M、300nM増幅プライマー。反応を確立し、37℃に90分間放置した。全ての試料は、標的配列を含有するキットゲノムDNAの1000コピーを含有した。gp32、UvsXおよびUvsYの種に関する各反応の正確な組成を示す。試料は、Qiagen PCRクリーンアップカラムの通過によって精製し、臭化エチジウムを含有する2%アガロースゲル上の電気詠動に付した。
図19に示すように、増幅は、Rb69 gp32とAehl UvsXおよびUvsYとの不均一な混合物を含有する試料で起こった。
【0114】
(実施例8)作成されたRb69構築体
修飾されたpEP21+ベクター中のRb69 UvsYの我々の親クローンの変形物を作成した。興味のある領域に注目するRb69のコーディング一次アミノ酸配列の総じてのレイアウトを
図20の頂部に示す。コーディング配列の変化を作り出して、具体的には、Walker Aモチーフ中およびその周りの、DNA−結合ループ2中およびその周りの、および蛋白質の非常にC側末端のコードされたアミノ酸を改変した。Walkerモチーフ中およびその周りの改変は、特殊なレタリング、およびRb69野生型蛋白質中のアミノ酸の位置に言及する数値、どんなアミノ酸か、および何にそれが突然変異したかによって示される。例えば、H64Sとは、天然蛋白質のヒスチジン64のセリンへの改変をいう。DNA−結合ループ2の領域における改変された配列は、異なるスキームに従って示される。この場合、DNA結合ループ配列のほとんどまたは全ては、T6またはT4 UvsXからループによって置換えられた。T6−1が示される場合、これは配列NHT AMEIGGLYPKE IMG GG(配列番号:107)の、配列NHT IETIEMFSKT VMG GG (配列番号:108)での置き換えをいい、そこでは、下線を施したグリシンはT6天然配列ではなく、Rb69配列と同様である。T6が示される場合、これは、Rb69配列のNHT IETIEMFSKT VHT GG
(配列番号:109)での置き換えをいい、そこでは、下線を施したスレオニンはこの位置における天然T6配列である。T4が示される場合、これは、Rb69配列の、NHT YETQEMFSKT VMG GG(配列番号:110)であるT4配列での置き換えをいう。C末端に対する修飾の場合には、記号「LSD」は、コードされたアミノ酸配列END LED MEDFDE(配列番号:111)からの非常にC側末端におけるRb69の天然配列の、配列END LED LSD MEDFDE(配列番号:112)への改変を示す。記号「LDE LDE」または時々は脚注においては「2×LDE」とは、Rb69 C−末端配列のEND LDE MEDFDE LDE LDE(配列番号:113)への変化をいう。すべての場合において、非常にC−末端側配列に続いて、蛋白質精製で用いられる6ヒスチジン残基をコードする18塩基が続く。
【0115】
簡単に述べれば、先に議論した選択された配列は以下にリストされる。
【0116】
Rb69 UvsX H64S配列は以下の通りである:
【0117】
【化7】
端部における6つの「H」は任意である。
【0118】
Rb69 UvsX H64S LSD配列は以下の通りである:
【0119】
【化8】
【0120】
【化9】
端部の6つの「H」は任意である。
【0121】
Rb69 UvsX H64S 2×LDE配列は以下の通りである:
【0122】
【化10】
端部の6つの「H」は任意である。
【0123】
Rb69 UvsX H64S T6/2×LDE配列は以下の通りである:
【0124】
【化11】
端部の6つの「H」は任意である。
【0125】
Rb69 UvsX H64S T4/2×LDE配列は以下の通りである:
【0126】
【化12】
【0127】
【化13】
端部の6つの「H」は任意である。
【0128】
Rb69 UvsX H64S T67S L68N T4/2×LDE配列は以下の通りである:
【0129】
【化14】
端部の6つの「H」は任意である。
【0130】
修飾されたpET21+ベクター中のRb69 UvsXの親クローンに対するさらなる改変物を作製した。興味があるさらなる領域に注目するRb69のコーディング/一次アミノ酸配列の全体的レイアウトを
図21の頂部に示す。コーディング配列における変化を、具体的には、DNA−結合ループ2中およびその周りに生じさせた。完全なDNA−結合ループ2配列を、ファージ133、ファージAeh1、ファージKVP40、代表的な(ハイブリッド)シアノファージ配列からの同等な配列、またはE.coli RecAからのループで置換えた。Ach1部分およびRb16部分であるループもテストした。正確なアミノ酸置換を
図21に示す。RPAにおける発現/精製の間にこれらのクローンから生じた蛋白質の挙動/活性に関するまとめ注釈を
図20および21の左側に掲げる。
【0131】
Rb69 UvsX配列は以下の通りである:
【0132】
【化15】
Rb69 ループ133 UvsX配列は以下の通りである:
【0133】
【化16】
Rb69 ループKVP40 UvsX配列は以下の通りである:
【0134】
【化17】
Rb69 H64Sの活性
野生型Rb69、またはT4 UvsXと比較した突然変異体Rb69 H64S蛋白質の活性のキネティック実験を行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は、組換え成分のタイプおよび濃度、およびPEG化合物を7%w/vで使用した以外は
図13に示した実験に関するのと同じであった。他の変更は以下の通りである:120ng/μl T4 UvsX、900ng/μl T4 gp32、50ng/μl T4 UvsY、あるいは100ng/μl Rb69またはRb69 H64S UvsX、400ng/μl Rb69 gb32、80ng/μl Rb69 UvsY。標的DNAは合計100コピーで存在させる。
図22に示したように、Rb69 H64S蛋白質は(この実験は増幅の間に生じたDNAの性質に取り込むものではないが)このアッセイによるとよく作動し、野生型蛋白質のキネティックスよりも性能が優れているようである。行った次の実験において、見掛け上同一の条件(400ng/μl Rb69 gp32)下での速度、結果はわずかに異なるものであった。これは、最もありそうには、後者の実験におけるわずかなピペッティング誤差によるものであろう。
Rb69 H64S−gp32アップ−滴定に対する相対的抵抗性
野生型Rb69と比較した突然変異体Rb69 H64S蛋白質の活性のキネティック実験を行い、そこでは、Rb69 gp32の量を幾分変化させた。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は、pg32蛋白質の可変濃度を除いて
図22で示した実験に関するものであり、そのPEG化合物は6%w/vで使用した。条件は:示された100ng/μl Rb69あるいはRb69 H64S UvsX、Rb69 gp32濃度、80ng/μl Rb69 UvsYであった。標的DNAは合計100コピーで存在させた。
図23に示すように、gp32のアップ滴定はRb69蛋白質と比較してRb69 H64Sのキネティックスに対してより低いインパクトを有した。RbH64Sはgp32による競合に対して幾分より抵抗性であると結論された。
野生型Rb69と比較したRb69 H64Sの活性
野生型Rb69と比較した突然変異体Rb69 H64S蛋白質の活性のキネティック実験を行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は、組換え成分のタイプおよび濃度およびPEG化合物を6%w/vで用いた以外は
図22に示した実験についてのものであった。他の条件は以下の通りである:100ng/μl Rb69またはRb69 H64S UvsX、400ng/μl Rb69 gp32、80ng/μl Rb69 UvsY。標的DNAは示された合計0コピー、100コピー、または1000コピーで存在させた。
図24に示すように、Rb69 H64S蛋白質はこのアッセイに従ってよく作動し、野生型蛋白質の挙動よりも性能がよい。
300ないし500ng/μl gp32におけるRb69 UvsX H64Sの活性
突然変異体Rb69 H64S蛋白質の活性のキネティック実験は、300、400、または500ng/μlのRb69 gp32蛋白質の条件下で行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的な条件は
図22に示した実験に関する通りであったが、gp32濃度を変化させ、PEG化合物は6%w/vで用いた。かくして、蛋白質濃度は以下の通りであった:100ng/μl Rb69 H64S UvsX、300ないし500ng/μl Rb69 gp32、80ng/μl Rb69 UvsY。標的DNAは、示されたように、0(水対照)または合計100コピーで存在させた。
図25に示すように、Rb69 H64Sは、Rb69 gp32蛋白質のテストされた範囲に渡って、Rb69 H64S蛋白質はキネティック挙動においてほとんど差なしにこのアッセイに従ってよく作動した。
Rb69 H64S UvsXの滴定
突然変異体Rb69 H64S UvsX蛋白質の活性のキネティック実験は、変化させる濃度のUvsX蛋白質下で行った。蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを採用した。一般的条件は
図22に示された実験についての通りであったが、Rb69 H64S UvsXの濃度を変化させ、PEG化合物は6% w/vで用いた。かくして、蛋白質濃度は以下の通りであった:100、150または200ng/μl Rb69 H64S UvsX、500ng/μl Rb69 gp32、80ng/μl Rb69 UvsY。標的DNAは示したように合計0(水対照)または100コピーで存在させた。
図26に示すように、Rb69 H64S蛋白質はこのアッセイに従ってよく作動し、UvsX濃度は有意に100ng/μlを超えないことを供する。
【0135】
突然変異体Rb69 H64S蛋白質の活性のもう1つのキネティック実験は、蛍光プローブベースのモニタリングアプローチを用いて変化させる濃度のUvsX蛋白質下で行った。一般的条件は
図22に示した実験に関する通りであったが、Rb69 H64S UvsXの濃度は変化させ、PEG化合物は6%w/vで使用した。かくして、蛋白質濃度は以下の通りであった:60、80または100ng/μl Rb69 H64S UvsX、500ng/μl Rb69 gp32、80ng/μl Rb69 UvsY。標的DNAは示された合計0(水対照)または100コピーで存在させた。
図27に示すように、Rb69 H64S蛋白質は、蛋白質が60ないし100ng/μlの範囲内にあるか否かに拘わらず、このアッセイに従ってよく作動する。
T4 UvsXおよびUvsYとの反応におけるRb69 gp32の有効性
T4 UvsXおよびUvsYと組合せた場合のRb69 gp32の利用性を調べるキネティック実験を行った。RPA反応はJ1(120ng/μl)およびK2(480ng/μl)を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン、(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチニンキナーゼ(Roche)、120ng/μl T4 UvsX、30ng/μl T4 UvsY、900ng/μl T4 g32あるいは500ng/μl Rb69 gp32あるいは1000ng/μl、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、6% PEG 35,000、120nM蛍光プローブBsFlc。エキソヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含めた。反応は384−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、38℃に設定したステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから実験を周期的に行った。試料は、水、または脚注に示したように標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの100コピーを含有した。
図28に示したように、全ての鋳型陽性試料は効果的に働き、T4およびRb69 gp32蛋白質の使用の間でほとんど差はないように見えた。
Rb69 gp32を双方の場合で用いる場合、T4はRb69 UvsX/UvsYよりも性能がよい。
【0136】
T4 UvsXおよびUvsYと組み合わせた場合、あるいはRb69 UvsXおよびUvsYと組み合わせた場合、Rb69 gp32の利用性を調べるキネティック実験。RPA反応はプライマーJ1(120nM)およびK2(480nM)を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM
ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、120ng/μl T4 UvsX、30ng/μl T4 UvsY、1000ng/μl Rb69 gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、6% PEG 35,000、300nM増幅プライマー、120nM蛍光プローブBsFlc。エキソヌクレアーゼIIIは、65ng/μlで含めた。別法として、同様の条件を使用したが、レコンビナーゼは100ng/μl Rb69 UvsXであって、負荷蛋白質は80ng/μl Rb69 UvsY蛋白質であった。反応は384−ウェルプレート中で氷上で確立され、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は水、あるいは脚注に示したように標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの100コピーを含有した。
図29に示すように、全ての鋳型陽性試料は陽性シグナルを発生したが、T4 UvsXおよびUvsYで確立された系はかなり初期および強いシグナルを発生した。Rb69 gp32濃度が1000ng/μl Rb69まで上昇させた場合に、T4成分を用いる場合に増幅の阻害はほとんど起こらないが、Rb69 UvsXおよびUvsYを用いる場合、有意な阻害がある(
図23におけるRb69 UvsXおよびUvsYでのRb69 gp32過剰滴定の効果参照)。
Rb69 UvsX H64T蛋白質の貧弱な活性
Rb69 UvsX−コーディングクローンを作製し、そこでは、ヒスチジン64をスレオニンに改変した。この突然変異は先に評価したRb69 UvsX H64S蛋白質と類似しており、スレオニン残基がRPA挙動を改良するにおいてセリン残基と同程度に効果的であるか否かをテストするために設計した。一般的な反応条件は以下の例外を除いては
図29中の実験について記載したのと同一であった。:UvsXは100ng/μlのRb69野生型UvsX、または100ng/μlのRb69 UvsX H64T、80ng/μlのRb69 UvxY、および500ng/μl Rb69 gp32いずれかであった。DNA標的は0または100コピーいずれかで存在させた。
図30に示すように、Rb69 UvsX H64Tを用いて行った反応はほとんどシグナルを発生せず、このアミノ酸置換はセリンをこの位置において置換した場合とは対照的に効果的でないと推定された。
Rb69 UvsXを用いるATP滴定
Rb69 UvsXを用いる場合の増幅キネティクスに対する異なるATP濃度の効果を調べた。反応条件は、
図30における通りであるが、野生型Rb69 gp32、UvsX、およびUvsYのみを用いた。ATPの最終濃度は1mM、2mM、または3mMいずれかに調整した。標的は示したように0または100コピーでいずれかで存在させた。
図31に示したように、増幅は、標的DNAを存在させたすべての場合に起こったが、最強のシグナルは3mM ATPを用いた場合に発生する。
Rb69 UvsXおよびUvsYに対するT4 gp32の抑制効果
Rb69 UvsXおよびUvsY蛋白質と共にT4 gp32蛋白質を用いる効果を調べた。条件は、以下の修飾を施して
図29に記載されたものと同一であった。Rb69
UvsXは100ng/μlで用いた。Rb69 UvsYは80ng/μlで用い、gp32は500ng/μlのRb69 gp32、あるいは500ng μlのT4 gp32、あるいは1000ng/μlのT4 gp32いずれかであった。
図32に示したように、Rb69 gp32を用いた場合にシグナルが発生したに過ぎず、T4 gp32を使用した場合には発生せず、T4異種成分を用いた場合のRb69 gp32の十分な適合性とは対照的である。
Rb69 UvsXのC末端に対する修飾の結果
Rb69 UvsX H64Sで、Rb69 UvsX H64S LSDで、およびRb69 UvsX H64S 2×LDEで構成された増幅反応のキネティック実験を行った。一般的な反応条件は、異なるUvsX蛋白質を100ng/μlにて全ての場合に用いたのを除いて
図29に記載した通りであった。Rb69 UvsYは80ng/μlで用いた。Rb69 gp32は500ng/μlで用いた。DNA標的は0または1000コピーいずれかで存在させた。
図33に示したように、強いシグナルが全ての標的含有試料において発生し、同様なキネティックスを示す。シグナルを非常にわずかに遅く開始し、合計してわずかにより強いシグナルを生じさせるより酸性のC−末端を持つ蛋白質(LSDおよび2×LDEクローン)についての非常にわずかな傾向が見られる。
【0137】
図33に記載されたのと同様な実験を行った。しかしながら、この場合には、DNA標的を0または100コピーいずれかで存在させた。
図34に示すように、強いシグナルはすべての標的−含有試料で発生し、再度、かなり同様なキネティックスを示す。この場合において、わずかに遅くシグナルを開始させ、より強いシグナルを生じさせるより酸性のC−末端を持つ蛋白質(LSDおよび2×LDEクローン)についてのわずかにより強い傾向が観察された。
Rb69 UvsX H64S/2×LDEを用いる場合のPEGの滴定
同様な条件を
図33に記載された実験におけるように使用した。しかしながら、この場合、Rb69 UvsX H64S 2×LDEのみを用い、100ng/μlの濃度において、Rb69 UvsYは80ng/μlで用い、およびRb69 gp32は500ng/μlで用いた。DNA標的は示された反応当たり0または200コピーいずれかで存在させた。ポリエチレングリコール(M.W.35,000 Fluka)の濃度は5%、6%、および7%でテストした。
図35に示すように、裁量のシグナルは、ポリエチレングリコールN.W.35,000を5%w/vで用いた場合に得られた。
【0138】
(実施例9)作製されたUvsY構築体
T4 UvsYによってコードされると予測されるペプチドは配列の模式図が示され、Rb69 UvsY遺伝子は
図36示される。これらの2つの蛋白質の間で置換される反応が示され、全ての他の残基は同一である。キメラ蛋白質を発現するのに用いた2つのキメラクローンを作り出した。各キメラは他方のC−末端半分に融合した1つのUvsY分子のN−末端半分よりなるものであった。これらをUvsYハイブリッド1およびUvsYハイブリッド2という。
T4 UvsYおよびT4 gp32とのUvsYハイブリッドの活性
実験は、
図36に記載されたT4、Rb69、およびハイブリッドUvsY蛋白質はどれほどよく、T4 UvsXおよびT4 gp32と組み合わせた場合に機能するかに取組むために行った。
図29中の実験について記載された標準条件を用いたが、以下の修飾を行った。T4 UvsXは120ng/μlの濃度で使用し、T4 gp32は900ng/μlで使用し、およびテストしたUvsY蛋白質は80ng/μlで用いた。DNA標的は各反応において0または1000コピーいずれかで存在させた。PEG 35,000(Fluka)は5%w/vで使用した。
図37に示すように、UvsYの異なる形態のすべてはこのアッセイにおいて優れて挙動し、これは、T4 UvsXおよびT4
gp32を使用した場合に、T4 vs Rb69 UvsYについて目に見える優先性はほとんどまたは全くなく、またはハイブリッド分子からのいずれの有意な区別にもなかったことを示す。
Rb69 UvsXおよびR69 gp32とのUvsYハイブリッドの活性
実験は、
図36に記載されたT4、Rb69、およびハイブリッドUvsY蛋白質が、Rb69 UvsXおよびRb69 gp32と組み合わせた場合にどれほどよく機能するかに取組むために行った。
図37中の実験について記載された標準条件を用いたが、以下の修飾を行った。Rb69 UvsX H64S 2×LDEは100ng/μlの濃度で使用し、Rb69 gp32は500ng/μlで使用し、およびテストしたUvsY蛋白質は80ng/μlで用いた。DNA標的は各反応において0または1000コピーいずれかで存在した。
図38に示すように、UvsYのすべての形態はこのアッセイで機能したが、応答時間およびシグナル強度において強い差があった。これは、Rb69 UvsXおよびRB69 gp32を使用した場合に、Rb69 UvsYについて明瞭な優先性があることを示す。
【0139】
UvsYハイブリッド1の配列は以下の通りである:
【0140】
【化18】
【0141】
【化19】
N末端の6つのヒスチジンは任意である。
【0142】
UvsYハイブリッド2の配列は以下の通りである:
【0143】
【化20】
N末端の6つのヒスチジンは任意である。
【0144】
(実施例10)Rb69作成構築体およびキメラのさらなる分析
Rb69 UvsX H64S/T6−1/2×LDEについての活性無し
Rb69 UvsX H64S/2×LDEの頑強な活性と比較したRb69 UvsX H64S/T6−1 2×LDEの活性を調べた。反応は、以下の修飾を施して
図29に記載した標準条件に従って確立した。Rb69 UvsX H64S/2×LDE蛋白質およびRb69 UvsX H64S/T6−1/2×LDE蛋白質は100ng/μlで用い、Rb69 gp32は600ng/μlで用い、およびRb69 UvsYは80ng/μlで使用した。DNA標的は反応あたり0または1000コピーいずれかで存在させた。
図39に示したように、頑強な活性がRb69 UvsX H64S/2×LDE蛋白質によって呈されたが、Rb69 UvsX H64S/T6−1/2×LDE蛋白質で活性が検出されなかった。明らかに、この場合におけるDNA−結合ループ2配列の再コーディングの結果、非−機能的蛋白質がもたらされた。
Rb69 UvsX H64S/2×LDEの存在下におけるRb69 gp32の滴定
Rb69 UvsX H64S/2×LDE蛋白質を使用する場合の増幅キネティックスに対する滴定Rb69 gp32蛋白質の効果を調べた。反応は、以下の修飾を施して、
図29に記載された標準条件に従って確立した。PEG 35,000(Fluka)は5%w/vで用いた。Rb69 UvsX H64S/2xLDE蛋白質は100ng/μlで用い、Rb69 gp32は400、700、または1000ng/μlで用い、およびRb69 UvsYは80ng/μlで使用した。DNA標的は反応当たり0または100コピーいずれかで存在させた。
図40に示したように、増大させる量のRb69 gp32はシグナル検出の開始の遅延を導く。
Rb69 UvsX H64S/F69M/G70S/T6−1/2×LDEについての活性なし
増幅反応におけるRb69 UvsX H64S/F69M/G70S/T6−1/2×LDE蛋白質を用いる効果を調べた。このクローンはT6 UvsX DNA−結合ループ2のほとんどを含有する先にテストしたものと同様であるが、Walker Aモチーフ近くに2つのさらなるT6−様残基を含有した。反応は、以下の修飾を施して、
図40に記載された標準条件に従って確立した。Rb69 UvsX H64S/2×LDE蛋白質またはRb69 UvsX H64S F69M/G70S/T6−1/2×LDEは100ng/μlで用い、Rb69 pg32は500ng/μlで用い、およびRb69 UvsYは80ng/μlで使用した。DNA標的は反応当たり0または1000コピーいずれかで存在させた。
図41に示すように、Rb69 UvsX H64S F69M/G70S/T6−1/2×LDE蛋白質について活性は検出されない。
Rb69 H64S T67S/L68N/T4/2×LDEおよびRb69 H64S/T4/2×LDEの強力な活性
Rb69 H64S T67S/L68N/T4/2×LDEおよびRb69 H64S/T4/2×LDE蛋白質を増幅反応で用いる効果を調べた。これらの蛋白質は、この場合には、DNA−結合ループ2配列およびWalker A配列がT4 UvsXに由来した以外は、T6 UvsX DNA−結合ループ2を含有し、および/またはWalker Aモチーフ近くのT6−様残基をさらに含有する先にテストされたものと同様であった(クローンの模式的チャート参照)。反応は、以下の修飾を施して、
図40に記載された標準的な条件に従って確立した。Rb69 UvsX蛋白質またはRb69 UvsX H64S/2xLDEまたはRb69 UvsX H64S/T67S/L68N/T4/2xLDEは100ng/μlで用い、Rb69 gp32は500ng/μlで用い、Rb69 UvsYは80ng/μlで使用した。DNA標的は反応当たり0または100コピーいずれかで存在させた。
図42に示すように、テストした全てのUvsX蛋白質について優れた活性が検出され、これは、T4 DNA−結合ループおよび関連Walker A残基がRb69 UvsX蛋白質に成功して置換することができることを示す。
Rb69 UvsX H64S/T67S/L68N/T4/2xLDE蛋白質はRb69 gp32のアップ−滴定に対して比較的抵抗性である。
【0145】
野生型Rb69 UvsXおよびRb69 UvsX H64S/T67S/L68/T4/2xLDEを比較する反応キネティクスに対するRb69 gp32の濃度の阻害効果を調べた。反応は、以下の修飾を施して、
図40に記載された標準条件に従って確立した。Rb69 UvsX蛋白質またはRb69 UvsX H64S/T67S/L68/T4/2xLDEは100ng/μlで用い、Rb69 gp32は400または800ng/μlいずれかで用い、およびRb69 UvsYは80ng/μlで使用した。DNA標的は反応当たり0または100コピーいずれかで存在させた。
図43に示すように、gp32濃度を増大させる場合、野生型Rb69 UvsXと比較したRb69 UvsX H64S/T67S/L68/T4/2xLDEについて経験した検出に対して適時に示すことはせいぜい約半分に過ぎなかった。置換された蛋白質はgp32濃度に対して感受性が低いと結論された。
Rb69 UvsX H64S/T67S/L68/T4/2xLDE蛋白質はT4 gp32とで機能できる。
【0146】
Rb69 UvsXおよびUvsYで構成された反応に対するT4 gp32の阻害効果がRb69 UvsX H64S/T67S/L68/T4/2xLDEの使用によって克服できるか否かを調べた。反応は、以下の修飾を施して、
図40に記載された標準条件に従って確立した。T4 UvsX蛋白質またはRb69 UvsXまたはRb69 UvsX H64S/T67S/L68/T4/2xLDEは、各々、120ng/μlまたは100ng/μlまたは100ng/μlで用い、T4 gp32は700ng/μlで用い、およびT4またはRb69 UvsYは、各々、30ng/μlまたは80ng/μlで使用した。T4 UvsXをT4 UvsYと組み合せ、Rb69 UvsX蛋白質をRb69 UvsYと組み合わせた。DNA標的は反応当たり0または100コピーいずれかで存在させた。
図44に示すように、Rs69 UvsX H64S/T67S/L68N/T4/2xLDEはT4成分とほとんど同程度によく機能し、他方、T4 gp32を用いた場合は野生型Rb69 UvsXは不活性であった。置換されたRb69蛋白質はT4 gp32に対して非常に良好な許容性を発生した。
ファージ133からのDNA−結合ループを含有するRb69 UvsXキメラは弱く作動し、他方、シアノファージおよびAeh1ループは非−機能的である。
【0147】
他の多様なUvsX−様分子において見出された配列でDNA−結合ループ2が置換されているRb69 UvsX蛋白質の活性を調べた。反応は、以下の修飾を施し、
図40に記載した標準条件に従って確立した。Rb69 UvsX蛋白質またはRb69 UvsX loop 133またはRb69 loop Cyano またはRb69 loop Aehlは100ng/μlで用い、Rb69 gp32は500ng/μlで用い、およびRb69 UvsYは80ng/μlで使用した。
図45に示すように、シアノファージまたはAeh1ループを含有する蛋白質で活性は検出されず、他方、ファージ133ループを含有する蛋白質は非常に弱い活性を示した。
Rb69 UvsX H64S/T6/2xLDEは、DNA−結合ループ2の最終的なGからTへの置換を欠如する同等体とは異なって活性である。
【0148】
T4およびT6の間が異なる最終残基が、Rb69 UvsX H64S T6−1 2xLDEの場合とは異なってT6同等体に改変された蛋白質である、Rb69 UvsX H64S/T6/2xLDEの活性をテストした。また、DNA−結合ループ2がAeh1ループおよびRb16ループのハイブリッドで置き換えられた蛋白質もテストした(Rb16で見出されたシステインの代わりにAeh1ループの始まりにおいて異常なアラニンを補充)反応は、以下の修飾を施して、
図40に記載された標準条件に従って確立した。Rb69 UvsX蛋白質またはRb69 UvsX H64S/T6/2xLDEまたはRb69ループ(ハイブリッドAehl/Rb16)は100ng/μlで用い、Rb69 gp32は500ng/μlで用い、およびRb69 UvsYは80ng/μlで使用した。
図46に示すように、Aehl/Rb16ハイブリッドループを含有する蛋白質では活性は検出されなかったが、修復されたT6ループを含有する蛋白質は優れた活性を示した。T6−様DNA−結合ループ2の完全な置換えの結果活性がもたらされたが、同様なT4およびT6ループのハイブリッドは活性ではなく、これは、T4およびT6の間の置換がサイレントではなく、基が交換されていなければならないと結論されたことを示す。
【0149】
(実施例11)マンガンイオンはRPA反応を支持することができる。
【0150】
RPA反応は以下の条件下で確立された:50mMトリスアセテートpH8.3、100mM酢酸カリウム、200μM dNTP、3mM ATP、50mMホスホクレアチン、120ng/μl T4 UvsX、30ng/μl T4 UvsY、900ng/μl T4 gp32、5% PEG 35,000、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、1000コピーのB.subtilisゲノムDNA。二価マンガンカチオンを、個々に、0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、3mMの最終濃度を与えるまで各反応に供給した。別法として、対照として、16mMマグネシウムを使用した。反応を37℃にて90分間インキュベートし、PCRクリンアップカラム(SIGMA)で精製し、次いで、臭化エチジウムでの可視化前に2%アガロースゲルで分離した。
図47に示すように、マンガンイオンは0.5ないし3mMマンガンの濃度範囲においてRPAを効果的に支持した。(約4ないし5mMマンガンからの−ここでは示さず)有意により高い濃度は反応挙動を阻害することを開始し、それは、10mMマンガンにおいて、90分後に産物がこれらのプライマーで検出されないようになるまで徐々により少ない産物に導く。緩衝液からのマンガンイオンのいくらかのキャリーオーバーが予測され、恐らくは、反応当たり合計して大まか0.5mMマンガンイオンを占める。
【0151】
(実施例12)Staphylococcus aurecsポリメラーゼI大断片はRPA反応においてよく機能する。
【0152】
RPA反応は、E.coli、Bacillus subtilis、およびStaphylococcus aureusのPol Iクラスに対して相同性を担う細菌ポリメラーゼI修復酵素を含めた、ストランド変位合成が可能な代替ポリメラーゼを用いて構築した。この実験において、どこかおよび本明細書中に記載された、あるいはイン−ハウスで生じた、S.aureusからの同等な大断片を持つBacillus subtilis PolI大断片いずれかをRPA反応で用いた。反応は標準条件下で構成された。すなわち:300nMプライマーJ1、300nMプライマーK2、50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、200μM dNTP、3mM ATP、50mMホスホクレアチン、120ng/μl T4 UvsX、30ng/μl T4 UvsY、900ng/μl T4 gp32、5%PEG化合物(SIGMA)、70ng/μl Bsuポリマー、あるいは70ng/μl S.aureus(Sau)ポリメラーゼ、および0、100、1000、または10,000コピーのB.subtilisゲノムDNA。反応は、SYBR Green(Invitrogen)の1:50,000希釈を含めることによってモニターした。
図48に示すように、双方の場合において、頑強な増幅が起こった。もし何かがあるとすれば、水および標的−含有試料の間の一時的な分離は、S.aureusポリメラーゼを使用した場合にはより高かった。これは、このポリメラーゼが感受性があるRPA反応についてのわずかに改良された特徴を呈することを示すことができよう。
【0153】
(実施例13)RPA反応におけるヘパリンの使用
ヘパリンは、0−標的対照におけるシグナルの発生を遅延させる。
【0154】
RPA反応は、慎重に標的DNAを省いた以外は、本開示において他の箇所で用いたJ1およびK2プライマーを用いて構成した。反応は、標準条件下で構成した。すなわち:300nMプライマーJ1、300nMプライマーK2、50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、200μM dNTP、3mM ATP、50mMホスホクレアチン、120ng/μl T4 UvsX 30ng/μl T4 UvsY、900ng/μl T4 gp32、5%PEG化合物(SIGMA)、30ng/μl Bsuポリメラーゼ。反応は、SYBR Green(Invitrogen)の1:50,000希釈を含めることによってモニターした。ヘパリンは反応に含めず、あるいは20ng/μlで存在させた。
図49に示すように、しばらく後、バックグラウンドシグナルが全ての反応で発生し、しかしながら、これはヘパリンを含有する試料で後に起こり、それがノイズ発生を遅らせることを示唆する。
RPA反応におけるシグナル:ノイズ比率をヘパリンは改良する。
【0155】
キネティック実験を行って、プローブ−ベースのアプローチを介してモニターされた増幅反応の感度およびキネティクスに対するヘパリンの効果を示した。RPA反応はプライマーJ1(120ng/μl)およびK2(480ng/μl)を用い、以下の条件下で確立した:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMクレアチンホスフェート(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、120ng/μl T4 UvsX、30ng/μl T4 UvsY、1000ng/μl Rb69 gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、5%PEG化合物、120nM蛍光プローブBsFlc。エキソヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含めた。ヘパリンは存在させないか、または示したように20ng/μlで存在させた。反応は384−ウェルプレート中で氷上で確立され、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点に、底−読み取りプローブから周期的に測定を行った。試料は水、脚注に示したように標的配列を含有するB.subtilisゲノムDNAの10、100、1000または10,000コピーいずれかを含有した。
図50に示すように、全ての鋳型陽性試料は陰性シグナルを発生し、しかしながら、ヘパリンで確立された系は、10コピーにおいてシグナル発生の合致性の改良を示した。ヘパリンを含めると、ノイズの発生を遅らせ、これは、低コピー数におけるシグナル検出の同時性のより少ない破壊に導く。
【0156】
(実施例14)RPA反応における3’−ブロックプライマーおよびE.coliエキソヌクレアーゼIII
少なくとも炭素−酸素−炭素結合を介してビオチンのような基で3’−ブロックされたプライマーが、もしE.coliエキソヌクレアーゼIIIが反応に含まれれば、増幅プライマーとして成功して使用することができることを示唆する強力な証拠が発見された。本実験はこの現象の例を提供する。本実験において、RPA反応は、本明細書中で広く用いられるプライマーJ1およびK2を用いてBacillus subtilisゲノムからの断片を増幅することによって行った。他の目的で設計されてきたK2−イプシロンと命名されたプライマーの使用。このプライマーはK2プライマーと同一の配列を有するが、リンカーを介して攻撃され、かつビオチン−TEGと記載される3’−ブロッキングビオチン基のその保有が異なる(供給者のウェブサイトhttp://uk.eurogentec.com参照)。これは、酸素原子を介して3’糖に連結されたリンカーを介して結合されたビオチンを構成する。K2−イプシロンプライマーは、配列の本体内のデオキシチミジン残基を置き換えるデオキシウラシル残基も含有するが、これはこの実験には関係がないと考えられる。反応は、K2プライマーと追号したJ1プライマー、あるいはK2−イプシロン「ブロック」プライマー、およびエキソヌクレアーゼIIIまたはE.coli Nfo蛋白質を含有した。RPA反応はプライマーJ1(120ng/μl)およびK2またはK2イプシロン(480ng/μl)を用い、以下の条件下で確立された:50mMトリスアセテートpH7.9、100mM酢酸カリウム、14mM酢酸マグネシウム、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、3mM ATP(Roche)、200マイクロモラーdNTP、50mg/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、120ng/μl T4 UvsX、30ng/μl T4 UvsY、1000ng/μl T4 gp32、30ng/μl Bsuポリメラーゼ、5%PEG化合物、120nM蛍光プローブBsFlc。エキソヌクレアーゼIIIは65ng/μlで含め、あるいはエンドヌクレアーゼIV(Nfo)は200mg/μlで含めた。K2イプシロンプライマーのブロックされた性質にかかわらず、エキソヌクレアーゼIIIを蛍光を発するためのプローブを処理する剤として用いる場合、
図51に示すように、K2を使用する試料およびK2−イプシロンを使用するものの間に増幅キネティクスの差はない。これは、エキソヌクレアーゼIIIが、恐らくは、エキソヌクレアーゼ活性によって、あるいはこの酵素および(エンドヌクレアーゼIVとしても知られた)Nfoに帰属されてきた活性の3’−ジエステラーゼまたはホスファターゼタイプを介して、K2−イプシロンに結合した鋳型の延長できないハイブリッドを延長可能な形態に迅速に処理することを示唆する。対照的に、NfoをExo IIIの代わりに使用した場合、増幅に一般的な遅延はないが、これはK2−イプシロン反応と対合したJ1についてかなりより顕著であった「活性化」プロセスは、Nfoを使用する場合には貧弱にしか働かないが,exoIIIを使用した場合には非常に迅速に働くと結論された。
【0157】
(実施例15)UvsY−フリーDNA増幅
一連の実験を行って、RPA反応からUvsYを除去することによるDNA増幅に対する効果を調べた。
T6 H66Sを用いるUvsY−フリーDNA増幅
本実験においては、RPAは以下の条件下で行った:適切には、100mM酢酸カリウム、50mMトリスアセテートpH8.3、14mM酢酸マグネシウム、5mM dTT、200mM dNTP、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、2.5mM ATP(Roche)、50mg/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、300nM増幅プライマー、5%PEG 35,000、43ng/μl S.auポリメラーゼ、600ng/μl Rb69 gb32、120ng/μl T6 H66S UvsX および79ng/μl Rb69 UvsY。反応は、プライマーMS2 downRt2およびプライマーMS2 up4、up5、up6、またはup7と共に1000コピーのMS2 DNA鋳型を用い、かつRb69 UvsYの存在下または非存在下で行った。反応を氷上で確立し、次いで、1時間で37℃まで移した。増幅に続いて、GenElute PCRクリーンアップキッド(Sigma)を用いて産物を精製し、ゲル電気泳動を用いて可視化した。T6 H66Sレコンビナーゼは、UvsY非存在下において、RPA反応でDNAを効果的に増幅することができるのが予期せぬことに見出された。
図52に示すように、正しいサイズの産物はUvsYの存在下で増幅された。UvsYの非存在下において、MS2 downRT2+MS2 up5反応産物を例外として、ほとんどの豊富な産物は、UvsYが存在した場合に合成されたのと同一のサイズのものであるように見えた。用いた鋳型およびプライマー対では、RPA DNA増幅はUvsYの非存在下で可能であって、そのような反応は、しばしば、正しいサイズの産物を生じさせると結論された。
【0158】
さらなる実験を行って、従前に観察されたUvsY−非依存性増幅が、異なるサイズの産物を合成する異なるプライマー対を用いて起こるか否かを調べた。このさらなる実験についての結果は、(キネティクスは知られていないが)UvsYの非存在下においてT6
H66Sレコンビナーゼを用いて丁度どれくらい効果的な増幅であり得るかを巧く示す。一般的な反応条件は以下の例外を除いて、
図52に示された実験について記載したのと同一であった:反応はプライマーMS2 up5、up6、up7、またはup2と共にプライマーMS2 down5を用いて行った。また、反応はプライマーMS2 down2およびMS2 up4を用いても行った。プライマー組合せのいずれかを用いた場合、かつUvsYの存在下および非存在下の双方において、増幅産物が作られた。
図53に示すように、全ての反応はMS2 down5/up5プライマー対を例外としてよく作動したが、これは、依然として、少量の正しい産物を生じた。各反応からの主な産物は、UvsYが反応に存在するか否かにかかわらず正しいサイズのものであった。UvsYの非存在下においては、正しくない産物のより大きな豊富性があるように見えたが、これらは正しい産物よりも少量で存在した。種々のプライマー対を用いて異なるサイズのRPA産物を増幅することができ、かつUvsYの非存在下で進行する反応の能力は用いるプライマーまたは得られた産物のサイズに依存するようではないと結論された。
小さなゲノムDNA標的のUvsY−フリー増幅
実験を行って、UvsYの非存在下において、DNA標的のサイズがDNAを増幅するRPAの能力において役割を演じるか否かを調べた。この目的で、ヒトゲノムDNAから増幅された小さな305bp RPA産物をRPA反応においてDNA標的として用いた。反応条件が各々、305bp、210bp、143bpおよび141bpの産物を生じる、プライマーApoB4、およびApoB300、ApoB3、ApoB7またはApoB10いずれかと共にDNA標的の1000コピーを用いて反応を行った以外は、
図52に示した実験について述べたのと同一であった。
図54に示したように、UvsYの非存在下で、反応の全てはDNAアンプリコンを生じたが、UvsYの非存在下においてDNA産物を合成する見掛け上頑強な能力にかかわらず、UvsYなくしてT6 H66S
UvsXを用いて生じた産物は、常には、予測されたサイズの、およびUvsYの存在下で生じたものと同一サイズのものではなかった。恐らくは、プライマー−関連人工物は、時々、理由は明瞭ではないが、真実の産物の形成が支配的である。UvsYの非存在下において、DNA増幅は、小さなDNA標的を用いて合理的に巧く起こるが、UvsYが存在する場合とは異なり、産物は常に正しいサイズのものである。
完全なゲノム標的のUvsY−フリー増幅
本実験は、低いコピー数の複雑なゲノム標的がUvsYの非存在下で増幅できるか否かに取組んだ。反応条件は、各々、305bp、210bp、143bpおよび141bpの産物を生じる、プライマーApoB4、およびプライマーApoB300、ApoB3、ApoB7またはApoB10いずれかと共にヒトゲノムDNAの1000コピーを用いて反応を行った以外は、
図52に示された実験について記載したのと同一であった。
図55に示すように、UvsYの非存在下においては、DNA増幅は全ての反応で起こったが、UvsYなしでT6 H66S UvsXを用いて生じた産物は、常には、予測されたサイズ、およびUvsYの存在下で生じたのと同一のサイズのものではなかった。UvsYの非存在下においては、複雑なゲノムDNA標的を用いてDNA増幅は効果的に起きるか、UvsYの存在下で行った反応とは異なり、正しい産物が通常合成される場合には、産物は常に正しいサイズのものであると結論された。
UvsYフリーDNA増幅はPEGを必要とする。
【0159】
実験を行って、T6 H66Sレコンビナーゼによって呈されたUvsY−非依存性挙動がPEGについての要件の欠如までさらに拡大されたか否かに取組んだ。これらの反応は、以下の例外として、
図52に示された実験について記載されているように行った:反応は、PEGの存在の有りおよび無しの双方にて、プライマーApoB300またはApoB3いずれかと共にヒトゲノムDNAの1000個ポーおよびプライマーApoB4を用いて行った。
図56に示すように、結果は、PEGが存在するまたは非存在の間で反応生産性の激しい差を示した。この実験は、効果的な増幅を行うためのRPA反応にポリエチレングリコールを含めての使用の臨界性を示した。PEGの非存在下においては、真実の産物の増幅は一般的には起こらないが、使用にわずかな人工物が1つのレーンに存在し、おそらくは、T6 H66Sレコンビナーゼを用いた場合に低いレベルの負荷フィラメントを示すが(これはUvsYの存在下では起こらない)。標的DNAの正しいかつ効果的な増幅のためには、UvsYの存在または非存在にかかわらず、PEGは反応において必要である。
T6 H66Sレコンビナーゼと共にT4 gp32を用いるUvsY−フリーDNA増幅
本実験を行って、T4 gp32をT6 H66S UvsXと共に用いた場合に、UvsY−非依存性増幅が起こるか否かを調べた。一般的な反応条件は、ここでは、Rb69 gp32または337.5ng/μl T4 gp32いずれかを用いて反応を行った以外は、
図52に示された実験について記載された通りであった。T4 gp32をUvsYの存在下で用いた場合、30ng/μl T4 UvsYを用いた。ヒトゲノムDNAの1000コピーを、プライマーApoB4、およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと組合せて反応当たりに用いた。
図57に示したように、この実験は、T6 H66SレコンビナーゼのUvsY−非依存性の活性が、T4 gp32を、Rb69 gp32よりはむしろ利用した場合に依然として見出されることを示す。明瞭な予測された産物の生産はRb69 gp32を用いた場合よりも効果的でなかったが、多数の組換えにより活性なフィラメントが存在することは疑いがない。反応でT4 gp32を用いる場合に、DNA増幅が完結に起こるが、正しい産物の点についてはRb69
gp32を用いるよりもこのプロセスは効果的でないと結論された。
T6 H66SおよびAehl gp32を用いるUvsY−フリーDNA増幅
本実験を行って、Aehl gp32をT6 H66S UvsXと共に用いた場合にUvsY−非依存性増幅が起こるか否かを調べた。反応条件は、プライマーApoB4、およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと共に、400ng/μl Rb69 gp32または360ng/μl Aehl gp32、および1000コピーのヒトゲノムDNAを用いて反応を行った以外は、
図52に示された実験について記載したのと同一であった。
図58に示すように、結果は、UvsYを省き、かつT6 H66Sを用いた場合、Aeh1 gp32は正しい産物を生産するに置いてRPAを支持できないことを示す。しかしながら、ある程度少量の増幅が起こった。T6 H66Sと組み合わせた場合、Aeh1は限定されたDNA増幅を促進したに過ぎない。このデータは、従前に記載されたデータと組み合わせた場合、T6 H66S RPA反応のUvsY−非依存性挙動の効率が、ある程度、gp32タイプに依存することを示唆する。
T4 UvsXを用いるUvsY−フリーDNA増幅
実験を行って、Rb69gp32と共にT4 UvsXを用いた場合に、UvsYの存在はDNA増幅が起こるのに必要か否かを調べた。これらの反応は、以下の例外の下に、
図52に示された実験に記載した通りに行った:反応は、プライマーApoB4およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと共に、T6 H66S UvsXまたは123.5ng/μl T4 UvsXいずれか、およびヒトゲノムDNAの1000コピーを用いて行った。T4 UvsXをUvsYと共に用いた場合、30ng/μl
T4 UvsYを利用した。
図59に示すように、結果は、UvsYの存在下では、T6 H66S UvsXを用いた場合のように、T4 UvsX反応は予測されたサイズの産物を生じることを示す。しかしながら、T6 H66S反応とは異なり、UvsYを省くと、増幅産物は決して生じない。この実験は、標準条件下では、使用したT4 UvsXは、T6 H66S UvsXとは異なり、UvsY蛋白質の存在に完全に依存することを示す。このデータは、UvsYおよびPEGは共にT4試薬で構成されたRPA系の必要な成分であることを示す多量の以前の証拠を確認する。
【0160】
さらなる実験を行って、Rb69 gp32の代わりにT4 gp32を用いることによって、UvsY−欠乏T4 UvsX反応が継続的に増幅産物を生産しないか否かを調べた。一般的な反応条件は、T6 H66S UvsXと共にRb69 gp32あるいは123ng/μl T4 UvsXと共に337ng/μl T4 gp32のいずれかを用いて反応を行った以外は、
図52に示された実験について記載した通りであった。プライマーApoB4、およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと組合せて、ヒトゲノムDNAの1000コピーを反応当たりに用いた。T4 gp32および UvsXをUvsYと共に用いた場合、30ng/μl T4 UvsYを利用した。
図60に示すように、結果は、従前に示したのと同様に、UvsYの存在下においては、T4成分を利用する反応は正しいサイズの産物を生じ、およびUvsYの非存在はこれを否定することを示す。このデータは、標準条件下では、T4 UvsXは、T6 H66S UvsXとは異なり、UvsY蛋白質の存在に完全に依存することを確認する。この場合、T4 gp32を一本鎖DNA結合蛋白質として使用した。
【0161】
なおもう1つの実験を行って、蛍光プローブ系を利用するRPA増幅/検出反応においてT4 UvsXを用いてDNA蓄積を検知する場合、UvsYについての要件を調べた。本実験においては、RPAは以下の条件下で行った:適切には、100mM酢酸カリウム、50mMトリスアセテートpH8.3、14mM酢酸マグネシウム、5mM dTT、200mM dNTp、50mMリン酸クレアチン(Calbiochem)、2.5mM ATP(Roche)、50ng/μlクレアチンキナーゼ(Roche)、増幅プライマーJ1(120nM)およびK2(480nM)、120nM蛍光プローブBsFlc、5%PEG 35,000、43.33ng/μl Sauポリメラーゼ、600ng/μl Rb69 gp32、120ng/μl T6 H66S UvsXおよび79ng/μl Rb69 UvsY。Nfoは100ng/μlで含めた。試料は水、またはB.subtilisゲノムDNAの200コピーいずれかを含有し、Rb69
UvsYの存在または非存在下のいずれかであった。反応は384−ウェルプレート中で氷上で確立し、次いで、38℃に設定されたステージを備えたBIOTEK Flx−800蛍光マイクロプレートリーダーに移し、その時点で、底−読み取りプレートから実験を周期的に行った。
【0162】
図61に示すように、シグナルはUvsYの有りまたは無しにてT6 H66Sレコンビナーゼで、およびUvsYの存在下でT4 UvsXを含有する反応で構成された反応において鋳型−依存的に蓄積した。しかしながら、UvsYの非存在下において、T4 UvsX反応がDNA増幅能力を呈しなかった。これらの標準条件下では、DNA増幅が起こるためには、T6 H66S UvsXとは異なり、T4 UvsX はUvsYについて厳格な要件を有すると結論された。
【0163】
さらなる実験を行って、UvsYについてのT4 UvsXの要件に対する滴定Rb69 gp32濃度の効果を調べた。これらの反応は、適切には、反応を増幅プライマーSccii35IV(480nM)およびOrf
x45a(120nM)、120nM蛍光プローブSA Tamra2、125ng/μl、T4 UvsXおよび30ng/μl
T4 UvsYを用いて行った以外は、
図61に示した実験について記載されたように行った。Rb69 gp32は400ng/μl、600ng/μlまたは800ng/μlで用いた。試料は水、またはMRSA IゲノムDNAの200コピーのいずれかを含有し、Rb69 UvsYの存在下または非存在下のいずれかであった。
図69に示すように、DNA増幅は、用いたRb69の濃度には無関係に、UvsYを含有する全ての鋳型試料で起こった。UvsYが失われた場合、DNA増幅を示した鋳型試料はなかった。使用した標準条件下では、DNA増幅が起こるためには、T4 UvsX蛋白質はUvsYに依存性であり、およびこの依存性はgp32濃度の変動によって変化しないと結論された。
【0164】
なおもう1つの実験を行って、UvsYについてのT4 UvsX蛋白質の要件をさらに調べた。用いた反応条件は、以下を除いて、
図61に示した実験について記載したのと同一であった:反応は増幅プライマーScciii(480nM)およびOrfX45a(120nM)、120nM蛍光プローブBsFlcベータ、123.5ng/μl T4 UvsX、500ng/μl Rb69 gp32および18ng/μl Sauポリメラーゼを用いて行った。試料は水、または506bp PCR DNA断片の10000コピーいずれかを含有し、Rb69 UvsYの存在下または非存在下のいずれかであった。
図70に示すように、これらの条件下では、T4 UvsX反応は、UvsYの存在下および非存在下双方においてDNAを効果的に増幅する。しかしながら、UvsYを含有する試料中でのDNA増幅は、UvsYが失われた場合に先行し、実験の終了においては、UvsYの非存在下におけるよりもUvsYの存在下においてより多くのDNAが増幅された。使用した条件に依存して、T4 UvsXは起こるにはDNA増幅についてのUvsYの存在を必要とし、または必要としないであろう。しかしながら、条件がUvsYの非存在下で増幅が起こるのを可能とする場合でさえ、UvsYの添加は反応速度を改良し、増幅されたDNA出力を増大させる。
【0165】
UvsYについてのT4 UvsX蛋白質の要件をさらに解明するために、さらなる実験を行った。反応条件および試料は
図70に記載されたものであった。反応の完了に続いて、試料の各々をGenElute PCRクリーンアップキット(Sigma)を用いて精製し、ゲル電気泳動を用いて可視化した。
図71に示すように、ゲル電気泳動は、
図70に記載された実験のように、RPAを用いるDNA増幅で収集されたデータを可視化するさらなる方法(プロセス)として用いることができる。
図71に示された結果は、さらに、これらの条件下で、T4 UvsXがUvsYの存在および非存在双方においてDNA増幅が起こるのを可能とすることを示す。しかしながら、
図70に示す実験で記載したように、UvsYの非存在下におけるよりもUvsYの存在下においてより多くのDNAが増幅された。これらの結果は、ある条件下では、T4 UvsXはUvsYの非存在下においてDNA増幅を支持できるが、DNA増幅の量はUvsYの存在下において改良されることを確認する。
T6 UvsXを用いるUvsY−フリーDNA増幅
本実験を用いて、修飾されていないT6 UvsX蛋白質が、UvsYの非存在下においてDNAを増幅する能力を呈するか否かを決定した。用いた反応条件は、プライマーApoB4、およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと共にT6 H66S UvsXまたは120ng/μl T6 UvsX、およびヒトゲノムDNAの1000コピーを用いて反応を行った以外は、
図52に示された実験について記載されたとおりであった。
図62に示すように、調べた2つのアンプリコンのうちの1つはUvsYの非存在下において効果的に増幅されたが、1つはされなかった。さらに、UvsYの有りまたは無しにてT6およびT6 H66Sレコンビナーゼの間の断片の増幅の相対的効果は可変であった。レコンビナーゼ蛋白質の間の調製−依存性変動を排除できないが、このデータは、修飾されていないおよび修飾されたレコンビナーゼが従前に示されたように可変活性を示すという示唆に合致する。UvsYの非存在下においては、DNA増幅はT6 UvsXで起こり得るが、これを行う効率はT6 H66S UvsXとは異なる。Rb69 UvsXを用いるUvsY−フリーDNA増幅
本実験は、Rb69 UvsXが効果的な増幅のためにUvsYを必要とするか否かを調べた。反応は、プライマーApoB4およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと共にT6 H66S UvsXまたは120ng/μl Rb69 UvsX、400ng/μl Rb69 gp32、およびヒトゲノムDNAの1000コピーを用いて反応を行った以外は、
図52に示した実験について記載されたように行った。
図63に示すように、使用した条件下ではUvsYの存在に対する厳格な依存性と合致して、UvsYの非存在下において増幅は見られなかった。存在するUvsYに関するものでさえ、増幅は貧弱であり、いくつかの注意を解釈にはらうべきである。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、最も単純な説明はT4 UvsXに関するように、効果的かつ感受性の増幅で必要なフィラメント−負荷レベルを達成するのにUvsYが必要であるというものである。使用した標準条件下では、Rb69 UvsXは効果的なDNA増幅が達成されるためにはUvsYを必要とするようである。
Aeh1 UvsXを用いるUvsY−フリーDNA増幅
本実験を行って、効果的な増幅のためにはAeh1 UvsXがUvsYを必要とするか否かに取組んだ。反応条件は、UvsYを含めた場合、T6 H66S UvsXとの反応では、およびAeh1:500ng/μl Rb69 gp32 UvsX、200ng/μl Aeh1 UvsXおよび80ng/μl Aeh1 UvsYとの反応では400ng/μl Rb69 gp32を用いて反応を行った以外は、
図52に示された実験について記載した通りである。プライマーApoB4、およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと組合せて、ヒトゲノムDNAの1000コピーを反応当たり用いた。
図64に示すように、Aeh1蛋白質を用いた場合、UvsYの非存在下においては増幅は見られず、他方、UvsYの存在下では、正しいサイズの産物は明らかであった。使用した条件下では、UvsYの存在に対する厳格な依存性と合致して、Aeh1蛋白質はUvsYの非存在下においてDNA増幅を受けることができないと結論された。
修飾されたRb69 UvsX(T6 DNA結合ループ2、ヒツチジン64からセリンへの修飾、および修飾されたC末端(LDEx2))を用いるUvsY−フリーDNA増幅
本実験を行って、T6UvsXのDNA結合ループ2を含有する修飾されたRb69 UvsXが効果的な増幅のためにUvsYを必要とするか否かを調べ、かつT6レコンビナーゼの変種DNA結合ループ2がT6レコンビナーゼのUvsY−非依存性活性を説明するか否かを決定した。使用した反応条件は、以下を例外として、
図52に示された実験について記載された通りであった:400ng/μl Rb69 gp32、およびT6
H66S UvsXまたは120ng/μl T6 H64S 2xLDE UvsXいずれかを用いて反応を行った。プライマーApoB4、およびプライマーApoB300またはApoB3いずれかと組合せて、ヒトゲノムDNAの100コピーを反応当たりに用いた。
図65に示すように、使用した条件下では、UvsYの存在に対する依存性と合致して、UvsYの非存在下で増幅は観察されなかった。
いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、本実験の1つの解釈は、DNA結合ループ2は、単離において、ハイブリッドレコンビナーゼに対してUvsY―非依存性活性を付与するのには不十分であろうということである。しかしながら、注意を払うべきである。というのは、UvsYの存在下においてさえこの蛋白質では貧弱な増幅が観察されたからである。使用した標準条件下では、T6 H64S 2xLDE UvsXは、効果的なDNA増幅が達成されるのにUvsYを必要とするようであると結論された。
【0166】
(実施例16)gp32活性
切断速度を調節するにおけるgp32の有効性を測定する能力は、gp32活性を評価するための非常に正確なアプローチであることが判明し、歴史的には評価するのが困難だとされてきたものである。実験を行って、gp32調製の活性のために有用なアッセイを示した。実験条件は以下の通りであった:反応は50μl容量で行った;プローブ(SA−Tamera2;
【0167】
【化21】
(配列番号:125、ここにy=thf,b=BHQ2−dT,r=TAMRA−dT,3’=Bio−TEG)は100nMであり;Rb69 pg32は0、40、50、63、83、100、125、167、または250ng/μlの最終濃度で用い;Nfoは33ng/μlで存在させ;緩衝液の条件は20mMトリスアセテート、50mM酢酸カリウム(pH7.9)、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオスレイトールであった。
【0168】
図66に示すように、本実験の結果は、テトラヒドロフラン残基(THF)によって分離されたフルオロフォアおよびクエンチャーを含有する一本鎖プローブは、緩衝化水溶液中に、およびgp32蛋白質の非存在下で存在した場合、過剰のNfoヌクレアーゼによって迅速に切断することができることを示す。この活性は、NfoはデュプレックスDNA基質のみを標的とするという文献中の主張に拘わらず、この活性はこれらの条件下で頑強であった。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、活性は、本明細書中で用いた条件下では、一過性デュプレックス構造、ヘアピン等の形成によって生起し得る。この活性は、反応混合物に含めた場合、過剰のgp32蛋白質によって完全に抑制された。gp32の質量が徐々に減少した場合、切断活性は、再度、(経時的に蛍光を増加させることによってモニターして)測定され、切断の速度は、これらの限定的最終濃度において加えたgp32の質量によって調節された。さらに、実験において限定的レベルのgp32の濃度を設定することによって、gp32の挙動および回転に対する競合体核酸または温度の効果のような種々の操作の結果を評価するのが可能であった。
gp32分子の異なる種内での生化学的区別
実験を行って、異なる起源の種からのgp32分子が相互に生化学的に区別されるか否かを評価した。実験条件は以下の通りであった:反応は50μl容量で行い;プローブ(SA−Tamra2
【0169】
【化22】
(配列番号:126)、ここにy=thf,b=BHQ2−dT,r=TAMRA−dT,3’=Bio−TEG)は100nMであり;Rb69 gp32は80ng/μlの最終濃度で用い、Nfoは33ng/μlで存在し;350秒後、水、dsDNA(550ngヒトゲノムDNA;すなわち、ほぼ10×質量のオリゴヌクレオチドプローブ)またはssDNA(28ピコモルの配列:
【0170】
【化23】
(配列番号:127)のオリゴヌクレオチド)のいずれかを加え;緩衝液条件は20mMトリスアセテート、50mM酢酸カリウム(pH7.9)、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオスレイトールであった。測定は、520nMのLED励起および585nMにおける発光を用いるEmbedded System Engineering(ESE,GmbH)によって製造されたフルオロメーターで行った。
【0171】
最初に、フルオロフォア/クエンチャープローブでのNfoヌクレアーゼによる非常に低い切断活性のみを許容するgp32の濃度を確立した。この濃度において、gp32の利用性は実質的プローブ保護のための最小量に制限され、これらの条件下では、gp32が競合実験においてプローブからgp32が分配されるか否かを非常に感度よく評価することが可能であった。しばらくの間ゆっくりとしたプローブ切断をモニターした後、過剰な二本鎖DNAまたは一本鎖オリゴヌクレオチドを加えて、プローブに対するgp32の分布にこれが影響したか否かを評価した。全ての場合において、一本鎖オリゴヌクレオチドで過剰な付加は、蛍光および、よって、プローブ切断の突然かつ顕著な増加に導く。しかしながら、むしろ興味深いことには、切断が非常に顕著となり、プローブDNAからのgp32の喪失を示すにつれ、T4 gp32はデュプレックスDNAの添加によって強く影響され、他方、Rb69およびAeh1 gp32種は切断においてわずかな増加のみを示したことが発見された。明らかに、Rb69およびAeh1 gp32分子は、T4 gp32よりは一本鎖DNAに好都合にかなり効果的に分けられ、分配された。結果は
図67に示し、これは、T4およびRb69 gp32分子は、一本鎖およびデュプレックスDNAの間の分配に関して生物学的に区別されることを示す。
異なるgp32種についての温度制限
プローブ保護アッセイを用いて実験を行って、いずれの高い側温度において、gp32の種々の種が正しく機能しないかを評価した。実験条件は以下の通りであった:反応は50μl容量で行い;プローブ(SA−Tamara2;
【0172】
【化24】
(配列番号:128)、ここに、y=thf,b=BHQ2−dT,r=TAMRA−dT,3’=Bio−TEG)の最終濃度は100nMであり;Rb69 gp32は80ng/μlの最終濃度で用い、Nfoは33ng/μlで存在させ;350秒後に、温度を徐々に上昇させ(グラフ参照);緩衝液条件は20mMトリスアセテート、50mM酢酸カリウム(pH7.9)、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオスレイトールであった。測定は、520nMのLED励起および585nMにおける発光にてEmbedded System Engineering(ESE,GmbH)によって製造されたフルオロメーターで行った。
【0173】
gp32がプローブ保護に関して丁度制限的である状況に導くgp32の濃度を用いた。次いで、温度が反応環境中で徐々に上昇するように熱源を適用した後、反応を注意深くモニターした。示された温度は、反応を含むチューブ近くの利用した蛍光プローブデバイスにおける熱電対および、かくして、反応温度の良好なインジケーターからの読みをいうものであった。
図68に示すように、異なるgp32種についての高い側温度の活性の限界に差があった。温度が上昇するにつれ、蛍光曲線の傾きは最初は一定のままであったが、ある地点において、増大し始めた。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、この証拠は、gp32はその有効性を失っていることを示した。なぜならば、蛋白質は構造的に不安定となりつつあったからである。Nfo活性は徐々に増大する解釈よりはむしろこの解釈に対する裏付けは、比較的高い温度までT4 gp32はいずれの速度変化も示さず、他方、他のgp32分子を用いた場合、変化はかなり早く開始するという事実によって供される。特に、Aeh1 gp32は約40℃においてかなり非効率的となり、この地点を超えてはアッセイにおいて活性の顕著な喪失を呈したことが認められた。Rb69
gp32もまた、T4 gp32よりも高い温度は許容性が低いように見え、約42℃によって部分的に影響されるようになった。T4 gp32はかなり抵抗性であって、少なくとも47℃の温度において依然として機能的であった。
【0174】
データは、本明細書中において、新規で、多様なハイブリッドおよび作成レコンビナーゼ酵素の発見、およびRPA反応を行うためのそのような酵素の利用性を裏付ける。データは、さらに、本明細書中に記載された新規な、多様なハイブリッドおよび作成レコンビナーゼ剤および関連する組換え因子を用いてRPA反応を行うための最適条件の同定を裏付ける。主題の発明の特別な具体例を考察してきたが、前記明細書は例示的なものであって、制限的なものではない。本発明の多くの変形は、本明細書をレビューするに際して当業者に明らかとなるであろう。添付の請求の範囲は全てのそのような具体例および変形を主張する意図ではなく、本発明の十分な範囲は、同等物のその十分な範囲と共に請求の範囲、およびそのような変形と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
【0175】
以下にリストされる項目を含めた本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、および特許は、あたかも各個々の刊行物または特許が引用により具体的かつ個々に取り込まれるように示されるかのごとく、引用してその全体をここに援用する。コンフリクトする場合、本明細書中のいずれの定義も含む本出願が支配する。
【0176】
【化64】
【0177】
【化65】