特許 5833332 除菌方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5833332

(24)【登録日】2015年11月6日

(45)【発行日】2015年12月16日

(54)【発明の名称】除菌方法

(51)【国際特許分類】

   A01N 25/00 20060101AFI20151126BHJP

   A01N 43/40 20060101ALI20151126BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20151126BHJP

   A61K 31/4425 20060101ALN20151126BHJP

   A61P 31/04 20060101ALN20151126BHJP

【ＦＩ】

   A01N25/00 102

   A01N43/40 101K

   A01P3/00

   !A61K31/4425

   !A61P31/04

【請求項の数】5

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2011-87753(P2011-87753)

(22)【出願日】2011年4月11日

(65)【公開番号】特開2012-77065(P2012-77065A)

(43)【公開日】2012年4月19日

【審査請求日】2014年3月3日

(31)【優先権主張番号】特願2010-202831(P2010-202831)

(32)【優先日】2010年9月10日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 研究集会名；ＬＥＤ総合フォーラム、主催者名；国立大学法人徳島大学、財団法人とくしま産業振興機構、徳島ＬＥＤアートフェスティバル実行委員会、開催日；平成２２年４月１７日 発行者名；ＬＥＤ総合フォーラム実行委員会、徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部、刊行物名；ＬＥＤ総合フォーラム論文集、発行年月日；平成２２年４月１７日

(73)【特許権者】

【識別番号】595137941

【氏名又は名称】タマ化学工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100098707

【弁理士】

【氏名又は名称】近藤 利英子

(74)【代理人】

【識別番号】100169812

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 寛志

(72)【発明者】

【氏名】白井 昭博

(72)【発明者】

【氏名】高麗 寛紀

(72)【発明者】

【氏名】五十嵐 喜雄

(72)【発明者】

【氏名】延嶋 浩文

【審査官】 瀬下 浩一

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−２１５２７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｎ ２５／００

Ａ０１Ｎ ４３／４０

Ａ０１Ｐ ３／００

Ａ６１Ｋ ３１／４４２５

Ａ６１Ｐ ３１／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

除菌対象物と下記一般式（１）で表される化合物とを接触させながら、該対象物に発光ダイオードから発生した波長４００ｎｍ〜３１５ｎｍのＵＶＡを照射することを特徴とする除菌方法。

（ただし、上記一般式（１）において、Ｒ₁およびＲ₄は、炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐の同一または異なるアルキレン基であり、Ｒ₂およびＲ₅は、水素原子、同一若しくは異なるハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ₃は、炭素数２〜１２の直鎖または分岐のアルキレン基であり、Ｒ₆は、炭素数１〜１８の直鎖または分岐のアルキル基であり、Ｚは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子またはＯＳＯ₂Ｒ₇基（Ｒ₇は、炭素数１〜４のアルキル基または置換若しくは無置換のフェニル基である）である。）

【請求項2】

前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（２）〜（５）で表される少なくとも１種の化合物である請求項１に記載の除菌方法。

【請求項3】

前記除菌対象物と前記一般式（１）で表される化合物との接触を、該化合物を溶解した水系で行う請求項１又は２に記載の除菌方法。

【請求項4】

前記除菌対象物がコンタクトレンズである請求項１〜３のいずれか一項に記載の除菌方法。

【請求項5】

前記除菌対象物が、バイオフィルムが付着した物品である請求項１〜３のいずれか一項に記載の除菌方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物を殺菌・除菌する方法に関する。詳しくは除菌剤と発光ダイオード光の照射とを併用して対象物を除菌する方法に関し、具体的には、ＵＶＡ−ＬＥＤを使用し、工業製品や医療用機械器具を対象とする除菌方法に関する。

【背景技術】

【0002】

工業製品や医療用機械器具は、使用することにより原核生物である細菌に加え、真核生物である原生生物、アメーバ、かび、藻など種々の微生物が発生する。このため、工業製品や医療用機械器具を除菌する目的には、広い抗菌スペクトルを有するビス第四級アンモニウム塩化合物が使用されている。

【0003】

ビス第四級アンモニウム塩化合物の中でも、本発明者らが開発した１分子内にピリジニウム塩を２残基有するビス第四級アンモニウム塩化合物は、水溶性が高いことに加えて、水系でも分解されにくく、微量でも優れた除菌または殺菌効果を発揮し、分子中に硫黄を含まないことから生分解生成物のヒトに対する毒性が低いという優れた特長を有し（特許文献１、２参照）、工業製品や医療用機械器具の除菌および殺菌などの用途に多用されている。

【0004】

しかし、上記１分子内にピリジニウム塩を２残基有するビス第四級アンモニウム塩化合物は、環境中での安定性が高く、長期間残存することから、環境に対する影響をより軽減するため、さらにその使用量を減らすことが求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４１５２３５３号公報

【特許文献2】特許第４３８１２２０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従って、本発明の目的は、１分子内にピリジニウム塩を２残基有するビス第四級アンモニウム塩化合物のみを用いて除菌を行う場合と比べて、該化合物の使用量を減らしても、同等の広い抗菌スペクトルを示し、優れた除菌効果を有する除菌方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を達成するために、本発明者らは、鋭意研究を行い、１分子内にピリジニウム塩を２残基有するビス第四級アンモニウム塩化合物を使用することと、発光ダイオードから発生した光を除菌対象物に照射することとを組み合わせることにより、上記ビス第四級アンモニウム塩化合物の広い抗菌スペクトルと優れた除菌効果を維持しながら、該化合物の使用量を減らすことができることを見い出し、本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本発明によれば、除菌対象物と下記一般式（１）で表される化合物とを接触させながら、該対象物に発光ダイオードから発生した波長４００ｎｍ〜３１５ｎｍのＵＶＡを照射することを特徴とする除菌方法が提供される。

（ただし、上記一般式（１）において、Ｒ₁およびＲ₄は、炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐の同一または異なるアルキレン基であり、Ｒ₂およびＲ₅は、水素原子、同一若しくは異なるハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ₃は、炭素数２〜１２の直鎖または分岐のアルキレン基であり、Ｒ₆は、炭素数１〜１８の直鎖または分岐のアルキル基であり、Ｚは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子またはＯＳＯ₂Ｒ₇基（Ｒ₇は、炭素数１〜４のアルキル基または置換若しくは無置換のフェニル基である）である。）

【0009】

また、本発明においては、前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（２）〜（５）で表される少なくとも１種の化合物であることが好ましい。

【0010】

また、本発明においては、前記除菌対象物と前記一般式（１）で表される化合物との接触を、該化合物を溶解した水系で行うこと；前記除菌対象物がコンタクトレンズであること；および、前記除菌対象物が、バイオフィルムが付着した物品であることが好ましい。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、１分子内にピリジニウム塩を２残基有するビス第四級アンモニウム塩化合物のみを用いて除菌を行う場合と比べて、該化合物の使用量を減らしても、同等の広い抗菌スペクトルを示し、優れた除菌効果を有する除菌方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＵＶＡ−ＬＥＤ照射装置の模式図

【図2】カンジダ菌に対する除菌効果を示すグラフ

【図3】栄養体アメーバに対する除菌効果を示すグラフ

【図4】殺菌剤濃度３ｍｇ／Ｌでのシスト体アメーバに対する除菌効果を示すグラフ

【図5】殺菌剤濃度１ｍｇ／Ｌでのシスト体アメーバに対する除菌効果を示すグラフ

【図6】大腸菌に対する除菌効果を示すグラフ

【図7】緑膿菌に対する除菌効果を示すグラフ

【図8】黄色ブドウ球菌に対する除菌効果を示すグラフ

【図9】バイオフィルムに対する除菌効果を示すグラフ

【図10】本発明に使用したＬＥＤの発光スペクトルを示すグラフ

【図11】大腸菌に対する白色ＬＥＤの除菌効果を示すグラフ

【図12】カンジダ菌に対する除菌効果を示すグラフ

【図13】大腸菌に対する除菌効果を示すグラフ

【図14】緑膿菌に対する除菌効果を示すグラフ

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本発明において、『除菌』というときは、原核生物に加えて、真核生物であるかび、酵母、原生動物、アメーバなどの微生物の個体数を減少させることをいうものとする。
また、本発明において、単に『光』というときは、可視光線のみならず、紫外線や赤外線を含む電磁波のことをいうものとする。

【0014】

本発明に使用する下記一般式（１）で表される１分子内にピリジニウム塩を２残基有するビス第四級アンモニウム塩化合物は、広い抗菌スペクトルを有する抗菌剤であり、上記特許文献２に記載の方法により合成することができる。

（ただし、上記一般式（１）において、Ｒ₁およびＲ₄は、炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐の同一または異なるアルキレン基であり、Ｒ₂およびＲ₅は、水素原子、同一若しくは異なるハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ₃は、炭素数２〜１２の直鎖または分岐のアルキレン基であり、Ｒ₆は、炭素数１〜１８の直鎖または分岐のアルキル基であり、Ｚは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子またはＯＳＯ₂Ｒ₇基（Ｒ₇は、炭素数１〜４のアルキル基または置換若しくは無置換のフェニル基である）である。）

【0015】

上記一般式（１）で表される化合物は、抗菌性に優れ、水溶性が高く、生分解性生成物の毒性が低いため、抗菌剤として優れている。

【0016】

本発明においては、上記一般式（１）で表される化合物の中でも、下記式（２）〜（５）で表される少なくとも１種の化合物を用いることが好ましい。

【0017】

上記式（４）で表される化合物は、１００ｇの水に対する溶解度が５８９ｇと極めて高く、細菌、かび、酵母、原生動物等の微生物に対して高い除菌効果を有することに加え、ラット経口急性毒性が３００ｍｇ／ｋｇ、変異原性陰性、皮膚感作性陰性などの高い安全性を有する化合物である。タマ化学工業株式会社からハイジェニア（登録商標；ＣＡＳ．Ｎｏ．８５１７６１−７５−６）として販売されているものを使用することができる。

【0018】

また、上記式（２）で表される化合物は、原生生物に対する除菌効果が優れている。

【0019】

本発明において、防菌対象物と一般式（１）の化合物とを接触させる方法としては、除菌対象物に一般式（１）の化合物の水溶液を噴霧することにより行ってもよく、一般式（１）の化合物を溶解した水系において接触させてもよい。例えば、一般式（１）の化合物の水溶液に、除菌対象物を浸すことにより接触させる。一般式（１）の化合物は水溶性が高く、容易に水溶液を調製することができる。

【0020】

上記接触を一般式（１）で表される化合物を溶解した水系で行う場合、該化合物の適切な濃度は、該化合物の構造や除菌対象の微生物に大きく依存する。以下、本発明の除菌方法において、一般式（１）で表される化合物として式（４）のハイジェニア（登録商標）を使用した場合について説明する。
対象微生物がグラム陰性菌の場合、ごく微量でも除菌効果を発揮でき、例えば大腸菌では０．１μＭ以上で除菌効果が現われ、０．５μＭ程度で十分に強い除菌効果を得ることができる。コンタクトレンズの連続装用に関連する角膜炎の起炎菌である緑膿菌に対しては、０．０５μＭ以上で除菌効果が現われ、３μＭ程度で十分に強い除菌効果を得ることができる。
一方、グラム陽性菌の場合には、グラム陰性菌よりも高濃度とする必要がある。例えば、角膜炎の起炎菌として代表的な黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に対しては、０．２μＭ以上で除菌効果が現われ、３μＭ程度で十分に強い除菌効果を得ることができる。

【0021】

感染性角膜炎の起炎菌として知られているカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対しては、５００μｇ／Ｌ以上で除菌効果が現われ、１ｍｇ／Ｌ程度で十分に強い除菌効果を得ることができる。近年、コンタクトレンズの装着に伴う感染性角膜炎の起炎菌として報告が増加しているアカントアメーバに対しては、栄養体とシスト体とで除菌効果が異なり、栄養体アメーバでは５００μｇ／Ｌ以上で除菌効果が現われ、１ｍｇ／Ｌ程度で十分に強い除菌効果を得ることができるが、シスト体アメーバでは除菌効果を得るためには、３ｍｇ／Ｌ以上とすることが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ以上とすることがより好ましい。

【0022】

本発明では、除菌対象物と上記一般式（１）で表される化合物とを接触させながら、該対象物に発光ダイオードから発生した光を照射することにより除菌を行う。上記一般式（１）で表される化合物は、それ自体除菌能力を持つ化合物であるが、本発明者らは、それに発光ダイオードから発生した光を照射することにより、相乗的な除菌効果が現われることを見出した。言い換えると、発光ダイオードから発生した光の照射を組み合わせることにより、一般式（１）で表される化合物の除菌能力を格段に向上させることができる。例えば、本明細書の実施例で例示するように、上記化合物のみを使用した場合には、ほとんど除菌能力を発揮しないほどの低濃度としても、発光ダイオードから発生した光の照射を併用することにより、効果的な除菌を行うことができる。このため、除菌能力を落とさずに、上記化合物の使用量を減らすことが可能である。

【0023】

本発明者らは、発光ダイオード光の照射により除菌能力が向上する理由として、発光ダイオード光の照射による細胞内での・ＯＨやＨ₂Ｏ₂などの活性酸素種の発生と式（１）で表される化合物の細胞膜破壊による酸素流入の促進に起因した・ＯＨやＨ₂Ｏ₂の発生が重なり、これらの相乗効果により一般式（１）で表される化合物の除菌能力が格段に向上するものと考えている。

【0024】

本発明に使用する発光ダイオードは、白色ＬＥＤを使用してもよいが、一般式（１）で表される化合物に光を照射したときに、活性酸素種が発生しやすい波長の光を放出するものが好ましい。具体的な波長としては、紫外線領域であることが好ましく、波長４００〜３１５ｎｍのＵＶＡ領域の光であることがより好ましい。ＵＶＡ領域の中でも、活性酸素種の発生効率の面から波長３６５ｎｍ付近の光が、本発明に最も適している。このような波長の光を放出する発光ダイオードの例として、波長４００〜３１５ｎｍのＵＶＡを発するＵＶＡ−ＬＥＤを挙げることができる。
なお、上記一般式（１）で表される化合物は、２８５ｎｍ付近の光を吸収し、分解されやすいため、２８５ｎｍ付近の波長を含む光を避けることが好ましい。

【0025】

発光ダイオードは、その製造工程において水銀やハンダなどの環境負荷の高い物質が使用されず、また寿命が長く、省電力であることから環境に優しいという点で優れている。また、発光ダイオードは機械的強度が強く小型化が容易であるため、本発明の方法を実施するための装置を小型化できる点で有利である。さらにＵＶＡ波長は、紫外領域の中でも長波長であるため照射対象物への劣化作用が低い点でも有利である。

【0026】

発光ダイオードからの照射光の強度は、除菌対象物や除菌対象の微生物の種類により一概には言えないが、一例として除菌対象物の表面において２０〜２０００μＷ／ｃｍ²となるような強度の光を照射する。

【0027】

本発明の除菌方法において、除菌対象物と一般式（１）で表される化合物とを接触させておく時間は、該化合物の濃度、除菌対象物、除菌対象の微生物の種類により異なり一概には言えないが、原核生物に対しては５分以上とすることが好ましく、１０分〜３時間程度とすることがより好ましい。真核生物に対しては、３０分以上とすることが好ましく、１〜２４時間程度とすることがより好ましい。
本発明の除菌方法においては、光を連続照射してもよいが、短い休止時間を設けて断続的に照射してもよい。

【0028】

本発明の除菌方法では、各種の工業製品や医療用機械器具を除菌対象物とすることができる。例えば、残留薬剤が懸念される食品工場生産ラインや医療用機械器具の殺菌に本発明の除菌方法を適用することにより、少量の抗菌剤使用による微生物殺菌が達成でき、また除菌廃液中の残留薬剤量が非常に少ないため、簡便な薬剤除去後、廃水の工業用水さらには上水への再利用も可能である。また、本発明の除菌方法は、ブドウ球菌、緑膿菌、カンジダ菌、アカントアメーバなどコンタクトレンズの装着に伴い引き起こされる角膜炎の起炎菌に対して顕著な除菌効果を発揮するため、コンタクトレンズの除菌に好適に適用できる。
コンタクトレンズを除菌するための除菌剤としては、従来、塩化ベンザルコニウム（以下、ＢＡＣと略す。）やポリヘキサメチレンビグアナイド（以下、ＰＨＭＢと略す。）などが使用されてきた。しかし、一般式（１）で表される化合物はＢＡＣやＰＨＭＢと比べてもヒトに対する毒性が低く、さらに本発明の除菌方法では、上記化合物の使用量を、単独使用の場合と比べて大幅に減らすことができるので、安全性に優れている。
また、発光ダイオードの照射装置は容易に小型化できるので、本発明の方法を実施するためのコンタクトレンズ用除菌装置は、例えば、１ｃｍ角程度に小型化することができる。

【0029】

また、本発明の除菌方法は、バイオフィルムが付着した物品の除菌にも適用できる。バイオフィルムには、原核生物である細菌をはじめ、かび、酵母、原生動物、アメーバなど種々の微生物が生息するが、本発明の除菌方法は、広い抗菌スペクトルを有するので、バイオフィルムに存在するこれらの種々の微生物を効果的に除菌することができる。このため、本発明によれば、居住空間においてバイオフィルムが発生しやすい、台所、トイレ、雨どい、上下水道管などの除菌やカテーテル、人工透析装置、入れ歯、コンタクトレンズなどのバイオフィルムが発生しやすい医療用機械器具の除菌に好適に使用することができる。

【実施例】

【0030】

以下、例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらによって本発明が限定されるものではない。

【0031】

＜カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５）菌液の調製＞
サブロー液体培地５ｍＬを入れた試験管にカンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５）を植菌し、これを２４時間、１１０ｍｉｎ^-1の条件で振盪培養した。その後、６５００ｒｐｍ、４℃での遠心分離により集菌および生理食塩水を用いて２回洗菌したものを、滅菌済みのイオン交換水で再懸濁してカンジダ菌液を調製した。

【0032】

＜アメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ＡＴＣＣ ３０８７１）の調製＞
（１）ＰＹＧＣ液体培地の調製
プロテオースペプトン（Ｓｉｇｍａ）５ｇ、酵母エキス（ＯＸＩＯＤ）５ｇ、ＮａＣｌ（関東化学）２．５ｇを４５０ｍＬの蒸留水に溶解後、オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却して第１液を調製した。
Ｄ（＋）−グルコース（関東化学）５ｇ、Ｌ−システイン・ＨＣｌ ０．４７５ｇ（関東化学）を蒸留水３５ｍＬに溶解し、これに０．５Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（関東化学）水溶液１０ｍＬと０．５Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄（関東化学）水溶液５ｍＬを加えて混和し、この溶液をろ過滅菌（０．４５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）して第２液を調製した。

【0033】

第１液と第２液を混和し、ろ過滅菌済みの１Ｎ ＫＯＨ水溶液または１Ｎ ＨＣｌ水溶液でｐＨ６．５±０．１に調整して第３液を調製した。
ろ過滅菌済みの０．４Ｍ ＭｇＣｌ₂（関東化学）水溶液２．５ｍＬと０．４Ｍ ＣａＣｌ₂（関東化学）水溶液０．５ｍＬを第３液に加え、ＰＹＧＣ液体培地を調製した。
また、第１液のプロテオースペプトンと酵母エキスをそれぞれ２．５ｇ、第２液のＤ（＋）−グルコース（関東化学）を２．５ｇとしたこと以外は上記ＰＹＧＣ液体培地と同様にして、１／２ ＰＹＧＣ液体培地を調製した。

【0034】

（２）ＰＡＳ培地（Ｐａｇｅ’ｓ Ａｍｏｅｂａ Ｓａｌｉｎｅ）の調製
本実施例では、細胞内ＡＴＰ量測定を行うために、可溶性有機物を添加しない培地を用いた。このための培地として、ＮａＣｌ １２０ｍｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（関東化学） ４ｍｇ、ＣａＣｌ₂ ４ｍｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １４２ｍｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １３６ｍｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解し、オートクレーブ滅菌したＰａｇｅ’ｓ Ａｍｏｅｂａ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＡＳ）を使用した。

【0035】

（３）熱処理大腸菌懸濁液の調製
Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（バクトトリプトン １０ｇ、酵母エキス ５．０ｇ、ＮａＣｌ ５．０ｇを１Ｌにメスアップしたもの）５ｍＬ中で前培養した大腸菌を、２０００ｍＬ容の坂口フラスコ中に調製した２倍濃度Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ；以下ＮＢ培地と略す。）１０００ｍＬに加え、３７℃において２４時間振盪培養した。培養後の培地を４５０ｍＬ容遠心チューブに移し、６０００ｒｐｍ、４℃、１０分間、遠心分離（ＭＯＤＥＬ５０Ａ−７、佐久間製作所）し、次いでＰＡＳで２回洗浄した後、ＰＡＳ １００ｍＬに再懸濁した。この大腸菌懸濁液を５００ｍＬの三角フラスコに移し、７０℃、９０分間、振盪下（９０ストローク／分）で熱処理を行った。急冷の後、懸濁液を２５ｍＬ遠沈管に分注し、使用時まで−８０℃で保存した。

【0036】

（４）アメーバの前培養
凍結保存シストアメーバを３５℃の水浴で解凍後、１０ｍＬのＰＹＧＣ液体培地を分注した培養フラスコ（培養面積２５ｃｍ²、容量６０ｍＬ）に０．１ｍＬ接種し、２５℃で静置培養した。上清の汚れの程度に応じて培地を交換し、培養フラスコ底面に十分に増殖させて前々培養を行った。
実験に使用するアメーバの前培養は、上記前々培養アメーバを培地交換した後、培養フラスコの底面をボルテックスミキサーで激しく振動（２０〜３０秒間）し、剥離させて得たアメーバ懸濁液０．１ｍＬを、１／２ ＰＹＧＣ液体培地９．９ｍＬとＯＤ₆₆₀≒４に調整した熱処理大腸菌０．１ｍＬとを混合した培養フラスコに接種し、２５℃で４日間静置培養することにより行った。

【0037】

（５）栄養体アメーバ懸濁液の調製
上記（４）にて前培養した培養液の上清を廃棄し、ＰＡＳ １０ｍＬで培養フラスコ内を緩やかに洗浄した後、激しい振動によりアメーバを剥離させ、培養液を１５ｍＬ遠沈管に入れて遠心分離により集菌（２１５０ｒｐｍ、４℃、５分間、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２、ＨＩＴＡＣＨＩ）および洗浄（２回）を行い、１０ｍＬ ＰＡＳで再懸濁した。所期の栄養体アメーバ細胞数に血球計数盤（ｄｅｐｔｈ ０．１ｍｍ、１／４００ｐｍｍ、Ｔｈｏｍａ）を使用し、ＰＡＳで２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。

【0038】

（６）シストアメーバの調製
上記（５）で調製した栄養体アメーバを、シスト形成培地（ＫＣｌ ０．７ｇ、ＣａＣｌ₂ ０．８ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．８ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解後、オートクレーブ滅菌）中に２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加してアメーバ懸濁液を調整した。シスト形成培地０．９ｍＬを分注した４８穴マイクロプレートに上記アメーバ懸濁液０．１ｍＬを接種し、２５℃で８日間静置培養することによりシスト化させた。

【0039】

＜カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５）に対する暴露試験＞
［実験例１］
滅菌イオン交換水で２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したカンジダ菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れた。これに、終濃度が１ｍｇ／Ｌになるようにハイジェニア（タマ化学工業株式会社）溶液を添加後、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数をハイジェニアの添加から０、１、３、６時間後に測定した。結果を図２に黒丸●で示す。ハイジェニアおよびＵＶＡの暴露開始から１時間後には生菌数は１０分の１に急減し、開始から６時間後には約１００分の１にまで減少した。

【0040】

なお、ＵＶＡの照射は、１００×３００ｍｍ²の基板に９直列×３並列で３６５ｎｍＬＥＤを備えた装置を用いて行った（サン電子工業株式会社製作）。光源部から５０ｍｍの距離における照射強度は６２８μＷ／ｃｍ²であった。本実験例で使用したＵＶＡ照射装置の模式図を図１に示す。また、当該ＵＶＡ照射装置の発光スペクトルを図１０に実線で示す。
生菌数の測定は、０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入り生理食塩水で菌液を１０倍段階希釈し、各希釈液１００μＬを０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入りサブロー寒天培地に塗布し、４８時間、３０℃で培養後、コロニーを計数することにより行った。

【0041】

［実験例２］
ハイジェニアに代えて１０％塩化ベンザルコニウム溶液（和光純薬工業；以下ＢＡＣと略す。）を終濃度が１ｍｇ／Ｌになるように添加したこと以外は実験例１と同様にして実験を行った。結果を図２に逆黒三角▼で示す。ＢＡＣとＵＶＡの暴露から１時間後には生菌数が約６分の１に減少したが、その後は６時間を経過するまで生菌数に大きな変化は見られなかった。

【0042】

［実験例３］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例１と同様にして実験を行った。結果を図２に白丸○で示す。ハイジェニアの暴露から１時間後には生菌数が約６分の１に減少し、６時間後には２０分の１に減少した。

【0043】

［実験例４］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例２と同様にして実験を行った。結果を図２に逆三角▽で示す。ＢＡＣの暴露から１時間後には生菌数が約６分の１に減少したが、その後は６時間を経過するまで生菌数に大きな変化は見られなかった。

【0044】

［実験例５］
ハイジェニア溶液を添加しなかったこと以外は実験例１と同様にして実験を行った。結果を図２に黒三角▲で示す。実験開始から６時間経過後に至るまで生菌数に大きな変化は見られなかった。

【0045】

［実験例６］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液の添加も、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例１と同様にして実験を行った。結果を図２に×で示す。実験開始から時間の経過とともにわずかに生菌数が増加した。

【0046】

実験例１〜６の結果から、カンジダ菌に対しては、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤとの併用により、除菌作用について優れた相乗効果がみられた。特に、ハイジェニアのみを使用した場合（実験例３）に比べてＵＶＡ−ＬＥＤを併用することで、６時間後における生菌数が５分の１に減少し、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤの併用による殺真菌性の相乗効果が示された。

【0047】

＜栄養体アメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ＡＴＣＣ ３０８７１）に対する暴露試験＞
［実験例７］
４８穴マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）に、上記（５）で調製した２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬの栄養体アメーバ懸濁液０．１ｍＬ、上記（３）で調製した熱処理大腸菌懸濁液を、最終ＯＤ₆₆₀が０．０８になるように０．１ｍＬおよびＰＡＳ ０．７５ｍＬを分注し、アメーバ定着のため２時間静置した後、終濃度が１ｍｇ／Ｌとなるようにハイジェニア（タマ化学工業株式会社製）溶液を０．０５ｍＬ添加した。

【0048】

実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、プレートを２５℃で静置培養した。ハイジェニアの添加から０、１、３および６時間後に後述する手順にて浮遊アメーバおよび付着アメーバ由来のＡＴＰ量を測定し、両者の和をアメーバ生細胞由来の全ＡＴＰ量とした。
結果を図３に黒丸●で示す。ＡＴＰ量は、ハイジェニアおよびＵＶＡの暴露開始から急激に減少し、６時間後には約７１分の１にまで減少した。

【0049】

なお、ＡＴＰ測定は、薬剤不活化剤としてＴｗｅｅｎ８０を終濃度が０．５ｗ／ｖ％となるように０．２ｍＬ添加し、３０分静置後に行った。ＡＴＰ測定試薬は、抗菌試験用発光測定試薬セット（キッコーマン株式会社製）を使用し、測定機器は、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１（アロカ）を使用した。

【0050】

（浮遊アメーバ由来のＡＴＰ量測定）
まず、各ウェルから上清を静かに除き、得られた上清０．９ｍＬをルミチューブに分注し、これにＡＴＰ消去試薬０．１ｍＬを加えよく攪拌した。次いで、この溶液を別のルミチューブ３本に０．１ｍＬずつ分注後、２０分間静置することにより細胞外ＡＴＰを消去した。消去後、ＡＴＰ抽出試薬を０．１ｍＬ加えよく攪拌し、３０秒間の抽出時間後、発光試薬を０．１ｍＬ加え、３０秒間積算の発光量から検量線（ＰＡＳ溶媒で作成、検出限界９．５２×１０^-2ｐｍｏｌ／Ｌ）により浮遊アメーバ由来のＡＴＰ量を算出した。

【0051】

（付着アメーバ由来のＡＴＰ量測定）
上清を除いた各ウェルにＰＡＳ ０．３６ｍＬおよびＡＴＰ消去試薬０．０４ｍＬを加え、２０分間静置して細胞外ＡＴＰを消去した。次に、ＡＴＰ抽出試薬を０．４ｍＬ加えて混合し３０秒間抽出した後、各ウェルから溶液を吸い取り、これをルミチューブ３本に０．２ｍＬずつ分注し、発光試薬０．１ｍＬを加え、浮遊アメーバ由来のサンプルと同様の手順にて付着アメーバ由来のＡＴＰ量を算出した（ＰＡＳ溶媒で検量線作成、検出限界９．５２×１０^-2ｐｍｏｌ／Ｌ）。データには示さないが、本測定法で含有する熱処理大腸菌由来のＡＴＰ発光量は検出限界以下であった。

【0052】

［実験例８］
ハイジェニアに代えてＢＡＣを終濃度が１ｍｇ／Ｌになるように添加したこと以外は実験例７と同様にして実験を行った。結果を図３に逆黒三角▼で示す。ＡＴＰ量は、ＢＡＣおよびＵＶＡの暴露開始から急激に減少し、６時間後にはハイジェニア＋ＵＶＡの実験例７と同程度の約６３分の１にまで減少した。

【0053】

［実験例９］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例７と同様にして実験を行った。結果を図３に白丸○で示す。ハイジェニアの暴露から３時間後にはＡＴＰ量が約３分の１に減少し、６時間後には約１１分の１に減少した。

【0054】

［実験例１０］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例８と同様にして実験を行った。結果を図３に逆三角▽で示す。ＢＡＣの暴露から時間の経過とともに穏やかにＡＴＰ量が減少し、６時間後には４分の１に減少した。

【0055】

［実験例１１］
ハイジェニア溶液の代わりにＰＡＳ０．０５ｍＬを添加したこと以外は実験例７と同様にして実験を行った。結果を図３に黒三角▲で示す。実験開始から時間の経過とともにＡＴＰが減少し、６時間後には４０分の１に減少した。

【0056】

［実験例１２］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液の代わりにＰＡＳ０．０５ｍＬを添加し、ＵＶＡ照射をしないこと以外は実験例７と同様にして実験を行った。結果を図３に×で示す。実験開始から６時間経過後までＡＴＰ量の変化はわずかであった。

【0057】

以上、実験例７〜１２の栄養体アメーバに対する暴露試験の結果から、ＢＡＣまたはハイジェニアを単独で用いた場合と比較して、ＵＶＡ−ＬＥＤ照射を併用することでより強い殺アメーバ効果が得られることが示された。ＵＶＡ−ＬＥＤ併用時の抗菌剤としてＢＡＣを用いた場合とハイジェニアの場合とでは殺アメーバ効果に大きな差はみられなかった。しかし、ハイジェニアはＢＡＣと比較して溶血毒性、皮膚感作性などの毒性が低いことから、コンタクトレンズの洗浄などの医療器具洗浄の用途において有利である。
なお、ＵＶＡ−ＬＥＤ単独使用の場合と比べ、ＢＡＣまたはハイジェニアを併用した際の６時間後におけるＡＴＰ量は、それぞれ６３％、５６％に減少した。

【0058】

＜シスト体アメーバに対する暴露試験 抗菌剤濃度３ｍｇ／Ｌ＞
［実験例１３］
上記（６）で調製したシスト体アメーバからシスト形成培地を除いた後、各ウェルにＰＡＳ １ｍＬを添加してウェルを穏やかに洗浄し、次いで、ＰＡＳ ０．９５ｍＬと、終濃度が３ｍｇ／Ｌとなるようにハイジェニア溶液を０．０５ｍＬ添加した。

【0059】

実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、プレートを２５℃で静置培養した。ハイジェニアの添加から０、１、３および６時間後に実験例７と同様の手順にて浮遊および付着シスト由来のＡＴＰ量を測定し、両者の和をアメーバ生細胞由来の全ＡＴＰ量とした。
結果を図４に黒丸●で示す。ＡＴＰ量は、ハイジェニアおよびＵＶＡの暴露開始から減少し、６時間後には１１分の１にまで減少した。

【0060】

［実験例１４］
ハイジェニアに代えてＢＡＣを終濃度が３ｍｇ／Ｌになるように添加したこと以外は実験例１３と同様にして実験を行った。結果を図４に逆黒三角▼で示す。ＡＴＰ量は、ＢＡＣおよびＵＶＡの暴露開始から減少し、６時間後には約１７分の１にまで減少した。

【0061】

［実験例１５］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例１３と同様にして実験を行った。結果を図４に白丸○で示す。ハイジェニアの暴露から６時間後にはＡＴＰ量が約２分の１に減少した。

【0062】

［実験例１６］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例１４と同様にして実験を行った。結果を図４に逆三角▽で示す。ＢＡＣの暴露によるＡＴＰ量の変化は少なく、６時間後ＡＴＰ量は、実験開始直後の９７％程度であった。

【0063】

［実験例１７］
ハイジェニア溶液の代わりにＰＡＳ０．０５ｍＬを添加したこと以外は実験例１３と同様にして実験を行った。結果を図４に黒三角▲で示す。実験開始から時間の経過とともにＡＴＰが減少し、６時間後には約７分の１に減少した。

【0064】

［実験例１８］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液の代わりにＰＡＳ０．０５ｍＬを添加し、ＵＶＡ照射をしないこと以外は実験例１３と同様にして実験を行った。結果を図４に×で示す。実験開始から６時間経過後までＡＴＰ量の変化はわずかであった。

【0065】

以上、実験例１３〜１８のシスト体アメーバに対する暴露試験の結果から、ＢＡＣまたはハイジェニアを単独で用いた場合と比較して、ＵＶＡ−ＬＥＤ照射を併用することでシスト体アメーバに対するより強い殺アメーバ効果が得られることが示された。ＵＶＡ−ＬＥＤ併用時の抗菌剤としてＢＡＣを用いた場合とハイジェニアの場合とでは殺アメーバ効果に大きな差はみられなかった。しかし、ハイジェニアはＢＡＣと比較して溶血毒性、皮膚感作性などの毒性が低いことから、コンタクトレンズの洗浄などの医療器具洗浄の用途において有利である。
なお、ＵＶＡ−ＬＥＤ単独使用の場合と比べ、ＢＡＣまたはハイジェニアを併用した際の６時間後におけるＡＴＰ量は、それぞれ４１％、６４％に減少した。

【0066】

＜シスト体アメーバに対する暴露試験 抗菌剤濃度１ｍｇ／Ｌ＞
［実験例１９〜２４］
ハイジェニアとＢＡＣの終濃度を１ｍｇ／Ｌとしたこと以外は実験例１３〜１８と同様にして、それぞれＡＴＰ量の測定を行った（実験例１９〜２４）。結果を図５に示す。これらの結果から、抗菌剤濃度が１ｍｇ／Ｌでは、ハイジェニア、ＢＡＣともに単独ではシスト体アメーバに対する殺アメーバ効果は弱く、ＵＶＡ−ＬＥＤと併用しても殺アメーバ効果の併用効果は確認できなかった。

【0067】

＜大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＢＲＣ １２７１３）に対する暴露試験＞
［実験例２５］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＢＲＣ １２７１３）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（バクトトリプトン １０ｇ、酵母エキス ５．０ｇ、ＮａＣｌ ５．０ｇを１Ｌにメスアップしたもの）５ｍＬを入れた試験管中で１７時間、１１０ｍｉｎ^-1にて振盪培養して前培養した。前培養液を６５００ｒｐｍ、４℃で集菌および生理食塩水で２回洗菌し、滅菌イオン交換水で再懸濁し、２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。この大腸菌菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れ、次いで、終濃度が０．３μＭになるようにハイジェニア（タマ化学工業株式会社）溶液を添加後、実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数をハイジェニアの添加から０、１０、３０および６０分後に測定した。結果を図６に黒丸●で示す。ハイジェニアおよびＵＶＡの暴露開始から３０分後には生菌数は１０分の１に急減し、開始から６０分後には約１万分の１にまで減少した。

【0068】

なお、生菌数の測定は、０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入り生理食塩水で菌液を１０倍段階希釈し、各希釈液１００μＬをＳＣＤＬＰ寒天培地に塗布し、２４時間、３７℃で培養後、コロニーを計数することにより行った。

【0069】

［実験例２６］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例２５と同様にして実験を行った。結果を図６に白丸○で示す。生菌数はハイジェニアの暴露から緩やかに減少し、６０分後には生菌数が約７分の１となった。

【0070】

［実験例２７］
ハイジェニア溶液を添加しなかったこと以外は実験例２５と同様にして実験を行った。結果を図６に黒三角▲で示す。実験開始から６０分後には生菌数が１００分の１まで減少した。

【0071】

［実験例２８］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液の添加も、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例２５と同様にして実験を行った。結果を図６に×で示す。実験開始から６０分の間での生菌数の変化はなかった。

【0072】

実験例２５〜２８の結果から、大腸菌に対しては、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤとの併用により、除菌作用について優れた相乗効果がみられた。特に、ハイジェニアのみを使用した場合（実験例２６）に比べてＵＶＡ−ＬＥＤを併用することで、６０分後における生菌数が１０００分の１以下となり、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤの併用による殺菌性の相乗効果が示された。

【0073】

＜緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５）に対する暴露試験＞
［実験例２９］
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５）を、１００ｍＬの三角フラスコに入れた２０ｍＬのＮＢ培地中で１７時間、１４７ｍｉｎ^-1にて振盪培養して前培養した。前培養液を６５００ｒｐｍ、４℃で集菌および生理食塩水で２回洗菌し、滅菌イオン交換水で再懸濁し、２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。この緑膿菌菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れ、次いで、終濃度が０．０５μＭになるようにハイジェニア（タマ化学工業株式会社）溶液を添加後、実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数をハイジェニアの添加から０、１０、３０および６０分後に測定した。結果を図７に黒丸●で示す。ハイジェニアおよびＵＶＡの暴露開始から３０分後には生菌数は３７分の１に急減し、開始から６０分後には検出限界以下（１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ未満）にまで減少した。

【0074】

なお、生菌数の測定は、０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入り生理食塩水で菌液を１０倍段階希釈し、各希釈液１００μＬをＳＣＤＬＰ寒天培地に塗布し、２４時間、３７℃で培養後、コロニーを計数することにより行った。

【0075】

［実験例３０］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例２９と同様にして実験を行った。結果を図７に白丸○で示す。６０分間のハイジェニアの暴露では生菌数の変化は認められなかった。

【0076】

［実験例３１］
ハイジェニア溶液を添加しなかったこと以外は実験例２９と同様にして実験を行った。結果を図７に黒三角▲で示す。実験開始から６０分後には生菌数が７７０分の１まで減少した。

【0077】

［実験例３２］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液の添加も、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例２９と同様にして実験を行った。結果を図７に×で示す。実験開始から６０分の間での生菌数の変化はなかった。

【0078】

実験例２９〜３２の結果から、緑膿菌に対しては、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤとの併用により、除菌作用について優れた相乗効果がみられた。特に、ハイジェニアのみを使用した場合（実験例３０）の生菌数は、コントロールと大きな差は見られなかったにもかかわらず、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤを併用することで、ＵＶＡ−ＬＥＤの照射のみの場合と比べても、生菌数は１００分の１以下の検出限界以下に減少し、指数関数的減少を伴った相乗的除菌効果が示された。

【0079】

＜黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＢＲＣ １２７３２）に対する暴露試験＞
［実験例３３］
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＢＲＣ １２７３２）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地５ｍＬを入れた試験管中で、で１７時間、１１０ｍｉｎ^-1にて振盪培養して前培養した。前培養液を６５００ｒｐｍ、４℃で集菌および生理食塩水で２回洗菌し、滅菌イオン交換水で再懸濁し、２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。この黄色ブドウ球菌菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れ、次いで、終濃度が３μＭになるようにハイジェニア（タマ化学工業株式会社）溶液を添加後、実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数をハイジェニアの添加から０、１０、３０および６０分後に測定した。結果を図８に黒丸●で示す。ハイジェニアおよびＵＶＡの暴露開始から３０分後には生菌数は１００分の１に急減し、開始から６０分後には５０００分の１まで減少した。

【0080】

なお、生菌数の測定は、０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入り生理食塩水で菌液を１０倍段階希釈し、各希釈液１００μＬをＳＣＤＬＰ寒天培地に塗布し、２４時間、３７℃で培養後、コロニーを計数することにより行った。

【0081】

［実験例３４］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例３３と同様にして実験を行った。結果を図８に白丸○で示す。ハイジェニアの暴露から１０分後には生菌数が１００分の１まで激減し、６０分後には生菌数が約３０００分の１となった。

【0082】

［実験例３５］
ハイジェニア溶液を添加しなかったこと以外は実験例３３と同様にして実験を行った。結果を図８に黒三角▲で示す。実験開始から緩やかに生菌数は減少し、６０分後には生菌数が１０分の１となった。

【0083】

［実験例３６］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液の添加も、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例３３と同様にして実験を行った。結果を図８に×で示す。実験開始から６０分の間での顕著な生菌数の変化はなかった。

【0084】

実験例３３〜３６の結果から、黄色ブドウ球菌に対しては、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤとの併用による殺菌について相乗効果は認められなかった。そして、ＵＶＡ−ＬＥＤによる黄色ブドウ球菌に対する殺菌効果は、大腸菌や緑膿菌と比較すると、明らかに低かった。従って、黄色ブドウ球菌の殺菌には、ハイジェニアの添加が有効であることが分かった。

【0085】

＜緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５）バイオフィルムに対する暴露試験＞
［実験例３７］
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５）を、１００ｍＬの三角フラスコに入れた２０ｍＬのＮＢ培地中で１７時間、１４７ｍｉｎ^-1にて振盪培養して前培養した。前培養液を６５００ｒｐｍ、４℃で集菌および生理食塩水で２回洗菌し、滅菌イオン交換水で再懸濁し、これをＲ２Ａ培地でＯＤ₆₆₀＝０．０１７（２．０×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に調製し、それを６．７×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈したものを、４８穴マイクロプレート（平底、非コーティングポリスチレン製、滅菌済み、ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに１ｍＬずつ分注し、３０℃、５日間静置培養することにより、プレート壁にバイオフィルムを形成させた。

【0086】

バイオフィルムを形成した４８穴マイクロプレートのウェル中から培地を除き、滅菌済みのイオン交換水で１回洗浄し、風乾させた。次いで、滅菌済みイオン交換水０．８ｍＬをウェルに加え、終濃度が０．０５μＭになるようにハイジェニア（タマ化学工業株式会社）溶液を０．２ｍＬ添加後、実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で１時間静置培養した。
バイオフィルムでの生菌数を確実に評価するため、上清における生菌数と、プレート壁に吸着したバイオフィルム表層および内部の生菌数を計数した。上清については、ウェル中の上清を試験管へ移し、プレートを風乾させた。その上清を０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入り生理食塩水で希釈してから、ＳＣＤＬＰ寒天培地に塗布し、２４時間培養後にコロニーカウントを行った。一方、風乾したウェルについては、０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入り生理食塩水を１ｍＬ加え、ウェルの底と壁を十分にピペッティングし、０．７％ Ｔｗｅｅｎ８０入り生理食塩水で希釈後、上清と同様の手順にてコロニーカウントを行った。結果を図９に棒グラフ（左端）で示す。網掛け棒を上清における生菌数、白色棒をバイオフィルム表層および内部の生菌数とした。ハイジェニアおよびＵＶＡの暴露開始から６０分後には上清生菌数は１０ｃｅｌｌｓ未満、吸着生菌数は１００ｃｅｌｌｓ未満までに急減した。

【0087】

なお、Ｒ２Ａ培地は、ペプトン ０．５ｇ、酵母抽出物 ０．５ｇ、カザミノ酸 ０．５ｇ、グルコース ０．５ｇ、可溶性デンプン ０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５ｇ、ピルビン酸ナトリウム ０．３ｇを１Ｌにメスアップし、ｐＨ７．０〜７．４としたものを使用し、ＵＶＡの照射は実験例１と同じ装置を用いて行った。

【0088】

［実験例３８］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例３７と同様にして実験を行った。結果を図９に棒グラフ（左から２番目）で示す。網掛け棒を上清における生菌数、白色棒をバイオフィルム表層および内部の生菌数とした。コントロール生菌数（右端）と比較し、ハイジェニアの暴露による生菌数の著しい変化は、６０分暴露間では認められなかった。

【0089】

［実験例３９］
ハイジェニア溶液を添加しない代わりに滅菌イオン交換水０．２ｍＬを加えたこと以外は実験例３７と同様にして実験を行った。結果を図９に棒グラフ（左から３番目）で示す。網掛け棒を上清における生菌数、白色棒をバイオフィルム表層および内部の生菌数とした。ＵＶＡの暴露開始から６０分後には上清生菌数は、約１０００分の１まで減少し、一方吸着生菌数は１０ｃｅｌｌｓ未満までに急減した。

【0090】

［実験例４０］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液を添加しない代わりに滅菌イオン交換水０．２ｍＬを加え、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例３７と同様にして実験を行った。結果を図９に棒グラフ（右端）で示し、網掛け棒を上清における生菌数、白色棒をバイオフィルム表層および内部の生菌数とした。実験開始から６０分後の生菌数は、上清においては１０⁸オーダー、バイオフィルムにおいては１０⁷オーダーであった。

【0091】

実験例３７〜４０の結果から、バイオフィルムを形成した緑膿菌に対しては、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤとの併用により、除菌効果について優れた相乗効果がみられた。特に、ハイジェニアのみを使用した場合（実験例３８）に比べてＵＶＡ−ＬＥＤを併用することで、６０分暴露後における生菌数は激減し、ハイジェニアとＵＶＡ−ＬＥＤの併用による強い殺菌性の相乗効果が示された。

【0092】

＜大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＢＲＣ １２７１３）に対する白色ＬＥＤ暴露試験＞
［実験例４１］
実験例２５と同様の手順にて、２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬの大腸菌菌液を調製した。この大腸菌菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れ、次いで、終濃度が０．３μＭになるようにハイジェニア（タマ化学工業株式会社）溶液を添加後、７０ｍｍの距離から白色ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数をハイジェニアの添加から０、１０、３０、６０分後に測定した。結果を図１１に黒丸●で示す。ハイジェニアおよび白色ＬＥＤの暴露開始から３０分後には生菌数は１０分の１に減少し、開始から６０分後には１００分の１にまで減少した。

【0093】

なお、白色ＬＥＤの照射は、１００×３００ｍｍ²の基板に９直列×３並列で白色ＬＥＤを備えた装置を用いて行った（サン電子工業株式会社製作）。光源部から７０ｍｍの距離における照射強度は８９０μＷ／ｃｍ²であった。ＵＶＡ−ＬＥＤ照射実験では、光源部と菌液との距離を５０ｍｍとしたが、白色ＬＥＤ照射実験では、放熱により生菌数に影響が及ぶことを避けるため、光源部と菌液との距離を７０ｍｍとした。本実験例では、白色ＬＥＤ照射装置として、図１のＵＶＡ照射装置と同様の構成のものを使用した。当該白色ＬＥＤ照射装置の発光スペクトルを図１０に点線で示す。生菌数の測定は、実験例２５と同様に行った。

【0094】

［実験例４２］
白色ＬＥＤを照射しなかったこと以外は実験例４１と同様にして実験を行った。結果を図１１に白丸○で示す。生菌数はハイジェニアの暴露から緩やかに減少し、６０分後には生菌数が約７分の１となった。

【0095】

［実験例４３］
ハイジェニア溶液を添加しなかったこと以外は実験例４１と同様にして実験を行った。結果を図１１に三角△で示す。実験開始から６０分後には生菌数が約４分の１に減少した。

【0096】

［実験例４４］
コントロール実験として、ハイジェニア溶液の添加も、白色ＬＥＤ照射もしないこと以外は実験例４１と同様にして実験を行った。結果を図１１に×で示す。実験開始から６０分の間での生菌数の変化はなかった。

【0097】

実験例４１〜４４の結果から、大腸菌に対して、ハイジェニアと白色ＬＥＤとの併用により、除菌効果について相乗効果がみられた。特に、ハイジェニアのみを使用した場合（実験例４２）に比べて白色ＬＥＤを併用することで、６０分後における生菌数が約１４分の１以下となり、ハイジェニアと白色ＬＥＤとの併用による殺菌性の相乗効果が示された。

【0098】

＜カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５）に対する暴露試験＞
［実験例４５］
滅菌イオン交換水で２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したカンジダ菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れた。これに、終濃度が２０ｍｇ／Ｌになるように式（２）化合物溶液を添加後、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数を式（２）化合物の添加から０、１、３、６時間後に測定した。結果を図１２に黒丸●で示す。式（２）化合物およびＵＶＡの暴露開始から１時間後には生菌数は１０００分の１に急減し、開始から３時間後には不検出となった。なお、ＵＶＡの照射と生菌数の測定は、実験例１と同様の手順にて行った。

【0099】

［実験例４６］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例４５と同様にして実験を行った。結果を図１２に白丸○で示す。式（２）化合物の暴露から１時間後には生菌数が約１０分の１に減少し、その後は生菌数に大きな変化はなかった。

【0100】

［実験例４７］
式（２）化合物を添加しなかったこと以外は実験例４５と同様にして実験を行った。結果を図１２に黒三角▲で示す。実験開始から６時間経過後に至るまで生菌数に大きな変化は見られなかった。

【0101】

［実験例４８］
コントロール実験として、式（２）化合物の添加も、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例４５と同様にして実験を行った。結果を図１２に×で示す。実験開始から時間の経過とともにわずかに生菌数が増加した。

【0102】

実験例４５〜４８の結果から、カンジダ菌に対しては、式（２）化合物とＵＶＡ−ＬＥＤとの併用により、除菌作用について非常に強い相乗効果がみられた。特に、式（２）化合物のみを使用した場合（実験例４６）に比べてＵＶＡ−ＬＥＤを併用することで、６時間後には生菌数を不検出まで減少させ、式（２）化合物とＵＶＡ−ＬＥＤの併用による殺真菌性の相乗効果が示された。

【0103】

＜大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＢＲＣ １２７１３）に対する暴露試験＞
［実験例４９］
滅菌イオン交換水で調整した２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＢＲＣ １２７１３）菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れた。次いで、終濃度が４．５μＭになるように式（２）化合物溶液を添加後、実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数を式（２）化合物の添加から０、１０、３０および６０分後に測定した。結果を図１３に黒丸●で示す。式（２）化合物およびＵＶＡの暴露開始から３０分後には生菌数は５分の１に急減し、開始から６０分後には約１万分の１近くまで減少した。なお、生菌数の測定は、実験例２５と同様の手順にて行った。

【0104】

［実験例５０］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例４９と同様にして実験を行った。結果を図１３に白丸○で示す。生菌数は式（２）化合物の暴露から緩やかに減少し、６０分後には生菌数が約３分の１となった。

【0105】

［実験例５１］
式（２）化合物を添加しなかったこと以外は実験例４９と同様にして実験を行った。結果を図１３に黒三角▲で示す。実験開始から６０分後には生菌数が１００分の１まで減少した。

【0106】

［実験例５２］
コントロール実験として、式（２）化合物溶液の添加も、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例４９と同様にして実験を行った。結果を図１３に×で示す。実験開始から６０分の間での生菌数の変化はなかった。

【0107】

実験例４９〜５２の結果から、大腸菌に対しては、式（２）化合物とＵＶＡ−ＬＥＤとの併用により、除菌作用について優れた相乗効果がみられた。特に、式（２）化合物のみを使用した場合（実験例５０）に比べてＵＶＡ−ＬＥＤを併用することで、６０分後における生菌数が１０００分の１以下となり、式（２）化合物とＵＶＡ−ＬＥＤの併用による殺菌性の相乗効果が示された。

【0108】

＜緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５）に対する暴露試験＞
［実験例５３］
滅菌イオン交換水で懸濁した２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬの緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５）菌液２０ｍＬを、深底９０ｍｍシャーレに入れた。次いで、終濃度が０．０５μＭになるように式（２）化合物溶液を添加後、実験例１と同じＵＶＡ照射装置を用いて、５０ｍｍの距離からＵＶＡ−ＬＥＤを連続照射しながら、３０℃で静置培養した。菌液中の生菌数を式（２）化合物の添加から０、１０、３０および６０分後に測定した。結果を図１４に黒丸●で示す。式（２）化合物およびＵＶＡの暴露開始から３０分後には生菌数は８３分の１に急減し、開始から６０分後には検出限界以下（１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ未満）にまで減少した。なお、生菌数の測定は、実験例２９と同様の手順にて行った。

【0109】

［実験例５４］
ＵＶＡを照射しなかったこと以外は実験例５３と同様にして実験を行った。結果を図１４に白丸○で示す。６０分間の式（２）化合物の暴露では生菌数の変化は認められなかった。

【0110】

［実験例５５］
式（２）化合物溶液を添加しなかったこと以外は実験例５３と同様にして実験を行った。結果を図１４に黒三角▲で示す。実験開始から６０分後には生菌数が７７０分の１まで減少した。

【0111】

［実験例５６］
コントロール実験として、式（２）化合物溶液の添加も、ＵＶＡ照射もしないこと以外は実験例５３と同様にして実験を行った。結果を図１４に×で示す。実験開始から６０分の間での生菌数の変化はなかった。

【0112】

実験例５３〜５６の結果から、緑膿菌に対しては、式（２）化合物とＵＶＡ−ＬＥＤとの併用により、除菌作用について優れた相乗効果がみられた。特に、式（２）化合物のみを使用した場合（実験例５４）の生菌数は、コントロールと大きな差は見られなかったにもかかわらず、式（２）化合物とＵＶＡ−ＬＥＤを併用することで、ＵＶＡ−ＬＥＤの照射のみの場合と比べても、生菌数は１００分の１以下の検出限界以下に減少し、指数関数的減少を伴った相乗的除菌効果が示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】