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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5842819
(24)【登録日】2015年11月27日
(45)【発行日】2016年1月13日
(54)【発明の名称】ピロロキノリンキノンのカルシウム塩
(51)【国際特許分類】
C07D 471/04 20060101AFI20151217BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20151217BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20151217BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20151217BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20151217BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20151217BHJP
【ＦＩ】
C07D471/04 102
C07D471/04CSP
A61K31/4745
A61P43/00 105
A61K8/49
A61Q19/00
A23L1/30 Z
【請求項の数】8
【全頁数】22
(21)【出願番号】特願2012-535081(P2012-535081)
(86)(22)【出願日】2011年9月22日
(86)【国際出願番号】JP2011071697
(87)【国際公開番号】WO2012039474
(87)【国際公開日】20120329
【審査請求日】2014年6月24日
(31)【優先権主張番号】特願2010-211883(P2010-211883)
(32)【優先日】2010年9月22日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004466
【氏名又は名称】三菱瓦斯化学株式会社
(72)【発明者】
【氏名】池本 一人
(72)【発明者】
【氏名】中野 昌彦
【審査官】
早川 裕之
(56)【参考文献】
【文献】
特開平０３−１１２９１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開昭６２−２４６５７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
BERGE，S. M.，Pharmaceutical salts，JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES，米国，AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION，１９７７年，Vol.66，No.1，pp.1-19
【文献】
川口洋子ら，医薬品と結晶多形，生活工学研究，２００２年，Vol.4, No.2，p.310-317
【文献】
新医薬品の規格及び試験方法の設定について，医薬審発第５６８号，２００１年
【文献】
大島寛，結晶多形・擬多形の析出挙動と制御，PHARM STAGE，２００７年 １月１５日，Vol.6, No.10，p.48-53
【文献】
高田則幸，創薬段階における原薬Formスクリーニングと選択，PHARM STAGE，２００７年 １月１５日，Vol.6, No.10，p.20-25
【文献】
山野光久，医薬品のプロセス研究における結晶多形現象への取り組み，有機合成化学協会誌，２００７年 ９月 １日，Vol.65, No.9，p.907(69)-913(75)
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｄ ４７１／０４
Ａ６１Ｋ ３１／４７４５
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｋ ８／４９
Ａ６１Ｑ １９／００
Ａ２３Ｌ １／３０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ピロロキノリンキノンイオンとカルシウムイオンとのモル比が１：０．５〜１．５である、白色のピロロキノリンキノンのカルシウム塩。
【請求項2】
請求項１に記載のピロロキノリンキノンのカルシウム塩の結晶。
【請求項3】
粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして８．８°、１７．５°、２５．４°、２８．１°、３０．５°、３３．９°（いずれも±０．４°）を示す、請求項２に記載のピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
【請求項4】
請求項１に記載のピロロキノリンキノンのカルシウム塩または請求項２又は３に記載のピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶と、キレート性物質とを含んでなる、ピロロキノリンキノン含有組成物。
【請求項5】
キレート性物質が、リン酸、ピロリン酸、核酸、フィチン酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサメタリン酸およびポリリン酸からなる群から選択される１種以上である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られたｐＨが４未満の混合物から析出物を得ることを含んでなる、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法。
【請求項7】
混合物中に水が存在する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
カルシウムイオン源が、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、および水酸化カルシウムからなる群から選択される、請求項６又は７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【0001】
本特許出願は、２０１０年９月２２日に提出された日本出願である特願２０１０−２１１８８３の利益を享受する。この先の出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。【技術分野】
【0002】
本発明は、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法および該製造方法により得られるピロロキノリンキノンのカルシウム塩に関する。本発明は、また、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の使用に関する。【背景技術】
【0003】
ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと表すことがある）は新しいビタミンの可能性があることが提案されて（例えば、非特許文献１参照）、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。更には細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用、神経線維再生など多くの生理活性が明らかにされている。当分野において、より高い結晶性は、化学安定性およびより長い貯蔵寿命をもたらすことが知られており、結果的に、剤を安定化する必要性が少なく、かつ長い貯蔵寿命を有し、かつ比較的簡素な包装形態において提供される可能性を有する。【0004】
ＰＱＱは、有機化学的合成法（非特許文献２）または発酵法（特許文献１）などの方法により得たＰＱＱをクロマトグラフィーに供し、流出液中のＰＱＱ区分を濃縮して、有機溶媒を加え、晶析により結晶化し（特許文献２）、乾燥して得ることが出来る。しかし、ＰＱＱのアルカリ金属塩は水溶液からアルコールを入れて溶解度を下げて析出させることで作られるが、その結晶性は高くない。また、この方法は高価で可燃性があり、廃液処理の費用もかさむ有機溶媒を使用することから、これを使用しない方法が求められている。また、非特許文献２ではジナトリウム塩の結晶が得られているがこの方法は生産性が低く、工業的に有用でない。更にカルシウムイオンは栄養成分として重要であり、ピロロキノリンと同時に摂取することが望まれているが、これまでＰＱＱのカルシウム塩の具体的な製造方法についての報告はされていない。【0005】
特許文献２にはアルカリ金属の塩と同様にアルカリ土類金属の塩に言及されているが実施例はなく、また、有機溶媒を使用して結晶化させる方法であるから可燃性物質を扱うための設備や排水設備が高価になる。また、アルカリ金属塩は水溶性であり、アミンやカルボニル、還元性化合物と反応しやすく、溶解した水分がある環境は特に反応しやすくなる。その為、安定性を上げるために水溶性が低いことが求められている。食品や薬として投与されるときには容易にＰＱＱが吸収されることが望まれている。【0006】
一方、ＰＱＱおよびその塩類は赤色かそれが濃くなった色として得られることが多い。これらの色はＰＱＱ特有の色として知られているが、食品や薬に混合した際にはその色が強く出て、意図する目的の色調にできないことがある。特に、嗜好性が重要である食品においてはこの色は目的の色を設計するうえで障害となる場合がある。そのため、ＰＱＱの色はより白色に近いものが望まれている。ＰＱＱの色はコーティングや他の成分との混合によって白色に見せることができる。しかし、非必須成分の混合は、食品、薬の成分設計の自由度が下げるという欠点がある。また、コーティング等を行う場合は、元のＰＱＱと同じ機能であるか、ＰＱＱにもどることが求められる。あるいは、有機合成等によって修飾することで色を変えることが考えられるが、多くの有機溶媒を必要とし、有毒性の高い試薬を使う必要がある。加えて、ＰＱＱは反応性が高いことから、食品等と接触する場所では固体であり、吸収が行われる腸では溶液となるような形態が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特許第２７５１１８３号公報
【特許文献2】特公平７−１１３０２４号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】nature,vol422, 24April,2003, p832
【非特許文献2】JACS、第103巻、第5599〜5600頁（1981）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明者らは、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の水溶液と、カルシウムイオン源の水溶液とを混合して得られた溶液から結晶を析出させることにより、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩を製造することができ、また、得られたカルシウム塩は結晶性が高く、水溶性が低いことを見出した。本発明者らは、また、所定の条件下では白色のカルシウム塩が得られることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。【0010】
本発明は、ＰＱＱの塩で結晶性が高いと同時に水溶性が低く、かつ、容易にＰＱＱを遊離する物質を、大量の有機溶媒を用いることなく、製造可能な方法を提供することを目的とする。具体的にはＰＱＱのカルシウム塩の製造方法とその高純度な結晶を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明によれば、以下の発明が提供される。（１）ピロロキノリンキノンイオンとカルシウムイオンとのモル比が１：０．５〜１．５である、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩。
（２）ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物から析出させて得られる、（１）に記載のピロロキノリンキノンのカルシウム塩。
（３）カルシウムイオン源が、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、および水酸化カルシウムからなる群から選択される、（２）に記載のピロロキノリンキノンのカルシウム塩。
（４）白色である、（１）〜（３）のいずれかに記載のピロロキノリンキノンのカルシウム塩
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のピロロキノリンキノンのカルシウム塩の結晶。
（６）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして７．７°、１０．６°、１９．１°、２６．４°、３８．６°（いずれも±０．４°）を示す、（６）に記載のピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
（７）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして９．８°、１５．３°、１７．１°、１９．７°、２６．３°、２８．３°（いずれも±０．４°）を示す、（５）に記載のピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
（８）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして８．８°、１７．５°、２５．４°、２８．１°、３０．５°、３３．９°（いずれも±０．４°）を示す、（５）に記載のピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
（９）（１）〜（４）のいずれかに記載のピロロキノリンキノンのカルシウム塩または（５）〜（８）のいずれかに記載のピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶と、キレート性物質とを含んでなる、ピロロキノリンキノン含有組成物。
（１０）キレート性物質が、リン酸、ピロリン酸、核酸、フィチン酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサメタリン酸およびポリリン酸からなる群から選択される１種以上である、（９）に記載の組成物。
（１１）ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物から析出物を得ることを含んでなる、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法。
（１２）混合物中に水が存在する、（１１）に記載の製造方法。
（１３）混合物のｐＨが４未満である、（１１）または（１２）に記載の製造方法。
（１４）カルシウムイオン源が、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、および水酸化カルシウムからなる群から選択される、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（１５）（１１）〜（１４）のいずれかに記載の製造方法により製造される、ピロロキノリンキノンカルシウム塩。
（１６）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして７．７°、１０．６°、１９．１°、２６．４°、３８．６°（いずれも±０．４°）を示すピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
（１７）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして９．８°、１５．３°、１７．１°、１９．７°、２６．３°、２８．３°（いずれも±０．４°）を示すピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
（１８）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして８．８°、１７．５°、２５．４°、２８．１°、３０．５°、３３．９°（いずれも±０．４°）を示すピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
【0012】
本発明によれば、有機溶媒を使用せず工業的に有用な方法で、水溶性が低く結晶性の高い安定なＰＱＱのカルシウム塩を高純度で製造できる点で有利である。また、得られたＰＱＱのカルシウム塩が使用時には溶解することも可能で、吸収性も高い点で有利である。本発明によれば、また、白色または白色に近い（淡赤色）ＰＱＱのカルシウム塩を製造できる点で有利である。【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明の具体的説明】
【0014】
本発明によれば、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合することにより、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩を製造することができる。【0015】
本発明で用いられるピロロキノリンキノンは、下記式（１）で表される構造を有する。【化1】
【0016】
本願明細書において「ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩」とは、式（１）で表される化合物のアルカリ金属塩を意味する。【0017】
本願明細書において「ピロロキノリンキノンのカルシウム塩」とは、式（１）で表される化合物のカルシウム塩を意味する。ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の水付加物もピロロキノリンキノンのカルシウム塩に含まれる。【0018】
本願明細書において「ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の結晶」とは、式（１）で表される化合物のカルシウム塩の結晶を意味し、固体状態でピロロキノリンキノン分子が規則正しく整列している状態であり、一般的には、高純度で安定性の高い状態である。ピロロキノリンキノンのカルシウム塩が結晶の形態であるか否かは、粉末Ｘ線回析でピークを検出することにより確認することができる。【0019】
粉末Ｘ線回折による回折角２θの測定は、例えば、下記の測定条件で行うことができる。（測定条件）
装置：株式会社ＲＩＧＡＫＵ製ＲＩＮＴ２５００
Ｘ線：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ｍＡ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅：０．０２０°
その他、モノクロメータが装着された一般的な粉末Ｘ線回折装置で観測することもできる。
【0020】
本発明において用いられるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、ルビジュウムなどの塩が挙げられる。好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩であり、手に入れやすいナトリウム塩が特に好ましい。これらを単独で使用しても、混合して使用してもよい。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩における塩の置換数は、１〜３であり、モノアルカリ金属塩、ジアルカリ金属塩、トリアルカリ金属塩のどれでも良いが、好ましくは、ジアルカリ金属塩である。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩として、特に好ましくは、ジナトリウム塩である。【0021】
本発明において用いられるＰＱＱのアルカリ金属塩は、市販されているものを入手することもできる。また、有機化学的合成法および発酵法などにより製造することも可能である。原料に用いるＰＱＱの塩は結晶でもよいし、非晶質でもよい。また、不純物を含んでいてもよい。【0022】
本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩は、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の溶液として使用することができる。用いられる溶媒は、反応が進行すれば特に限定されず、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩を、水、アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン等の溶媒に溶解して使用することができる。溶媒は単独または２種以上を混合して使用することができる。用いられる溶媒は、好ましくは、水（水溶液）である。【0023】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の溶液は、例えば、０．１〜１００ｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは、１〜２０ｇ／Ｌである。【0024】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の溶液のｐＨは、最終的に１から１２にすることが好ましく、より好ましくは、２〜９、より好ましくは、２〜７である。また、このｐＨを調整選択することでカルシウムの置換数を制御できる。ｐＨを２から４（好ましくは、２．５〜４）で調整することによりＰＱＱ１に対し１個のカルシウムの塩、それ以上（例えば、４より大きく７以下、好ましくは、４．５〜７）でＰＱＱ１に対し１．５個のカルシウム塩を得ることができる。なお、後述のように、白色ＰＱＱカルシウム塩を製造する場合は、この時点で、ｐＨを４未満（例えば、１．５以上４未満、好ましくは１．５〜３．５、より好ましくは２〜３）に調整することができる。【0025】
ｐＨの変化させる際の添加の手順として、ＰＱＱまたはそのアルカリ金属塩の溶液に対して酸、アルカリを加えてｐＨを変えることができる。ｐＨを変えるために使用される酸、アルカリは、ピロロキノリンキノンやカルシウムと反応性が低い物質が好ましく、この種類は特に制限されない。無機、有機、どちらでも使用できる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、燐酸、硝酸等が挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸等が挙げられる。無機アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、酸化カルシウム等が挙げられ、有機アルカリとしては、例えば、テトラメチルアンモニウム水酸化物等の４級アンモニウムヒドロキシドやアミン等が挙げられる。これらは単独もしくは混合して使用することが可能である。【0026】
本発明のｐＨを調整する操作の温度は特に制限がないが一般的に取り扱いやすいのは−２０℃から１４０℃である。好ましくは、０〜１４０℃、より好ましくは、２０〜９０℃である。加温してピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩の溶解度を上げるほうが取り扱いやすい。ただし、後述のように、白色ＰＱＱカルシウム塩を製造する場合は３８℃以下が好ましく、より好ましくは、−２０から３０℃である。温度が低いほうが白色変化しやすい前駆体を与えることができる。【0027】
本発明において用いられるカルシウムイオン源としては、カルシウムイオンを供給することができる物質であればよく、例えば、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、酸化カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム化合物等が挙げられる。本発明において用いられるカルシウムイオン源は、好ましくは、２５℃での溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは、１ｇ／Ｌ以上の物質である。溶解性の点から、好ましくは、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウムであり、より好ましくは、塩化カルシウムである。【0028】
本発明において用いられるカルシウムイオン源は、そのまま（粉末）で使用することもできるし、溶液として使用することもできるが、溶液として使用することが好ましい。用いられる溶媒は、反応が進行すれば特に限定されず、カルシウムイオン源を、水、アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の溶媒に溶解して使用することができる。溶媒は単独または２種以上を混合して使用することができる。用いられる溶媒は、好ましくは、水（水溶液）である。【0029】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源との重量比は、１：０．１〜１００、好ましくは、１：０．１〜２０、より好ましくは、１：０．１〜１０、さらに好ましくは、１：０．３〜５とすることができる。【0030】
本発明によれば、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオンとを反応させ、析出させることでカルシウム体を製造することができる。【0031】
すなわち、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合することでカルシウム塩が形成され、これを析出させることで得ることができる。【0032】
本発明において、「ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合する」工程は、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオンとを溶媒中で反応させることができればよく、例えば、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の溶液とカルシウムイオン源の溶液とを混合して行うこともできるし、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の溶液にカルシウムイオン源を添加して行うこともできる。【0033】
本願明細書において、「混合」については、一方の混合対象物を他方の混合対象物に添加して行うこともできるし、混合対象物を別の容器に添加して行うこともできる。【0034】
本願明細書において、「添加」については、添加物を添加対象に一時に添加することもできるし、徐々に添加することもできる。【0035】
本発明による製造方法において、反応ｐＨは、特に制限がないが、例えば、１〜１２とすることができ、好ましくは２〜９、より好ましくは、２〜７である。あるいは、反応ｐＨは、４未満とすることができ、好ましくは、１．５以上４未満、より好ましくは、１．５〜３．５、さらに好ましくは、２〜３とすることができる。【0036】
本発明による製造方法において、反応温度は、特に制限がないが、例えば、−２０〜１４０℃とすることができ、好ましくは０〜１２０℃である。【0037】
本発明による製造方法において、反応時間は、特に制限がないが、例えば、５分〜１週間とすることができる。【0038】
上記反応を経て製造された本発明のＰＱＱカルシウム塩（赤色）は、ピロロキノリンキノンイオンとカルシウムイオンの比は、１：０．５から１．５であることが好ましい。より好ましくは１：１から１．５である。これはＰＱＱのカルボン酸がカルシウムと形成する塩であることを意味している。さらに結晶性が高い物質は安定性も高いことが多く、本発明も結晶性であることが好ましい。【0039】
具体的な操作方法について説明する。ＰＱＱまたはそのアルカリ金属塩を水に溶解させる。溶解が完全に行われていなくても反応は進行することができる。ｐＨ調整のために酸、アルカリの溶液を加えて調整してもよい。この時のＰＱＱまたはそのアルカリ金属塩の濃度は０．１から１００g/Lであることが望ましく、より望ましくは１から２０g/Lである。このときの温度は０から１４０℃で使用すれは良く、好ましくは２０から９０℃が特別な装置も要らず、使用しやすい。溶解度の面では高い温度が溶解しやすいため、５０℃以上にするのが生産性を高める。ここに塩化カルシウムを加えることでカルシウム塩を析出させることができる。カルシウムは水溶液、粉末の形で添加することができる。混合する時間は特に制限がないが、５分から１週間ぐらいで行うことができる。スケールが小さい場合は短時間ですむが、大きな場合は長時間必要である。
【0040】
本発明において、さらには、ＰＱＱカルシウム塩を白色として得ることができる。本発明の白色ＰＱＱカルシウム塩は、上記のようにして得られたＰＱＱカルシウム塩（赤色）を経て形成することができる。【0041】
本発明の白色ＰＱＱカルシウム塩は、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物から析出されたもの（析出物）、すなわち、赤色ＰＱＱカルシウム塩を水の存在する環境下に所定のｐＨで一定時間置くことによって得ることができる。【0042】
本願明細書において「水の存在する環境下に置く」とは、製造系において、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源との混合物中に含まれる赤色ＰＱＱカルシウム塩を水と接触できる状況に置くことができればよく、例えば、赤色ＰＱＱカルシウム塩を水溶液中に存在させることもできるし、水と有機溶媒との混合溶液中に存在させることもできる。赤色ＰＱＱカルシウム塩を水溶液中に存在させることが好ましい。【0043】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物のｐＨは４未満となるように調整することができるが、好ましくは、１．５以上４未満、より好ましくは、１．５〜３．５、さらに好ましくは、２〜３とすることができる。なお、ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物のｐＨが４未満である場合は、特段の調整をせずにそのまま使用することができる。【0044】
ｐＨの変化させる際の添加の手順として、混合物に対して酸、アルカリを加えてｐＨを変えることができる。ｐＨを変えるために酸、アルカリを使用するが、この種類は特に制限されない。無機、有機、どちらでも使用できる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、過塩素酸、硫酸、燐酸、硝酸等が挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、蟻酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸等が挙げられる。無機アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、酸化カルシウム等が挙げられ、有機アルカリとしては、例えば、テトラメチルアンモニウム水酸化物等の４級アンモニウムヒドロキシドやアミン等が挙げられる。これらは単独もしくは混合して使用することが可能である。【0045】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物を水の存在する環境下に置く時間は、２時間以上とすることができる。好ましくは、２４時間以上、より好ましくは、４８時間以上、さらに好ましくは、７２時間以上である。【0046】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物は、攪拌されてもよい。攪拌は、磁気攪拌、機械攪拌、手動攪拌、振とう攪拌等に供することにより実施することができる。【0047】
ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩とカルシウムイオン源とを溶液中で混合して得られた混合物の温度は、−２０から１２０℃で行うことができ、より好ましくは０から８０℃である。白色変化させる反応は反応温度が高いほう変化が速い。【0048】
白色のピロロキノリンキノンのカルシウム塩を得るために、例えば、下記工程を実施することができる：（ｉ）ピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の水溶液とカルシウムイオン源の水溶液とを混合すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた混合物から析出物を得ること；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた析出物を含む混合物をｐＨ４未満で２時間以上置くこと。
【0049】
上記工程を経て製造された本発明のＰＱＱカルシウム塩（白色）は、ピロロキノリンキノンイオンとカルシウムイオンの比が、１：０．５〜１．５であることが好ましい。より好ましくは１：１〜１．５である。【0050】
析出した固体は濾過、もしくは遠心分離により液と分ける。これを水洗い、必要であればエタノールのような有機溶媒でさらに洗えばよい。この得られた固体は風乾、減圧乾燥することで水分を除くことができる。本発明の製造方法は水を溶媒にすることで有機溶媒を使用しなくてもカルシウム塩を製造できる方法である。【0051】
白色のＰＱＱカルシウム塩と赤色のＰＱＱカルシウム塩とが共存することがあるが、遠心分離で分けることができる。白色塩は結晶としてもアモルファスとしても得ることができる。【0052】
本発明のピロロキノリンキノンのカルシウム塩は、結晶の形態で得ることができる。本発明によれば、ピロロキノリンキノンイオンとカルシウムイオンの比が、１：０．５〜１．５、好ましくは、１：１〜１．５である、ピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶が提供される。【0053】
本発明のＰＱＱのカルシウム塩は、上記のＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして、少なくとも、７．７°、１０．６°、１９．１°、２６．４°、３８．６°（いずれも±０．４°）を示すピロロキノリンキノンカルシウムの結晶として得ることができる。若しくは、少なくとも、９．８°、１５．３°、１７．１°、１９．７°、２６．３°、２８．３°（いずれも±０．４°）を示すピロロキノリンキノンカルシウムの結晶として得ることができる。当該ＰＱＱのカルシウム塩は赤色である。あるいは、上記のＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして、少なくとも、８．８°、１７．５°、２５．４°、２８．１°、３０．５°、３３．９°（いずれも±０．４°）を示すＰＱＱカルシウムの結晶として得ることができる。当該ＰＱＱのカルシウム塩は白色である。
本発明の結晶は、単一の結晶であっても、これらの結晶の混合物であってもよい。
【0054】
測定誤差は、±０．４°とすることができるが、好ましくは、±０．２°、より好ましくは、±０．１°とすることができる。【0055】
本発明で規定する結晶形は測定誤差も含まれることから、ピークの角度に関する合理的な同一性があればよい。【0056】
本発明では結晶性のカルシウム塩を得られていれば、アルカリ金属が残留しても特に問題がない。【0057】
本発明のＰＱＱのカルシウム塩は難溶性である。この難溶性ＰＱＱのカルシウム塩を溶解しやすくするにはキレート性物質と反応させてカルシウムを除くことで容易に行うことができる。そのためキレート性物質との組成物は遊離性を制御するのに有効である。キレート性物質はカルシウムに対して有効であればよくいずれであってもよく、例えば、食べることができるキレート性物質としては、リン酸（リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム等）、ピロリン酸、核酸（ＤＮＡナトリウム等）、フィチン酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサメタリン酸、ポリリン酸等及びその塩類が挙げられる。これらの添加量は機能に合わせて決定することができるが、カルシウム塩に対して０．１から１０００倍の重量で加えればよい。より好ましくは１から１００倍である。この方法により、難溶性であったカルシウム塩をキレート性物質が反応することでキレート物質のカチオン交換することで水溶性にかえることができる。【0058】
難溶性ＰＱＱのカルシウム塩はそのままでも細胞や生体に投与した場合、生体内には多くのカルシウムと反応する物質が存在しているため、遊離し、働くことができる。また、その難溶性結晶の大きさは、細胞が物質を取り込むのに適する１μｍ以下である場合、溶解しているより促進する可能性がある。これはエンドサイトーシスと呼ばれる細胞内取り込みのメカニズムに依存していると考えられる。【0059】
本発明のＰＱＱのカルシウム塩は、溶解と同時にカルシウムイオンを遊離することができる。ＰＱＱのカルシウム塩は、有機溶媒、特に、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の存在下で容易にカルシウムイオンを遊離することができる。【0060】
本発明のＰＱＱのカルシウム塩の結晶は、医薬または機能性食品の有効成分とすることができる。すなわち、本発明によれば、本発明のＰＱＱのカルシウム塩の結晶を含んでなる医薬または食品が提供される。皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。なお、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。【0061】
錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。【0062】
ＰＱＱのカルシウム塩の結晶は、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ群、ビタミンＣ及びビタミンＥ等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω３脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。【0063】
本発明の好ましい態様によれば、（ｉ）ｐＨ２．５〜４のピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の水溶液とカルシウムイオン源の水溶液とを混合すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた混合物から析出物を得ること
を含んでなる、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法および該製造方法により得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩（結晶）が提供される。このようにして得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩は、ピロロキノリンキノンとカルシウムイオンとの比が約１：１である。
【0064】
本発明の好ましい態様によれば、（ｉ）ｐＨ４．５〜７のピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の水溶液とカルシウムイオン源の水溶液とを混合すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた混合物から析出物を得ること
を含んでなる、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法および該製造方法により得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩（結晶）が提供される。このようにして得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩は、ピロロキノリンキノンとカルシウムイオンとの比が約１：１．５である。
【0065】
本発明の好ましい態様によれば、（ｉ）ｐＨ２〜７のピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の水溶液とカルシウムイオン源の水溶液とを混合すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた混合物から析出物を得ること；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた析出物を含む混合物をｐＨ１．５〜３．５で２４時間以上置くこと
を含んでなる、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法および該製造方法により得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩（結晶）が提供される。このようにして得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩は白色である。
【0066】
本発明のより好ましい態様によれば、（ｉ）ｐＨ２〜７のピロロキノリンキノンまたはそのアルカリ金属塩の水溶液と、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、および水酸化カルシウムからなる群から選択されるカルシウムイオン源の水溶液とを混合すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた混合物から析出物を得ること；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた析出物を含む混合物をｐＨ１．５〜３．５で２４時間以上置くこと
を含んでなる、ピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法および該製造方法により得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩（結晶）が提供される。このようにして得られたピロロキノリンキノンのカルシウム塩は白色である。
【0067】
本発明はまた、以下の発明も提供される。〔１〕ピロロキノリンキノンイオンとカルシウムイオンの比が１：０．５から１．５であるピロロキノリンキノンのカルシウム塩。
〔２〕粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして７．７°、１０．６°、１９．１°、２６．４°、３８．６°（いずれも±０．４°）を示すピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
〔３〕粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして９．８°、１５．３、１７．１、１９．７°、２６．３°、２８．３°（いずれも±０．４°）を示すピロロキノリンキノンカルシウム塩の結晶。
〔４〕ピロロキノリンキノンのカルシウム塩とキレート性物質を含む組成物。
〔５〕キレート性物質がリン酸、ピロリン酸、核酸、フィチン酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサメタリン酸及びポリリン酸からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする〔４〕記載の組成物。
〔６〕ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩とカルシウム化合物を反応させることを特徴とするピロロキノリンキノンのカルシウム塩の製造方法。
【実施例】
【0068】
実施例および比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。【0069】
本発明に関する分析は以下のようにして行った。（粉末Ｘ線回折）
装置：RIGAKU製RINT2500
Ｘ線：Cu／管電圧４０kV／管電流１００mA
発散スリット：2/3°
散乱スリット：2/3°
受光スリット：０．３ｍｍ
スキャンスピード：4.000°／min
サンプリング幅：0.02
（吸光度測定）
装置：ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２０００（日立）
（ＩＣＰ分析）
装置：ｉＣＡＰ６５００(Thermo Scientific)
（ＮＭＲ測定）
装置：ＥＣＡ−５００（日本電子）
分析条件：
１Ｈ：ｗＰＭＬＧ３
１Ｈ−１３Ｃ：dipolar hetcor
回転数：１０ｋＨｚ
プローブ：固体３．２ｍｍ
試料管：窒化ケイ素製
（ＸＰＳ分析）
装置：ＥＳＣＡ３４００（島津製作所）
分析条件：
Ｘ線源：Ｍｇ Ｋα
出力：１０ｋＶ １００Ｗ
Ｐ．Ｅ．：７５
Resolution ナロー：high
（ＣＨＮＯ分析）
装置：ＥＡ１１１２（Thermo Finnigan）
分析条件：
燃焼温度：ＣＨＮ：９５０℃；Ｏ：１０６０℃
カラムオーブン温度：ＣＨＮ：６５℃；Ｏ：７５℃
検出器：ＴＣＤ
検量線用標準物質：アンチピリン
【0070】
試験例１：原料合成特許第２６９２１６７号公報の実施例１に基づき、ハイホミクロビウム メチロボラム ＤＳＭ１８６９を培養して得られた培養液を遠心分離して、菌体を除去し、ＰＱＱを含有する培養上澄液を得た。なお、この菌株はＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から入手できるものである。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０（ファルマシア製）カラムに、この培養上澄液を通過させてＰＱＱを吸着させ、ＮａＣｌ水溶液で溶出させて得られたｐＨ７．５のＰＱＱ水溶液をさらにNaＣｌを６０g/L濃度になるように加えて冷却し、固体を得た。得られた固体を水に溶かし高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収によるＰＱＱ純度は９９．０％以上であった。この固体をイオン交換水に溶解し、ＰＱＱ１０ｇ/Ｌを含む溶液を８００ｇ用意した。塩酸を加えてｐＨを３．５にした後、エタノールを２００ｍＬ添加した。この時、赤色固体が析出した。室温下で５時間攪拌した後、５℃で２４時間静置し、固体を析出させた。連続遠心分離で固体を回収し、５０℃で減圧乾燥を行った。得られた固体の粉末Ｘ線回折スペクトルを測定した。得られた固体（ＰＱＱジナトリウム塩）には低角側でピークが見られる他は殆どピークが見られず、結晶性が低かった。
【0071】
実施例１：ＰＱＱ結晶化（ｐＨ６．４）試験例１で得られたＰＱＱジナトリウム塩１gを水１００gに加え、ＮａＯＨでｐＨ６．４に調整した。塩化カルシウム１ｇを水４０ｍｌに溶解した液を加え、一晩攪拌した後、析出した固体をろ過し、水、エタノールで洗った。これを減圧乾燥５０℃で一晩行った。濃赤色結晶の重量1.１８gを得た。含水量２３％であった。ＩＣＰ分析を使って分析した結果、ＰＱＱ１に対してＣａ１．５ｍｏｌの比で含有しており、Ｎａ含有量０でナトリウムは含まれていなかった。得られたカルシウム体の粉末Ｘ線回折の結果を図１に示す。７．７°、１０．６°、１９．１°、２６．４°、３８．６°にピークを有する結晶性ＰＱＱカルシウム塩であった。この固体は結晶性で水溶性の低い物質であった。
【0072】
実施例２：ＰＱＱ結晶化（ｐＨ３．５）ＰＱＱジナトリウム塩３ｇを水８００ｇに加え溶解した。この時のｐＨは３．５であった。塩化カルシウム６ｇを水１００ｍｌに溶解した液を加え、２日間攪拌後、析出した固体をろ過し、水、エタノールで洗った。これを減圧乾燥７０℃で一晩行い赤色の固体３．２９ｇを得た。含水量１１％であった。ＩＣＰ分析を使って分析した結果、ＰＱＱ１に対してＣａ１ｍｏｌの比で含有しており、Ｎａ含有量０でナトリウムは含まれていなかった。得られたカルシウム塩の粉末Ｘ線回折は図２に示す。９．８°、１５．３、１７．１、１９．７°、２６．３°、２８．３°にピークを有する結晶性ＰＱＱカルシウム塩であった。この固体は結晶性で水溶性の低い物質であった。
【0073】
実施例１−１、２−１、比較例１：細胞を使用した吸収性試験ＰＱＱは培養動物細胞に対して増殖を増やす効果と高濃度にすると細胞の増殖を抑える効果がある。これを利用して細胞吸収がどのように変化するかを試験した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ-ＤＨＦＲ−、大日本住友製薬社製)をα‐MEM＋１０％牛胎児血清の培地で５％ＣＯ２, ３７℃で培養した。イワキ製９６穴プレート使用し、１個の穴に６０００個の細胞になるように１００μlの培地とともに加え、一晩培養した。培養液を抜き、所定の試験濃度の培地を加えた。２日培養後、培地を入れ替え、Cell Counting Kit ８（同仁化学社製）を使用して１時間反応させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。この時の吸光度は細胞数に比例する。
【0074】
試験サンプルは前記実施例１，２の結晶ＰＱＱカルシウム塩、および試験例１の原料のＰＱＱジナトリウム塩を使用し、培地で希釈して試験した。各サンプル２回行い平均化した。試験濃度は１５０μg／ＭＬを上限に１／２に濃度を変え、２．３μg／ＭＬを下限として行った。無添加と比較してＰＱＱによる細胞数が最も多くなっている濃度（５％程度）を最適増殖濃度として記載する。また、全細胞数が無添加と比較して１０％程度少なくなる添加量を増殖低下濃度として記載する。その結果を以下の表1に示す。
【表1】
【0075】
実施例３−１０、１−２，２−２：溶出試験キレート性物質を添加することによる不溶性の塩の溶解性の変化を測定した。キレート性物質を実施例１、２で得られた結晶ＰＱＱカルシウム塩と混合し水１ｍｌに加え、４時間室温で放置した後、遠心分離で不溶成分を除いた液を４５０ｎｍでの吸収からＰＱＱの溶解量を測定した。その結果を表２に示す。
【表2】
【0076】
実施例１１：ＰＱＱ結晶化（ｐＨ４．８）実施例１と同様に実験を行った。ただし、ＰＱＱジナトリウム塩の水溶液はｐＨ４．８にあわせた。回収量等は実施例１と変わりなく、粉末Ｘ線回折の分析結果も実施例１と同様の結晶構造を有していた。ＰＱＱ１に対してＣａ１．５ｍｏｌの比の塩であった。
【0077】
実施例１２：結晶化（ｐＨ２．９）実施例２と同様の操作を行った。ただし、ＰＱＱジナトリウム塩の水溶液はｐＨ２．９にあわせた。回収量等は実施例２と同様で、粉末Ｘ線回折の分析結果は実施例２の結晶（ＰＱＱ：Ｃａ＝１：１の塩）とともに他の結晶構造も混合された結晶性物質であった。
【0078】
実施例１３：ＰＱＱ結晶化（ｐＨ６．６）ピロロキノリンキノンのカリウム塩０．５４ｇを水３００ｍｌに溶かしてｐＨを６．６にした。塩化カルシウム１．４ｇを含む水溶液２０ｍｌと混合し、一晩攪拌した。ろ過した後、水、エタノールで洗浄後、減圧乾燥して０．４２ｇの固体を得た。得られた物質の粉末Ｘ線回折は実施例１と同様のピークを与え、ＰＱＱ１に対してＣａ１．５ｍｏｌの比のカルシウム塩が製造できた。
【0079】
実施例１４：白色の結晶ＰＱＱカルシウム塩の製造試験例１で得られたＰＱＱジナトリウム塩を水に溶かし、２ｇ／Ｌの水溶液を作製した。この水溶液４００ｍｌに２Ｎの塩酸を２ｍｌ加えた。塩化カルシウム（２ｇ／Ｌ）の水溶液１７０ｍｌと温度１０℃で混合した。混合時のｐＨは２．３であった。３０分間１０℃にしたのち、４０℃にして３日間攪拌した。これをろ過し、５０ｍｌの水で洗浄し白色固体を得た。減圧乾燥を一晩行い、０．７６ｇの固体を得た。粉末Ｘ線回析結果を図３に示す。８．８°、１７．５°、２５．４°、２８．１°、３０．５°、３３．９°にピークを示す結晶性の白色物質であった。
【0080】
実施例１５：１０℃での反応試験例１で得られたＰＱＱジナトリウム塩を水に溶かし、２ｇ／Ｌの水溶液を作製した。この水溶液４００ｍｌに２Ｎの塩酸を２ｍｌ加えた。塩化カルシウム（２ｇ／Ｌ）の水溶液１７０ｍｌと温度１０℃で混合した。混合時のｐＨは２．３であった。１０℃で３日間おいた。これをろ過し、５０ｍｌの水で洗浄し白色固体を得た。減圧乾燥を一晩行い、０．７８ｇの固体を得た。粉末Ｘ線回析結果は実施例１４と同じであった。
【0081】
実施例１６：ｐＨ２．６での反応試験例１で得られたＰＱＱジナトリウム塩を水に溶かし、２ｇ／Ｌの水溶液を作製した。この水溶液２５０ｍｌに２Ｎの塩酸を０．６ｍｌ加えた。塩化カルシウム（２ｇ／Ｌ）の水溶液１２０ｍｌを室温（約２０℃）で混合した。混合時のｐＨは２．６であった。４０℃で６日攪拌した。これをろ過し、１０ｍｌのエタノールで洗浄し白色固体を得た。減圧乾燥を一晩行い、０．５０ｇの固体を得た。粉末Ｘ線回析結果は実施例１４と同じであった。
【0082】
実施例１７：白色結晶前駆体（赤色固体）の合成１０℃で混合後、３０分でろ過する以外は実施例１５と同様に実験を行った。その結果、赤色固体を得た。減圧乾燥を一晩行い、０．７９ｇの赤色固体を得た。
【0083】
実施例１８：酢酸でｐＨ調整試験例１で得られたＰＱＱジナトリウム塩を水に溶かし、２ｇ／Ｌの水溶液を作製した。この水溶液２５０ｍｌに酢酸を４．１９ｇ加えた。塩化カルシウム（２ｇ／Ｌ）の水溶液１２０ｍｌと室温で混合した。混合時のｐＨは２．８であった。４０℃で６日攪拌し、これをろ過し、１０ｍｌのエタノールで洗浄し白色固体を得た。減圧乾燥を一晩行い、０．５１ｇの白色固体を得た。
【0084】
実施例１９：白色固体と赤色固体の分離試験例１で得られたＰＱＱジナトリウム塩を水に溶かし、２ｇ／Ｌの水溶液を作製した。この水溶液４００ｍｌに２Ｎの塩酸を２ｍｌ加えた。塩化カルシウム（２ｇ／Ｌ）の水溶液１７０ｍｌと室温で混合した。混合時のｐＨは２．３であった。５分後７０℃にして１日間放置した。赤色と白色の固体が生じていた。これを５０ｍｌの遠沈管に分けて入れ、遠心分離機ＨＩＴＡＣＨＩ ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２に入れ、２０００回転３０分おこなった。容器の底に赤色が下、白色が上の層になって沈降していた。比重差で白色固体と赤色固体とを分離することができた。
【0085】
実施例２０−２２、比較例２−４：ｐＨによる変化の確認ＰＱＱジナトリウム塩水溶液（２ｇ/L）と塩化カルシウム水溶液（２ｇ/L）を２：１ので混合した。ｐＨは塩酸またはＮａＯＨで調整した。混合時は全て赤色であった。５０℃で３日以上放置して色の変化を観察した。
【表3】
【0086】
実施例２３：原料を変えた実験ＰＱＱジナトリウム塩水溶液に塩酸を加え、ｐＨ１で析出させて得られたＰＱＱフリー体に水を加え３g/LとしたＰＱＱフリー体の水溶液５００μLと炭酸カルシウム１g/Ｌの水溶液７５０μLを混合して７０℃で一晩放置した（ｐＨ３．１）。白色ＰＱＱカルシウム化合物が生成した。
【0087】
実施例２４〜２８：ＰＱＱの遊離実施例１５で製造した白色のＰＱＱカルシウム塩１０ｍｇを２ｍｌの表４に示す各溶媒に加えた。４０℃で５時間放置した後、遠心分離で固体分を除き、高速液体クロマトグラフィーでＰＱＱを分析した。
【表4】
【0088】
実施例２９： 以下の各試料について、ＮＭＲ及びＸＰＳによる構造解析を行った。
１：ＰＱＱフリー体（ＰＱＱジナトリウム塩水溶液に塩酸を加えｐＨ１で析出した赤色ＰＱＱ固体）
２：ＰＱＱジナトリウム塩（比較例２）
３：赤色ＰＱＱカルシウム化合物（実施例１７）
４ 白色ＰＱＱカルシウム化合物（実施例１４）
固体ＮＭＲ測定
図４に１Ｈ−固体ＮＭＲ（ｗＰＭＬＧ３）スペクトル結果を示した。ＰＱＱフリー体についてはケミカルシフト値から各シグナルを帰属した。６個のプロトンに対し、５本のシグナルしか確認できないが、ＰＱＱの構造から３個のＣＯＯＨがあるため、８〜９ｐｐｍのシグナルが２個分のＣＯＯＨシグナルであると推定した。一方、ＰＱＱ−Ｎａ赤、ＰＱＱ−Ｃａ赤、ＰＱＱ−Ｃａ白では５〜６ｐｐｍに五員環Ｈ（ａ）のシグナルを確認した。また、各試料、５ｐｐｍ以下（高磁場側）にＮＨ由来と推定されるシグナルを確認したが、ＰＱＱ−Ｃａ白は２本のシグナルが重なった形状であり、他の試料には無いシグナルを確認した。
【0089】
図５に１３Ｃ−固体ＮＭＲ（ＣＰＭＡＳ）スペクトル（６ｍｍプローブ，９ｋＨｚ）を示した。いずれのスペクトルにおいても１６０ｐｐｍ以上のシグナルがＣＯＯ，Ｃ＝Ｏ由来であり、１６０ｐｐｍ以下が五員環及び六員環の骨格由来のシグナルであると推定した。また、ＰＱＱ−Ｃａ赤、ＰＱＱーＣａ白はＣ＝Ｏ由来と推定されるシグナルは一本しか確認できなかった。ただし、１９０ｐｐｍ付近のサイドバンドが重なってシグナルが隠れている可能性も考えられた。ＰＱＱ−Ｃａ白では９３ｐｐｍ付近にシグナルが有り、１Ｈ測定で３〜４ｐｐｍにシグナルがあったことから、−ＣＨ−Ｏーの構造を持つ可能性が考えられた。【0090】
Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定官能基の変化を確認するため、ＥＳＣＡ３４００（島津製作所社製）を用いてＸＰＳ測定を行った。白色ＰＱＱＣａ塩については装置内で高真空下に置き、一定時間経過後に取り出したところ、色が赤く（赤色ＰＱＱＣａ塩よりは薄い赤色）変化していた。これは後述するＣＨＮＯ分析結果から、付着していた水が真空化で飛んだためと推定した。従って白色ＰＱＱＣａ塩のＸＰＳ分析結果は色の変化後の結果であると考えられ、＊印で区別した。
【0091】
図６にＣ１ｓの測定結果を示した。帯電補正はＣ１ｓの低エネルギー側のピークトップを２８５ｅＶに合わせた。ＰＱＱフリー体と赤色ＰＱＱＣａ塩、白色ＰＱＱＣａ塩のＣ１ｓを比較するといずれの試料も２８８〜２８９ｅＶ付近にＣＯＯ由来のピークを確認したが、ＰＱＱ−Ｃａ赤、ＰＱＱ−Ｃａ白は２８７ｅＶ付近が凹んでおり、Ｃ＝Ｏ由来のピークが減少していると考えられた。【0092】
ＣＨＮＯ分析モル比（Ｎ＝１として）でＰＱＱ−Ｃａ赤とＰＱＱ−Ｃａ白を比較するとＨとＯに差が有り、差分の組成はＨ２Ｏ（またはＨ３Ｏ）に相当した。また真空引き前後（ＰＱＱ−Ｃａ白とＰＱＱ−Ｃａ白＊）で比較してもＨとＯに差が有り、差分の組成はＨ２Ｏに相当した。
【表5】