特許 5846122 Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する腸内細菌科の細菌、及びＬ−アスパラギン酸又はＬ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5846122

(24)【登録日】2015年12月4日

(45)【発行日】2016年1月20日

(54)【発明の名称】Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する腸内細菌科の細菌、及びＬ−アスパラギン酸又はＬ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 13/20 20060101AFI20151224BHJP

   C12P 13/06 20060101ALI20151224BHJP

   C12P 13/10 20060101ALI20151224BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20151224BHJP

   C12P 13/12 20060101ALI20151224BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20151224BHJP

【ＦＩ】

   C12P13/20

   C12P13/06 E

   C12P13/10 B

   C12P13/08 A

   C12P13/08 C

   C12P13/12 A

   C12N15/00 AZNA

【請求項の数】9

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2012-532187(P2012-532187)

(86)(22)【出願日】2011年1月12日

(65)【公表番号】特表2013-516958(P2013-516958A)

(43)【公表日】2013年5月16日

(86)【国際出願番号】JP2011050797

(87)【国際公開番号】WO2011087139

(87)【国際公開日】20110721

【審査請求日】2014年1月7日

(31)【優先権主張番号】2010101135

(32)【優先日】2010年1月15日

(33)【優先権主張国】RU

【微生物の受託番号】VKPM  B-7926

【微生物の受託番号】VKPM  B-9246

(73)【特許権者】

【識別番号】000000066

【氏名又は名称】味の素株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】クヴァエヴァ タチヤナ ミハイロヴナ

(72)【発明者】

【氏名】スミルノフ セルゲイ ヴァシリエヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】イヴァノヴァ オリガ ニコラエヴナ

(72)【発明者】

【氏名】キヴェロ アレクサンドル ドミトリエヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】カタシュキナ ジャンナ イオシフォヴナ

【審査官】 北田 祐介

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−２５４７９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２５４７３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１８３８６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０２２７５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−１３６２８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０４６０８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０１７７１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 YANG Z. et al.，The Journal of Biological Chemistry，２００３年，Vol.278, No.10，pp.8804-8808

【文献】 YONEDA K. et al.，Biochimica et Biophysica Acta，２００６年，Vol.1764，pp.1087-1093

【文献】 KATASHKINA J. et al.，BMC Molecular Biology，２００９年，Vol.10: 34，pp.1-11

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １３／００−１３／２４

Ｃ１２Ｐ １５／００−１５／９０

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

発酵法によりL-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法であって、
L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する腸内細菌科の細菌であって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを有するよう改変された細菌を培地中で培養すること、および
L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を培地から回収すること、を含み、
前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号１および配列番号１と９０％以上の相同性を示す配列、配列番号３および配列番号３と９０％以上の相同性を示す配列、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２から選ばれるいずれか一つの配列を有するDNAによってコードされるものである、方法。

【請求項2】

前記細菌はアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入することにより改変された、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細菌がPantoea属に属する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記細菌がPantoea ananatisである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記細菌がEscherichia属に属する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記細菌がEscherichia coliである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物が、L-スレオニン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、及びL-ホモセリンからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記細菌が少なくとも以下のものを有するよう更に改変された、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法：
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの減少した活性；
クエン酸合成酵素の減少した活性；
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼの増加した活性；
アスパラギン酸アンモニアリアーゼの減少した活性；
ピルビン酸キナーゼの減少した活性。

【請求項9】

前記細菌がリンゴ酸デヒドロゲナーゼの減少した活性を有するよう更に改変された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物工業に関し、特に、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（aspartate dehydrogenase）を有するよう改変された腸内細菌科（Enterobacteriaceae family）の細菌を使用する、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物（L-aspartic acid-derived metabolites）の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、L-アミノ酸は、自然源（natural sources）から得られた微生物の株又はその変異体を利用する発酵法によって工業的に生産されている。典型的には、微生物は、L-アミノ酸の生産収量を増強するよう改変されている。

【0003】

L-アミノ酸の生産収量を増強するための多くの技術が報告されており、これには組換えDNAによる微生物の形質転換が含まれる（特許文献１）。生産収量を増強するための他の技術には、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は、結果的に得られるL-アミノ酸によるフィードバック阻害に対して標的酵素を非感受性とすることが含まれる（特許文献２、３、および４）。

【0004】

L-アスパラギン酸は、種々の用途（アスパルテーム甘味料、生分解性ポリマー等）を有する有用な代謝産物である。現在使用されている工業プロセスにおいて、アスパラギン酸は、アスパルターゼを使用してフマル酸から酵素的に生産されている。翻って、フマル酸は、石油の分留の生成物として化学合成により、又は細菌による発酵プロセスにおいて炭化水素から、得ることができる。

【0005】

公知の三工程（three-step）製造プロセスには、１）細菌株の発酵におけるフマル酸カルシウムの製造の工程、２）アンモニアの添加、炭酸アンモニウムの添加、又はCO₂と組合せたアンモニアの添加によるフマル酸カルシウムのフマル酸ジアンモニウムへの変換の工程、及び３）アスパルターゼによる、得られたフマル酸ジアンモニウムのアスパラギン酸アンモニウムへの酵素的変換の工程が含まれる（特許文献５）。

【0006】

コリネバクテリウム（Corynebacterium）属又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する細菌を利用する、細菌の発酵において炭水化物又は炭化水素からL-アスパラギン酸を直接製造する方法が先に開発されている（特許文献６）。これらの属の野生株の中には、もともとL-アスパラギン酸を生産するものもいる。これらの方法及び細菌は、生産能が増大するよう誘導された変異体を選択する過程に関連する。

【0007】

Yang Zh.ら（非特許文献１）により、サーモトーガ・マリチマ（Thermotoga maritima）から単離されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、オキサロ酢酸及びアンモニアからのアスパラギン酸合成の正反応をin vitroで触媒できることが示されている。アスパラギン酸合成のためにこの反応を利用することで、グルタミン酸の副生を回避することが容易になり得る。一方、この著者らは、生体内（in vivo）におけるこの酵素の役割は、アスパラギン酸を、NAD生合成の前駆体であるイミノアスパラギン酸へ変換することにあると提唱している。更に、T. maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、高い至適温度（+70℃）を有し、+30℃〜+40℃では低い残存活性しか有さないことが示されている。

【0008】

しかしながら、現在のところ、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造するために、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを有するよう改変された腸内細菌科の細菌を使用することについては報告されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第4,278,765号

【特許文献2】米国特許第4,346,170号

【特許文献3】米国特許第5,661,012号

【特許文献4】米国特許第6,040,160号

【特許文献5】米国特許第6,071,728号

【特許文献6】米国特許第4,000,040号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Yang Zh. et al., J. Biol. Chem., 278 (10): 8804-8808 (2003)

【発明の概要】

【0011】

ここに開示する主題の態様には、L-アスパラギン酸生産株の生産性を増強すること、及びこれらの株を使用するL-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法を提供することが含まれ得る。

【0012】

前記態様は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを有するよう腸内細菌科の細菌を改変し、細菌によるL-アスパラギン酸の生産を増強できることによって、達成することができる。

【0013】

ここに開示する主題には、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する増大した能力を有する腸内細菌科の細菌、及びこの細菌を使用するL-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法が含まれ得る。

【0014】

ここに開示する主題の一態様は、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する腸内細菌科の細菌であって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを有するよう改変され得る細菌を提供することである。

【0015】

ここに開示する主題の更なる態様は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入することにより改変され得る前記細菌を提供することである。

【0016】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、サーモトーガ・マリチマ（Thermotoga maritima）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0017】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ポラロモナス属の一種（Polaromonas sp.）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0018】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0019】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）に由来し得る前記細菌
を提供することである。

【0020】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、アゾリゾビウム・コーリノダンス（Azorhizobium caulinodans）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0021】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0022】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、メゾリゾビウム属の一種（Mesorhizobium sp.）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0023】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0024】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ニトロソモナス・マリチムス（Nitrosopumilus maritimus）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0025】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、オセアニコーラ・グラニュロサス（Oceanicola granulosus）に由来し得る前記細菌を提供することである。

【0026】

ここに開示する主題の更なる態様は、パントエア（Pantoea）属に属する細菌であり得る前記細菌を提供することである。

【0027】

ここに開示する主題の更なる態様は、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である前記細菌を提供することである。

【0028】

ここに開示する主題の更なる態様は、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌であり得る前記細菌を提供することである。

【0029】

ここに開示する主題の更なる態様は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である前記細菌を提供することである。

【0030】

ここに開示する主題の更なる態様は、L-アスパラギン酸を生産する前記細菌を提供することである。

【0031】

ここに開示する主題の更なる態様は、L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する前記細菌を提供することである。

【0032】

ここに開示する主題の更なる態様は、L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物が、L-スレオニン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、及びL-ホモセリンを含み得る前記細菌を提供することである。

【0033】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物がL-アルギニンである前記細菌を提供することである。

【0034】

ここに開示する主題の更なる態様は、少なくとも以下のものを有するよう更に改変された前記細菌を提供することである：
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの減少した活性；
クエン酸合成酵素の減少した活性；
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼの増加した活性；
アスパラギン酸アンモニアリアーゼの減少した活性；
ピルビン酸キナーゼの減少した活性。

【0035】

ここに開示する主題の更なる態様は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの減少した活性を有するよう更に改変された前記細菌を提供することである

【0036】

ここに開示する主題の更なる態様は、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法であって、
前記いずれかの細菌を培地で培養すること、および
L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を培地から回収すること、を含み得る方法を提供することである。

【0037】

ここに開示する主題の更なる態様は、L-アスパラギン酸が製造される前記方法を提供することである。

【0038】

ここに開示する主題の更なる態様は、L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物が製造される前記方法を提供することである。

【0039】

ここに開示する主題の更なる態様は、L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物が、L-スレオニン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、及びL-ホモセリンを含み得る前記方法を提供することである。

【0040】

ここに開示する主題の更なる態様は、前記L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物がL-アルギニンである前記方法を提供することである。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１は、サーモトーガ・マリチマ（Thermotoga maritima）由来のTM1643遺伝子のクローニングを示す。

【図2】図２は、pET-MT1643-Allプラスミド又は対照であるpET-22bを保持するBL21(DE3)株の不溶性及び可溶性画分についてのPAAG電気泳動パターンの写真である。 レーン１、２、３、４：不溶性画分 レーン５、６、７、８：可溶性画分 Ｍ：タンパク質マーカー。 レーン１：pET-22bプラスミド + IPTG レーン２：pET-22bプラスミド レーン３：pET-TM1643-All + IPTG レーン４：pET-TM1643-All レーン５：pET-TM1643-All + IPTG レーン６：pET-TM1643-All レーン７：pET-22bプラスミド+ IPTG レーン８：pET-22bプラスミド。

【図3】図３は、T. maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号２のヌクレオチド１〜233）及びポラロモナス属の一種（Polaromonas sp. ）JS666由来のホモログ（配列番号４のヌクレオチド2〜260）のアラインメントを示す。

【図4】図４は、pMW-intxis-catプラスミドベクターの構築を示す。

【図5】図５は、phMIV-1ヘルパープラスミドの構築を示す。

【図6】図６は、pMIVK620Sプラスミドの構築を示す。

【図7】図７は、Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの幾つかのホモログのアラインメントを示す。 Polaromonas sp. JS666（配列番号４） デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）（配列番号１００） コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）（配列番号１０２） ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）（配列番号１０４） シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（配列番号１０６） バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）（配列番号１０８） ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris） RPB_3108（配列番号１１０） ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris） RPB_0147（配列番号１１２） コンセンサス（配列番号１１３）。

【図8】図８は、Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの幾つかのホモログのアラインメントを示す（続き）。

【図9】図９は、Polaromonas sp.のADHの精製のSDS-PAGE（10％）による分析について示す写真である。 Ｍ：分子量タンパク質マーカー； レーン１：BL21(DE3)/pET-ADH-P(S)の粗細胞抽出物（crude cell extract）の可溶性画分（30μg） レーン２：硫酸アンモニウム溶液中での沈殿後の画分（30μg） レーン３：陰イオン交換クロマトグラフィ後の画分（4.6μg） レーン４、５：アフィニティクロマトグラフィ後の画分（6.6μg及び3.3μg）。

【図10】図１０は、ADHの正反応及び逆反応の触媒作用に対するpHの効果を示す。

【図11】図１１は、Polaromonas sp.のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの安定性に対する温度の効果を示す。

【図12】図１２は、Polaromonas sp.のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの調節特性（regulatory properties）を示す。

【図13】図１３は、ADHのオキサロ酢酸のアミノ化反応の触媒作用に対するアスパラギン酸の効果を示す。

【図14】図１４は、pET-ADH-P(S)プラスミドの構築を示す。

【図15】図１５は、Rhodopseudomonas palustris HaA2由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子RPB_0147を含むpET-15-ADH1-Rpプラスミドの構築のスキームを示す。

【図16】図１６は、pET-15-ADH1-Rpプラスミドを保持するBL21(DE3)株の粗抽出物から調製した可溶性及び不溶性画分のSDS/PAAG（10％）電気泳動の写真である。 Ｋ：BL21(DE3)/pET15b Ｍ：タンパク質マーカーSM0431 レーン７、８：BL21(DE3)/pET15-ADH1-Rp、クローン７及び８。

【図17】図１７は、精製したRhodopseudomonas palustrisのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1-Rp）のSDS-PAGEの写真である。

【図18】図１８は、Rhodopseudomonas palustrisのADH1-Rpの触媒作用に対するpHの効果を示す。

【図19】図１９は、Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの完全長ホモログの系統樹（distance tree）である。

【図20】図２０は、Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの完全長ホモログの系統樹である（続き）。

【図21】図２１は、E. coli MG1655株の染色体への、Bradyrhizobium japonicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の組込みを示す。

【図22】図２２は、Ralstonia eutropha H16由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子h16_B0736を含むpET15-ADH-Reプラスミドの構築を示す。

【図23】図２３は、pET15-ADH-Reプラスミドを保持するBL21(DE3)株の粗抽出物から調製した可溶性及び不溶性画分のSDS/PAAG（10％）電気泳動の写真である。 Ｋ：pET15b Ｍ：タンパク質マーカーSM0431 レーン２：pET15-ADH-Re、クローン２ レーン３：pET15-ADH-Re、クローン３ レーン４：pET15-ADH-Re、クローン４ レーン５：pET15-ADH-Re、クローン５。

【図24】図２４は、精製したRalstonia eutropha ADH-ReのSDS-PAGEの写真である。 左のレーン：精製した酵素（1 mkg）；右のレーン：タンパク質マーカー。

【図25】図２５は、Ralstonia eutropha ADH-Reのアミノ化反応及び脱アミノ化反応の触媒作用に対するpHの効果を示す。

【図26】図２６は、pET15-ADH-Bjプラスミドを保有するBL21(DE3)株の粗抽出物から調製した可溶性及び不溶性画分のSDA/PAAG（10％）電気泳動の写真である。 Ｍ：SM0431マーカー レーン１：BL21(DE3)/pET15bの可溶性画分 レーン２、３：BL21(DE3)/pET15-ADH-Bjの可溶性画分、クローン１、２ レーン４：BL21(DE3)/pET15bの不溶性画分 レーン５、６：BL21(DE3)/pET15-ADH-Bjの不溶性画分、クローン１、２

【図27】図２７は、精製したブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum ）ADH-BjのSDS-PAGE（12％）の写真である。 左のレーン：精製した酵素（2 mkg）；右のレーン：タンパク質マーカー。

【図28】図２８は、Bradyrhizobium japonicum ADH-Bjのアミノ化反応及び脱アミノ化反応の触媒作用に対するpHの効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0042】

１．ここに開示する主題に基づく細菌
腸内細菌科は、エシェリヒア（Escherichia）属, エンテロバクター（Enterobacter）属, エルビニア（Erwinia属）, クレブシエラ（Klebsiella）属, パントエア（Pantoea）属, フォトラブダス（Photorhabdus）属, プロビデンシア（Providencia）属, サルモネラ（Salmonella）属, セラチア（Serratia）属, シゲラ（Shigella）属, モルガネラ（Morganella）属, エルシニア（Yersinia）属等に属する細菌を包含する。特に、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）により使用される分類法に従って腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に分類されるものを使用することができる。Escherichia属又はPantoea属に属する細菌が好適である。

【0043】

「Pantoea属に属する細菌」という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従ってPantoea属に分類できることを意味する。エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）の幾つかの種が、近年、16S rRNAの塩基配列解析等に基づいて、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、またはパントエア・スチュアールティ（Pantoea stewartii）等に再分類されている（International Journal of Systematic Bacteriology, July, 1989, 39
(3), p. 337-345）。更に、Erwinia属に属する幾つかの細菌が、Pantoea ananatis又はPantoea stewartiiとして再分類された（International Journal of Systematic Bacterio
logy, Jan., 1993, 43 (1), pp. 162-173）。Pantoea細菌の代表的な株としては、限定されるものではないが、Pantoea ananatis、Pantoea stewartii、Pantoea agglomerans、及びパントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、以下の株が挙げられる：Pantoea ananatis AJ13355（FERM BP-6614、ヨーロッパ特許公告第0952221号）、Pantoea ananatis AJ13356（FERM BP-6615、ヨーロッパ特許公告第0952221号）、Pantoea ananatis AJ 13601（FERM BP-7207、ヨーロッパ特許公告第0952221号）。ここに開示する主題の例示的な実施態様においては、Pantoea ananatis SC17(0)を、λ-Red耐性細菌として使用することができる（VKPM B-9246、ロシア連邦出願第2006134574号）。

【0044】

「Escherichia属に属する細菌」という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従ってEscherichia属に分類されることを意味する。Escherichia属に属する細菌としては、限定されるものではないが、Escherichia coli（E. coli）が挙げられる。

【0045】

Escherichia属に属する細菌は特に限定されない。しかしながら、例えば、Neidhardt, F. C.ら（Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, Table 1）によって記載された細菌が、本発明によって包含される。

【0046】

「L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する細菌」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を培地又は細胞から回収することができる程度に、ここに開示した主題に従って、L-アスパラギン酸及び／又はL-アスパラギン酸より誘導される１またはそれ以上の代謝産物を生産し、L-アスパラギン酸及び／又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物の培地又は細胞中での蓄積を引き起こす能力をいう。あるいは、「L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する細菌」という記載は、野生株又は親株より多い量で、目的のL-アスパラギン酸及び／又はL-アスパラギン酸より誘導される１またはそれ以上の代謝産物の培地中での蓄積を引き起こすことのできる細菌を意味する。ここに開示する主題の例示的な実施態様においては、微生物は、第１の例示的な量として0.4g/L以上の、又は第２の例示的な量として1.0g/L以上の、アスパラギン酸及び／又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物の培地中での蓄積を引き起こすことができる。細菌におけるL-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する能力は、生来の（native）能力であってもよく、突然変異誘発又は組換えDNA技術を使用して細菌を改変することにより付与されたものであってもよい。

【0047】

ここに開示する主題に従い、「L-アスパラギン酸」という用語は、遊離のL-アスパラギン酸又はアスパラギン酸と呼ばれるそのあらゆる塩をいう。L-アスパラギン酸より誘導される代謝産物には、L-スレオニン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、及びL-ホモセリンが含まれ得る。L-アスパラギン酸及び／又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を、標的アミノ酸ともいう。標的アミノ酸は、遊離のL-アミノ酸であってもよく、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、又はカリウム塩のような塩であってもよい。

【0048】

ここに開示する主題に関連する主題の著者らは、これまでに、Pantoea属に属する細菌によってL-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造することを試み、また、必要に応じて、少なくとも以下のものを有するように細菌を改変することを試みた：
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（a-ketoglutarate dehydrogenase）の減少した活性；
クエン酸合成酵素（citrate synthase）の減少した活性；
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）又
はピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）の増加した活性；及び
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（glutamate dehydrogenase）又はグルタミン酸合成酵素（glutamate synthase）の増加した活性。

【0049】

細菌は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（aspartate ammonia-lyase）（アスパルターゼ（aspartase））をコードする遺伝子の弱化した発現（attenuated expression）を有するよう改変されていてもよい（WO/2010/038905）。

【0050】

細菌は、ピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase）をコードする遺伝子の弱化した発現を有するよう改変されていてもよい。

【0051】

細菌は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）をコードする遺伝子の弱化した発現を有するよう改変されていてもよい。

【0052】

更に、ここに開示する主題の発明者により、Pantoea属に属する細菌によるL-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸により誘導される代謝産物の生産は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを有するよう細菌を改変した場合に、増強させることができることが見出された。

【0053】

アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの活性とは、オキサロ酢酸及びアンモニアからのアスパラギン酸の直接的な合成の正反応を触媒する活性を意味する。アスパラギン酸合成のためにこの反応を利用することで、グルタミン酸の副生を回避することが容易になり得る。また、この場合、必ずしもグルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸合成酵素の活性を増加させる必要はない。

【0054】

ここに開示する主題に基づく細菌は、当業者に周知の方法を使用し、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（adh遺伝子）を導入することによって得ることができる。例えば、細菌は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むDNA断片を用いて形質転換することができる。遺伝子は、組込み／組換え系（integration/recombination systems）を利用して、Pantoea属に属する細菌のような腸内細菌科の細菌内での発現に適したプロモーターの制御下に導入することができる。例えば、Pantoea属に属する組換え細菌を構築する方法は、ロシア連邦特許出願第2006134574号に詳細に記載されている。あるいは、細菌は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換すること等もできる。細菌におけるadh遺伝子のコピー数は、１またはそれ以上であってよい。

【0055】

サーモトーガ・マリチマ（Thermotoga maritima）由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列及びアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。

【0056】

また、ここに開示する主題の発明者は、ポラロモナス属の一種（Polaromonas sp.）JS666由来の、低い至適温度を有するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を初めて同定しクローニングした。Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列及びアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。

【0057】

Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの幾つかのホモログのアラインメント（Polaromonas sp. JS666, Delftia acidovorans, Comamonas testosterone, Ralstonia eutropha, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cenocepacia, Rhodopseudomonas palustris RPB_3108, R. palustris RPB_0147, T. maritima）を図７及び８
に示す。これらホモログのコンセンサス配列も図７及び８に示す。

【0058】

また、ここに開示する主題の発明者は、幾つかの微生物由来の遺伝子群を選択して、他のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを見出し、クローニングし、特徴付けた。

【0059】

Rhodopseudomonas palustris HaA2由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするRPB_0147遺伝子の塩基配列を配列番号６４に示す。

【0060】

Rhodopseudomonas palustris HaA2由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするRPB_3108遺伝子の塩基配列を配列番号６５に示す。

【0061】

Ralstonia eutropha H16由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするH16_B0736遺伝子の塩基配列を配列番号６６に示す。

【0062】

Azorhizobium caulinodans ORS 571由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするAZC_4388遺伝子の塩基配列を配列番号６７に示す。

【0063】

Bradyrhizobium japonicum USDA 110由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするbll6567遺伝子の塩基配列を配列番号６８に示す。

【0064】

Mesorhizobium sp.由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするMeso_0824遺伝子の塩基配列を配列番号６９に示す。

【0065】

Corynebacterium glutamicum R由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするcgR_1126遺伝子の塩基配列を配列番号７０に示す。

【0066】

Nitrosopumilus maritimus由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするNmar_1240遺伝子の塩基配列を配列番号７１に示す。

【0067】

Oceanicola granulosus由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするOG2516_00504遺伝子の塩基配列を配列番号７２に示す。

【0068】

前記微生物は、ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)、又はJCM (Japan Collection of Microorganisms（〒351-0198 埼玉県和光市広沢2-1 独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室）)から入手可能である。

【0069】

「酵素の活性が増加する」とは、細胞内の酵素の活性が、改変されていない微生物、例えば、親株又は野生型株、と比較して高いことを意味する。酵素の活性は、酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって細胞内で増加させることができる。このような改変としては、発現させる遺伝子の細胞当りのコピー数を増加させること、遺伝子の発現のレベルを増加させること等が挙げられる。発現させる遺伝子のコピー数の量は、例えば、染色体DNAを制限酵素処理した後、遺伝子配列に基づくプローブを使用したサザンブロッティングを行うことや、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を行うこと等によって測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCR等を含む種々の公知の方法によって測定することができる。また、対照となり得る野生型株には、例えば、Pantoea ananatis FERM BP-6614が含まれていてよい。

【0070】

P. ananatis由来のaspA遺伝子の塩基配列及びアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（Asp
A、アスパルターゼ）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び配列番号６に示す。

【0071】

P. ananatis由来のsucA遺伝子の塩基配列及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（SucA、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase））のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７及び配列番号８に示す。

【0072】

P. ananatis由来のgltA遺伝子の塩基配列及びクエン酸合成酵素（GltA、シトロゲナーゼ（citrogenase）、オキサロ酢酸トランスアセチラーゼ（oxalaoacetate transacetylase））のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９及び配列番号１０に示す。

【0073】

P. ananatisは、ピルビン酸キナーゼをコードする２つのアイソザイム、PykA及びPykF、を有する。P. ananatis由来のpykA遺伝子の塩基配列及びピルビン酸キナーゼ（PykA）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示す。P. ananatis由来のpykF遺伝子の塩基配列及びピルビン酸キナーゼ（PykF）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示す。

【0074】

E. coli由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするppc遺伝子は公知である（GenBank accession no. NC_000913.2; gi: 49175990の位置4,148,470〜4,151,121のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド）。ppc遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のyijP遺伝子とびargE遺伝子の間に位置する。E. coli由来のppc遺伝子の塩基配列及びppc遺伝子によりコードされるPpcのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示す。

【0075】

シノリゾビウム・メリローティ（Sinorhizobium meliloti）由来のピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpycA遺伝子は公知である（WO/2010/038905）。

【0076】

属間又は株間でDNA配列に幾分かの相異があり得るため、発現が増加又は弱化されるよう改変するadh、aspA、sucA、gltA、pykA、pykF、又はppc遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５にそれぞれ示した遺伝子に限定されるものではなく、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５のそれぞれに対して相同な遺伝子を含んでいてよい。したがって、adh、aspA、sucA、gltA、pykA、pykF、又はppc遺伝子によってコードされるタンパク質バリアント（variant）は、対応するタンパク質の活性が維持される限り、それぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６に示したアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の例示的な相同性を有していてよい。ここに開示する主題において使用される「タンパク質バリアント」とは、アミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換であるかを問わず、配列に改変を有するタンパク質を意味する。バリアントタンパク質における改変の数は、タンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類に依存し得る。例示的な態様は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６のそれぞれにおいて、１〜３０、１〜１５、又は１〜５であってよい。バリアントにおけるこれらの改変は、タンパク質の三次元構造に重要ではないタンパク質の領域において生じうる。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有するため、そのような改変によっては三次元構造は影響を受けないからである。この明細書において、「相同性」は「同一性」を意味する場合がある。

【0077】

２つのアミノ酸配列間の相同性は、周知の方法、例えば、スコア、同一性、及び類似性の３つのパラメータを計算するコンピュータプログラムBLAST 2.0、を利用して決定することができる。

【0078】

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的変異（conservative mutation(s)）である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及びValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。

【0079】

したがって、adh、aspA、sucA、gltA、pykA、pykF、又はppc遺伝子は、機能性のタンパク質をコードする限り、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５に示す塩基配列、又は同塩基配列から調製することのできるプローブに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするバリアントであってよい。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、６０％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記未満の相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれ得る。他の例示的な相同性には、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、及び９９％以上が含まれ得る。例えば、ストリンジェントな条件としては、1xSSC、0.1％SDSの塩濃度で、１回またはそれ以上の回数、例えば２回又は３回洗浄することが挙げられる。他の例示的な塩濃度には、60℃で0.1xSSC、0.1％SDSが含まれ得る。洗浄時間はブロッティングに使用される膜の種類に依存するが、原則として、製造業者により推奨された時間であってよい。例えば、ストリンジェントな条件下でのHybond（商標）N+ナイロン膜（アマシャム）について推奨される洗浄時間は１５分である。例として、洗浄は２〜３回行ってよい。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件に応じて適切に選択することができ、例えば、100 bp〜1 kbpであってよい。

【0080】

「遺伝子の発現が弱化されるよう細菌が改変された」とは、改変された細菌が、同遺伝子によってコードされるタンパク質を、改変されていない細菌、例えば、親株又は野生型株、と比較して低減された量で含有するように、又は同遺伝子によってコードされるタンパク質を合成することができないように、細菌が改変されたことを意味する。

【0081】

「遺伝子の不活性化」とは、改変した遺伝子が、全く機能しないタンパク質をコードすることを意味する。遺伝子の一部若しくは全体の欠失、遺伝子のリーディングフレームのシフト、ミスセンス／ナンセンス変異の導入、又はプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等のような遺伝子の発現を制御する配列を含む遺伝子の隣接領域の改変により、改変されたDNA領域が同遺伝子を自然に発現することができないようにすることもできる。

【0082】

細菌の染色体におけるaspA、sucA、gltA、pykA、又はpykF遺伝子の有無は、PCRやサザンブロッティング等を含む周知の方法によって検出することができる。また、遺伝子の発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等を含む種々の公知の方法を使用して、同遺伝子から転写されるmRNAの量を測定することによって見積もることができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量又は分子量は、SDS-PAGEの後にイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング分析）を行うこと等を含む公知の方法によって測定することができる。

【0083】

遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞内の量が改変されていない株と比較して減少するよう、染色体上の遺伝子に変異を導入することにより、弱化させることができる。このような変異は、薬剤耐性遺伝子の挿入、又は遺伝子の一部若しくは全体の欠失であってよい（Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)）。遺伝子の発現は、プロモーターやシャイン・ダルガルノ(SD)配列等のような発現調節配列を改変することによっても、弱化させることができる（WO95/34672, Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)）。

【0084】

例えば、遺伝子の組換えによって変異を導入するために、以下の方法を用いることができる。変異型遺伝子を調製し、変異型遺伝子を含むDNA断片を用いて、改変すべき細菌を形質転換する。その後、相同組換えによって染色体上の本来の遺伝子（native gene）を変異型遺伝子と置換し、この結果得られる株を選択する。このような相同組換えによる遺伝子置換は、「Redドリブン・インテグレーション（Red-driven integration）」として知られている直鎖状DNA（linear DNA）を用いることにより（Datsenko, K. A.とWanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)）、又は温度感受性複製（replication）を示すプラスミドを用いる方法により（米国特許第6,303,383号又はJP 05-007491A）、行うことができる。ここに開示する主題に従って用いられる例示的な株は、λ-Red遺伝子の産物に対して耐性となるように改変することのできるPantoea ananatis株であってよい。このような株としては、限定されるものではないが、Pantoea ananatis株SC17(0) （VKPM B-9246、ロシア連邦出願第2006134574号）が挙げられる。

【0085】

また、上記のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異の組込みは、宿主中で複製できないプラスミドを用いて行うこともできる。

【0086】

遺伝子の発現は、トランスポゾン若しくはISファクターを遺伝子のコード領域に挿入することにより（米国特許第5,175,107号）、又はUV照射若しくはニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を用いる変異誘発のような慣用的な方法により、弱化させることもできる。

【0087】

遺伝子の不活性化は、慣用的な方法、例えば、UV照射若しくはニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を用いる変異誘発、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子の破壊、及び／又は、「Redドリブン・インテグレーション」とも呼ばれる挿入−欠失変異誘発（Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45）によっても、行うことができる。

【0088】

プラスミドDNAの調製、DNAの消化及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に周知である。これらの方法は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis. T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に記載されている。

【0089】

L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する細菌
ここに開示する主題に基づく、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産することのできる細菌としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの減少した活性を有するよう改変された細菌、クエン酸合成酵素の減少した活性を有するよう改変された細菌、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼの増加した活性を有するよう改変された細菌、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸合成酵素の増加した活性を有するよう改変された細菌、を使用することができる。細菌は、さらに、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（アスパルターゼ）を
コードする遺伝子の弱化した発現を有するよう改変することもできる。

【0090】

L-スレオニン生産細菌
ここに開示する主題に基づくL-スレオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-スレオニン生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。例示的な態様では、ここに開示する主題に基づく細菌は、以下の遺伝子の１またはそれ以上の発現が増強されるよう改変されてよい：
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩ（aspartokinase homoserine dehydrogenase I）をコードする変異型thrA遺伝子；
ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）をコードするthrB遺伝子；
スレオニン合成酵素（threonine synthase）をコードするthrC遺伝子；
推定上の膜貫通タンパク質（putative transmembrane protein）をコードするrhtA遺伝子；
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase）をコードするasd遺伝子；及び
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase）（アスパルテートトランスアミナーゼ（aspartate transaminase））をコードするaspC遺伝子。

【0091】

Escherichia coli細菌由来の遺伝子を使用することができる。Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかとなっている（ヌクレオチド位置337〜2799、GenBank accession no. NC_000913.2, gi: 49175990）。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかとなっている（ヌクレオチド位置2801〜3733、GenBank accession no. NC_000913.2, gi: 49175990）。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子は明らかとなっている（ヌクレオチド位置3734〜5020、GenBank accession no. NC_000913.2, gi: 49175990）。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら３つの遺伝子は全て、単一のスレオニンオペロンとして機能し得る。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、転写に影響を与えるアテニュエーター領域を同オペロンから除去することができる（WO2005/049808、WO2003/097839）。

【0092】

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子は、thrB遺伝子及びthrC遺伝子と共に、スレオニン生産E. coli株VKPM B-3996中に存在する周知のプラスミドpVIC40から単一のオペロンとして取得することができる。プラスミドpVIC40については、米国特許第5,705,371号に詳細に記載されている。

【0093】

rhtA遺伝子は、E. coli染色体上の18分に位置し、グルタミン輸送系の構成要素をコードするglnHPQオペロンに近接している。rhtA遺伝子は、ORF1（ybiF遺伝子、ヌクレオチド位置764〜1651、GenBank accession no. AAA218541, gi:440181）と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によってコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている（rht：ホモセリン及びスレオニンに対する耐性（resistance to homoserine and threonine））。また、rhtA23変異が、AGT開始コドンに対する−１位におけるG→A置換であることが明らかにされている（ABSTRACTS of the 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with
Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A）。

【0094】

E. coliのasd遺伝子は既に明らかとなっており（ヌクレオチド位置3572511〜3571408、GenBank accession no. NC_000913.1, gi:16131307）、同遺伝子の塩基配列に基づいて調製したプライマーを利用するPCR（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T. J.ら、Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照のこと）によって取得することができる。他の微生物のasd遺伝子は、同様の手法で取得することができる。

【0095】

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかとなっており（ヌクレオチド位置983742〜984932、Genbank accession no. NC_000913.1, gi:16128895）、PCRによって取得することができる。他の微生物のaspC遺伝子は、同様の手法で取得することができる。

【0096】

L-リジン生産細菌
ここに開示する主題に基づくL-リジン生産細菌を誘導するための親株としては、L-リジン生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。そのような遺伝子としては、限定されるものではないが、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（dihydrodipicolinate synthase）をコードする遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ（aspartokinase）をコードする遺伝子（lsyC）、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase）をコードする遺伝子（dapB）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase）をコードする遺伝子（lysA）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（diaminopimelate dehydrogenase）をコードする遺伝子（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）をコードする遺伝子（ppc）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenease）をコードする遺伝子（asd）、及びアスパルターゼ（aspartase）をコードする遺伝子（aspA）（EP1253195A）が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP1170376A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（nicotinamide nucleotide transhydrogenase）をコードする遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、又はこれらの組合せの増加した発現を有していてもよい。

【0097】

ここに開示する主題に基づくL-リジン生産細菌を誘導するための親株としては、L-リジンの生合成経路から分岐してL-リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または消失した株が挙げられる。L-リジンの生合成経路から分岐してL-リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）、リジンデカルボキシラーゼ（lysine decarboxylase）（米国特許第5,827,698号）、及びリンゴ酸酵素（malic enzyme）（WO2005010175）が挙げられる。

【0098】

L-アルギニン生産細菌
ここに開示する主題に基づくLアルギニン生産細菌を誘導するための親株としては、E. coli 237株（VKPM B-7925）（米国特許出願第2002/058315A1号）及び変異型N-アセチルグルタミン酸合成酵素（N-acetylglutamate synthase）を保持するその誘導株（ロシア連邦特許出願第2001112869号）、E. coli 382株（VKPM B-7926）（EP1170358A1）、ならびにN-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株（EP1170361A1）等のようなEscherichia属に属する株が挙げられる。

【0099】

本発明のL-アルギニン生産細菌を誘導するための親株としては、L-アルギニン生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。このような遺伝子としては、N-アセチルグルタミルリン酸リダクターゼ（N-acetylglutamyl phosphate reductase）の遺伝子（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ornithine acetyl transferase）の遺伝子（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（N-acetylglutamate kinase）の遺伝子（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（acetylornithine transaminase）の遺伝子（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラー
ゼ（ornithine carbamoyl transferase）の遺伝子（argF）、アルギノコハク酸合成酵素（argininosuccinic acid synthetase）の遺伝子（argG）、アルギノコハク酸リアーゼ（argininosuccinic acid lyase）の遺伝子（argH）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carbamoyl phosphate synthetase）の遺伝子（carAB）が挙げられる。

【0100】

L-メチオニン生産細菌
L-メチオニン生産細菌及びL-メチオニン生産細菌を誘導するための親株としては、限定されるものではないが、L-スレオニン要求性変異株及びノルロイシン耐性変異株が挙げられる（JP 2000-139471A）。また、親株としては、メチオニンリプレッサー欠失株、並びにホモセリントランススクシニラーゼ（homoserine transsuccinylase）及びシスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine γ-synthase）のようなL-メチオニンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株（JP2000-139471A）も使用できる。

【0101】

L-ホモセリン生産細菌
L-ホモセリン耐性は、rhtB遺伝子のコピー数を増加させることにより細菌に付与することができ、L-ホモセリン、L-スレオニン、L-アラニン、L-バリン、及びL-イソロイシンの生産が増加する（EP994190A2）。更に、L-ホモセリン及びL-スレオニンに対する耐性は、rhtC遺伝子のコピー数を増加させることにより細菌に付与することができ、L-ホモセリン、L-スレオニン、及びL-ロイシンの生産が増加する（EP994190A2）。ここに開示する主題に基づくL-リジン生産細菌を誘導するための親株としては、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に受託番号VKPM B-2175の下で1980年9月1日に寄託された後、2000年9月1日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されたE. coli 44株が挙げられる。

【0102】

２．ここに開示する主題に基づく方法
ここに開示する主題に基づく方法は、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法であって、ここに開示する主題に基づく細菌を培養培地中で培養して、目的アミノ酸を生産し培地中に分泌すること、および生産されたアミノ酸を培地から回収することを含む方法であってよい。

【0103】

ここに開示する主題に基づき、培養、培地からの目的アミノ酸の回収および精製等は、細菌を使用してアミノ酸を製造する従来の発酵法と同様の手法で行うことができる。

【0104】

培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて細菌が生育のために要求する適当量の栄養分を含む限り、合成培地であてもよく、天然培地であってもよい。炭素源には、グルコースやショ糖のような種々の炭水化物、及び種々の有機酸が含まれ得る。選択される微生物の同化の様式によっては、エタノールやグリセリンを含むアルコールを使用することができる。窒素源としては、アンモニアや硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵微生物のような天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、モノリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄（ferrous sulfate）、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。

【0105】

培養は、30℃〜36℃の第１の例示的な温度、又は32℃〜34℃の第２の例示的な温度で、振盪及び／又は通気攪拌によるような好気的な条件下で行うことができる。第１の例示的な培養pHは5.0〜7.0であってよく、第２の例示的な培養pHは6.0〜6.5であってよい。培養pHは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液を用いて調整することができる。１〜５日間の培養により、液体培地中に目的L-アミノ酸が蓄積し得る。

【0106】

培養後、細胞のような固形分は、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、L-アミノ酸は、イオン交換法、濃縮法、及び／又は結晶化法により回収および精製することができる。

【0107】

回収したL-アミノ酸は、同L-アミノ酸に加えて、細菌細胞、培地成分、水分、及び細菌の副生代謝産物を含んでいてよい。回収したL-アミノ酸の純度は、５０％以上、８５％以上、または９５％以上であってもよい（日本国特許第1214636号、米国特許第5,431,933号、4,956,471号、4,777,051号、4,946,654号、5,840,358号、6,238,714号、米国特許出願公開第2005/0025878号）。

【実施例】

【0108】

以下、ここに開示する主題を、以下の非限定的な例を参照してより具体的に説明する。

【0109】

実施例１．Thermotoga maritima由来のTM1643遺伝子のアスパラギン酸生産株への導入
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするThermotoga maritima由来の十分に研究されたTM1643遺伝子（Yang Zh.ら、J. Biol. Chem., 278 (10): 8804-8808 (2003)）をクローニングし、E. coliで過剰発現させた。Thermotoga maritima株は、ATCCから入手することができる。

【0110】

この遺伝子のコード部分は、E. coliでは稀（rare）な１８コドンを含んでいる。クローニングした遺伝子がE. coli中で効率的に翻訳されるように、全てのレアコドン（rare codons）を同義の高頻度コドン（frequent codons）に置換したT. maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード部分を含むDNA断片の化学合成及びクローニングを、Sloning BioTechnology, GmbH（ドイツ）に発注した。このクローニング技術は、WO2005071077に開示されている。全てのレアコドンの置換を含むTM1643遺伝子の塩基配列、及びこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１７及び配列番号１８にそれぞれ示す。

【0111】

翻訳が行われるように、全てのレアコドンの置換を含むTM1643遺伝子の改変されたコード部分を、pET-22b（"Novagen"）ベクターにサブクローニングし、PT7プロモーター及びRBSΦ10の制御下に置いた。このために、Sloning BioTechnology, GmbH（ドイツ）により提供されたpUC-TM1643-AllプラスミドをNdeI及びBamHI制限酵素により消化した。レアコドンが置換されたTM1643のバリアントを含むプラスミド断片を、NdeI及びBamHI制限酵素により消化したpET-22b(+)ベクター（Novagen）とライゲーションした。当初のpUC-TM1643-Allプラスミドから解放されるように、ライゲーションした混合物をKpnI制限酵素により消化した後、15 kV/cmの電界強度及び５ミリ秒のパルス時間でE. coli TG1株にエレクトロトランスフォーム（electrotransform）した。TG1株は、例えば、Zymo Research Corporationから入手することができる。

【0112】

アンピシリン（100 mg/L）を含むLBプレート上で生育したクローンからプラスミドDNAを単離し、期待される構造を有するプラスミドを制限酵素解析によって選択した。この結果得られたプラスミドを、pET-TM1643-Allとした（図１）。pET-TM1643-Allプラスミド及びpET-22bプラスミド（対照として）のそれぞれを、染色体上にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を保持するE. coli BL21(DE3) 株（"Novagen"）に導入した。E. coli BL21(DE3)/pET-TM1643-All及びBL21(DE3)/pET-22b株をLB培地で37℃、一夜生育させ、培養物を新鮮なLB培地で100倍に希釈し、OD₅₉₅＝1.0となるまで通気しながら+37℃でインキュベートした。その後、IPTGを1 mM濃度となるまで適当な培養物中に添加し、+37℃で１時間インキュベートした。PAAG電気泳動を利用して細菌培養物のサンプルを分析したところ、IPTGによる誘導の後に、不溶性画分において、期待される大きさ（27 kDa）のタンパク質の高いレベル
の蓄積が観察された。可溶性画分にも、著量の同タンパク質が含まれていた（図２参照）。生育した細胞の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性も測定した。45mlの培養物から細胞を遠心分離によって回収し、2 mM DTTを添加した50 mM TRIS pH 7.5に再懸濁し、フレンチプレスを使用して破砕した。溶解物を13000 rpmで10分間遠心分離し、得られた粗抽出物を新しいバイアルに移した。反応混合物は、100 mM TRIS pH 9.8、1 mM
NAD⁺又はNADP⁺、及び5 mMアスパラギン酸を含有するものとした。粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定により（表１）、少なくとも逆反応においてはNADP⁺が好適な補因子であることが示された。+34℃での活性は検出可能であると証明されたが、これは+70℃の場合と比較して30倍低かった。

【0113】

【表1】

【0114】

RBSΦ₁₀に接続した遺伝子を、組込みベクターpMIV5-JS（ロシア連邦特許出願第2006132818号、EP1942183）にサブクローニングし、P_tacプロモーターの制御下に置いた。この結果得られたプラスミドpMIV-TM1643（図１）を、P. ananatis 5ΔP2-36S株に導入した。P.
ananatis 5ΔP2-36S及び5ΔP2-36S/pMIV-TM1643株のそれぞれを、保持するプラスミド用に50 mg/Lのクロラムフェニコールを添加したLB-M91/2培地中で７時間生育させ、試験管
発酵用の標準的な培地を用いて30倍に希釈し、フラスコ（750 mlのフラスコ中の30 mlの
培地）中で通気しながら15時間培養した。6 mlの培養物から細胞を遠心分離により回収し、50 mM TRIS, pH 7.5で洗浄して凍結した。ペレットを50 mM TRIS, pH 7.4及び2 mM DTTの緩衝液に再懸濁し、超音波によって細胞を破砕した。反応混合物は、100 mM TRIS, pH 9.8、1 mM NADP、5 mM アスパラギン酸、及び2.5μgの全タンパク質を含むものとした。
プローブは、+70℃で30分間インキュベートした。インキュベートしていないプローブ及
びアスパラギン酸なしのプローブを対照として使用した。5ΔP2-36S/pMIV-TM1643の粗抽
出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定により、６つの独立した形質転換体において、E. coli BL21(DE3)/pET-TM1643-All株で測定された比活性と同等の高いレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性が示された（表２）。

【0115】

【表2】

【0116】

TM1643遺伝子を、E. coli ppc^K620S遺伝子について参考例１に記載したように、5ΔP2R株の染色体へMu依存的に組み込んだ。試験管培養（試験管培養用の標準的な手順（T＝+34℃、初発グルコース40 g/L、初発L-Glu（L-グルタミン酸）3 g/L、48時間培養）を適用した）により、TM1643遺伝子を保有する株によるアスパラギン酸蓄積の顕著な（2.8倍までの）増加が示された（表３、２つの独立した培養の平均データを示す）。

【0117】

【表3】

【0118】

T. maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持する5ΔP2R-TM1643組込み体の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性を検定した。組込み体用に50 mg/Lのクロラムフェニコールを添加した5 g/Lのグルコースを含有するLB-M91/2培地で９時間培養物を生育させた。その後、これら培養物を、10g/Lグルコース及び3g/L L-Gluを含有する試験管発酵用の標準的な培地（表４、pH６、CaCO₃を含まない）で1：30に希釈して最終容量10mlとした。この結果得られた培養物を、試験管内で通気しながら+34℃で16時間培養した。その後、遠心分離によって細胞を回収し、50 mM TRIS, pH 7.4で洗浄して凍結した。ペレットを50 mM TRIS, pH 7.4及び2 mM DTTを含有する緩衝液中に再懸濁し、超音波によって細胞を破砕した。反応混合物は、100 mM TRIS, pH 9.8、1 mM NADP⁺、及び5 mMアスパラギン酸を含むものとした。プローブは、+70℃で30分間インキュベートした。アスパラギン酸なしのプローブを対照として使用した。結果を表５に示す。これらの結果は、酵素活性とアスパラギン酸の蓄積との間の直接的な相関を示している。

【0119】

【表4】

区分Ｂは、NaOHによりpH6.5に調整した。区分Ｂ及びＣは別々に滅菌した。

【0120】

【表5】

【0121】

実施例２．推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
P. ananatisと類似の環境中に生存する生物学的安全性（biosafety）レベル１の細菌種であるPolaromonas sp. JS666を、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の候補の供与体として選択した。T. maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びPolaromonas
sp. JS666由来のホモログ（GENE ID: 4013636 Bpro_3686）のアラインメントを図３に示す。Polaromonas sp. JS666は、ATCCから入手することができる。

【0122】

最初に、Polaromonas sp. Bpro_3686由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をpET-22b(+)ベクターにクローニングし、PT7プロモーター及び標準的なSD配列であるAGGAGGの制御下に置いた。pET-ADH-P(S)プラスミド（図１４）を構築するために、プライマーAspP5S-Xba（配列番号２１）及びAspP3-BH（配列番号２２）を用いたPCRにより、標準的なSD配列であるAGGAGGに接続されたPolaromonas sp. Bpro_3686の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのコード部分を含むDNA断片を生成した。Polaromonas sp. JS666株（ATCC BAA-500）から単離した染色体DNAを、反応におけるテンプレートとして使用した。得られた断片をXbaI及びBamHI制限酵素を用いて消化し、同じエンドヌクレアーゼを用いて消化したpET-22b(+)ベクターとライゲーションした。ライゲーションした混合物でE. coli TG1株を形質転換し、アンピシリン（100 mg/L）を含むLBプレート上で生育したクローンからプラスミドDNAを単離した。期待される構造を有するプラスミドを制限酵素解析によって選択した。この結果得られたプラスミドをpET-ADH-P(S)とした。クローニングした断片のDNA配列の正確性は、プライマーSeq-adh-P5（配列番号２３）、Seq-adh-P3（配列番号２４）、及びSeq-adh-Pm（配列番号２５）を使用するサンガー（Sanger）法により証明した。

【0123】

構築したプラスミドをpET-ADH-P(S)と命名した。pET-ADH-P(S)を保有するBL21(DE3)株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの+25℃における比活性を求めた。細胞を、OD₅₉₅＝0.9となるまでM9培地（5 g/Lグルコース）中で+37℃で培養した。その後、1 mMのIPTGを添加し、細胞を２時間培養した。測定は室温で行った。正反応用の反応混合物は、100 mM TRIS-HCl, pH 8.0、100 mM NH₄Cl、0.15 mM NAD(P)H、5 mMオキサロ酢酸（NaOHによりpH 7.0）を含有するものとした。逆反応用の反応混合物は、100 mM TRIS-HCl, pH 9.8、1 mM NAD(P)⁺、及び5 mM アスパラギン酸ナトリウム（pH 7.0）を含有するものとした。結果を表６に示す。これらの結果から、このプラスミドによって室温における高いレベルのNAD/NADP依存性のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性が得られることが示された。

【0124】

【表6】

【0125】

Polaromonas sp. Bpro_3686遺伝子のコード領域は、E. coliでは稀な９つのコドンを含んでいた。効率的な翻訳を行うために、レアコドンを置換したORFをSloning BioTechnology GmbH（ドイツ）で化学合成した。全レアコドンの置換を含むBpro_3686遺伝子の塩基配列、及びこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１９及び配列番号２０に示す。野生型（native）のBpro_3686遺伝子及びレアコドンを含まない同遺伝子のバリアントを、pMIV5-JS-likeベクターにクローニングし、P_tacプロモーター及び標準的なSD配列AGGAGGの制御下に置いた。構築されたプラスミドは、それぞれ、pMIV-ADH-P(S)及びpMIV-ADH-P(S)-allと命名した。Polaromonas sp. JS666由来の野生型アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子、及びレアコドンを置換した遺伝子を保持するプラスミドにより得られるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性を測定した。クロラムフェニコール（50 mg/L）を添加したLBブロス（LB broth）で生育させた、上記ベクタ
ーのそれぞれで形質転換したE. coli MG1655（ATCC 47076, ATCC 700926）の一夜培養物を、5 g/Lグルコース及びクロラムフェニコール（50 mg/L）を含有するM9培地にOD₅₉₅＝0.1、最終容量10 mlとなるよう希釈した。MG1655株は、American Type Culture Collection（住所: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 米国）から入手することができる。5 g/Lグルコース及びクロラムフェニコール（50 mg/L）を含有するLB-M91/2培地中で９時間生育させた、上記ベクターのそれぞれで形質転換したP. ananatis 5ΔP2RMGの培養物を、10 g/Lグルコース、3 g/L L-Glu、及びクロラムフェニコール（50 mg/L）を含有する試験管発酵用の標準的な培地（pH６、CaCO₃を含まない）で1：30に希釈し最終容量10 mlとした。この結果得られた培養物を、+34℃で通気しながらOD₅₉₅＝1.0まで培養した。それぞれの培養物の５mlから細胞を遠心分離により回収し、TRIS-HCl（pH 7.4, 50 mM）中で洗浄し、-70℃で凍結した。ペレットをTRIS-HCl（pH 7.4, 50mM）及びDTT（2 mM）を含有する450μlの緩衝液中に再懸濁し、超音波により破砕した。活性測定は、室温で逆反応について行った。反応混合物は、100 mM
TRIS, pH = 9.8、1 mM NAD⁺、及び5 mMアスパラギン酸を含有するものとした。３つの独立したクローンについての平均データを表７に示す。これらのデータにより、コドンの置換によって、E. coliにおいては比活性がいくらか増加するが、P. ananatisにおいてはそうならないことが示された。

【0126】

【表7】

【0127】

Ralstonia eutropha由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（orf h16_B0736, 配列番号７５）及びRhodopseudomonas palustris由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ORF1 RPB_0147, 配列番号７３及びORF2 RPB_3108, 配列番号７４）についても、レアコドンを置換したものをSloning BioTechnologyで化学合成し、pMIV5-JS-likeベクターにクローニングして、P_tacプロモーターの制御下に置いた。構築したプラスミドは、それぞれpMIV-ADH-Re、pMIV-ADH1-Rp、及びpMIV-ADH2-Rpと命名した。構築した全てのプラスミドを保有するE. coli MG1655株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の比較測定を行った。これらの株の一夜培養物を、クロラムフェニコール（50 mg/L）を添加したLBブロス中で生育させた。培養物は、5 g/Lグルコース、1 mM IPTG、及びクロラムフェニコール（50 mg/L）を含有するM9倍地中でOD₅₉₅＝0.1となるまで希釈し、OD₅₉₅＝1.0まで通気しながら+34℃でインキュベートした。それぞれの培養物の5
mlから細胞を遠心分離により回収し、TRIS-HCl（pH 7.4, 50 mM）中で洗浄し、-70℃で凍結した。ペレットをTRIS-HCl（pH 7.4, 50 mM）及びDTT（2 mM）を含有する450μlの緩衝液中に再懸濁し、超音波によって破砕した。活性測定は、室温で逆反応について行った。反応混合物は、100 mM TRIS, pH＝9.8、1 mM NAD⁺、及び5 mMアスパラギン酸を含有するものとした。２つの独立したクローンの平均データを表８に示す。これらのデータにより、Polaromonas sp. JS666由来の遺伝子を保持するプラスミド以外には、Rhodopseudomonas palustris由来の遺伝子の１つ（ORF2 RPB_3108）を保持するプラスミドによってのみ、検出可能なレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性が得られることが示された。
よって、高い活性レベルが得られるPolaromonas sp.に見出されるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を更なる解析のために選択した。

【0128】

【表8】

【0129】

更なる検討により、pMIV5-JS-likeベクターにクローニングされたRhodopseudomonas palustris由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH1-Rp)及びRalstonia eutropha由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH-Re)は、E. coli中では発現しないことが示された。これらの遺伝子は、これらの酵素の転写及び翻訳のために最適化されたpETベクターへ遺伝子を再クローニングすることにより、上首尾に発現するに至った。それぞれ実施例５及び実施例９を参照のこと。

【0130】

実施例３．Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製と特徴付け
同タンパク質（以下、ADHという）を、pET-ADH-P(S)プラスミドを保有するBL21(DE3)株から精製した。粗細胞抽出物の可溶性画分からのADHの精製手順は、硫酸アンモニウム溶液中での沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィ、及びアフィニティクロマトグラフィにより進めた。ADH活性は、29℃で340 nmにおける吸光度の増加を測定することにより分光学的に求めた。測定混合物は、1 mlの最終容量中に、0.1 M TRIS-HCl緩衝液、pH 9.8、1 mM
NAD⁺、5 mMアスパラギン酸を含有するものとした。結果を表９に示す。これらのデータにより、実行された手順の結果、20％の収率で77倍のADHの精製が行われたことが示される。精製したADHの均質性は、SDS/PAGEによって評価し、約（30±3）kDaの分子量を有する主要なバンドが得られた（図２）。決定されたADHの分子量は、その配列から予測される値（27.6kDa）に合致している。非変性（native）のADHの分子量はゲルろ過によって約（49±12）kDaと決定されており、このことから、この酵素の活性な形態はホモダイマーとして存在することが示唆される。

【0131】

【表9】

【0132】

精製したタンパク質をゲルから抽出し、トリプシンによって消化した。マススペクトル分析により、精製した酵素は、Polaromonas sp. JS666由来のBpro_3686アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質産物であることが証明された。

【0133】

HPLC分析により、in vitroでは、アスパラギン酸が、精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼにより触媒されるオキサロ酢酸の還元的アミノ化の直接的な反応の唯一の生成物であることが示された。

【0134】

温度安定性
精製したタンパク質の温度安定性を確認するために、その一定分量を20, 30, 34, 40, 50, 60 又は70℃で１時間インキュベートした。タンパク質の熱安定性は、ｘ軸に示す種々の温度で１時間予備インキュベートしたタンパク質の一定分量を使用し、標準的な正反応（29℃で、0.1 M TRIS-HCl緩衝液, pH 9.8、0.15 mM NADH、100 mM NH₄Cl、及び20 mMオキサロ酢酸）における残存活性を測定することにより評価した。0℃で保持したタンパク質を用いて測定した活性に対する、種々の温度でインキュベートしたタンパク質を用いて測定した活性の百分率として、結果を図１１に示す。検定は少なくとも２連で行い、エラーバーは、測定間の偏差を示す。

【0135】

図１１に示すように、20℃〜50℃の温度範囲でのインキュベートの後では、酵素活性の顕著な減少は観察されなかった。60℃でのインキュベートの後では、酵素は、その活性の約90％を失った。70℃でのインキュベートの後では、酵素活性の100％の喪失が観察された。よって、精製した酵素は、50℃までの温度ではかなり安定である。

【0136】

ADHの触媒作用についての至適pH及び基質特異性
ADHの正反応及び逆反応の触媒作用におけるpHの効果を決定した。結果を図１０に示す。正反応は、(a) 0.1M MES-NaOH緩衝液, pH 6〜7、(b) 0.1M TRIS-HCl緩衝液, pH 7〜9.8、又は(c) 0.05M Gly-NaOH緩衝液, pH 8〜11中で、0.15mM NADH、50mM NH₄Cl、及び10mMオキサロ酢酸を用いて行った。逆反応は、(d) 0.1M TRIS-HCl緩衝液, pH 8〜9.8、又は(e) 0.1M Gly-NaOH緩衝液, pH 9.8〜12中で、1mM NAD⁺及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。

【0137】

図１０から分かるように、ADHの正反応及び逆反応（それぞれ、アスパラギン酸の合成及びアスパラギン酸の酸化的脱アミノ化）の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領
域に観察された。精製したADHは、pH9〜10で正反応の最大活性を示した。逆反応の最大ADH活性は、pH9.8〜11で見られた。よって、pH 9.8の0.1 M TRIS-HCl緩衝液を、精製したADHの更なる特徴付けに使用した。

【0138】

精製したADHの、正反応及び逆反応における代替的な基質を同定するために、基質特異性のスクリーニングを行った。各10 mMのピルビン酸、α‐ケトグルタル酸、α‐ケト酪酸、ケトイソ吉草酸、及びケトメチル吉草酸について、29℃で0.15 mM NADH, 50 mM NH₄Clを用いた正反応における、オキサロ酢酸を代替する能力を試験した。各10 mMのグルタミン酸、アラニン、α‐アミノ酪酸、バリン、イソロイシン、アスパラギンについて、29℃で1 mMのNAD⁺を用いた逆反応における、アスパラギン酸を代替する能力を試験した。これらの基質の全てについて活性は認められず、この酵素は、オキサロ酢酸及びL-アスパラギン酸に対して厳密に特異的である。

【0139】

動力学的パラメータ（kinetic parameters）
精製した野生型（native）のADHについて、正反応及び逆反応において、詳細な動力学的特徴付け（kinetic characterization）を行った。正反応におけるADHの動力学的解析は、0.15 mM NADH及び100 mM NH₄Clにおいて基質（オキサロ酢酸）濃度を0.5〜20 mMに変動させることにより、0.15 mM NADH及び20 mMオキサロ酢酸においてアンモニウム（NH₄Cl）濃度を6〜125 mMに変動させることにより、および20 mMオキサロ酢酸及び100 mM NH₄Clにおいて補酵素（NADH又はNADPH）の濃度を0.017〜0.35 mMに変動させることにより、実施した。逆反応におけるADHの動力学的解析は、2 mM NAD⁺において基質（アスパラギン酸）濃度を0.1〜40 mMに変動させることにより、および20 mMアスパラギン酸において補酵素（NAD⁺又はNADP⁺）の濃度を0.06〜4 mMに変動させることにより、実施した。結果を表１０に示す。表１０から分かるように、補酵素特異性に関しては、NADHに対するADHの触媒効率（k_cat /K_m）は、NADPHに対するものより約３倍高く、NAD⁺に対する触媒効率は、NADP⁺に対するものより約５倍高かった。すなわち、ADHは、正反応においてはNADPHよりもNADHに対してより良好な親和性を有し、逆反応においてはNADP⁺よりもNAD⁺に対してより良好な親和性を有する。正反応と逆反応とを比較すると、ADHは、NADH又はNADPHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を、アスパラギン酸の脱アミノ化より約３倍〜１０倍高い速度で触媒した。

【0140】

【表10】

^ａK_m及びV_maxパラメータは、ミカエリス−メンテンの反応速度式のプロットから求めた。
^ｂこれらの反応についてシグモイド曲線が観察されたことから、動力学的パラメータは、ヒルの反応速度式のプロットから求めた。計算されたヒル係数は次の通りである：NADHについて1.71±0.13及びNADPHについて1.37±0.08。
全てのデータフィッティング手順は、Sigma Plot 8.0プログラムを用いて実行した。k_cat及びk_cat / K_m値は、ADHの分子量（27.57 kDaに等しい）に基づいて計算した。

【0141】

ADHの調節特性（regulatory properties）
ADHの活性は、正反応及び逆反応において、1 mMのピルビン酸、α‐ケトグルタル酸、グルタミン酸、リンゴ酸、補酵素Ａ、又はアセチル補酵素Ａ（acetyl-coenzyme A）の添加によっては顕著な影響を受けなかった。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの測定は、ｙ軸に示すそれぞれの代謝産物1 mMの存在下で、正反応（0.1 M TRIS-HCl緩衝液, pH 9.8、0.15 mM NADH、100 mM NH₄Cl、及び20mMオキサロ酢酸）及び逆反応（0.1 M TRIS-HCl緩衝液, pH 9.8、2 mM NAD⁺、及び20 mMアスパラギン酸）について29℃で実施した。代謝産物の非存在下で測定された活性に対する代謝産物の存在下での活性の百分率として、結果を図１２に示す。測定は少なくとも２連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。

【0142】

1 mMのオキサロ酢酸又はNH₄Clの添加は、逆反応であるアスパラギン酸脱アミノ化を顕著には阻害しなかった。アスパラギン酸について、1〜100 mMの濃度範囲において、正反応であるアスパラギン酸合成を阻害する能力を試験した。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの測定は、アスパラギン酸を添加して、あるいは添加しないで、0.1 M TRIS-HCl緩衝液, pH 9.8、0.15 mM NADH、100 mM NH₄Cl、及び20 mMオキサロ酢酸中で29℃で実施した。アスパラギン酸の非存在下で測定された活性に対するアスパラギン酸の存在下での活性の百分率として、結果を図１３に示す。測定は、少なくとも２連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。図１３に示すように、100 mMのアスパラギン酸の添加により、酵素活性は３倍減少したのみであった。

【0143】

Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの生物学的役割の検討
Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの生体内（in vivo）での機能を解明するために、E. coli ΔaspCΔtyrB変異の相補実験を行った。ΔaspCΔtyrB株は、L-アスパラギン酸及びL-チロシンの要求性である。構築したPolaromonas sp.由来のBpro_3686アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するpMIV-ADH-P(S)プラスミド及びpMIV5-JAベクターを、E. coli MG1655ΔaspCΔtyrB株に導入した。pMIV5-JSベクターを保有するE. coli MG1655株を陽性対照として使用した。相補性を試験するために、得られたプラスミド株を、唯一炭素源であるグルコース（10 g/L）、Tyr（0.1 g/L）、及びクロラムフェニコール（50 mg/L）を含有するM-9培地上に再ストリークした。前記示したM9培地上でのMG1655ΔaspCΔtyrB株の生育物からpMIV-ADH-P(S)プラスミドを回収した。

【0144】

逆反応については、E. coliにおけるΔaspA変異の相補性を試験した。ΔaspA株は、L-アスパラギン酸を唯一炭素源として利用することができない。E. coli MG1655ΔaspA-PL-gltSへpMIV-ADH-P(S)プラスミドを導入することにより、唯一炭素源であるアスパラギン酸（10 g/L）及びクロラムフェニコール（50 mg/L）を含有するM-9培地上におけるこの株の生育がもたらされた。MG1655ΔaspA-PL-gltS/pMIV5-JSを陰性対照として使用した。

【0145】

よって、E. coliにおいて、Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するプラスミドによるΔaspCΔtyrB及びΔaspA変異の相補が証明された。結果的に得られたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸の生合成および異化の両方に関与しているようである。

【0146】

実施例４．Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のP. ananatisアスパラギン酸生産株への導入
Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を、組込み型pMIV-ADH-P(S)-allプラスミドを使用したminiMu依存的な手順によって、5ΔP2RMG-S株に組み込んだ。5ΔP2RMG-S株の構築については参考例１に記載されている。最良のRMG::ADH(P)組込み体の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定を行った。組込み体用に50 mg/Lのクロラムフェニコールを添加した5 g/Lのグルコースを含有するLB-M91/2培地中で培養物を９時間生育させた。その後、これら培養物を、0.1 mM IPTGを添加した10 g/Lのグルコース及び3 g/LのL-Gluを含有する試験管発酵用の標準的な培地（pH 6、CaCO₃
を含まない）で1：30に希釈して最終容量10 mlとした。

【0147】

結果的に得られた培養物を、+34℃で16時間通気しながら試験管内で培養した。その後、遠心分離によって細胞を回収し、50mM TRIS, pH 7.4を用いて洗浄して凍結した。ペレットを50mM TRIS, pH 7.4及び2 mM DTTを含有する緩衝液中に再懸濁し、超音波によって細胞を破砕した。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定は、+26℃で、正反応及び逆反応について行った。一方の反応混合物は、100 mM TRIS, pH 9.8、2 mM NAD⁺、及び10
mMアスパラギン酸を含有するものとした。他方の反応混合物は、100 mM TRIS, pH 9.8、0.15 mM NADH、100 mM NH₄Cl、及び20 mMオキサロ酢酸を含有するものとした。アスパラギン酸なしのプローブを正反応における対照として使用した。NH₄Clなしのプローブを逆反応における対照として使用した。結果を表１１に示す。表１１のデータは、E. coli BL21(DE3)/pET-ADH-P(S)株において測定される比活性と同等の高いレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を示す。

【0148】

【表11】

【0149】

RMG::ADH(P)組込み体の試験管培養を行った。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現誘導のために、0.1 mM IPTGを標準的な培地（初発グルコース40 g/L、初発L-Glu 3
g/L）に補填した。+34℃での72時間の培養を実施した。３つの独立した培養の平均データを表１２に示す。表１２に示されるように、最良の組込み体によるアスパラギン酸の蓄積は、対照よりも約２培高かった。したがって、Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸発酵におけるオキサロ酢酸のアミノ化に活用することができる。

【0150】

【表12】

【0151】

実施例５．Rhodopseudomonas palustris HaA2由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製と特徴付け
Rhodopseudomonas palustris HaA2由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子RPB_0147のクローニング
上述したように（実施例２参照）、Rhodopseudomonas palustris HaA2由来のRPB_0147遺伝子を、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として、分析のために選択した。そのタンパク質産物は、Thermotoga maritima由来の公知のTM1643アスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して28％の相同性を有し、見出されたPolaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して同様のレベルの相同性（34％の同一性）を有する。RPB_0147遺伝子は、トランスポーター（transporter）をコードする遺伝子及び推定上の１価陽イオン／H⁺アンチポーター（antiporter）をコードする遺伝子の近傍に位置する。すなわち、R. palustris RPB_0147の遺伝子環境（gene surroundings）は、T. maritima及びPolaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子環境とは異なる。R. palustris由来の酵素は新規な特徴を有し得ると想定された。

【0152】

R. palustris由来のRPB_0147遺伝子のmRNAが効果的に翻訳されるように、レアコドンを置換した遺伝子のバリアント（配列番号７３）をSloning BioTechnology, GmbH（ドイツ）に発注し、さらにpET-15bベクターにサブクローニングして、P_T7プロモーター、T7翻訳開始点、RBS_Φ10、His-Tagコード配列、それに続くトロンビン部位を含むT7発現領域の下に置いた。このために、レアコドンを置換したR. palustris RPB_0147遺伝子のORFを含むpPCRScript_AspDH1-RpプラスミドのNdeI-BamHI断片を、同じNdeI及びBamHIエンドヌクレアーゼを用いて消化したpET-15bベクターとライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpET15-ADH1-Rpとした。pET15-ADH1-Rpプラスミドの構築のスキームを図１５に示す。クローニングした断片のDNA配列の正確性を確認するために、構築したプラスミドの構成におけるクローニングした遺伝子の塩基配列を、サンガーの方法（Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467）を使用してVostok社（ロシア）で決定した。この結果、pET15-ADH1-Rpのクローン７及び８は、期待されるDNA配列を有するクローニング遺伝子を含んでいた。

【0153】

得られたpET15-ADH1-Rpプラスミドを、染色体中にT7 RNAポリメラーゼの遺伝子を保持するBL21(DE3)株に形質転換した。pET-15bベクターを保有する株を陰性対照として使用した。細胞を、OD₅₉₅＝0.9となるまで+37℃でアンピシリン（120 mg/L）を含むLB培地中で培養した。その後、1 mMのIPTGを添加し、細胞を２時間培養した。1.5 ml分の細胞を、50
mM TRIS pH 7.5、1 mM DTT、及び1 mM EDTAを含有する緩衝液中で超音波により破砕した。IPTGによる誘導後には、可溶性及び不溶性画分において、期待される大きさ（30.6 kDa）のタンパク質の高いレベルの蓄積が観察された（図１６）。

【0154】

細胞を、アンピシリン（120 mg/L）を含むLB培地中で+37℃でOD₅₉₅＝0.9となるまで培養した。その後、1 mM IPTGを添加し、細胞を２時間培養した。測定は室温（+30℃）で行った。脱アミノ化反応用の反応混合物は、100 mM TRIS-HCl, pH 9.8、2 mM NAD(P)⁺ 、及び10 mMアスパラギン酸ナトリウム（pH 7.0）を含有するものとした。アミノ化反応用の反応混合物は、100 mM TRIS-HCl, pH 9.8、100 mM NH₄Cl、0.15 mM NAD(P)、及び20 mMオキサロ酢酸（pH 7.0）を含有するものとした。粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性の測定により、室温（+30℃）における高いレベルのNADP(H)依存性アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの活性が示された（表１３）。すなわち、Rhodopseudomonas palustris由来のクローニングしたRPB_0147遺伝子は、室温で活性のある新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1-Rp）をコードするものであった。

【0155】

【表13】

【0156】

Rhodopseudomonas palustris由来の見出されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ１の精製と特徴付け
Rhodopseudomonas palustrisからクローニングされた新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1-Rp）を、pET15-ADH1-Rpプラスミドを保有するE. coli BL21(DE3)株のクローン８から精製した。アンピシリン（120 mg/L）を補填した30 mlのLBブロス中で生育させた一夜培養物を、200 mlの同じ培地で1：100に希釈し、OD₅₉₅＝1となるまで+37℃でフラスコ中で培養した。その後、1 mM IPTGを添加して細胞を誘導した。２時間の培養の後、1 Lの培養物から細胞を遠心分離によって回収し、使用するまで-70℃で保存した。凍結した細胞を融解し、10 mlの緩衝液Ａ（20 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0、0.5 M NaCl、20
mMイミダゾール）中に懸濁し、p = 2000 psiでFrench pressure cell（Thermo spectronic）を２回通過させることおよび超音波によって破砕した後、遠心分離を行って破片を除去した。N末端に６×Ｈｉｓ融合タグ（hexa-histidine fusion tag）を付加して発現させた組換えアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、HisTrap HPカラム（Amersham Pharmacia Biotech, UK）を製造業元の推奨する通りに使用して精製した。溶出は、緩衝液Ｂ（20 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0、0.5 M NaCl）中のイミダゾールの20〜500 mMのリニアグラジエントにより実施した。活性な画分をプールし、緩衝液Ｃ（20 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0、1 mM DTT、1 mM EDTA、15％グリセリン）を用いて平衡化したPD-10脱塩カラム（Amersham Pharmacia Biotech, UK）でのゲルろ過によって脱塩した。精製した酵素は一定分量に小分けにし、使用するまで-70℃で保存した。

【0157】

使用した手順の結果、Rhodopseudomonas palustris ADH1-Rpは、19％の収率で５倍に精製された。精製したADHの均質性をSDS/PAGEによって評価し、約31 kDaの分子量の主要なバンドが得られた（図１７）。決定したADH1-Rpの分子量は、その配列から予測される値（30.6kDa）と合致している。

【0158】

至適pH
アミノ化反応は、(a) 0.1M MES-NaOH緩衝液, pH 6〜7、(b) 0.1M TRIS-HCl緩衝液, pH 7〜9.8、又は(c) 0.05M Gly-NaOH緩衝液, pH 8〜11中で、0.15mM NADPH、100mM NH₄Cl、及び20mMオキサロ酢酸を用いて行った。脱アミノ化反応は、(d) 0.1 M TRIS-HCl緩衝液, pH 8〜9.8、又は(e) 0.05M Gly-NaOH緩衝液, pH 9〜12中で、1mM NADP⁺及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。測定は少なくとも２連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。

【0159】

Rhodopseudomonas palustris ADH1-Rpのオキサロ酢酸アミノ化反応及びアスパラギン酸脱アミノ化反応の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領域に観察された（図１８）。精製したADH1-Rpは、pH 9.0でアミノ化反応についての最大活性を示した。脱アミノ化反応についての最大のADH1-Rp活性は、pH 9.8に見られた。よって、pH 9.0及び9.8の0.1
M TRIS-HCl緩衝液を、それぞれ、アミノ化反応及び脱アミノ化反応における精製したADH1-Rpの更なる特徴付けのために使用した。

【0160】

動力学的パラメータ
精製したRhodopseudomonas palustris ADH1-Rpについて、アミノ化反応及び脱アミノ化反応において、詳細な動力学的特徴付けを行った。アミノ化反応におけるADH1-Rpの動力学的解析は、0.15 mM NADPH及び100 mM NH₄Clにおいて基質（オキサロ酢酸）濃度を1.3〜20 mMに変動させることにより、0.15 mM NADPH及び20 mMオキサロ酢酸においてアンモニウム（NH₄Cl）濃度を1〜100 mMに変動させることにより、20 mMオキサロ酢酸及び100 mM NH₄ClにおいてNADPHの濃度を0.025〜0.400 mMに変動させることにより、および20 mMオキサロ酢酸及び100 mM NH₄ClにおいてNADHの濃度を0.050〜5 mMに変動させることにより、実施した。脱アミノ化反応におけるADH1-Rpの動力学的解析は、1 mM NADP⁺において基質（アスパラギン酸）濃度を1〜60 mMに変動させることにより、40 mMアスパラギン酸においてNADP⁺の濃度を0.015〜1 mMに変動させることにより、および40 mMアスパラギン酸においてNAD⁺の濃度を0.5〜12 mMに変動させることにより、実施した。全てのデータフィッティング手順は、Sigma Plot 8.0プログラムを用いて実行した。k_cat及びk_cat / K_m値は、ADH1-Rpの分子量（30.63 kDaに等しい）に基づいて計算した。得られたデータを表１４に示す。K_m及びV_maxパラメータは、ミカエリス−メンテンの反応速度式のプロットから求めた。補酵素特異性に関しては、NADPHに対するADH1-Rpの触媒効率（k_cat / K_m）は、NADHに対するものより約72倍高く、NADP⁺に対する触媒効率は、NAD⁺に対するものより約103倍高かった。すなわち、ADH1-Rpは、正反応においてはNADHよりもNADPHに対して極めて良好な親和性を有し、逆反応においてはNAD⁺よりもNADP⁺に対して極めて良好な親和性を有する。アミノ化反応と脱アミノ化反応とを比較すると、ADH1-Rpは、アスパラギン酸の脱アミノ化についての場合より約４倍〜５倍高い速度で、NADPH又はNADHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を触媒した。

【0161】

【表14】

【0162】

要約
１．Rhodopseudomonas palustris ADH1-Rpは、アルカリ性条件下（pH 9.0及びpH 9.8）で、in vitroでのアスパラギン酸合成の反応を、逆反応であるアスパラギン酸の脱アミノ化よりも効率的に（４〜５倍）触媒する。また、pH 7.0の生理的条件下では、アミノ化反応のみが検出された。
２．アンモニウム（NH₄Cl）に対する決定されたK_m値は11 mMである。この値は、Polaromonas sp.のADHについて決定されたNH₄Clに対するK_m値（33 mM）より３倍低い。
３．NADPH及びNADPは、in vitroで、Rhodopseudomonas palustris ADH1-Rpのより好適な（70〜100倍）補因子である。
４．NADPH及びNADHに対する決定されたK_m値は、それぞれ0.210 mM及び4.5 mMである。一方、同ピリジンヌクレオチドのE. coli細胞内での典型的な濃度は、0.15mM NADPH及び0.02 mM NADHである（T Penfound & JW Faster, 1996. Biosynthesis and Recycling of NAD. In: Neidhardt, F.C. (ed), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, Washington, DC, pp. 721-730）。よって、生体内（in vivo）では、Rhodopseudomonas palustris由来のADH1-Rpは、オキサロ酢酸のアミノ化反応における補因子としてNADPHのみを利用し得ると言えよう。

【0163】

実施例６．公知のADH1-Rpのホモログおよびそれらの遺伝子環境の解析に基づく、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の検索
実施例２に記載したように、穏やかな（moderate）温度（+29℃）で活性なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするPolaromonas sp. JS666由来のBpro_3686遺伝子が見出された。アスパラギン酸生合成に最適な新たな酵素を見出すために、Polaromonas sp.のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのBlastp（タンパク質‐タンパク質BLAST（protein-protein BLAST））解析を実施した。このタンパク質の完全長ホモログは、多くの群の細菌及び古細菌に見出された（図１９及び２０）。このタンパク質に近縁なホモログ（同一性50〜71％）は、Ralstonia, Burkholderia, Comamonas testosteroni, Delftia acidovorans, Cupriavidus taiwanensis及びPseudomonas aeruginosaに見出された。

【0164】

見出されたPolaromonas sp. JS666由来の新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの全ホモログは、このようなホモログをコードする遺伝子の機能的な染色体環境に基づいて分類した。

【0165】

Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、チアミンピロリン酸酵素をコードする遺伝子及びベタイン−アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の近傍に位置していた。第１の群には、同一の遺伝子環境を有する推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。Thermotoga maritima由来の公知のTM1643遺伝子（Yang Zh, Savchenko A, Yakunin A, Zhang R, Edwards A, Arrowsmith C, Tong L. Aspartate dehydrogenase, a novel enzyme identified from structural and functional studies of TM1643. 2003. J Biol Chem, 278(10): 8804-8808）は、キノリネート合成酵素Ａ及びニコチネート−ヌクレオチドピロホスホリラーゼをそれぞれコードするnadA及びnadC遺伝子とオペロンを構成する。また、第２の群には、T. maritima由来の遺伝子に体系づけられた推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。第３の群には、トランスポーターをコードする遺伝子の近傍に位置する推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。第４の群には、lysRファミリーの遺伝子の近傍に位置する推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。弱いホモログの一群は異なる遺伝子環境を有しており、分類を行わなかった。

【0166】

Mesorhizobium sp. BNC1由来のMeso_0824遺伝子（配列番号６９）を、Polaromonas sp.由来の遺伝子と同一の遺伝子環境を有する第１の群のホモログの候補として選択した。これは、群の中で最も弱い相同性を有している（Polaromonas sp. JS666由来のBpro_3686遺伝子に対して42％のアミノ酸同一性）。

【0167】

Nitrosopumilus maritimus SCM1由来のNmar_1240遺伝子（配列番号７１）（32％のアミノ酸同一性）を、T. maritima由来の遺伝子に類似する遺伝子環境を有する第２の群のホモログの候補として選択した。T. maritimaとは対照的に、Nitrosopumilus maritimusは、穏やかな温度（25〜40℃）で生存する非好熱性の生物である。

【0168】

Azorhizobium caulinodans ORS 571由来のAZC_4388遺伝子（配列番号６７）（Polaromonas sp. JS666由来のBpro_3686遺伝子に対して45％のアミノ酸同一性）及びBradyrhizobium japonicum USDA 110由来のbll6567遺伝子（配列番号６８）（Polaromonas sp. JS666由来のBpro_3686遺伝子に対して35％のアミノ酸同一性）を、２つのホモログ群からの候補として選択した。両生物は、共生性の窒素固定細菌であり、植物において根粒（nodule）の形成を引き起こし得る。窒素固定細菌は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの探索において、見込みのある対象であり得る。これは、アスパラギン酸は、根粒の植物体部分のみならずバクテロイド部分においても、オキサロ酢酸の還元的なアミノ化を介して合成され得るからである（Kretovich WL, Kariakina TI, Weinova MK, Sidelnikova LI and Kazakova OW. The synthesis of aspartic acid in Rhizobium lupini bacteroids. Plant Soil 1981. 61: 145-156）。

【0169】

Corynebacterium glutamicum R由来の仮想タンパク質をコードするcgR_1126遺伝子（配列番号７０）及びOceanicola granulosus由来のOG2516_00504遺伝子を、弱いホモログから選択した（Polaromonas sp. JS666由来のBpro_3686遺伝子に対して、それぞれ31％及び30％のアミノ酸同一性）。

【0170】

E. coli及びP. ananatisで上記遺伝子が効率的に翻訳されるように、全てのレアコドンが同義の頻出コドンに置換されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード部分を含むDNA断片の化学合成及びクローニングを、Sloning BioTechnology, GmbH（ドイツ）に発注した。全てのレアコドンの置換を含む遺伝子の塩基配列を配列表のセクションに示す。Rhodopseudomonas palustris HaA2由来の改変されたRPB_0147遺伝子（配列番号７３）、Rhodopseudomonas palustris HaA2由来の改変されたRPB_3108遺伝子（配列番号７４）、Ralstonia eutropha由来の改変されたh16_B0736遺伝子（配列番号７５）、Azorhizobium caulinodans ORS 571由来の改変されたAZC_4388遺伝子（配列番号７６）、Bradyrhizobium japonicum USDA 110由来の改変されたbll6567遺伝子（配列番号７７）、Mesorhizobium sp. BNC1由来の改変されたMeso_0824遺伝子（配列番号７８）、Corynebacterium glutamicum R由来の改変されたcgR_1126遺伝子（配列番号７９）、Nitrosopumilus maritimus
SCM1由来の改変されたNmar_1240（配列番号８０）、及びOceanicola granulosus由来の改変されたOG2516_00504遺伝子（配列番号８１）がある。

【0171】

実施例７．Ralstonia eutropha H16由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ADH-Re）の精製と特徴付け
Ralstonia eutropha H16由来の新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子h16_B0736のクローニング
上述したように（実施例２参照）、Ralstonia eutropha H16由来のh16_B0736遺伝子を、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として、分析のために選択した。そのタンパク質産物は、Thermotoga maritima由来の公知のTM1643アスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して31％の相同性を有し、Polaromonas sp.由来の見出されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して高いレベルの相同性を有する（68％の同一性）。Ralstonia eutropha由来の遺伝子のmRNAが効果的に翻訳されるように、レアコドンを置換した遺伝子のバリアントをpET-15bベクターにサブクローニングして、P_T7プロモーター、T7翻訳開始点、RBS_Φ10、His-Tagコード配列、それに続くトロンビン部位を含むT7発現領域の下に置いた。このために、pPCRScript_AspDH1-ReプラスミドをNdeI及びBamHI制限酵素を用いて消
化した。レアコドンを置換したRalstonia eutropha h16_B0736遺伝子のORFを含むプラスミド断片を、同一のエンドヌクレアーゼ（NdeI及びBamHI）を用いて消化したpET-15bベクターとライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpET15-ADH-Re（図２２）とした。クローニングした断片の一次構造は、配列解析によって明らかにした。プライマーSeq-adh-P5（配列番号２３）及びsvs-3（配列番号９４）を配列決定のために使用した。

【0172】

pET15-ADH-Reプラスミドを保有するBL21(DE3)株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性の予備的な測定を行った。pET-15bベクターを保有する株を陰性対照として使用した。細胞を、OD₅₉₅＝0.9となるまで+37℃でアンピシリン（120 mg/L）を含むLB培地中で培養した。その後、1 mMのIPTGを添加し、細胞を２時間培養した。測定は室温で行った。反応混合物は、100 mM TRIS-HCl, pH 9.8、2 mM NAD(P)⁺ 、及び10 mMアスパラギン酸ナトリウム（pH 7.0）を含有するものとした。1.5 ml分の細胞を、50 mM TRIS
pH 7.5、1 mM DTT、及び1 mM EDTAを含有する緩衝液中で超音波により破砕した。表１５に示すように、このプラスミドは、かなり低いレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性をもたらす。NAD⁺は、少なくともアスパラギン酸の脱アミノ化反応においては、好適な補因子である。

【0173】

【表15】

【0174】

pET15-ADH-Reプラスミドを保有するBL21(DE3)株の粗抽出物から調製した可溶性画分及び不溶性画分のSDS/PAAG電気泳動を行った。図２３に示すように、可溶性画分において、約33 kDaの分子量を有するタンパク質の高いレベルの蓄積が観察された。この結果は、コンピュータ計算によるタンパク質のMwと合致するものであった。

【0175】

新規なRalstonia eutrophaアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、pET15-ADH-Reプラスミドを保有するE. coli BL21(DE3)株のクローン４から精製した。N末端に６×Ｈｉｓ融合タグ（hexa-histidine fusion tag）を付加して発現させた組換えアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを粗抽出物の可溶性画分から精製する手順は、アフィニティクロマトグラフィに基づくものとした。使用した手順の結果、ADH-Reは、20％の収率で４倍に精製された。精製したADH-Reの均質性をSDS/PAGEによって評価し、約33〜34 kDaの分子量を有する主要なバンドが得られた（図２４参照）。

【0176】

至適pH
Ralstonia eutropha ADH-Reのオキサロ酢酸アミノ化反応及びアスパラギン酸脱アミノ化反応の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領域に観察された（図２５）。アミノ化反応は、(a) 0.1M MES-NaOH緩衝液, pH 6〜7、(b) 0.1M TRIS-HCl緩衝液, pH 7〜9.8、
又は(c) 0.05M Gly-NaOH緩衝液, pH 8〜11中で、0.15mM NADH、100mM NH₄Cl、及び20mMオキサロ酢酸を用いて行った。脱アミノ化反応は、(d) 0.1 M TRIS-HCl緩衝液, pH 7〜9.8、又は(e) 0.05M Gly-NaOH緩衝液, pH 9〜12中で、2mM NAD⁺及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。測定は少なくとも２連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。精製したADH-Reは、pH 9でアミノ化反応についての最大活性を示した。脱アミノ化反応についての最大のADH-Re活性は、pH 9.8〜11で見られた。よって、pH 9及び9.8の0.1 M TRIS-HCl緩衝液を、それぞれ、アミノ化反応及び脱アミノ化反応における精製したADH-Reの更なる特徴付けのために使用した。なお、pH 7.0の生理的条件下では、高いレベルの活性はアミノ化反応においてのみ検出されたことに注目されたい。

【0177】

動力学的パラメータ
精製したRalstonia eutropha ADH-Reについて、アミノ化反応及び脱アミノ化反応において、詳細な動力学的特徴付けを行った（表１６）。アンモニウム（NH₄Cl）に対する決定されたK_m値は12 mMである。これは、Polaromonas sp. ADHについて決定されたNH₄Clに対するK_m値（33 mM）より３倍低い。

【0178】

【表16】

^a)アミノ化反応におけるADH-Reの動力学的解析は、0.15 mM NADH及び50 mM NH₄Clにおいて基質（オキサロ酢酸）濃度を0.3〜20 mMに変動させることにより、0.15 mM NADH及び20 mMオキサロ酢酸においてアンモニウム（NH₄Cl）濃度を0.7〜50 mMに変動させることにより、20 mMオキサロ酢酸及び50 mM NH₄ClにおいてNADHの濃度を0.040〜0.800 mMに変動させることにより、および20 mMオキサロ酢酸及び50 mM NH₄ClにおいてNADPHの濃度を0.025〜1.200 mMに変動させることにより、実施した。脱アミノ化反応におけるADH-Reの動力学的解析は、2 mM NAD⁺において基質（アスパラギン酸）濃度を2.5〜40 mMに変動させることにより、40 mMアスパラギン酸においてNAD⁺の濃度を0.2〜8 mMに変動させることにより、および40 mMアスパラギン酸においてNADP⁺の濃度を0.5〜8 mMに変動させることにより、実施した。全てのデータフィッティング手順は、Sigma Plot 8.0プログラムを用いて実行した。
^b) K_m及びV_maxパラメータは、ミカエリス−メンテンの反応速度式のプロットから求めた。
^c)この反応についてシグモイド曲線が観察されたことから、動力学的パラメータは、ヒルの反応速度式のプロットから求めた。計算されたヒル係数は1.6±0.1であった。
^d) k_cat及びk_cat / K_m値は、ADH-Reの分子量（29.94 kDaに等しい）に基づいて計算した。

【0179】

NADPH飽和曲線は、古典的なミカエリス−メンテンの双曲線というよりは、むしろ、正のヒル係数（1.6±0.1）を有するシグモイドであることが見出された。一方、オキサロ酢酸の飽和曲線及びアンモニウムの飽和曲線の両者は双曲線であった。天然（native）のADH-Reは、協同的にNADPHに結合する２つのザイモフォア（zymophore）を有すると見られる。補酵素特異性に関しては、NADHに対するADH-Reの触媒効率（k_cat / K_m）は、NADPHに対するものより約２〜３倍高く、NAD⁺に対する触媒効率は、NADP⁺に対するものより約６倍高かった。すなわち、ADH-Reは、アミノ化反応においてはNADPHに対してよりもNADHに対して幾分良好な親和性を有し、脱アミノ化反応においてはNADP⁺に対してよりもNAD⁺に対して幾分良好な親和性を有する。アミノ化反応と脱アミノ化反応とを比較すると、ADH-Reは、NADH又はNADPHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を、アスパラギン酸の脱アミノ化より約30倍又は60〜90倍高い速度で触媒した。

【0180】

要約
１． Ralstonia eutropha L-ADH-Reは、アルカリ性条件下（pH 9及びpH 9.8）で、in vitroでのアスパラギン酸合成の反応を、逆反応であるアスパラギン酸の脱アミノ化よりも効率的に（30〜90倍）触媒する。また、pH 7.0の生理的条件下では、アミノ化反応のみが検出された。
２．アンモニウム（NH₄Cl）に対する決定されたK_m値は12 mMである。これは、Polaromonas sp.のADHについて決定されたNH₄Clに対するK_m値（33 mM）より３倍低い。
３．NADH及びNADは、in vitroで、Ralstonia eutropha ADH-Reの幾分好適な（２〜６倍）補因子である。
４．NADH及びNADPHに対する決定されたK_m値は、それぞれ0.87 mM及び0.39〜0.9 mMである。これらの値は、典型的な細胞内濃度（E. coli細胞内では0.02 mM NADH及び0.15mM NADPH）と比較してかなり高い。よって、生体内（in vivo）では、ADH-Reの触媒作用には、NAD(P)Hが過剰となる必要があり得る。

【0181】

実施例８．Bradyrhizobium japonicum由来の新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ADH-Bj）の精製と特徴付け
上述したように（実施例６参照）、Bradyrhizobium japonicum USDA 110由来のbll6567を、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として選択した。そのタンパク質産物は、Rhodopseudomonas palustris由来のNADPH依存性アスパラギン酸デヒドロゲナーゼADH1-Rpの最も相同なホモログである（73％の同一性）。一方、B. japonicum及びR. palustrisにおけるこれらの遺伝子の周囲の遺伝子は相異する（R. palustris RPB_0147遺伝子は、トランスポーターをコードする遺伝子及び推定上の１価陽イオン／H⁺アンチポーターをコードする遺伝子の近傍に位置している。B. japonicum bll6567遺伝子は、LysRファミリー転写レギュレーターの近傍に位置している）。そこで、本願発明者らは、B. japonicum由来の酵素が新規な特徴を有していることを提唱した。

【0182】

B. japonicum由来の遺伝子のmRNAが効果的に翻訳されるように、レアコドンを置換したbll6567遺伝子のバリアントを、Sloning BioTechnology, GmbH（ドイツ）により提供されたpSlo3.1A_AspDH-BjプラスミドからpET-15bベクターにサブクローニングし、P_T7プロモーター、T7翻訳開始点、RBS_Φ10、His-Tagコード配列を含むT7発現領域の下に置いた。このために、レアコドンを置換したB. japonicum bll6567遺伝子のORFを含むpSlo3.1A_AspDH-BjプラスミドのXbaI-BamHI断片を、同じエンドヌクレアーゼ（XbaI及びBamHI）を用いて消化したpET-15bベクターとライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpET15-ADH-Bjとした。クローニングした断片の一次構造は、配列解析によって明らかにした。
プライマーSeq-adh-P5（配列番号２３）及びsvs-3（配列番号９４）を配列決定のために使用した。

【0183】

pET15-ADH-Bjプラスミドを保有するBL21(DE3)株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性の予備的な測定を行った。pET-15bベクターを保有する株を陰性対照として使用した。細胞を、OD₅₉₅＝1となるまで、+37℃でアンピシリン（200 mg/L）を含むLB培地中で培養した。その後、1 mMのIPTGを添加し、細胞を２時間培養した。1.5 ml分の細胞を、50 mM TRIS pH 7.5、1 mM DTTを含有する緩衝液中で超音波により破砕した。NADP(H)依存性アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性は、室温（+28℃）で観察された。SDS/PAAG電気泳動により、可溶性及び不溶性画分において、約30kDaの分子量を有するタンパク質の高いレベルの蓄積が示された（図２６）。この結果は、コンピュータ計算によるタンパク質のMw（30.76kDa）と合致するものであった。

【0184】

新規なBradyrhizobium japonicum ADH-Bj は、pET15-ADH-Bjプラスミドを保有するE. coli BL21(DE3)株のクローン１から精製した。組換えhis6-tagアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製のためにIMACを使用した。使用した手順の結果、ADH-Bjは、53％の収率で28倍に精製された。精製したADH-Bjの均質性をSDS/PAGEによって評価し、約30 kDaの分子量を有する主要なバンドが得られた（図２７）。決定されたADH-Bjの分子量は、その配列から予測される値（30,76 kDa）に合致していた。

【0185】

至適pH
アミノ化反応は、(a) 0.1M MES-NaOH緩衝液, pH 6〜7、(b) 0.1M TRIS-HCl緩衝液, pH 7〜9.8、又は(c) 0.05M Gly-NaOH緩衝液, pH 8〜11中で、0.15mM NADPH、100mM NH₄Cl、及び20mMオキサロ酢酸を用いて行った。脱アミノ化反応は、(d) 0.1 M TRIS-HCl緩衝液, pH 8〜9.8、又は(e) 0.05M Gly-NaOH緩衝液, pH 9.8〜11中で、2mM NADP⁺及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。測定は少なくとも２連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。Bradyrhizobium japonicum ADH-Bjのオキサロ酢酸アミノ化反応の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領域に観察された（図２８）。精製したADH-Bjは、pH 8〜9でアミノ化反応についての最大活性を示した。よって、0.1 M TRIS-HCl緩衝液（pH 9）を、精製したADH-Bjのアミノ化反応における更なる特徴付けに使用した。脱アミノ化反応についての最大のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性は、0.1 M TRIS-HCl緩衝液中でpH 9.8で見られた（図２８）。よって、この緩衝液を、脱アミノ化反応における精製したADH-Bjの更なる特徴付けに使用した。

【0186】

動力学的パラメータ
精製したBradyrhizobium japonicum ADH-Bjについて、アミノ化反応及び脱アミノ化反応において、詳細な動力学的特徴付けを行った（表１７）。K_m及びV_maxパラメータは、ミカエリス−メンテンの反応速度式のプロットから決定した。アンモニウム（NH₄Cl）に対する決定されたK_m値は4.3 mMである。これは、Polaromonas sp. ADHについて決定されたアンモニウム（NH₄Cl）に対するK_m値（33 mM）より８倍低い。NADPHに対する決定されたK_m値は0.032 mMである。これは、E. coli細胞内の典型的なNADPH濃度（0.15 mM）より５倍低い。よって、生体内（in vivo）では、Bradyrhizobium japonicum ADH-Bjは、オキサロ酢酸のアミノ化反応の補因子としてNADPHを好み得ると言えよう。補酵素の特異性に関しては、NADPHに対するADH-Bjの触媒効率（k_cat / K_m）は、NADHに対するものより約12倍高く、NAD⁺に対する触媒効率は、NADP⁺に対するものより約160倍高い。すなわち、ADH-Bjは、アミノ化反応においてはNADHに対してよりもNADPHに対して極めて良好な親和性を有し、脱アミノ化反応においてはNAD⁺に対してよりもNADP⁺に対して極めて良好な親和性を有する。アミノ化反応と脱アミノ化反応とを比較すると、ADH-Bjは、NADPH又はNADHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を、アスパラギン酸の脱アミノ化より約24倍又は310倍高い速度で触媒した。

【0187】

【表17】

^a)アミノ化反応におけるADH-Bjの動力学的解析は、0.15 mM NADPH及び50 mM NH₄Clにおいて基質（オキサロ酢酸）濃度を2〜60 mMに変動させることにより、0.15 mM NADH及び20
mMオキサロ酢酸においてアンモニウム（NH₄Cl）濃度を1〜100 mMに変動させることにより、30 mMオキサロ酢酸及び50 mM NH₄ClにおいてNADPHの濃度を0.012〜0.400 mMに変動させることにより、および30 mMオキサロ酢酸及び50 mM NH₄ClにおいてNADHの濃度を0.1〜0.7 mMに変動させることにより、実施した。脱アミノ化反応におけるADH-Bjの動力学的解析は、2 mM NADP⁺において基質（アスパラギン酸）濃度を5〜80 mMに変動させることにより、100 mMアスパラギン酸においてNADP⁺の濃度を0.015〜2 mMに変動させることにより、および100 mMアスパラギン酸においてNAD⁺の濃度を2〜16 mMに変動させることにより、実施した。全てのデータフィッティング手順は、Sigma Plot 10.0プログラムを用いて実行した。
^b) k_cat及びk_cat / K_m値は、ADH-Bjの分子量（30.76 kDaに等しい）に基づいて計算した。

【0188】

要約
１．Bradyrhizobium japonicum ADH-Bjは、アルカリ性条件下（pH 9及びpH 9.8）で、in vitroでのアスパラギン酸合成の反応を、アスパラギン酸の脱アミノ化の逆反応よりも効率的に（24〜310倍）触媒する。また、pH 7.0の生理的条件下では、アミノ化反応のみが検出された。
２．アンモニウム（NH₄Cl）に対する決定されたK_m値は4 mMである。これは、Polaromonas sp.のADHについて決定されたNH₄Clに対するK_m値（33 mM）より８倍低い。
３．NADPH及びNADPは、in vitroで、Bradyrhizobium japonicum ADH-Bjのより好適な（12〜160倍）補因子である。
４．NADPH及びNADHに対する結滞されたK_m値は、それぞれ0.032 mM及び0.25 mMである。NADPH及びNADHの典型的な細胞内濃度は、E. coli細胞内では0.15 mM及び0.02 mM である。よって、生体内（in vivo）では、Bradyrhizobium japonicum ADH-Bjは、オキサロ酢酸のアミノ化反応における補因子としてNADPHを好み得る。

【0189】

実施例９．試験されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼにより触媒されるアスパラギン酸の脱アミノ化における生成物の決定、及び試験されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの
基質特異性
アスパラギン酸及びNADP⁺からのオキサロ酢酸及びアンモニウムの酵素的生成を確認するために、Polaromonas sp由来の精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ (ADH)、Rhodopseudomonas palustris由来の精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ (ADH1-Rp)、及びRalstonia eutropha由来の精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ (ADH-Re)を用いた反応混合物中のセット中の、オキサロ酢酸のキャピラリー分析（capillary analysis）及びアンモニウム（NH₄⁺）のHPLC分析を行った（表１８）。得られたアンモニウムの値は、この反応におけるNADPHの生成と極めて良好に相関していた。決定されたオキサロ酢酸の値は、NADPH及びアンモニウムの値より幾分低かった（1.5〜2.5倍）。これは、オキサロ酢酸がかなり不安定であり、ピルビン酸に変換されることにより得る。よって、in vitroでは、Polaromonas sp.、Rhodopseudomonas palustris、及びRalstonia eutropha由来の精製した酵素は、NADP⁺の還元と共役したL-アスパラギン酸からのオキサロ酢酸及びアンモニウムの生成を触媒した。

【0190】

【表18】

^a)反応混合物は、1 mlの最終容積中に、0.05 M TRIS-HCl緩衝液, pH 9.8、5 mM NDDP⁺、40 mMアスパラギン酸、10 mklの精製酵素を含むものとした。
^b)NADPHは、340 nmでの吸光度の増加によって分光学的に求めた。
^c)オキサロ酢酸は、キャピラリー泳動によって求めた。
^d)アンモニウム（NH4⁺）は、HPLCによって求めた。
nm - 測定せず。

【0191】

代謝上重要なアミノ酸のケト前駆体に対する、試験した４種のデヒドロゲナーゼの基質特異性を決定した（表１９、２０）。ADH1-Rp及びADH-Bjだけは、α−ケトグルタル酸及びピルビン酸に対して弱いアミノ化活性を示したが、ADH及びADH-Reは、オキサロ酢酸に対して厳密に特異的であった。

【0192】

【表19】

¹⁾オキサロ酢酸を用いて測定した活性に対する、代替的な基質を用いて測定した活性の百分率として結果を示す。反応混合物は、0.1 M TRIS-HCl緩衝液(pH 9)、100 mM NH₄Cl、20 mM 基質、および、ADH1-Rp及びADH-Bjについては0.15 mM NADPH（ADH1-Rp及びADH-Bjについて）を、ADH-Re及びADHについては0.15 mM NADH（ADH-Re及びADHについて）を、含有するものとした。
na - 活性なし（< 0.2％）。

【0193】

【表20】

¹⁾アスパラギン酸を用いて測定した活性に対する、代替的な基質を用いて測定した活性の百分率として結果を示す。反応混合物は、0.1 M TRIS-HCl緩衝液(pH 9.8)、20 mM 基質、および、ADH1-Rp及びADH-Bjについては2 mM NADP⁺を、ADH-Re及びADHについては2 mM NAD⁺を、含有するものとした。
na - 活性なし（< 2％）。

【0194】

実施例１０．E. coli 382ilvA⁺P_nlp8φ10-adh::ΔpepA::Km株によるL-アルギニンの生産
Bradyrhizobium japonicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の増加した活性のL-アルギニン生産における効果を試験するために、下記のE. coli MG1655P_nlp8φ10-adh::ΔpepA::Km株（参考例７参照）の染色体由来のDNA断片を、E. coliアルギニン生産株382ilvA⁺（参考例６参照）に、P1トランスダクション（Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, ColdSpring HarborLab. Press, 1972, Plainview, NY）により導入し、382ilvA⁺P_nlp8φ10-adh::ΔpepA::Km株を得た。382ilvA⁺株及び382ilvA⁺ΔpepA::Cm株（参考例６参照）を対照として使用した。

【0195】

E. coli 382ilvA⁺株、382ilvA⁺ΔpepA::Cm株、及び382ilvA⁺P_nlp8φ10-adh::ΔpepA::Km株を、3 mlのニュートリエントブロス中で37℃で18時間振盪しながら別々に培養し、得られた培養物の0.3 mlを20×200 mm試験管中の2 mlの発酵培地中に接種し、ロータリーシェーカーで32℃で72時間培養した。

【0196】

培養の後、培地中に蓄積したL-アルギニンの量を、以下の移動相：ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（v/v）、を用いたペーパークロマトグラフィにより決定した。ニンヒドリン（2％）のアセトン溶液を発色試薬として使用した。L-アルギニンを含有するスポットを切り出し、CdCl₂の0.5％水溶液を用いてL-アルギニンを溶出し、L-アルギニンの量を540 nmで分光学的に見積もった。８つの試験管発酵の結果を表２１に示す。表１５から分かるように、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子が組み込まれた382ilvA⁺P_nlp8φ10-adh::ΔpepA::Km株は、親株のL-アルギニン生産性E. coli株382ilvA⁺及び対照のE. coli株382ilvA⁺ΔpepA::Cmの両者と比較して、より高い量のL-アルギニンを生産することができた。

【0197】

発酵培地の組成（g/l）は次の通りである：
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミンHCl 0.0002
酵母エキス 1.0
CaCO₃ 5.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別に滅菌した。CaCO₃は、180℃で２時間乾熱滅菌した。pHは7.0に調整した。

【0198】

【表21】

【0199】

参考例１．株の構築
PCRにより生成した断片のλRed依存性組込みの方法（Datsenko, K.A. andWanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12), 6640-6645(2000)）を行った後、組込み体の選択のために使用した抗生物質耐性マーカーのλInt/Xis依存性除去（P. ananatisで使用するために先に調整したもの；ロシア連邦出願第2006134574号、WO2008/090770号、US2010062496号）を行って、株を構築した。使用したプライマーを表２２に列挙する。

【0200】

【表22】

【0201】

組込み用DNA断片を調製するために、表２２に示すプライマーを用いて、ファージλのattL部位及びattR部位に挟まれたカナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片のPCR増幅を行った。反応に使用したプライマーは、その5'-末端に、P. ananatisゲノムの標的部位に対する40bpの相同部分を保持する。pMW118-(λattL-Km^r-λattR)プラスミド（ロシア連邦出願第2006134574号、WO2008/090770号、US2010062496号）を、全ての反応において、テンプレートとして使用した。得られたDNA断片は、メチル化されたGATC部位を認識するDpnI制限酵素で２又は３時間処理し、pMW118-(λattL-Km^r-λattR)を除去した。

【0202】

RSF-Red-TERプラスミドを保有する、ファージλ由来の３つのRed遺伝子（gam, bet及びexo）の全ての発現に対して耐性のP. ananatis SC17(0) 株（VKPM B-9246, ロシア連邦出願第2006134574号）を、組込み実験における受容体として使用した。SC17(0) 株は、2005年9月21日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII
Genetika (住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)に受託番号VKPM B-9246で寄託された後、2006年10月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。

【0203】

P. ananatisのエレクトロコンピテントセルを取得するために、RSF-Red-TERプラスミドで形質転換されたSC17(0)株を、50μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB培地で34℃で一夜生育させた。その後、培養物を、50μg/mlのクロラムフェニコールを含む新鮮なLB培地で100倍に希釈し、通気しながら34℃でOD₆₀₀が0.3となるまで生育させた。その後、IPTGを1 mMとなるよう添加し、OD₆₀₀＝0.7となるまで培養を継続した。10mlのサンプルを、
同量の氷冷した脱イオン水で３回洗浄し、40μlの10％冷グリセリンに再懸濁した。エレクトロポーレーションの直前に、5μlの脱イオン水に溶解した、in vitroで増幅した100〜200ngのDNA調製物を、細胞懸濁液に添加した。手順は、細菌のエレクトロトランスフォーメーション（electrotransformation）用の装置（"BioRad", USA, カタログ番号165-2089, バージョン2-89）を使用して実行した。以下のパルスパラメータを適用した：20 kV/cmの電界強度；5 msecのパルス時間。エレクトロポーレーションの後、直ちに、グルコース（0.5％）で補強した1 mlのLB培地を細胞懸濁物に添加した。その後、細胞を、34℃で２時間通気しながら生育させ、40μg/mlのカナマイシンを含有するLB固体培地上にプレーティングし、34℃で一夜インキュベートした。生育したKm^Rクローンの中から組込み体を選択するために、それらの染色体構造を、表２２に示すテストプライマーを用いたPCRによって検証した。選択したKm^R組込み体からRSF-Red-TERヘルパープラスミドをキュアリングするために、組込み体を、IPTG（1 mM）及びショ糖（5 g/L）を添加したLB培地を含むプレート上に34℃でストリークし、シングルコロニーを形成するまで生育させた。プラスミドのない、Km^RかつCm^Sであるクローンを単離した。

【0204】

カナマイシン又はテトラサイクリン抗生物質耐性マーカーを除去するために、pMW-IntXis-catプラスミド（参考例２参照）を、選択したプラスミドのない組込み体に、PCR生成断片のエレクトロポーレーションと同じ手順によりエレクトロポーレーションした。エレクトロポーレーションの後、細胞を、0.5％グルコース、0.5 x M9塩類溶液、及びクロラムフェニコール（50 mg/L）を含有するLB寒天上にプレーティングし、37℃で一夜インキュベートし、Int/Xisタンパク質の合成を誘導した。生育したクローンを、カナマイシンを含むLBプレートおよびカナマイシンを含まないLBプレート上にレプリカプレーティングし、Km^Sバリアントを選択した。選択したKm^Sクローンは、対応するテストプライマーを用いたPCRにより再チェックした。

【0205】

クロラムフェニコール耐性マーカー（Cm^R）を除去するために、pMW-IntXisヘルパープラスミド（WO2005010175）を使用した。Cm^Sクローンの選択は、上記のようにして行った。ただし、この場合、エレクトロポーレーションの後の細胞は、800 mg/Lのアンピシリンを含有する培地上でプレーティングした。

【0206】

多重変異を有する株を構築するために、対応するプライマーペアを用いて全手順を繰り返した。このようにして構築した5Δ-S株は、aspA, sucA, gltA, pykA, pykF遺伝子が欠失している。これらの遺伝子欠失の構築に使用したプライマーを表２２に列挙する。

【0207】

ppc欠失を構築するために、λattR/Lに挟まれたkan遺伝子を、プライマーDppc-3'（配列番号２８）及びattR3-XbaI-HindIII（配列番号２９）を使用したPCRによって増幅した。P. ananatis SC17(0) Ptac-lacZ株（ロシア連邦出願第2006134574号、WO2008/090770号、US2010062496号）から単離したゲノムDNAを、PCRのテンプレートとして使用した。P. ananatis SC17(0) Ptac-lacZ株においては、λattL-Km^r-λattR及び下流に連結されたPtacプロモータを有する配列（λattL-Km^r-λattR-Ptac）を、lacZ遺伝子の上流に組込んだ。並行して、E. coliのスレオニンオペロンのリーダーペプチドのターミネーター（Tthr）を含む断片を、PCRによって構築した。このために、２対のオリゴヌクレオチドを使用した：mash1（配列番号３０）とmash2（配列番号３１）、及びDppc-5'（配列番号３２）とTthr5'-XbaI（配列番号３３）である。最初に、mash1（配列番号３０）及びmash2（配列番号３１）を互いにアニールさせた。この結果、ターミネーターが生成された。得られたDNA断片を、Dppc-5'（配列番号３２）及びTthr5'-XbaI（配列番号３３）プライマーを用いるPCRのテンプレートとして使用し、組込みカセットの接合に必要なXbaI認識部位を5'-末端に、組込み用の相同アームを3'-末端に有する断片を生成した。Tthrを含む断片及び除去可能なKm^Rマーカーを含む断片を、XbaI制限酵素により消化し、次いでライゲーションした。上記λRed依存性組込みの手順による組込みを行うため、ライゲーションした混合
物をSC17(0)/RSFRedTER株（ロシア連邦出願第2006134574号、WO2008/090770号、US2010062496号）にエレクトロポーレーションした。組込み体を、カナマイシン（40 mg/l）を含むLB寒天プレート上で選択した。組込み体の染色体構造は、オリゴヌクレオチドppc-t1（配列番号３４）及びppc-t2（配列番号３５）をプライマーとして使用したPCRにより確認した。この結果得られた株をSC17(0)Δppcと命名した。

【0208】

構築した欠失を、染色体エレクトロポーレーションの手順により5Δ-Sに導入した。このために、"Fermentas"により提供されるゲノムDNA精製キット（Genomic DNA Purification Kit）を使用してSC17(0)Δppcから単離した200 ngのゲノムDNAを、5Δ-Sにエレクトロトランスフォームした。培養条件は、IPTG添加を除いて、Red依存性組込み手順の場合と同一である。エレクトロコンピテントセルの調製は、Red依存性組込みの場合と同一である。パルスパラメータは次の通りとした：Ｅ＝12.5 kV/cm；10 msecのパルス時間。得られた組込み体は、オリゴヌクレオチドppc-t1（配列番号３４）及びppc-t2（配列番号３５）をプライマーとして使用したPCRによって検証した。この結果得られた株を5ΔPと命名した。

【0209】

その後、フィードバック耐性PEPカルボキシラーゼをコードするE. coliのppc^K620S遺伝子の5ΔPへのMu依存性組込みを、組込み用プラスミドpMIVK620S（参考例５参照）を使用して行った。組込み手順は次のように実行した。pMIVK620Sを、Muインテグラーゼ（Mu integrase）の発現をもたらすphMIV-1ヘルパープラスミド（参考例３参照）を保有する5ΔP株にエレクトロポーレーションした。エレクトロポーレーションの後、インテグラーゼ合成の誘導のために、細胞を37℃でインキュベートした。細胞を、25mg/Lのクロラムフェニコールを含有するL-寒天上にプレーティングした。生育したクローンをレプリカプレーティングし、Ap^Sクローンを選択した。得られた組込み体からヘルパープラスミドをキュアリングした。このために、細胞をLB培地に接種し、攪拌を行わずに37℃で３日間インキュベートした。その後、細胞を、クロラムフェニコール（25 mg/L）を添加したL-寒天上にプレーティングし、34℃で一夜インキュベートした。生育したクローンをレプリカプレーティングし、Tc^SかつCm^Rであるバリアントを選択し、得られた組込み体（５９の独立したクローン）を5ΔP2と命名した。クローンNo. 36（5ΔP2-36）は、増加したL-Glu濃度（6.0 g/L）での48時間の試験管培養において最高のアスパラギン酸及びバイオマスの蓄積を示し（表２、最良のクローン１５つのデータを示す）、これを更なる改良のために選択した。高いL-Glu濃度を用いてグルタミン酸デヒドロゲナーゼの存在をシミュレートした。λInt/Xis依存性手順（上記参照）を使用し、選択した株からクロラムフェニコール耐性マーカーをキュアリングした。この結果得られた株を5ΔP2-36Sと命名した。

【0210】

5ΔP2R株を、5ΔP2-36Sから、親株と同一の生産能力を有する、10 g/Lグルコース及び30 g/L L-Aspを含有するpH 5.5のM9プレート上で選択した自然Asp^R変異株として得た。

【0211】

その後、5ΔP2RM株を、5ΔP2R株から、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするmdhA遺伝子を欠失させることにより得た（WO2010038905号）。mdhA遺伝子を欠失させることにより、オキサロ酢酸のリンゴ酸、フマル酸、及びコハク酸への非生産的な変換を回避することができる。

【0212】

5ΔP2RMG-S株を、5ΔP2RM株から取得した。このために、5ΔP2RM株において、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするgcd遺伝子を、オリゴヌクレオチドgcd-attR（配列番号
９５）及びgcd-attL（配列番号９６）を組込み用DNA断片の生成のためのプライマーとし
て使用した上記λRed依存性手順に従って欠失させた。オリゴヌクレオチドgcd-test1（配列番号９７）及びgcd-test2（配列番号９８）を、得られた組込み体のPCR検証に使用した。この結果得られた株5ΔP2RMGから、上記λInt/Xis依存性手順を使用してカナマイシン
耐性マーカーをキュアリングし、5ΔP2RMG-Sと命名した。

【0213】

参考例２．pMW-intxis-catベクターの構築
pMW-intxis-cat（図４）を構築するために、cat遺伝子を含むDNA断片を、プライマーcat5'BglII（配列番号３６）及びcat3'SacI（配列番号３７）、ならびにテンプレートとしてpACYC184プラスミドを用いるPCRにより増幅した。平滑末端を生成するPfuポリメラーゼ（"Fermentas"）をこの反応に使用した。得られたDNA断片を、pMW-intxisプラスミド（WO2005010175）の唯一のScaI認識部位（ScaI制限エンドヌクレアーゼは平滑末端を生成する）にクローニングした。プラスミドがcat遺伝子を図４に示す向きで有することは、NcoI制限酵素を使用する制限分析により確認した（必要なDNA断片の長さは3758及び3395bp）。

【0214】

参考例３．phMIV-1ヘルパープラスミドの構築
インテグラーゼ及び熱感受性リプレッサーをコードするMuC(cst62)、ner、MuA、及びMuB遺伝子を含むDNA断片を、プライマーMuC5（配列番号３８）及びMuB3（配列番号３９）、ならびにテンプレートとしてpMH10プラスミド（米国特許第6,960,455号）を用いるPCRにより増幅した。プライマーMuC5は、その5'-末端にEcoRI制限酵素用の部位を含む。プライマーMuB3は、その5'-末端にNcoI制限酵素用の部位を含む。得られた断片は、pACYC184プラスミドのEcoRI-NcoI認識部位にクローニングした。そうして、phMIV-1ヘルパープラスミドが得られた（図５）。

【0215】

参考例４．E. coli株MG1655Δppcの構築
１．ppc遺伝子の欠失を有するE. coli株の構築
ppc遺伝子の欠失を有する株を、「Redドリブン・インテグレーション」と呼ばれる、Datsenko, K. A.とWanner, B. L.によって最初に開発された方法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 2000, 97(12), 6640-6645）により構築した。cat遺伝子によりコードされるCm^Rマーカーを含むDNA断片を、プライマーpps-attR（配列番号４０）及びppc-attL（配列番号４１）、並びにテンプレートとしてプラスミドpMW118-attL-Cm-attR（WO2005010175）を使用するPCRにより得た。プライマーpps-attRは、ppc遺伝子の5'末端に位置する領域に相補的な領域及びattR領域に相補的な領域の両方を含む。プライマーpps-attRは、ppc遺伝子の3'末端に位置する領域に相補的な領域及びattL領域に相補的な領域の両方を含む。

【0216】

1.7 kbpのPCR産物を取得し、アガロースゲルにより精製し、温度感受性複製を有するプラスミドpKD46を保持するE. coli MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のエレクトロポーレーションに使用した。プラスミドpKD46（Datsenko, K.A. andWanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45）は、ファージλの2,154ヌクレオチドのDNA断片（ヌクレオチド位置31088〜33241, GenBank accession no. J02459）を含み、且つ、アラビノース誘導性P_araBプロモーターの制御下にλRed相同組換え系の遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含む。プラスミドpKD46は、MG1655株の染色体へのPCR産物の組込みに必要である。

【0217】

エレクトロコンピテントセルは、次のようにして調製した。E. coli MG1655/pKD46を、アンピシリン（100 mg/l）を含有するLB培地で30℃で一夜生育させ、培養物を、アンピシリン及びL-アラビノース（1 mM）を含有する5 mlのSOB培地（Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989）で100倍に希釈した。細胞を、通気しながら30℃でOD₆₀₀が約0.6となるまで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水により３回洗浄することによりエレクトロコンピテント化した。エレクトロポーレーションは、70μlの細胞及び約100 ngのPCR産物を使用して行った。エレクトロポーレーションの後の細胞を、1 mlのSOC培地（Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989）を用いて37℃で2.5時間インキュベートした後
、クロラムフェニコール（30μg/ml）を含有するL-寒天上にプレーティングし、37℃で生育させてCm^R組換え体を選択した。その後、pKD46プラスミドを除去するために、Cmを含むL-寒天上で42℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン感受性を試験した。

【0218】

２．PCRによるppc遺伝子欠失の検証
ppc遺伝子が欠失しCm耐性遺伝子により標識されたバリアントを、PCRによって検証した。部位特異的（locus-specific）検証用プライマーppc-test1（配列番号４２）及びppc-test2（配列番号４３）を、検証用PCRに使用した。親のppc⁺株であるMG1655の細胞をテンプレートとして用いた反応により得られたPCR産物は、2.8 kbpの長さであった。変異株の細胞をテンプレートとして用いた反応により得られたPCR産物は、1.7 kbpの長さであった。変異株は、MG1655Δppc::catと命名した。WO2005010175号に記載されている標準的な技術（int-xis系）を使用し、染色体からCmマーカーを切り出した。Cmマーカーを切り出した場合の、プライマーppc-test1及びppc-test2を使用したPCRで得られたDNAの長さは280 bpであった。

【0219】

参考例５．pMIVK620Sプラスミドの構築
アスパラギン酸による阻害に対して耐性のPEPカルボキシラーゼをコードするE. coliのppcK620S遺伝子を、２工程で、プラスミドpTK620S（Masato Yano and Katsura Izui, Eur. Biochem. FEBS, 247, 74-81, 1997）からpMIV-5JSプラスミド（ロシア連邦特許出願第2006132818号、US2009197309号）へとサブクローニングした。最初に、pTK620SのSalI-SphI断片を、pMIV5-JSのSalI-SphI認識部位にサブクローニングした。得られたpMIV-ppc-5'プラスミドは、ppcK620S遺伝子の大きな5'-末端部分（large 5'-terminal portion）を保持する。ppcK620S遺伝子の3'-近傍部分（3'-proximal portion）を、プライマーppc-SphI（配列番号４４）及びppc-HindIII（配列番号４５）、ならびにテンプレートとしてpTK620Sプラスミドを用いるPCRにより、増幅した。このようにして得られた断片及びpMIV-ppc-5'を、SphI及びHindIII制限酵素を用いて消化し、ライゲーションした。ライゲーションした混合物をE. coli MG1655Δppc株（参考例４参照）にエレクトロポーレーションした。形質転換後の細胞を、クロラムフェニコール（50 mg/l）を含むM9グルコース（5 g/l）最小培地上にプレーティングし、PEPカルボキシラーゼ活性をもたらすプラスミドを保有するコロニーを選択した。生育したコロニーからのプラスミドDNAの単離及び制限酵素分析の後、期待される構造のプラスミド（図６）を選択した。

【0220】

参考例６．親アルギニン生産株E. coli 382ilvA⁺及び対照株E. coli 382ilvA⁺ΔpepA::Cmの構築
382ilvA⁺株は、アルギニン生産株382（VKPM B-7926, EP 1170358A1）から、E. coli K12株由来の野生型ilvA遺伝子をP1トランスダクションすることにより得た。382株は、2000年4月10日にVKPM （the Russian National Collection of Industrial Microorganisms, (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)）に受託番号VKPM B-7926で寄託された。382ilvA⁺のクローンは、最小寒天プレート上で良好に生育するコロニーとして選択された。382株は、2000年4月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1)に受託番号VKPM B-7926で寄託された後、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。pepA遺伝子が欠失した382ilvA⁺ΔpepA::Cm株は以下のようにして構築した。

【0221】

細菌株におけるpepA遺伝子の欠失は、「Redドリブン・インテグレーション」と呼ばれる、Datsenko, K. A.とWanner, B. L.によって最初に開発された方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645）により達成した。この手順に従って、pepA遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子の両方に相同なPCRプライマーP9（配列番号９０）及びP10（配列番号９１）を構築した。プラスミドpMW118-attL-Cm-attR（WO05/010175）を、PCR反応におけるテンプレートとして使用し
た。PCRの条件は次の通りとした：94℃で30秒間の最初のDNAの変性；その後の25サイクルの94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で１分30秒間の伸長；及び72℃で２分間の最後の伸長。

【0222】

1.7 kbのPCR産物をアガロースゲルより精製し、温度感受性の複製開始点を有するプラスミドpKD46を保有するE. coli MG1655株（ATCC700926）のエレクトロポーレーションに使用した。pKD46プラスミド（Datsenko, K.A. andWanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45）は、ファージλの2,154ヌクレオチドのDNA断片（ヌクレオチド位置31088〜33241, GenBank accession no. J02459）を含み、且つ、アラビノース誘導性P_araBプロモーターの制御下にλRed相同組換え系の遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含む。pKD46プラスミドは、MG1655株の染色体へのPCR産物の組込みに必要である。

【0223】

エレクトロコンピテントセルは、次のように調製した：E. coli MG1655/pKD46細胞を、アンピシリン（100 mg/l）を含有するLB培地中で30℃で一夜生育させ、培養物を、アンピシリン及びL-アラビノース（1 mM）を含有する5 mlのSOB培地（Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）で100倍に希釈した。細胞を、通気しながら30℃でOD₆₀₀が約0.6となるまで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水で３回洗浄することによりエレクトロコンピテント化した。エレクトロポーレーションは、70μlの細胞及び約100 ngのPCR産物を使用して行った。エレクトロポーレーションの後の細胞を、1 mlのSOC培地（Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）を用いて37℃で2.5時間インキュベートした後、クロラムフェニコール（30μg/ml）を含有するL-寒天上にプレーティングし、37℃で生育させてCm^R形質転換体を選択した。その後、pKD46プラスミドを除去するために、Cmを含むL-寒天上で42℃で２回継代し、コロニーのアンピシリン感受性を試験した。

【0224】

pepA遺伝子が欠失した変異株は、Cm耐性遺伝子により標識されており、部位特異的（locus-specific）プライマーP11（配列番号９２）及びP12（配列番号９３）を使用するPCRにより検証した。このために、新たに単離したコロニーを20μlの水に懸濁し、1μlの懸濁物をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした：94℃で30秒間の最初のDNAの変性；その後の30サイクルの94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で２分間の伸長；72℃で２分間の最後の伸長。親のpepA⁺株であるMG1655の細胞をテンプレートとして使用するPCR反応で得られたPCR産物は、1.65 kbの長さであった。MG1655ΔpepA::Cm変異株の細胞をテンプレートとして使用するPCR反応で得られたPCR産物は、1.71 kbヌクレオチドの長さであった。

【0225】

その後、E. coli MG1655ΔpepA::Cm株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクション（Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring HarborLab. Press, 1972, Plainview, NY）により、上記E. coliアルギニン生産株382ilvA⁺に導入した。得られた株を382ilvA⁺ΔpepA::Cmと命名した。

【0226】

参考例７．E. coli MG1655P_nlp8φ10-adh::ΔpepA::Km株の構築
E. coli由来のnlpD遺伝子のプロモーターを含むDNA断片を、PCRを利用して取得した。E. coli MG1655株の染色体DNAをテンプレートとして使用し、プライマーP1（配列番号８２）及びP2（配列番号８３）をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした：95℃で３分間の変性工程；最初の2サイクルのプロフィール：95℃で１分、50℃で30秒、72℃で40秒；最後の25サイクルのプロフィール：94℃で20秒、55℃で20秒、72℃で15秒；最終工程：72℃で５分。増幅したDNA断片は約0.2 kbの大きさであり、アガロースゲル電気泳動によって精製した。その後、精製した断片を、エンドヌクレアーゼPaeI及びSalIで処理した。得られたDNA断片を、エンドヌクレアーゼPaeI及びSalIで予め処理したプラスミドpMIV-5JS
（ロシア連邦特許出願第2006132818号、EP1942183号）とライゲーションした。ライゲーション用混合物を4℃で一夜インキュベートした後、エレクトロポーレーションによってE. coli MG1655株を形質転換するのに使用した。この結果得られた形質転換体を、アンピシリン（50 mg/l）を含有するLB寒天を用いたプレート上にプレーティングし、個々のコロニーが見えるようになるまでプレートを37℃で一夜インキュベートした。得られた形質転換体からプラスミドを単離し、制限酵素分析により分析した。得られたプラスミドは、E. coli由来のnlpD遺伝子のプロモーターを含み、pMIV-Pnlp0と命名した。

【0227】

次いで、プロモーターP_nlpDの-10領域のランダム化及びP_nlp8プロモーターの選択を行った。プロモーターP_nlpDの3'-末端を、PCR増幅を使用して取得した。プラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして使用し、プライマーP1（配列番号８２）及びP7（配列番号８８）をPCRに使用した。プライマーP7はランダムヌクレオチドを有し、それらは配列番号８８において文字"n"（A又はG又はC又はTを意味する）により示される。PCRの条件は次の通りとした：95℃で３分間の変性工程；最初の2サイクルのプロフィール：95℃で１分、50℃で30秒、72℃で40秒；最後の25サイクルのプロフィール：94℃で20秒、60℃で20秒、72℃で15秒；最終工程：72℃で５分。プロモーターP_nlpDの5'-末端を、PCR増幅を使用して取得した。プラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして使用し、プライマーP2（配列番号８３）及びP8（配列番号８９）をPCRに使用した。プライマーP8はランダムヌクレオチドを有し、それらは配列番号８９において文字"n"（A又はG又はC又はTを意味する）により示される。PCRの条件は次の通りとした：95℃で３分間の変性工程；最初の2サイクルのプロフィール：95℃で１分、50℃で30秒、72℃で40秒；最後の25サイクルのプロフィール：94℃で20秒、60℃で20秒、72℃で15秒；最終工程：72℃で５分。増幅した両DNA断片は、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、得られたDNA断片を、エンドヌクレアーゼBglIIで処理した後、等モル割合で断片のライゲーションを行った。ライゲーション用混合物を4℃で一夜インキュベートした後、次のPCR手順のテンプレートとして使用し、プライマーP1（配列番号８２）及びP2（配列番号８３）をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした：95℃で３分間の変性工程；最初の2サイクルのプロフィール：95℃で１分、50℃で30秒、72℃で40秒；最後の12サイクルのプロフィール：94℃で20秒、60℃で20秒、72℃で15秒；最終工程：72℃で５分。増幅したDNA断片は約0.2 kbの大きさであり、アガロースゲル電気泳動によって精製した。

【0228】

その後、精製した断片を、クレノウ断片（Klenow fragment）で処理した。この結果得られたDNA断片を、予めエンドヌクレアーゼXbaIで処理した後にクレノウ断片で処理したプラスミドpMW118-(λattL-Km^r-λattR)（ロシア連邦出願第2006134574号）と等モル割合でライゲーションした。ライゲーション用混合物を4℃で一夜インキュベートした後、エレクトロポーレーションによってE. coli MG1655株を形質転換するのに使用した。この結果得られた形質転換体を、カナマイシン（20 mg/l）を含有するLB寒天を用いたプレート上にプレーティングし、個々のコロニーが見えるようになるまでプレートを37℃で一夜インキュベートした。得られた形質転換体からプラスミドを単離し、制限酵素分析によって分析した。得られたP_nlp8プロモーターを含むプラスミドを、pMW-Km-Pnlp8と命名した。

【0229】

Bradyrhizobium japonicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むDNA断片を、PCRを利用して取得した。プラスミドDNA pET15-ADH-Biをテンプレートとして使用し、プライマーP3（配列番号８４）及びP4（配列番号８５）をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした：95℃で１分間の変性工程；最後の25サイクルのプロフィール：95℃で１分、55℃で30秒、72℃で１分；最終工程：72℃で２分。増幅したDNA断片は約1 kbの大きさであり（図２１）、アガロースゲル電気泳動によって精製した。

【0230】

λattL-Km-λattR-P_nlp8φ10カセットを含むDNA断片を、PCRを利用して取得した。プラスミドDNA pMW-Km-Pnlp8をテンプレートとして使用し、プライマーP5（配列番号８６）及
びP6（配列番号８７）をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした：95℃で１分間の変性工程；最後の25サイクルのプロフィール：95℃で１分、55℃で30秒、72℃で１分40秒；最終工程：72℃で５分。増幅したDNA断片は約1.7 kbの大きさであり（図２１）、アガロースゲル電気泳動によって精製した。

【0231】

次いで、重複領域を有する得られたDNA断片（図２１）を、次のPCR手順のテンプレートとして使用し、プライマーP4（配列番号８５）及びP5（配列番号８６）をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした：95℃で２分間の変性工程；次の30サイクルのプロフィール：94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で２分；最終工程：72℃で５分。増幅したDNA断片は約2 kbの大きさであり、アガロースゲル電気泳動によって精製した。

【0232】

得られた断片は、切り出し可能なKmマーカー、およびP_nlp8φ10プロモーターの制御下にあるBradyrhizobium japonicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでいた。この断片を、参考例６に記載したようにして、Datsenko, K.A.とWanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって開発された「Redドリブン・インテグレーション」により、E. coli MG1655の染色体にpepA遺伝子の代わりに組み込んだ。このようにして、E. coli MG1655 P_nlp8φ10-adh::ΔpepA::Km株を取得した。

【0233】

本発明をその好適な態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、等価物を用いることができることは当業者に明らかであろう。ここに引用した参考文献は全て、参照によりこの出願の一部として組み込まれる。

【産業上の利用可能性】

【0234】

本発明によれば、腸内細菌科に属する微生物を使用する発酵によりL-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法において、L-アスパラギン酸又はL-アスパラギン酸より誘導される代謝産物の生産性を向上させることができる。

【図1】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図23】

【図25】

【図28】

【図2】

【図9】

【図16】

【図17】

【図22】

【図24】

【図26】

【図27】