特許 5852880 温度感応性材料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5852880

(24)【登録日】2015年12月11日

(45)【発行日】2016年2月3日

(54)【発明の名称】温度感応性材料

(51)【国際特許分類】

   C08L 33/14 20060101AFI20160114BHJP

   C09K 3/00 20060101ALI20160114BHJP

   C08K 5/17 20060101ALI20160114BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20160114BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20160114BHJP

   C12N 1/02 20060101ALI20160114BHJP

【ＦＩ】

   C08L33/14

   C09K3/00 E

   C08K5/17

   C12M3/00 A

   C12N5/00 202A

   C12N1/02

【請求項の数】5

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2011-287592(P2011-287592)

(22)【出願日】2011年12月28日

(65)【公開番号】特開2013-136660(P2013-136660A)

(43)【公開日】2013年7月11日

【審査請求日】2014年10月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】510094724

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立循環器病研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】000005278

【氏名又は名称】株式会社ブリヂストン

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100119530

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 和幸

(74)【代理人】

【識別番号】100150360

【弁理士】

【氏名又は名称】寺嶋 勇太

(72)【発明者】

【氏名】中山 泰秀

(72)【発明者】

【氏名】根本 泰

【審査官】 井上 政志

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭５８−１２７７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２０７８１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１３６６３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−１７５４９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−１０２４９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第００３８７９７５（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０９９９２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−１５０７９６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｋ３／００−１３／０８

Ｃ０８Ｌ１／００−１０１／１４

Ｃ０８Ｃ１９／００−１９／４４

Ｃ０８Ｆ６／００−２４６／００

Ｃ１２Ｎ１／００−７／０８

Ｃ１２Ｍ１／００−３／１０

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする温度感応性ポリマー材料と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩とを含み、
前記温度応答性ポリマー材料は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体であり、
前記分岐鎖１本当りの２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体単位の分子量が、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることを特徴とする温度感応性材料。

【請求項2】

請求項１において、前記温度感応性ポリマー材料に対する２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の含有量がポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート］の式量（モノマー単位のモル量）の１／１０００モル量〜１０００倍モル量であることを特徴とする温度感応性材料。

【請求項3】

請求項１又は２において、前記温度感応性ポリマー材料の水溶液に２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の水溶液を添加してなることを特徴とする温度感応性材料。

【請求項4】

請求項１において、前記分岐鎖は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体単位のみからなることを特徴とする温度感応性材料。

【請求項5】

２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートの前記誘導体が、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートの主鎖骨格のメチル基の水素原子を、フッ素原子、ヒドロキシメチル基に置換したものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の温度感応性材料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする温度感応性ポリマー材料を用いた温度感応性材料に係り、詳しくは、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする温度感応性ポリマー材料の曇点（ＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を上昇させた温度感応性材料に関する。

【背景技術】

【0002】

曇点より低い温度では親水性であり、曇点より高い温度では疎水性となる温度感応性を示す温度感応性ポリマーとして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのポリマー及び２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートのポリマーが公知である（特許文献１，２）。

【0003】

特許文献１の通り、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が３７℃付近では疎水性であり、２５℃付近では親水性である特性を利用して培養皿から培養細胞を剥離することができる。細胞は、疎水性の表面に接着するため、３７℃でポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が疎水性のときには、これが付着した培養皿に細胞が培養される。２５℃でポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が親水性となると、培養細胞は培養皿から剥離する。この現象を利用して培養皿から細胞シートを剥離させて回収することができる。

【0004】

特許文献２には、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート］の温度感応性を利用した、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに対して、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合してなるスター型ポリマーよりなる遺伝子導入剤が記載されている。この遺伝子導入剤は、分岐鎖を構成する２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体が、僅かながらカチオン性を有する。そのため、このカチオン性の２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート単位は、核酸との結合に寄与し、遺伝子導入剤の核酸担持量が多くなる。また、この遺伝子導入剤は、分岐鎖が感温性を有しており、温度を上昇させることにより、遺伝子導入剤が疎水性に変化する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４４７５８４７号公報

【特許文献2】特開２０１０−１３６６３１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を用いて細胞を培養皿に付着させ、約３７℃の温度下で増殖させて細胞シートとした後、この細胞シートを培養皿から剥離させるには、培養皿及びその内容物を１０〜２５℃に降温させ、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を親水化させる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が親水性になると、細胞シートを培養皿から剥離させることができる。

【0007】

この剥離方法では、３７℃で培養している細胞を１０〜２５℃の環境に数分から数十分置くことになるので、細胞にダメージを与えるおそれがある。

【0008】

２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートを重合させたスター型ポリマーは、水中で加水分解して経時的に曇点が上昇する。従って、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の代わりにこのスター型ポリマーを用いて細胞を培養皿に付着させて細胞を増殖させ、その後、このスター型ポリマーを加水分解してその曇点を上昇させ、約３７℃の温度下のままで細胞シートを培養皿から剥離させることができると推察される。しかしながら、この加水分解の際に２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エタノールが生成し、細胞が被毒するおそれがある。また、加水分解反応により曇点を上昇させるのに長時間を要する。

【0009】

本発明は、温度感応性ポリマーとして２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とするポリマー材料を含む温度感応性材料であって、細胞被毒の問題を引き起こすことなく、しかも、曇点を容易にかつ短時間で上昇させることができる温度感応性材料を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明（請求項１）の温度感応性材料は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする温度感応性ポリマー材料と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩とを含み、前記温度応答性ポリマー材料は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体であり、前記分岐鎖１本当りの２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体単位の分子量が、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることを特徴とするものである。

【0011】

請求項２の温度感応性材料は、請求項１において、前記温度感応性ポリマー材料に対する２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の含有量がポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート］の式量（モノマー単位のモル量）の１／１０００モル量〜１０００倍モル量であることを特徴とするものである。

【0012】

請求項３の温度感応性材料は、請求項１又は２において、前記温度感応性ポリマー材料の水溶液に２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の水溶液を添加してなることを特徴とするものである。

【0013】

２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートの前記誘導体が、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートの主鎖骨格のメチル基の水素原子を、フッ素原子、ヒドロキシメチル基に置換したものであることが好ましい。

【0015】

請求項６の温度感応性材料は、請求項４又は５において、前記分岐鎖は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体単位のみからなることを特徴とするものである。

【0016】

前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させた分岐型重合体であってもよい。

【0017】

この場合、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることが好ましい。

【0018】

本発明では、前記ポリマー材料の分子量は、好ましくは５，０００〜５００，０００である。

【発明の効果】

【0019】

温度感応性ポリマーである、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とするポリマー材料に、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩を加えることにより、この温度感応性ポリマーの曇点が速やかに上昇する。２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の添加量が多くなるほど曇点の上昇量が多くなるので、この添加量を調整することにより、曇点を任意に調整することができる。

【0020】

また、このポリマー材料に２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩を添加して曇点を上昇させても、加水分解反応は生じず、細胞に対して毒性を有した加水分解生成物は生成しない。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。

【0022】

本発明では、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とするポリマー材料に対し、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩を添加して該ポリマー材料本来の曇点よりも曇点が上昇した温度感応性材料を得る。なお、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートの誘導体としては、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートの主鎖骨格のメチル基の水素原子を低い分子量の分子団（例えばフッ素原子、ヒドロキシメチル基など）に置換したものなどが例示される。

【0023】

２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする温度感応性ポリマー材料は、線形ポリマーであってもよく、前述のスター型ポリマーのような非線形ポリマーであってもよく、これらの混合物であってもよい。スター型ポリマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに少なくとも２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体（以下、これらを「ＤＭＡＥＭ」と称す場合がある。）を光照射リビング重合させたものが好ましい。

【0024】

このイニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子である。

【0025】

イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。

【0026】

上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。

【0027】

イニファターと上記ＤＭＡＥＭとを反応させるには、イニファター、及びＤＭＡＥＭを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭが結合した反応生成物を生成させる。

【0028】

該原料溶液中のＤＭＡＥＭの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。

【0029】

照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えば蛍光灯、ショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ^２〜１０ｍＷ／ｃｍ^２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。市販の蛍光灯を用いて光照射を行う場合には、１〜１００時間程度光照射を行うことが好ましい。

【0030】

この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にＤＭＡＥＭ単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。

【0031】

このスター型ポリマーの分岐鎖の１本当たりの分子量としては、１００〜６０，０００程度、特に２００〜３０，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。

【0032】

なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。

【0033】

ポリマー材料の分岐鎖は、前述のＤＭＡＥＭをモノマーとする１種のモノマーのみからなるホモポリマーであることが好ましいが、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＥＭとは異なる１種以上のモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。

【0034】

この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられ、特に、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。

【0035】

イニファターとＤＭＡＭＥとＤＭＡＥＭとは異なるモノマーとを反応させるには、前述のイニファターとＤＭＡＥＭとを反応させる場合と同様に、イニファター、ＤＭＡＥＭ、及びＤＭＡＥＭ以外のモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＥＭ以外のモノマーが結合したランダムコポリマーを得る。

【0036】

また、上記イニファターに対し、まず、ＤＭＡＥＭをブロック重合させて、ホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、分岐鎖の基端側をＤＭＡＥＭのブロックポリマー、分岐鎖の先端側を３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドブロックポリマーで構成した分岐鎖としてもよい。このように、分岐鎖を２種類以上のモノマーのブロックコポリマーとする場合、イニファターに対する重合の順序は任意である。

【0037】

いずれの場合も分岐鎖の末端は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基となる。

【0038】

前記のように、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＥＭ以外のモノマーとを反応させた場合には、分岐鎖１本当りのＤＭＡＥＭ単位の分子量が、当該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上、特に９５〜１００％となるようにするのが好ましい。ＤＭＡＥＭ単位はカチオン性であるため、分岐鎖に含まれるＤＭＡＥＭ単位が多いほど、ポリマー材料とアニオン性である核酸との親和性が高くなり、核酸担持量を高めることができ、遺伝子導入材料の遺伝子導入活性が向上する。

【0039】

また、本発明において、ポリマー材料は核酸の担体として機能すると共に、培養容器等への付着のためのアンカーとして機能することから、ポリマー材料の分岐型重合体の分岐鎖は多い方が好ましく、分岐鎖は４本以上、特に６本であることが好ましい。

【0040】

また、ポリマー材料の分子量としては、上記機能を有効に得る上で５，０００〜５００，０００程度、特に２５，０００〜１５０，０００程度が好ましい。

【0041】

線形ポリマーよりなる温度感応性ポリマー材料は、モノマーとして少なくともＤＭＡＥＭを用い、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）等の重合開始剤の存在下に常法に従って重合を行うことにより製造することができる。また、上記のスター型ポリマーの製造において、イニファターを用いないこと以外は同様にして光照射を行って製造することもできる。この線形ポリマーについても、上述のスター型ポリマーを製造する際に用いられると同様の他のモノマーを用いてもよいが、ＤＭＡＥＭによる温度感応性を十分に得るために、線形ポリマーの分子量の９０％以上、特に９５以上とりわけ１００％がＤＭＡＥＭ単位よりなることが好ましい。

【0042】

また、この線形ポリマーの分子量についても、スター型ポリマーにおけると同様な理由から、５，０００〜５００，０００程度、特に２５，０００〜１５０，０００程度が好ましい。

【0043】

本発明の温度感応性材料を調製するには、上記の温度感応性ポリマー材料の水溶液に２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩を添加することにより、曇点が上昇した温度感応性ポリマー材料とすることが好ましい。この２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の添加量が少ない程、温度感応性材料ポリマーの曇点上昇量が少なく、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の添加量が多くなるほど温度感応性ポリマー材料の曇点は高いものとなる。

【0044】

本発明において、温度感応性ポリマー材料に対する２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の添加量は、必要とされる温度感応性材料の曇点の上昇量に応じて適宜決定されるが、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート］の式量（モノマー単位のモル量）の１／１０００モル量〜１０００倍モル量であることが好ましい。即ち、本発明の温度感応性材料は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩をポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート］の式量（モノマー単位のモル量）の１／１０００モル量〜１０００倍モル量含有するものであることが好ましい。
このような温度感応性材料であれば、通常、３２℃程度の温度感応性ポリマー材料の曇点を３８℃程度にまで、その２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩添加量に応じて任意の曇点に高めることができる。

【0045】

このような本発明の温度感応性材料は、培養皿から細胞シートを剥離させるための温度感応性材料として利用することができる。例えば、上記の温度感応性ポリマー材料の水溶液を曇点以下の温度とし、培養皿中に流延した後、曇点以上の温度とし、温度感応性ポリマー材料水溶液をゲル状の層とする。この温度感応性ポリマー材料層上に細胞を置き、培養液を注ぎ、約３７℃で細胞を増殖させ温度感応性ポリマー材料層上に細胞シートを形成する。なお、この際、温度感応性ポリマー材料層中にＤＮＡを存在させておき、細胞にＤＮＡを取り込ませるようにしてもよい。その後、培養液に２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩水溶液を注いで温度感応性ポリマー材料の曇点を例えば５０℃又はそれ以上にまで上昇させる。そうすると、温度感応性ポリマー材料層が親水性となって溶解し、細胞シートが培養皿底面から離反するので、この細胞シートを培養皿から取り出す。

【0046】

なお、この温度感応性ポリマー材料の水溶液を培養皿に流延させる代りに温度感応性ポリマー材料のモノマーを気相重合反応器内に供給し、培養皿内面に気相重合法によって温度感応性ポリマー材料を生成・付着させてもよい。培養皿内面に予め低温プラズマ照射又はβ線照射を行っておいてもよい。

【0047】

また、本発明の温度感応性材料は、温度感応性ポリマー材料の曇点よりも低い温度の温度感応性ポリマー材料水溶液を被着物に付着させ、被着物同士を当接させた後、曇点よりも高い温度とすることにより、被着物同士を接着する用途にも利用することができる。

【0048】

温度感応性ポリマー材料による接着部分に対して２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩水溶液を供給し、温度感応性ポリマー材料の曇点を環境温度よりも高くすることにより、温度感応性ポリマー材料の接着力が消失し、被着物同士を離反させることができる。このような温度感応性ポリマー材料による接着剤は、生体用接着剤として好適である。

【実施例】

【0049】

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

【0050】

＜実施例１＞
ｉ） イニファターの合成（４分岐型）
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。

【0051】

１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇとをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間撹拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬに溶解させた後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。この結晶を高速液体クロマトグラフィーで分析し、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。

【0052】

^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ_３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ_２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。

【0053】

【化1】

【0054】

ii) ４分岐型スター型重合体よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの光重合による合成
２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートをモノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＥＭＡＡと記載することがある。）よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの合成を行った。
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート８．５ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を６０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ^２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ｎ−ヘキサン系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ｎ−ヘキサンを蒸散させた後に少量のベンゼンへ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＥＭＡＡよりなる弱塩基性カチオン性ホモポリマーを得た。

【0055】

ポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量は、ＧＰＣにより、１１，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）と測定された。

【0056】

^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ₃ＯＤ）の測定結果は、δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＨ_３−），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＨ_３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ_３)，δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ_２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ_２）であった。

【0057】

【化2】

【0058】

iii)曇点の測定
ii）で合成した感温性カチオンホモポリマーの３重量％水溶液を調製し、６６０ｎｍでの吸光度の温度依存性を２０℃〜４０℃の間で測定した。その結果、３２℃付近に曇点を有し、曇点以上の温度では疎水性の無電荷のポリマーとなって水中で懸濁する感温性のポリマーであることが分かった。

【0059】

iv） 曇点を上昇させる処理
２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の水溶液を１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲で調製した。

【0060】

上記のプロセスii）で調製した感温性カチオンホモポリマーの３重量％水溶液９００μＬへ各２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の水溶液を１００μＬ加えて混合し、１分間放置した後にiii)と同様の方法で曇点を測定した。結果を表１に示す。

【0061】

【表1】

【0062】

表１の通り、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩（Ｔｒｉｓ）を添加することにより曇点が上昇する。また、その添加量が多くなるほど曇点が高くなる。

【0063】

＜感温性カチオンホモポリマーの水溶液の安定性試験＞
ii）で調製した感温性カチオンホモポリマーの水溶液を室温で放置し、曇点の経時変化を観察した。曇点が３７℃を超えるまでには４８時間〜７２時間の時間を要し、６０日後でも曇点は５０℃以上までは到達しなかった。また、水溶液中の２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エタノール濃度は経時的に増加した。

【0064】

＜比較例１＞
Wetering et al, J Control Release(1997), 49, 59-69に記載されている方法に従って、開始剤にＡＩＢＮ、溶媒にトルエンを使用して２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートの線形ポリマーを合成した。この線形ポリマーについて、iii）と同様に曇点を測定すると、このポリマーは、感温性を有し、曇点は約３２℃であることが認められた。

【0065】

このポリマーの３重量％水溶液を室温で放置しても曇点にはほとんど変化が認められなかった。この理由は、このポリマーは線形構造であり、上記ii）で合成したスター構造のポリマーのように側鎖の加水分解が容易には起こらないためと考えられる。
このポリマーの３重量％水溶液に実施例１のiv）曇点を上昇させる処理と同様に２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩の水溶液を表１の添加割合にて添加したが、曇点にはほとんど変化が認められなかった。

【0066】

＜考察＞
本発明によれば、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする温度感応性ポリマー材料に対し、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩を添加することにより、このポリマー材料の曇点を瞬時に上昇させることができる。なお、実施例では２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩を添加した後１分間の放置を行なっているが、これは実験操作の均一性及び再現性を担保するために設定した待ち時間であり、曇点上昇に１分間を要するためではない。