特許 5854559 小胞を調製する方法及びこれから製造される製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5854559

(24)【登録日】2015年12月18日

(45)【発行日】2016年2月9日

(54)【発明の名称】小胞を調製する方法及びこれから製造される製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20160120BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/14 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/16 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/34 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 39/29 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 39/295 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20160120BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/00 G

   A61K47/24

   A61K47/14

   A61K47/10

   A61K47/28

   A61K47/16

   A61K47/12

   A61K47/20

   A61K47/26

   A61K47/34

   A61K47/42

   A61K47/36

   A61K39/12

   A61K39/29

   A61K39/145

   A61K39/21

   A61K39/295

   A61K39/39

   A61K9/127

【請求項の数】11

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2012-519672(P2012-519672)

(86)(22)【出願日】2010年7月6日

(65)【公表番号】特表2012-532200(P2012-532200A)

(43)【公表日】2012年12月13日

(86)【国際出願番号】US2010041078

(87)【国際公開番号】WO2011005769

(87)【国際公開日】20110113

【審査請求日】2013年7月3日

(31)【優先権主張番号】61/223,196

(32)【優先日】2009年7月6日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/256,912

(32)【優先日】2009年10月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507397054

【氏名又は名称】ヴァリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100148596

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 和弘

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】アンダーソン， デイヴィッド， イー．

(72)【発明者】

【氏名】オグレル， アンドレイ

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５０２２９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０９−５０３２２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０５１３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５２９１６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５３８１０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３５６５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２３７１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Vaccine，２００４年，22，p.2425-2429

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／４８

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

非イオン性界面活性剤、ステロール、及びイオン性界面活性剤を含む小胞形成脂質の溶融混合物を用意するステップと、
前記溶融混合物を、抗原を含む水溶液に添加し、前記水溶液をホモジナイズすることで抗原含有小胞を形成するステップと、
抗原を含む前記水溶液を、前記溶融混合物を抗原を含む水溶液に添加するステップ中に５０℃未満の温度に保つステップと
を含む、
抗原含有小胞を調製する方法。

【請求項2】

前記抗原含有小胞が形成された後に、ＴＬＲ−３アゴニストを添加するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＴＬＲ−３アゴニストが、ポリリボイノシン酸：ポリリボシチジル酸又は
ポリ−Ｌ−リジンカルボキシメチルセルロースにより安定化された、ポリリボイノシン酸：ポリリボシチジル酸である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＴＬＲ−３アゴニストが、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コハク酸ジメチルバッファー（ＤＭＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マンニトール、又はデキストランである、凍結保護物質と共に添加される、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

前記小胞形成脂質の前記溶融混合物を用意するステップが、
小胞形成脂質の溶融混合物及びＴＬＲ−４アゴニストを用意するステップを含む、
請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ＴＬＲ−４アゴニストが、弱毒化された脂質Ａ誘導体である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ＴＬＲ−４アゴニストが、脂質Ａのモノホスホリル誘導体である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＴＬＲ−４アゴニストが、脂質Ａの３−デアシルモノホスホリル誘導体である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記抗原が、ウイルス抗原である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記抗原が、ポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記抗原が、熱不安定性である、請求項９又は１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）に基づき、２００９年７月６日に申請された米国特許仮出願第６１／２２３，１９６号、及び２００９年１０月３０日に申請された米国特許仮出願第６１／２５６，９１２号の優先権を主張し、各号の全内容を本明細書により参照により援用する。
［背景］

【0002】

[0002]小胞は細胞膜のモデルとして１９６０年代に初めて記載された（Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１３巻：２３８〜２５２頁、１９６５年を参照されたい）。小胞は小分子の薬物、ワクチンアジュバント効果（ａｄｊｕｖａｎｃｙ）の送達、遺伝子移入、及び診断画像でいくつかの用途を見出した（例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編集、Ｉｎｆｏｒｍａ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、２００６年、及びＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２６４）、第２版、Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ及びＶｏｌｋｍａｒ Ｗｅｉｓｓｉｇ編集、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、米国、２００３年を参照されたい）。

【0003】

[0003]小胞の調製方法についていくつか記載されている（例えば、上記文献で引用されている参考文献、並びにＷａｌｄｅ及びＩｃｈｉｋａｗａ、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、第１８巻：１４３〜１７７頁、２００１年を参照されたい）。しかし、当技術分野では、小胞内に物質を取り込むのに利用可能な方法がなおも必要とされている。

【0004】

[0004]当技術分野において記載されてきた１つの方法として、いわゆる３−ステップ溶融法が挙げられる。小胞形成脂質は、最初に高温（例えば、１２０℃）で溶融される。第２ステップでは、水性バッファー（例えば、重炭酸バッファー）を溶融脂質に添加することによりエマルジョンが作製される。最終的に、取り込み対象物質は、凍結乾燥前に低温（例えば、５０℃）でエマルジョンの成分と共にホモジナイズされる。或いは、エマルジョンからなる小胞は凍結乾燥され、次に取り込み対象物質の存在下で再構成される。

【0005】

[0005]上記のような方法は、高温に耐え得る物質、及び／又は空の小胞内に迅速に拡散することができる小分子を取り込むのには十分適しているものの、我々は、ワクチンに一般的に含まれる抗原（例えば、ポリペプチド、ウイルス等）のようなタイプを取り込むのには不向きであることを見出した。特に、我々は、これらの方法では取り込み効率が低く、もとの抗原の活性（例えば、免疫反応により測定される）が劇的に低減し得ることを認めた。したがって、当技術分野では、抗原活性に与える影響を最低限に抑えつつ、抗原を取り込む能力を有する小胞を調製する方法を必要としている。

【0006】

［概要］
[0006]１つの態様では、本開示は、抗原含有小胞が形成されるように、小胞形成脂質の溶融混合物を用意するステップと、次に抗原を含む水溶液に当該溶融混合物を添加するステップとを含む、小胞の調製方法を提供する。

【0007】

[0007]別の態様では、本開示は、抗原含有小胞が形成されるように、凍結乾燥された脂質生成物を用意するステップと、抗原を含む水溶液で凍結乾燥された脂質生成物を再水和するステップとを含む、小胞の調製方法を提供する。凍結乾燥された脂質生成物は、溶融脂質混合物が生成するように小胞形成脂質を溶融し、次に当該溶融脂質混合物を凍結乾燥することにより調製される。

【0008】

[0008]別の態様では、本開示は、上記方法を用いて調製される抗原含有小胞製剤を提供する。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞製剤は、先行技術の方法を用いて実現し得るレベルよりも高い抗原取り込みレベルを示す。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞製剤は、先行技術の方法を用いて実現し得るレベルよりも高い抗原活性レベルを示す。

【0009】

[0009]なおも別の態様では、本開示は、第１の容器に凍結乾燥された脂質生成物を、及び第２の容器に抗原を含む水溶液を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットには、抗原含有小胞製剤が生成するように、２つの容器の内容物を混合する際の説明書も含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】[0010] 図１は、実施例１の３−ステップ溶融法、及び実施例２の逆転式２−ステップ溶融法を用いて調製された２つの小胞製剤に関する平均粒子サイズを比較する図である。製剤は凍結乾燥され、次に不活性化されたＡ型肝炎抗原２μｇを含有するバッファーの存在下で再水和された。小胞サイズは安定性を示す優れた指標であるが、これはマスターサイザーを用いて水和直後、及び２、４、及び６時間後に測定された。

【図2】[0011] 図２は、Ａ型肝炎抗原含有小胞により引き起こされた免疫反応を示す図である。空の小胞は、実施例１の３−ステップ溶融法、及び実施例２の逆転式２−ステップ溶融法を用いて調製された。製剤は凍結乾燥され、次に不活性化されたＡ型肝炎抗原２μｇを含有するバッファーの存在下で再水和された。マウスは、第０、１４、及び２８日目に経口により３回免疫感作を受け、血清は、最後のワクチン接種後１４日経過して反応性について試験された。各記号は、個々の動物から得られた血清のエンドポイント力価を表す。

【図3】[0012] 図３は、フローサイトメトリー法により証明された通り、小胞内の胆汁塩内容物が未成熟樹状細胞の成熟に影響を及ぼすことを示す図である。未成熟樹状細胞の成熟は、抗−ＭＨＣＩＩ及び抗−ＣＤ８６抗体を用いて、フローサイトメトリー法により測定された。成熟したＤＣは、両抗体に対する二重の陽性として規定された。未成熟の樹状細胞は、実施例２のステップ１及び２で調製された非イオン性界面活性剤脂質小胞（ＮＩＳＶ）（抗原をその後に添加しない）、及び総脂質に対する２種類の異なるモル比（０．１及び０．５）の胆汁酸を用いて又は用いないで処理された。陽性対照として、未成熟の樹状細胞がＴＮＦ−α単独で処理された。

【図4】[0013] 図４は、実施例１及び実施例２の方法により抗原を全く添加しないで調製された、典型的な小胞の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを比較する図である。全てのスペクトルは２５℃で収集された。

【0011】

［定義］
[0014]本開示全体を通じて、以下のパラグラフで規定されるいくつかの用語が用いらる。

【0012】

[0015]本明細書で用いる場合、用語「抗原」とは、抗体により認識され得る１つ又は複数のエピトープ（直線状、高次構造状、又は両方）を含有する物質を意味する。特定の実施形態では、抗原はウイルス、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類等であり得る。用語「抗原」とは、サブユニット抗原（すなわち、抗原が天然の状態で関連する生物全体から分離及び独立した抗原）、並びに死滅した、弱毒化された、又は不活性化された細菌、ウイルス、菌類、寄生虫、又はその他の微生物の両方を表す。特定の実施形態では、抗原は「免疫原」であり得る。

【0013】

[0016]本明細書で用いる場合、用語「取り込むこと（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）」とは、物質及び小胞間の任意の種類の物理的関連付け、例えばカプセル化、接着（小胞の内壁若しくは外壁）、又は物質の押し出しを含む又は含まない壁内への埋め込みを意味する。この用語は、用語「負荷すること（ｌｏａｄｉｎｇ）」及び「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と交換可能に用いられる。

【0014】

[0017]本明細書で用いる場合、用語「免疫反応」とは、動物で誘発された反応を意味する。免疫反応は、細胞性免疫、体液性免疫を意味する場合があり、又はその両方を含む場合もある。また、免疫反応は、免疫系の一部分に限定される場合もある。例えば、特定の実施形態では、免疫原性製剤は、増強したＩＦＮγ反応を誘発し得る。特定の実施形態では、免疫原性製剤は粘膜性ＩｇＡ反応（例えば、鼻腔及び／又は直腸洗浄法で測定される）を誘発し得る。特定の実施形態では、免疫原性製剤は、全身的ＩｇＧ反応（例えば、血清で測定される）を誘発し得る。

【0015】

[0018]本明細書で用いる場合、用語「免疫原性」とは、宿主動物において非宿主本体（例えば、Ａ型肝炎ウイルス又はＢ型肝炎ウイルス）を標的とする免疫反応を引き起こす能力を意味する。特定の実施形態では、この免疫反応は、特定の感染性生物（例えば、Ａ型肝炎ウイルス又はＢ型肝炎ウイルス）を標的とするワクチンにより誘発される防御免疫性の基礎を形成する。「免疫原」とは免疫原性物質（例えば、分子）である。

【0016】

[0019]本明細書で用いる場合、用語「治療有効量」とは、治療対象患者において重要な利益を示すのに十分な量を意味する。免疫原性製剤の治療有効量は、所望の生物学的エンドポイント、製剤の性質、投与経路、治療対象患者の健康状態、大きさ、及び／又は年齢等の要因に依存して変化し得る。

【0017】

[0020]本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」とは、タンパク質（すなわち、ペプチド結合により相互に連結した少なくとも２つのアミノ酸からなる糸）を意味する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはアミノ酸以外の部分を含み得る（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質等であり得る）、及び／又はそうでなければ処理可能若しくは改変可能である。当業者であれば、「タンパク質」が細胞により産生されるような完全なポリペプチド鎖（シグナル配列を有する、又は有さない）であり得る、又はその一部分であり得ることを認識するであろう。当業者であれば、タンパク質は、時には、例えば１つ又は複数のジスルフィド結合により連結した、又はその他の手段により会合した複数のポリペプチド鎖を含み得ることを認識するであろう。ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方を含有し得るが、また当技術分野において公知の任意の様々なアミノ酸修飾体又は類似体も含有し得る。有用な修飾として、例えば末端のアセチル化、アミド化等が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、合成アミノ酸、及びこれらを組み合わせたものを含み得る。

【0018】

[0021]本明細書で用いる場合、用語「多糖類」とは、糖のポリマーを意味する。このポリマーとして、天然の糖（例えば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクトロース、及びシアロース）、及び／又は改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、及びヘキソース）を挙げることができる。典型的な多糖類としては、デンプン、グリコーゲン、デキストラン、セルロース等が挙げられる。

【0019】

[0022]本明細書で用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーを意味する。このポリマーとして、天然のヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、及び２−チオシチジン）、化学的に改変された塩基、生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）、挿入塩基、改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノース、及びヘキソース）、又は改変されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）を挙げることができる。

【0020】

[0023]本明細書で用いる場合、用語「小分子治療物質」とは、いくつかの炭素−炭素結合を含有し得る、及び約１５００Ｄａ未満（例えば、約１０００Ｄａ未満、約５００Ｄａ未満、又は約２００Ｄａ未満）の分子量を有し得る、非ポリマー性の治療分子を意味する。小分子治療物質は、研究室で合成可能であり（例えば、工学的に作製した微生物等を用いたコンビナトリアル合成による）、又は天然の状態で発見され得る（例えば、天然物）。一般的に、小分子治療物質は、生物学的事象を変化させ、阻害し、活性化し、又は影響を及ぼし得る。例えば、小分子治療物質として抗ＡＩＤＳ物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿病物質、免疫抑制物質、抗ウイルス物質、酵素阻害物質、神経毒素、オピオイド、催眠物質、抗ヒスタミン物質、潤滑物質、精神安定剤、抗痙攣薬、筋弛緩薬及び抗パーキンソン物質、チャンネル遮断薬を含む鎮痙薬及び筋収縮薬、縮瞳薬及び抗コリン作動薬、抗緑内障化合物、抗寄生虫及び／又は抗原生動物化合物、細胞増殖阻害薬及び抗接着分子を含む細胞−細胞外マトリックス相互作用のモジュレーター、血管拡張薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質合成阻害物質、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱剤、ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症薬、抗血管新生因子、分泌抑制因子、抗凝固物質及び／又は抗血栓薬、局所麻酔薬、眼薬、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病物質、鎮吐薬、及び造影剤を挙げることができるが、但し、これらに限定されない。本開示の方法で使用するのに適する典型的な小分子のより完全なリストは、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐａｔｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｘｅｌ Ｋｌｅｅｍａｎｎ及びＪｕｒｇｅｎ Ｅｎｇｅｌ編集、Ｔｈｉｅｍｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９９年；Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｓｕｓａｎ Ｂｕｄａｖａｒｉら編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年、及びＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ−２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ ｆｏｒｍｕｌａｒｙ−２０、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．出版、２００１年に見出すことができる。好ましくは、但し必ずしも必要ではないが、小分子は、しかるべき政府機関又は当局によりすでに使用上安全かつ有効であるとみなされたものである。例えば、米国特許法施行規則§§３３０．５、３３１〜３６１、及び４４０〜４６０に基づき、ＦＤＡによりリスト化されたヒト用途の薬物、並びに米国特許法施行規則§§５００〜５８９に基づき、ＦＤＡによりリスト化された獣医学用途の薬物は、すべて本開示の方法に基づく用途で許容可能と考えられる。

【0021】

[0024]本明細書で用いる場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」（又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）とは、疾患、疾患の１つ又は複数の症状、又は疾患素因を緩和、軽減、変更、回復、改善し、又はこれに影響を及ぼすことを目的として、疾患、疾患の症状、又は疾患素因を有する患者に製剤を投与することを意味する。特定の実施形態では、用語「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、患者にワクチン接種することを意味する。

【0022】

［いくつかの実施形態の詳細な説明］
１．小胞を調製する方法
[0025]本開示は小胞を調製する方法を提供する。小胞は、任意選択的にその他の分子と共に脂質を含有する１つ又は複数の二重層に封入された水性区画を一般的に有する。例えば、下記でより詳細に議論されるように、いくつかの実施形態では、本開示の小胞は、粘膜を横断する脂質輸送を促進する輸送促進分子（例えば、胆汁塩）を含む。

【0023】

[0026]１つの態様では、本開示は小胞形成脂質の溶融混合物を用意するステップと、次に抗原含有小胞が形成されるように抗原を含む水溶液に当該溶融混合物を添加するステップとが含まれる小胞を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原を含む水溶液は温度制御を受ける。いくつかの実施形態では、抗原を含む水溶液は、添加するステップの間、約５０℃未満の温度（例えば、約４０℃未満、約３０℃未満等）に保たれる。いくつかの実施形態では、抗原を含む水溶液は、約２５℃〜約５０℃の間の温度範囲に保たれる。いくつかの実施形態では、抗原を含む水溶液は、室温に保たれる。

【0024】

[0027]小胞形成脂質の溶融混合物は、任意の方式で入手可能であり、例えば脂質が溶融混合物を形成するように溶融されると理解される。いくつかの実施形態では、脂質は１２０℃〜１５０℃の間の温度範囲（例えば、１２０℃〜１２５℃の間、１２０℃〜１３０℃の間、１２０℃〜１４０℃の間、１３０℃〜１４０℃の間、１３５℃〜１４５℃の間、又は１４０℃〜１４５℃の間）で溶融される。いくつかの実施形態では、脂質は約１２０℃で溶融される。いくつかの実施形態では、脂質は約１２５℃で溶融される。いくつかの実施形態では、脂質は約１３０℃で溶融される。いくつかの実施形態では、脂質は約１３５℃で溶融される。いくつかの実施形態では、脂質は約１４０℃で溶融される。いくつかの実施形態では、脂質は約１４５℃で溶融される。いくつかの実施形態では、脂質は約１５０℃で溶融される。

【0025】

[0028]別の態様では、本開示は、凍結乾燥された脂質生成物を用意するステップと、抗原含有小胞が形成されるように、当該凍結乾燥された脂質生成物を抗原を含む水溶液で再水和するステップとが含まれる、小胞を調製する方法を提供する。凍結乾燥された脂質生成物は、溶融脂質混合物が生成するように小胞形成脂質を溶融し、次に当該溶融脂質混合物を凍結乾燥することにより調製される。

【0026】

[0029]いかなる理論にも拘束されることを欲することなく、抗原の水溶液を凍結乾燥された脂質生成物に添加することにより、抗原の存在下で小胞が形成されると考えられる。これは、観察された高い取り込み効率を説明し得る。更に、本開示の方法では、有機溶媒及び高温に対する抗原の暴露が回避される。いかなる理論にも限定されることを欲することなく、これは、取り込まれた抗原が、得られた製剤中で高い活性（すなわち、抗原性及び／又は免疫原性）を有することを説明し得る。

【0027】

小胞形成脂質
[0030]脂質は、一般的に水に不溶性であるが、非極性有機溶媒（例えば、エーテル、クロロホルム、アセトン、ベンゼン等）に可溶性の有機分子である。脂肪酸は、飽和又は不飽和炭化水素鎖に連結した酸部分が含まれる、脂質の１つのクラスである。具体例として、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等が挙げられる。脂肪酸のアルカリ金属塩は、脂肪酸そのものよりも一般的に水に可溶性である。８個以上の炭素を有する炭化水素鎖が含まれる脂肪酸及びその塩は、同一分子内に親水的（頭部）及び疎水的（尾部）な領域の両方が存在することから、多くの場合両親媒性特性を示す。極性の頭部基を備える非イオン性脂質も両親媒性（すなわち、界面活性）特性を示し得る。脂肪酸とグリセリン（１，２，３−トリヒドロキシプロパン）とのトリエステルは、動物脂肪及び植物油に一般的に認められるトリグリセリドとして公知である脂質の別のクラスを構成する。脂肪酸と長鎖の一価アルコールとのエステルは、ワックス中に認められるような脂質の別のクラスを形成する。リン脂質も脂質の別のクラスである。これらは、グリセリン若しくはスフィンゴシンと脂肪酸及びリン酸とのエステル又はアミド誘導体であるという点においてトリグリセリドと類似する。得られたホスファチジン酸のリン酸部分は、リン脂質それ自身においてエタノールアミン、コリン、又はセリンと更にエステル化可能である。この方法は、先行技術（例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編集、Ｉｎｆｏｒｍａ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、２００６年、及びＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２６４）、第２版、Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ及びＶｏｌｋｍａｒ Ｗｅｉｓｓｉｇ編集、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、米国、２００３年）が記載する任意の脂質が含まれる小胞を形成する能力を有する、任意の脂質と共に利用可能であると理解される。

【0028】

[0031]いくつかの実施形態では、小胞形成脂質はリン脂質である。あらゆる天然又は合成リン脂質が利用可能である。非限定的に、具体的なリン脂質の例として、Ｌ−α−（ジステアロイル）レシチン、Ｌ−α−（ジアパルミトイル）レシチン、Ｌ−α−ホスファチド酸、Ｌ−α−（ジラウロイル）−ホスファチジン酸、Ｌ−α（ジミリストイル）ホスファチジン酸、Ｌ−α（ジオレオイル）ホスファチジン酸、ＤＬ−α（ジパルミトイル）ホスファチジン酸、Ｌ−α（ジステアロイル）ホスファチジン酸、及び脳、肝臓、卵黄、心臓、大豆等から、又は合成により調製される様々なタイプのＬ−α−ホスファチジルコリン、及びこれらの塩が挙げられる。

【0029】

[0032]いくつかの実施形態では、小胞形成脂質は非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の小胞は本明細書において「ＮＩＳＶ」と呼ぶ。非限定的に、非イオン性界面活性剤の適する例として、グリセリンをベースにエステル結合した界面活性剤が挙げられる。かかるグリセリンエステルは、２つのより高級の脂肪族アシル基のうちの１つ、例えば各アシル部分内に少なくとも１０個の炭素原子を含有する脂肪族アシル基のうちの１つを含み得る。かかるグリセリンエステルをベースとする界面活性剤は、複数のグリセリンユニット、例えば最大５個のグリセリンユニットを含み得る。グリセリンモノエステル、例えばＣ_１２〜Ｃ_２０のアルカノイル又はアルケノイル部分を含有するもの、例えば、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、オレイル、又はステアロイルが利用可能である。典型的な非イオン性界面活性剤は１−モノパルミトイルグリセリンである。

【0030】

[0033]いくつかの実施形態では、エーテル結合型界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としても利用可能である。例えば、最大４個の炭素原子からなる低級脂肪性グリコール、例えばエチレングリコール、を有するグリセリン又はグリコールをベースとしたエーテル結合型界面活性剤が適する。かかるグリコールをベースとする界面活性剤は、複数のグリコールユニット、例えば最大５個のグリコールユニットを含み得る（例えば、ジグリコールセチルエーテル及び／又はポリオキシエチレン−３−ラウリルエーテル）。Ｃ_１２〜Ｃ_２Ｏアルカニル又はアルケニル部分を含有するもの、例えばカプリル、ラウリル、ミリスチル、セチル、オレイル、又はステアリルを含め、グリコール又はグリセリンモノエーテルが利用可能である。利用可能なエチレンオキサイド縮合生成物には、ＰＣＴ国際公開第８８／０６８８２号パンフレットで開示されているもの（例えば、ポリオキシエチレン高級脂肪性エーテル及びアミン界面活性剤）が含まれる。典型的なエーテル結合型界面活性剤には、１−モノセチルグリセリンエーテル及びジグリコールセチルエーテルが含まれる。

【0031】

その他の成分
[0034]いくつかの実施形態では、小胞は、小胞形成を阻害しない限り、その他の脂質及び非脂質成分を含有し得る。これらの成分は、小胞形成脂質と同時混合可能、及び／又は抗原（複数可）と同時混合可能であると理解される。いくつかの実施形態では、我々は、これらの成分を小胞形成脂質と同時混合するのが有利であり得ることを見出した。

【0032】

[0035]いくつかの実施形態では、小胞には、粘膜を横断する脂質の輸送を促進する輸送促進分子が含まれ得る。米国特許第５，８７６，７２１号に記載するように、輸送促進物質として様々な分子が利用可能である。例えば、側鎖のＣ_２３炭素原子がカルボン酸及び／又はその誘導体を担持するコレステロール誘導体が、輸送促進物質として利用可能である。かかる誘導体には、「胆汁酸」であるコール酸及びケノデオキシコール酸、そのグリシン又はタウリンとの結合体生成物、例えばグリココール酸及びタウロコール酸等、デオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸を含む誘導体、及びこれらの酸のそれぞれの塩が含まれるが、但し、これらに限定されない。胆汁酸又は塩が更に含まれるＮＩＳＶは、本明細書では「バイロソーム（ｂｉｌｏｓｏｍｅ）」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、輸送促進物質には、アシルオキシ化アミノ酸、例えばアシルカルニチンとその塩が含まれる。例えば、パルミトイルカルニチン等のＣ_６〜２０アルカノイル又はアルケノイル部分を含有するアシルカルニチンが輸送促進物質として利用可能である。本明細書で用いる場合、用語アシルオキシ化アミノ酸には、第一、第二、及び第三アミノ酸、並びにα、β、及びγアミノ酸が含まれるように意図されている。アシルカルニチンは、アシルオキシ化γアミノ酸の例である。小胞は、複数のタイプの輸送促進物質、例えば１つ又は複数の異なる胆汁塩、及び１つ又は複数のアシルカルニチンを含み得ると理解される。輸送促進物質（複数可）は、存在する場合、小胞形成脂質の４０〜４００重量％を一般的に構成する（例えば、６０〜１００重量％、又は７０〜９０重量）。いくつかの実施形態では、輸送促進物質（複数可）は、存在する場合、小胞形成脂質の１〜４０重量％を構成する（例えば、１〜２０重量％、１〜２５重量％、１〜３０重量％、１〜３５重量％、２〜２５重量％、２〜３０重量％、又は２〜３５重量％）。

【0033】

[0036]特定の実施形態では、小胞は輸送促進分子を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、小胞は、コール酸及びケノデオキシコール酸等の「胆汁酸」、そのグリシン又はタウリンとの結合体生成物、例えばグリココール酸及びタウロコール酸等、デオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸を含む誘導体、及びこれらの酸のそれぞれの塩を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、小胞は、アシルオキシ化アミノ酸、例えばアシルカルニチンとその塩、及びパルミトイルカルニチン等を欠く場合がある。

【0034】

[0037]いくつかの実施形態では、小胞には、例えば小胞がマイナス電荷を帯びるようにするためにイオン性界面活性剤が含まれ得る。例えば、これは小胞を安定化し、効果的な分散を実現するのに役立つ可能性がある。非限定的に、高級アルカノン酸及びアルケン酸（例えば、パルミチン酸、オレイン酸）等の酸性物質、又はジアルキルホスフェート等のホスフェートを含む酸性基を含有するその他の化合物（例えば、ジセチルホスフェート、又はホスファチジン酸、又はホスファチジルセリン）、及び高級アルキルサルフェート（例えば、セチルサルフェート）等の硫酸モノエステルが、いずれもこの目的で利用可能である。イオン性界面活性剤（複数可）は、存在する場合には、小胞形成脂質の１〜３０重量％を一般的に構成する。例えば、２〜２０重量％、又は５〜１５重量％を構成する。いくつかの実施形態では、イオン性界面活性剤（複数可）は、存在する場合には、小胞形成脂質の１〜５０重量％を構成する（例えば、１〜３５重量％、５〜４０重量％、１０〜４０重量％、１５〜４０重量％、２０〜４０重量％、又は２０〜３５重量％）。

【0035】

[0038]いくつかの実施形態では、小胞には、二重層の形成を促進する高分子量のしかるべき疎水性物質（ステロイド等、例えばコレステロール等のステロール）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ステロイドが存在すれば、小胞の物理特性を支配する二重層を形成する際に役立ち得る。ステロイドは、存在する場合には、小胞形成脂質の２０〜１２０重量％を一般的に構成する。例えば、２５〜９０重量％、又は３５〜７５重量％である。いくつかの実施形態では、ステロイドは、存在する場合には、小胞形成脂質の２５〜９５重量％、２５〜１０５重量％、３５〜９５重量％、又は３５〜１０５重量％を構成する。

【0036】

[0039]いくつかの実施形態では、凍結乾燥する前の任意の溶液又は混合物中には、凍結保護物質が含まれ得る。典型的な凍結保護物質とて、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コハク酸ジメチルバッファー（ＤＭＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マンニトール、及びデキストランが挙げられる。

【0037】

[0040]いくつかの実施形態では、本開示の小胞は、イオン性界面活性剤又はステロイドを更に含むバイロソーム（ｂｉｌｏｓｏｍｅ）である。いくつかの実施形態では、バイロソームには、イオン性界面活性剤及びステロイドの両方が含まれ得る。

【0038】

[0041]いくつかの実施形態では、本開示の小胞は、輸送促進分子が欠如し、イオン性界面活性剤又はステロイドを更に含む、非イオン性界面活性剤小胞（ＮＩＳＶ）である。いくつかの実施形態では、小胞は、コール酸及びケノデオキシコール酸等の「胆汁酸」、そのグリシン又はタウリンとの結合体生成物、例えばグリココール酸及びタウロコール酸等、デオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸を含む誘導体、及びこれらの酸のそれぞれの塩を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、小胞は、アシルオキシ化アミノ酸、例えばアシルカルニチンとその塩、及びパルミトイルカルニチン等を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、ＮＩＳＶは、輸送促進分子（例えば、上記の分子のいずれか）が欠如し、並びにイオン性界面活性剤及びステロイドの両方を含む場合がある。

【0039】

凍結乾燥
[0042]上記及び下記で議論されるように、いくつかの実施形態では、本開示の方法には、凍結乾燥するステップが含まれる（溶融脂質混合物のステップであるか、又は抗原含有小胞の製剤のステップであるかを問わない）。凍結乾燥は、生成物の長期安定性を高めるのに用いられる確立された方法である。物理的及び化学的安定性の強化は分解及び加水分解を防止することにより実現されると考えられている。凍結乾燥には対象調製物を凍結し、次に周囲圧力を減圧して（及び任意選択的に調製物を加熱して）凍結された溶媒（複数可）を固相から気体に直接昇華させるステップ（すなわち、乾燥段階）が含まれる。特定の実施形態では、乾燥段階は一次及び二次乾燥段階に分割される。

【0040】

[0043]凍結段階は、調製物を容器（例えば、フラスコ、エッペンドルフチューブ等）内に配置し、任意選択的に容器を機械的冷却法（例えば、ドライアイスとメタノール、液体窒素等を用いて）により冷却された浴漕内で回転することにより実施可能である。いくつかの実施形態では、凍結ステップには、調製物をその共晶点よりも低い温度に冷却することが含まれる。共晶点は調製物の固相及び液相が共存し得る最低温度で生じるので、この点よりも低い温度で物質を維持することにより、次のステップで蒸発よりも昇華が生じることが保証される。

【0041】

[0044]乾燥段階（又は２つの乾燥段階が用いられる場合には一次乾燥段階）には、圧力を減圧するステップと、任意選択的に溶媒（複数可）が昇華し得る点まで調製物を加熱するステップとが含まれる。この乾燥段階では、溶媒（複数可）の大部分が調製物から一般的に取り除かれる。凍結段階及び乾燥段階は必ずしも異なる段階ではなく、任意の方式で組み合わせることができると認識される。例えば、特定の実施形態では、凍結段階及び乾燥段階は重複し得る。

【0042】

[0045]二次乾燥段階が、任意選択的に凍結段階において吸着された残留溶媒（複数可）を取り除くのに利用可能である。いかなる理論にも拘束されることを欲することなく、この段階には、溶媒分子と凍結された調製物との間で形成されたあらゆる物理化学的相互作用を破壊するように温度を上げるステップを含む。乾燥段階が完了したら、凍結乾燥された生成物が任意選択的に密封される前に、不活性気体（例えば、窒素又はヘリウム）を用いて真空は破壊され得る。

【0043】

再水和
[0046]上記で議論されたように、いくつかの実施形態では、本開示の方法には、抗原含有小胞が形成されるように、凍結乾燥された脂質生成物を再水和するステップが含まれる。これは、凍結乾燥された脂質生成物を、抗原を含む水溶液と共に混合することにより実現される。いくつかの実施形態では、これには、凍結乾燥された脂質生成物に水溶液を添加するステップが含まれる。

【0044】

[0047]いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約１０％を含有する。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約２０％を含む。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約３０％を含む。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約４０％を含む。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約５０％を含む。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約６０％を含む。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約７０％を含む。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約８０％を含む。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞は、再水和ステップで添加された抗原の少なくとも約９０％を含む。

【0045】

[0048]いくつかの実施形態では、水溶液にはバッファーが含まれる。用いられるバッファーは、水溶液中の１つの抗原又は複数の抗原の性質に一般的に依存する。例えば、非限定的に、ＰＣＢバッファー、Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４バッファー、ＰＢＳバッファー、ビシンバッファー、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー等が利用可能である。ＰＣＢバッファーは、プロピオン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、及びビス−トリスプロパンを２：１：２のモル比で混合することにより製造される。添加するＨＣｌの量を変化させることにより、４〜９のｐＨ範囲で緩衝効果を得ることができる。いくつかの実施形態では、炭酸バッファーが利用可能である。

【0046】

[0049]いくつかの実施形態では、上記のいずれかの方法により調製された抗原含有小胞の製剤は、将来利用するために凍結乾燥可能であり、その後使用前に再水和可能である（例えば、滅菌水又は水性バッファーを用いて）。いくつかの実施形態では、アジュバントがこの再水和ステップ期間中に添加可能である（例えば、滅菌水又は水性バッファーに含めることにより）。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞の製剤は、凍結乾燥する前に−８０℃で貯蔵可能である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された製剤は、−２０℃〜１０℃の温度範囲で貯蔵可能である（例えば、−５℃〜１０℃、０℃〜５℃、又は２℃〜８℃）。
小胞サイズ及び処理

【0047】

[0050]小胞製剤には、ある範囲のサイズを有する小胞の混合物が一般的に含まれると認識される。下記に掲載する直径数値は、混合物内の最高出現頻度の直径に対応するものと理解される。いくつかの実施形態では、製剤中の小胞の＞９０％は、最高出現頻度の数値の５０％の範囲以内に分布する直径（例えば、１０００±５００ｎｍ）を有する。いくつかの実施形態では、分布はより狭くなる可能性があり、例えば、製剤中の小胞の＞９０％が、最高出現頻度の数値の４０、３０、２０、１０、又は５％の範囲内に分布する直径を有し得る。いくつかの実施形態では、小胞形成を促進する及び／又は小胞粒子サイズを変更するために、音波処理又は超音波処理が利用可能である。いくつかの実施形態では、小胞サイズ分布を調節するのに濾過、透析、及び／又は遠心分離が利用可能である。

【0048】

[0051]一般的に、本開示の方法に基づき製造される小胞は、任意のサイズであり得る。いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｎｍ〜約１５μｍの範囲内、例えば約８００ｎｍ〜約１．５μｍの直径を有する小胞を含み得る。特定の実施形態では、小胞は１０μｍを上回る直径、例えば約１５μｍ〜約２５μｍを有し得る。特定の実施形態では、小胞は約２μｍ〜約１０μｍの範囲、例えば、約１μｍ〜約４μｍの直径を有し得る。特定の実施形態では、小胞は１５０ｎｍ未満、例えば約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有し得る。

【0049】

抗原
[0052]一般的に、任意の１種類又は複数種類の抗原が、本開示の方法を用いて取り込まれ得ると理解される。これまでに議論したように、１種類又は複数種類の抗原が、任意の方式で小胞と会合し得る。いくつかの実施形態では、１種類又は複数種類の抗原が、小胞の水性コア内に存在し得る。しかし、その疎水性度に応じて、抗原も部分的に又は完全に二重層と会合し得る。一般的に、いくつかの実施形態では、小胞製剤には、小胞と会合しない量の１種類又は複数種類の抗原が含まれ得ると理解される。

【0050】

[0053]いくつかの実施形態では、本開示の方法はワクチンに含まれる１種類又は複数種類の抗原を取り込むのに利用可能である。表１は適するワクチンの非限定的なリストである。

【0051】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0052】

[0054]下記セクションでは、発明者らは利用可能でありうるいくつかの典型的な抗原について議論する。

【0053】

Ａ型肝炎
[0055]Ａ型肝炎は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）によって引き起こされる重篤な肝臓疾患である。ウイルスは、Ａ型肝炎に罹患した患者の便に見出される。表１に示すように、いくつかの不活性化されたＡ型肝炎ワクチンが現在認可されている。例えば、ハブリックス（Ｈａｖｒｉｘ）（登録商標）はＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓにより製造されている。米国特許第６，１８０，１１０号は、ＨＡＶのＨＭ１７５系統（米国特許第４，８９４，２２８号）に起源を有する、ハブリックス（登録商標）で用いられている弱毒化されたＨＡＶ系統（ＨＡＶ４３８０）について記載する。ハブリックス（登録商標）は、ホルマリンで不活性化されたＨＡＶの滅菌懸濁液を含有する。ウイルス抗原活性がＥＬＩＳＡを用いた基準とされ、ＥＬＩＳＡ単位（Ｕ）として表される。成人投与用のワクチン各１ｍｌはウイルス抗原１４４０Ｕから構成され、水酸化アルミニウム（ミョウバン）としてアルミニウム０．５ｍｇに吸着されている。ハブリックス（登録商標）（全てのその他の認可されているＡ型肝炎ワクチンと同様に）が筋肉内（ＩＭ）投与用の滅菌懸濁液として供給されている。ハブリックス（登録商標）を１回投与すれば、少なくとも短期的な保護がもたらされるが、６〜１２ヶ月後に行われる第２回目のブースター投与が、長期的な保護を保証するために現在推奨されている。

【0054】

[0056]不活性化されたＡ型肝炎ワクチンの別の例である、エイムゲン（ＡＩＭＭＵＧＥＮ）（登録商標）が日本で認可され、化血研により１９９４年以降市販されている。エイムゲン（登録商標）は、ホルムアルデヒドで不活性化されたＨＡＶの滅菌懸濁液を含有する。推奨される成人用量は、０、１、及び６ヶ月目に実施される０．５μｇＩＭである。

【0055】

[0057]本明細書で用いる場合、表現「ＨＡＶ抗原」は、ヒトのＨＡＶを標的とする中和抗体を刺激する能力を有する任意の抗原を意味する。ＨＡＶ抗原は、弱毒化した生ウイルス粒子、若しくは不活性化された弱毒化ウイルス粒子を含み得るが、又は組換えＤＮＡ技術により好都合に入手可能な、例えばＨＡＶカプシド若しくはＨＡＶウイルスタンパク質であり得る。

【0056】

[0058]１つの態様では、本開示は、不活性化された又は弱毒化されたＡ型肝炎ウイルス（本明細書では「Ａ型肝炎ウイルス抗原」又は「ウイルス抗原」とも呼ばれる）が含まれる免疫原製剤を調製する方法を提供する。当該方法は、不活性化されたＡ型肝炎ウイルスを調製するのに利用可能であると認識される。一般的に、これらの方法には、Ａ型肝炎ウイルスを宿主細胞中で繁殖させ、宿主細胞を溶解してウイルスを放出させ、単離し、次にウイルス抗原を不活性化するステップが含まれる。細胞培養培地を除去した後、細胞は溶解されて懸濁液を形成する。この懸濁液は限外濾過及びゲル浸透クロマトグラフィー法により精製される。次に、精製されたライセートは、ウイルスの不活性化を保証するために、ホルマリンで処理される（例えば、Ａｎｄｒｅら、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、第３７巻：７２〜９５頁、１９９０年を参照されたい）。

【0057】

[0059]エイムゲン（登録商標）を調製する際には、Ａ型肝炎ウイルス系統ＫＲＭ０００３（Ａ型肝炎患者の糞便から単離された野生型ＨＡＶより確立された）を、ＧＬ３７細胞（アフリカミドリザル腎臓の親細胞系統からワクチン生産用に確立された細胞系統）内で繁殖させる。ＧＬ３７細胞はＨＡＶ系統ＫＲＭ０００３を用いて接種され、ウイルス抗原が捕集され、大規模に精製され、ホルムアルデヒドで不活性化される。

【0058】

[0060]市販されているが認可されていないワクチンである、不活性化されたＡ型肝炎ウイルスの別の例として、Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＡ型肝炎抗原（ＨＡＶ−ａｇ）が挙げられる。ハブリックス（登録商標）と同様に、Ｍｅｒｉｄｉａｎ ＨＡＶ−ａｇも、Ａ型肝炎ウイルス系統ＨＭ１７５に由来するが、ＦＲｈＫ−４（アカゲザル胎児の腎臓）細胞内で繁殖された。細胞培養培地を除去した後、細胞は溶解されて懸濁液を形成し、当該懸濁液は勾配遠心分離法により部分的に精製され、ホルマリン処理により不活性化される。

【0059】

[0061]任意のＡ型肝炎ウイルス系統、例えば非限定的に当技術分野において記載されている下記系統のいずれか（及びその他の非ヒト変異体）が利用可能であると理解される。
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ａｒｉｚｏｎａ／ＨＡＳ−１５／１９７９
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／ＨＭ１７５／１９７６
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｃｈｉｎａ／Ｈ２／Ｈ１９８２
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｃｏｓｔａ Ｒｉｃａ／ＣＲ３２６／１９６０
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｆｒａｎｃｅ／ＣＦ−５３／１９７９
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｇｅｏｒｇｉａ／ＧＡ７６／１９７６
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＧＢＭ／１９７６
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｊａｐａｎ／ＨＡＪ８５−１／１９８５
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｏｓ／ＬＡ／１９７５
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ａｆｒｉｃａ／ＭＢＢ／１９７８
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｎｏｒｗａｙ／ＮＯＲ−２１／１９９８
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｈｕ／Ｓｉｅｒｒａ Ｌｅｏｎｅ／ＳＬＦ８８／１９８８
ヒトＡ型肝炎ウイルス ＭＳＭ１
ヒトＡ型肝炎ウイルス Ｓｈａｎｇｈａｉ／ＬＣＤＣ−１／１９８４

【0060】

[0062]更に、ホルマリン及びホルムアルデヒドが、認可済みのＡ型肝炎ワクチンを不活性化するのに一般的に利用されているが、その他の技法、例えば塩素処理、高温への暴露（ウイルス抗原は８５℃／１８５°Ｆよりも高温で不活性化される）等も利用可能であると理解される。

【0061】

[0063]特定の実施形態では、不活性化されたＡ型肝炎ウイルスを調製する従来方法に対して追加のステップを付加するのが有利となると判明し得る。例えば、米国特許第６，９９１，９２９号では、ウイルスを繁殖させた後にプロテアーゼ処理ステップ（例えば、トリプシン）を含めることが記載されている。このステップは、宿主細胞物質除去を改善し、より純粋なウイルス調製物を生成することが判明した。

【0062】

[0064]現在認可済みの全Ａ型肝炎ワクチンには、不活性化されたウイルス抗原が含まれているが、弱毒化されたウイルス抗原が含まれている代替ワクチンも文献に記載されている。特定の実施形態では、免疫原性製剤はかかる弱毒化ウイルス抗原を含み得る。当技術分野において周知の通り、弱毒化ワクチンの長所は、完全感染を引き起こすさずに、ｉｎ ｖｉｖｏで複製する能力に起因するより高い免疫原性に関する潜在能力にある。

【0063】

[0065]当技術分野において、弱毒化Ａ型肝炎ウイルスを調製するのに用いられる１つの方法は、ウイルス系統に複数回の細胞培養処理を連続的に適用するステップと関係するウイルス適応である。時間経過と共に、系統は突然変異し、次いで弱毒化した系統が同定され得る。特定の実施形態では、ウイルスに異なる細胞培養処理を適用することができる。例えば、研究者らはヒト二倍体肺（ＭＲＣＳ）細胞培養物に系統ＣＲ３２６を１６回通過させることにより、弱毒化Ａ型肝炎ウイルスを生み出した（Ｐｒｏｖｏｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、第２０巻：１６５〜１７５頁、２００５年を参照されたい）。同一系統をアカゲザル胎児の腎臓（ＦＲｈＫ６）細胞培養物に１５回、及びＭＲＣＳ細胞培養物に８回通過させることにより若干高毒性の系統が得られた。このような方法でＨ２系統から調製された別の弱毒化Ａ型肝炎ワクチンも記載されている（欧州特許第０４１３６３７号及びＭａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１５巻：９４４〜９４７頁、１９９７年を参照されたい）。

【0064】

[0066]特定の実施形態では、低温で１回又は複数回の細胞培養ステップを実施するのが有利であると判明する場合がある。例えば、欧州特許第０４１３６３７号は、温度を下げた（例えば、３５〜３６℃の代わりに３２〜３４℃まで）１つ又は複数の接種ステップを含めることを記載する。

【0065】

[0067]米国特許第６，１８０，１１０号は、ＭＲＣ−５細胞内で増殖する弱毒化Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ４３８０）について記載する。研究者らは、より高毒性の系統のゲノムをＨＡＶ４３８０ゲノムと比較することにより、ＨＡＶ４３８０中に、弱毒化に関連すると考えられる突然変異を認めた。これにより、研究者らは、弱毒化Ａ型肝炎ワクチンの候補として最適な特徴を有する突然変異ＨＡＶ系統を設計できるようになった。このアプローチは、任意の公知の弱毒化Ａ型肝炎ウイルスに適用可能であり、ウイルス適応を必要とせずに変異体を遺伝子工学的に作り出すのに利用可能であると認識される。

【0066】

Ｂ型肝炎
[0068]Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、急性及び慢性感染症の両方を引き起こす。ＨＢＶ感染症の臨床スペクトルは広く、無症候性から急性症候性の肝炎、すなわち不活性なＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）キャリア状態から肝硬変及びその慢性期の合併症に及ぶ（Ｆａｔｔｏｖｉｃｈ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、第３９巻：ｓ５０〜５８頁、２００３年）。ＨＢＶは、一般的にＨＢＶに感染したヒトに由来するＨＢｓＡｇ陽性体液に対して非経口的に又は粘膜経由で暴露すると感染する（Ｈｉｌｌｅｍａｎ、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２１巻：４６２６〜４６４９頁、２００３年）。

【0067】

[0069]現在のところ、２つの市販ワクチンがＨＢＶ感染防止に用いられており、両方共に組換え技術を用いて製造されている。例えば、Ｅｎｇｅｒｉｘ（エンジェリックス）−Ｂ（商標）は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓにより開発された、非感染性組換えＤＮＡ Ｂ型肝炎ワクチンである。このワクチンはＨＢＶの精製された表面抗原を含有するが、同ＨＢＶは、ＨＢＶの表面抗原遺伝子を担持する、遺伝子工学的に生み出されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）細胞を培養することにより得られる。

【0068】

[0070]本明細書で用いる場合、表現「Ｂ型肝炎表面抗原」又は「ＨＢｓＡＧ」は、ヒトでＨＢＶ表面抗原の抗原性を提示する任意のＨＢｓＡＧ抗原又はその断片を意味する。

【0069】

[0071]エンジェリックス−Ｂ（商標）及びその他の認可済みのＢ型肝炎ワクチンは、非経口的（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）に投与され、ＨＢＶに対する全身性免疫反応を誘発するのに成功した。しかし、全身性免疫反応の一環として生成した抗体は、ＨＢＶを含めほとんどの感染性物質の主要な侵入部位である粘膜のレベルで防御を提供することができない。したがって、当技術分野においてＢ型肝炎ワクチンを経口により送達する必要性が依然存在する。

【0070】

[0072]１つの態様では、本開示は、ＨＢｓＡＧの抗原性を提示するＢ型肝炎ウイルス表面抗原又はその断片が含まれる免疫原性製剤を調製する方法を提供する。全ての公知のＢ型肝炎ワクチンには、組換えＨＢｓＡＧが含まれている。上記の認可済みＢ型肝炎ワクチンの任意の１つが、免疫原性製剤を生成させるために抗原源として本開示の方法で利用可能であると理解される。

【0071】

[0073]一般的に、任意の方法がＢ型肝炎表面抗原を調製するのに利用可能である。ＨＢｓＡＧの調製物について十分に文書化されている（例えば、特にＨａｒｆｏｒｄら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ、第５４巻：１２５頁、１９８３年、及びＧｒｅｇｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第５巻：４７９頁、１９８７年を参照されたい）。一般的に、組換えＤＮＡ技術法が利用可能であり、同法には、ＨＢＶの表面抗原遺伝子を担持する遺伝子工学的に生み出された細胞を培養するステップが含まれる。次に、発現した表面抗原は精製され、そして通常、水酸化アルミニウム上に吸着された表面抗原の懸濁液として処方化される（例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、第８０巻：１〜５頁、１９８３年、及びＭｃＡｌｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、第３０７巻：１７８〜１８０頁、１９８４年を参照されたい）。

【0072】

インフルエンザ
[0074]インフルエンザは、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスに関連した呼吸器系の一般的感染性疾患である。インフルエンザＡ及びＢは、流行性のヒト疾患を引き起こす２つタイプのインフルエンザウイルスである。インフルエンザＡウイルスは、２つ表面抗原、赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）に基づき、更にサブタイプに分類される。インフルエンザＢウイルスは、サブタイプに分類されない。ワクチン接種は、インフルエンザ感染及び関連する合併症に起因する重篤な疾患に対してハイリスク状態にある者のために、インフルエンザを予防し、又は弱毒化する単独の最も効果的な方法として認識されている。不活性化されたインフルエンザウイルスから調製された抗原を接種することにより、特異的抗体産生が刺激される。防御は、ワクチンの調製源となるウイルス系統、又はこれと緊密に関連した系統に対してのみ一般的に有効である。

【0073】

[0075]インフルエンザワクチンは、すべての種類において、通常三価ワクチンである。これらは一般的に２種類のインフルエンザＡウイルス系統、及び１種類のインフルエンザＢ系統に由来する抗原を含有する。季節毎にインフルエンザワクチンに組み込まれるインフルエンザウイルス系統は、国家保健機関及びワクチン製造業者と協力しながら、世界保健機構（ＷＨＯ）により決定される。本開示に基づき任意のインフルエンザウイルス系統が利用可能であるが、またインフルエンザウイルス系統はＷＨＯの勧告に基づき年毎に異なると認識される。

【0074】

[0076]単価ワクチンは、例えば流行型の場合に有用であり得るが、これも含まれる。単価の、流行型インフルエンザワクチンは、単一のＡ系統に由来するインフルエンザ抗原を含有する可能性が最も高い。いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は流行型インフルエンザ系統に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ（ブタ起源のＨ１Ｎ１）ウイルス抗原である。

【0075】

[0077]主として３つのタイプの不活性化されたワクチンが、インフルエンザに対する防御を提供するために全世界で用いられている。全粒子ウイルスワクチン、ウイルスの外部及び内部の成分を含有するスプリットウイルスワクチン、及びウイルスのすぐ外側の成分（赤血球凝集素及びノイラミニダーゼ）から構成されるサブユニットワクチン。いかなる理論にも制限されることを欲することなく、サブユニットワクチンの純度がより高いほど、同ワクチンの反応原生（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）は低下し、耐容性は高められるはずであると考えられる。反対に全粒子ウイルスワクチン、及びスプリットウイルスワクチンは、より多くのエピトープを含有し、したがって免疫原性が高まると考えられる。

【0076】

[0078]いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原はサブユニットワクチンに基づく。一般的に、サブユニットワクチンは、効果的なワクチン接種に必要とされるインフルエンザウイルスのかかる部分のみを含有する（例えば、防御免疫反応を誘発する部分）。いくつかの実施形態では、サブユニットインフルエンザ抗原は、ウイルス粒子から調製される（例えば、ウイルスの特別な成分を精製する）。いくつかの実施形態では、サブユニットインフルエンザ抗原は、組換え法により調製される（例えば、細胞培養物中での発現）。例えば、米国特許第５，８５８，３６８号は、組換えＤＮＡ技術を用いて、組換えインフルエンザワクチンを調製する方法を記載する。得られた三価インフルエンザワクチンは、伝染能力を有するインフルエンザウイルスからクローン化された、組換え赤血球凝集素抗原の混合物に基づく。組換え赤血球凝集素抗原は、培養された昆虫細胞中のバキュロウイルス発現ベクターから生み出され、非変性条件下で精製された完全長、非開裂、糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、サブユニットインフルエンザ抗原は、合成法により生み出される（例えば、ペプチド合成）。サブユニットワクチンは、ＷＨＯが決定した選択系統から調製された、精製済みの表面抗原、赤血球凝集素抗原、及びノイラミニダーゼ抗原を含有し得る。いかなる理論にも拘束されることを欲することなく、表面抗原、赤血球凝集素抗原、及びノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）抗原は、ワクチン接種時のウイルス中和抗体産生の誘発において重要な役割を演ずると考えられる。

【0077】

[0079]いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、スプリットウイルス抗原である。スプリットウイルス抗原を用いて調製されたワクチンは、ウイルスの最も免疫原性の部分（例えば、赤血球凝集素及びノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ））をより高濃度で一般的に含有するが、一方、免疫原性がより低いウイルスタンパク質、並びに卵に由来する非ウイルスタンパク質（ウイルスの産生に用いられる）、又は外来物質（例えば、ニワトリ白血病ウイルス、その他の微生物、及び細胞残屑）の濃度を低減する。一般的に、スプリットウイルス抗原は物理的プロセスにより調製されるが、同プロセスには一般的に有機溶媒又は界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００）によりウイルス粒子を破壊するステップと、例えばスクロース勾配上で遠心分離を行う、又はクロマトグラフ用カラム上で尿膜腔液を通過させる等により、程度に相違こそあれウイルスタンパク質を分離又は精製するステップとが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子の破壊及び分離の後に透析又は限外濾過が続く。スプリットウイルス抗原は、全ウイルス内で生じている割合と必ずしも同一ではないものの、大部分の又は全てのウイルス構造タンパク質を通常含有する。ウイルスのスプリッティング方法、並びに適するスプリッティング剤は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許公開第２００９０１５５３０９号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、スプリットウイルス抗原の最終抗原濃度（例えば、赤血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）抗原の濃度）は、当技術分野において公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて標準化される。

【0078】

[0080]いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、全粒子ウイルス抗原である。抗原刺激を受けていない個人では、全粒子ウイルス抗原で調製されたワクチンは、免疫原性がより高くなり得、その他の製剤（例えば、サブユニット又はスプリットウイルス抗原）よりも低い抗原用量で、高い防御的抗体反応を誘発し得ると考えられる。しかし、全粒子ウイルス抗原を含むインフルエンザワクチンは、その他の製剤よりも多くの副作用を引き起し得ると考えられる。

【0079】

[0081]本明細書に記載する免疫原性製剤中に存在するインフルエンザウイルス抗原は、感染性であり得、不活性化又は弱毒化され得る。

【0080】

[0082]特定の実施形態では、免疫原性製剤は、不活性化されたウイルス抗原を含み得る。不活性化されたインフルエンザウイルス抗原を調製するのに、任意の方法が利用可能であると認識される。国際公開第０９／０２９６９５号パンフレットは、不活性化全粒子ウイルスワクチンを生成する典型的な方法を記載する。一般的に、これらの方法には、宿主細胞中でインフルエンザウイルスを繁殖させるステップと、任意選択的に宿主細胞を溶解してウイルスを放出させるステップと、ウイルス抗原を単離し、次にこれを不活性化するステップとが含まれる。ウイルスの化学的処理（例えば、特にホルマリン、ホルムアルデヒド）が、ワクチン製剤の用途でウイルスを不活性化するのに一般的に用いられる。しかし、例えば塩素による処理、高温への暴露等のその他の技法も利用可能と理解される。これらの処理では、外部ビリオンコートは一般的にそのままの状態に保たれるが、一方、複製機能は損なわれる。非複製ウイルスワクチンは、宿主中で複製可能な生ワクチンよりも多くの抗原を含有するのが好ましい。

【0081】

[0083]特定の実施形態では、免疫原性製剤は、弱毒化ウイルス抗原を含み得る。当技術分野において周知の通り、弱毒化ウイルス抗原により調製されたのワクチンの１つの長所は、完全な感染を引き起こすさずに、ｉｎ ｖｉｖｏで複製する能力に起因するより高い免疫原性に関する潜在能力にある。弱毒化された系統から調製された生ウイルスワクチンは、好ましくは病原性を欠くが、なおも宿主中で複製することができる。弱毒化インフルエンザウイルス抗原を調製するのに当技術分野において用いられている１つの方法は、ウイルス系統に複数回の細胞培養処理を連続的に適用するステップと関係するウイルス適応である。時間経過と共に、系統は突然変異し、次いで弱毒化した系統が同定され得る。特定の実施形態では、ウイルスに異なる細胞培養処理を適用することができる。特定の実施形態では、低温で１回又は複数回の細胞培養ステップを実施するのが有利であると判明する場合がある。

【0082】

[0084]いくつかのインフルエンザワクチンが、現在認可されている（表１を参照されたい）。例えば、フルゾン（Ｆｌｕｚｏｎｅ）（登録商標）はスプリット細胞不活性化インフルエンザワクチンであり、これはＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｉｎｃ．により開発及び製造されており、本開示に基づき利用可能である。フルゾン（登録商標）は、発育鶏卵中で繁殖したインフルエンザウイルスから調製された滅菌懸濁液を含有する。ウイルス含有液は、捕集され、ホルムアルデヒドで不活性化される。インフルエンザウイルスは、連続フロー遠心分離機を用いて、線形スクロース密度勾配溶液内で濃縮及び精製される。次に、ウイルスは非イオン性界面活性剤、オクトキシノール−９、（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（登録商標）Ｘ−１００）を用いて化学的に破壊され、スプリットウイルス抗原を生成する。次に、スプリットウイルスは、化学的手段により更に精製され、リン酸ナトリウムで緩衝化された等張性塩化ナトリウム溶液中に懸濁される。フルゾン（登録商標）ワクチンは、次にインフルエンザシーズンに応じた要件に基づき標準化され、３種類のプロトタイプ系統（例えば、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４系統を用いて調製された２００７−２００８ワクチン）の代表的な推奨比である各１５μｇの赤血球凝集素（ＨＡ）で、０．５ｍＬ用量当たり４５μｇのＨＡを含むように処方化される。フルゾン（登録商標）ワクチンは筋肉内注射用として処方化されている。

【0083】

[0085]本開示に基づき利用可能である認可済みインフルエンザワクチンの別の例はバクシグリップ（Ｖａｘｉｇｒｉｐ）（登録商標）であり、これもＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｉｎｃ．により開発及び製造されたスプリット細胞不活性化インフルエンザワクチンである。バクシグリップ（登録商標）は、フルゾン（登録商標）について上記で概説したプロセスに類似した方法で調製され、筋肉内注射用として同様に処方化されている。

【0084】

[0086]本開示に基づき利用可能である認可済みインフルエンザワクチンのなおも別の例は、フルミスト（Ｆｌｕｍｉｓｔ）（登録商標）である。フルミスト（登録商標）は、鼻腔内スプレーにより投与するための生の弱毒化された三価ワクチンである。フルミスト（登録商標）に含まれるインフルエンザウイルス系統は、温度制約を受ける増殖、及び弱毒化された表現型を引き起こす３種類の遺伝子突然変異を有する。抗原特性及び遺伝学的に改変されたインフルエンザウイルスの累積的な効果として、同ウイルスが鼻咽頭内で複製可能、及び防御免疫を誘発可能であることが挙げられる。フルミスト（登録商標）を製造するために、特別な病原体を含まない（ＳＰＦ）卵が、しかるべきウイルス系統それぞれを用いて接種され、ワクチンウイルスの複製が可能となるようにインキュベーションされる。上記卵の尿膜腔液は捕集され、プールされ、次に濾過により清透化される。ウイルスは、超遠心分離法により濃縮され、安定化バッファーを用いて希釈されて、最終的なスクロース及びリン酸カリウム濃縮物が得られる。次に、ウイルス捕集物は滅菌濾過されて、単価バルクが生成する。３つの系統に由来する単価バルクは混合され、その後必要に応じて所望の効力に達するように安定化バッファーを用いて希釈されて、三価のバルクワクチンが生成する。次に、バルクワクチンは個々の鼻腔投与用噴霧器に直接充填される。事前充填され、冷蔵保存された各フルミスト（登録商標）噴霧器は、単回用量０．２ｍＬを含有する。各０．２ｍＬ用量は、該当する３種類のウイルス系統それぞれからなる生きた弱毒化インフルエンザウイルス再集合体１０^{６．５〜７．５}ＦＦＵを含有する。

【0085】

[0087]上記したように、いくつかのインフルエンザワクチンが現在認可されている。これらの認可済みのインフルエンザワクチンの任意の１つ又は組み合わせたものが、免疫原性処方を製造するために本明細書に記載する小胞と併用可能であると理解される。例えば、市販のフルゾン（登録商標）及び／又はバクシグリップ（登録商標）が、活性な免疫原性製剤を製造するのにこのような方式で併用可能である。いくつかの実施形態では、認可済みのインフルエンザワクチンは最初に精製される（例えば、ワクチンに含まれるミョウバンアジュバント又はその他の試薬を除去すために）。いくつかの実施形態では、認可済みのインフルエンザワクチンは、本明細書に記載する小胞と共に処方化される前に精製されない。

【0086】

国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／４７９１１号は、本開示の方法及び製剤で利用可能ないくつかのその他の典型的なインフルエンザ抗原を記載する。典型的なインフルエンザ抗原は、米国特許第７，５２７，８００号；同第７，５３７，７６８号；同第７，５１４，０８６号；同第７，５１０，７１９号；同第７，４９４，６５９号；同第７，４６８，２５９号；同第７，３９９，８４０号；同第７，３６１，３５２号；同第７，３１６，８１３号；同第７，２６２，０４５号；同第７，２４４，４３５号；同第７，１９２，５９５号；同第７，０５２，７０１号；同第６，８６１，２４４号；同第６，７４３，９００号；同第６，７４０，３２５号；同第６，６３５，２４６号；同第６，６０５，４５７号；同第６，５３４，０６５号；同第６，３７２，２２３号；同第６，３４４，３５４号；同第６，２８７，５７０号；同第６，１３６，６０６号；同第５，９６２，２９８号；同第５，９４８，４１０号；及び同第５，９１９，４８０号にも記載されている。

【0087】

その他のウイルス
[0088]Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、今日、輸血に関連した非Ａ、非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の主原因として認識されている。ＨＣＶは、フラビウイルス及びペスチウイルスと類似性を有する一本鎖、プラスのセンス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）のＲＮＡウイルスである（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８７巻：２０５７頁、１９９１年、及びＷｅｉｎｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１８０巻：８４２頁、１９９０年）。米国特許第７，３４８，０１１号；同第６，８３１，１６９号；同第６，５３８，１２３号及び同第６、２３５、８８８号の全ては、ワクチンで利用可能な典型的なＨＣＶ抗原について記載する。

【0088】

[0089]ヒト免疫不全レトロウイルス（ＨＩＶ）は、身体の免疫系を破壊し、身体を日和見感染に対して感染し易くする疾患であるＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）に関係する。米国特許第７、０６７、１３４号；同第７、０６３、８４９号；同第６、７８７、３５１号；同第６、７０６、８５９号；同第６、６９２、９５５号；同第６、６５３、１３０号；同第６、６４９、４１０号；同第６、５４１、００３号；同第６、５０３、７５３号；同第６、５００、６２３号；同第６、３８３、８０６号；同第６、０９０、３９２号；同第５、８６１、２４３号；同第５、８１７、３１８号；及び同第４、９８３、３８７号の全ては、ワクチンで利用可能な典型的なＨＩＶ抗原について記載する。様々なＨＩＶ抗原も、米国特許出願公開第２００９０１１７１４１号及び同第２００９００８１２５４号に開示されている。

【0089】

[0090]特定の実施形態では、本開示の方法に基づき調製される免疫原性製剤は、熱不安定性の抗原を含み得る。本明細書で用いる場合、用語「熱不安定性の抗原」とは、ある上昇した温度に暴露されると、抗原完全性を喪失するような抗原を意味する。いくつかの実施形態では、熱不安定性の抗原を上昇した温度に暴露すると、抗原の完全性分析（例えば、ＥＬＩＳＡ）で測定される通り、操作を受けない抗原と比較して抗原の抗原完全性の２０％超（例えば、３０％超、４０％超、５０％超、又はこれらより多く）が破壊される。特定の実施形態では、熱不安定性の抗原は、３０℃より高い温度で抗原完全性を喪失する（例えば、３５℃超、４０℃超、４５℃超、又は５０℃超）。いくつかの実施形態では、熱不安定性の抗原をこれらの上昇した温度のうちの１つで３分より長く（例えば、５分、１０分、１５分、又はこれらより長く）保管すると、抗原の完全性分析（例えば、ＥＬＩＳＡ）で測定される通り、操作を受けない抗原と比較して抗原の抗原完全性の２０％超（例えば、３０％超、４０％超、５０％超、又はこれらより多く）が破壊される。上記で議論したように、本開示の方法ではより低い温度の抗原溶液が利用可能であり、抗原の完全性がより良好に保存可能となるので、このような方法は、熱不安定性の抗原にとって特に有益である。

【0090】

[0091]本開示は抗原に限定されず、一般的に、本方法は物質が抗原的か又は非抗原的かによらず任意の物質を取り込むのに利用可能であると理解される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、抗原であっても、またなくてもよい１つ又は複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は多糖類を取り込むのに利用可能である。特定のクラスの物質として、アジュバント、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞反応修飾因子、例えば増殖因子及び化学走化性因子等、抗体、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス薬、プラスミド、ＤＮＡ、及びＲＮＡが挙げられるが、但し、これらに限定されない。いくつかの実施形態ではポリペプチドは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト化抗体であり得る。いくつかの実施形態では、これらの物質は、抗原に関する文脈において上記で引用した条件下において、分解生成物（ｄｅｇｒａｄａｎｔ）に変換するという点において熱不安定性である。

【0091】

アジュバント
[0092]特定の実施形態では、本開示の方法は、小胞製剤に１つ又は複数のアジュバントを添加するステップを更に含み得る。当技術分野において周知の通り、アジュバントは免疫反応を増強する物質である。アジュバントは、当技術分野において周知されている（例えば、「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、Ｐｏｗｅｌｌ及びＮｅｗｍａｎ編集、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＬｏｎｄｏｎ、１９９５年を参照されたい）。いくつかの実施形態では、アジュバントは、小胞製剤が（取り込まれる抗原と共に）調製され次第添加可能である。いくつかの実施形態では、アジュバントは、小胞処方を調製するプロセス期間中に添加可能である（例えば、小胞形成脂質又はその他の小胞成分と共に、抗原と共に、又は専用のステップで）。

【0092】

[0093]特定の実施形態では、抗原が添加される前にアジュバントは添加される。いくつかの実施形態では、アジュバントは小胞形成脂質と共に同時溶融される。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−４アジュバント（下記に記載する）は小胞形成脂質と共に同時溶融される。特定の実施形態では、アジュバントは、抗原が添加された後に添加される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、抗原が添加された後に凍結保護物質と共に添加される。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−３アジュバント（下記に記載する）は、抗原が添加された後に凍結保護物質と共に添加される。いくつかの実施形態では、凍結保護物質はスクロースである。

【0093】

[0094]典型的なアジュバントとして、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、スクアレン、スクアラン、及びミョウバン（水酸化アルミニウム）が挙げられ、これらは当技術分野において周知の物質であり、いくつかの供給元から市販されている。特定の実施形態では、アルミニウム又はカルシウム塩（例えば、水酸化物又はリン酸塩）が、アジュバントとして利用可能である。ミョウバン（水酸化アルミニウム）が、多くの既存のワクチンで用いられてきた。ＩＭ投与の場合、一般的に、１用量当たり約４０〜約７００μｇのアルミニウムが含まれる。例えば、ハブリックス（登録商標）には、１用量当たり５００μｇのアルミニウムが含まれる。

【0094】

[0095]様々な実施形態では、水中油型エマルジョン、又は油中水エマルジョンもアジュバントとして利用可能である。例えば、油相はスクアレン又はスクアラン、及び界面活性剤を含み得る。様々な実施形態では、非イオン性界面活性剤、例えばソルビタン及びマンニドのモノ−及びジ−Ｃ_１２〜Ｃ_２４−脂肪酸エステルが利用可能である。油相は、免疫原性製剤の約０．２〜約１５重量％を含むのが好ましい（例えば、約０．２〜１％）。ＰＣＴ国際公開第９５／１７２１０号パンフレットは典型的なエマルジョンについて記載する。

【0095】

[0096]ＱＳ２１と呼ばれるアジュバントは、南米の木であるキラジャ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来するアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン分画であり、その製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。キラジャ・サポナリア・モリナの半合成及び合成誘導体、例えば米国特許第５，９７７，０８１号及び同第６，０８０，７２５号に記載する誘導体等も有用である。

【0096】

[0097]ＴＬＲは、ショウジョウバエＴｏｌｌ受容体と相同性を有するタンパク質ファミリーであり、病原体に関連する分子パターンを認識し、したがって身体が自己及び非自己分子を区別する際に役立つ。ウイルス病原体に一般的な物質は、病原体関連の分子パターンとしてＴＬＲにより認識される。例えば、ＴＬＲ−３は二本鎖ＲＮＡ内のパターンを認識し、ＴＬＲ−４は、リポ多糖内のパターンを認識する一方、ＴＬＲ−７／８は、ウイルス及び細菌のＲＮＡ及びＤＮＡ内のアデノシン含有パターンを認識する。ＴＬＲがかかるパターン認識により誘発されると、炎症及び自然免疫反応及び適応性免疫反応の活性化を引き起こす一連のシグナル伝達現象が生ずる。様々なＴＬＲにより認識される分子パターンを含有するいくつかの合成リガンドが、アジュバントとして開発途上にあり、本明細書に記載する免疫原性製剤に含まれ得る。

【0097】

[0098]例えば、ポリリボイノシン酸：ポリリボシチジル酸又はポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（カリフォルニア州）のＩｎｖｉｖｏＧｅｎより入手可能）は、二本鎖ＲＮＡ（ウイルス感染に関連した分子パターン）の合成アナログであり、ＴＬＲ−３に対するアゴニストである典型的なアジュバントである（例えば、Ｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、第５８巻：１００４頁（１９６７年）、及びＬｅｖｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、第６２巻：３５７頁（１９６９年）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、安定性を改善するためにその他の物質と併用可能である（例えば、リボヌクレアーゼによる分解を低減することにより）。例えば、米国特許第３，９５２，０９７；同第４，０２４，２４１号、及び同第４，３４９，５３８号は、ポリ−Ｌ−リジンとのポリ（Ｉ：Ｃ）複合体について記載する。ポリ（Ｉ：Ｃ）にポリ−アルギニンを添加しても、ＲＮＡ分解酵素の活性による分解が低減することが明らかとなった。ポリ（ＩＣ：ＬＣ）は、ポリ−Ｌ−リジンカルボキシメチルセルロースにより安定化された合成、二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）である。米国特許公開第２００９００４１８０９号は、ＴＬＲ−３アゴニストとして作用可能なロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシドを１つ又は複数含む二本鎖核酸について記載する。当業者は、その他の適するＴＬＲ−３アゴニストアジュバントを識別することができるであろう。

【0098】

[0099]弱毒化された脂質Ａ誘導体（ＡＬＤ）、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、及び３−デアシルモノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）は、ＴＬＲ−４に対するアゴニストである典型的なアジュバントである。ＡＬＤは、分子が、脂質Ａが示す副作用よりも少ない又はこれと異なる副作用を示すように変更又は構築された脂質Ａ様分子である。そのような副作用として発熱性、局所的シュワルツマン反応、及びニワトリ胚５０％致死量分析（ＣＥＬＤ_５０）で評価されるような毒性が挙げられる。ＭＰＬ及び３Ｄ−ＭＰＬは、米国特許第４，４３６，７２７号及び同第４，９１２，０９４号にそれぞれ記載されている。ＭＰＬは、腸内細菌性のリポ多糖類（ＬＰＳ）の成分であり、強力であるが極めて毒性の高い免疫系モジュレーターである脂質Ａに起源を有した。３Ｄ−ＭＰＬは、第３位の還元末端グルコサミンにエステル結合したアシル残基が選択的に除去されている点においてＭＰＬと異なる。ＭＰＬ及び３Ｄ−ＭＰＬには、いくつかの脂肪酸置換パターン、すなわち異なる脂肪酸鎖長を有するヘプタアシル、ヘキサアシル、ペンタアシル等が混合したものが含まれ得ると認識される。したがって、ＭＰＬ及び３Ｄ−ＭＰＬの様々な形態が、それらの混合したものを含め、本開示に含まれる。

【0099】

[0100]いくつかの実施形態では、これらのＡＬＤは、例えば２％スクアレン／ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）８０エマルジョン（例えば、英国特許第２１２２２０４号を参照されたい）内で、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）と併用可能である。ＭＰＬは、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ（アラバマ州）のＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．からＰＨＡＤ（リン酸化ヘキサアシル二糖類）として入手可能である。当業者は、その他の適するＴＬＲ−４アゴニストアジュバントを識別できるであろう。例えば、その他のリポ多糖類が、ＰＣＴ国際公開第９８／０１１３９号パンフレット；米国特許第６，００５，０９９号、及び欧州特許第７２９４７３号に記載されている。

【0100】

ＩＩ．小胞処方
[0101]別の態様では、本開示は、これらの方法を用いて調製された抗原含有小胞製剤を提供する。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞製剤は、先行技術の方法を用いて実現可能なレベルよりも高い抗原取り込みレベルを示す。いくつかの実施形態では、抗原含有小胞製剤は、先行技術の方法を用いて実現可能なレベルよりも高い抗原活性（すなわち、抗原性及び／又は免疫原性）レベルを示す。

【0101】

[0102]免疫原性小胞製剤は、成人及び小児を含むヒトが罹患する多くの疾患を治療するのに有用である。但し、一般的に同製剤は任意の動物で利用可能である。特定の実施形態では、本明細書の方法は、獣医学用途、例えばイヌ及びネコの用途で利用可能である。所望であれば、本明細書の方法は、家畜、例えばヒツジ、トリ、ウシ、ブタ、及びウマの飼育でも利用可能である。

【0102】

[0103]本明細書に記載する免疫原性小胞製剤は、免疫反応を誘発するのに必要な又は十分なほどの量で、及び時間かけて一般的に投与される。投与計画は、単回投与、又は長期複数回投与から構成され得る。投与される正確な抗原量は、患者によって変化し得るが、またいくつかの要因に依存する場合がある。したがって、一般的に、用いられる正確な用量は、処方担当医師の決定に従い、並びに患者の体重及び投与経路に依存するばかりでなく、投与頻度、患者の年齢、及び症状の重症度、及び／又は感染リスクにも依存し得ると認識される。特定の実施形態では、免疫原性製剤中の抗原用量は、約５μｇ〜約５ｍｇ、例えば、約１００μｇ〜約７５０μｇの範囲であり得る。舌下又は口腔内投与法を用いる場合、又はアジュバントが存在する場合には低めの用量の抗原で十分であり得る。経口投与の場合、特にアジュバントが存在しない場合には、高めの用量がより有用であり得る。

【0103】

[0104]一般的に、製剤は任意の経路により患者に投与可能である。特に、実施例の結果は、本明細書に記載する免疫原性製剤を、経口により投与しても、防御反応を誘発可能であることを実証する。あらゆる形態の注射よりも経口送達の方が有利である（すなわち、順守、質量分布等）という点に照らして、経口経路が特に望ましいと認識される。また、ほとんどのワクチン（全ての公知のＡ型肝炎ワクチンを含む）が、これまで非経口的に投与されてきたという事実に照らして、結果が予測しえないとも認識される。

【0104】

[0105]したがって、特定の実施形態では、免疫原性製剤は経口により（口腔内、舌下による、及び胃洗浄又はその他の人工的な摂食手段による投与を含め）投与可能である。かかる経口送達は、例えば錠剤、カプセル、多重粒子、ゲル、フィルム、胚珠（ovule）、エリキシル剤、溶液、懸濁液等の形態の固体又は液体製剤を用いて実現可能である。特定の実施形態では、液体製剤を用いる場合には、胃のｐＨを中和するために、製剤は塩基性製剤（例えば、重炭酸溶液）と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態では、塩基性製剤は、免疫原性製剤の前、及び／又は後に投与され得る。特定の実施形態では、塩基性製剤は、投与前に免疫原性製剤と併用可能であり、又は免疫原性製剤と同時に服用可能である。

【0105】

[0106]経口送達が特に興味深いけれども、特定の実施形態では、免疫原性製剤は、非経口的、例えば注射による送達用途でも処方化可能であると認識される。かかる実施形態では、投与法は、例えば静脈内、筋肉内、皮内、若しくは皮下であり得、又は輸液又は無針注射技法経由であり得る。かかる非経口投与法の場合、免疫原性製剤は、従来の凍結乾燥された製剤の状態で調製可能及び維持可能であり、投与前に０．９％生理食塩水溶液等の薬学的に許容される生理食塩水溶液で再溶解可能である。注射用製剤のｐＨは、当技術分野において公知なように、薬学的に許容される酸、例えばメタンスルホン酸等で調節可能である。利用可能なその他の許容可能なビヒクル及び溶媒として、リンゲル液及びＵ．Ｓ．Ｐ．が挙げられる。更に、滅菌状態の不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒体として慣習的に利用されている。これを目的として、合成モノ又はジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油が利用可能である。更に、オレイン酸等の脂肪酸が注射剤の調製に用いられる。注射用製剤は、例えば細菌保持フィルターを通過させる濾過により、又は滅菌水若しくはその他の滅菌注射媒体に溶解可能又は分散可能な、滅菌固体製剤の形態を取る滅菌剤を組み込むことにより、使用前に滅菌処理可能である。

【0106】

[0107]免疫原性製剤は鼻腔内経由で又は吸入によっても投与可能であり、同製剤は、乾燥粉末吸入剤又はエアゾールスプレー調製物の形態で、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、又は噴霧機から、適する噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ハイドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又はその他の適する気体を使用する又は使用しないで好都合に送達される。加圧エアゾールの場合には、用量単位は、計量された量を送達するバルブを設けることにより設定可能である。加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、又は噴霧機は、抗体の溶液又は懸濁液を、例えば溶媒としてエタノール及び噴霧剤の混合物を用いて含み得るが、潤滑剤、例えばソルビタントリオレエート等を更に含み得る。吸入器又は注入器で使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製の）が、免疫原性製剤とラクトース又はデンプン等の適する粉末ベースとの粉末混合物を含むように処方可能である。

【0107】

[0108]直腸投与用の製剤は好ましくは坐剤であり、これは、免疫原性製剤を、周囲温度で固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸円蓋内で溶融し、抗体を放出する適する非刺激性の賦形剤又は担体、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、又は坐薬ワックスと共に混合することにより調製可能である。当技術分野において公知なように、貯留浣腸器及び直腸カテーテルも利用可能である。ヒドロキシプロピルセルロース等の増粘担体も、直腸内に製剤を保持しやすくするので、直腸投与で用いられる本開示のしかるべき担体に該当する。一般的に、製剤に添加される担体の容積は、製剤の保持が最大化するように選択される。特に、容積は、投与された製剤を直腸円蓋内で保持するのを阻害するほどに大きくなってはならない。

【0108】

典型的な処方
[0109]いくつかの実施形態では、本開示は免疫原性製剤を提供するが、これには抗原、ＴＬＲ−３アゴニストアジュバント、及び小胞が含まれ、前記小胞は、非イオン性界面活性剤、及び粘膜を横断する脂質様分子の輸送を促進する輸送促進物質を含む。いくつかの実施形態では、これらの製剤は経口投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−３アゴニストアジュバントは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−３アゴニストアジュバントは、ポリ（ＩＣ：ＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、輸送促進物質は、胆汁酸、その誘導体、又は任意のこれらの塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、グリセリンエステル（例えば、１−モノパルミトイルグリセリン）である。いくつかの実施形態では、小胞は、イオン性両親媒性物質（例えば、ジセチルホスフェート）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、ステロイド（例、コレステロール）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、１−モノパルミトイルグリセリン、ジセチルホスフェート、コレステロール、及びデオキシコール酸ナトリウムを含む。

【0109】

[0110]いくつかの実施形態では、本開示は免疫原性製剤を提供するが、これには抗原、ＴＬＲ−３アゴニストアジュバント、及び小胞が含まれ、前記小胞は、非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、これらの製剤は非経口（例えば、筋肉内注射により）投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−３アゴニストアジュバントは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−３アゴニストアジュバントは、ポリ（ＩＣ：ＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、グリセリンエステル（例えば、１−モノパルミトイルグリセリン）である。いくつかの実施形態では、小胞は、イオン性両親媒性物質（例えば、ジセチルホスフェート）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、ステロイド（例、コレステロール）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、１−モノパルミトイルグリセリン、ジセチルホスフェート、及びコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、小胞は輸送促進分子を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、小胞は、コール酸及びケノデオキシコール酸等の「胆汁酸」、そのグリシン又はタウリンとの結合体生成物、例えばグリココール酸及びタウロコール酸等、デオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸を含む誘導体、及びこれらの酸のそれぞれの塩を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、小胞は、アシルオキシ化アミノ酸、例えばアシルカルニチンとその塩、及びパルミトイルカルニチン等を欠く場合がある。

【0110】

[0111]いくつかの実施形態では、本開示は免疫原性製剤を提供するが、これには抗原、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバント、及び小胞が含まれ、前記小胞は、非イオン性界面活性剤、及び粘膜を横断する脂質様分子の輸送を促進する輸送促進物質を含む。いくつかの実施形態では、これらの製剤は経口投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントは、モノホスホリルリピドＡ、又は３−デアシルモノホスホリルリピドＡを含む。いくつかの実施形態では、輸送促進物質は、胆汁酸、その誘導体、又は任意のこれらの塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、グリセリンエステル（例えば、１−モノパルミトイルグリセリン）である。いくつかの実施形態では、小胞は、イオン性両親媒性物質（例えば、ジセチルホスフェート）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、ステロイド（例、コレステロール）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、１−モノパルミトイルグリセリン、ジセチルホスフェート、コレステロール、及びデオキシコール酸ナトリウムを含む。

【0111】

[0112]いくつかの実施形態では、本開示は免疫原性製剤を提供するが、これには抗原、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバント、及び小胞が含まれ、前記小胞は、非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、これらの製剤は非経口（例えば、筋肉内注射により）投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ−４アゴニストアジュバントは、モノホスホリルリピドＡ、又は３−デアシルモノホスホリルリピドＡを含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、グリセリンエステル（例えば、１−モノパルミトイルグリセリン）である。いくつかの実施形態では、小胞は、イオン性両親媒性物質（例えば、ジセチルホスフェート）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、ステロイド（例、コレステロール）を更に含む。いくつかの実施形態では、小胞は、１−モノパルミトイルグリセリン、ジセチルホスフェート、及びコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、小胞は輸送促進分子を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、小胞は、コール酸及びケノデオキシコール酸等の「胆汁酸」、そのグリシン又はタウリンとの結合体生成物、例えばグリココール酸及びタウロコール酸等、デオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸を含む誘導体、及びこれらの酸のそれぞれの塩を欠く場合がある。いくつかの実施形態では、小胞は、アシルオキシ化アミノ酸、例えばアシルカルニチンとその塩、及びパルミトイルカルニチン等を欠く場合がある。

【0112】

[0113]特定の実施形態では、本開示の製剤は、ラメラ構造（例えば、二重層構造）を示す小胞を含む。いくつかの実施形態では、本開示の製剤は、非ラメラ構造（例えば、ミセル）を実質的に欠いている。

【0113】

[0114]本明細書に記載する製剤内に存在する小胞の物理的特徴（例えば、ラメラ構造）は、任意の公知の方法により測定可能であると認識される。例えば、いくつかの実施形態では、小胞の物理的特徴は、^３１Ｐ ＮＭＲにより２５℃で測定可能である。いくつかの実施形態では、化学シフト異方性が約１５〜２０ｐｐｍであり、−２．５ｐｐｍ付近に高磁場の最大値を有する異方性ピークは、ラメラ構造の存在を示唆する。いくつかの実施形態では、^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルで認められる等方性ピークが２．５ｐｐｍ付近に中心を有する場合、それは非ラメラ構造の存在を示唆する。いくつかの実施形態では、本開示の製剤の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルは、２．５ｐｐｍ付近にある等方性ピークを実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、２．５ｐｐｍ付近に等方性ピークが存在する場合には、同ピークは、化学シフト異方性が約１５〜２０ｐｐｍであり、−２．５ｐｐｍ付近に高磁場の最大値を有する異方性ピークの強度（ピーク高さ）よりも小さい強度（ピーク高さ）を有する。いくつかの実施形態では、２．５ｐｐｍ付近に等方性ピークが存在する場合には、同ピークは、化学シフト異方性が約１５〜２０ｐｐｍであり、−２．５ｐｐｍ付近に高磁場の最大値を有する異方性ピークの強度（ピーク高さ）の５０％よりも小さい強度（ピーク高さ）を有する（例えば、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、又は１％未満）。

【0114】

[0115]いくつかの実施形態では、本開示は凍結乾燥形態にある上記製剤の任意の１つを提供する。

【0115】

ＩＩＩ．キット
[0116]なおも別の態様では、本開示は、第１の容器に凍結乾燥された脂質生成物を、及び第２の容器に抗原（及び任意選択的にアジュバント）を含む水溶液を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットには、抗原含有小胞製剤が生成するように、２つの容器の内容物を混合する際の説明書も含まれる。

【0116】

[0117]上記で議論したように、凍結乾燥された脂質生成物は、溶融脂質混合物が生成するように小胞形成脂質を溶融し、次に凍結乾燥された脂質生成物が生成するように当該溶融脂質混合物を凍結乾燥することにより、これまでに調製されたものである。

【0117】

[0118]なおも別の態様では、本開示は、第１の容器に本開示の任意の凍結乾燥された抗原含有小胞製剤を、及び第２の容器に水溶液（任意選択的にアジュバントを含有する）を含む水溶液を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットには、抗原含有小胞製剤が再水和するように、２つの容器の内容物を混合する際の説明書も含まれる。

【0118】

[0119]いくつかの実施形態では、キットは患者に抗原含有小胞製剤を注射するシリンジ等の追加成分を含み得る。

【実施例】

【0119】

[0120]下記の実施例では、本明細書に記載される特定の製剤を作製し、実用に供するいくつかの典型的なモードを記載する。これらの実施例は説明目的に限られ、本明細書に記載する製剤及び方法の範囲を制限するようには意図されていないと理解されるべきである。

【0120】

実施例１−小胞を調製するための３−ステップ溶融法
[0121]本実施例では、後の実施例で記載されるいくつかの小胞を調製するのに用いられた３−ステップ溶融法について記載する。

【0121】

[0122]ステップ１では、５：４：１のモル比の下記の脂質、１−モノパルミトイルグリセリン（ＭＰＧ、２７０ｍｇ）、コレステロール（ＣＨＯ、２５５ｍｇ）、及びリン酸ジセチル（ＤＣＰ、９０ｍｇ）が、平底の５０ｍｌガラスビーカーに、当該ガラスビーカーの側面に粉末が付着しないことを徹底しながら導入された。次に、脂質混合物は、アルミニウムフォイルで覆われたガラスビーカー内で時々回旋操作を受けながら、１２０℃に加熱されたオイルバス中で１０分間溶融された。

【0122】

[0123]溶融脂質混合物の温度を１２０℃に維持しながら、２５ｍＭ重炭酸バッファー、ｐＨ７．６（５０℃に事前加熱済み）、１０．９ｍｌを添加することにより、ステップ２でエマルジョンは作製された。このエマルジョンは、５０℃で２分間速やかにホモジナイズされた（５０℃の水浴中、８０００ｒｐｍでのホモジナイゼーション）。なおもホモジナイズしながら、２５ｍＭ重炭酸バッファー、ｐＨ９．７（５０℃に事前加熱済み）に溶解した１００ｍＭデオキシコール酸ナトリウム（「胆汁塩」）溶液、１．１ｍｌが添加され、ホモジナイゼーションは５０℃で８分間継続された。

【0123】

[0124]ステップ３では、約ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液中の抗原（例えば、ＨＡＶ抗原又はＨＢＶ表面抗原）が、胆汁塩を含有する加熱された溶融脂質混合物に添加された。

【0124】

[0125]この３−ステップ法の変法では、ステップ２で胆汁酸塩と共に調製された溶融脂質混合物は、３０℃まで冷却され、インキュベータ／振とう機（２２０ｒｐｍ）内で２時間インキュベーションされ、−８０℃で凍結され、凍結乾燥され、次に使用前に１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．５に溶解された抗原溶液で再溶解された。

【0125】

実施例２−小胞を調製するための逆転式２−ステップ溶融法
[0126]本実施例では、後の実施例で記載されるいくつかの小胞を調製するのに用いられた逆転式２−ステップ溶融法について記載する。

【0126】

[0127]ステップ１では、同じ５：４：１のモル比の脂質（ＭＰＧ：ＣＨＯ：ＤＣＰ）が用いられた。但し、この方法では、０．１〜０．５のモル比のデオキシコール酸（「胆汁酸」）も含まれ、１３５℃で１０分間、加熱されたオイルバス内で脂質と共に同時溶融された。実施例１の方法では、水性の胆汁酸塩溶液が、ステップ２で溶融脂質をエマルジョンに変換した後に添加されたに過ぎない。

【0127】

[0128]この段階で、抗原のストック溶液（例えば、６ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．１１）で希釈された２５μｇ／ｍｌのＨＡＶ抗原溶液４ｍｌ、又は８．７５ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）で希釈された１．０ｍｇ／ｍｌのＨＢＶ表面抗原溶液１．２５ｍｌ）が、加熱された水浴（２５℃〜５０℃）中で５分間プレ−インキュベーションされた。ステップ２では、得られた抗原ストック溶液は、ホモジナイズされ（８，０００ｒｐｍで）、溶融脂質混合物が添加され、ホモジナイゼーションが更に１０分間継続された。得られたホモジネートは２２０ｒｐｍ、３０℃で２時間振とうされた。ＰＢＳバッファーに溶解した４００ｍＭスクロース溶液、１０ｍｌが、振とう済みのホモジネートに添加され、このホモジネートは更に３０秒間ボルッテックス処理を受けた。この混合物は−８０℃で凍結され、凍結乾燥され、次に使用前に１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．５中で再溶解された。

【0128】

[0129]本２−ステップ法の変法では、ステップ１で調製された同時溶融脂質／胆汁酸溶液は、３０℃まで冷却され、インキュベータ／振とう機（２２０ｒｐｍ）内で２時間インキュベーションされ、−８０℃で凍結され、凍結乾燥され、次に使用前に１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．５に溶解された抗原溶液で再溶解された。

【0129】

実施例３−Ｂ型肝炎抗原の完全性分析
[0130]ＨＢＶ表面抗原溶液は、４℃、２５℃及び５０℃の温度、８，０００ｒｐｍでホモジナイズされた。下記の表２では、ＥＬＩＳＡにより測定された得られた抗原の割合（％）を、ＥＬＩＳＡにより直接測定された操作を受けない抗原と比較している。示す通り、実施例１の３−ステップ溶融法ではＨＢｓＡｇを５０℃に暴露するが、そうした暴露により、抗原の抗原完全性が５０％を超えて破壊された。本開示の逆転式２−ステップ溶融法を用いれば、抗原を含有するバッファーの温度を顕著に低減させることができる（例えば、２５^０Ｃまで）。この逆転式２−ステップ溶融法は、より低い温度の抗原溶液を利用することができるので、サブユニットタンパク質の抗原性をより良好に保存できるようにする。

【0130】

【表2】

【0131】

実施例４−Ｂ型肝炎抗原の取り込みに関する分析
[0131]本実施例では、Ｂ型肝炎表面抗原の取り込みレベルを測定するために実施された実験について記載する。取り込みレベルはニンヒドリン分析法を用いて測定された。当該ニンヒドリン分析法は、試料中のポリペプチドの濃度を求める比色法である。アミノ基を含有する物質は、ニンヒドリン試薬と反応して青紫色の錯体を生成する。

【0132】

[0132]Ｂ型肝炎表面抗原は、実施例１及び２の方法を用いて小胞内に取り込まれた。２つの異なる比の胆汁酸（０．１０及び０．５０）が、実施例２の方法を用いて試験された。取り込まれたＢ型肝炎表面抗原は、小胞より加水分解され、中和され、ニンヒドリン試薬と混合され、次に１１０℃でインキュベーションされた。次に、当該溶液は冷却放置され、その吸収が５９５ｎｍで測定された。この波長の吸収と最初の試料中に存在したポリペプチドの量との間には線形関係が認められる。表３は、実施例２の逆転式２−ステップ法を用いて高レベルの抗原の取り込み（この場合はＨＢＶ表面抗原）が実現したことを示している。表３は、取り込み効率は、胆汁酸含有量により影響を受け得ることも示唆している。

【0133】

【表3】

【0134】

実施例５−再水和後の小胞安定性の物理化学的特徴付け
[0133]本実施例では、動的光散乱を用いて小胞安定性を測定するために実施された実験について記載する。発明者らは、三重読み取り及び２分平衡時間を採用するＭａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（ＺＥＮ３６００）を用いて粒子サイズ及びサイズ分布を求めた。小胞試料２０μｌがｐＨ７．６の重炭酸バッファー、９８０μｌに添加され、ボルッテックス処理を受け、次にポリスチレンキュベット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ６７．７５４）に添加された。統計的解析が、Ｍｉｎｉｔａｂ ｖ１４を用いて２標本ｔ−検定により９５％信頼水準で実施された。ナノサイズ分析から得られた結果を図１に示す。実施例１及び２に記載する通りに調製された小胞が、マスターサイザーを用いて、ＨＡＶ抗原２μｇを含有するバッファーの存在下で再水和した直後、及び再水和後２、４及び６時間経過して測定された。図１に示す通り、実施例２の逆転式２−ステップ溶融法により調製された小胞は、実施例１の３−ステップ溶融法により調製された小胞よりも長期間安定（サイズ安定性により評価された通り）であった。水和後の小胞安定性は、患者に投与される小胞製剤にとって潜在的に重要な要因である。

【0135】

実施例６−マウスの免疫感作におけるＡ型肝炎抗原に対する抗体反応
[0134]本実施例では、マウスを対象とした特定の免疫原性製剤のｉｎ ｖｉｖｏ試験について記載する。小胞は、実施例１及び２に記載する通りに調製され、次にＨＡＶ抗原２μｇを含有するバッファーの存在下で再水和された。メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）が、上記抗原含有小胞を用いて、強制経口投与により、第０、１４、及び２８日目に３回ワクチン接種を受けた（１用量当たりＨＡＶ抗原２μｇに等しい）。

【0136】

[0135]次に、血清試料が、経口ワクチン接種により誘発されたＡ型肝炎−特異的ＩｇＧの力価を評価するために採取された。最終の免疫感作後１４日目に採取された血清試料は、不活性化されたＨＡＶ抗原に対してＥＬＩＳＡにより試験された。図２に示す通り、実施例２の逆転式２−ステップ溶融法により調製された小胞を用いてマウスを経口ワクチン接種した方が、実施例１の３−ステップ溶融法により調製された小胞の場合よりも、Ａ型肝炎抗原に対して顕著に高い全身性の（血清）ＩｇＧ反応を誘発した。各記号は個別の動物のエンドポイント血清力価を表す。このデータは、逆転式２−ステップ溶融法を用いて調製された空の小胞を、ＨＡＶ抗原で水和する方が、３−ステップ溶融法を用いて調製された小胞を水和する場合と比較して、より良好な免疫原性を実現することを実証する。

【0137】

[0136]複数の研究者は、現在認可されているＡ型肝炎ワクチン及びＢ型肝炎ワクチンを筋肉内（ＩＭ）注射すると、中和性のＩｇＧ抗体が誘発されることを実証した。我々は、経口により投与される免疫原性Ａ型肝炎製剤は、全身レベルでＩｇＧ抗体（血清試料）を、及び粘膜レベルでＩｇＡ抗体（鼻腔洗浄試料）を誘発する能力を有することを見出した。Ａ型肝炎及びＢ型肝炎の感染は、粘膜の表面を介して生ずるので、ＩｇＡ反応（粘膜性免疫反応の証拠）の方が、全身性のＩｇＧ反応よりも効果的であり得る。我々は、免疫原性Ａ型肝炎又はＢ型肝炎製剤が、標準的な非経口経路（例えば、ＩＭ注射）により投与される場合には、全身性のＩｇＧ反応を期待するしかあり得ない。

【0138】

実施例７−小胞の胆汁塩含有量は未成熟樹状細胞の成熟に影響を及ぼす
[0137]腸管内で抗原（例えば、ＨＡＶ抗原）が耐容性又は防御的免疫反応を誘発するかどうか規定する役割を演じている樹状細胞（ＤＣ）が重要な抗原提示細胞であると今日一般的に認められている。（Ａｌｐａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６６巻（８）：４８４３〜４８５２頁、２００１年）。ＤＣの活性化は通常、炎症性の刺激によるが、そのような活性化はＴ細胞の増殖プライミングを可能にするように、共刺激分子の発現及び抗原提示を促進する。

【0139】

[0138]端的には、骨髄に由来するＤＣ前駆体は、ｎａｉｖｅ ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離され、並びにインターロイキン４（ＩＬ−４）及び未成熟ＤＣ表現型への分化を引き起こす果粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養された（５日間）。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）によるその後の処理は、未成熟のＤＣを成熟した樹状細胞に更に分化させる。未成熟ＤＣは、実施例２のステップ１及び２の場合と同様に（その後に抗原を添加しないで）、総脂質に対する胆汁酸の２つの異なるモル比（０．１及び０．５）を用いて、又は用いないで調製された非イオン性界面活性剤脂質小胞（ＮＩＳＶ）と共にインキュベーションされた。陽性対照として未成熟のＤＣがＴＮＦ−α単独で処理された。ＤＣの成熟は、抗−ＭＨＣＩＩ及び抗−ＣＤ８６抗体を用いて、フローサイトメトリー法により測定された。成熟ＤＣは両抗体に対する二重の陽性として規定された。図３に示す通り、胆汁酸を含まないＮＩＳＶでは、未成熟ＤＣの成熟は顕著には影響を受けなかったが、一方、胆汁酸を含むＮＩＳＶではＤＣの成熟が増強された。この結果は、この成熟の増強が、胆汁酸含有量により影響を受け得ることも示唆する。

【0140】

実施例８−^３１Ｐ ＮＭＲによる小胞の特徴付け
[0139]本実施例では、本開示の方法に基づき調製された特定の典型的な小胞の^３１Ｐ ＮＭＲによる特徴付けについて記載する。

【0141】

[0140]小胞は、抗原を一切添加せずに実施例１及び２に記載する通りに調製された。凍結乾燥された小胞は重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）バッファー中で再溶解された。最終脂質濃度は５０ｍｇ／ｍｌであった。懸濁された小胞、４ｍｌが１０ｍｍのＮＭＲチューブに移され、数滴のＤ_２Ｏが添加された。

【0142】

[0141]逆転式２−ステップ溶融法を用いて調製された小胞の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを図４Ａに示す。低磁場のショルダーと高磁場のピーク、及び約２０ｐｐｍの化学シフト異方性を有する非対象的なライン形状は、典型的ラメラ構造内で組織化されたＤＣＰに対応する。

【0143】

[0142]３−ステップ溶融法を用いて調製された小胞の^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを図４Ｂに示す。ブロードなラインと重なり合った、及び２．５ｐｐｍ付近に中心を有する等方性のピークが認められた。この等方性のピークは、非ラメラ構造、例えばミセル、六方相、又は非常に小さいサイズ（ナノサイズ）の小胞等の存在に帰属することができると考えられる。

【0144】

実施例９−小胞を調製するための逆転式２−ステップ溶融法
[0143]本実施例では、小胞を調製するのに利用可能な典型的な逆転式２−ステップ溶融法について記載する。５：４：１のモル比の脂質（ＭＰＧ、５．５７５ｇ；ＣＨＯ、５．２１８ｇ；及びＤＣＰ、１．８４５ｇ）が平底の２５０ｍＬガラスビーカーに、当該ガラスビーカーの側面に粉末が付着しないことを徹底しながら導入された。特定の実施形態では、バイロソームが作製される場合には、胆汁酸、例えば０．５のモル比のデオキシコール酸（デオキシコール酸、０．６６２ｇ）がこのステップで添加される。

【0145】

[0144]脂質及び胆汁酸を含有するビーカーを保持するのにクランプを用いながら、当該ビーカーはアルミニウムフォイルで覆われ、脂質はビーカー内で時々回旋操作を受けながら１４０℃〜１４５℃に加熱されたオイルバス中で溶融される。

【0146】

[0145]この段階で、抗原ストック溶液が、抗原及び濃縮リン酸バッファー（ＷＦＩ滅菌水１５ｍｌ中にＮａ_２ＨＰＯ_４、５．１７４ｇ、及びＮａＨ_２ＰＯ_４、１．１７９ｇ）を混合することにより調製される。抗原ストック溶液は、滅菌処理された１ＬのＳＳ容器内において、８０００ｒｐｍでホモジナイズされる。当該溶液を継続してホモジナイズしながら、溶融脂質（胆汁酸を含む又は含まない）は、滅菌処理されたガラス製の漏斗を介して速やかにＳＳ容器内に移される。この混合物は８０００ｒｐｍで１０分間ホモジナイズされる。得られた懸濁液は、１Ｌの滅菌ボトルに移され、３０°〜３５℃、２２０ｒｐｍで１〜２時間振とうされる。

【0147】

[0146]特定の実施形態では、得られた懸濁液は等容積（各２２５ｍｌ）の２分量に分割され、アジュバントであるポリ（ＩＣ：ＬＣ）が下記の通りに添加される。

【0148】

[0147]最初のグループでは、ポリ（ＩＣ：ＬＣ）懸濁液２２．５ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌのときポリ（ＩＣ：ＬＣ）４５ｍｇ）と１００ｍＭリン酸バッファーに溶解した４００ｍＭスクロース溶液２０２．５ｍｌとを混合することにより、４００ｍＭスクロース溶液に溶解したポリ（ＩＣ：ＬＣ）が調製される。得られた懸濁液は、第１の２２５ｍｌの容積の抗原／小胞懸濁液に添加され、３０°〜３５℃、２２０ｒｐｍで５分間振とうされる。

【0149】

[0148]第２のグループでは、ポリ（ＩＣ：ＬＣ）懸濁液７．５ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌのときポリ（ＩＣ：ＬＣ）が１５ｍｇ）と１００ｍＭリン酸バッファーに溶解した４００ｍＭスクロース溶液、２１７．５ｍｌとを混合することにより、４００ｍＭスクロース溶液に溶解したポリ（ＩＣ：ＬＣ）が調製される。得られた懸濁液は、第２の２２５ｍｌの容積の抗原／小胞懸濁液に添加され、３０°〜３５℃、２２０ｒｐｍで５分間振とうされる。

【0150】

[0149]次に、試料は−８０℃、オーバーナイトで凍結され得る。特定の実施形態では、試料はその後凍結乾燥され、４℃で貯蔵される。

【0151】

実施例１０−小胞を調製するための逆転式２−ステップ溶融法
[0150]本実施例では、小胞を調製するのに利用可能である別の典型的な逆転式２−ステップ溶融法について記載する。５：４：１のモル比の脂質（１−モノパルミトイルグリセリン（ＭＰＧ）４９６ｇ；コレステロール（ＣＨＯ）４９６ｇ；及びリン酸ジセチル（ＤＣＰ）１６４ｇ）が、平底ガラスビーカー内に、当該ガラスビーカーの側面に粉末が付着しないことを徹底しながら導入される。ＴＬＲ−４アゴニストが、脂質（例えば、１２ｍｇのＰＨＡＤ（商標）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ製のリン酸化ヘキサアシル二糖類））と共に同時溶融される。ビーカーはクランプで固定され、アルミニウムフォイルで覆われ、脂質は、時々ビーカー内で回旋操作を受けながら１２０〜１２５℃に加熱されたオイルバス内で溶融される。

【0152】

[0151]この段階で、抗原ストック溶液が、抗原及び濃縮リン酸バッファー（滅菌水２０ｍｌ中にＮａ_２ＨＰＯ_４、５．９８０ｇ、及びＮａＨ_２ＰＯ_４、１．３６３ｇ）を混合することにより調製される。抗原ストック溶液は、３０〜３５℃、８０００ｒｐｍでホモジナイズされ、ＴＬＲ−４アゴニストと共に溶融された脂質は、ホモジナイズしながら速やかにビーカー内に移される。この混合物は８０００ｒｐｍでホモジナイズされ、３０〜３５℃で１０分間継続される。得られた脂質−抗原懸濁液は３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで１〜２時間振とうされる。

【0153】

[0152]いくつかの実施形態では、スクロース水溶液は、小胞／抗原溶液に添加可能、及び３０〜３５℃、２２０±１０ｒｐｍで５分間振とう可能である。

【0154】

[0153]次に、試料は−８０℃、オーバーナイトで凍結可能である。特定の実施形態では、試料はその後凍結乾燥され、４℃で貯蔵される。

【0155】

［参考資料の援用］
[0154]本明細書で引用されるあらゆる参考資料の内容は、本明細書によりその全体を参照により援用する。

【0156】

［その他の実施形態］
[0155]説明及び実施例は、事例としてのみ考慮されるように意図されている。本明細書で開示する方法、製剤、及びキットの説明又は実践内容を検討すれば、その他の実施形態も当業者にとって明白であろう。

【0157】

[0156]特に、上記議論では、抗原の取り込みに重点が置かれたが、一般的に、当該方法は、抗原性又は非抗原性を問わず、任意の物質を取り込むのに利用可能であると理解される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、抗原性であってもまたなくてもよい１つ又は複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は多糖類を取り込むのに利用可能である。具体的な分類の物質として、アジュバント、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞反応修飾因子、例えば増殖因子及び化学走化性因子等、抗体、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス薬、プラスミド、ＤＮＡ、及びＲＮＡが挙げられるが、但し、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体又は抗体断片、例えばヒト化抗体であり得る。表４には、本開示の方法を用いて取り込まれ得る典型的な物質の非限定的なリストが記載されている。

【0158】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0159】

[0157]更に、本開示の方法は、化学的及び／又は物理的環境（例えば、微生物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類等の生物学的物質）に敏感な熱不安定性の物質に特に適用可能と考えられるが、いくつかの実施形態では、本方法は従来型の小分子治療物質を含むより安定な物質を取り込むのにも利用可能であると理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】