特許 5856481 多発性硬化症の二次性自己免疫疾患の診断および治療についての方法ならびに組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5856481

(24)【登録日】2015年12月18日

(45)【発行日】2016年2月9日

(54)【発明の名称】多発性硬化症の二次性自己免疫疾患の診断および治療についての方法ならびに組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160120BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160120BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20160120BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20160120BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20160120BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20160120BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

   G01N33/50 P

   G01N33/53 P

   !A61K39/395 N

   !C07K16/28

【請求項の数】31

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2011-530591(P2011-530591)

(86)(22)【出願日】2009年10月8日

(65)【公表番号】特表2012-504954(P2012-504954A)

(43)【公表日】2012年3月1日

(86)【国際出願番号】IB2009007327

(87)【国際公開番号】WO2010041149

(87)【国際公開日】20100415

【審査請求日】2012年3月30日

(31)【優先権主張番号】61/197,187

(32)【優先日】2008年10月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/195,658

(32)【優先日】2008年10月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/198,631

(32)【優先日】2008年11月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508311226

【氏名又は名称】ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100080137

【弁理士】

【氏名又は名称】千葉 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100096013

【弁理士】

【氏名又は名称】富田 博行

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】コールズ，アラズデア・ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】ジョーンズ，ジョアン・エル

(72)【発明者】

【氏名】コンプストン，アラステア

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１１１７１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ther. Adv. Neurol. Disord., (2008.07), 1, [1], p.33-42

【文献】 J. Clin. Immunol., (2008.09), 28, [6], p.660-670

【文献】 Nature, (2007), 448, [7152], p.480-483

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高い多発性硬化症（ＭＳ）患者を特定する方法であって、前記方法は、
前記ＭＳ患者からの血液試料中のインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）を測定するステップであって、自己免疫疾患を持たない被検者と比較して上昇したＩＬ−２１は、前記患者が、上昇したＩＬ−２１を持たないＭＳ患者と比較して、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いことを示す、ステップ、を含む、方法。

【請求項2】

リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高い多発性硬化症患者を特定する方法であって、前記方法は、
前記患者において、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される、前記患者における一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在を検出するために、前記患者の遺伝子型を決定するステップであって、前記１つ以上の前記遺伝子型の存在は、前記１つ以上の遺伝子型を持たないＭＳ患者と比較して、二次性自己免疫疾患を発症するリスクの上昇に関連するステップ、を含む、方法。

【請求項3】

前記リンパ球除去が、ＣＤ５２を標的とする治療によって誘発される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＣＤ５２を標的とする治療が、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合部分での治療を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記抗ＣＤ５２抗体が、アレムツズマブまたはＣＤ５２への結合をめぐりアレムツズマブと競合する抗体である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記リンパ球除去が、ＣＤ５２を標的とする治療によって誘発される、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

ＣＤ５２を標的とする前記治療が、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合部分での治療を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記抗ＣＤ５２抗体が、アレムツズマブまたはＣＤ５２への結合をめぐりアレムツズマブと競合する抗体である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫疾患の発症について、強化されたモニタリングを必要とする多発性硬化症（ＭＳ）患者を選択する方法であって、前記方法は、
前記ＭＳ患者からの血液試料中のＩＬ−２１を測定するステップを含み、前記患者における、自己免疫疾患を持たない被検者と比較して上昇したＩＬ−２１は、前記患者が、上昇したＩＬ−２１を持たないＭＳ患者と比較して、二次性自己免疫疾患の発症について、強化されたモニタリングを必要とすることを示す、方法。

【請求項10】

リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫疾患の発症について、強化されたモニタリングを必要とする多発性硬化症患者を選択する方法であって、前記方法は、
ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される、一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在を検出するために、前記患者の遺伝子型を決定するステップを含み、前記ＳＮＰのうちの１つ以上の存在は、前記患者が、二次性自己免疫疾患の発症について、前記１つ以上の遺伝子型を持たないＭＳ患者と比較して、強化されたモニタリングを必要とすることを示す、方法。

【請求項11】

前記測定が、前記試料内のＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１をコードする核酸の量または濃度を決定することを含む、請求項１および９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記測定が、前記試料内のＩＬ−２１産生細胞内のＩＬ−２１をコードするｍＲＮＡの測定である、請求項１および９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＩＬ−２１産生細胞がＴｈ１７細胞である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記測定が、細胞内ＩＬ−２１の測定である、請求項１および９のうちのいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記測定が、サイトカイン染色およびフローサイトメトリーを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記測定が、血清ＩＬ−２１の測定である、請求項１および９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記測定が、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記二次性自己免疫疾患が、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グレーブス病、グッドパスチャー病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少、および自己免疫性リンパ球減少からなる群から選択される、請求項１、２、９および１０のうちのいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記リンパ球除去療法が、ＣＤ５２含有細胞を標的とする、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項20】

ＣＤ５２含有細胞を標的とする前記リンパ球除去療法が、ＣＤ５２に結合する抗体、または前記抗体の抗原結合部分を投与することを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記抗体が、ＣＤ５２への結合をめぐり、アレムツズマブと競合する、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記抗体が、ＣＤ５２への結合をめぐり、アレムツズマブと競合する、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記抗体が、アレムツズマブである、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

前記血液試料が、多発性硬化症に対する療法前、療法中、または療法後の患者から獲得される、請求項１または９に記載の方法。

【請求項26】

前記血液試料が、リンパ球除去療法前の患者から獲得される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記多発性硬化症が、再発−寛解型多発性硬化症である、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記多発性硬化症が、一次性進行型多発性硬化症である、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記多発性硬化症が、二次性進行型多発性硬化症である、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高い、多発性硬化症（ＭＳ）患者を特定するためのキットであって、
抗インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）抗体および前記ＩＬ−２１抗体の前記ＭＳ患者からの血液試料中のＩＬ−２１への結合を検出するための１つ以上の試薬を含む、キット。

【請求項31】

リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高い、多発性硬化症患者を特定するためのキットであって、
個人から獲得される試料中で、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８からなる群から選択される、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を特定するのに好適な１つ以上の試薬を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

本出願の開示は、２００９年１０月８日に作成され、８，８５６バイトの容量を有する、同時に申請された「ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」ファイルを含む。
多発性硬化症（「ＭＳ」）は、中枢神経系の炎症性自己免疫障害である（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｅｓ， Ｌａｎｃｅｔ ３７２，１５０２−１７（２００８））。ＭＳは、約１０００人に１人の罹患率で、若年成人における神経障害の最も一般的な原因である（Ｐｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｕｉｔｄｅｈａａｇ，ＢＭＪ３２１，４９０−４（２０００））。ＭＳは、免疫系の関与、軸索および神経膠の急性炎症性損傷、機能の回復および構造修復、炎症後神経膠症、ならびに神経変性を伴う（例えば、Ｃｏｍｐｓｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｅｓ，２００８を参照のこと）。これらの連続的プロセスは、回復を伴う発現、持続性の欠損、および二次性進行を残す発現によって特徴付けられる、臨床経過の根拠をなす（同上）。

【0002】

ＭＳ治療の目標は、再発頻度および重症度を低減すること、疾患進行から生じる身体障害を予防すること、および組織修復を促進することである（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｅｓ，２００８）。ＭＳ治療に対する第１のアプローチは、免疫系の調節または抑制である。現在入手可能なＭＳ薬には、インターフェロンベータ−１ａ（例えば、ＡＶＯＮＥＸおよびＲＥＢＩＦ）、インターフェロンベータ−１ｂ（例えば、ベータＳＥＲＯＮ）、グラチラマー酢酸塩（例えば、ＣＯＰＡＸＯＮＥ）、ミトキサントロン（例えば、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）、およびナタリズマブ（例えば、ＴＹＳＡＢＲＩ）が含まれる。ＭＳに対する別の有望な新薬は、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）である。

【0003】

アレムツズマブは、リンパ球および単球の表面上に広範に分配されるが、未知の機能を有するタンパク質であるＣＤ５２に対して向けられる、ヒト化モノクローナル抗体である。アレムツズマブは、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病を治療するために使用されている。単一パルスの治療は、急激な、重度の、および持続的なリンパ球減少をもたらす。細胞数は回復するが、その速度は様々であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、特に回復が遅く、少なくとも５年間は減少状態のままである（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２５３，９８−１０８（２００６））。第２相試験（ＣＡＭＭＳ−２２３ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ；Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９，１７８６−１８０１（２００８））は、アレムツズマブが、早期の再発−寛解型多発性硬化症を治療するのに非常に有効であることを示している。この薬物は、早期の再発−寛解型多発性硬化症を持つ患者において、インターフェロン−ベータと比較して、疾患活性および身体障害の蓄積のリスクを、７０％を超える割合で低減させる。主な有害作用は、投薬後数ヶ月〜数年でＴ細胞リンパ球減少の状況において生じる、自己免疫である。患者の約２０％〜３０％は、甲状腺自己免疫、主にグレーブス病（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３５４，１６９１−１６９５ （１９９９））を発症し、３％は、免疫性血小板減少（ＩＴＰ）（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）を有する。グッドパスチャー病、自己免疫性好中球減少（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ２５３，９８−１０８（２００６））、および自己免疫性溶血性貧血（未発表）の単一のケースもまた、観察されている。加えて、患者のさらに５．５％は、臨床疾患（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）のない、持続性非甲状腺自己抗体を発症する。アレムツズマブ後の自己免疫の時期および範囲は、他の臨床背景における「再構成自己免疫」の他の例で見られるそれらに類似し、例えば、自己免疫性甲状腺疾患および自己免疫血球減少もまた、造血幹細胞移植またはＨＩＶの抗レトロウイルス治療の数ヶ月〜数年後に主に現れる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）８４，９８−１０６（２００５）、Ｄａｉｋｅｌｅｒ ａｎｄ Ｔｙｎｄａｌｌ，Ｂｅｓｔ．Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０，３４９−３６０（２００７）、Ｊｕｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８５，４２５４−４２５７（２０００）、Ｔｉｎｇ，Ｚｉｅｇｌｅｒ，ａｎｄ Ｖｏｗｅｌｓ，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２１，８４１−８４３（１９９８）、Ｚａｎｄｍａｎ−Ｇｏｄｄａｒｄ ａｎｄ Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．１，３２９−３３７（２００２））。

【0004】

リンパ球減少という状況において生じる自己免疫が、動物モデルにおいて周知である一方で、それはまれな遭遇であり、故に、ヒトにおいて検討することは困難である。ほとんどのリンパ球減少被検者は、自己免疫を発症せず、さらなる要因を伴うことを示唆する（Ｋｒｕｐｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ１２０，１２１−１２８（２００６））。それらのさらなる要因が何であるかは、依然として不明確である。マウス大腸炎および胃炎モデルで見られる通り、制御性Ｔ細胞の減少が１つの要因として考えられている（Ａｌｄｅｒｕｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１７８，４１９−４２６（１９９３）、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６８，５９７９−５９８３（２００２）、Ｐｏｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ５，１４６１−１４７１（１９９３）、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１５５，１１５１−１１６４（１９９５））。しかしながら、ヒト患者において、制御性Ｔ細胞が、アレムツズマブ後に増加し、それ以降正常レベルに回帰することが観察されている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ３５、３３３２−３３４２（２００５））。以来、この観察は再現されており（Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．８，７９３−８０２（２００８））、他の実験的リンパ球減少モデルと一致している（ｄｅ Ｋｌｅｅｒ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０７，１６９６−１７０２（２００６）；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１，１２３８−１２４３（２００５））。

【発明の概要】

【0005】

我々は、ＭＳ治療におけるリスク管理を改善するための、新たなかつ有用な方法および組成物を発明した。方法および組成物は、二次性自己免疫等の、ＭＳ治療の副作用を低減し、ＭＳ治療および治療後のモニタリング計画を選択する際に、医療提供者および患者を援助する。本発明の方法および組成物は、多発性硬化症（ＭＳ）患者において、アレムツズマブ治療等のリンパ球除去療法の前であっても検出可能な、上昇したＩＬ−２１が、治療後に二次性自己免疫を発症するリスクの上昇と相関するという、我々の発見に基づく。我々はさらに、個人のＩＬ−２１レベルが、遺伝的に決定され得るということを発見しており、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃの一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型は、上昇したＩＬ−２１に関連する。

【0006】

したがって、本発明は、自己免疫疾患を持たない被検者におけるＩＬ−２１と比較して、上昇したインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）を有するＭＳ患者を特定する方法を提供する。幾つかの実施形態では、方法は、ＭＳ患者からの血液試料中のＩＬ−２１を測定するステップを含み、それによって被検者と比較して、上昇したＩＬ−２１を有するＭＳ患者を特定する。代替的に、方法は、患者において、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在を検出するために、患者の遺伝子型を決定するのステップを含み、ここで１つ以上の遺伝子型の存在は、上昇したＩＬ−２１に関連する。

【0007】

本発明はさらに、リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いＭＳ患者を特定する方法を提供する。幾つかの実施形態では、方法は、ＭＳ患者からの血液試料中の、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）のレベルを確認する（例えば、測定によって）ステップを含み、ここで自己免疫疾患を持たない被検者と比較して上昇したＩＬ−２１は、患者が、上昇したＩＬ−２１を持たないＭＳ患者と比較して、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いことを示す。代替的に、方法は、患者において、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在を確認する（例えば、遺伝子型決定によって）ステップを含み、ここで１つ以上（例えば、２つまたは３つ）の前記遺伝子型の存在は、１つ以上の遺伝子型を持たないＭＳ患者と比較して、二次性自己免疫疾患を発症するリスクの上昇に関連する。これらの方法は任意に、患者および／またはおよび／または患者の医療提供者に、リスクの上昇を通知するステップ、ならびに／またはリスクの上昇を記録するステップを含む。

【0008】

本発明はさらに、リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫疾患の発症について、強化されたモニタリングを必要とするＭＳ患者を選択または特定する方法を提供する。これらの方法は、ＭＳ患者からの血液試料中のＩＬ−２１を測定するステップを含んでもよく、ここで患者における、自己免疫疾患を持たない被検者と比較して上昇したＩＬ−２１は、患者が、上昇したＩＬ−２１を持たないＭＳ患者と比較して、二次性自己免疫疾患の発症について、強化されたモニタリングを必要とすることを示す。代替的に、方法は、患者において、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在を検出するために、患者の遺伝子型を決定するのステップを含んでもよく、ここで１つ以上のＳＮＰの存在は、患者が、二次性自己免疫疾患の発症について、前記１つ以上の遺伝子型を持たないＭＳ患者と比較して、強化されたモニタリングを必要とすることを示す。これらの方法は任意に、患者および／または患者の医療提供者に、強化されたモニタリングの必要性を通知するステップ、ならびに／または必要性を記録するステップを含む。

【0009】

本発明はまた、ＭＳ患者に対する治療を通知する方法を提供し、その方法は、患者からの血液試料中のＩＬ−２１測定すること、または前述の３つのＳＮＰ表現型の存在または非存在について、患者の遺伝子型を決定すること、およびＩＬ−２１測定値もしくは遺伝子型に適切な治療計画を選択することを含む。

【0010】

本発明は、治療を必要とすることが知られている患者におけるＭＳを治療する方法を提供し、その方法は、（ａ）（ｉ）患者からの血液試料中のＩＬ−２１（例えば、試料内のＩＬ−２１を測定することによって）、または（ｉｉ）ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在（例えば、患者の遺伝子型を決定することによって）、についての情報を獲得または確認するステップ、（ｂ）患者に、多発性硬化症に対する治療剤を投与するステップ、および（ｃ）任意に、二次性自己免疫疾患の発症について、患者をモニタリングするステップを含む。幾つかの実施形態では、治療の方法は、正常なＩＬ−２１レベルを有することが見出され、および／または前述の３つのＩＬ−２１ＳＮＰ遺伝子型を１つも有さない患者に対して使用される。これらの治療方法に使用される抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブまたは生物学的に類似した薬剤）、またはその抗原結合部分、およびこれらの治療方法に使用するための薬剤の製造における、これらの抗体または抗原結合部分の使用もまた、本発明によって包含される。これらの治療方法を使用する治療計画が、本発明によってさらに包含される。

【0011】

本発明は、リンパ球除去療法で治療されているか、または治療されようとしている多発性硬化症患者における二次性自己免疫疾患の発生または重症度を低減するための方法を提供し、ここで二次性自己免疫疾患は、リンパ球除去療法での治療後に発生し、ＩＬ−２１拮抗薬を、例えば、リンパ球除去療法での治療前、治療中、または治療後に投与するステップを含む。これらの方法に使用するためのＩＬ−２１拮抗薬（例えば、抗ＩＬ−２１もしくは抗ＩＬ−２１受容体抗体、またはその抗原結合部分、あるいは可溶性ＩＬ−２１受容体）、および方法に使用するための薬剤の製造における、これらのＩＬ−２１拮抗薬の使用もまた、本発明によって包含される。

【0012】

本発明は、多発性硬化症患者における、リンパ球除去療法での治療に対する、Ｔ細胞の応答性を評価する方法を提供し、その方法は、療法後の患者から獲得されるＴ細胞内のカスパーゼ−３を測定することを含み、ここで療法を受けていないＭＳ患者からのＴ細胞と比較した、Ｔ細胞内のカスパーゼ−３の増加は、療法に対するＴ細胞の応答性を示す。測定は、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−３をコードする核酸の量または濃度を決定することを伴い得る。

【0013】

本発明は、ＭＳ患者に、リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクの上昇を通知する方法を提供し、その方法は、ＭＳ患者からの血液試料中の、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）についての情報を獲得または確認するステップであって、自己免疫疾患を持たない被検者と比較して上昇したＩＬ−２１は、患者が、上昇したＩＬ−２１を持たないＭＳ患者と比較して、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いことを示すステップ、および患者にリスクの上昇またはそれを欠くことを通知するステップを含む。代替的に、方法は、血中ＩＬ−２１レベルについての情報の代わりに、１つ以上の前述のＩＬ−２１遺伝子型の存在または非存在についての情報を獲得または確認することを含む。したがって、本発明はまた、ＭＳ患者に、患者のＩＬ−２１レベルまたは上述のＩＬ−２１遺伝子型の存在または非存在に基づいて、リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫疾患の発症についての、強化されたモニタリングの必要性または必要性の欠如を通知する方法をも提供する。

【0014】

本発明は、リンパ球除去療法の後に、ＭＳ患者をモニタリングする計画について、通知する方法を提供し、その方法は、（ｉ）患者からの血液試料中のＩＬ−２１、または（ｉｉ）ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在、についての情報を獲得または確認するステップ、および情報に基づき、患者に適切な治療計画を選択するステップを含む。適切なモニタリング計画は、例えば、患者における自己抗体を測定することを含み得る。

【0015】

本発明は、ＭＳ治療の際のリスク管理における利点を提供する。例えば、本発明は、多発性硬化症を治療するためのリンパ球除去薬を患者に分配する方法を提供し、その方法は、患者に、薬物での治療後の、二次性自己免疫疾患を発症するリスクの上昇について助言するステップであって、ここでのリスクの上昇は、（ｉ）上昇したＩＬ−２１、または（ｉｉ）ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在に関連するステップ、および助言の後、または任意に、患者から告知に基づく同意を獲得した後、患者に薬物を提供するステップを含む。

【0016】

本発明はさらに、いかなる既知の炎症性疾患をも持たない被検者と比較して、上昇したインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）を有する可能性が高い個人を特定する方法を提供し、その方法は、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在または非存在を検出するために、患者の遺伝子型を決定するステップを含み、ここで１つ以上の遺伝子型の存在は、上昇したＩＬ−２１に関連する。

【0017】

本発明の文脈において、リンパ球除去は、例えば、抗ＣＤ５２抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはその抗原結合部分での治療等、ＣＤ５２を標的とする治療によって誘発され得る。この抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブ、またはＣＤ５２への結合をめぐり、アレムツズマブと競合する抗体等の、生物学的に類似した薬剤であり得る。

【0018】

本発明の方法において、ＩＬ−２１測定は、試料内のＩＬ−２１もしくはＩＬ−２１をコードする核酸の量または濃度（例えば、検出すること／定量化すること）、または試料内のＩＬ−２１産生細胞（例えば、ＴｈＩ７細胞）中の、ＩＬ−２１をコードするｍＲＮＡの量または濃度を測定することを伴い得る。幾つかの実施形態では、測定は、細胞内ＩＬ−２１の測定であり、例えば、サイトカイン染色およびフローサイトメトリーを使用する。幾つかの実施形態では、測定は、血清ＩＬ−２１の測定であり、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用する。ヒト被検者におけるＩＬ−２１レベルを検出するためのＥＬＩＳＡキットもまた、本発明によって包含され、それは、抗ＩＬ−２１抗体もしくはその抗原結合部分、または可溶性ＩＬ−２１受容体を含む。キットはさらに、ヒト被検者から血液試料を採ることを指示する使用説明書を含み得る。

【0019】

本発明の方法において、ＩＬ−２１情報（測定または遺伝子型決定を含む）は、ＭＳ治療前、治療中、または治療後に獲得され得る。本発明の方法は、あらゆるＭＳ型の背景において使用され得、再発−寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、および二次性進行型多発性硬化症を含むが、それらに限定されない。

【0020】

本発明はまた、多発性硬化症を治療するキットをも提供し、リンパ球除去療法剤（例えば、アレムツズマブ等の抗ＣＤ５２抗体）、および患者または医療提供者に、薬剤での治療後の、二次性自己免疫疾患を発症するリスクの上昇についての潜在性を通知するための使用説明書を含み、このリスクの上昇は、（ｉ）上昇したＩＬ−２１、または（ｉｉ）ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される遺伝子型等、上昇したＩＬ−２１に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在によって示されるか、またはそれらに関連する。

【0021】

本発明はさらに、リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いＭＳ患者を特定するためのキット提供し、それは抗インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）抗体、および抗体の、ＭＳ患者からの血液試料中のＩＬ−２１への結合を検出するための１つ以上の試薬を含む。本発明はまた、リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いＭＳ患者を特定するためのキット提供し、それは個人から獲得される試料中で、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８からなる群から選択される、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を特定するのに好適な１つ以上の試薬を含む。

【0022】

本発明の他の特徴および利点は、以下の図面および詳細な説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】健康な対照（ＨＣ）、治療されていない患者（Ｐｒｅ）、およびアレムツズマブ後から３ヶ月間隔についての、刺激されていない（Ｕｎｓｔｉｍ）、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）もしくは甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨｒ）で培養された後のＴ細胞の前駆体頻度（ＰＦ）を示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図1B】健康な対照（ＨＣ）、治療されていない患者（Ｐｒｅ）、およびアレムツズマブ後から３ヶ月間隔についての、刺激されていない（Ｕｎｓｔｉｍ）、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）もしくは甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨｒ）で培養された後のＴ細胞の増殖指数（ＰＩ）を示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図1C】健康な対照（ＨＣ）、治療されていない患者（Ｐｒｅ）、およびアレムツズマブ後から３ヶ月間隔についての、刺激されていない（Ｕｎｓｔｉｍ）、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）もしくは甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨｒ）で培養された後の、培養液中で１０日間後の生存Ｔ細胞の合計数を示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図1D】健康な対照（ＨＣ）、治療されていない患者（Ｐｒｅ）、およびアレムツズマブ後から３ヶ月間隔についての、無刺激に応答して、または培養液中のＭＢＰもしくはＴＳＨｒでの培養後に、アポトーシスを起こしたＴ細胞の割合を示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図1E】アレムツズマブ前後の、３ヶ月間隔での、健康な対照および患者についての、受動Ｔ細胞アポトーシスを示すプロットおよびグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図1F】アレムツズマブ前後の、３ヶ月間隔での、健康な対照および患者についての、Ｆａｓ媒介Ｔ細胞アポトーシスを示すプロットおよびグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図1G】健康な対照、治療前患者、およびアレムツズマブ後９ヶ月についての、受動ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞アポトーシスを示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図1H】健康な対照、治療前患者、およびアレムツズマブ後９ヶ月についての、Ｆａｓ媒介ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞アポトーシスを示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図2】図２Ａ〜２Ｃ：エクスビボ直後での、またはＭＢＰもしくはポリクローナル刺激（抗ＣＤ３／２８抗体）での刺激後のいずれかでの、それぞれ（Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ１４＋単球、および（Ｃ）ＣＤ１９＋Ｂ細胞中の、ベータ−アクチンｍＲＮＡ発現に相対的な、カスパーゼ３ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図3】アレムツズマブ後の自己免疫が、過剰Ｔ細胞アポトーシスに関連することをを示すプロットおよびグラフである。自己免疫のない場合（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ１０１，３０４１−３０４６（２００４））、または二次性自己免疫のある場合（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００４）の受動的（Ｕｎ）、Ｆａｓ媒介、またはＭＢＰもしくはＴＳＨｒ刺激に応答したＴ細胞アポトーシスの割合は、別個のプロットで示される。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図4】図４Ａおよび４Ｂ：ｒｈＩＬ−２１が、インビトロでのＴ細胞アポトーシスを誘発することを示すプロットおよびグラフである。それらは、それぞれ刺激されていないか、またはポリクローナル刺激を受けた（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞および（Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞が、用量依存的様式でｒｈＩＬ−２１に応答してアポトーシスを起こすことを示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）

【図5】図５Ａ〜５Ｄ：ｒｈＩＬ−２１が、インビトロでのＴ細胞増殖を誘発することを示すグラフである。図５Ａは、ｒｈＩＬ−２１に応答した、刺激されていないＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖指数を示すグラフである。図５Ｂは、ｒｈＩＬ−２１に応答した、ポリクローナル刺激を受けた（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖指数を示すグラフである。図５Ｃは、ｒｈＩＬ−２１に応答した、刺激されていないＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の前駆体頻度を示すグラフである。図５Ｄは、ｒｈＩＬ−２１に応答した、ポリクローナル刺激を受けたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の前駆体頻度を示すグラフである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【0024】

図５Ｅ：ｒｈＩＬ−２１の非存在下での、またはｒｈＩＬ−２１に応答した、異なるチャネルにおける、刺激されていないか、またはポリクローナル刺激を受けた（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋細胞の数を示すプロットである。

【図6】図６Ａ：二次性自己免疫を持つ１５人の患者、および二次性自己免疫を持たない１５人の患者における、アレムツズマブ治療前ならびに治療後の血清ＩＬ−２１を示すグラフである。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１） 図６Ｂ：非自己免疫患者（アレムツズマブ後の自己免疫を有さなかった）および自己免疫患者（アレムツズマブ後の自己免疫を有した）における、治療前の血清ＩＬ−２１レベル（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明は、リンパ球除去療法の後の（例えば、アレムツズマブを用いた治療後）、ＭＳ患者における、二次性自己免疫の発生が、患者における上昇したＩＬ−２１に関連するという我々の発見に基づく。我々は、治療後の二次性自己免疫を後に発症するＭＳ患者において、ＩＬ−２１が、治療前であっても、標準と比較して（以下の説明を参照のこと）上昇していることを発見している。我々はまた、リンパ球除去療法の後に、ＩＬ−２１が、それらの同一の患者において、そのＩＬ−２１がより小幅に上昇している、二次性自己免疫の兆候を持たないＭＳ患者と比較して、より著しく上昇していることを発見している。したがって、ＩＬ−２１レベルは、ＭＳ患者における、リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫の発生を予測する。我々はまた、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃの一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型が、個人における上昇したＩＬ−２１に関連することを発見しており、したがってこれらの特定のＳＮＰ遺伝子型の存在または非存在についての、ＭＳ患者の遺伝子型決定はまた、リンパ球除去の後の、患者における二次性自己免疫を発症するリスクを予測することを助ける。

【0026】

１９９９年に、我々は、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ）治療に合併した自己免疫を最初に記載し（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、早期の再発−寛解型多発性硬化症に対して非常に有効な治療として次第に認識されつつある治療薬の、この合併症を観察し続けている（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２５３，９８−１０８（２００６）、Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９および２００８）。下述のように我々の研究は、入手可能な患者の一連のコホートを含み、アレムツズマブによって治療されたＭＳ患者のサブセットにおいて発生する、この前例のないヒト自己免疫の「モデル」を理解することを目的としていた。

【0027】

免疫状態は、アレムツズマブへの曝露の後に、根本的に変化する。アレムツズマブによって生じるリンパ球減少環境へと再生するＴ細胞は、非常に増殖性であり、自己反応性に偏る。しかしながら、これらの細胞は、非常に不安定で、短命である。それらの結果がこれまで直接に対処されてこなかった一方で（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１７，２６５−２７７（２００４））、我々は、これらの細胞が、アポトーシスによって迅速に死滅しつつあることを示す。高レベルおよび持続性レベルのＴ細胞アポトーシスは、循環アレムツズマブの半減期が６日間に過ぎず、血液学的前駆体が減少しないにもかかわらず、単回用量のアレムツズマブが、数年間持続するＴ細胞リンパ球減少を誘発する理由を説明し得る（Ｇｉｌｌｅｅｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８２，８０７−８１２（１９９３））。

【0028】

その背景に照らして、我々は、二次性自己免疫疾患を持つ患者が、自己免疫を持たない患者と比較して、より高い比率のＴ細胞アポトーシスを有するが、より大規模なＴ細胞リンパ球減少は有さず、それはこの群における細胞周期の増加を示唆することを示す。これらのＴ細胞周期の摂動は、有意に高い血清ＩＬ−２１の発現に関連し、我々はそれが、少なくとも幾つかの場合においては、遺伝的に決定されることを見出している。さらに、リンパ球減少関連型自己免疫に対する感受性は、リンパ球除去前から明白であり、治療前のＩＬ−２１レベルは、アレムツズマブへの曝露の数ヶ月〜数年後の自己免疫の発症を、正確に（７０％を超える、例えば、８３％の陽性適中率、および６２％を超える、例えば、７２％の陰性適中率）予測する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、我々は、Ｔ細胞増殖および死滅の周期を過剰なまでに駆り立てることによって、ＩＬ−２１が、Ｔ細胞が自己抗原に遭遇し、耐性を破壊する確率的機会を増加させ、故に自己免疫を促進すると考える。

【0029】

要約すると、我々の発見は、ヒトにおける、リンパ球減少誘発型自己免疫の最初の探求を提供し、またアレムツズマブを用いた多発性硬化症の治療という限られた文脈を超えて、リンパ球減少関連型自己免疫を理解するための概念的枠組みを提供する。概念は、第１に治療的リンパ球除去、および第２に、ＩＬ−２１の遺伝的に制限された過剰産生によって、過剰なＴ細胞周期および生存率低下の状態がもたらされ、それがヒトにおける自己免疫を促進するということである。これらの発見は、本発明のための基盤を提供する。

【0030】

本発明は、アレムツズマブ治療等のリンパ球除去療法を検討する場合に、ＭＳ患者に対応する方法を提供する。例えば、本発明は、標準（すなわち、下述のように対照の被検者におけるＩＬ−２１のレベル）と比較して上昇したＩＬ−２１を有するＭＳ患者を特定する方法、およびリンパ球除去の後に、二次性自己免疫を発症するリスクが高いＭＳ患者を特定する方法を提供する。これらの方法は、患者からの血液試料中のＩＬ−２１（例えば、細胞内または細胞外のタンパク質レベル、ＲＮＡ転写物レベル、またはＩＬ−２１活性レベル；以下の説明を参照のこと）を測定するステップ、およびＩＬ−２１値を正常なＩＬ−２１値と比較するステップを含む。代替的に、血液試験の代わりにまたは血液試験に加えて、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／ＣのＳＮＰ遺伝子型の１つ以上の存在または非存在について、患者の遺伝子型を決定することが可能であり、ここでこれらの遺伝子型の１つ、２つ、または３つ全ての存在は、上昇したＩＬ−２１に関連する。上述のように、上昇したＩＬ−２１は、上昇したＩＬ−２１を有さないＭＳ患者と比較して、リンパ球除去の後の、ＭＳ患者における二次性自己免疫を発症するリスクの増加に関連する。

【0031】

本発明の方法による患者の特定には、本発明によって企図される幾つかのさらなるステップが続いてもよい。例えば、患者は、患者のＩＬ−２１レベルまたは遺伝子型に基づいて、リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫を発症するリスクの上昇、またはかかるリスクの欠如について通知され得る。したがって、本発明は、治療に専念する前の、治療リスクについての個別の助言を可能にするであろう。医療提供者は、二次性自己免疫のリスクを考慮して治療的選択肢を検討し、提案提供することができ、例えば、リンパ球除去療法の前、間、または後にＩＬ−２１拮抗薬投与すること、またはリンパ球除去を伴わない治療計画を選択することを含む。

【0032】

医療提供者はまた、リンパ球除去療法を経ることを選択する患者のために、リスク管理計画を検討することができる。例えば、医療提供者は、患者の、二次性自己免疫を発症するリスクの上昇を考慮して、患者に、リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫疾患の発症についての強化されたモニタリングの必要性を通知することができる。医療提供者はまた、リンパ球除去療法の後の、適切なモニタリング計画を提案することもできる。リスクのある患者のための、適切なモニタリング計画は、制限なしに、例えば、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年等の間隔で、リンパ球除去療法の後の、二次性自己免疫についてのより頻繁なモニタリングを含み得る。一部の患者は、リンパ球除去療法の１年よりもはるかに後まで、二次性自己免疫を示さない可能性があるため、モニタリングは、例えば、１年を超えて、２年、３年、４年、５年を超えて、またはそれ以上にわたり、長期間継続される必要があり得る。強化されたモニタリングはまた、例えば、二次性自己免疫の兆候について、専門医によるより徹底的な健康診断（例えば、さらなる血液試験）を伴い得る。さらに、ＭＳを治療するためのリンパ球除去薬を患者に分配する薬剤師または臨床スタッフは、患者が、上昇した血清ＩＬ−２１に関連する、本明細書で説明される上昇したレベルのＩＬ−２１および／または特定のＩＬ−２１遺伝子型を有する場合には、患者に、薬物使用の後に二次性自己免疫を発症するリスクの上昇について助言することを求められ得る。薬剤師または臨床スタッフはまた、患者に薬物を分配する前に、患者から告知に基づく同意獲得することをも求められ得る。
多発性硬化症患者
本発明の方法および組成物は、例えば、再発−寛解型ＭＳ、一次性進行型ＭＳ、および二次性進行型ＭＳ等、あらゆる形態のＭＳの背景において、使用され得る。本発明の文脈におけるＭＳ患者とは、例えば、症状の経歴、ならびに試験等磁気共鳴画像装置（ＭＲＩ）、脊椎穿刺、誘発電位試験、および血液試料の研究所分析の活用による神経学的検査によって、ＭＳの形態を有すると診断されている患者である。

【0033】

散在性硬化症としても知られる、多発性硬化症（「ＭＳ」）はまた、免疫系が中枢神経系を攻撃し、脱髄をもたらすような自己免疫状態でもある（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｅｓ，２００８）。ＭＳは、神経線維を包み込み電気的に絶縁する、ミエリン鞘と呼ばれる脂肪層を破壊する。ほとんど全ての神経症状が疾患と共に現れ得、しばしば身体および認知障害にまで進行する（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｅｓ，２００８）。ＭＳは複数の形態をとり得る。新たな症状は、離散した発作（再発型）として発生し得るか、または時間と共に徐々に蓄積され得る（進行型）（Ｌｕｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４６（４），９０７−１１（１９９６））。各発作の間に、症状は完全に消失し得るが（寛解）、永続的な神経学的問題が、特に疾患が進行すると共にしばしば発生する（Ｌｕｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。進行の幾つかのサブタイプまたはパターンが説明されており、それらは、予後ならびに治療的決定のために重要である。１９９６年に、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｓｏｃｉｅｔｙは、４つのサブタイプの定義を標準化した：再発−寛解型、二次性進行型、一次性進行型、および再発進行型（Ｌｕｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0034】

再発−寛解型サブタイプは、悪化または再発と呼ばれる予測不可能な急性発作、続いて疾患活動性の新たな兆候がない数ヶ月〜数年の比較的平穏な（寛解）期間によって特徴付けられる。これは、ＭＳを有するほとんどの個人の初期の経過を説明する（Ｌｕｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0035】

二次性進行型ＭＳは、再発−寛解型経過と共に始まるが、後に各急性発作の間に、まれな再発および小規模の寛解が現れ得るとしても、いかなる寛解の一定期間をも有さずに、進行型神経減少へと発展する（Ｌｕｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0036】

一次性進行型サブタイプは、それらの最初のＭＳ症状が現れた後の明白な寛解を有さない、身体障害の段階的であるが着実な進行によって特徴付けられる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ６（１０）、９０３−１２（２００７））。それは、発現以降、寛解および改善を有さないか、わずかな小規模の寛解ならびに改善を有する、身体障害の進行によって特徴付けられる（Ｌｕｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。一次性進行型サブタイプについての発現の年齢は、通常他のサブタイプに比べて高めである（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７））。

【0037】

再発進行型ＭＳは、いくらかの回復が後に続く可能性があるか、またはその可能性がない急性発作を有する着実な神経減少によって特徴付けられる。これは、本明細書で上述される全てのサブタイプのうち最もまれである（Ｌｕｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0038】

時にＭＳの境界型と呼ばれる、非標準的な行動を有するケースもまた記載されている（Ｆｏｎｔａｉｎｅ，Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１５７（８−９ Ｐｔ ２）：９２９−３４（２００１））。これらの形態には、デビック病、バロー同心円性硬化症、シルダー汎発性硬化症、およびＭａｒｂｕｒｇ型多発性硬化症が含まれる（Ｃａｐｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２５Ｓｕｐｐｌ４：Ｓ３６１−３（２００４）；Ｈａｉｎｆｅｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．５５（１２）：１１９４−６（１９９２））。
多発性硬化症患者におけるリンパ球除去
本明細書で使用されるとき、「リンパ球除去」とは、循環リンパ球、例えば、Ｔ細胞および／またはＢ細胞を減少させることによる、免疫抑制の一種であり、リンパ球減少をもたらす。持続的リンパ球除去は、多発性硬化症を治療するために、例えば、自己骨髄移植（ＢＭＴ）または全身リンパ節照射が使用されるときに見られる。例えば、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５、３３３２−３３４２（２００５）を参照のこと。例えば、リンパ球除去は、サイモグロブリン、シクロホスファミド、および全身照射を組み合わせた使用によって達成され得る。ＭＳ患者におけるリンパ球除去はまた、幾つかの薬物治療によっても達成され得る。例えば、ヒト化抗ＣＤ５２モノクローナル抗体である、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（アレムツズマブ）は、ＭＳ患者を治療するためのリンパ球除去療法に使用されている。ＣＡＭＰＡＴＨ−ｌＨ−誘発型リンパ球減少は、臨床的かつ放射線学的に、中枢神経系炎症を効果的に低減させることが示されている（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６，２９６−３０４（１９９９）、Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0039】

他の薬剤もまた、ＭＳ患者を治療するためのリンパ球除去療法に使用され得る。これらの薬剤は、リンパ球細胞死を引き起こすか、またはリンパ球機能を阻害する薬剤であり得る。これらには、制限なしに、（１）アレムツズマブに生物学的に類似する薬剤等の、ＣＤ５２含有細胞を標的とする薬剤、すなわち、アレムツズマブと同一のまたは異なるエピトープに結合するか、ＣＤ５２への結合をめぐり、アレムツズマブと競合する他の抗ＣＤ５２抗体（例えば、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体）、およびＣＤ５２のリガンドへの結合をめぐり、細胞表面ＣＤ５２と競合する可溶性ＣＤ５２ポリペプチド、（２）リンパ球上の細胞表面分子を標的とする、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ＴＣＲ抗体、および抗インテグリン抗体（例えば、ナタリズマブ）等の、ペプチド、タンパク質、ならびに抗体等の生体分子（例えば、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体）、（３）リンパ球へ特異的にまたは非特異的に送達される、細胞毒（例えば、アポトーシス含有薬剤、シクロホスファミド、アルキル化剤、およびＤＮＡ挿入剤）、および（４）前述の抗体の抗原結合部分が含まれる。抗体には、制限なしに、モノクローナル抗体、二機能性抗体、オリゴクローナル抗体、およびポリクローナル抗体が含まれ得る。

【0040】

本明細書で使用されるとき、「抗原結合部分」という用語は、その部分の由来となる完全な抗体として、特異的に同一の抗原に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片に言及する。「抗原結合部分」の例としては、制限なしに、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、分離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、ｓｃＦｖ、および二重特異性抗が挙げられる。本発明に有用な抗体およびその抗原結合部分は、当業者に周知のあらゆる方法によって作製され得る。

【0041】

以上のリンパ球除去療法のどれもがリンパ球減少を引き起こし得、一部の患者においては、リンパ球減少が二次性自己免疫をもたらす。
ＭＳ患者における二次性自己免疫
本明細書で自己免疫は、それが第１の（「一次性」）疾患、例えば、「一次性」自己免疫疾患の発現の後に生じるとき、「二次性自己免疫」と呼ばれる。二次性自己免疫は時に、例えば、リンパ球除去療法に続く、リンパ球減少を有するか、有したことのあるＭＳ患者において生じる。一部の個人においては、二次性自己免疫は、リンパ球除去療法の後間もなく生じる（例えば、アレムツズマブを用いた治療）。他の個人においては、二次性自己免疫は、リンパ球除去療法の数ヶ月または数年後まで生じない可能性があり、それらの個人の一部においては、彼らが二次性免疫を発症する頃には、かなりのリンパ球回復（合計リンパ球数）が生じ得、彼らはもはやリンパ球減少症ではなくなる可能性がある。

【0042】

リンパ球減少ＭＳ患者において生じる二次性自己免疫は、ＭＳ以外のあらゆるタイプの自己免疫状態であり得、それは、甲状腺自己免疫（例えば、グレーブス病）、免疫性血小板減少（ＩＴＰ）、グッドパスチャー病、自己免疫性好中球減少、自己免疫性溶血性貧血、および自己免疫性リンパ球減少を含むが、それらに限定されない。これらの自己免疫疾患を診断およびモニタリングする技術は、当業者に周知であり、それは症状の評価および血液分析等の健康診断を含む。本発明は、あらゆる既知の方法の使用を企図する。例えば、患者の体液（例えば、血液）における自己抗体レベルは、自己免疫の兆候を検出する手段として、決定され得る。特に、抗核抗体、抗平滑筋抗体、および抗ミトコンドリア抗体が測定され得る。抗核抗体が検出される場合、抗二本鎖ＤＮＡ抗体、抗リボ核タンパク質抗体、および抗Ｌａ抗体を測定するために、追加的検定が行われ得る。自己免疫性甲状腺疾患を検出するために、抗甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）および抗甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体抗体が測定され得、抗ＴＰＯまたは抗ＴＳＨ受容体抗体が検出される場合、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４およびＴＳＨレベルを測定することによって、甲状腺機能が影響を受けているかどうかを測定することができる。自己免疫血小板減少検出するために、抗血小板抗体が測定され得、血液血小板レベルの測定は、抗血小板抗体の存在が、血小板数の減少を引き起こしているかどうかを決定する機能を果たし得る。
ＩＬ−２１の測定
本発明の方法において、ＩＬ−２１は、幾つかの技術によって測定され得る。ＩＬ−２１は、ガンマｃ関連サイトカインファミリーの一員であり、ＴおよびＢ細胞増殖、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞毒性を促進するのに強力な活性を有する。ＩＬ−２１は、主に活性ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、ＴｈＩ７細胞）によって発現され、ＴヘルパータイプＩ（ＴｈＩ）免疫応答に重要である（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７，１７０５−１７２１（２００７）、Ｓｉｖａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１１２，１７７−１８２（２００４））。ヒトＩＬ−２１遺伝子は、１６２アミノ酸残基のポリペプチド前駆体および１３３アミノ酸残基（約１５ｋＤ）の十分に進行した成熟タンパク質をコードし、遺伝子は、ヒト染色体４ｑ２６−２７に配置される（Ｓｉｖａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＩＬ−２１（ＩＬ−２ＩＲ）に対する受容体は、休止抹消Ｂ細胞上、活性抹消血液単核細胞上、およびヒトリンパ節の胚中心内で見出さている（Ｍａｒｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．７８、５７５−５８４（２００５））。

【0043】

ＩＬ−２１を測定する方法は、当業者に周知である。本発明の幾つかの実施形態にしたがって、体液試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液）が、患者から獲得され、試料内のＩＬ−２１レベルが、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等の免疫検定を含むが、それに限定されない、あらゆる検定に好適なタンパク質検出によって測定される。ヒトＩＬ−２１を測定するための商用のＥＬＩＳＡキットは、例えば、ＫＯＭＡＢＩＯＴＥＣＨ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である。

【0044】

代替的に、患者から獲得されるＩＬ−２１産生細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）内のＩＬ−２１転写物レベルが、ノーザンブロット解析および定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）によって測定され得る。Ｔｈ１７細胞を単離する方法は、当分野で周知であり、単離は、市販のキット、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのキットを使用することによって行われ得る。幾つかの実施形態では、ＩＬ−２１レベルは、サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによって測定され、フローサイトメトリーにおいて、検出可能部分に結合された抗ＩＬ−２１抗体は、患者からのＩＬ−２１産生細胞内のＩＬ−２１の細胞内レベルを検出するために使用される。ＩＬ−２１はまた、例えば、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル）を使用して、例えば、ＩＬ−２１およびＩＬ−１５の組み合わせに対するＴ細胞の増殖性応答測定することによって、生物検定における活性の観点から測定され得る（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８：６．３０．１−６．３０．８（２００７））。ＩＬ−２１を測定する別の方法は、フローサイトメトリーに基づく分析を使用する、脾臓ＣＤ８（＋）Ｔ細胞内の、Ｓｔａｔ３のＩＬ−２１誘発型チロシンリン酸化に基づく（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。当業者であれば、ＩＬ−２１を測定するための他の好適な手段を容易に理解するであろう。

【0045】

本発明の方法において、患者が上昇した（異常に高い）ＩＬ−２１を有するかどうかを決定するための参照（または指数）値は、同一のもしくは異なる時間に行われる同一の検定を使用して獲得される、対照被検者のＩＬ−２１の値または対照被検者群のＩＬ−２１の平均値である。対照被検者は、正常なまたは健康な被検者であり、この文脈において、それは自己免疫疾患を持たない（自己免疫疾患のいかなる検出可能症状をも持たない）個人を含む、いかなる進行中の既知の炎症性疾患をも持たない個人である。幾つかの実施形態では、対照被検者は、リンパ球減少でない。約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２倍、３倍４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上のＩＬ−２１レベルの上昇が、有意な上昇であると考えられ得る。ある種の統計分析は、試験試料中のＩＬ−２１レベルが、対照レベルから有意に異なるかどうかを決定するために適用され得る。かかる統計分析は、当業者に周知であり、制限なしに、パラメトリック（例えば、両側スチューデントのｔ検定）またはノンパラメトリック（例えば、ウィルコクソン−マン−ホイットニーのＵ検定）検定を含んでもよい。
ＩＬ−２１ＳＮＰ遺伝子型の検出
本発明の幾つかの方法において、患者が、リンパ球減少を有する一方で、上昇したＩＬ−２１を有する傾向があり（すなわち、有するリスクがある、または有する可能性がある）、故に二次性自己免疫疾患を発症するリスクがあるかどうかを予測するために、遺伝子型決定が使用される。「遺伝子型決定」は、生物検定の使用により個人の遺伝子を決定するプロセスに言及する。遺伝子型決定の方法は、当業者に周知であり、制限なしに、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、アレル特異的オリゴ（ＡＳＯ）プローブ、およびＤＮＡマイクロアレイまたはビーズに対するハイブリダイゼーションを含む。遺伝子型決定は部分的であり得、すなわち、個人の遺伝子型の小さな断片のみが決定される。本発明の文脈においては、ある種のＳＮＰのみが、検出される必要がある。ＳＮＰは、ゲノムの対応部分における単一のヌクレオチド−Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧが、種の員の間または個人における対合染色体の間で異なる場合に発生するＤＮＡ配列変異である。既知のヒトＳＮＰは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）でホストされる、パブリックドメインアーカイブＳｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｄｂＳＮＰ）内における、指定リファレンスＳＮＰ（ｒｅｆＳＮＰ ｏｒ ｒｓ）識別番号である。

【0046】

本発明者らは、ｒｓ１３１５１９６１Ａ／Ａ、ｒｓ６８２２８４４Ｇ／Ｇ、およびｒｓ６８４０９７８Ｃ／Ｃの小規模のＳＮＰ遺伝子型が、これらの遺伝子型を有さない個人と比較して、高レベルの血清ＩＬ−２１のに有意に関連することを発見している。したがって、これらのＳＮＰ表現型のうちの１つ以上を有するＭＳ患者は、これらの遺伝子型を有さないＭＳ患者と比較して、リンパ球除去後に、二次性自己免疫を発症する感受性増大を有する。
ＩＬ−２１情報を獲得する時期
ＭＳ患者のＩＬ−２１（ＩＬ−２１レベルまたはＩＬ−２１関連ＳＮＰ遺伝子型）についての情報を獲得することは、患者のための治療および治療後モニタリング計画を選択するのに有用である。ＭＳ治療の前に情報が獲得される場合、患者は、リンパ球除去療法の後に二次性自己免疫疾患を発症する相対リスクについて、通知され得、それに応じて治療決定が下され得る。患者はまた、彼が「リスクがある」と分類される場合、強化された治療後モニタリング、例えば、専門医による、より頻繁でより徹底的な検査の必要性について通知され得る。したがって、ＩＬ−２１情報は、ＭＳ治療におけるリスク管理（医師、薬剤師、および患者による）を改善する。

【0047】

ＭＳ治療の間または後にＩＬ−２１情報を獲得することはまた、二次性自己免疫疾患の発症および治療をモニタリングするのに有用である。以上で言及され、以下でさらに記載されるように、我々は、リンパ球除去療法の後に二次性自己免疫を発症することになるＭＳ患者が、二次性自己免疫を発症しないＭＳ患者と比較して、彼らの血清ＩＬ−２１のはるかに大幅な上昇を有することを発見している。ＭＳ患者の後者の群は、リンパ球除去の後に、僅かに高いのみのＩＬ−２１を産生する。したがって、リンパ球除去療法の後に、ＩＬ−２１を測定することによって、治療の数ヶ月〜数年後まで発生しない可能性のある二次性自己免疫のリスクを予測することができる。
二次性自己免疫の治療
ＭＳ患者において生じる二次性自己免疫疾患は、疾患のタイプに基づいて治療され得る。本発明の幾つかの実施形態では、二次性自己免疫は、有効用量のＩＬ−２１拮抗薬を使用することによって治療され得る。ＩＬ−２１拮抗薬は、ＩＬ−２１活性を阻害する治療剤、例えば、ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒとの間の相互作用を阻害する薬剤であり得る。「有効用量」は、二次性自己免疫疾患の症状が緩和または予防されるような、患者におけるＩＬ−２１活性を阻害するのに十分な阻害剤の量に言及する。ＩＬ−２１拮抗薬は、例えば、ヒトＩＬ−２１もしくはＩＬ−２ＩＲに対するキメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体、あるいは可溶性ＩＬ−２ＩＲタンパク質であり得る。また例えば、米国特許第７，４１０，７８０号および米国特許出願公開第２００８０２４１０９８号を参照されたく、それらの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２１拮抗薬を含有する薬学的組成物は、当業者に既知の方法に従って作製され得る。ＩＬ−２１拮抗薬を含有する薬学的組成物は、当分野で既知の好適な方法、例えば、静脈注射、筋肉注射、または皮下注射を使用して患者に投与され得る。
ＭＳ患者を治療および試験するためのキット
本発明は、多発性硬化症を治療するためのキットを提供する。本発明のキットは、特に、リンパ球除去薬（例えば、アレムツズマブ）と、患者または医療提供者に、この薬物の禁忌、例えば、この薬物での治療後に二次性自己免疫疾患を発症するリスクの上昇についての潜在性を通知するための使用説明書と、を含み得る。リスクの上昇は、（ｉ）上昇したＩＬ−２１、または（ｉｉ）ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１におけるＡ／Ａ、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４におけるＧ／Ｇ、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８におけるＣ／Ｃからなる群から選択される一塩基多型（ＳＮＰ）の１つ以上の遺伝子型の存在に関連し得るか、またはそれによって示され得る。

【0048】

他の実施形態では、本発明は、ＭＳ患者の血清ＩＬ−２１を検出するため、および／またはリンパ球除去の後に二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いＭＳ患者を特定するためのキットを提供する。かかるキットは、抗ＩＬ−２１抗体、またはその抗原結合部分、または可溶性ＩＬ−２１受容体と、任意に、患者から血液試料を採取することを使用者に指示する使用説明書と、任意に、ＭＳ患者からの血液試料中で、本抗体、部分、または可溶性ＩＬ−２１受容体のＩＬ−２１への結合を検出するための１つ以上の試薬と、を含み得る。かかるキットは、ＭＳ患者等の患者に医学的診断を行うために、適切な規制当局によって認証または承認されているだろう。

【0049】

さらに他の実施形態では、本発明は、リンパ球除去の後に、二次性自己免疫疾患を発症するリスクが高いＭＳ患者を特定するためのキットを提供する。キットは、ＭＳ患者から獲得された試料中で、ＳＮＰ ｒｓ１３１５１９６１、ＳＮＰ ｒｓ６８２２８４４、およびＳＮＰ ｒｓ６８４０９７８からなる群から選択される１つ以上のＳＮＰ遺伝子型の存在または非存在を特定するために好適な１つ以上の試薬と、ＭＳ患者から試料を採取することを使用者に指示する使用説明書と、を含み得る。
ＭＳ治療に対するＴ細胞の応答性の評価
本発明は、ＭＳ患者において、リンパ球除去療法での治療に対するＴ細胞の応答性を評価するための方法を提供する。方法は、治療後に患者から獲得されたＴ細胞内のカスパーゼ−３の測定を伴う。治療を受けていないＭＳ患者からのＴ細胞と比較して、上記Ｔ細胞中のカスパーゼ−３の増加（例えば、カスパーゼ−３タンパク質、ＲＮＡの転写、および／または活性レベル）は、治療された患者のＴ細胞がその治療に応答したことを示す。これらの方法は、治療されていないＭＳを持つ個人からのＴ細胞がアポトーシス抵抗性であり、この抵抗性が、カスパーゼ−３の低発現に関連するという我々の発見に基づく。しかし、リンパ球除去療法の後、カスパーゼ−３の発現は、Ｔ細胞内で有意に増加し、健康な個人において見られるレベルに達する。

【0050】

Ｔ細胞内のカスパーゼ−３を測定する技術は、当該技術分野において既知である。例えば、当該技術分野において既知である技術を使用して、Ｔ細胞からの細胞抽出物を獲得することができ、例えば、ＥＬＩＳＡによって、カスパーゼ−３タンパク質レベルを測定することができる。ヒトカスパーゼ−３を測定するための商業的なＥＬＩＳＡキットは、例えば、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、ＥＭＤＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手可能である。代替的に、カスパーゼ−３転写レベルは、Ｔ細胞内で、例えば、ノーザンブロット分析または定量ＰＣＲによって測定することができる。また、カスパーゼ−３は、例えば、そのプロテアーゼ活性を測定することによって、生物学的検定で活性の観点から測定することもできる。カスパーゼ−３の活性を測定するための商業的キットは、例えば、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能である。

【0051】

別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野に精通するものによって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料も、本発明の実践または試験において使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物および他の参照文献は、参照することによりその全体が組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含み、本明細書が優先される。本明細書に多くの文献が引用されるが、この引用は、これらの文献のうちのいずれかが、当該技術分野における一般常識の一部を形成するという承認を構成するものではない。本明細書および実施形態を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載される整数または整数の群の包含を意味するが、いずれの他の整数または整数の群の除外も意味するものではないことが理解されるであろう。材料、方法、および実施例は、例示であるに過ぎず、限定的であることは意図されていない。

【0052】

以下の実施例は、本発明の方法および材料を例示することが意図される。当業者には明白である、当該技術分野において通常遭遇する記載された条件およびパラメータの好適な修正および適合は、本発明の精神および範囲内である。
実施例
以下の実施例では、全ての患者が再発寛解型多発性硬化症を有し、アレムツズマブが５日間、１２〜２４ｍｇ／日の静脈内注入によって与えられ、その後１２ヶ月で再治療された、ＣＡＭＭＳ−２２３およびＣＡＭＭＳ−２２４（ＲＥＣ ０２／３１５および０３／０７８）の２つの臨床治験のうちの１つの参加者であった。患者および対照は、リサーチ目的（ＬＲＥＣ ０２／２６３）の静脈切開に同意し、全て、血液採取の時点で少なくとも１ヶ月間、ステロイド類を含む他の疾患修飾薬に曝露されていなかった。

【0053】

リンパ球増殖およびアポトーシスのデータは、６５人の患者および２１人の健康な対照（男性７人、平均年齢３４歳）からの新鮮なエクスビボ細胞の横断的研究によって生成された。これは、二次性自己免疫の病理発生におけるＴ細胞周期についての仮説を生み、Ｔ細胞アポトーシスを確実に分析し得る最も早い時点として選択された、アレムツズマブ治療の９ヶ月後に入手可能な試料について試験した。この時点で入手可能な２９個の試料のうち、自己免疫なしの１０個（男性３人、平均年齢３８歳）と比較して、１０個が自己免疫の我々の研究定義に合った（男性１人、平均年齢３６歳）。自己免疫とは、臨床疾患を伴わない、新規自己免疫疾患の発症（自己抗体の有無にかかわらず）、または自己抗体の持続適な有意な力価（少なくとも３ヶ月離れた少なくとも２回の機会に存在した）として定義された。「自己免疫なし」とは、本研究において、アレムツズマブ後少なくとも１８ヶ月間の、自己免疫疾患および自己抗体の非存在として定義された。自己免疫を有する１０人の患者のうち、３人が自己抗体のみ（抗核抗体）を有した。次に、血清ＩＬ−２１を、自己免疫を持つ１５人の無作為に選択された患者（そのうち５人が上記の通り研究された）（男性３人、平均年齢３４歳；１２人が甲状腺自己免疫を持ち、１人がグッドパスチャー病を持ち、１人がＩＴＰを持ち、１人が抗核抗体のみを持った）、ならびに自己免疫を持たない１５人の無作為に選択された患者（そのうち６人が上記の通り研究された）、（男性５人、平均年齢３１歳）、ならびに１９人の健康な対照（男性７人、平均年齢３３歳）において順次測定した。

【0054】

７３人の被験者を、遺伝子分析について研究した。これらのうち、２３人が「自己免疫なし」の定義にあい、２７人が、アレムツズマブ後に二次性自己免疫を有した（６人が自己抗体のみを持ち（４人が抗核抗体を持ち、２人が抗平滑筋抗体を持つ）；１８人が甲状腺自己免疫を持ち、２人がＩＴＰを持ち、１人がグッドパスチャー病を持った）。２３人の残りの被験者は、一過性の自己抗体産生、および／またはアレムツズマブでの治療からの時間が不十分であることに基づき、分類することができなかった。

【0055】

以下の実施例に記載される全ての統計分析について、データは、ＷｉｎｄｏｗｓのＳＰＳＳ １２．０．１を使用して分析した。正常性の評価後、パラメトリック（スチューデントのｔ検定）またはノンパラメトリック（ウィルコクソン−マン−ホイットニー）検定を行った。本文を通じてＰ値が記載されるが、ｐ＜０．０５の値が統計的に有意であると見なされ、示されている場合、ボンフェローニ補正で修正した。

【0056】

実施例１：アレムツズマブはＴ細胞のリンパ球減少を誘発する
アレムツズマブ単回投与により、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球が、１ヶ月目にベースライン値のそれぞれ５．６％および６．８％に、そして１２ヶ月目にそれぞれ３０．３％および４０．８％（データ示さず）に減少された。

【0057】

実施例２：治療されていない多発性硬化症を持つ患者からのＴ細胞は細胞死に抵抗性である
本実施例で行われる種々の検定には、入手可能性に従って、異なる長期横断的試料を使用した。測定するアレムツズマブ後のリンパ球細胞周期を測定する前置きとして、多発性硬化症を持つ治療されていない患者と正常な対照（図１Ａおよび１Ｂ）との間で、刺激されていないか、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）もしくは甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨｒ）で培養中の、Ｔ細胞の増殖応答について調査した。
Ａ．末梢単核細胞培養物
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）での遠心分離によって、ヘパリン添加血液から単離した。全ＰＢＭＣを、直ちに１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｓ５３９４）を含有する培養培地（ＲＰＭＩ）中に懸濁させ、１０^６／ｍＬの生存細胞の濃度に調製した（トリパンブルー排除によって測定）。受動的細胞死を誘発するために、ＰＢＭＣを、増殖因子を付加することなく、培地のみの中で、７２時間インキュベートした。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３ ｍＡｂプレコートプレート（１μｇ／ｍＬ−ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中、可溶性抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ：ご好意によりＭ．Ｆｒｅｗｉｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ）により供与）とともに４８時間培養し、その後、活性化抗ヒトＦａｓ（クローンＣＨｌ １、１μｇ／ｍＬ−Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）とともに１８時間インキュベーションして、Ｆａｓ媒介アポトーシスが誘発された。
Ｂ．アポトーシスの検出
アポトーシスＴ細胞は、ＣＤ３（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ４６３ＡＰＣ）、ＣＤ４（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ１２６７ＡＰＣ）、およびＣＤ８（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ１２２６ＡＰＣ）に対してアロフィコシアニン共役マウス抗ヒトモノクローナル抗体、ＦＩＴＣ共役アネキシン−Ｖ、およびＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で細胞を染色することによって検出した。蛍光性は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって検出した。前方および側方散乱に基づき、生存およびアポトーシスリンパ球（減少したＦＳｃおよび増加したＳＳｃを有する）を含むように広いリンパ球ゲートが引き出された。そのゲート内で少なくとも１５，０００の事象を収集し、ＷｉｎＭＤＩ ２．８ソフトウェアを使用して分析した。早期アポトーシス細胞は、アネキシンＶ^＋ＰＩ⁻として、および後期アポトーシス細胞もしくは壊死細胞は、アネキシンＶ^＋ＰＩ^＋として定義した（Ａｕｂｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３７、１９７−２０４（１９９９））。アポトーシス細胞死は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ ＯＰＨ００１）での汎カスパーゼ阻害によって遮断される総細胞死（アネキシンＶ^＋ＰＩ⁻＋アネキシンＶ^＋ＰＩ^＋）として定義した。
Ｃ．増殖検定
ＰＢＭＣに細胞分裂追跡用色素、ＣＦＳＥ
（カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル）（Ｌｙｏｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６３，３７５−３９８（２００１））を負荷し、５０μｇ／ｍＬのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ：ＲＤＩ−ＴＲＫ８Ｍ７９／ＬＹＯ）、またはマトリックス結合タンパク質に結合させた１μｇ／ｍＬの甲状腺刺激ホルモン受容体細胞外ドメイン（ＴＳＨｒ：ご好意によりＭ．Ｌｕｄｇａｔｅ（Ｃａｒｄｉｆｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により供与）とともに培養した。細胞中での１０日間のＣＦＳＥ染色後、特異的表面マーカー（ＣＤ４、ＣＤ８）で特定し、フローサイトメトリーによって分析した。前駆体頻度（親集団を離れ、少なくとも２回の細胞分裂を受けたリンパ球の割合として定義される）、および増殖指数（算定された親細胞の数で割った全ての生成における細胞の合計として定義される）を、Ｍｏｄｆｉｔ ＬＴ ３．０（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して計算した。生存細胞の絶対数は、培養物中に含まれた個定数の不活性ビーズ（ＢＤＣＡＬＩＢＲＩＴＥ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との比較によって測定した。
Ｄ．結果
多発性硬化症を持つ治療されていない患者と正常な対照（図１Ａおよび１Ｂ）との間で、刺激されていないか、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）もしくは甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨｒ）での培養物中のＴ細胞の増殖応答には、差異がなかった。逆に、多発性硬化症を持つ治療されていない患者からのＴ細胞の生存は、対照のものよりも≧４倍高く（ｐ＜０．００５、図１Ｃ）、Ｔ細胞死の減少が、治療されていない多発性硬化症の特徴であることを示唆している。これは、治療されていない患者からのＴ細胞が、健康な対照と比較して、受動的およびＦａｓ媒介性の両方のアポトーシスに抵抗性であることを実証することによって、確認された（受動的：０．３％対６．７％、ｐ＝０．００１６、およびＦａｓ媒介：２．９％対１５．５％、ｐ＝０．００１８、図１Ｅおよび１Ｆ）。

【0058】

実施例３：アレムツズマブ後に再生するＴ細胞は高度に増殖性であり、自己反応性に偏り、アポトーシスを受けやすい
実施例２に記載した検定を使用して、アレムツズマブ後、自己抗原に応答するＴ細胞の割合（前駆体頻度）および増殖の程度（増殖指数）が、治療されていない患者および健康な対照と比較して有意に増加したことが見出された。例えば、３ヶ月時点には、刺激されていないＴ細胞の増殖は、治療されていない患者のものの＞６．５倍であり、ＭＢＰおよびＴＳＨｒ刺激に応答した増殖は、それぞれ９００％および７００％増加した（全てｐ＜０．０１：図１Ａおよび１Ｂ）。Ｔ細胞のアポトーシスも、アレムツズマブ後有意に増加した。抗原刺激に応答して、６ヶ月時点でアポトーシスを受けたＴ細胞の割合は、ベースラインより１０倍大きく（図１Ｄ、全ての抗原についてｐ＜０．００１）、培養の最後により少ない生存Ｔ細胞をもたらした（図１Ｃ）。受動的およびＦａｓ媒介アポトーシスもまた、アレムツズマブ後、健康な対照群で観察されたものの少なくとも２倍の比率で増加した（受動的：対照の６．７％と比較して、６、９、および１２ヶ月時点で、それぞれ２４．５％、２２．２％、および１７．９％、全てｐ＜０．００１；Ｆａｓ媒介：対照の１５．５％と比較して、６、９、および１２ヶ月時点で、それぞれ３７．８％、３５．８％、および２９．９％、全てｐ＜０．０１；図１Ｅおよび１Ｆ）。アレムツズマブ後のリンパ球アポトーシスの増加は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋亜集団の両方で見られ（図ＩＧおよびＩＨ）、アレムツズマブ治療後少なくとも１８ヶ月持続した（データ示さず）。

【0059】

実施例４：多発性硬化症を持つ治療されていない患者からのＴ細胞および低発現カスパーゼ３
Ａ．ｍＲＮＡ分析
ＰＢＭＣを、エクスビボ直後、またはＭＢＰもしくはポリクローナル刺激での培養後、ＭＡＣＳ（登録商標）ＬＳ Ｃｏｌｕｍｎに装填された１ｘ１０^７個の細胞につき、２０μＬの磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；ＣＤ１９ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ、ＣＤ３ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ、ＣＤ１４ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ）を使用して、陽に分離した。時期的に保持された細胞を溶出し、洗浄し、ＲＮＡｌａｔｅr (商標）中−７０℃で保管した（細胞純度は一貫して９５〜９８％、データ示さず）．
Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂａｄ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、サバイビン、ｃ−ＦＬＩＰ、およびカスパーゼ３、８、および９の発現は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＲＮＥＡＳＹ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）中に保管された細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＰＲＯ−ＳＴＡＲ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲプライマーおよびプローブは、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して設計し、Ｏｓｗｅｌ ＤＮＡサービスから購入した。ｍＲＮＡ配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから獲得された。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＲＯＸを含有するＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ＲＴ−ＱＰ２Ｘ−０３）を使用して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で行った。プライマーおよびプローブ配列は：Ｂｃｌ−２順方向：５’−ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＧＴＡ ＣＣＴ ＧＡＡ−３’（配列番号１）、逆方向５’−ＣＡＣ ＣＴＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＧＴ ＴＡ−３’（配列番号２）、ＪＯＥ標識プローブ５’−ＣＧＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＡＴＣ−３’（配列番号３）；ＢｃＩ−Ｘｌ順方向５’−ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＧＧ ＡＡＡ ＴＧＡ ＣＣＡ ＧＡＣ Ａ−３’（配列番号４）、逆方向５’−ＧＡＧ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＧＡ−３’（配列番号５）、ＦＡＭ標識プローブ５’−ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＣＴＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＣＡＣ ＣＣ−３’（配列番号６）；Ｆａｓ順方向５’−ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＴＡ ＴＴ−３’（配列番号７）、逆方向５’−ＧＧＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＧＡＴ ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＡＡ−３’（配列番号８）、ＪＯＥ標識プローブ５’−ＣＴＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＡＴＴ−３’（配列番号９）；ＦａｓＬ順方向５’−ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ Ｇ−３’（配列番号１０）、逆方向５’−ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＴＡ ＧＧＴ−３’（配列番号１１）、ＦＡＭ標識プローブ５’−ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＴＣ ＣＡＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧ−３’（配列番号１２）；サバイビン順方向５’−ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＴ−３’（配列番号１３）、逆方向５’−ＣＴＣ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＴＴ−３’（配列番号１４）、ＦＡＭ標識プローブ５’−ＴＣＡ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＣＡ ＴＣＴ ＣＴＡ ＣＡＴ Ｔ−３’（配列番号１５）；ｃ−ＦＬＩＰ順方向５’−ＧＴＧ ＧＡＧ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＣＴＣ−３’（配列番号１６）、逆方向５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＡＴＣ ＡＧＡ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＡＡ ＡＴＣ Ｃ−３’（配列番号１７）、ＦＡＭ標識プローブ５’−ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＣＣＧ ＡＡＡ ＣＡＡ−３’（配列番号１８）；カスパーゼ８順方向５’−ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＴＴ−３’（配列番号１９）、逆方向５’−ＡＣＣ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＣＴＴ ＣＴ−３’（配列番号２０）、ＪＯＥ標識プローブ５’−ＣＴＣ ＣＣＴ ＡＣＡ ＧＧＧ ＴＣＡ ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＴＣ ＡＧＡ ＴＴＴ ＣＡＧ−３’（配列番号２１）；カスパーゼ３順方向５’−ＡＡＧ ＡＴＣ ＡＴＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＡＡ ＴＣＡ−３’（配列番号２２）、逆方向５’−ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＧＴＧ ＣＴＴ ＴＴＡ−３’（配列番号２３）、ＦＡＭ標識プローブ５’−ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＡＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＴＴ ＡＴＡ ＡＡ−３’（配列番号２４）；カスパーゼ９順方向５’−ＴＧＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＧ ＣＡ−３’（配列番号２５）、逆方向５’−ＧＡＡ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＴＧＣ ＧＡＡ ＴＣＴ Ｃ−３’（配列番号２６）、ＦＡＭ標識プローブ５’−ＣＡＡ ＡＧＴ ＴＧＴ ＣＧＡ ＡＧＣ ＣＡＡ ＣＣＣ ＴＡＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＴＡ−３’（配列番号２７）；Ｂａｄ順方向５’ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ＡＴＣ ３’（配列番号２８）、逆方向５’−ＡＣＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＧＣＡ ＴＡＧ−３’（配列番号２９）、ＪＯＥ標識プローブ５’−ＡＣＴ ＣＣＡ ＣＣＣ ＧＴＴ ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＣＣ Ｃ−３’（配列番号３０）；Ｂａｘ順方向５’−ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＣＧ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＣＴ−３’（配列番号３１）、逆方向５’−ＧＧＴ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＧＣ ＣＴＴ ＧＡＧ−３’（配列番号３２）、ＪＯＥ標識プローブ５’−ＴＧＴ ＣＧＣ ＣＣＴ ＴＴＴ ＣＴＡ ＣＴＴ ＴＧＣ ＣＡＧ ＣＡ−３’（配列番号３３）；Ｂｉｄ順方向５’−ＧＣＴ ＧＴＡ ＴＡＧ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＡＧ−３’（配列番号３４）、逆方向５’−ＧＣＴ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＴＣ ＴＴＣ ＴＣＴ−３’（配列番号３５）、ＪＯＥ標識プローブ５’−ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＡＣＡ ＧＣＧ ＴＴＣ−３’（配列番号３６）、およびＢｉｍ順方向５’−ＡＣＣ ＡＣＡ ＡＧＧ ＡＴＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＧＡＴ ＡＣＣ−３’（配列番号３７）、逆方向５’−ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ−３’（配列番号３８）、ＦＡＭ標識プローブ５’−ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴ−３’（配列番号３９）であった。
Ｂ．結果
治療されていない多発性硬化症患者からの、両方のアポトーシス経路に共通する実行型カスパーゼである、カスパーゼ３のＴ細胞のｍＲＮＡ発現が、対照と比較して減少し、これは、刺激されていないＰＢＭＣおよびＭＢＰ刺激ＰＢＭＣでは有意であったが（多重比較の補正後、それぞれ７８％および８７％、ともにｐ＜０．０５）、ポリクローナル刺激培養物については有意ではなかった（図２Ａ）。ＣＤ１４＋細胞において同様の傾向が見られたが（しかしＣＤ１９＋細胞では見られなかった）、この差異は多重比較の補正後は存続しなかった（図２Ｂ）。アレムツズマブ後、カスパーゼ３の発現は、増加するＴ細胞および単球内で有意に増加し、健康な対照に見られるレベルに達した（ｐ＜０．０５、図２Ａおよび２Ｂ）。試験した他の全ての遺伝子の発現（方法に列挙）は、アレムツズマブ後変化しなかった。

【0060】

したがって、本研究は、治療されていない多発性硬化症を持つ個人からのＴ細胞が、アポトーシスに抵抗性であり、この抵抗が、カスパーゼ３の低発現に関連することを示している。外因性および内因性のアポトーシス経路の収束点でのこの実行型カスパーゼの位置と一致して、我々の患者における、Ｆａｓ媒介および受動的の両方のアポトーシスに対するＴ細胞の抵抗性が実証された。カスパーゼ３の低発現は、Ｉ型糖尿病（Ｖｅｎｄｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １５２、１１９−１２５（２００５））、橋本甲状腺炎、および多腺性自己免疫症候群２型（Ｖｅｎｄｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂｊｃ（２００６））を含む、幾つかの自己免疫疾患において記載されている。しかしながら、これは、多発性硬化症においては新たな知見である。
実施例５：アレムツズマブ後の二次性自己免疫は過剰なＴ細胞アポトーシスに関連する
リンパ球増殖およびアポトーシスの増加を治療に対する一般的応答として実証後、アレムツズマブ後、少なくとも３ヶ月を超えて持続する、新規自己免疫疾患の発症および／または正常な範囲を超える持続性の自己抗体として定義される、アレムツズマブ後のＴ細胞アポトーシスと自己免疫の発症との間の関係を試験した。この定義を用いて、自己免疫を持つ患者（ｎ＝１０）に由来するＴ細胞は、同じ時点に研究された非自己免疫患者（ｎ＝１０）からのＴ細胞と比較すると、治療後９ヶ月で、全ての培養条件で、有意により高いレベルのアポトーシス細胞死を示した（刺激されていない４．７％対１４．４％、Ｆａｓ媒介１８．２％対３２．１％、ＭＢＰ ７．６％対１７．６％、およびＴＳＨｒ ９．５％対２５．５％、全ての比較についてｐ＜０．０１；図３）。非病原性の抗体産生を除外した自己免疫疾患の発症という、自己免疫のより厳しい定義を適用した場合、自己免疫群の数を７に低減したにもかかわらず、差異が残った（刺激されていない、４．７％対１５．４％；Ｆａｓ媒介、１８．２％対３１．７％；ＭＢＰ、７．６％対２０．２％；ＴＳＨｒ、９．５％対１３．４％；全ての比較についてＰ＜０．０２）。

【0061】

２つの群間で、Ｔ細胞再構成の比率における差異はなく（例えば、自己免疫を持つものおよび持たないものにおいて、それぞれ、６ヶ月で、ＣＤ４数が０．１５×１０^９／Ｌ対０．１９×１０^９／Ｌ、またＣＤ８数が０．１１×１０^９／Ｌ対０．１１×１０^９／Ｌ）、自己免疫群のＴ細胞周期の増加を示唆している（データ示さず）。

【0062】

実施例６：ＩＬ−２１はＴ細胞増殖およびアポトーシスを誘発する
Ａ．ＩＬ−２１検定およびスパイク
血清ＩＬ−２１を、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥキット（８８−７２１６−８６）を使用して使用説明書の通り測定した。プレートを、マイクロプレートリーダー（モデル６８０、ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍで読み取った。刺激されていないＰＢＭＣおよびポリクローナル刺激ＰＢＭＣ（１μｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３および１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８）を、５ｐｇ／ｍＬおよび２０ｐｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−２１（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ １４−８２１９）でスパイクした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のアポトーシスおよび増殖を、上述の通り評価した。
Ｂ．結果
ヒトＴ細胞のアポトーシスおよび増殖に対する外因性ＩＬ−２１の影響をインビトロで試験した。健康な対照からのＰＢＭＣをｒｈＩＬ−２１でスパイクすることにより、刺激されていないおよびポリクローナル刺激のＣＤ４＋（図４Ａ）およびＣＤ８＋（図４Ｂ）Ｔ細胞のアポトーシス死における、用量依存的な増加がもたらされた（全ての条件についてｐ＜０．０５）。刺激されていない細胞をｒｈＩＬ−２１でスパイクすることにより、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞において、小さいが有意な増殖がもたらされ、増殖指数（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋：それぞれ１．０７対１．２５、ｐ＝０．０１７；および１．０９対１．３２、ｐ＝０．０１７、図５Ａ）、および前駆体頻度（ＣＤ４＋ ０．００７対０．０１４、ｐ＝０．０１６；ＣＤ８＋ ０．００７対０．０１５、ｐ＝０．０２６、図５Ｃ）の両方が増加した。ＩＬ−２１は、ポリクローナル刺激に応答して増殖するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に影響を及ぼさず（図５Ｄ）、それらがすでに最大限に刺激されていたことを示唆している。しかしながら、ＩＬ−２１は、ＣＤ８＋の細胞増殖の程度において有意な増加をもたらした（増殖指数１１．５９対１９．３９、ｐ＝０．０１２、図５Ｂ）。

【0063】

実施例７：ＩＬ−２１はアレムツズマブ後の二次性自己免疫の発症を予測する
実施例６の全ての時点において、血清ＩＬ−２１の濃度は、非自己免疫群と比較して二次性自己免疫を発症した患者において有意に高かった（全ての比較についてｐ＜０．０５、図６Ａ）。その後にアレムツズマブ摂取に進んだ８４人の患者からの、全ての治療前血清試料について調査した。これらの患者との少なくとも２年の経過観察後、彼らを「自己免疫」群（ｎ＝３５：３２人の患者が甲状腺疾患、１人がＩＴＰ、１人がグッドパスチャー病、そして１人が脱毛症を持つ）、または「非自己免疫」群（ｎ＝４９：一過性（６ヶ月を超えて持続しない）のみの自己抗体を持つか、または自己抗体を持たない患者）として分類した。これらの治療前血清は、対照よりも有意に高いＩＬ−２１の平均濃度を有したが、これは、完全に、二次性自己免疫の発症に進んだ患者の高ＩＬ−２１レベルによって説明された。自己免疫の発症に進んだもの（４６４ｐｇ／ｍＬ）と進まなかったもの（２２９ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０００２）との間には、高度に有意な差異があった（図６Ｂ）。

【0064】

誘発されたリンパ球減少と自己免疫との間の関連が、動物モデルにおいて観察されている。リンパ球減少条件下では、残りのＴ細胞は、免疫系を再構成するために、広範な代償性増殖を経る。このプロセスは、恒常性増殖と称され、ＴＣＲ自己ペプチドＭＨＣ複合体を介した刺激に依存し（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． １０１，３０４１−３０４６（２００４）、Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ９８，１７２８−１７３３（２００１）、Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １９７，１００７−１０１６（２００３））、本研究において見られるような自己抗原の認識の増加に偏る集団をもたらす。加えて、迅速に増殖するＴ細胞は、同時刺激への依存の減少、未処置細胞よりも低用量の抗原に応答する能力、および再刺激時の炎症性サイトカインの迅速な分泌を含む、メモリー細胞の表現型および機能的特徴を獲得し、したがって、自己寛容の破綻をさらに促進する（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，５４９−５５６（２０００）、Ｇｏｌｄｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，５５７−５６４（２０００）、Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５，１７３３−１７３７（２０００）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．１０，８７−９２（２００４））。しかしながら、これらの変化にもかかわらず、自己免疫は、リンパ球減少の必然的な結果ではない。実際、我々の患者の場合のように、ほとんどのリンパ球減少被験者は自己免疫を発症せず、さらなる「補助因子」が必要であることを示唆している。

【0065】

我々は、本研究において始めてヒトにおいて、ＩＬ−２１の過剰産生が、アレムツズマブ等のリンパ球除去薬剤を用いた、そうでなければ成功であった多発性硬化症の治療後の、二次性自己免疫の発症に必要とされる「第２の打撃」であることを実証した。本研究は、自己免疫が、リンパ球除去患者に生じ、治療の前でさえも検出可能である遺伝的に影響されるより高いレベルのＩＬ−２１によって駆り立てられる、より多くのＴ細胞のアポトーシスおよび細胞周期を伴うことを示している。治療前でも、二次性自己免疫の発症に進んだ患者は、非自己免疫群より２倍を超えて高いレベルの血清ＩＬ−２１を有し、血清ＩＬ−２１が、アレムツズマブ治療の数ヶ月〜数年後に自己免疫を発症するリスクに対する生物マーカーとしての役割を果たし得ることを示唆している。いずれの理論にも拘束されることを望むものではないが、我々は、Ｔ細胞の増殖および細胞死の周期を過度に駆り立てることにより、ＩＬ−２１が、自己反応性Ｔ細胞を生成する確立、および故に、自己免疫を増加すると考える。したがって、サイトカインによって誘発される異常なＴ細胞周期は、リンパ球減少に関連する自己免疫の一般原則である。

【0066】

実施例８：ＩＬ−２１遺伝子型はＩＬ−２１発現に影響を及ぼし、自己免疫に関係する
Ａ．ＩＬ−２１の遺伝子型の決定
染色体４ｑ２７上の４つの遺伝子、ＫＩＡＡ１１０９−ＡＤＡＤ１−ＩＬ２−ＩＬ２１を含有する強い連鎖不均衡の領域にある、合計で、４つのＳＮＰ、ｒｓ１３１５１９６１、ｒｓ６８２２８４４、ｒｓ４８３３８３７、およびｒｓ６８４０９７８を試験した。４つの全てのＳＮＰは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（ＡｏＤ）産物として入手可能であった。ＳＮＰの遺伝子型の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ手順を使用して、製造業者の推奨する条件に従って行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの３８４ウェル９７００ Ｖｉｐｅｒ ＰＣＲ機で行い、その後遺伝子型を、ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１を使用して、７９００ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）上で求めた。各個人の遺伝子型を二重に決定した。多発性硬化症に関連する遺伝因子：ＨＬＡ−ＤＲＢｌ ＊１５０１、ｒｓ２１０４２８６（ＩＬ２ＲＡ）、およびｒｓ６８９７９３２（ＩＬ７Ｒ）について、全ての個人の遺伝子型をさらに決定した。
Ｂ．結果
遺伝的変異とＩＬ−２１産生との間に関連があるかどうかを決定するために、ＩＬ−２１遺伝子をコードする染色体４ｑ２７上の連鎖不均衡（ＬＤ）のブロック内にある４つの一塩基多型（ＳＮＰ）について、７３人の被験者の遺伝子型を決定し、彼らのアレムツズマブ前血清ＩＬ−２１濃度を測定した。４つの全てのＳＮＰについての軽微な対立遺伝子頻度は、公開されているデータと一致していた：ｒｓ１３１５１９６１Ｇ（１４．５％）、ｒｓ６８２２８４４Ｔ（１４．６％）、ｒｓ４８３３８３７Ｇ（３８．０％）、およびｒｓ６８４０９７８Ｔ（１８．１％）（Ｇｌａｓ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０４，１７３７−１７４４（２００９））。４つのＳＮＰのうちの３つ（ｒｓ１３１５１９６１ Ａ／Ａ、ｒｓ６８２２８４４ Ｇ／Ｇ、およびｒｓ６８４０９７８ Ｃ／Ｃ）における遺伝子型が、有意に高いレベルの血清ＩＬ−２１（ｐ値：それぞれ０．００７６、０．００９８、および０．００６７）に関連することが見出された。ｒｓ４８３３８３７における遺伝子型は、ＩＬ−２１産生に影響を及ぼさなかった。ｒｓ４８３３８３７と他の３つのＳＮＰとの間のＬＤは低く（ｒ^２＜０．１５）、したがって、ハプロタイプｒｓ１３１５１９６１（Ａ）−ｒｓ６８２２８４４（Ｇ）−ｒｓ６８４０９７８（Ｃ）上のＳＮＰが、ＩＬ−２１産生の増加に関連している可能性が最も高い。ＨＬＡ−ＤＲＢｌ ＊１５０１、ｒｓ２１０４２８６（ＩＬ２ＲＡ）、およびｒｓ６８９７９３２（ＩＬ７Ｒ）についての遺伝子型頻度は、他の多発性硬化症を持つ任意抽出患者について公開されているデータと相違しなかった（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＭＳＧＣ），Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．７，５６７−５６９（２００８）、Ｙｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６１，２２８−２３６（２００７））。

【0067】

最後に、遺伝子型が、アレムツズマブ後の自己免疫に対する易罹患性に影響を及ぼすかどうかを扱うために、できるだけ多くの患者を、アレムツズマブ後に自己免疫を発症したもの（２７人の被験者）と、疑いなく発症しなかったもの（２３人の被験者）に分類した。２３人の患者は、一過性の自己抗体産生および／またはアレムツズマブに曝露後の時間が不十分であることから、分類できなかった。また、より高い血清ＩＬ−２１濃度に関連することが示された遺伝子型（ｒｓ１３１５１９６１ Ａ／Ａ、ｒｓ６８２２８４４ Ｇ／Ｇ、ｒｓ６８４０９７８ Ｃ／Ｃ）が、アレムツズマブ後の自己免疫に関連することも見出された。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]