特許 5860983 レウコユム球根の抽出物及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5860983

(24)【登録日】2015年12月25日

(45)【発行日】2016年2月16日

(54)【発明の名称】レウコユム球根の抽出物及びその利用

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/18 20060101AFI20160202BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160202BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20160202BHJP

   A61K 8/97 20060101ALI20160202BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20160202BHJP

   A61K 125/00 20060101ALN20160202BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/18

   A61P17/00

   A61P21/02

   A61K8/97

   A61Q19/00

   A61K125:00

【請求項の数】16

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2015-13405(P2015-13405)

(22)【出願日】2015年1月27日

(62)【分割の表示】特願2011-526632(P2011-526632)の分割

【原出願日】2009年9月13日

(65)【公開番号】特開2015-108004(P2015-108004A)

(43)【公開日】2015年6月11日

【審査請求日】2015年2月16日

(31)【優先権主張番号】61/095,954

(32)【優先日】2008年9月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511064775

【氏名又は名称】アイ．ビー．アール． イスラエリ バイオテクノロジー リサーチ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(72)【発明者】

【氏名】ソダン，エチエンヌ

(72)【発明者】

【氏名】フィッシュベイン マノア，ダニ

(72)【発明者】

【氏名】アリルイコ，アレックス

(72)【発明者】

【氏名】ヴォン オッペン−ベザレル，リー

(72)【発明者】

【氏名】ペリー，イノン

【審査官】 鳥居 福代

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０１６０７０２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０００−５１３７３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第６１５９４７６（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ８／００−８／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の皮膚および／あるいは皮下の筋細胞における筋収縮の抑制に使用するための、レウコユム・アエスティバム球根の水性抽出物を含む組成物。

【請求項2】

前記水性抽出物を筋収縮の抑制に有効である量で含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

対象において筋収縮が皮膚のしわ、皮膚の細かい線および皮膚の大きなしわのうちの少なくとも１つの形成に関与する領域において使用するための、請求項２に記載の組成物であって、それにより皮膚のしわ、皮膚の細かい線および皮膚の大きなしわのうちの少なくとも１つを改善、低減および／または除外する、組成物。

【請求項4】

前記抽出物が、前記球根の休眠状態とは無関係に得られる、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記量が、酸化損傷から皮膚を保護するのに更に効果がある、請求項２に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物が、前記皮膚上への局所的投与のために配合される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記組成物が、皮下送達、皮内送達又は経皮送達を介した投与のために配合される、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記抽出物の量が、前記抽出物が液体状である場合、前記組成物の全量に基づいて０．０１％〜９９．９％（重量／重量）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

前記抽出物の量が０．０１％〜３０％（重量／重量）である、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記抽出物の量が、前記抽出物が乾燥形態である場合、前記組成物の全量に基づいて０．０００１％〜０．９９％（重量／重量）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項11】

前記抽出物の量が０．０００１％〜０．３％（重量／重量）である、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記組成物が、美容面で効果のある希釈剤又は担体を更に含む化粧料組成物である、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

対象において筋収縮が皮膚のしわ、皮膚の細かい線および皮膚の大きなしわのうちの少なくとも１つの形成に関与する領域において、対象の皮膚および／あるいは皮下の筋細胞における筋収縮の抑制に使用するための、レウコユム・アエスティバム球根の水性抽出物を筋収縮の抑制に有効である量で含む組成物であって、
それにより皮膚のしわ、皮膚の細かい線および皮膚の大きなしわのうちの少なくとも１つを改善、低減および／または除外し、
前記水性抽出物が、レウコユム・アエスティバム球根から、前記レウコユム・アエスティバム球根の休眠状態とは無関係に得られる、組成物。

【請求項14】

筋細胞の収縮作用の抑制に使用するための、休眠状態ではないレウコユム球根の水性抽出物。

【請求項15】

酸化損傷からの皮膚の保護に使用するための、請求項１４に記載の抽出物。

【請求項16】

前記レウコユムが、レウコユム・アエスティバムである、請求項１４または１５に記載の抽出物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レウコユムの抽出物に関し、特に、筋細胞及び組織の収縮を抑制するのに、且つ、抗酸化剤として効果があるレウコユム球根の水性抽出物、上記のものを含む組成物、及び、筋弛緩剤としての、特に、皮膚のしわ、細かい線及び酸化損傷を治療及び防止するのに効果のある皮筋の弛緩剤としての、前記抽出物の利用に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、表皮と真皮から構成される。これらの層の下には、通常は皮膚層として分類されない皮下組織がある。皮下組織は、その上、通常、皮下の脂肪層又は皮下の組織と呼ばれている。最外の表皮は、下層の基底膜を有する階層化された扁平表皮から成る。その表皮は、血管を含んでおらず、真皮からの拡散により栄養を与えられる。表皮は、角化形成細胞から主に構成され、メラニン形成細胞とランゲルハンス細胞も存在する。この皮膚層は、身体と外部環境との間の障壁として機能し、身体内に水を保ち、有害な化学物質と病原体の浸透を妨げる。

【0003】

真皮は、表皮の下にあり、血管、神経、複数の毛嚢、平滑筋、腺及びリンパ組織を含む複数の構造を含む。真皮（又は真皮）は、通常、３〜５ｍｍの厚さであり、ヒト皮膚の主要な構成要素である。真皮は、結合組織網、主に、支台を与えるコラーゲン原繊維及び柔軟性を与える柔軟性組織から構成される。真皮を含む主要な細胞の種類は、繊維芽細胞、脂肪細胞（脂肪蓄積）及び貧食細胞である。皮下組織は、真皮の下にある。その目的は、下層にある骨及び筋肉に皮膚を貼り付け、血管と神経を皮膚に与えることである。皮下組織は、緩い結合組織とエラスチンから成る。皮下組織は、繊維芽細胞、貧食細胞及び脂肪細胞から構成され、脂肪細胞は、主に、皮下組織の脂質蓄積機能の役割をする。脂質は、充填材の役割をし、身体を外部環境から隔離する役割をする。

【0004】

顔の老化は、いくつかの要因の結果のために起こり、それらの要因の中には、皮膚内の先天的な変化、重力の影響、動的な線が形成される顔面筋の活動、柔軟組織の損失又は変化、骨量減少、組織の弾性の損失、及び、苛酷な環境状況、特に、太陽又は紫外線照射及び汚染物質への露出がある。皮膚が老化するのは、表皮が薄くなり始め、真皮との接合部が平坦になるときである。コラーゲンは、ヒトが年を取るにつれて減少し、コラーゲンの束は、皮膚に膨圧を与え、より緩くなり、強度を失う。皮膚は、弾性を失うとき、引っ張りにあまり耐えることができない。重力との組み合わせで、筋肉は、引っ張られ、組織は変化し、皮膚は、しわが出始める。水分の損失と細胞間の結合の破壊によっても、皮膚の障壁機能は減少し、それは、皮膚の空孔寸法を増加させ得る。

【0005】

反応性酸素種（ＲＯＳ）は、病気、老化及び外部的な悪化の結果、体細胞内で、増量で生成される。特に、皮膚は、反応性酸素種により損傷を受けやすく、その望まれない老化した外観に寄与する。従って、抗酸化剤は、スキンケアに一般的に利用されている。

【0006】

ボツリヌス毒素（カリフォルニア州、アーバインのアラガン社の商標ＢＯＴＯＸ（登録商標）よっても知られている）は、現在、しわと細かい線を治療するのに流行しているが、初期には、痙縮を治療するのに利用されていた。この毒素は、神経細胞内の神経伝達を特異的に抑制することにより、特に、アセチルコリンの放出を抑制することにより、筋肉の痙縮の状態に影響を及ぼし、それにより、収縮した筋肉を弛緩させる（例えば、米国特許第６，３９５，２７７号、第６，９３９，８５２号及び第７，３８４，９１８号）。ボツリヌス毒素は、皮下に注入される場合、眉間のしわ（眉の間のしわ）にも影響を及ぼす。しかしながら、ボツリヌス毒素の長期の利用に、及び、この物質を含む製品又は治療に関連する有害な影響の完全な範囲はまだ知られておらず、ある条件下での利用は、死を引き起こすことさえあり得る。ボツリヌス毒素での治療は、一時的な疲労、嚥下障害、首筋の衰弱、嗄声及び局所の痛みを含む複数の副作用に関連していた。その上、ボツリヌス毒素が事前に奏効した多くの患者は、その後、治療に反応しなくなる。

【0007】

キバナオランダセンニチ抽出物の形態でのスピラントールの利用は、皮下の筋肉、とりわけ、顔の筋肉の収縮抑制剤として示唆されてきており、従って、ボツリヌスのような活性を有するが、毒性ではない抗しわ製品として提案されてきた（米国特許出願公開第２００８／００６９９１２号）。

【0008】

「スノーフレーク」としても知られているレウコユム植物は、彼岸花科に属する球根植物である。スノーフレーク属に最近分類された唯一の種は、レウコユム・ヴァーナム（春スノーフレーク）及びレウコユム・アエスティバム（夏スノーフレーク）である。

【0009】

レウコユム・アエスティバムの全植物抽出物は、様々な活性を有する活性成分、ガランタミンを含むことで知られている。レウコユム植物の球根を含む様々な部分の抽出物からのガランタミンの精製方法が開示されている（例えば、米国特許第６，５７３，３７６号及び第６，６１７，４５２号；米国特許出願公開第２００９／０２１６０１２号）。

【0010】

米国特許第６，１１７，４２８号は、反芻動物、例えば、鹿により食べられることから葉を保護するための反芻動物忌避組成物を開示する。前記反芻動物忌避組成物は、レウコユム・アエスティバムを特に含む彼岸花科に見出される化合物を含む。

【0011】

米国特許第６，１５９，４７６号は、栄養補助食品、又は、ガランタミンを含む薬草の組成物、特に、レウコユム・アエスティバムの全植物の抽出物を含む組成物の投与により、アスリートの筋肉の性能を向上させることを開示する。

【0012】

米国特許番号第７，０２９，７０８号は、薬草抽出組成物、特に、薬草抽出物の活性成分がガランタミンである、レウコユム・アエスティバムの薬草抽出物を投与することにより、エストロゲン欠乏に関連する神経変性及び女性の認知障害を改善することを開示する。

【0013】

ガランタミンは、アルツハイマー病（米国特許第５，９５８，９０３号）とパーキンソン病（米国特許第５，９６５，５７１号）とを含む神経系の様々な病気の治療にも利用されている。ガランタミンのこの機能は、アセチルコリンエステラーゼの抑制剤としてのガランタミンの活性が原因であった。

【0014】

本発明の幾人かの発明者は、薬剤が、植物器官内に休眠状態を誘導するか又は休眠状態の器官を維持する能力を有する、植物から誘導される抗増殖剤を以前に開示している。本発明は、抗増殖剤を含む組成物と、植物又は哺乳動物組織内での望まれない又は有害な細胞増殖を抑制するための前記組成物の利用とを更に開示する。とりわけ、休眠状態のレウコユム球根からの抗増殖性抽出物が示された。

【0015】

米国特許出願公開第２００８／０２５４０５５号は、他の多くものの表の中で、スキンケア活性物質として、レウコユム・アエスティバムの抽出物を示すが、この抽出物の活性及び／又は効き目の説明が与えられていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

筋肉の弛緩を高める効果のある自然植物の抽出物は、化粧品産業及び製薬産業で大いに望まれている。特に、老化して天候に曝される皮膚の、しわ及び線のような目に見える徴候を治療し、防止するために、皮膚及び皮下の筋肉の弛緩剤として効果のある毒性のない物質に対する要求がある。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明は、筋細胞、特に、皮膚及び皮下の筋細胞の収縮を抑制するのに効果のある、植物由来の抽出物を提供する。これらの抽出物は、このように、皮膚老化の徴候を、特に、しわと細かい線を治療、低減、改善及び／又は除去するのに、及び／又は、皮膚の美的外観を向上させるのに効果がある。

【0018】

本発明は、部分的に、彼岸花科の植物レウコユムの球根の、特に、レウコユム・アエスティバムの球根の水性抽出物が筋収縮の抑制又は阻止に効果的であるという予想されていない発見に基づく。上述のように、今まで、レウコユム抽出物は、アセチルコリンエステラーゼの抑制剤である、高含有量のガランタミンについて知られていた。レウコユム球根の水性抽出物が、筋収縮を抑制し、従って、しわを治療し、防止するのに効果的であることが開示された又は示唆された背景技術は、どこにもない。意外にも、筋弛緩作用は、球根の休眠期とは無関係に得られた。

【0019】

本発明の抽出物は、本質的に毒性がない。従って、本抽出物は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）のように筋収縮を抑制する活性を示すが、ボツリヌス毒性がないので、本発明の抽出物は、とりわけ、ＢＯＴＯＸ（登録商標）に代わり得る。

【0020】

更に、本発明は、ここで、本抽出物が、超酸化物ラジカルを捕捉する鍵穴を有する抗酸化性酵素であるマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）の発現を容易することを開示する。このように、本発明の抽出物は、毒性がないばかりでなく、抗酸化作用を示し、従って、老化から皮膚を更に保護するので、筋収縮抑制作用を有する以前に周知の化合物よりも有利である。

【0021】

このように、一態様によれば、本発明は、レウコユム・アエスティバム球根の有効量の水性抽出物を含む組成物を、被験体にその必要に応じて投与することを含む、筋収縮を抑制する又は皮膚組織を緩める方法を提供する。ある実施形態によれば、抽出物は、球根の休眠期とは無関係に得られる。

【0022】

ある実施形態によれば、水性抽出物は、少なくとも１つの皮膚のしわ、細かい線、大きなしわ、眉間しわ線、又は、皮膚科学的老化又は皮膚露光の他の徴候を改善、低減及び／又は除外する有効量で投与される。この量は、酸化損傷から皮膚を保護するのにも有効である。

【0023】

ある実施形態によれば、水性抽出物は、その液体状態である。他の実施形態によれば、抽出物は、粉末状に乾燥されている。

【0024】

これらの実施形態によれば、組成物は、抽出物が液体状である場合、約０．０１％〜約９９，９％（重量／重量）、一般的には約０．０１％〜約３０％（重量／重量）、より一般的には約０．１％〜約１０％（重量／重量）の濃度でのレウコユム球根の抽出物を含む。前記抽出物が乾燥粉末状である場合、組成物は、約０．０００１％〜約０．９９％（重量／重量）、一般的には約０．０００１％〜約０．３％（重量／重量）、より一般的には約０．０１％〜約０．１％（重量／重量）の乾燥抽出物を含む。

【0025】

本明細書で用いられる場合、用語、治療すること及び治療は、特に、皮膚のしわ、細かい線、襞、小じわ、大きなしわ等に関して、皮膚の老化及び酸化損傷の影響を低減、改善、向上、緩和及び／又は除外することを含有及び包含することを含むと理解されるべきである。本発明は、前述のような、口の両側に走る「操り人形のような」線、並びに、前頭部上の線、及び、眉間の垂直な線の治療を更に包含する。

【0026】

ある実施形態によれば、被験体に投与される組成物は、美容面で効果のある希釈剤又は担体を更に含む化粧料組成物である。

【0027】

他の実施形態によれば、組成物は、化粧品分野及び皮膚科学分野で有用な添加物を更に含み、脂質、乳化剤及び共乳化剤、親水性又は親油性ゲル化剤、防腐剤、溶剤、芳香剤、充填剤、親水性及び親油性フィルタ、染料、中和剤、浸透増強剤及びポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。特に、組成物は、グリセリン、クロルフェネシン、フェノキシエタノール及びソルビン酸カリウムのうちの少なくとも１つを更に含み得る。これらの様々な添加剤の量は、当業者に周知のように、化粧料の調製及び皮膚科学的調製で従来利用されているものである。

【0028】

追加の実施形態によれば、組成物は、脱色剤、湿潤剤、抗脂漏剤、抗座瘡剤、角質溶解及び／又は剥離剤、抗刺激剤、平滑剤、並びに、レチノール及び他の抗しわ剤のような追加の抗老化活性成分から成る群から選択される追加の活性成分を含む。

【0029】

ある実施形態によれば、組成物は、局所的に投与される。あらゆる局所的な処方は、当該技術分野において周知のように、その処方が抽出作用及び非刺激特性を保つ限り利用され得る。ある実施形態によれば、組成物は、水溶液、クリーム、ローション、油中水型乳剤又は水中油型乳剤、多重乳剤、シリコーン乳剤、マイクロ乳剤又はナノ乳剤、ゲル、血清及び乳汁から成る群から選択される形態で投与される。

【0030】

追加の実施形態によれば、組成物は、標的送達システム、例えば、リポソーム、マイクロ球、経皮パッチ、マイクロ及びナノ注入、針なし注入等を利用して局所的に投与されるので、活性成分は、付与領域、例えば、顔又は首の筋肉層により容易に到達し、影響を与えることができる。

【0031】

追加の実施形態によれば、抽出物を含む組成物は、筋肉の弛緩又は脱収縮を必要とする部位に活性剤を堆積させるために、リポソーム処方、マイクロ及びナノ注入、針なし注入又は送達システムを含めて、皮下注入、皮内注入、又はイオン泳動による注入を含む直接付与により投与され得る。

【0032】

ある実施形態によれば、組成物は、しわ及び／又は細かい線、大きなしわ、眉間しわ線、又は、皮膚科学的老化又は皮膚露光の他の徴候を改善、低減、及び／又は除外するのに有効な時間周期にわたり付与される。

【0033】

典型的な実施形態によれば、組成物は、少なくとも日に一度、付与される。

【0034】

他の典型的な実施形態によれば、組成物は、日に二度、少なくとも７日の周期にわたり、一般的には３０日にわたり、毎日付与される。

【0035】

別の態様によれば、本発明は、筋細胞の収縮作用を抑制する効果がある、休眠状態ではないレウコユム球根の水性抽出物を提供する。ある実施形態によれば、本発明は、液体状である、休眠状態ではないレウコユム球根の水性抽出物を提供する。他の実施形態によれば、抽出物は、乾燥した粉末状である。

【0036】

別の態様によれば、本発明は、休眠状態ではないレウコユム球根の水性抽出物を活性成分として含み、美容面で効果のある希釈剤又は担体を更に含む、化粧料組成物を提供する。

【0037】

追加の実施形態によれば、本発明の化粧料組成物は、皮膚のしわ及び／又は細かい線及び／又は大きなしわを治療するためのものである。

【0038】

別の実施形態によれば、化粧料組成物は、酸化損傷を治療及び／又は防止するためのものである。ある実施形態によれば、化粧料組成物は、抽出物が液体状である場合、約０．０１％〜約９９．９％（重量／重量）、一般的には約０．０１％〜約３０％（重量／重量）、より一般的には約０．１％〜約１０％（重量／重量）の抽出物を含む。他の実施形態によれば、組成物は、前記抽出物が乾燥した粉末状である場合、約０．０００１％〜約０．９９％（重量／重量）、一般的には約０．０００１％〜約０．３％（重量／重量）、より一般的には約０．０１％〜約０．１％（重量／重量）の抽出物を含む。

【0039】

ある実施形態によれば、本発明の組成物は、局所的な付与のために配合される。当該技術分野において周知であるような、且つ、上に記載されるような、局所的付与に適したあらゆる処方が利用され得る。追加の実施形態によれば、組成物は、皮下注入、皮内注入、又はイオン泳動による注入を含む直接付与のために配合される。他の実施形態によれば、組成物は、経皮的付与のために配合される。

【0040】

本発明の組成物及び方法は、主に、顔の皮膚を治療するために設定され、上述のように、首、腕、手、脚、膝等を含むが、これらに限定されない、身体の多くの領域において皮膚の皮膚科学的状態を治療するのにも適している。

【発明の効果】

【0041】

ある実施形態によれば、本発明の組成物及び方法は、経時的な老化、光活性による老化又はホルモン性の老化を含む皮膚科学的老化を防止、改善及び／又は低減することを含む治療により、皮膚の美的外観を向上させ得る。この改善は、好ましくは、本明細書に記載されるレウコユム抽出物を含む製品又は製剤の局所的付与の後に生じる。

【0042】

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の記載と図面から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】筋肉−神経共培養液中の筋収縮への１．５％のレウコユム・アエスティバム抽出物の効果を示す。

【図2】被験体第８号の、製品「Ｔ」（２％のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物）を用いての治療後の皮膚表面の２次元表示を示す。

【図3】被験体第４号の、製品「Ｔ」（２％のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物）を用いての治療後の皮膚表面の２次元表示を示す。

【図4】被験体第８号の、製品「Ｔ」（２％のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物）を用いての治療後の皮膚の３次元表示の実施例を示す。図４Ａは治療前（０日）を示す。図４Ｂは治療後（２８日）を示す。

【図5】対照（偽薬、組成物のみ）と比較した、微起伏の小じわと中程度の深さのしわへの製品「Ｔ」（２％のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物）の全体的な効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本発明は、筋収縮を抑制するのに、且つ、抗酸化剤として効果があると示されるレウコユム球根の水性抽出物を含む組成物を提供する。本発明は、ここでは、抽出物が、筋収縮への抽出物の抑制効果と抽出物の抗酸化作用により、しわ、細かい線、及び、皮膚科学的老化（即ち、本質的な老化）又は太陽光への皮膚の露出の他の徴候を含む皮膚の皮膚科学的老化の徴候を防止、低減、改善及び／又は除外することを含む治療に有効であることを示す。

【0045】

本発明の抽出物は、皮膚又は皮下の筋肉中の筋繊維及び／又は神経組織を弛緩させるように筋収縮を調節し、しわ、並びに細かい線、襞、小じわ等を減らす。顔、又は手、足等のような領域の皮膚又は皮下の筋細胞の収縮又は過剰収縮を弛緩させるか又は防止することにより、レウコユム抽出物及び前記抽出物を含む組成物は、筋収縮がしわ等の形成に関与するこれらの領域で、皮膚の景観を効果的に滑らかにし得る。このように、筋肉及び筋細胞の収縮は、しわ、細かい線等の形成に関連するので、本発明の組成物により皮膚又は皮下の筋肉の収縮を弛緩又は脱収縮させることは、収縮した筋組織をほぐし又は緩め、しわと細かい線を緩和、低減、改善、抑制又は根絶する役割をし得る。抽出物の抗酸化特性は、老化の目に見える皮膚科学的影響の除去に更に寄与する。

【0046】

一態様によれば、本発明は、レウコユム・アエスティバム球根の有効量の水性抽出物を含む組成物を、被験体にその必要に応じて投与することを含む、筋収縮を抑制する又は皮膚組織を緩める方法を提供する。ある実施形態によれば、球根は、休眠状態又は休眠していない状態であり得る。

【0047】

本発明のレウコユム・アエスティバム球根の抽出物は、筋収縮作用の抑制剤として特徴付けられる。前述のように、レウコユム・アエスティバムの全植物抽出物は、筋肉の質を増加させ、従って、筋繊維の収縮効率を増加させることが示されていたので（例えば、米国特許第６，１５９，４７６号）、この効果への期待は高くはない。留意するべきことは、レウコユム球根を利用する今までに周知の方法では、抽出物は経口投与されたのに対し、本発明のレウコユム球根抽出物は、局所的に投与されることである。

【0048】

本明細書で用いられる場合、用語「局所的投与」又は「局所的に投与される」は、身体の局所の領域に又は身体部分の表面に、レウコユム抽出物又は前記のものを含む組成物を付与することを指す。このように、これらの用語は、皮膚表面への局所的投与、並びに、リポソーム、マイクロ球体、経皮パッチ、マイクロ及びナノ注入及び針なし注入を含むがこれらに限定されない標的送達システムを利用した、標的筋肉層への局所的投与を包含する。経口投与経路及び静脈内投与経路のような全身投与経路は、本発明の範囲から除外される。

【0049】

予想外に、レウコユム・アエスティバムの休眠状態の球根から得られた抽出物と、休眠状態ではない球根から得られた抽出物との間の筋収縮抑制作用の点での著しい差は見られらかった。これは、この作用が、本発明の発明者のうちの幾人かにより以前に開示された休眠状態の球根から得られた抽出物の抗増殖作用に関連していないことを示す。

【0050】

その上、本発明の未処理のレウコユム抽出物には、ガランタミンが本質的にないことがわかった。

【0051】

ある実施形態によれば、本発明の方法及び組成物は、顔の皮膚を治療するためのものである。他の実施形態によれば、首、腕、脚、手、足、胴（胸）、背中等を含む身体の様々な領域内の皮膚は、効果的に治療され得る。

【0052】

本発明の組成物及び方法は、以下の、皮膚科学的老化、特に、経時的老化、光活性による老化又はホルモン性の老化、若しくは、太陽露光のような外因性の老化の徴候のうちの少なくとも１つを治療することにより、皮膚の美的外観を改善する。特に、皮膚の美的外観の改善は、以下の、顔の線をあまり目立たなくすること、顔の線及び／又はしわをふくよかな感触にすること、眼窩下の線及び／又は眼窩周囲の線の外観を改善すること、目尻のこじわの外観を改善すること、しわ、特に、頬上の顔しわ、前頭部上の顔しわ（例えば、目の間の垂直じわ）及び／又は口の周りの顔しわ（例えば、操り人形のような線）、並びに、深いしわ、襞又は大きなしわの外観を低減又は減少させること、細かい及び／又は深い線、襞及び大きなしわを低減及び／又は除外すること、並びに、例えば、しわ／線が削減される程度に皮膚を滑らかにすることのうちの少なくとも１つを含む。

【0053】

ある実施形態によれば、本発明の抽出物は、レウコユムの球根から作製される。本発明のある態様によれば、抽出は、球根の休眠状態とは無関係に、レウコユム・アエスティバム球根から行われる。球根は、洗浄され、皮を剥かれ、皮を剥かれた球根は、純水中で、均質なスラリーが形成されるまで潰される。活性成分は、スラリーを攪拌しながら水溶液内に抽出され、次に、粗い固形物が、傾瀉によりスラリーから取り除かれる。細かな固形物及び蛋白質は、７０〜１３０℃の温度に懸濁液を加熱し、続いて遠心力分離することにより取り除かれる。得られた抽出物は、乾燥重量に応じて水及び／又はグリセリン内に希釈され、濾過される。

【0054】

ある実施形態によれば、抽出物の乾燥重量は、約７ｍｇ／ｇ〜約１５ｍｇ／ｇの範囲内である。

【0055】

収縮した筋細胞又は組織は、しわ、細かい線等の形成に関連している。収縮した筋肉の弛緩又は脱収縮は、皮膚の景観又は微起伏を滑らかにする役割をし、従って、皮膚内の収縮した筋組織により起こるしわ及び細かい線の形成を改善、低減及び／又は根絶することに影響を与える。

【0056】

本発明の組成物は、当業者に周知のように、あらゆる美容面で及び／又は皮膚科学的に適切な形態で配合され得る。ある実施形態によれば、その製剤は、ゲル又はクリームの形態、軟膏又は油系、並びに噴霧可能な液体状であり得る。本発明の組成物に適した他の化粧製品の形態は、例えば、乳剤、ムース、リップクリーム、リップグロス、ローション、マスク、軟膏、ポマード、溶液、血清又はスプレーを含む。幾つかの実施形態では、組成物は、経皮パッチ又は、マイクロ及びナノ注入並びに針なし注入のような他の送達システムに組み込まれるか又は混合される。

【0057】

本明細書に記載されるように、活性剤としてのレウコユム球根抽出物に加えて、本発明の組成物は、適切な薬剤的に又は美容的に許容可能な担体、希釈剤、又は、薬剤的に若しくは美容的に利用され得る調製物中で活性物質を処理するのを容易にする補助剤を含む賦形剤を含み得る。処方及び投与技術についての他の詳細は、レミングストン薬剤科学の最新版（マック出版社；イーストン、ペンシルバニア州）に与えられる。本発明のレウコユム球根抽出物を含む組成物は、当該技術分野において周知の方法で、例えば、従来の混合、溶解、粉末化、糖衣錠製造、研和、乳化、被包化、封入、又は凍結乾燥処理により製造され得る。

【0058】

ある実施形態によれば、本発明の組成物は、脂質、乳化剤及び共乳化剤、親水性又は親油性ゲル化剤、着色剤、芳香剤、皮膚軟化剤、湿潤剤、防腐剤、ビタミン、キレート剤、増粘剤、充填剤、溶剤、親水性又は親油性フィルタ、染料、中和剤、浸透増強剤ポリマー等、並びに、アロエ、カモミール等のような他の植物成分を含むがこれらに限定されない、相溶可能で美容的又は薬剤的に許容可能な１つ以上の添加剤を更に含む。

【0059】

ある実施形態によれば、脂質は、鉱物油類、動物由来オイル類（ラノニン）、合成油類（イソプロピルミリステート 、オクタドデシルイソステアリン酸イソステアリル、オレイン酸デシル又はパルミチン酸イソプロピル）、シリコーンオイル類（シクロメチコン又はジメチコン）及びフッ素系オイル類から成る群から選択されるが、これらに限定されない。脂質として、脂肪アルコール、脂肪酸類、鑞類及びガム質、特に、シリコーンガム類及びエラストマー類が利用され得る。

【0060】

他の実施形態によれば、乳化剤及び共乳化剤は、グリセリン脂肪酸エステル類、しょ糖脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、オキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ＰＥＧ脂肪アルコールエステル類、グリセロール脂肪酸エステル類、アルキル硫酸塩類、アルキルエーテル硫酸塩類、アルキル燐酸塩類、アルキルポリグルコシド類及びジメチコンコポリオール類から成る群から選択され得るが、これらに限定されない。

【0061】

他の実施形態によれば、親水性ゲル化剤は、カルボキシビニルポリマー類（カルボマー）、アクリレート／アルキルアクリレート共重合体類のようなアクリル系共重合体類、ポリアクリルアミド類、キサンタンガムのような多糖類、グアーガム類、セルロースガム及び誘導体類のような天然ガム類、粘土、並びに２−アクリルアミド−２−メチルプロパン酸共重合体から成る群から選択されるが、これらに限定されない。親油性ゲル化剤は、ベントンのような改質粘土、脂肪酸金属塩、疎水性シリカ及びエチルセルロースから成る群から選択されるが、これらに限定されない。充填剤は、タルク、カオリン、マイカ、雲母、炭酸マグネシウム、珪酸アルミニウム、及びナイロンのような有機粉末から成る群から選択され得るが、これらに限定されない。染料は、美容的又は皮膚科学的組成物に通常利用されている、親油性染料、親水性染料、顔料及び真珠層、並びにそれらの混合物から成る群から選択され得るが、これらに限定されない。中和剤は、ソーダ、トリエタノールアミン、アミノメチルプロパノール及び水酸化カリウムから成る群から選択されるが、これらに限定されない。浸透増強剤は、アルコール類及びグリコール類（エタノール及びポリエチレングリコール）、エトキシジグリコール、アルコール類及び脂肪酸類（オレイン酸類）、脂肪酸エステル、及びジメチルイソソルビドから成る群から選択され得るが、これらに限定されない。

【0062】

美容的及び皮膚科学的組成物と相溶する防腐剤は、当該技術分野においてよく知られている。ある実施形態によれば、防腐剤は、安息香酸、その塩類及びエステル類、ソルビン酸とその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類とそれらの塩類、トリクロサン、イミダゾリジニル尿素、フェノキシエタノール、ＤＭＤＭヒダントイン、ジアゾリジニル尿素、及びクロルフェネシンから成る群から選択される。

【0063】

ある実施形態によれば、フィルタは、有機フィルタ：オキシベンゾン−３、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、オクトクリレン、メトキシケイヒ酸オクチル、４−メチルベンジリデンショウノウ、サリチル酸オクチル、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸及びドロメトリゾールトリシロキサン、非有機フィルタ：酸化チタン及び酸化亜鉛から成る群から選択される、通常利用されるＵＶＡ及びＵＶＢフィルタであるが、これらに限定されない。

【0064】

ある実施形態によれば、溶剤は、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール及びソルビトールから成る群から選択されるが、これらに限定されない。通常の実施形態では、溶剤は、水及び／又はグリセリンである。

【0065】

ある通常の実施形態によれば、組成物は、局所的に付与される。

【0066】

本発明の組成物は、他の添加物又は物質を含み得る及び／又は投与後に部位に更に特異的に到達又は滞留するように改質され得る、リポソーム類内に配合され得る。リポソーム類及び送達システム及びリポソーム類を含む媒体は、当該技術分野においてよく知られている。簡潔には、リポソーム類は、かなりの分量の水溶液を封入する単層又は多層の脂質小胞である。リポソームの胞状のマイクロ容器は、乳剤内で懸濁される様々な水溶性材料を含み得る（例えば、Ｇ．グレゴリウス（編集者）、１９９１年、リポソーム技術、第Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ巻（ＣＲＣ出版、ボカラトン、フロリダ州）；デービスＳ．Ｓ．及びウォルカーＩ．Ｍ．、１９８７年、酵素学における方法、１４９、５１〜６４頁；メイヒューＥ．ら、１９８７年、酵素学における方法、１４９、６４〜７７頁、及び、シャファー−コールティングＭ．ら、１９８９年、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２１、１２７１〜１２７５頁で検討されている）。リポソームの調製及び生体系内でのリポソームの様々な利用が記載されている（例えば、米国特許番号第４，７０８，８６１号、４，２２４，１７９号及び第４，２３５，８７１号中に）。従って、そのようなリポソームは、本明細書に記載されるような皮膚科学的組成物又は化粧料組成物のいずれかの中に配合され得る。加えて又は代わりに、本発明の組成物は、特に、マイクロ及びナノ密閉化により包まれ得る。

【0067】

レウコユム球根抽出物を含む組成物は、配合され得、活性成分をそれらの作用点に持って行くのに有用な、マイクロ及びナノ注入、針なし注入、経皮送達及び伝達システムのような利用可能な様々な送達システムを利用して、皮膚及び筋肉に送達され得る。

【0068】

代わりに、レウコユム球根抽出物を含む組成物は、皮下に（ｓ．ｃ．）又は皮内に（ｉ．ｄ．）に、必要とされる部位に、つまり、しわ、細かい線等を有する皮膚部位に注入され得る。

【0069】

当業者は、本発明の方法を用いて利用されるべき組成物の有効投与量又は有効量、並びに、付与領域を定めることができる。有効投与量は、活性成分の量を指す、すなわち、例えば、しわ、細かい線、大きなしわ等を治療、防止、改善、低減、又は除外する、本発明に従って特定される水性レウコユム球根抽出物の量を指す。抽出物投与量は、個人の特定の要求の重症度、個人の一般的な健康状態、個人の年齢、体重、及び性別、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、及び治療に対する耐性／応答を含む、個別に要求される治療に関連する幾つかの要因に従って、従事者により定められ得る。一般的な治療指針として、長期作用の化粧料組成物は、日に一度、２〜４日毎に、毎週、又は２週に一度、特定の製剤の半減期及び排除速度に応じて投与され得る。これらの投与レベルの変動は、当業者に周知のように、通常の経験に基づく最適化のための日常操作を利用して調節され得る。特定の投与についての指針及び送達方法は、文献内に与えられ、一般に、当該技術分野の従事者に利用され得る。実例として、レウコユム球根抽出物は、抽出物がその乾燥形態である場合、組成物の全重量に基づいて、約０．０００１重量％〜約０．３重量％の量で、抽出物がその液体状態である場合、組成物の全重量に基づいて、約０．０１重量％〜約３０重量％の量で組成物内に存在する。典型的な実施形態によれば、組成物は、日に一度、毎日付与される。他の典型的な実施形態によれば、組成物は、２日に一度付与される。更に他の典型的な実施形態によれば、組成物は、約７日〜約３０日の周期の間に付与される。

【0070】

有利には、本発明のレウコユム抽出物は、本明細書の以下に記載されるような、ＭｎＳＯＤ発現への前記抽出物の影響のために、抗酸化作用を有することが示された。それにもかかわらず、本発明の組成物は、追加の抗酸化剤を含む追加の活性成分を更に含み得る。追加の活性成分は、脱色剤、湿潤剤、抗脂漏剤、抗座瘡剤、角質溶解剤及び／又は剥離剤、抗刺激剤、平滑剤、並びに、レチノール及び他の抗しわ剤のような追加の抗老化活性成分を含むが、これらに限定されない。

【0071】

別の態様によれば、本発明は、抽出物が筋細胞の収縮作用を抑制する、休眠状態ではないレウコユム球根の水性抽出物を提供する。

【0072】

ある実施形態によれば、本発明は、休眠状態ではないレウコユム球根の、液体状である水性抽出物を提供する。他の実施形態によれば、抽出物は、乾燥した粉末形状である。

【0073】

別の態様によれば、本発明は、活性成分として、休眠状態ではないレウコユム球根の水性抽出物を含み、美容的に効果のある希釈剤又は担体を更に含む、抗老化化粧料組成物を提供する。更に追加の実施形態によれば、本発明の抗老化化粧料組成物は、皮膚のしわ及び／又は細かい線を治療するためのものである。

【0074】

ある実施形態によれば、化粧料組成物は、抽出物が液体状である場合、約０．０１％〜約９９．９％（重量／重量）、一般的には約０．０１％〜約３０％（重量／重量）、更に一般的には約０．１％〜約１０％（重量／重量）の抽出物を含む。他の実施形態によれば、組成物は、前記抽出物が乾燥した粉末状である場合、約０．０００１％〜約０．９９％（重量／重量）、一般的には約０．０００１％〜約０．３％（重量／重量）、更に一般的には約０．０１％〜約０．１％（重量／重量）の抽出物を含む。

【0075】

ある実施形態によれば、本発明の組成物は、局所的投与のために、又は、皮下若しくは皮内投与或いはイオン泳動を通じての投与のために配合される。当該技術分野において周知のように、且つ、本明細書の上に記載されたように、局所的付与に適したあらゆる製剤が利用され得る。

【0076】

以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態を更に完備に示すために示される。しかしながら、それらの実施例は、本発明の幅の広い範囲を限定するものとして解釈されるものではない。当業者は、本明細書に開示された本原理の多くの変更及び修正を、本発明の範囲から逸脱することなく、容易に工夫することができる。

【0077】

実施例

【0078】

実施例１：レウコユム・アエスティバム球根抽出物

【0079】

レウコユム・アエスティバム球根は、洗浄され、皮を剥かれた。皮を剥かれた球根は、次に、純水内で、均質なスラリーが形成されるまで潰された。抽出は、螺旋状攪拌機を用いて、１５〜６０分にわたり、１５〜４５℃の温度範囲で行われた。粗い固形物の除去は、傾瀉により行われる。スラリーから細かい固形物を取り除くことは、次のように行われた：
・７０〜１３０℃間の範囲の温度でスラリーを加熱する、
・新たな清潔な容器に液相抽出物を傾瀉する、
・円盤型遠心分離器により、３〜１０Ｋｇ／分の範囲の流速で、得られた液体を遠心分離する。

【0080】

抽出物は、水及び／又はグリセリンで希釈され、７．０ｍｇ／ｇ〜１５．０ｍｇ／ｇの乾燥重量が得られた。最終溶液は、続けて配置された１、０．４５及び０．２μｍの濾材（サープロライフ濾材、ポール社）を通じて濾過された。

【0081】

最終抽出物は、約４．５０〜約６．５０のｐＨを有する。抽出物の色は、淡黄色から黄褐色であり、水への溶解に制限がない。ガランタミンは、抽出物中に検出されず、検出閾値は、４ｐｐｍ未満であった。

【0082】

実施例２：筋収縮へのレウコユム・アエスティバム球根抽出物の効果の評価

【0083】

本明細書の上に記載されたような得られたレウコユム・アエスティバム球根抽出物が、この調査に利用された。目的は、筋収縮頻度へのこの抽出物の効果を評価することであった。

【0084】

神経−筋肉共培養モデルは、筋収縮頻度への物質の影響を調査するのに適したモデルである。筋収縮の回数は、共培養液に検討物質を付与する前後に、所与の時間にわたり計数された。物質の存在下の収縮の数は、初期の収縮数と比較して、百分率で表記された。筋収縮への抑制効果は、筋収縮頻度の十分な低減又は阻止が、神経−筋肉共培養液を含む３つのウェルのうちの少なくとも２つのウェルで観察されるかで、判定された。

【0085】

材料及び方法

【0086】

細胞培養の調製

【0087】

ヒト筋細胞が、２４ウェル培養プレートに播種された。細胞は、全培養時間の間、３７℃、５％ＣＯ_２で恒温放置された。

【0088】

５日の培養の後に、脊髄は、ラット胚から隔離され、小部分（外植片）に切断された。培養ウェル毎の１つの外植片が、筋細胞上に配置され、両方の種類の細胞が、２４のウェル内で、２１日にわたり培養された。

【0089】

培養期間の間に、筋細胞は、現れ、筋繊維を形成する。脊髄内に存在する運動神経は、筋細胞に接触する神経の延長部を発する。神経−筋肉接合が形成され、筋収縮が現れる。

【0090】

２１日の共培養の後に、モデルは、成熟し、機能していた。筋繊維は、自然に神経支配され、規則的に収縮した。これらの収縮は、反転式顕微鏡を用いて観察され、計数された。

【0091】

検査抽出物の調製

【0092】

検査抽出物の原液が、培養液中に調製された。この溶液は、神経−筋肉培養液に加えられた。

【0093】

レウコユム・アエスティバム抽出物は、１．５％で検査された。

【0094】

培養液単独は、負の対照として用いられた。

【0095】

正の対照は、可逆に筋収縮を阻止する薬剤のカリソプロドールであった。カリソプロドールの原液は、ＤＭＳＯ中で１Ｍに調製された。この溶液は、培養液内に１／２００に希釈される（最終濃度は、５×１０^−３Ｍ）。３つの培養ウェルが、処理（対照／検査抽出物）毎に利用された。

【0096】

試験工程

【0097】

試験は、培養の２１日目に開始された。

【0098】

細胞は、顕微鏡を用いて、各ウェルで観察された。顕微鏡は、ＬＵＣＩＡソフトウェアにより操作される駆動ステージを備えている。顕微鏡は、カメラにも結合され、動画像系列の記録を可能にするコンピュータに接続されている。

【0099】

各々の選択された培養ウェルに対して、規則的な収縮を示す筋繊維が参照された。この筋繊維のＸＹデータは、ＬＵＣＩＡソフトウェアを利用して記録された。この繊維の収縮の頻度は、手動で、３０秒間にわたり計数され、動画像系列は、記録された（Ｔ_０）。同じ操作が、全てのウェルに対して実行された。

【0100】

検査抽出物及び参照物は、神経−筋肉培養液に加えられ、試験系は、３７℃、５％ＣＯ_２で恒温放置された。

【0101】

恒温放置の２時間、６時間及び２４時間後に、収縮頻度が、再び、３０秒間にわたり計数され、各計数に対して、動画像系列も記録された。

【0102】

結果の解釈

【0103】

各々の培養ウェルに対して、検査抽出物の存在下で計数される筋収縮の数は、抽出物付与（Ｔ_０）前に計数された収縮の数と比較して、百分率で表記される。

【0104】

収縮の頻度が、Ｔ_０と比較して、８０％〜１２０％の範囲内である場合、筋収縮頻度の変化は、十分であるとは見なされない。この範囲は、時間中に、筋収縮頻度が、与えられた条件において僅かに変化し得ることに基づく。

【0105】

８０％未満及び１２０％超過の頻度測定は、Ｔ_０とは十分に異なると見なされる。

【0106】

結果は、以下のように表される：
・筋収縮頻度の十分な変化なし：８０％〜１２０％の収縮率、（＝）で表される
・筋収縮頻度の十分な低減：収縮率＜８０％、（−）で表される
・筋収縮頻度の阻止：収縮率＝０％、（０）で表される
・筋収縮頻度の十分な増加：収縮率＞１２０％、（＋）で表される。

【0107】

製品の効果は、同じ結果が、３つのウェルのうちの少なくとも２つのウェル内（即ち、３つの筋繊維のうちの２つ）で得られる場合にのみ評価される。表１〜２及び図１は、得られた結果を要約する。

【0108】

結果

【表1】

【0109】

培養液のみが試験ウェルに加えられた場合（負の対照）、筋収縮の頻度の十分な変化は、付与後２時間で観察された。ある変化が、恒温放置の６時間及び２４時間後に観察された。

【0110】

カリソプロドール（正の対照）は、恒温放置の２時間、６時間及び２４時間後に、筋収縮を完全に阻止する。濯ぎ出しの後に、筋収縮の回復が観測され、カリソプロドールの効果が可逆的であることが示された。

【0111】

負の対照では、ある収縮頻度の変化が６時間及び２４時間で観測されたが、調査される製品により、収縮が減少したばかりでなく、収縮が完全に阻止されたので、実験手続は、有効と証明された。

【表2】

【0112】

結論

【0113】

前述の実験条件において、１．５％のレウコユム・アエスティバム抽出物は、付与後２時間、６時間及び２４時間で、筋収縮頻度を阻止した。

【0114】

濯ぎ出し（２５時間の恒温放置時間）の後に、筋収縮が阻止され、１．５％のレウコユム抽出物の効果が可逆的ではないことが示された。

【0115】

実施例３：顔しわ上でのレウコユム・アエスティバム球根抽出物の評価

【0116】

本明細書の上に記載されたように得られたレウコユム・アエスティバム球根抽出物は、この調査において２％の濃度で、以下の成分：カリウムパルミトイル、加水分解小麦タンパク、ステアリン酸グリセリル、セテアリルアルコール、イソヘキサデカン、カブリル酸／カプリン酸トリグリセリド、ＰＰＧ−１５ステアリルエーテル、プロピレングリコール、キサンタンガム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デヒドロ酢酸、安息香酸、ソルビン酸、ベンジルアルコール、２％のレウコユム・アエスティバム球根抽出物を含む組成物内で利用された。レウコユム・アエスティバム球根抽出物のない同じ組成物が、対照として用いられた。

【0117】

この調査の目的は、ヒト被験体上で、利用２８日後に、前記抽出物を含む組成物の抗しわ効果を、対照と比較して評価及び説明することであった。この調査は、二重盲検及び人内調査であった、即ち、各被験体は、彼女自身の対照であった。

【0118】

本調査の原理

【0119】

しわの測定

【0120】

ポリマーシリコーンによる皮膚の跡が、製品を付与する前後に（試験及び対照）、検査される皮膚領域から取られた。その皮膚の跡は、次に、スキンイメージアナライザ（登録商標）（Ｓ．Ｉ．Ａ）を利用して検査された。

【0121】

簡潔に、斜角の照明（３５°）により、そのレプリカの前面上に影が作り出され、その影は、コンピュータに接続されたデジタルカメラで写真撮影される。これは、グレーの濃淡が、皮膚表面の起伏を特徴付ける幾つかのパラメータに対して分析される、デジタル画像を作り出す。各々の跡の１ｃｍ^２の領域が調査された。

【0122】

カンチライド（登録商標）−モナデルム・ソフトウェアを利用して、調査されるパラメータは、皮膚の微起伏の小じわの数と中程度のしわの数であった。しわの深さも観察された。

【0123】

微起伏の小じわは、深さが５５μｍ未満である。中程度のしわは、深さが５５〜１１０μｍである。最小表面が０．０３ｍｍ^２の全ての小じわが検出された。

【0124】

３次元表示

【0125】

前述のように得られる、ポリマーシリコーンによる被験体の皮膚の跡（Ｓｉｌｆｌｏ（登録商標））は、最良の視覚的効果を表し、プリモス（登録商標）３次元コンパクト（位相シフト高速生体内皮膚測定、ＧＦ測定技術有限会社、ドイツ国）を利用して調査された。

【0126】

この技術は、干渉縞投影のある画像から位相像を計算し、各点の高さを判定するのを可能にする。このソフトウェアにより、２次元及び３次元測定を得ることができる。再位置決め自動化システムにより、測定領域を正確に再び識別することができる。このシステムは、以下である：

【表3】

【0127】

被験体の選択

【0128】

調査のための被験体の最小数は、２０である。算入基準は、以下であった：書面での同意をした健康な被験体、臨床試験により設けられるプロトコルを完全に支持することが期待され得るような、対照の必要性と期間を意識する協調的な被験体、中程度の目尻のこじわを有する１８歳以上の女性。

【0129】

除外基準は、以下である：妊娠中又は授乳中の女性又は調査中に妊娠する予定のある女性、検査される領域上の皮膚の病態（湿疹等）、測定領域上で、皮膚の起伏に作用するいずれかの製品（抗しわクリーム）を利用する、又は、調査開始前の１ヶ月以内に上記の製品の利用を止めた被験体、充填剤注入及び／又は眼瞼の持ち上げを行った被験体、調査開始前の１．５ヶ月以内に経口避妊薬又はホルモン治療を変更、開始又は停止した被験体、調査製品の皮膚の許容性の評価を妨げやすい、前２週間の間に局所的な又は全身の治療を受けている被験体、調査者によりプロトコルを準拠しないと見られる被験体、及び調査前一ヶ月以内に太陽光又はＵＶ線への過剰な露出を被っている被験体。

【0130】

通常の洗浄製品は、調査の間、顔面上への利用を許可された（研究室への訪問を除く）。検査製品以外の皮膚医薬製品又は美容製品の利用は、調査の間、顔面への付与を許可されなかった。調査の間、太陽光又はＵＶ線への過剰な露出も許可されなかった。

【0131】

試験計画

【0132】

０日（Ｄ_０、調査が開始する前の日）
・被験体は、前の晩以来、顔面にいずれの製品も付与せずに研究室に来た。
・被験体は、情報シート（製品使用についての説明及び調査に関連する制限）と複製の同意書を読み、署名をし、日付を記した。これらの書類は、説明と同意ついて話し合った人によっても署名され、日付を記された。被験体は、複写を受け取った。
・調査に携わる技術者は、算入基準と非算入基準を確認した。
・顔面上の２つの領域が定められ、一方の領域は、試験製品で処置され、他方の領域は、対照（本明細書の下に、それぞれ、製品「Ｔ」及び「Ｋ」で記される）で処置された。
・２つの検査領域の皮膚の跡が取られた。
・調査製品が、日に二度、各々の定められた半顔面に製品を付与する指示と共に、被験体に与えられた。

【0133】

２８日目（Ｄ２８）
・被験体は、研究室に戻ってきた。製品の最後の付与は、前の晩に行われた。
・２つの検査領域の皮膚の跡が取られた。被験体は家庭で試験製品を付与したので、準拠の管理は、調査の間、実行され得なかった。

【0134】

調査製品

【0135】

製品は、製品「Ｔ」：上述の２％のレウコユム・アエスティバム球根抽出物を含む組成物に１が付され、製品「Ｋ」：組成物のみに２が付された。両方の複合物は、白い乳剤であった。

【0136】

調査開始前に、製品は、専用の空調室内で室温に保たれた。この空調室は、鍵を掛けられ、出入りは管理された。

【0137】

製品は、日に二度、２８日にわたり、１つの製品が、各半顔面に付与された。乳剤は、正常な使用条件下で付与された。付与領域は、本明細書の以下の表３に記載されるように無作為であった。

【表4】

【0138】

２２の被験体は、調査を開始した。一人の被験体は、Ｄ２８に達し得なかったので、第２の測定が、２１の被験体に対して取られた。２１の被験体は、調査プロトコルを準拠した。参加者の平均年齢は、６０歳であり、最少は４２歳で、最大は６４歳であった。

【0139】

データ分析

【0140】

計算式

【0141】

任意の単位及び異なるパラメータの平均百分率の変位（Δ）が、以下の数式に従って計算された：

【表5】

式中、
ＺＰｄｔ−１：製品１（Ｔ）により処置される領域上で得られる値
ＺＰｄｔ−２：製品２（Ｋ）により処置される領域上で得られる値
ｔ０：製品を付与する前
ｔｉ：付与後の各測定点。

【0142】

留意点：

【0143】

変位の割合（Δ％）は、製品２により処置される領域の変位（ＺＰｄｔ―２_ｔｉ−ＺＰｄｔ―２_ｔ０）と比較しての、又は、処理前の状態と比較しての、製品１により処置される領域の変位（ＺＰｄｔ―１_ｔｉ−ＺＰｄｔ―１_ｔ０）の百分率で表記される：
（ＺＰｄｔ―１_ｔｉ−ＺＰｄｔ―１_ｔ０）−（ＺＰｄｔ―２_ｔｉ−ＺＰｄｔ―２_ｔ０）又は（ＺＰｄｔ_ｔｉ−ＺＰｄｔ_ｔ０）

【0144】

これらの変位は、初期値ＺＰｄｔ_ｔ０（処置前）で均衡を保たれ、その処置とは無関係に、ｔ０とｔｉとの間の可能な許容量により補正される。この許容量は、製品２により処理される領域（ＺＰｄｔ―２_ｉ−ＺＰｄｔ―２_ｔ０）上で、又は、ｔ０で処置された領域上で算出され、分母を与える：
Ｐｄｔ―１Ｚ_ｔ０＋（ＺＰｄｔ―２_ｔｉ−ＺＰｄｔ―２_ｔ０）又はＺＰｄｔ_ｔ０

【0145】

従って、この表記（Δ％）は、製品２（Ｋ）により処置される領域で観察される変動（処値とは無関係）を考慮して、初期条件と比較した、製品１（Ｔ）により処置される各領域の変化を百分率で与える。

【0146】

各検査パラメータに対して、付与前（０日）に及び処理完了後（２８日）に、製品Ｔにより処置される領域から得られる値（表５〜６）が示され、製品Ｋで処置される領域から得られる値（表７〜８）が示される。

【0147】

これらの表は、記述統計：平均：中心、最小値、最大値、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）及びこれらの値の９５％（ＣＩ９５％）の信頼区画も示す。

【0148】

統計方法

【0149】

統計分析は、各々の調査製品で処置される皮膚領域から得られる変化の有意性を定めた。

【0150】

データは、一対のｔ検定で分析された。この方法は、一対のデータ間のサンプル差の平均が、仮定された平均、帰無仮定（Ｈ０）下のゼロと十分に異なるかを検定する。

【0151】

対立仮定（Ｈ１）は、平均差が、０超過であるか又は０未満であることであった（両側検定）。検定を実行する前に、５％の第１種の過誤が選択される（それは、真の帰無仮定を棄却するおそれに対応する）。

【0152】

ｐ＜０．０５の場合、Ｈ０は拒絶された。処置前後の間、又は、検査製品間には十分な差があった。

【0153】

ｐ＞０．０５の場合、Ｈ０は許容され、平均は０とは異ならなかった。データは、処置前と処置後との間で、又は、検査製品間で十分な差を示さなかった。利用されたソフトウェアは、エクセル９．０バージョン２００３であった。

【0154】

結果

【0155】

抗しわ効果

【0156】

検査パラメータは、
・微起伏の小じわの数
・中程度のしわの数
であった。

【0157】

表４は、微起伏の小じわの数を示し、表５は、処理前後の、製品「Ｔ」（２％のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物）で処置される皮膚領域からの、ポリマーシリコーンによる個別の被験体の皮膚跡上で測定された中程度のしわの数を示す。

【表6】

【表7】

【0158】

表６〜７は、処理前後の、製品「Ｋ」（対照組成物）で処置される皮膚領域からの、ポリマーシリコーンによる個別の被験体の皮膚跡上で測定された同じパラメータを示す。

【表8】

【表9】

【0159】

以下の表８及び図５は、２８日の製品付与後に、全ての被験体から得られた皮膚起伏パラメータの平均変化を要約する。

【表10】

【0160】

結論：

【0161】

日に二度の利用の２８日後：
・製品「Ｔ」、２％のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物により、微起伏の小じわの数が著しく減少した（平均で３０％）。減少は、８６％の被験体で観察された。更に、中程度のしわの数の限定された著しい減少も測定された（平均で、−１４％）。このパラメータの減少は、６２％の被験体で観察された。

【0162】

全てのこれらの変位は、本発明のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物（製品「Ｔ」）の平滑性及び抗しわ効果の傾向を特徴付ける。対照組成物（製品「Ｋ」）は、皮膚の起伏パラメータを変えなかった。

【0163】

製品「Ｔ」と製品「Ｋ」との間の比較により、微起伏の小じわの数の著しい差が強調された。製品「Ｔ」は、このパラメータにおいて、製品「Ｋ」よりも良い効率を示した。

【0164】

図２及び図３は、製品「Ｔ」（２％のレウコユム・アエスティバム抽出物を含む組成物、図２Ａ及び図３Ａ）又は製品「Ｋ」（対照、図２Ｂ及び３Ｂ）で処置された皮膚領域の２次元測定の実施例を表す（それぞれ、第被験体８号及び第４号）。図４は、製品「Ｔ」（図４Ａ）又は製品「Ｋ」（図４Ｂ）で処置された被験体第８号の皮膚領域から得られた３次元視覚的測定を表す。しわ深さの視覚的な減少が観測された。

【0165】

実施例４：角化細胞内のＭｎＳＯＤ発現へのレウコユム・アエスティバム球根抽出物の効果

【0166】

本明細書の上述のように得られるレウコユム・アエスティバム球根抽出物は、ＭｎＳＯＤ遺伝子の発現を模擬実験するために、以前に実証された。本調査の目的は、遺伝子発現の模擬試験が、蛋白質レベルの増加と相関するかを検討することであった。蛋白質発現は、流動細胞計測法により評価された。

【0167】

材料及び方法

【0168】

生物学的モデル
細胞の種類：第３継代で利用される正常なヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）Ｋ_０７４
培養条件：３７℃、５％ＣＯ_２
培養液：表皮成長因子（ＥＧＦ）０．２５ｎｇ／ｍｌ、下垂体抽出物（ＰＥ）２５μｇ／ｍｌ（インビトロジェン３７０００１５）、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌ（シグマＧ１３９７）で補足された角化細胞用ＳＦＭ（インビトロジェン１７００５−０３４）
試験液：ゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌ（シグマＧ１３９７）で補足された角化細胞用ＳＦＭ（インビトロジェン１７００５−０３４）

【表11】

【0169】

培養及び処置

【0170】

角化細胞は、培養液中で培養された。半密集で、培養液は、取り除かれ、検討抽出物を含む又は含まない試験液に入れ替えられ、細胞は、７２時間にわたり恒温放置された。全ての処置は、ｎ＝３で行われた。

【0171】

流動細胞計測分析−蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）

【0172】

恒温放置後に、細胞は、トリプシンを用いた酵素処理により、それらの担体から分離された。

【0173】

よく洗浄した後に、細胞は、緩衝液中に固定され、次に、透過処理緩衝液中に調製された抗ＭｎＳＯＤ抗体（テビュＳＯＤ−１１０Ｃ）で標識された。１時間、恒温放置し、洗浄した後に、細胞は、透過処理緩衝液中に調製されたウサギ免疫グロブリンに対する蛍光抱合体（ＧＡＲ−Ａｌｅｘａ４８８、インビトロジェンＡ１１００８）の存在下で恒温放置された。

【0174】

第２抗体のみを用いた対照も、免疫標識の特異性を確認するために、同じ条件下で実行された。

【0175】

１時間、恒温放置し、洗浄した後に、蛍光パラメータが、ＦＡＣＳアレイシステムソフトウェア（ベクトン−ディキンソン）により駆動されるＦＡＣＳアレイ（商標）血球計数器を備えた流動細胞計測法により、１０，０００の個別の細胞について測定された（細胞密度の選択はない）。

【0176】

データ管理

【0177】

生データは、マイクロソフトエクセル（登録商標）ソフトウェアで分析された。群間の比較が、学生のｔ検定により行われた。統計的分析は、ｎ≧５の場合に解釈を与えられ得る。ｎ＜５に対しては、統計値は、情報価値があるが、定量的ではないと見なされ得る。この報告で利用される数式は、
平均値の標準誤差：ＳＥＭ＝Ｓｄ／√ｎ

【0178】

平均値の標準誤差（ＳＥＭ）は、標本平均が真の密度平均からどれくらい離れていると思われる、測度である。ＳＥＭは、標本寸法の二乗平均で割られた標準誤差（ｓｄ）として計算される。

【0179】

結果

【0180】

本明細書の以下の表９に示されるように、０．１５％で試験された本発明のレウコユム・アエスティバム抽出物は、遺伝子発現の増加に相関するＭｎＳＯＤ蛋白質発現を僅かに増加させた。０．０７５及び０．３％の濃度では、ＭｎＳＯＤ蛋白質発現へのその複合物の効果は、検出され得なかった。

【表12】

^（１）：統計有意性に対する閾値
ｎｓ：＞０．０５、大きくはない
＊：０．０１〜０．０５、大きい

【0181】

結論

【0182】

レウコユム・アエスティバム球根抽出物は、角質細胞内の抗酸化酵素ＭｎＳＯＤの発現を僅かに増加させた。この効果は、０．１５％の抽出物濃度で大きく（ｐ＜０．０５）、この抽出物による遺伝子発現の増加と相関し得た。

【0183】

実施例５：レウコユム・アエスティバム球根抽出物の毒性評価

【0184】

美容的用途に対する、本明細書の上に記載のように得られたレウコユム・アエスティバム球根抽出物の安全性は、以下のように検査された。

【0185】

刺激

【0186】

刺激は、「ＨＥＴ−ＣＡＭ」検定により検査された。検定の原理は、１０日の恒温放置後の胚性鶏卵の絨毛尿膜に製品を付与した後の最初の５分間の間に現れ得る、起こり得る刺激（充血、及び凝固／血栓症）の視覚的観察に基づく。観察される現象は、それらの出現（それらの強度ではない）に従って記録される。（１９９６年１１月２９日の法令に従う「公報」の公式的方法を要約する、操作モデルＡＴＳ Ｍ１９１８ＬＡＣ）。抽出物は、刺激性ではないとわかり、ＨＥＴ−ＣＡＭ検定では、スコア「０」が得られた。

【0187】

細胞毒性

【0188】

細胞毒性が、ニュートラルレッド（ＮＲ）毒性手続により測定された。この手続は、超生体色素であるニュートラルレッドを組み込んで結合する生存細胞の能力に基づいた、細胞生存／生存能の化学的感受性試験である。ＮＲは、非イオン性拡散により細胞膜を容易に透過し、細胞内のリソソーム中に堆積し、リソソーム基質中の陰イオン性の部位と結合する、弱い陽イオン性の色素である。細胞表面又は感受性リソソーム膜の変質により、リソソームは脆弱になり、徐々に非可逆性になる他の変化をもたらす。生体異物の作用により生じるそのような変化により、ＮＲの取り込み及び結合は減少することになる。従って、生きた細胞と損傷した又は死んだ細胞とを区別することができる。試験は、時間設定周期にわたり抽出物と接触したウサギ角膜繊維芽細胞を用いて行われた（フランス共和国公報、１９９９年１２月２７日）。

【0189】

抽出物は、抽出物の５０％希釈液で細胞死亡率が２０％を下回るので、細胞毒性が無視できるものとして定められた。

【0190】

皮膚の耐性

【0191】

刺激は、皮膚毒性方法：研究室作業者の参考書（Ｎ．マーツリ、Ｈ．マイバッハ編集、テイラー＆フランシス、１９９８年）に基本的に記載されるような、閉塞性単一貼布試験方法により検査された。抽出物は、貼布で皮膚に４８時間にわたり付与した後に、刺激性のないものとして見なされた。

【0192】

特定の実施形態の上記の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにする。、他者は、現在の知識を用いることにより、過度の実験方法を行うことなく、遺伝子学的概念から逸脱することなく、様々な用途に対して前記性質を容易に変更する及び／又は適合させることができる。従って、適合及び変更は、本開示の実施形態の均等物の意味及び範囲内で理解されるように意図されたものでなければならず、そのように意図されている。本明細書で用いられる表現法又は用語法は、記載目的のためのものであり、限定するものではないことが理解されるべきである。様々な開示機能を実行するための手段、材料、及び工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代わりの形態を取り得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】