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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】5866053
(24)【登録日】2016年1月8日
(45)【発行日】2016年2月17日
(54)【発明の名称】皮膚粘弾性のマーカー及びその利用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20160204BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20160204BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Q
G01N33/68
【請求項の数】4
【全頁数】12
(21)【出願番号】特願2015-179853(P2015-179853)
(22)【出願日】2015年9月11日
【審査請求日】2015年10月6日
(31)【優先権主張番号】特願2014-252607(P2014-252607)
(32)【優先日】2014年12月15日
(33)【優先権主張国】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発行者名 公益社団法人日本皮膚科学会 刊行物名 日本皮膚科学会雑誌 第１２５巻，第４号，臨時増刊号 発行年月日 平成２７年４月１５日
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100122954
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷部 善太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(74)【代理人】
【識別番号】100202430
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 千香子
(72)【発明者】
【氏名】近藤 慎也
(72)【発明者】
【氏名】高橋 美奈子
【審査官】
加々美 一恵
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００８−５３６４８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１５−００００３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１５−０００８６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００９−５０７０４６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − ３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
皮膚角層のＮＧＡＬの発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法。
【請求項2】
被験者の皮膚角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層のＮＧＡＬの発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたＮＧＡＬの発現量から皮膚粘弾性を求める工程を含む皮膚粘弾性の評価方法。
【請求項3】
皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである請求項２に記載の評価方法。
【請求項4】
皮膚角層のＮＧＡＬの発現量を測定することを特徴とする皮膚老化を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚粘弾性のマーカー及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚の健康状態は、様々な指標を用いて評価される。例えば、皮膚の「はり」感の有無が健康状態や老化度の評価指標の一つとされる。「はり」は、角層・表皮由来のはりと真皮由来のはりの二つに分けられる。特に真皮由来のはりは、指で皮膚を押すと押し返すような弾力があり、指を離すと速やかに元に戻る状態をいい、物理的には粘弾性ともいう。そして皮膚の示すこの粘弾性は、年齢や紫外線被曝、化学物質への皮膚露出などによっても低下する。このため、皮膚のはりは、皮膚老化の指標ともなり得る。皮膚を一つの弾性体であるとみなして、皮膚の粘弾性率を測定し、「はり」という官能的な評価方法に代えて用いようとする方法及び測定装置が開発されている。代表的な皮膚粘弾性測定装置としてＣＵＴＯＭＥＴＥＲ・キュートメーター（商品名）（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ社製）がある。この装置は、皮膚表面を陰圧状態のプローブ開口部に引き込み、開口部に引き込まれた皮膚長をプリズムで測定し、次いで吸引を解除し、解除したときの変位長（戻り）を同様に測定し、この測定結果をパラメータとして粘弾性率を求めるものである（非特許文献１参照）。この装置を用いた粘弾性率を指標として、皮膚の老化度の評価や、化粧料の効果を評価することが化粧品業界や、美容関連医療分野において広く普及している。
特許文献１には、皮膚のたるみを改善させるような美容施術を行ったときの効果を評価する手段としてキュートメーターを使用することが記載されている。
非特許文献２は、グルコシルセラミド含有ビート抽出物の皮膚弾力性に及ぼす影響を、キュートメーターを用いて評価したことが記載されている。このように皮膚粘弾性は皮膚の健康状態を評価するための重要なパラメータであると認識されている。
しかし、キュートメーターによる皮膚粘弾性の測定技術は、測定に用いるプローブや装置が高価であり、また使用にあたっては熟練を要する。このため、より簡便な方法が求められている。
【0003】
また、皮膚の粘弾性という物理的な指標を、化学的な分析手法で測定する方法も提案されている。特許文献２には、ヒト前腕を０．１５％の次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し、洗浄前後の酸化タンパク質を蛍光標識して測定すると、酸化タンパク質量が増加し、さらに、前腕部を前記キュートメーターで測定して得られる物理量であるＲ０（最大引っ張り幅）の処理前後の比が増加することが記載されている。そして、この結果に基づき酸化タンパク質を指標として皮膚の柔軟性を評価する方法が、同じく特許文献２に提案されている。
このヒト皮膚の柔軟性は、上皮細胞層と間質細胞の間に存在する膜状の細胞外マトリックスによって保たれるといわれている。この細胞外マトリックスは基底膜と呼ばれており、ＩＶ型コラーゲンやラミニンなどの細胞外タンパク質から構成されている（非特許文献３）。
【0004】
さらにまた、本発明は、リポカリンファミリーに属するタンパク質であるNeutrophil gelatinase-associated lipocalin（ＮＧＡＬ）にかかる発明である。ＮＧＡＬの遺伝子配列やタンパク質の構造は特許文献３に開示されている。本発明においては、この特許文献３に開示されたヒトＮＧＡＬを発明に用いるものである。ＮＧＡＬの利用技術として、ＮＧＡＬがアトピー性皮膚炎のマーカーとなりうることが特許文献４に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１０−５１７１７号公報
【特許文献2】特開２００６−３４９３７２号公報
【特許文献3】特表２００５−５０３８２９号公報
【特許文献4】特表２００８−５３６４８３号公報
【0006】
【非特許文献1】皮膚粘弾性測定装置 ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ ＭＰＡ５８０ マニュアル、２００７．５修正版、株式会社インテグラル
【非特許文献2】堀未央、米井嘉一他、Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 ７［１１］１２９−１４２，２０１０
【非特許文献3】Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｐａｎ． Ｖｏｌ．３５．Ｎｏ．１，１−７，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、皮膚の粘弾性を予測し、評価するための新しい指標を提供することを課題とする。また、本発明は、この指標を用いた、皮膚の検査方法を提供することを課題とする。さらにまた、本発明は皮膚の基底膜タンパク質産生を促進することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、前記のキュートメーターを用い、皮膚の粘弾性を測定し、粘弾性のパラメータと相関関係を有しているマーカーを探索する過程で、皮膚角層中のリポカリンファミリーに属するタンパク質であるNeutrophil gelatinase-associated lipocalin（以下「ＮＧＡＬ」）が粘弾性の指標となりうることを見いだし、本発明を完成した。さらに、ＮＧＡＬは被験者の年齢と高い相関を有しており、老化の指標ともなりうることを見いだした。また本発明者は、このＮＧＡＬによって皮膚のハリが回復し、さらには基底膜の構成タンパク質をＮＧＡＬが増加させることを見いだし、ＮＧＡＬを皮膚粘弾性指標とする有意性を明らかにした。
【0009】
すなわち、本発明の構成は、以下のとおりである。（１）皮膚角層のＮＧＡＬの発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法。
（２）被験者の皮膚角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層のＮＧＡＬの発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたＮＧＡＬの発現量から皮膚粘弾性を求める工程を含む皮膚粘弾性の評価方法。
（３）皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである（２）に記載の評価方法。
（４）皮膚角層のＮＧＡＬの発現量を測定することを特徴とする皮膚老化を評価する方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明の方法によれば、物理的な指標である皮膚の粘弾性を、生化学的なマーカーである皮膚角層中のＮＧＡＬの測定結果に基づいて得ることができるため、キュートメーターなど専用の測定装置が不要となり、皮膚粘弾性測定が簡便化できる。また皮膚角層はテープストリッピング法によって容易に採取可能であり、郵送等の簡易な手段で輸送できるため、一箇所で大量の被験者の皮膚粘弾性の測定が可能となる。またＮＧＡＬを新たな老化指標とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】キュートメーターを操作したときに得られる皮膚の変形を測定したチャートである。
【図2】角層中のＮＧＡＬ測定値と皮膚粘弾性パラメータＲ２の相関分析を行った図である。
【図3】角層中のＮＧＡＬ測定値と皮膚粘弾性パラメータＲ７の相関分析を行った図である。
【図4】角層中のＮＧＡＬ測定値と年齢の相関分析を行った図である。
【図5】ＮＧＡＬによるコラーゲンゲル収縮効果を確認した画像である。
【図6】ＮＧＡＬの添加量とコラーゲンゲル収縮率のグラフである。
【図7】ヒトＮＨＥＫ細胞にＮＧＡＬのｓｉＲＮＡ導入によるＮＧＡＬ産生抑制を示すグラフである。
【図8】ヒトＮＨＥＫ細胞にＮＧＡＬのｓｉＲＮＡ導入はＮＧＡＬ以外のタンパク質の産生抑制を示さないことを裏付けるグラフである。
【図9】ヒトＮＨＥＫ細胞のＮＧＡＬ遺伝子をノックダウンした場合基底膜タンパク質ＩＶ型コラーゲンの産生が抑制されることを示すグラフである。
【図10】ＮＧＡＬの刺激により、ヒト角層細胞から基底膜タンパク質であるＩＶ型コラーゲンが産生されることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、皮膚角層のＮＧＡＬの発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法及びＮＧＡＬの利用に係る発明である。Neutrophil gelatinase-associated lipocalin（ＮＧＡＬ）は、皮膚角層中に存在するリポカリンファミリーに属するタンパク質である。ＮＧＡＬは、健常人の血中や尿中に存在し、その量は各種の炎症性疾患や細菌感染時に上昇することが知られている。また急性腎機能障害の血中マーカーとされているほか、各種の腫瘍マーカーとしても注目を集めている。本発明においては、特許文献３に開示されたヒトＮＧＡＬを発明に用いるものである。また特許文献４に開示されているマーカーが皮膚の粘弾性パラメータに変わる指標となる。
【0013】
従来技術のキュートメーターによる皮膚粘弾性の測定は次のようにして行われている。標準的には、吸引径６ミリで３００ｍｂの吸引圧にて５秒間吸引し、その後開放したときの変形する皮膚の変位を解析する。キュートメーターで得ることのできる皮膚粘弾性値の測定パラメータとして、前記したとおり一定の吸引圧及び時間で変形する皮膚の変位を解析して求められる戻り弾性比率（Ｕｒ／Ｕｆ）が主として評価に用いられる。キュートメーターによる皮膚の変位量の経時的測定の代表的なチャートを図１に示す。図１において、Ｕｆ：吸引時の皮膚の伸び（図１のＵｆ１に対応）、Ｕｒ：即時的収縮（図１のＵｒ１に対応）、Ｕａ：吸引解放時の皮膚の戻り（図１のＵａ１に対応）である。皮膚の粘弾性指標として用いられるパラメーターは、Ｒ２：吸引時の皮膚の伸びた長さに対する吸引開放時の皮膚の戻り率＝皮膚の復元率（Ｒ２＝Ｕａ／Ｕｆ）、Ｒ７：吸引時の皮膚の伸びた長さに対する即時的（瞬間的）な収縮率＝収縮時の弾性率（Ｒ７＝Ｕｒ／Ｕｆ）である。Ｒ２は全体の弾力を表しており、完全弾性体で１．００、ヒト皮膚は０．３〜０．５である。Ｒ７は戻り弾性比率であり、１に近いほど弾性があり、ヒト皮膚は０．３〜０．５である。
【0014】
一方、本発明の方法では、皮膚角層試料中のＮＧＡＬの発現量として、遺伝子量またはタンパク質量を測定する。ここで、皮膚試料としては、ヒトの表皮角層を含む皮膚試料が好ましく、方法としては、皮膚に粘着性のテープを貼付し、これを剥離する際に、テープに付着してくる角層を試料とするテープストリッピング法を採用することが、患者への負担が少なく望ましい。
【0015】
皮膚試料中のＮＧＡＬを遺伝子試料として測定する場合には例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。また、ＮＧＡＬ遺伝子の定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行うことができる。ＮＧＡＬタンパク質の測定手段としては、例えば免疫染色等が採用できる。測定に用いる抗ＮＧＡＬ抗体及びその標識体は市販品を用いることができる。免疫染色の場合には、例えば蛍光免疫染色により測定可能である。ＮＧＡＬの定量は、例えば蛍光強度を、市販の測定装置とソフトウェアで定量することにより行うことができる。
【0016】
また、上記の抗ＮＧＡＬ抗体、その標識体、第２抗体、標識第２抗体などを含有するＥＬＩＳＡキットとすることが好ましい。さらに、分析のための緩衝液等と組み合せた検査キットとすることもできる。さらにまたＮＧＡＬは、皮膚基底膜タンパク質の産生促進作用を有しており、皮膚基底膜の機能を向上させる目的の剤としても使用可能である。
【実施例】
【0017】
次に実施例、試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【0018】
１．皮膚粘弾性及びＮＧＡＬの測定Ａ．方法
（１）試験対象
健常者女性４５歳〜６９歳（３７名）
【0019】
（２）キュートメーターを使用した粘弾性測定顔面右頬部に測定部位を統一して粘弾性を測定した。測定はキュートメーターＭＰＡ５８０を用いて、付属のプローブを用いて、吸引径６ミリで３００ｍｂの吸引圧を５秒間吸引するモードで行った。
【0020】
Ｂ．ＮＧＡＬの測定・角層採取
被験者の頬部より２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー（アサヒテクノラボ社）１枚を用いてストリッピングを行い、角層を採取した。
・角層抽出方法
ガラスビーズとＴ−ＰＥＲバッファー（＃７８５１０/Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＴＩＦＩＣ）５００μlの入ったチューブに角層を採取した角層チェッカーを入れ、ビーズ式細胞破砕装置（Tommy）を用い、４６００ｒｍｐ、１８０秒にて角層タンパクを抽出した。
・角層中総タンパク量の測定
各サンプルのタンパク量はＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃２３２２５）を用いて測定した。測定には角層サンプルを１０μｌに ｒｅａｇｅｎｔＡ： ｒｅａｇｅｎｔ＝５０：１で混和した液２００μｌを加え、６０℃３０分間インキュベーションしたのち、５６２ｎｍの吸光度で測定した。同時に精製ウシ血清アルブミンを標準品として検量線を作成し、吸光度の値からタンパク量を算出した。
【0021】
・角層中ＮＧＡＬ量の測定各サンプルのＮＧＡＬ発現量は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＤＹ１７５７）を用い、サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法によって次の基準で測定した。
（１）吸着抗体の固定化
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＣＯＳＴＡＲ ＃３５９０）にラットＮＧＡＬ（ｒａｔ ａｎｔｉ−Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２ Ｐａｒｔ ８４２２７１）を最終濃度2.0μg/ｍｌになるようにＰＢＳ（−）（ＷＡＫＯ ＃１６２１９３２１）で希釈したものを１００μｌ/ｗｅｌｌで添加し、２５℃、酸素／窒素混合雰囲気でインキュベートした。
（２）ブロッキング
蒸留水を用いて１０倍に希釈した希釈液（Ｒ＆Ｄ ＃８９０８０３）を３００μｌ/ｗｅｌｌ加え２５℃、１時間インキュベートした。
（３）サンプル添加
検量線作製用の遺伝子組み換えＮＧＡＬ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２ Part 842273）、ヒト角層抽出液（T-PER bufferで２倍希釈）をそれぞれ100μl/wellで加え、２５℃で２時間インキュベートした。
（４）検出用抗体反応
ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２（Ｐａｒｔ ８４２２７２）を終濃度１００ｎｇ/ｍｌになるように希釈液で希釈した反応液を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、２５℃、２時間インキュベートした。
（５）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ反応
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｌｕｅｎｔで２００倍に希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐａｒｔ ８９０８０３）を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、２５℃、２０分間インキュベートした。
（６）ＴＭＢ反応
ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７４３１）を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、２５℃、７．５分間インキュベートした。
（７）反応停止液の添加と吸光度計での測定
０．５ＮＨ２ＳＯ４（Ｗａｋｏ ＃１９８−０９５９５）を１００μｌ/ｗｅｌｌ加え、反応を止め、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍ−５４０ｎｍの吸光度を測定した。
なお手順（２）〜（６）を行う前には洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０/ＰＢＳ）を用いてプレートの洗浄を行った
【0022】
角層中ＮＧＡＬ量として、抽出液中の総タンパク量で補正し、単位タンパク量あたりのＮＧＡＬ量で表した。
【0023】
Ｃ．結果粘弾性とＮＧＡＬの相関解析
粘弾性及びＮＧＡＬの測定結果についてピアソンの単相関分析を行い、単相関回帰式と相関係数を求めた。散布図グラフ及び回帰式を図２、３に示す。
Ｒ２の粘弾性パラメータとＮＧＡＬ測定値の相関係数ｒ＝０．３１９、Ｒ７の粘弾性パラメータとＮＧＡＬ測定値の相関係数はｒ＝０．３０３であった。この解析結果から皮膚角層のＮＧＡＬ測定結果は、キュートメーターで測定した皮膚の粘弾性パラメータのＲ２、Ｒ７に代替できることが明らかとなった。
すなわち、皮膚の粘弾性の物理的な測定結果に変えて、ＮＧＡＬを測定することで皮膚の粘弾性を評価できた。
【0024】
２．老化指標としてのＮＧＡＬの利用ＮＧＡＬの測定結果を老化指標として利用することができないか試験を行った。
前記１．の試験と同様に健康な女性９７名の頬部のＮＧＡＬを測定し、年齢との相関の有無を確認するため、年齢とＮＧＡＬ値について、ピアソンの方法による２元配置の相関分析を行った。散布図、一次回帰式、相関係数を図５に示す。
【0025】
年齢とＮＧＡＬ値には負の相関が存在することが確認できた。また前記のとおり皮膚の粘弾性とＮＧＡＬには正の相関が観察されたことから、ＮＧＡＬを老化の指標として利用可能であることがわかった。
【0026】
以下に、皮膚粘弾性とＮＧＡＬが関係していることを証明する試験例を示し説明する。３．コラーゲンゲル収縮試験
皮膚の弾力性に係る皮膚の反応として、コラーゲン線維の収縮を指標として評価することができる。この試験は線維芽細胞を含むコラーゲンゲルは皮膚に弾力性を付与する化合物や組成物に反応してゲル収縮を起こす。ＮＧＡＬがこのコラーゲンゲル収縮を引き起こすことを確認する試験を行った。
（１）試験方法
コラーゲンゲルはブタ皮膚性コラーゲンＩ溶液（日本ハム社製、＃３０７−３１６１１）を使用した。まず、ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ ｃｅｌｌ）を ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ ＃１９９６−０６５）＋ １０％ ＦＢＳで混濁し、６０００００ ｃｅｌｌｓ/ｍｌに調整した後、細胞混濁液：ゲル溶液を１:６になるように混合し、氷冷上で２ｍｌずつ６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注した。３７℃、ＣＯ２雰囲気下で５時間培養した後、ゲルの固化を確認、調整したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２/ＮＧＡＬ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｒｈＮＧＡＬ;Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ＃１７５７−ＬＣ−０５０）を溶解した培地を２ｍｌ/ｗｅｌｌずつ添加し、培養を継続した。４８時間観察した後、培地を除き、ＰＢＳにて洗浄した後、１０％ホルマリン溶液にて、２４時間以上固定した。１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ 溶液に置換して、ゲル直径の計測を行った。各Ｗｅｌｌにおいて、ゲル及びＷｅｌｌの直径を４つの角度から測定し、各Ｗｅｌｌの面積当たりに対するゲルの面積を割って収縮率を算出し、３ｗｅｌｌの平均値及び標準偏差値を求めた。
【0027】
（２）結果コラーゲンゲル収縮の観察画像を図５に示す。また収縮率のデータを図６に示す。なお、データはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ−ｔｅｓｔにより対照群に対する統計解析を行い、＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１の危険率表示を付した。
ｒｈＮＧＡＬを添加すると、無添加のコントロールと比較して、ＮＧＡＬ添加により、濃度依存的にゲルの収縮率が高くなった。特にＮＧＡＬ １ｎｇ/ｍｌ以上の濃度において有意なゲル収縮が観察された。この結果から、皮膚において、ＮＧＡＬの濃度上昇に対応して皮膚の弾力性が上昇することが予測された。
【0028】
４．基底膜タンパク質の産生試験基底層を構成するヒト表皮角化細胞を用いてＮＧＡＬ発現の基底膜タンパク質に及ぼす作用を確認した。
（１）予備試験
（１−１）ｓｉＲＮＡによるＮＧＡＬ発現のノックダウン試験
ＮＧＡＬを産生している正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞;ＬＯＮＺＡ）を用い、ｓｉＲＮＡによるＮＧＡＬ遺伝子発現の一時的抑制を行い、ＮＧＡＬ発現のノックダウンを試みた。
細胞培養にはＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標） ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ６０ μＭ ｃａｌｃｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）にＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２増殖添加剤（倉敷紡績社製、日本）を添加したものを使用した。ＮＨＥＫ細胞は１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌの密度で直径３５ｍｍの組織培養ウェルで５０％コンフルエントになるまで培養した後、ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を細胞に導入した。なお、ｓｉＲＮＡは無血清培地で調整し、１００μｌ培地あたりＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、０．５ ｎＭのＨｓ＿ＬＣＮ２＿６ ＦｌｅｘｉＴｕｂｅ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）内でｓｉＲＮＡを細胞に導入した。またネガティブコントロールとして、Ａｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ （Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて同様に操作を行った。導入細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気の条件下で７２時間培養を行った。
【0029】
（１−２）ＮＧＡＬ量の測定各細胞の培養液中のＮＧＡＬ量は市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＤＹ１７５７）を用い、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法により測定した。
また、ｓｉＲＮＡによるＮＧＡＬノックダウンを確認するため同じく細胞外タンパク質であＭＭＰ−９を測定した。ＭＭＰ−９の測定は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＤＹ９１１（ＭＭＰ−９））を用いて測定し、ＮＧＡＬが選択的に抑制されていることを確認した。
【0030】
（１−３）基底膜タンパク質の測定１−１、１−２の試験でＮＧＡＬが選択的に抑制されていることを確認した後、基底膜タンパク質の産生抑制を確認する。
基底膜タンパク質として、ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＶ）を測定した。
測定は、ウエスタンブロッティング法によった。培養上清を１０−ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ｆｉｌｔｅｒ （Ａｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）を用いて１０−ｋＤａ以上のタンパク質が含まれるように濃縮を行い、ウエスタンブロッティング用のサンプルとして用いた。調整した培養上清は、７．５％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓで分離し、０．２μｍ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋに転写した。
Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＰＢＳ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、室温条件で1時間ブロッキングし、次いでｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで調整した一次抗体で、４℃で振動させながら一晩反応させた。
一次抗体には、ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１/１０００、 Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を使用した。
次いで、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳで５分間（２回）１０分間（１回）洗浄した。その後、２次抗体として、ＨＲＰ−Ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ. ８１−１６２０）を１００００倍に希釈し、室温で１時間反応させた。
反応終了後ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ.ＲＯＮ２２３２）を用いて５分間反応させ、ルミノ・イメージアナライザー ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉシリーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
【0031】
（２）結果（２−１）ｓｉＲＮＡによるＮＧＡＬ遺伝子ノックダウン結果
図７にＮＧＡＬ産生量の測定結果、図８にＭＭＰ−９産生量の測定結果を示す。明らかにｓｉＲＮＡによってＮＧＡＬ産生が抑制されることが確認できた。
【0032】
（２−２）ＮＧＡＬ遺伝子ノックダウンによる基底膜タンパク質の産生量測定結果図９にＩＶ型コラーゲンの測定結果を示す。
いずれの基底膜タンパク質も顕著に産生が抑制されていた。
【0033】
（３）ＮＧＡＬ刺激による基底膜タンパク質の産生促進試験（３−１）ＮＧＡＬ存在下での細胞培養
ＮＨＥＫ細胞をｒｈＮＧＡＬ存在下で４８時間培養した。ＮＨＥＫ細胞は、１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌの密度で直径３５ｍｍ組織培養ウェルを用いて、５０％コンフルエントになるまで培養した。次いで、ｒｈＮＧＡＬを無血清培地に溶解させた培養液に交換した。また比較のため、コントロールとして無血清培地のみの培地に交換したものを、同様に培養を行った。なお培養液中のＮＧＡＬ濃度は０．１、１．０、１０ｎｇ／ｍｌとした。また培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気とした。
培養用終了後、培養上清中の培養上清中のＩＶ型コラーゲンをウエスタンブロッティング法により測定した。なお測定は前記のルミノ・イメージアナライザーで行った。
【0034】
（３−２）結果測定結果を図１０に示す。ＩＶ型コラーゲンは、ＮＧＡＬ濃度に対応して顕著に増加した。
以上の試験結果から、ＮＧＡＬ濃度の増加は基底膜タンパク質であるＩＶ型コラーゲンを増加させることが明らかとなった。基底膜タンパク質の増加は皮膚の粘弾性改善に関わっており、この点からもＮＧＡＬを皮膚の粘弾性の指標とすることは有用であることが裏付けられた。
またＮＧＡＬは濃度依存性の基底膜タンパク質産生促進作用を有することが判明した。したがってＮＧＡＬは基底膜タンパク質の産生促進剤として利用可能である。
【要約】
【課題】皮膚の粘弾性を予測し、評価するための新しい指標を提供することを課題とする。また、この指標を用いた、皮膚の検査方法を提供することを課題とする。【解決手段】皮膚角層のＮＧＡＬの発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法。
【選択図】図３