特許 5866669 乳がん発症感受性の判定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5866669

(24)【登録日】2016年1月15日

(45)【発行日】2016年2月17日

(54)【発明の名称】乳がん発症感受性の判定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160204BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160204BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   !C12N15/00 A

【請求項の数】3

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2012-540681(P2012-540681)

(86)(22)【出願日】2011年10月26日

(86)【国際出願番号】JP2011005983

(87)【国際公開番号】WO2012056694

(87)【国際公開日】20120503

【審査請求日】2014年7月24日

(31)【優先権主張番号】特願2010-240189(P2010-240189)

(32)【優先日】2010年10月26日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、経済産業省、地域イノベーション創出研究開発事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(72)【発明者】

【氏名】末広 寛

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 功典

(72)【発明者】

【氏名】日野田 裕治

(72)【発明者】

【氏名】岡田 隆惠

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−０４８６６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting，２０１０年 ４月，Abstract 4720，<http://cancerres.aacrjournals.org/content/70/8_Supplement/4720.short>

【文献】 Carcinogenesis，２００７年，Vol.28, No.7，p.1442-1445

【文献】 遺伝子不安定性の機能解析及び遺伝子変異推測モデルの構築による乳癌卵巣癌ハイリスクキャリアーの同定と発，２０１０年 ５月，p.1-38

【文献】 Cytogenetic and Genome Research，２００８年，Vol.123, No.1-4，p.183-187

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトから得られた試料において、以下の２箇所のヒト染色体領域のＤＮＡコピー数の減少を検出することを特徴とする乳がん発症感受性の判定方法。
配列番号３で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）
配列番号４で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）

【請求項2】

ＤＮＡコピー数を定量ＰＣＲ法によって検出することを特徴とする請求項１記載の判定方法。

【請求項3】

以下の２箇所のヒト染色体領域のＤＮＡコピー数多型を検出するための、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん発症感受性の判定用キット。
配列番号３で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）
配列番号４で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト染色体領域におけるＤＮＡコピー数多型を検出することによる乳がん発症感受性を判定する方法や、判定用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

我が国では死亡原因の第一位はがんであり、その対策は国民の健康という観点から最重要課題となっている。がんの死亡率を低下させる基本的な解決法は、がんに罹患しないことであり、「がんの発症予防及びがんの早期発見」が重要であるといわれているが、がん発症感受性（がんになりやすい体質）の判定方法が十分確立されていないため、がんの発症予防（一次予防）より早期発見（二次予防）に重点をおいた診断及び治療が行われているのが現状である。このため、各人の各種がん発症感受性が予め判定することができれば、「生活習慣や生活環境」等の改善を含めた効果的ながんの発症予防ができるだけでなく、現行のがん検診を効率的かつ効果的に実施することができ、受診率の向上にも繋がることが期待される。

【0003】

乳がんについても、その進行度合いや発病の危険性の判定方法がいくつか提案されている。例えば、細胞や核の形態の観察だけでは見逃す可能性のある乳癌細胞の検出、手術のリンパ節の廓清の程度を決定する為のリンパ節における乳癌細胞の検出及び転移後の同様な判定と治療に用いることができる、生物学的試料中の内皮細胞特異的プロテインＣレセプター（ＥＰＣＲ）の存否を確認し、該物質の存在により陽性と判断することを特徴とする乳癌の判定方法（特許文献１参照）や、被検者から核酸を得て、前記核酸中の多型部位のヌクレオチドを決定する段階を含む４０歳以下または５５歳以上の被検者の乳がん診断方法（特許文献２参照）や、対象における乳癌または乳癌を発症する素因を診断する方法であって、患者由来の生物試料における乳癌関連遺伝子の発現のレベルを決定する段階を含み、該試料の発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇または低下していることによって、該対象が乳癌に罹患しているまたは乳癌を発症するリスクを有すると判定する方法（特許文献３参照）が提案されている。

【0004】

ＤＮＡコピー数多型（ＣＮＰ；copy number polymorphism）は、特定の染色体領域において、ＤＮＡが約１００ｋｂに渡って増幅又は欠失する状態があるとして２００４年に報告され、２００８年にはヒトのゲノムにはＤＮＡコピー数多型は約２０，０００カ所存在することが報告されている。ＤＮＡコピー数多型は、数千塩基対から数百万塩基対の配列のコピー数が、個人によって異なる現象である。遺伝子領域におけるＤＮＡコピー数多型により、通常ヒトの遺伝子は父母それぞれのゲノムに由来するものを１コピーずつ、あわせて２コピー受け継がれるが、個人によっては１細胞あたり、遺伝子が１コピーのみ、あるいは３コピー以上存在することが知られている。様々な薬の効きやすさや副作用の違いといった個人の体質差を生み出す原因として、１塩基多型（ＳＮＰ；Single Nucleotide Polymorphism）に代表される個人間の遺伝子の“塩基配列の違い”が広く知られていたが、最近ＤＮＡコピー数多型は遺伝子の“数の違い”の面から注目されてきている。

【0005】

本発明者らは、ＤＮＡコピー数多型を指標とした子宮内膜がんや大腸がんの発症感受性の判定方法を報告している（特許文献４参照）。しかし、乳がん発症感受性を判定できるＤＮＡコピー数多型についてはこれまで知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００３−４３０４６号公報

【特許文献2】特表２００８−５３１０４１号公報

【特許文献3】特開２００８−９２９４９号公報

【特許文献4】特開２００８−４８６６８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

乳がんは生活習慣を正すことで発がんリスクが下がること、また、定期的な検診によって早期発見・早期治療が可能となりがん死亡率が減少することが知られている。このため、乳がん発症感受性を判定することができれば、乳がんの発症リスクを下げる行動（スポーツなどの身体活動を行う、太らない、飲酒を控える）に対する強い動機づけと実践、がん検診を積極的に受けるという意識向上が期待できる。その結果、がんの予防実現や、たとえがんを発症したとしても早期発見・早期治療を可能とし、がん死亡率を大幅に減少させうる。乳がんの中でも、遺伝性乳がんのリスク予測にはＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２遺伝子が知られているが、遺伝性乳がん以外の孤発性乳がんについては発がんリスクを高精度に予測可能なＤＮＡ領域はこれまで見つかっていなかった。本発明の課題は、乳がんに対する感受性に関連したＤＮＡコピー数多型を同定し、該ＤＮＡコピー数多型の増減を基にした乳がん発症感受性の判定方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、末梢血由来ＤＮＡを用いたマイクロアレイ法により、乳がん患者に特徴的なＤＮＡコピー数多型を世界で初めて同定した。続いて、ＤＮＡコピー数多型領域のコピー数増減から乳がん発症体質を高精度、簡便、安価に検証できないかと考え、定量ＰＣＲ法による解析を行った。本発明者らは、定量ＰＣＲ法では、マイクロアレイ法により同定した染色体領域のうち、特定の領域に絞って検出している。すなわち、マイクロアレイ法よりも狭い染色体領域を検出している。また、単独のＣＮＰ領域よりも、複数ＣＮＰ領域の組み合わせにより、感度および特異度が向上する可能性があるため、複数ＣＮＰの組み合わせによる乳がん発症体質予測も試みた。
マイクロアレイ法に用いた検体数よりも６倍以上多い検体数を用いて定量ＰＣＲ法を行い、乳がん発症体質との関連性を検証したところ、例えばプライマーセット（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ）を用いて検出した染色体領域（１５ｑ２６．３ ［９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５］）のＤＮＡコピー数減少（コピー数１．５未満）の頻度は健常者群では２５．９％であるのに対して、乳がん患者群では７６．７％であり、オッズ比９．４であることがわかった。すなわち、この領域にＤＮＡコピー数減少がある場合、乳がんになりやすいことを見出した。同様に、プライマーセット（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ）を用いて検出した染色体領域（１５ｑ２６．３ ［９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３］）のＤＮＡコピー数減少（コピー数０．５未満）の頻度は健常者群では１０．２％であるのに対して、乳がん患者群では２３．８％であり、オッズ比２．８であることもわかった。すなわち、この領域にＤＮＡコピー数減少がある場合、乳がんになりやすいことを見出した。さらに、かかる２つの領域の定量ＰＣＲ法による結果を基にした判別分析を行うと、乳がん患者群の中で「乳がん」と判定されるのは８３．９％（感度）であるのに対して、健常者群の中で「乳がんではない」と判定されるのは８１．０％（特異度）であった。すなわち、乳がん発症感受性の高精度な判定方法を見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち本発明は、（１）ヒトから得られた試料において、以下の２箇所のヒト染色体領域のＤＮＡコピー数の減少を検出することを特徴とする乳がん発症感受性の判定方法に関する。
配列番号３で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）
配列番号４で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）

【0011】

さらに本発明は、（２）ＤＮＡコピー数を定量ＰＣＲ法によって検出することを特徴とする上記（１）記載の判定方法に関する。
本発明のその他の態様としては、乳がん発症感受性を判定するためのデータを収集する方法や、乳がん治療の予後を予測するためのデータを収集する方法を挙げることができる。

【0013】

本発明はまた、（３）以下の２箇所のヒト染色体領域のＤＮＡコピー数多型を検出するための、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん発症感受性の判定用キットに関する。
配列番号３で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）
配列番号４で示される塩基配列からなる、
１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）

【発明の効果】

【0014】

本発明により、採取が容易な血液など正常な組織を材料にして、乳がんになりやすい体質（乳がん発症感受性［乳がん発症リスク］）を判定することが可能になるため、発症予防や早期発見に必要な定期検診等のがんの検診者の増加が期待される他、早期がんの段階で診断・治療をうける検診者が増えることや、これまで予測不可能とされてきた孤発性乳がんの判定も可能となり、乳がんによる死亡率を下げることが期待される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】「ＮＣＢＩ;February 2009 human reference sequence（Build ３７．１）」のヒト染色体位置情報に基づいた染色体１ｐ３６．１２において、プライマーセット（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出する乳がん発症感受性に関わるＤＮＡコピー数多型の染色体領域を示す図である。

【図2】「ＮＣＢＩ;February 2009 human reference sequence（Build ３７．１）」のヒト染色体位置情報に基づいた染色体３ｑ２６．１において、プライマーセット（Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出する乳がん発症感受性に関わるＤＮＡコピー数多型の染色体領域を示す図である。

【図3】「ＮＣＢＩ;February 2009 human reference sequence（Build ３７．１）」のヒト染色体位置情報に基づいた染色体１５ｑ２６．３において、プライマーセット（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ、Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ、又はＨｓ０３８９８３３８＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出する乳がん発症感受性に関わるＤＮＡコピー数多型の染色体領域を示す図である。

【図4】「ＮＣＢＩ;February 2009 human reference sequence（Build ３７．１）」のヒト染色体位置情報に基づいた染色体２２ｑ１２．３において、プライマーセット（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎ又はＨｓ０４０９０８９８＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出する乳がん発症感受性に関わるＤＮＡコピー数多型の染色体領域を示す図である。

【図5】健常者群（Control）と乳がん患者群（Breast cancer）において、プライマーセット（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出したＤＮＡコピー数多型の結果を示す図である。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。点線は、カットオフ値を示す。○は各症例でのコピー数を示す。

【図6】健常者群（Control）と乳がん患者群（Breast cancer）において、プライマーセット（Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出したＤＮＡコピー数多型の結果を示す図である。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。点線は、カットオフ値を示す。○は各症例でのコピー数を示す。

【図7】健常者群（Control）と乳がん患者群（Breast cancer）において、プライマーセット（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出したＤＮＡコピー数多型の結果を示す図である。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。点線は、カットオフ値を示す。○は各症例でのコピー数を示す。

【図8】健常者群（Control）と乳がん患者群（Breast cancer）において、プライマーセット（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出したＤＮＡコピー数多型の結果を示す図である。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。点線は、カットオフ値を示す。○は各症例でのコピー数を示す。

【図9】健常者群（Control）と乳がん患者群（Breast cancer）において、プライマーセット（Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出したＤＮＡコピー数多型の結果を示す図である。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。点線は、カットオフ値を示す。○は各症例でのコピー数を示す。

【図10】健常者群（Control）と乳がん患者群（Breast cancer）において、プライマーセット（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出したＤＮＡコピー数多型の結果を示す図である。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。点線は、カットオフ値を示す。○は各症例でのコピー数を示す。

【図11】健常者群（Control）と乳がん患者群（Breast cancer）において、プライマーセット（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎ）を用いた定量ＰＣＲ法により検出したＤＮＡコピー数多型の結果を示す図である。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。点線は、カットオフ値を示す。○は各症例でのコピー数を示す。

【図12】図５及び１０で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図13】図５及び１１で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図14】図５及び７で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図15】図５及び９で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図16】図５及び６で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図17】図５及び８で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図18】図１０及び１１で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図19】図７及び１０で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図20】図８及び１０で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図21】図９及び１０で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図22】図６及び１０で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図23】図７及び１１で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図24】図８及び１１で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図25】図９及び１１で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図26】図６及び１１で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図27】図７及び８で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図28】図７及び９で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図29】図６及び７で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図30】図８及び９で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図31】図６及び８で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【図32】図６及び９で得られた結果を基に、判別分析を行った結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明の乳がん発症感受性の判定方法としては、上記［Ａ群］におけるヒト染色体領域から少なくとも１つ以上のＤＮＡコピー数多型を検出する方法や、上記［Ｂ群］におけるヒト染色体領域から少なくとも１つ以上のＤＮＡコピー数の減少、及び／又は上記［Ｃ群］におけるヒト染色体領域から少なくとも１つ以上のＤＮＡコピー数の増加を検出する方法（但し、医師による診断行為を除く。）であれば特に制限されず、また、本発明の乳がん発症感受性の判定用キットとしては、上記［Ａ群］におけるヒト染色体領域から少なくとも１つ以上のＤＮＡコピー数多型を検出するための、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えるキットや、上記［Ｂ群］及び／又は［Ｃ群］におけるヒト染色体領域から少なくとも１つ以上のＤＮＡコピー数多型を検出するための、プライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えるキットであれば特に制限されず、ここで「ＤＮＡコピー数多型」とは、１細胞あたりのゲノムＤＮＡコピー数が、染色体の特定の領域で２コピーよりコピー数が増加又は減少している状態のことをいい、「ＤＮＡコピー数多型を検出する」とは、ＤＮＡコピー数の増減の程度及びＤＮＡコピー数多型の頻度を検出することをいい、「ＤＮＡコピー数多型」の中には「遺伝子コピー数多型」も含まれる。

【0017】

上記［Ａ群］、［Ｂ群］及び［Ｃ群］におけるヒト染色体領域は、「ＮＣＢＩ；March 2006 human reference sequence（Build ３６．１）」のヒト染色体位置情報に基づいており、バージョンの更新等によりかかるヒト染色体位置情報に変更があった場合には、対応する染色体領域を適宜選択することができる。

【0018】

上記［Ａ群］におけるヒト染色体領域から１つの領域のＤＮＡコピー数多型を検出することで乳がん発症感受性を判定することもできるが、判定の精度を高めるために、２つ以上の領域、好ましくは３つ以上の領域、より好ましくは５つ以上の領域のＤＮＡコピー数多型を検出することもでき、これらのように複数の領域のＤＮＡコピー数多型を検出する場合、ハイスループットで検出できるため、マイクロアレイ法を用いることが好ましい。また、ＤＮＡコピー数多型のコピー数の増減をより正確に検出するために、［Ａ群］におけるヒト染色体領域から選ばれる特定の領域又はその近傍の領域である、［Ｂ群］や［Ｃ群］におけるヒト染色体領域を判定対象とすることが好ましい。［Ａ群］におけるヒト染色体領域とその近傍の領域との差は、１０ｋｂ（キロ塩基長）以内が好ましく、より好ましくは５ｋｂ以内、特に２ｋｂ以内を好適に例示することができる。

【0019】

上記ＤＮＡコピー数多型を検出する方法としては、ヒト血液又はヒト組織を検出試料として用い、例えばマイクロアレイ法、定量ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＦＩＳＨ（Fluorescence in situ hybridization）法、ＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法等により検出する方法を挙げることができるが、ハイスループットで検出する場合、マイクロアレイ法が好ましく、ＤＮＡコピー数多型の増減を高精度に検出する場合、定量ＰＣＲ法が好ましい。

【0020】

上記マイクロアレイ法に用いられるマイクロアレイ（マイクロチップ）は、ヒト染色体断片からなるプローブが支持体上の定められた領域に固定されているマイクロアレイ（マイクロチップ）であり、マイクロアレイ（マイクロチップ）の支持体としては、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであればよく、例えばガラス、シリコン、プラスチックなどの基板や、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等を好適に用いることができる。かかるマイクロアレイ（マイクロチップ）は、当業者に公知の任意の方法で製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、Roche社製の２．１Ｍ Ａｒｒａｙ（登録商標）、Macrogen社製のＭＡＣ Ａｒｒａｙ（登録商標）、SPECTRAL GENOMICS社製のＳｐｅｃｔｒａｌＣｈｉｐ（登録商標）等の市販品を挙げることができ、これらの中でもRoche社の２．１Ｍ Ａｒｒａｙを好適に例示することができる。

【0021】

上記ハイブリダイゼーションとしては、例えばＣｙ−３、Ｃｙ−５等の蛍光物質であらかじめ標識した染色体ＤＮＡと、マイクロアレイ（マイクロチップ）表面上に固定されたプローブとが、ハイブリダイゼーションできればよく、ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning A laboratory manual）、第２版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）等から適宜選択することができる。

【0022】

上記定量ＰＣＲ法としては、例えば競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等を挙げることができるが、汎用性に優れているため、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法における増幅されるＤＮＡを検出する方法としては、蛍光色素を結合させたプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）を用いたＴａｑＭａｎ法（特許第２８２５９７６号）や、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉなどのインターカレーターを用いたインターカレーター法等を挙げることができるが、プライマーによる特異性にプローブによる特異性が加わり特異性がより高いため、ＴａｑＭａｎ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法は、通常のサーマルサイクラー及び分光蛍光光度計が一体化されたリアルタイムＰＣＲ専用装置を用いて実施することができる。

【0023】

本発明の乳がん発症感受性の判定方法において、ＤＮＡコピー数を定量ＰＣＲ法によって検出するために用いるプライマーセットとしては、検出する染色体領域を増幅できるプライマーセットであれば、プライマー配列の長さ、ヒト染色体領域とアニーリングする部位等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。上記［Ｂ群］及び［Ｃ群］における染色体領域を検出するために、例えば、Applied Biosystems社製のプライマーセットを、Applied Biosystems社のホームページ（http://www5.appliedbiosystems.com/tools/cnv/）等から製品番号を検索し、注文することにより入手することができ、「１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）（配列番号１）」を検出するプライマーセットとして「Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎ」を、「３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）（配列番号２）」を検出するプライマーセットとして「Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎ」を、「１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）（配列番号３）」を検出するプライマーセットとして「Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ」を、「１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）（配列番号４）」を検出するプライマーセットとして「Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ」を、「１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）（配列番号５）」を検出するプライマーセットとして「Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎ」を、「２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）（配列番号６）」を検出するプライマーセットとして「Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎ」を、「２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）（配列番号７）」を検出するプライマーセットとして「Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎ」を、具体的に挙げることができる。

【0024】

上記ＬＡＭＰ法としては、特定の遺伝子領域を増幅するための複数のプライマー、鋳型ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰ等を混合し、一定温度（６５℃付近）で一定時間反応させ、反応液の濁度により増幅を検出する方法を挙げることができる。

【0025】

上記ＦＩＳＨ法としては、染色体標本の標的とするゲノム領域に、ハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列を有するプローブをＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）、ＴＲＩＴＣ（Tetramethyl rhodamin isothiocyanate）、ＣｙＤｙｅ（登録商標）などの蛍光物質で標識したプローブＤＮＡと、染色体領域とをハイブリダイゼーションさせ、それにより得られる蛍光シグナルの数量を蛍光顕微鏡下で計数する手法を挙げることができる。また、標的とする対象領域と同一染色体上に存在するＤＮＡに対しては、プローブを異なる蛍光で標識し、同時にハイブリダイゼーションを行うと、コピー数異常をより正確に評価することが可能となる。

【0026】

上記ＳＭＡＰ法としては、特定の遺伝子領域を増幅するための複数のプライマー、鋳型ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰ等を混合し、一定温度（６０℃付近）で一定時間反応させ、反応液の蛍光強度により増幅を検出する方法を挙げることができる。

【0027】

乳がん発症感受性の判定方法の精度を高めるために、上記［Ｂ群］及び／又は［Ｃ群］から２つ以上の領域を選択し、判別分析を行うことが好ましく、費用対効果や作業効率を考慮した場合、２つの領域を選択して判別分析を行うことが好ましく、選択する２つの領域の組合せとしては、配列番号１で示される塩基配列からなる、１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）と、配列番号２で示される塩基配列からなる、３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）との組合せや、配列番号１で示される塩基配列からなる、１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）と、配列番号６で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）との組合せや、配列番号１で示される塩基配列からなる、１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）と、配列番号７で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）との組合せや、配列番号３で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）と、配列番号２で示される塩基配列からなる、３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）との組合せや、配列番号３で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）と、配列番号６で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）との組合せや、配列番号３で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）と、配列番号７で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）との組合せや、配列番号４で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）と、配列番号２で示される塩基配列からなる、３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）との組合せや、配列番号４で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）と、配列番号６で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）との組合せや、配列番号４で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）と、配列番号７で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）との組合せや、配列番号５で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）と、配列番号２で示される塩基配列からなる、３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）との組合せや、配列番号５で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）と、配列番号６で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）との組合せや、配列番号５で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）と、配列番号７で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）との組合せや、配列番号１で示される塩基配列からなる、１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）と、配列番号３で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）との組合せや、配列番号１で示される塩基配列からなる、１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）と、配列番号４で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）との組合せや、配列番号１で示される塩基配列からなる、１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）と、配列番号５で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）との組合せや、配列番号３で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）と、配列番号４で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）との組合せや、配列番号３で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）と、配列番号５で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）との組合せや、配列番号４で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）と、配列番号５で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）との組合せや、配列番号２で示される塩基配列からなる、３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）と、配列番号６で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）との組合せや、配列番号２で示される塩基配列からなる、３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）と、配列番号７で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）との組合せや、配列番号６で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）と、配列番号７で示される塩基配列からなる、２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）との組合せを挙げることができ、これらの中でも、配列番号３で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５）と、配列番号４で示される塩基配列からなる、１５ｑ２６．３ ［９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３］との組合せが好ましい。

【0028】

上記判別分析としては、あらかじめどのサンプル（検出試料）がどの群（健常者群又は乳がん患者群）に属すのかというデータをもとに、どの群に属すのかわからないサンプルがどの群に属すのかを判別する関数（判別関数）を求める手法であれば制限されず、判別関数のうち、線形判別関数として、例えば超平面・直線による判別関数等を挙げることができ、非線形判別関数として、例えば超曲面・曲線によるマハラノビス氾距離による判別関数等を挙げることができる。

【0029】

上記［Ａ群］に含まれる、以下の［Ａ−１群］におけるヒト染色体領域から、少なくとも１つ以上選択して、判定対象と対照となる健常者のＤＮＡコピー数多型をそれぞれ検出し、両ＤＮＡコピー数を比較して、判定対象にＤＮＡコピー数の増加が有意に認められた場合、あるいは、上記［Ａ群］に含まれる、以下の［Ａ−２群］におけるヒト染色体領域から、少なくとも１つ以上選択して、判定対象と対照となる健常者のＤＮＡコピー数多型をそれぞれ検出し、両ＤＮＡコピー数を比較して、判定対象にＤＮＡコピー数の減少が有意に認められた場合、判定対象の乳がん発症感受性（乳がん発症リスク）が高いと判定することができる。
［Ａ−１群］
１ｑ４４ （２４６，８５５，９４７−２４６，８５７，１０１）
１ｑ４４ （２４６，８５７，１０１−２４６，８５８，２６６）
２２ｑ１２．３ （３５，４７４，２０２−３５，４７７，７０１）
［Ａ−２群］
２ｐ１６．３ （５２，６０３，４８８−５２，６０５，５０２）
２ｐ１６．３ （５２，６０５，５０２−５２，６０６，６４５）
２ｐ１６．３ （５２，６０６，６４５−５２，６２５，５２８）
２ｐ１６．３ （５２，６２５，５２８−５２，６３４，９７２）
２ｐ１６．３ （５２，６３６，０７９−５２，６３６，９０１）
３ｑ２６．１ （１６３，６９８，３９９−１６３，７１４，９５７）
３ｑ２６．１ （１６３，７１４，９５７−１６３，７１６，８８０）
３ｑ２６．１ （１６３，７１６，８８０−１６３，７１８，２９２）
６ｐ２５．３ （２５６，３６４−３０７，２２０）
６ｐ２５．３ （３０７，２２０−３２４，８７７）
７ｐ１３ （４３，９６８，８１３−４３，９６９，９８９）
７ｐ１３ （４３，９６９，９８９−４３，９７３，９１７）
７ｐ１３ （４４，０３３，２９２−４４，０４６，９４４）
７ｐ１３ （４４，９６５，４０１−４４，９６６，２８８）
８ｐ１１．２３−ｐ１１．２２ （３９，３５１，５９８−３９，３５２，９６８）
８ｐ１１．２３−ｐ１１．２２ （３９，３５２，９６８−３９，５０５，３１６）
８ｐ１１．２３−ｐ１１．２２ （３９，５０５，３１６−３９，５０６，７０３）
１５ｑ２５．２ （８０，７００，０１２−８０，７０３，０５５）
１５ｑ２５．２ （８０，７０３，０５５−８０，７０４，２３９）
１６ｐ１３．３ （１，３７４，２４５−１，３８６，９２８）
１６ｐ１３．３ （１，４０９，６３５−１，４５１，１４５）
１６ｐ１３．３ （２，５３０，８５６−２，５３１，９１７）
１６ｐ１３．３ （４，６８８，２７８−４，６８９，４１０）
１７ｐ１１．２ （１８，８６４，１１４−１８，８６６，６８４）
１７ｑ１２ （３３，５９３，６２４−３３，６０６，１００）
２２ｑ１１．２１ （１８，６９８，４４９−１８，７０１，７３４）
２２ｑ１１．２１ （１８，７０８，８６３−１８，７１８，１０４）
２２ｑ１１．２１ （１８，７４４，４８５−１８，７５１，６４８）
２２ｑ１１．２１ （１８，７５１，６４８−１８，７５７，０１５）
２２ｑ１１．２１ （１８，７６３，２４７−１８，７６４，３７５）
２２ｑ１１．２１ （１８，７６４，３７５−１８，７６６，６０８）
２２ｑ１１．２１ （１８，７６６，６０８−１８，７６７，９０９）
２２ｑ１１．２１ （１８，７６７，９０９−１８，８０３，３０４）
２２ｑ１１．２１ （１８，８５１，６５０−１８，８５４，８５３）
２２ｑ１１．２１ （１８，８６１，０３５−１８，８６２，７５７）
２２ｑ１１．２１ （２０，１２９，７３３−２０，１３２，５５３）
２２ｑ１１．２１ （２０，１３９，３６７−２０，１４０，４７８）
２２ｑ１１．２１ （２０，１４２，３１６−２０，１４３，９２９）
２２ｑ１１．２１ （２０，１５７，４２７−２０，１５８，５０７）
２２ｑ１１．２１ （２０，１５８，５０７−２０，１６３，７５９）
２２ｑ１１．２１ （２０，１６３，７５９−２０，１６６，９３８）
２２ｑ１１．２１ （２０，１６６，９３８−２０，１８９，９１５）
２２ｑ１１．２１ （２０，１８９，９１５−２０，１９４，５８３）
２２ｑ１１．２１ （２０，１９４，５８３−２０，１９８，７８０）
２２ｑ１１．２１ （２０，１９８，７８０−２０，２０６，０３０）
２２ｑ１１．２１ （２０，２０６，０３０−２０，２３３，４６２）
２２ｑ１１．２１ （２０，２３３，４６２−２０，２３９，３６７）
２２ｑ１１．２１ （２０，２３９，３６７−２０，２４３，２２０）
２２ｑ１１．２１ （２０，２４３，２２０−２０，２４４，３０１）
Ｘｑ２６．３ （１３４，６８６，７６８−１３４，７１０，７２１）
Ｘｑ２６．３ （１３４，７１５，８２６−１３４，７１８，２７７）

【0030】

また、上記［Ａ群］に含まれる、以下の［Ａ−３群］におけるヒト染色体領域から、少なくとも１つ以上選択して、判定対象と対照となる健常者のＤＮＡコピー数多型をそれぞれ検出し、両ＤＮＡコピー数を比較して、判定対象にＤＮＡコピー数の増加が有意に認められた場合、あるいは、上記［Ａ群］に含まれる、以下の［Ａ−４群］におけるヒト染色体領域から、少なくとも１つ以上選択して、判定対象と対照となる健常者のＤＮＡコピー数多型をそれぞれ検出し、両ＤＮＡコピー数を比較して、判定対象にＤＮＡコピー数の減少が有意に認められた場合、判定対象の乳がん発症感受性（乳がん発症リスク）が低いと判定することができる。
［Ａ−３群］
２ｐ１６．３ （５２，６０３，４８８−５２，６０５，５０２）
２ｐ１６．３ （５２，６０５，５０２−５２，６０６，６４５）
２ｐ１６．３ （５２，６０６，６４５−５２，６１１，９６５）
２ｐ１６．３ （５２，６１１，９６５−５２，６２０，１５３）
２ｐ１６．３ （５２，６２０，１５３−５２，６２２，５４３）
２ｐ１６．３ （５２，６２２，５４３−５２，６３６，９０１）
２ｐ１６．３ （５２，６３６，９０１−５２，６３８，２２３）
２ｑ２４．３ （１６５，５４４，５７６−１６５，５６３，４２０）
３ｑ２６．１ （１６３，７０１，８６２−１６３，７０５，２２３）
７ｑ３１．１ （１０９，２４０，１４５−１０９，２４１，２６０）
９ｐ１１．２ （４３，７５２，２４８−４３，７５４，４４６）
９ｑ１２−ｑ１３ （６９，９５０，６２６−７０，０００，４１６）
９ｑ１２−ｑ１３ （７０，０００，４１６−７０，０２６，２４６）
１５ｑ１１．２ （１９，０５４，９６７−１９，０５５，８６３）
１５ｑ１１．２ （２０，０８１，４０６−２０，０９１，５８１）
１５ｑ１１．２ （２０，０９１，５８１−２０，１４６，２００）
２２ｑ１１．１ （１４，５２９，１７７−１４，５５１，３０６）
［Ａ−４群］
１ｐ３６．１２ （２１，３７３，５５９−２１，３７４，４３７）
１ｐ３６．１２ （２１，３７４，４３７−２１，３７６，９２９）
１ｐ３６．１２ （２１，３７６，９２９−２１，３７８，０６８）
８ｐ２３．１ （７，３３１，１５１−７，３６６，８９４）
８ｐ２３．１ （７，３８４，４８２−７，３８５，７１７）
８ｐ２３．１ （７，３８５，７１７−７，６７５，６４４）
８ｐ２３．１ （７，６７５，６４４−７，６７７，００３）
８ｐ２３．１ （７，７２９，３１０−７，７５６，２２２）
８ｐ２３．１ （７，７６６，３０８−７，７８５，９６４）
８ｐ２３．１ （７，７８９，３１６−７，７９６，８８１）
８ｐ２３．１ （７，７９６，８８１−７，８０４，８４３）
８ｐ２３．１ （７，８０４，８４３−７，８１２，７２５）
１０ｐ１２．３１ （２２，６４４，９９２−２２，６４６，１３２）
１０ｐ１２．３１ （２２，６４６，１３２−２２，６４７，０５０）
１０ｐ１２．３１ （２２，６４８，３５６−２２，６５４，９１７）
１０ｐ１２．３１ （２２，６５４，９１７−２２，６５６，０５７）
１０ｑ２１．３ （６６，９７７，０５９−６６，９８２，３７９）
１１ｑ１３．１ （６４，２９８，８８３−６４，２９９，７９１）
１１ｑ１３．１ （６４，２９９，７９１−６４，３００，７０５）
１１ｑ１３．１ （６４，３００，７０５−６４，３０３，７７５）
１１ｑ１３．１ （６４，３０３，７７５−６４，３０５，０７５）
１１ｑ１３．１ （６４，３０５，０７５−６４，３０９，７５２）
１１ｑ１３．１ （６４，３０９，７５２−６４，３１０，５０７）
１５ｑ２６．３ （９９，８４７，２２９−９９，８４８，３６１）
１５ｑ２６．３ （９９，８４８，３６１−９９，８５１，９１０）
１６ｐ１２．１ （２２，５８７，７９０−２２，５９０，３１７）
１６ｐ１２．１ （２２，６０２，２００−２２，６０５，９０４）
１６ｐ１２．１ （２２，６０５，９０４−２２，６１０，５２５）
１６ｐ１２．１ （２２，６１２，７４６−２２，６１４，７１１）
１７ｑ２１．３１ （３９，７８６，１４３−３９，７８９，７８１）
１７ｑ２１．３１ （３９，７８９，７８１−３９，７９１，４７５）
１９ｑ１３．３３ （５５，７６９，６２６−５５，７７４，３０６）
１９ｑ１３．４２ （６０，５７９，２７６−６０，５８１，１３０）
１９ｑ１３．４２ （６０，５８１，１３０−６０，５８２，６６６）
１９ｑ１３．４２ （６０，５８２，６６６−６０，５８８，２３７）
１９ｑ１３．４２ （６０，５８８，２３７−６０，５８９，１６０）
１９ｑ１３．４２ （６０，５８９，１６０−６０，５８９，９６９）
１９ｑ１３．４２ （６０，５９７，１２２−６０，５９８，６３８）
１９ｑ１３．４２ （６０，５９８，６３８−６０，５９９，７７２）
１９ｑ１３．４２ （６０，５９９，７７２−６０，６０１，００９）
２２ｑ１２．３ （３５，４７２，９０４−３５，４７４，２０２）

【0031】

また、上記［Ｂ群］におけるヒト染色体領域から少なくとも１つ以上選択して、判定対象と対照となる健常者のＤＮＡコピー数多型をそれぞれ検出し、両ＤＮＡコピー数を比較して、判定対象にＤＮＡコピー数の減少が有意に認められた場合、あるいは、上記［Ｃ群］におけるヒト染色体領域から少なくとも１つ以上選択して、判定対象と対照となる健常者や乳がん患者のＤＮＡコピー数多型をそれぞれ検出し、両ＤＮＡコピー数を比較して、判定対象にＤＮＡコピー数の増加が有意に認められた場合、判定対象の乳がん発症感受性（乳がん発症リスク）が高いと判定することができる。なお、本発明における、乳がん発症感受性を判定するためのデータを収集する方法や乳がん治療の予後を予測するためのデータを収集する方法には、判定対象と対照となる健常者のＤＮＡコピー数多型の検出結果をデータとして収集する工程が含まれる。

【0032】

本発明の乳がん発症感受性の判定用キットにおけるプライマーセットとしては、［Ａ群］におけるヒト染色体領域の上流及び下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマーセットであれば、プライマー配列の長さ、該ヒト染色体領域とアニーリングする部位、増幅するＤＮＡの長さ等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。上記プライマーセットがアニーリングする染色体領域としては、［Ａ群］におけるヒト染色体領域から選ばれる特定の領域又はその近傍の領域である、［Ｂ群］や［Ｃ群］におけるヒト染色体領域を判定対象とすることが好ましい。

【0033】

本発明の乳がん発症感受性の判定用キットにおけるプローブとしては、［Ａ群］におけるヒト染色体領域の全部又は一部がハイブリダイゼーションするプローブであればよい。上記プローブがハイブリダイゼーションする染色体領域としては、［Ａ群］におけるヒト染色体領域から選ばれる特定の領域やその近傍の領域である、［Ｂ群］や［Ｃ群］を判定対象とすることが好ましい。上記プローブの標識としては、例えばビオチン、蛍光、^３２Ｐ等を挙げることができる。

【0034】

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0035】

１．マイクロアレイによる乳がん発症感受性に関わるＤＮＡコピー数多型領域の同定
１−１ 材料
〔１〕３０名の健常女性末梢血より抽出したＤＮＡ３０検体（健常者群）
〔２〕３０名の孤発性乳がん患者末梢血より抽出したＤＮＡ３０検体（乳がん患者群）
〔３〕３０名の健常女性末梢血より抽出したＤＮＡを１本のチューブにまとめたプールＤＮＡ（リファレンスＤＮＡ）

【0036】

１−２ 方法
１−２−１ ＤＮＡの蛍光標識（Nimblegen Dual-Color DNA Labeling Kit[Roche社]を製品プルトコルに準拠し使用）
あらかじめ、Cy3-Random Nonamer及びCy5-Random Nonamer中に、それぞれRandom Primer Buffer９９８．２５μｌ並びにβメルカプトエタノール１．７５μｌを入れて希釈する。

【0037】

（１）テストＤＮＡの標識
〔１〕２本の０．５ｍｌチューブを用意し、各チューブ内に以下を入れる。
テストＤＮＡ１μｇ（乳がん患者あるいは健常女性末梢血由来ＤＮＡ）
希釈済みCy-3-Random Nonamers ４０μｌ
Nuclease-free水を加えて全量８０μｌとする。
〔２〕９８℃１０分インキュベーション後、氷上で２分インキュベーションする。
〔３〕各チューブに以下の試薬類を加える。
１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １０μｌ
Nuclease-free水 ８μｌ
５０Ｕ／μｌ Klenow Fragment ２μｌ
〔４〕３７℃で一晩インキュベーション。
〔５〕各チューブにStop Solution（０．５Ｍ ＥＤＴＡ）１０μｌを加える。
〔６〕各チューブに５Ｍ ＮａＣｌ１１．５μｌを加える。
〔７〕各チューブにイソプロパノール１１０μｌを加える。
〔８〕２本のチューブ内容物を１本の１．５ｍｌチューブ内にまとめる。
〔９〕よく混ぜた後、室温で１０分間インキュベーション。
〔１０〕１２，０００ｇで１０分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔１１〕各チューブに冷やした８０％エタノール５００μｌを加えて、１２，０００ｇで２分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔１２〕遮光下で自然乾燥させＤＮＡをペレット化する。
〔１３〕−２０℃で保存。

【0038】

（２）リファレンスＤＮＡの標識
〔１〕２本の０．５ｍｌチューブを用意し、各チューブ内に以下を入れる。
リファレンスＤＮＡ１μｇ（３０名の健常女性末梢血由来プールＤＮＡ）
希釈済みCy-5-Random Nonamers４０μｌ
Nuclease-free水を加えて全量８０μｌとする。
〔２〕９８℃１０分インキュベーション後、氷上で２分インキュベーション。
〔３〕各チューブに以下の試薬を加える。
１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １０μｌ
Nuclease-free水 ８μｌ
５０Ｕ／μｌ Klenow Fragment ２μｌ
〔４〕３７℃で一晩インキュベーション。
〔５〕各チューブにStop Solution（０．５Ｍ ＥＤＴＡ）１０μｌを加える。
〔６〕各チューブに５Ｍ ＮａＣｌ１１．５μｌを加える。
〔７〕各チューブにイソプロパノール１１０μｌを加える。
〔８〕２本のチューブ内容物を１本の１．５ｍｌチューブ内にまとめる。
〔９〕よく混ぜた後、室温で１０分間インキュベーション。
〔１０〕１２，０００ｇで１０分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔１１〕各チューブに冷やした８０％エタノール５００μｌを加えて、１２，０００ｇで２分間遠心後、上澄みをピペットで吸って除去する。
〔１２〕遮光下で自然乾燥させＤＮＡをペレット化する。
〔１３〕−２０℃で保存。

【0039】

１−２−２ ハイブリダイゼーション
〔１〕各ペレットに２０μｌの精製水を加えて２０分間静置後、ボルテックスをかける。
〔２〕ＤＮＡ濃度を測定する。
〔３〕以下を０．５ｍｌチューブ内に入れる。
蛍光標識されたテストＤＮＡ ３４μｇ
蛍光標識されたリファレンスＤＮＡ ３４μｇ
精製水を加えて全量を１２．３μｌとする。
〔４〕NimbleGen Hybridization Kit（Roche社製）の以下の試薬を０．５ｍｌチューブ内に入れる。
2X Hybridization Buffer ２９．５μｌ
Hybridization Component A １１．８μｌ
Alignment Oligo １．２μl
〔５〕〔３〕の溶液中に、〔４〕の溶液３１．７μｌを加える。
〔６〕９５℃５分インキュベーションの後、４２℃で５分以上インキュベーションする。
〔７〕２．１Ｍ array（Roche社製）にNimblegen HX1 Mixer（Roche社製）をセットし、４２℃のヒートブロック上に静置。
〔８〕〔５〕の溶液４１μｌを２．１Ｍ arrayに注入する。
〔９〕Nimblegen hybridization system（Roche社製）に２．１Ｍ arrayスライドをセットし、７２時間ハイブリダイゼーションを行う。

【0040】

１−２−３ 洗浄（NimbleGen Wash Buffer Kit及びNimbleGen Array Processing Accessories（Roche社製）を使用）
〔１〕洗浄液１、２及び３を作製する。
１）洗浄液１（２セット）
水（ＶＷＲ社製） ２２５ｍｌ
10X Wash Buffer Ｉ ２５ｍｌ
１Ｍ ＤＴＴ ２５μｌ
２）洗浄液２（１セット）
水（ＶＷＲ社製）２２５ｍｌ
10X Wash Buffer ＩＩ ２５ｍｌ
１Ｍ ＤＴＴ ２５μｌ
３）洗浄液３（１セット）
水（ＶＷＲ社製） ２２５ｍｌ
10X Wash Buffer ＩＩＩ ２５ｍｌ
１Ｍ ＤＴＴ ２５μｌ
〔２〕４０℃に温めた洗浄液１に２．１Ｍ arrayを浸し、Nimblegen HX1 Mixerを取り除く。
〔３〕２．１Ｍ arrayを洗浄液１中で１０〜１５秒間揺らして、hybridization bufferを除去する。
〔４〕２．１Ｍ arrayを洗浄液１（室温）中で２分間しっかり揺らして洗浄する。
〔５〕２．１Ｍ arrayを洗浄液２（室温）中で１分間しっかり揺らして洗浄する。
〔６〕２．１Ｍ arrayを洗浄液３（室温）中で１５秒間しっかり揺らして洗浄する。
〔７〕遠心器にてスライドを乾燥させる。

【0041】

１−２−４ アレイスライドのスキャニング及びデータ解析
〔１〕マイクロアレイスキャナGenePix 4000B（Axon instruments社製）に２．１Ｍ arrayをセットしアレイの蛍光スキャニングを行う。
〔２〕取得した蛍光画像ファイルをNimbleScan v2.5ソフトウェア（Roche社製）にて解析を行い、２．１Ｍ arrayにおける各プローブの蛍光強度情報を得る。
〔３〕Nexus copy numberソフトウェア（version5、BioDiscovery社製）にて健常者及び乳がん患者におけるコピー数多型領域を比較し、乳がん発症に関わるＣＮＰ領域を同定する。

【実施例2】

【0042】

２．定量ＰＣＲによる検証試験
マイクロアレイで得られたデータを基に、定量ＰＣＲにて１ｐ３６．１２、３ｑ２６．１，１５ｑ２６．３及び２２ｑ１２．３領域のＣＮＰを評価した。なお、コントロールとして、１４番染色体のリボヌクレアーゼＰ（RNase P）（配列番号８）遺伝子領域のコピー数を定量した。

【0043】

２−１ 材料
〔１〕：健常女性末梢血より抽出したＤＮＡ２１６検体（健常者群）
〔２〕：乳がん患者（女性）末梢血より抽出したＤＮＡ１９３検体（乳がん患者群）
〔３〕：１−１〔３〕の３０名の健常女性末梢血由来プールＤＮＡ（リファレンスＤＮＡ）

【0044】

２−２ 方法
〔１〕以下の試薬類を加える。
５ｎｇ／μｌ ＤＮＡ ２μｌ
TaqMan Genotyping Master Mix（Applied Biopsystems社製） ５μｌ
TaqMan Copy Number Assayプローブ・プライマーセット（Applied Biopsystems社製） ０．５μｌ
TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P（Applied Biopsystems社製） ０．５μｌ
精製水 ２μｌ

【0045】

ＰＣＲプライマー及びプローブはApplied Biosystems社のホームページ（http://www5.appliedbiosystems.com/tools/cnv/）からプレデザイン製品を検索し、使用した。用いたTaqMan Copy Number Assayプローブ・プライマーセットは以下の表１、図１、図２、図３及び図４に示す（Applied biosystems社ホームページ〔http://www5.appliedbiosystems.com/tools/cnv/〕参照）。なお、定量ＰＣＲにより増幅した染色体領域の塩基配列は、以下の「〔３〕定量ＰＣＲ解析及びＰＣＲ増幅産物の塩基配列の同定」の項目で示す方法により同定した（表１、「ＰＣＲ増幅領域の塩基配列」参照）。同定した塩基配列を基に、定量ＰＣＲにより増幅した染色体領域を、ＮＣＢＩ；March ２００６ human reference sequence（Build ３６．１）をベースとした位置情報として示した（表１、「染色体領域」参照）。

【0046】

【表1】

【0047】

〔２〕定量ＰＣＲ
7900HT FastリアルタイムＰＣＲシステム(Applied Biopsystems社製)を用いて以下の表２に示すＰＣＲ反応を行った。

【0048】

【表2】

【0049】

〔３〕定量ＰＣＲ解析及びＰＣＲ増幅産物の塩基配列の同定
CopyCallerソフトウェア（Applied Biopsystems社製)にてTaqMan Copy Number Assayプローブ・プライマーセットのコピー数を解析した。リファレンスＤＮＡ（ＲＮａｓｅＰ、配列番号８）における当該TaqMan Copy Number Assayプローブ・プライマーセットのコピー数を２と仮設定し、テストサンプルにおける相対的コピー数を算出した。定量ＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物の塩基配列を同定するために、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）へクローニングした後、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列検出用サンプルを調製し、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製）にてＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。

【実施例3】

【0050】

３．結果
３−１ マイクロアレイ結果
乳がん患者群と健常者群において、〔１〕いずれかの群におけるコピー数変化の頻度が２５％以上であり〔２〕両群間のコピー数変化頻度に統計学的有意差があった（Ｆｉｓｈｅｒ検定でＰ値が０．０５未満）ＣＮＰ領域を以下の表３〜６に示す。

【0051】

【表3】

【0052】

【表4】

【0053】

【表5】

【0054】

【表6】

【0055】

表中の「オッズ比」とは、要因（ＤＮＡコピー数多型）と結果（乳がん）との関連を示す指標であり、オッズ比は０〜無限大に分布する。オッズ比が１より小さい場合、ＤＮＡコピー数多型を有する者を乳がん発症感受性が低いと判定することができ、オッズ比が１より大きい場合、ＤＮＡコピー数多型を有する者を乳がん発症感受性が高いと判定することができる。表３中の一番上のデータを例に示すと、染色体座位１ｑ４４の２４６，８５５，９４７−２４６，８５７，１０１領域（１，１５４塩基長）のコピー数増加の頻度が健常者群では３０例中８人（２６．７％）、乳がん患者群では３０人中１７人（５６．７％）であり、乳がん患者において当該領域コピー数増加が有意に高頻度に認められた（Ｐ＝０．０３５、オッズ比３．６）。このように、個々のＣＮＰの中に乳がん発症体質を予測できる領域が存在することが明らかとなった。

【0056】

３−２ 定量ＰＣＲ結果
（１）定量ＰＣＲ法
マイクロアレイ法より同定した表３〜６に示した染色体領域や、その近傍の領域を用いて、上記「２−２ 方法」の項目で示した方法で定量ＰＣＲ法を行った。具体的に用いた領域は、「１ｐ３６．１２ ２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１」、「３ｑ２６．１ １６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７」、「１５ｑ２６．３ ９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５」、「１５ｑ２６．３ ９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３」、「１５ｑ２６．３ ９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３」、「２２ｑ１２．３ ３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４」、及び「２２ｑ１２．３ ３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３」の、計７領域である。

【0057】

〔１〕図５及び表７（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎ）：プライマーセット（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（１ｐ３６．１２ ［２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１］）の０．５未満のＤＮＡコピー数は、健常者群では２１６例中３６例（１６．７％）であったのに対し、乳がん患者群では１９３例中１０７例（５５．４％）と、乳がん患者群において０．５未満のＤＮＡコピー数の頻度が有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、オッズ比６．２、Ｆｉｓｈｅｒ検定）。

【0058】

〔２〕図６及び表７（Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎ）：プライマーセット（Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（３ｑ２６．１ ［１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７］）の３．５以上のＤＮＡコピー数は、健常者群では２１６例中２２例（１０．２％）であったのに対し、乳がん患者群では１９３例中７６例（３９．４％）と、乳がん患者群において３．５以上のＤＮＡコピー数の頻度が有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、オッズ比５．７、Ｆｉｓｈｅｒ検定）。

【0059】

〔３〕図７及び表７（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ）：プライマーセット（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（１５ｑ２６．３ ［９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５］）の１．５未満のＤＮＡコピー数は、健常者群では２１６例中５６例（２５．９％）であったのに対し、乳がん患者群では１９３例中１４８例（７６．７％）と、乳がん患者群において１．５未満のＤＮＡコピー数の頻度が有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、オッズ比９．４、Ｆｉｓｈｅｒ検定）。

【0060】

〔４〕図８及び表７（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ）：プライマーセット（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（１５ｑ２６．３ ［９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３］）の０．５未満のＤＮＡコピー数は、健常者群では２１６例中２２例（１０．２％）であったのに対し、乳がん患者群では１９３例中４６例（２３．８％）と、乳がん患者群において０．５未満のＤＮＡコピー数の頻度が有意に高かった（Ｐ＝０．０００３、オッズ比２．８、Ｆｉｓｈｅｒ検定）。

【0061】

〔５〕図９及び表７（Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎ）：プライマーセット（Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（１５ｑ２６．３ ［９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３］）の１．５未満のＤＮＡコピー数は、健常者群では２１６例中６４例（２９．６％）であったのに対し、乳がん患者群では１９３例中１６１例（８３．４％）と、乳がん患者群において１．５未満のＤＮＡコピー数の頻度が有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、オッズ比１１．９、Ｆｉｓｈｅｒ検定）。

【0062】

〔６〕図１０及び表７（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎ）：プライマーセット（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（２２ｑ１２．３ ［３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４］）の９．０以上のＤＮＡコピー数は、健常者群では２１６例中０例（０．０％）であったのに対し、乳がん患者群では１９３例中８例（４．１％）と、乳がん患者群において９．０以上のＤＮＡコピー数頻度が有意に高かった（Ｐ＝０．００２３、オッズ比１９．８、Ｆｉｓｈｅｒ検定）。

【0063】

〔７〕図１１及び表７（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎ）：プライマーセット（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（２２ｑ１２．３ ［３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３］）の１２．０以上のＤＮＡコピー数は、健常者群では２１６例中０例（０．０％）であったのに対し、乳がん患者群では１９３例中７例（３．６％）と、乳がん患者群において１２．０以上のＤＮＡコピー数の頻度が有意に高かった（Ｐ＝０．００４９、オッズ比１７．４、Ｆｉｓｈｅｒ検定）。

【0064】

上述した〔１〕〜〔７〕の定量ＰＣＲによる解析結果から、カットオフ値（乳がん患者と健常者とを判定するために定める値）を設定することにより、健常者郡と比べ乳がん患者群の方が、陽性とする乳がん患者を有意に判定できた。この結果から、上記７つの領域において、ＤＮＡコピー数多型を有する者を乳がん発症感受性が高いと判定することができることが明らかとなった。

【0065】

（２）判別分析
定量ＰＣＲ法によりＤＮＡコピー数を測定した上記７つの領域の中から様々な組合せパターンの２つの領域を選択し、判別分析を行った。結果を図１２〜３２及び表８に示す。

【0066】

〔１〕図１２及び表８（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎとＨｓ０４０９３４１５＿ｃｎとの組合せ）：図５及び図１０で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数］×(−０．５６９５)＋［Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数］×（０．０２３６）＋（０．７１４２）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５９名（感度：８２．４％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１１２名（特異度：５１．９％）であった。なお、「Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数」とは、プライマーセット（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎ）で増幅される染色体領域のコピー数、すなわち「１ｐ３６．１２ （２１，３７５，４３０−２１，３７５，５１１）」のコピー数のことをいい、「Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数」とは、プライマーセット（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎ）で増幅される染色体領域のコピー数、すなわち「２２ｑ１２．３ （３５，４７３，７３０−３５，４７３，８０４）」のコピー数のことをいう。

【0067】

〔２〕図１３及び表８（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎとＨｓ０４０９０８９８＿ｃｎとの組合せ）：図５及び図１１で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数］×（−０．５６９９）＋［Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数］×（０．０２５２）＋（０．６９７）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５８名（感度：８１．９％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１１１名（特異度：５１．４％）であった。なお、「Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数」とは、プライマーセット（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎ）で増幅される染色体領域のコピー数、すなわち「２２ｑ１２．３ （３５，４７５，９３７−３５，４７６，０４３）」のコピー数のことをいう。

【0068】

〔３〕図１４及び表８（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎとＨｓ０３８９９３００＿ｃｎとの組合せ）：図５及び図７で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数］×（０．１４０３）＋［Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数］×（−２．９４６６）＋（４．２０７４）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１４２名（感度：７３．６％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６３名（特異度：７５．５％）であった。なお、「Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数」とは、プライマーセット（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ）で増幅される染色体領域のコピー数、すなわち「１５ｑ２６．３ （９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５］」のコピー数のことをいう。

【0069】

〔４〕図１５及び表８（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎとＨｓ０３８９８３３８＿ｃｎとの組合せ）：図５及び図９で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数］×（０．１３９９）＋［Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数］×（−３．７９９１）＋（５．２７２１）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５２名（感度：７８．８％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６２名（特異度：７５．０％）であった。なお、「Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数」とは、プライマーセット（Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎ）で増幅される染色体領域のコピー数、すなわち「１５ｑ２６．３ （９９，８４８，５４７−９９，８４８，６２３）」のコピー数のことをいう。

【0070】

〔５〕図１６及び表８（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎとＨｓ０３１０３０５６＿ｃｎとの組合せ）：図５及び図６で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数］×（−０．６６５１）＋［Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数］×（０．６６２４）＋（−０．８４９８）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１４５名（感度：７５．１％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１４４名（特異度：６６．７％）であった。なお、「Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数」とは、プライマーセット（Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎ）で増幅される染色体領域のコピー数、すなわち「３ｑ２６．１ （１６３，７０６，１７２−１６３，７０６，２８７）」のコピー数のことをいう。

【0071】

〔６〕図１７及び表８（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎとＨｓ０３９０８７８３＿ｃｎとの組合せ）：図５及び図８で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数］×（−０．３９１１）＋［Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数］×（−０．３９７２）＋（１．０２９８）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５４名（感度：７９．８％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１１９名（特異度：５５．１％）であった。なお、「Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数」とは、プライマーセット（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ）で増幅される染色体領域のコピー数、すなわち「１５ｑ２６．３ （９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３）」のコピー数のことをいう。

【0072】

〔７〕図１８及び表８（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎとＨｓ０４０９０８９８＿ｃｎとの組合せ）：図１０及び図１１で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数］×（−０．２２８５）＋［Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数］×（０．１８３４）＋（−０．０２７２）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは３５名（感度：１８．１％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１８４名（特異度：８５．２％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0073】

〔８〕図１９及び表８（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎとＨｓ０３８９９３００＿ｃｎとの組合せ）：図７及び図１０で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数］×（０．０４２３）＋［Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数］×（−２．６９４９）＋（３．９４２３）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１４７名（感度：７６．２％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６１名（特異度：７４．５％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0074】

〔９〕図２０及び表８（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎとＨｓ０３９０８７８３＿ｃｎとの組合せ）：図８及び図１０で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数］×（０．０３１６）＋［Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数］×（−０．９４１５）＋（１．１５２３）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１３８名（感度：７１．５％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１３０名（特異度：６０．２％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0075】

〔１０〕図２１及び表８（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎとＨｓ０３８９８３３８＿ｃｎとの組合せ）：図９及び図１０で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数］×（０．０３４２）＋［Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数］×（−３．５３８３）＋（５．０２１８）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５２名（感度：７８．８％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６２名（特異度：７５．０％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0076】

〔１１〕図２２及び表８（Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎとＨｓ０３１０３０５６＿ｃｎとの組合せ）：図６及び図１０で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数］×（０．００５）＋［Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数］×（０．５１４２）＋（−１．３５４７）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１１８名（感度：６１．１％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１１３名（特異度：５２．３％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0077】

〔１２〕図２３及び表８（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎとＨｓ０３８９９３００＿ｃｎとの組合せ）：図７及び図１１で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数］×（０．０３８５）＋［Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数］×（−２．６９６７）＋（３．９２８９）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１４６名（感度：７５．７％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６１名（特異度：７４．５％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0078】

〔１３〕図２４及び表８（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎとＨｓ０３９０８７８３＿ｃｎとの組合せ）：図８及び図１１で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数］×（０．０３１）＋［Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数］×（−０．９４３）＋（１．１３７）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１３９名（感度：７２．０％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１３０名（特異度：６０．２％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0079】

〔１４〕図２５及び表８（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎとＨｓ０３８９８３３８＿ｃｎとの組合せ）：図９及び図１１で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数］×（０．０１９１）＋［Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数］×（−３．５２８２）＋（５．０２３３）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５２名（感度：７８．８％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６２名（特異度：７５．０％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0080】

〔１５〕図２６及び表８（Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎとＨｓ０３１０３０５６＿ｃｎとの組合せ）：図６及び図１１で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数］×（０．０１１４）＋［Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数］×（０．５１３）＋（−１．３６９７）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１１７名（感度：６０．６％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１１５名（特異度：５３．２％）であった。なお、「Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0081】

〔１６〕図２７及び表８（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎとＨｓ０３９０８７８３＿ｃｎとの組合せ）：図７及び図８で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数×（−６．７５５４）＋Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数×（２．８２３）＋（６．４４７１）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１６２名（感度：８３．９％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１７５名（特異度：８１．０％）であった。なお、「Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0082】

〔１７〕図２８及び表８（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎとＨｓ０３８９８３３８＿ｃｎとの組合せ）：図７及び図９で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数］×（−０．６７１９）＋［Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数］×（−２．９２９）＋（５．２０９８）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５４名（感度：７９．８％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６４名（特異度：７５．９％）であった。なお、「Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0083】

〔１８〕図２９及び表８（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎとＨｓ０３１０３０５６＿ｃｎとの組合せ）：図６及び図７で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数］×（−３．０５３２）＋［Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数］×（０．７８７６）＋（２．４９１５）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５３名（感度：７９．３％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６２名（特異度：７５．０％）であった。なお、「Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0084】

〔１９〕図３０及び表８（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎとＨｓ０３８９８３３８＿ｃｎとの組合せ）：図８及び図９で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数］×（０．７８７７）＋［Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数］×（−４．５３７１）＋（５．５０６５）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１６３名（感度：８４．５％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６３名（特異度：７５．５％）であった。なお、「Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0085】

〔２０〕図３１及び表８（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎとＨｓ０３１０３０５６＿ｃｎとの組合せ）：図６及び図８で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数］×（−１．１３７２）＋［Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数］×（０．６８１５）＋（−０．３２２７）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１３７名（感度：７１．０％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１４４名（特異度：６６．７％）であった。なお、「Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0086】

〔２１〕図３２及び表８（Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎとＨｓ０３１０３０５６＿ｃｎとの組合せ）：図６及び図９で得られた結果を基に判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数］×（−３．４９９１）＋［Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数］×（０．４８５２）＋（３．７５７２）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１５７名（感度：８１．４％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１６０名（特異度：７４．１％）であった。なお、「Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりであり、「Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数」とは、上述のとおりである。

【0087】

上述の判別分析〔１〕〜〔２１〕の結果から、感度及び特異度に着目した場合、〔１６〕に示した判別分析、すなわちプライマーセット（Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（１５ｑ２６．３ ［９９，８４５，９２０−９９，８４６，０２５］）と、プライマーセット（Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ）で増幅される染色体領域（１５ｑ２６．３ ［９９，８４７，９４７−９９，８４８，０４３］）との組合せによる判別分析が、最も優れていることがわかった（感度：８３．９％、特異度：８１．０％）。さらに、７つの組合せ（Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎ、Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎ、Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎ、Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎ、Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎ、Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎ、及びＨｓ０４０９０８９８＿ｃｎ）について、判別分析を行ったところ、線形判別式（Ｙ＝［Ｈｓ０６５３５５２９＿ｃｎコピー数］×（−０．４１２８）＋［Ｈｓ０４０９３４１５＿ｃｎコピー数］×（０．０２）＋［Ｈｓ０４０９０８９８＿ｃｎコピー数］×（−０．００１）＋［Ｈｓ０３８９９３００＿ｃｎコピー数］×（−５．６７４７）＋［Ｈｓ０３９０８７８３＿ｃｎコピー数］×（３．３１１）＋［Ｈｓ０３８９８３３８＿ｃｎコピー数］×（−１．８８６４）＋［Ｈｓ０３１０３０５６＿ｃｎコピー数］×（０．６１０７）＋（５．８３６０）を用いて、判別得点Ｙを求めることができる。判別得点０以上を乳がん発症感受性ありとし、判別得点０未満を乳がん発症感受性なしとした場合、真の乳がん患者１９３名中でこの判別式により「乳がん」と判定（判別得点が０点以上）されたのは１７２名（感度：８９．１％）であるのに対し、真の健常者２１６名中で「乳がんではない」と判定（判別得点が０点未満）されたのは１７１名（特異度：７９．２％）であった。この結果は、上記７つの組合せにより、健常者と乳がん患者とを有意な差をもって判別することもできるが、上記〔１６〕で示した２つの組合せで十分判別できることを示している。

【0088】

【表7】

【0089】

【表8】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]