特許 5871814 ＨＰＰＤ阻害型除草剤に耐性を有する植物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5871814

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】ＨＰＰＤ阻害型除草剤に耐性を有する植物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160216BHJP

   C12N 5/14 20060101ALI20160216BHJP

   A01H 5/00 20060101ALI20160216BHJP

   A01C 1/06 20060101ALI20160216BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N5/14

   A01H5/00 A

   A01C1/06 Z

【請求項の数】12

【全頁数】84

(21)【出願番号】特願2012-545338(P2012-545338)

(86)(22)【出願日】2010年12月22日

(65)【公表番号】特表2013-515471(P2013-515471A)

(43)【公表日】2013年5月9日

(86)【国際出願番号】EP2010070578

(87)【国際公開番号】WO2011076892

(87)【国際公開日】20110630

【審査請求日】2013年12月20日

(31)【優先権主張番号】09015986.4

(32)【優先日】2009年12月23日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/290,581

(32)【優先日】2009年12月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10190659.2

(32)【優先日】2010年11月10日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/412,077

(32)【優先日】2010年11月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512164746

【氏名又は名称】バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＥＲ ＩＮＴＥＬＬＥＣＴＵＡＬ ＰＲＯＰＥＲＴＹ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(74)【代理人】

【識別番号】100078662

【弁理士】

【氏名又は名称】津国 肇

(74)【代理人】

【識別番号】100131808

【弁理士】

【氏名又は名称】柳橋 泰雄

(74)【代理人】

【識別番号】100135873

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 圭子

(74)【代理人】

【識別番号】100141357

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 音哉

(74)【代理人】

【識別番号】100146422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 聖

(74)【代理人】

【識別番号】100147533

【弁理士】

【氏名又は名称】岡崎 祐一

(74)【代理人】

【識別番号】100181102

【弁理士】

【氏名又は名称】後藤 孝明

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(72)【発明者】

【氏名】ポレ，ファビアン

(72)【発明者】

【氏名】ラバー，ベルント

(72)【発明者】

【氏名】クニッテル−オットレーベン，ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ランゲ，グートルーン

(72)【発明者】

【氏名】シュルツ，アルノー

(72)【発明者】

【氏名】ハイン，リューディガー

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 特表平１１−５０５７２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５１７１６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５０３６２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５２２６０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０５５１９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０５３１３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１４４０７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Pest Management Science，２００５年，61，269-276

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ａ０１Ｃ １／００

Ａ０１Ｈ ５／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

コード配列に対して異種調節要素である植物で発現可能なプロモーターに操作可能に連結されたコード配列を含むキメラ遺伝子であって、該コード配列が、配列番号４のアミノ酸２位〜アミノ酸４０１位のアミノ酸配列もしくは配列番号１８のアミノ酸２位〜アミノ酸４０２位のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤタンパク質、又は配列番号４のアミノ酸２位〜アミノ酸４０１位もしくは配列番号１８のアミノ酸２位〜アミノ酸４０２位のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含み、そしてそのタンパク質はＨＰＰＤタンパク質の酵素機能を保持していることを特徴とする、キメラ遺伝子。

【請求項2】

ＨＰＰＤコード配列の上流に、植物中で活性なトランジットペプチドをコードする核酸配列を含み、それによりトランジットペプチド／ＨＰＰＤ融合タンパク質が前記キメラ遺伝子によりコードされることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ遺伝子。

【請求項3】

請求項１〜２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのキメラ遺伝子を含むベクター。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、植物細胞、植物の一部、植物又は種子。

【請求項5】

ＰＤＨ（プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）酵素をコードするキメラ遺伝子も含む、請求項４に記載の植物細胞、植物の一部、植物又は種子。

【請求項6】

成長調節剤、好ましくは、２，４−Ｄもしくはジカンバ及び／又はアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ＥＰＳＰシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）及び／又はグルタミンシンターゼ（ＧＳ）を阻害する除草剤に対する耐性を付与する１つ以上のキメラ遺伝子をさらに含む、請求項４又は５に記載の植物細胞、植物の一部、植物又は種子。

【請求項7】

キメラ遺伝子が、請求項１〜２の一項に記載の前記植物に導入されることを特徴とする、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に耐性を有する植物を得るための方法。

【請求項8】

請求項４、５又は６に記載の植物又は種子を含有するか又は播種する領域又は農地における雑草を防除するための方法であって、前記領域又は農地に、請求項４、５又は６に記載の種子又は植物に重大な影響を与えることなく、前記雑草に毒性である用量のＨＰＰＤ阻害型除草剤を適用することを含む方法。

【請求項9】

ＨＰＰＤ阻害剤が、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−ＣＦ_３フェニル）プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−２，３ Ｃｌ_２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、ジケトニトリルならびにピラゾキシフェンの群より選択されることを特徴とする、請求項８に記載の雑草を防除するための方法。

【請求項10】

請求項４、５又は６に記載の植物を成長させ、場合により、そのような植物をＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理し、穀物を収穫し、そして、穀物を製粉して食物を製造し、場合により油を抽出することを含む、油又は食物を得るための方法。

【請求項11】

植物をＨＰＰＤ阻害型除草剤に耐性を有するようにするための、配列番号４又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤタンパク質、又は配列番号４又は配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＰＰＤの使用であって、そしてそのタンパク質はＨＰＰＤタンパク質の酵素機能を保持している、使用。

【請求項12】

ＨＰＰＤ阻害型除草剤が、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−ＣＦ_３フェニル）プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−２，３ Ｃｌ_２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、ジケトニトリルならびにピラゾキシフェンからなる群より選択される、請求項１１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌から得られるヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＥＣ １．１３．１１．２７、本明細書においてＨＰＰＤと略する）をコードする核酸配列及びそれによりコードされるタンパク質、そのような核酸配列を含むキメラ遺伝子、ならびにＨＰＰＤ阻害型除草剤に耐性を有する植物を得るための、そのような核酸配列、タンパク質又はキメラ遺伝子の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＨＰＰＤは、チロシン分解産物のパラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（本明細書においてＨＰＰと略する）が、植物におけるトコフェロール及びプラストキノンの前駆体であるホモゲンチシン酸（本明細書においてＨＧと略する）に変換される反応を触媒する酵素である（Crouch N.P. et al. (1997) Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze et al., (2004), Plant Physiology 134:1388-1400）。トコフェロールは、膜結合抗酸化物質として作用する。プラストキノンは、第一に、ＰＳＩＩとシトクロムｂ６／ｆ複合体間の電子伝達体として作用し、第二に、カロテノイドの生合成に関与するフィトエンデサチュラーゼの酸化還元補因子である。

【0003】

これまで、ＮＣＢＩデータベースの様々な生物に由来する７００を超える核酸配列が、、ＨＰＰＤドメインを有する推定タンパク質をコードする配列として注解された（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬデータベースの登録番号Ｑ０ＳＣ９２及びＱ０ＳＦ３９、それぞれＮＣＢＩタンパク質データベースの登録番号ＹＰ＿７０３００２及びＹＰ＿７０２００５としても公開される配列を含む）。しかし、登録番号Ｑ０ＳＣ９２／ＹＰ＿７０３００２及びＱ０ＳＦ３９／ＹＰ＿７０２００５に相当する配列を含むこれらのほとんどにとって、該タンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ又はｉｎ ｐｌａｎｔａアプローチのいずれかでＨＰＰＤ酵素活性を有することも、また、そのようなＨＰＰＤタンパク質が植物で発現されたときに、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する除草剤耐性を付与することができることも証明されていない。いくつかのＨＰＰＤタンパク質及びその一次配列、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどの細菌（Ruetschi et al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（WO 96/38567, Genebank AF047834）、ニンジン（WO 96/38567, Genebank 87257）、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ （WO 02/046387）、コムギ（WO 02/046387）、Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ（WO 02/046387）、Ｃｅｎｃｈｒｕｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓ（WO 02/046387）、Ｌｏｌｉｕｍ ｒｉｇｉｄｕｍ（WO 02/046387）、Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（WO 02/046387）、Ｓｅｔａｒｉａ ｆａｂｅｒｉ（WO 02/046387Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｉｎｄｉｃａ（WO 02/046387）、Ｓｏｒｇｈｕｍ（WO 02/046387）Ｃｏｃｃｉｃｏｉｄｅｓ（Genebank COITRP）などの植物、Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ（WO 06/132270）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ES 2275365）、又はマウスもしくはブタなどの哺乳動物のＨＰＰＤタンパク質が当技術分野においてこれまでに記載されている。表示の文献に開示されている対応する配列は、参照することで本明細書に組み込まれる。

【0004】

ほとんどの植物は、アロゲン酸（arrogenate）を経由してチロシンを合成する（Abou-Zeid et al. (1995), Applied Env Microb 41: 1298-1302; Bonner et al., (1995), Plant Cells Physiol. 36, 1013-1022; Byng et al., (1981), Phytochemistry 6: 1289-1292; Connely and Conn (1986), Z. Naturforsch 41c: 69-78; Gaines et al.、(1982), Plants 156: 233-240）。これらの植物では、ＨＰＰはチロシンの分解からのみ誘導される。一方で、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は細菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの生物では、ＨＰＰはチロシン前駆体であり、そして、これは、プレフェン酸をＨＰＰに変換する酵素のプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（以下、本明細書でＰＤＨと称する）の作用により合成される（Lingens et al., (1967) European J. Biochem 1: 363-374; Sampathkumar and Morrisson (1982), Bioch Biophys Acta 701: 204-211）。これらの生物では、このため、ＨＰＰの産生は芳香族アミノ酸生合成経路（シキミ酸経路）に直結しており、チロシン分解経路に直結していない。

【0005】

ＨＰＰＤの阻害は、カロテノイドにより通常与えられる光防護の欠如が原因で、光合成の遮断（uncoupling）、補助集光性色素の欠乏、そして、最も重要なことだが、ＵＶ照射及び活性酸素種によるクロロフィルの破壊（白化）をもたらす（Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149）。光合成活性組織の白化は、増殖阻害及び植物死をもたらす。

【0006】

ＨＰＰＤを阻害し、そして、ＨＰＰのホモゲンチシン酸への変換を阻害するために該酵素に特異的に結合するいくつかの分子が、非常に効果的な選択的除草剤であると証明されている。

【0007】

現在、市販されている多くのＨＰＰＤ阻害型除草剤が、以下の４種の化学物質ファミリーの１つに属する：
１）トリケトン、例えば、スルコトリオン［即ち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、メソトリオン［即ち、２−［４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］；テンボトリオン［即ち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［（２，２，２，−トリ−フルオロエトキシ）メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロ−ヘキサンジオン］；テフリルトリオン［即ち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［［（テトラヒドロ−２−フラニル）メトキシ］メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］］；ビシクロピロン［即ち、４−ヒドロキシ−３−［［２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−６−（トリフルオロメチル）−３−ピリジニル］カルボニル］ビシクロ［３．２．１］オクタ−３−エン−２−オン］；ベンゾビシクロン［即ち、３−（２−クロロ−４−メシルベンゾイル）−２−フェニルチオビシクロ［３．２．１］オクタ−２−エン−４−オン］
２）ジケトニトリル、例えば、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン；
３）イソオキサゾール、例えば、イソキサフルトール［即ち、（５−シクロプロピル−４−イソオキサゾリル）［２−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］（植物では、イソキサフルトールは、ＨＰＰＤ阻害特性を示すＤＫＮ（ジケトニトリル）化合物に急速に代謝される）；及び
４）ピラゾリネート、例えば、トプラメゾン［即ち、［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソオキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メタノン］、及びピラスルホトール［（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾール−４−イル（２−メシル−４−トリフルオロメチルフェニル）メタノン］；ピラゾフェン（pyrazofen）［２−［４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１，３−ジメチルピラゾール−５−イルオキシ］アセトフェノン］

【0008】

これらのＨＰＰＤ阻害型除草剤は、Ｚｅａ ｍａｙｓなどの代謝耐性を示す作物の中で、イネ科及び／又は広葉雑草に対して使用することができ、これら雑草は急速に減少する（Schulz et al., (1993). FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al., (2001) Pest Management Science, Vol 57, 120-128; Garcia et al., (2000) Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al., (2001) Pest Management Science, Vol 57, 133-142）。これらのＨＰＰＤ阻害型除草剤の範囲を拡張するために、植物、特に、代謝耐性を有しないか、又は代謝耐性が低い植物に、農地条件下で許容可能な耐性レベルを付与するためのいくつかの取り組みがなされてきた。

【0009】

ＨＰＰＤ介在性のホモゲンチシン酸産生を回避する試行（US 6,812,010）の他に、除草剤に対する十分量の標的酵素を植物において産生するために、感受性酵素の過剰発現が実施された（WO96/38567）。ＨＰＰＤの過剰発現により、イソキサフルトール（ＩＦＴ）のジケトニトリル誘導体（ＤＫＮ）に対して良好な発芽前耐性が得られたが、出芽後処理に対しての耐性は十分ではなかった（Matringe et al., (2005), Pest Management Science 61: 269-276）。

【0010】

第三の戦略は、ＨＰＰのホモゲンチシン酸への変換を触媒する特性を保持しながらも、突然変異前の天然ＨＰＰＤよりＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低い標的酵素を得るために、ＨＰＰＤを突然変異させることであった。

【0011】

この戦略を、ジケトニトリルファミリーに属する２つのＨＰＰＤ阻害型除草剤の、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン（EP 496630）に耐性を有する植物の産生に適用することに成功した（WO 99/24585）。Ｐｒｏ２１５Ｌｅｕ、Ｇｌｙ３３６Ｇｌｕ、Ｇｌｙ３３６Ｉｌｅ、そして特に、Ｇｌｙ３３６Ｔｒｐ（突然変異アミノ酸の位置は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＨＰＰＤを参照して示される）が、これらのジケトニトリル除草剤による発芽前処理に対して、酵素活性の変化を引き起こすことなく、耐性増加をもたらす原因である突然変異であると同定された。

【0012】

最近、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＨＰＰＤ遺伝子をタバコ及びダイズの色素体ゲノムへの導入が、核形質転換より効果的であり、イソキサフルトールの出芽後適用にも耐性を付与することが示された（Dufourmantel et al., 2007, Plant Biotechnol J.5(1):118-33）。

【0013】

WO 04/024928で、発明者等は、植物細胞内へのＨＰＰ前駆体のフラックスを増加させることにより、植物細胞内のプレニルキノン生合成（例えば、プラストキノン、トコフェロールの合成）を増加させようとした。これは、ＰＤＨ酵素を過剰発現させて前記前駆体の合成を「シキミ酸」経路に連結させることにより実施した。また、彼らは、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することで、前記植物のＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性を増加させることが可能であることに言及している。

【0014】

特許出願WO 2009/144079には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＨＰＰＤタンパク質の３３６位に突然変異を有するヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）をコードする核酸配列、及びＨＰＰＤ阻害型除草剤に耐性を有する植物を得るためのその使用が開示されている。

【0015】

WO 2002/046387では、植物由来のＨＰＰＤタンパク質のいくつかのドメインが、様々なＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性付与に関連している可能性があることが確認されたが、記載されるドメインの機能による影響を確認するための、in plantaのみならず、生化学的データも示されていない。

【0016】

WO 2008/150473では、２つの異なる耐性メカニズムの組み合わせ（突然変異ＨＰＰＤ酵素とＣＹＰ４５０トウモロコシモノオキシゲナーゼ（ｎｓｆ１遺伝子）をコードする改変Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ遺伝子）が、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性改善を達成するために例示されたが、両タンパク質の組み合わせに基づく相乗効果を示すデータが開示されていない。

【0017】

上記のいくつかのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を示す植物を開発するためのこれらの成功が得られたにもかかわらず、依然として、新規又はいくつかの異なるＨＰＰＤ阻害剤、特に、トリケトン（例えば、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、ベンゾビシクロン及びビシクロピロン）及びピラゾリネート（例えば、トプラメゾン及びピラスルホトール）のクラスに属するＨＰＰＤ阻害剤に対する、植物の耐性の開発及び／又は改善が必要とされている。

【0018】

説明
従って、本発明は、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸への変換を触媒する特性を示すＨＰＰＤ酵素をコードする、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する生物から得ることが可能又は得られるＨＰＰＤタンパク質をコードする遺伝子、及びそのバリアント又は突然変異体、より具体的には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．種に属する生物由来の遺伝子、及びそのバリアント又は突然変異体、さらにより具体的には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＲＨＡ１株に属する生物由来の遺伝子、及びそのバリアント又は突然変異体を含有するトランスジェニック植物であって、そのようなＨＰＰＤコード導入遺伝子を全く含有しない植物よりＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低い植物の作製に関する。

【0019】

特に、従って、本発明は、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸への変換を触媒する特性を示すＨＰＰＤ酵素をコードする、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する生物から得ることが可能又は得られる遺伝子、より具体的には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．種に属する生物由来の遺伝子、そのバリアント又は突然変異、さらにより具体的には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＲＨＡ１株に属する生物由来の遺伝子、そのバリアント又は突然変異体、最も具体的には、単離体ｒｏ０３０４１又はｒｏ０２０４０に属する生物由来の遺伝子、そのバリアント又は突然変異体を含有するトランスジェニック植物であって、そのようなＨＰＰＤ導入遺伝子を全く含有しない植物よりＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低い植物の作製に関する。ＨＰＰＤタンパク質をコードする、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＲＨＡ１由来、最も具体的には、単離体ｒｏ０３０４１又はｒｏ０２０４０に属する生物由来の遺伝子が、ＨＰＰＤ阻害型除草剤に感受性の参照分子と考えられる感受性ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＨＰＰＤタンパク質と比較したＨＰＰＤタンパク質の実験及び構造的決定により、ＨＰＰＤ阻害剤耐性に関連する位置のアミノ酸組成の多様性が高いことから、優れたＨＰＰＤ阻害剤耐性候補として選択された。

【0020】

一実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６又は７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列、及び／又は、配列番号１８のアミノ酸２位〜４０２位のアミノ酸配列、特に、配列番号１８、１９、２０又は２１のいずれか１つ、好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0021】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、配列番号４の２０７位〜４０１位の任意のアミノ酸が任意の天然のアミノ酸により変更されており、好ましくは、それが任意の保存的置換であってもよい、ＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質ｒｏ０３０４１」又は「Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｏ０３０４１ＨＰＰＤタンパク質」と称する、ｒｏ０３０４１から単離されるＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0022】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号１８のアミノ酸２位〜４０２位のアミノ酸配列、特に、配列番号１８、１９、２０、２１のいずれか１つ、好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、配列番号１８の２０８位〜４０２位の任意のアミノ酸が任意の天然のアミノ酸により変更されており、好ましくは、それが任意の保存的置換であってもよい、ＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質ｒｏ０２０４０」又は「Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｏ０２０４０ＨＰＰＤタンパク質」と称する、ｒｏ０２０４０から単離されるＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0023】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、括弧内の番号（配列番号４の番号に関して）で指定される位置に１つ以上の下記アミノ酸、即ち、Ｈｉｓ（２０５）、Ｓｅｒ（２４８）、Ａｓｎ（２６３）、Ｇｌｎ（２８７）、Ｈｉｓ（２８８）、Ｔｙｒ（３１７）、Ｇｌｎ（３５４）、Ｐｈｅ（３６７）、Ｇｌｕ（３６９）、Ｇｌｙ（３８０）及びＡｓｎ（３８３）を有するＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０３０４１由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0024】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、表（ｉ）の２段目に示される各位置で、元々存在するアミノ酸が表（ｉ）の３段目に列挙されるアミノ酸のいずれかで置換されうるＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０３０４１由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0025】

【表1】

【0026】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、表（ｉｉ）の２段目に示される各位置で、元々存在するアミノ酸が表（ｉｉ）の３段目に列挙されるアミノ酸のいずれかで置換されうるＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０３０４１由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0027】

【表2】

【0028】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、表（ｉｉｉ）の２段目に示される各位置で、元々存在するアミノ酸が表（ｉｉｉ）の３段目に列挙されるアミノ酸のいずれかで置換されうるＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０３０４１由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0029】

【表3】

【0030】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０２位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、括弧内の番号（配列番号４の番号に関して）で指定される位置に１つ以上の下記アミノ酸、即ち、Ｈｉｓ（２０６）、Ｓｅｒ（２４９）、Ａｓｎ（２６４）、Ｇｌｎ（２８８）、Ｈｉｓ（２８９）、Ｔｙｒ（３１８）、Ｇｌｎ（３５５）、Ｐｈｅ（３６８）、Ｇｌｕ（３７０）、Ｇｌｙ（３８１）及びＡｓｎ（３８４）を有するＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０２０４０由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0031】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０２位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、表（ｉ）の２段目に示される各位置で、元々存在するアミノ酸が表（ｉｖ）の３段目に列挙されるアミノ酸のいずれかで置換されうるＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０２０４０由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0032】

【表4】

【0033】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０２位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、表（ｉｉ）の２段目に示される各位置で、元々存在するアミノ酸が表（ｖ）の３段目に列挙されるアミノ酸のいずれかで置換されうるＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０２０４０由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0034】

【表5】

【0035】

さらなる実施態様においては、本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０２位のアミノ酸配列、特に、配列番号４、５、６、７のいずれか１つ、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９７％；少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、そして、表（ｉｉｉ）の２段目に示される各位置で、元々存在するアミノ酸が表（ｖｉ）の３段目に列挙されるアミノ酸のいずれかで置換されうるＨＰＰＤタンパク質であって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤタンパク質」又は「単離体ｒｏ０２０４０由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質」と称するＨＰＰＤタンパク質に関する。

【0036】

【表6】

【0037】

本発明は、配列番号４のアミノ酸２位〜アミノ酸４０１位、又は配列番号１８のアミノ酸２位〜アミノ酸４０２位の配列と比較して、置換、欠失又は付加されたアミノ酸を有する、トランジットペプチド融合タンパク質などのタンパク質、又は、ＨＰＰＤタンパク質の酵素機能を保持し、そして、植物で発現されたとき、依然として、ＨＰＰＤ耐性、好ましくは、配列番号４又は配列番号１８のタンパク質により付与される耐性と同等のＨＰＰＤ耐性を付与するアミノ酸変化を配列番号４又は配列番号１８の配列において有するタンパク質を包含する。これは、配列番号４のタンパク質由来のバリアント又は突然変異体タンパク質、例えば、配列番号５、６又は７のタンパク質のいずれか、又は配列番号１８のタンパク質由来のバリアント又は突然変異体タンパク質、例えば、配列番号１９、２０、２１のタンパク質のいずれか、特に、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン又はピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する感受性が低いそのような突然変異体又はバリアント、好ましくは、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン及び／又はピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害型除草剤、特に、メソトリオン、テンボトリオン、イソキサフルトール又はビシクロピロンのいずれか１つが、そのような植物に適用されたとき、より具体的には、出芽後に適用されたときにそのタンパク質を発現する宿主植物に農学的に妥当な除草剤耐性を付与するそのような突然変異体又はバリアントを包含する。これは、また、植物で発現されたときにＨＰＰＤ阻害剤耐性を付与する、配列番号４又は配列番号１８の配列の活性部位を含むタンパク質を包含する。これは、配列番号４又は配列番号１８の配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質、例えば、配列番号４〜７又は配列番号１９〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。これは、以下で定義されるような単離タンパク質、及び特定のアミノ酸が以下に定義されるような同様のアミノ酸で置換、好ましくは、保存的アミノ酸置換されている、配列番号４又は配列番号１８のタンパク質などのタンパク質も包含する。また、本明細書における本発明のＨＰＰＤタンパク質として、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位又は配列番号１８のアミノ酸２位〜４０２位のアミノ酸配列を含むが、１〜２０、１〜１５、１〜１０、又は１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個のアミノ酸が欠失又は他のアミノ酸で置換されているＨＰＰＤタンパク質、特に、ＨＰＰＤ酵素活性を保持し、宿主植物で発現されたときＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を付与するそのようなタンパク質が包含される。本明細書において、後述するような本発明のＤＮＡ配列に相同のＤＮＡ配列によりコードされるＨＰＰＤタンパク質、又は配列番号１もしくは配列番号１５のＤＮＡの少なくとも一部（少なくとも２０〜３０個のヌクレオチド）とハイブリダイズするか、又は配列番号１もしくは配列番号１５に基づくプライマーを使用して得ることが可能であるＤＮＡ配列によりコードされるＨＰＰＤタンパク質、又は配列番号４又は配列番号１８に対して、少なくとも７５％の配列同一性を有し、微生物、例えば、真核微生物、特に、細菌、例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の微生物のゲノム配列に見出されるＤＮＡ配列によりコードされるＨＰＰＤタンパク質が包含される。本明細書における本発明のＨＰＰＤタンパク質としては、植物で発現されたときに、該植物に、メソトリオン、テンボトリオン、イソキサフルトール又はビシクロピロンなどのＨＰＰＤ阻害剤に対する除草剤耐性を付与するＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤタンパク質が包含され、特に、そのようなＨＰＰＤタンパク質は、配列番号４のアミノ酸２位〜４０１位又は配列番号１８のアミノ酸２位〜４０２位の配列を含むタンパク質などのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＨＰＰＤタンパク質である。これは、下記にさらに記載する突然変異体又はバリアントＨＰＰＤタンパク質を包含する。

【0038】

本発明は、配列番号：４、５、６、７、１８、１９、２０又は２１からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は上記表（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の１つ以上に開示されているアミノ酸置換によるその誘導配列を含む、実質的に純粋なタンパク質に特異的に結合することができる抗体を包含し、提供する。

【0039】

本発明のさらなる態様は、本発明の１つ以上のタンパク質又はペプチド分子及びその同族体、融合体又はフラグメントに特異的に結合する抗体、一本鎖抗原結合分子、又は他のタンパク質に関する。

【0040】

特に好ましい実施態様においては、本抗体は、配列番号：４〜７又は１８〜２１で記述されるアミノ酸配列又はそのフラグメント、又は上記表（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の１つ以上に開示されているアミノ酸置換によるその誘導配列を有するタンパク質に特異的に結合する。

【0041】

別の実施態様においては、本抗体は、配列番号：４〜７又は１８〜２１で記述されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメント、又は上記表（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の１つ以上に開示されているアミノ酸置換によるその誘導配列を含む融合タンパク質に特異的に結合する。

【0042】

別の実施態様においては、本抗体は、配列番号：４〜７又は１８〜２１で記述されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメント、又は上記表（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の１つ以上に開示されているアミノ酸置換によるその誘導配列を含む融合タンパク質に特異的に結合する。

【0043】

本発明の抗体は、本発明のタンパク質又はペプチド分子の定量的又は定性的検出、又は該タンパク質の翻訳後修飾の検出に使用することができる。本明細書において使用される抗体又はペプチドは、関係のない分子の存在により競合的に結合が阻害されない場合に、本発明のタンパク質又はペプチド分子に「特異的に結合」すると言われる。

【0044】

別の実施態様においては、本発明は、上記で定義される本発明のＨＰＰＤをコードする核酸又はＤＮＡであって、本明細書において、「本発明のＨＰＰＤ核酸／ＤＮＡ」と称するＨＰＰＤ核酸又はＤＮＡに関する。これは、配列番号１のヌクレオチド４位〜ヌクレオチド１２０３位の配列、配列番号２のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２４位の配列、又は配列番号３のヌクレオチド４位〜ヌクレオチド１５９９位の配列、又は配列番号１５のヌクレオチド４位〜ヌクレオチド１２０６位の配列、配列番号１６のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２７位の配列、又は配列番号１７のヌクレオチド４位〜ヌクレオチド１６０３位の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、又はＨＰＰＤをコードするＤＮＡ領域を含むＤＮＡ、又は０．１％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ（単一強度（single-strength）クエン酸ナトリウム）は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸三ナトリウム、５０mM リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６を意味する）中、６０〜６５℃の温度でインキュベートし、次に、同温度で０．１％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣでリンスした場合、依然として、配列番号１、２及び３からなる群より選択される配列とハイブリダイズするように、別のＤＮＡと十分に相補的であるＤＮＡを包含する。試験及び本発明の配列が二本鎖である場合、試験配列を構成する核酸は、好ましくは、配列番号１、２及び３からなる群より選択される配列のＴＭの１０℃内のＴＭを有する。試験及び配列番号１、２及び３からなる群より選択される配列が一緒に混合され、同時に変性した場合、その配列のＴＭ値は、好ましくは、互いに５℃以内である。より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、下記で定義する比較的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施する。

【0045】

一実施態様においては、変性した試験又は本発明の配列は、好ましくは、最初に支持体に結合させ、ハイブリダイゼーションは、０．１％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６０〜６５℃の温度で特定の時間で行い、次に、支持体を同温度で０．１×ＳＳＣを用いてリンスする。ハイブリダイゼーションが、配列番号１、２、３、１５、１６又は１７からなる群より選択される配列のフラグメントを含む場合は、ハイブリダイゼーション条件は、当業者に明らかであるように、より低いストリンジェント条件であってよい。

【0046】

また、本明細書における本発明のＨＰＰＤ ＤＮＡとして、ＤＮＡ配列が、例えば、ネイティブコドンを、宿主細胞においてより好ましいコドンで置換することにより、微生物又は植物での発現に適合されているか、又はここで、特定の制限酵素認識部位がクローニングを容易に行うために付加又は除去されているか、又は特定の数の付加、置換又は欠失ヌクレオチドを有するＤＮＡ配列である、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列が包含される。これは、また、単離ＤＮＡ配列及びバリアント、突然変異体もしくは合成ＤＮＡ又は下記にさらに記載する核酸を包含する。

【0047】

特定の実施態様においては、本発明のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤ ＤＮＡは、植物において、植物で外来遺伝子を発現することができるプロモーターの制御下で発現される。さらに特定の実施態様においては、そのように発現したＨＰＰＤ酵素のＮ末端に、シグナルペプチド、例えば、トランジットペプチド、好ましくは、色素体トランジットペプチド、例えば、約１２０アミノ酸（約３０〜約１２０アミノ酸）の葉緑体トランジットペプチド、最も好ましくは、二重トランジットペプチド、例えば、第一部位がヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）に由来し、第二部位がＺｅａ ｍａｙｓに由来する最適化されたトランジットペプチド（米国特許第5,188,642号に記載）、又は植物のリブロースビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕ）の色素体トランジットペプチド（適宜、成熟ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのＮ末端部位の数個のアミノ酸を含む（EP 189 707））が位置する。

【0048】

さらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１に由来するか、もしくはそれから得ることができ、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号２のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２４位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されているか、又は配列番号１５に由来するか、もしくはそれから得ることができ、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号１６のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２７位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡのなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されている、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。

【0049】

さらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号３のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１５９９位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、植物で発現するように最適化されている、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。

【0050】

別のさらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１５に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号１７のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１６０２位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、植物で発現するように最適化されている、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。

【0051】

さらに特定の実施態様においては、配列番号４のアミノ酸２位〜アミノ酸４０１位のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤ、又は配列番号４〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＰＰＤなどの本発明のＨＰＰＤは、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトンもしくはピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害型除草剤、又はイソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−ＣＦ_３フェニル）プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−２，３ Ｃｌ_２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン及びピラゾキシフェンから選択されるＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する感受性が低い。

【0052】

別のさらに特定の実施態様においては、配列番号１８のアミノ酸２位〜アミノ酸４０２位のアミノ酸配列を含むＨＰＰＤ、又は配列番号１８〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＰＰＤなどの本発明のＨＰＰＤは、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン又はピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ阻害型除草剤、又はイソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、２-シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−ＣＦ_３フェニル）プロパン−１，３−ジオン及び２-シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−２，３ Ｃｌ_２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン及びピラゾキシフェンから選択されるＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する感受性が低い。

【0053】

さらに特定の実施態様においては、本発明は、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号２のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２４位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されている本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードし、そして、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン又はピラゾリネートのクラスの少なくとも１つのＨＰＰＤ阻害型除草剤、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラスルホトール、トプラメゾン、スルコトリオン、ピラゾレート及びベンゾフェナップに対する感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡを包含する。

【0054】

別のさらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１５に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号１６のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２７位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されている本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードし、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン又はピラゾリネートのクラスの少なくとも１つのＨＰＰＤ阻害型除草剤、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラスルホトール、トプラメゾン、スルコトリオン、ピラゾレート及びベンゾフェナップに対する感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡを包含する。

【0055】

さらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号３のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１５９９位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、植物で発現するように最適化されている本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードし、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン又はピラゾリネートのクラスの少なくとも１つのＨＰＰＤ阻害型除草剤、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラスルホトール、トプラメゾン、スルコトリオン、ピラゾレート及びベンゾフェナップに対する感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡを包含する。

【0056】

さらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１５に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号１７のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１６０２位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、植物で発現するように最適化されている本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードし、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン又はピラゾリネートのクラスの少なくとも１つのＨＰＰＤ阻害型除草剤、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソキサフルトール、ジケトニトリル、ピラスルホトール、トプラメゾン、スルコトリオン、ピラゾレート及びベンゾフェナップに対する感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡを包含する。

【0057】

さらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号２のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２４位の配列（指定された位置を含む）、又は配列番号３のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１５９９位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されているか、又は植物で発現するように最適化されているＨＰＰＤタンパク質をコードし、宿主植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡのいずれかを含む植物、植物の一部、植物細胞及びこれらの植物の子孫に関する。そのような植物には、農作物、果物及び野菜、例えば、キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、コットン、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ、ダイズ類、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、シトラス、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝及び飼料草、亜麻及び菜種ならびにナッツ産生植物が含まれるが、これらに限定されない。

【0058】

別のさらに特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１５に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号１６のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２７位の配列（指定された位置を含む）、又は配列番号１８の配列のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１６０２位（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されているか、又は植物で発現するように最適化されているＨＰＰＤタンパク質をコードし、宿主植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡのいずれかを含む植物、植物の一部、植物細胞及びこれらの植物の子孫に関する。そのような植物には、農作物、果物及び野菜、例えば、キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、コットン、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ、ダイズ類、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、シトラス、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝及び飼料草、亜麻及び菜種ならびにナッツ産生植物が含まれるが、これらに限定されない。

【0059】

より特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号２のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２４位の配列（指定された位置を含む）、又は配列番号３のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１５９９位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されているか、又は植物で発現するように最適化されているＨＰＰＤタンパク質をコードし、宿主植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡのいずれかを含む植物、植物の一部、植物細胞及びこれらの植物の子孫に関し、ここで、該植物は、キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、コットン、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、ジャガイモ、ダイズ類、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝及び飼料草、亜麻及び菜種ならびにナッツ産生植物からなる群より選択され、さらにより好ましくは、そのような植物は、ダイズ類、コメ、テンサイ、コムギ、コットン、キャノーラ、菜種又はトウモロコシからなる群より選択される。

【0060】

別のより特定の実施態様においては、本発明は、配列番号１５に由来し、そして、コドン最適化ＤＮＡ、例えば、配列番号１６のヌクレオチド２５位〜ヌクレオチド１２２７位の配列（指定された位置を含む）、又は配列番号１７のヌクレオチド４００位〜ヌクレオチド１６０２位の配列（指定された位置を含む）を含むＤＮＡなど、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するように最適化されているか、又は植物で発現するように最適化されているＨＰＰＤタンパク質をコードし、宿主植物の内因性ＨＰＰＤよりも感受性が低いＨＰＰＤをコードするＤＮＡのいずれかを含む植物、植物の一部、植物細胞及びこれらの植物の子孫に関し、ここで、該植物は、キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、コットン、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、ジャガイモ、ダイズ類、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝及び飼料草、亜麻及び菜種ならびにナッツ産生植物からなる群より選択され、さらにより好ましくは、そのような植物は、ダイズ類、コメ、テンサイ、コムギ、コットン、キャノーラ、菜種又はトウモロコシからなる群より選択される。

【0061】

別の特定の実施態様においては、本発明のＨＰＰＤタンパク質は、配列番号７又は配列番号２１の配列を含み、そして、植物、特に、そのような本発明のＨＰＰＤを発現しているか、又は発現される宿主植物の内因性の非突然変異ＨＰＰＤと比較して、トリケトンのクラス（トリケトンＨＰＰＤ阻害剤と呼ぶ）、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、特に、テンボトリオン、又はジケトニトリル（イソキサフルトール）のクラス、又はピラゾリネートのクラス（ピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤と呼ぶ）、例えば、ピラスルホトール、ピラゾレート、トプラメゾン、ベンゾフェナップのＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性が低い。

【0062】

ＨＰＰＤタンパク質の酵素活性は、ＨＰＰ又はＯ_２基質の量の減少を測定するか、又は酵素反応から生じる生成物のいずれか、即ち、ホモゲンチシン酸又はＣＯ_２の蓄積を測定することが可能な任意の方法により測定することができる。特に、ＨＰＰＤ活性は、Garcia等(1997), Biochem. J. 325, 761-769、又はGarcia等(1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を用いて測定することができる。

【0063】

本発明によれば、トリケトンのクラスのＨＰＰＤ阻害剤（又はトリケトンＨＰＰＤ阻害剤）は、トリケトン骨格を有するＨＰＰＤ阻害剤を意味する。そのようなトリケトンＨＰＰＤ阻害剤の例として、分子スルコトリオン［即ち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、メソトリオン［即ち、２−［４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、及びテンボトリオン［即ち、２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［（２，２，２−トリ−フルオロエトキシ）メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、テフリルトリオン［即ち、２−｛２−クロロ−４−メシル−３−［（ＲＳ）−テトラヒドロ−２−フリルメトキシメチル］ベンゾイル｝シクロヘキサン−１，３−ジオン］、ビシクロピロン［即ち、４−ヒドロキシ−３−｛２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−６−（トリフルオロメチル）−３−ピリジルカルボニル｝ビシクロ［３．２．１］オクタ−３−エン−２−オン］、ベンゾビシクロン［即ち、３−（２−クロロ−４−メシルベンゾイル）−２−フェニルチオビシクロ［３．２．１］オクタ−２−エン−４−オン］を挙げることができる。

【0064】

本発明によれば、ピラゾリネートのクラスのＨＰＰＤ（又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤）は、ピラゾール基を有するＨＰＰＤ阻害剤を意味する。そのようなピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤の例として、分子トプラメゾン［即ち、［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソオキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メタノン］及びピラスルホトール［（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾール−４−イル（２−メシル−４−トリフルオロメチルフェニル）メタノン］を挙げることができる。

【0065】

本発明は、また、核酸配列、特に、単離ＤＮＡ、好ましくは、本発明のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤ及びその適合した配列をコードする、植物で発現可能なキメラ遺伝子に関する。

【0066】

本発明は、また、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸への変換を触媒する特性を保持し、そして、内因性の非突然変異植物のＨＰＰＤより、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオンなどのトリケトンのクラス、又はピラスルホトール及びトプラメゾンなどのピラゾリネートのクラス、テフリルトリオン、ビシクロピロン、ベンゾビシクロンのＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低く、そのコードアミノ酸配列が、配列番号４又は配列番号１８に対して、少なくとも７５％、８０％、特に、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す、本発明のＨＰＰＤ酵素をコードする核酸配列に関する。

【0067】

より特定の実施態様においては、本発明の核酸配列は、宿主植物の内因性ＨＰＰＤより、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン及びテフリルトリオンなどのトリケトンのクラス、イソキサフルトールなどのイソオキサゾールのクラス、ピラスルホトール、ピラゾレート、トプラメゾン、ベンゾフェナップなどのピラゾリネートのクラス（ピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤と呼ぶ）、又はジケトニトリルなどのジケトンのクラスのＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低いＨＰＰＤ酵素をコードする。

【0068】

本発明によれば、「核酸配列」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ型、好ましくは、ＤＮＡ型、特に、天然又は合成起源の二本鎖、特に、本発明のＨＰＰＤをコードするコドンが、発現が行われる宿主生物に基づいて最適化されているＤＮＡ配列（例えば、コドンを、オリジナル又は起源生物と比較して、そのような宿主生物又はそのような宿主生物が属する群のコドン使用頻度においてより好ましい又は最も好ましいコドンで置換することにより）であることができる、ヌクレオチド配列であると理解される。

【0069】

「単離核酸／ＤＮＡ／タンパク質」は、本明細書において使用される場合、非天然（天然ＤＮＡとは異なるヌクレオチド配列を有する人工もしくは合成ＤＮＡ、又は改変タンパク質など）であるか、又は元来存在した自然環境にもはや存在しない核酸／ＤＮＡ／タンパク質、例えば、キメラ遺伝子における異種調節要素と関連するＤＮＡコード配列（植物で発現可能なプロモーターに操作可能に連結された細菌のコード配列など）、トランスジェニック植物細胞などの別の宿主細胞に導入されたＤＮＡを指す。

【0070】

本発明の特定の実施態様と求められる解決、即ち、トリケトン、イソオキサゾール又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性が低いＨＰＰＤを考慮して、耐性レベルの測定は、トリケトン、イソオキサゾール又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤、特に、テンボトリオン、メソトリオン、ピラスルホトール、トプラメゾン、スルコトリオン、ビシクロピロン、ジケトニトリル、ベンゾフェナップ、ピラゾレート、テフリルトリオンから選択されるＨＰＰＤ阻害剤を使用し、後述するWO 2009/14407に詳しく記載されている方法を用いて分析した。

【0071】

特定の配列「Ｘ」を「含む」ＤＮＡ又はタンパク質という専門用語は、本文全体を通して使用される場合、他のヌクレオチド又はアミノ酸配列が、５’（又はＮ末）及び／又は３’（又はＣ末）端、例えば、選択マーカータンパク質（のヌクレオチド配列）、トランジットペプチド（のヌクレオチド配列）、及び／又は５’リーダー配列又は３’トレーラー配列に含まれうるように、少なくとも配列「Ｘ」を含む又は含有するＤＮＡ又はタンパク質を指す。同様に、本文及び本願の特許請求の範囲全体を通して、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」又は「含む（comprises）」という用語の使用は、規定の整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群を含むが、任意の他の整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群が除外されるわけではないことを意味することと理解されるものとする。

【0072】

本発明の一実施態様においては、ＨＰＰＤをコードするコード領域は、配列番号１、２及び３のヌクレオチド配列などの、配列番号４、５、６及び７に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0073】

本発明の別の実施態様においては、ＨＰＰＤをコードするコード領域は、配列番号１５、１６及び１７のヌクレオチド配列などの、配列番号１８、１９、２０及び２１に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0074】

しかし、その挿入、欠失及び置換を含むこれらのヌクレオチド配列のバリアントも、また、同じ目的に使用することができることが明らかであろう。同様に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．と異なる種由来の上記ヌクレオチド配列に対する同族体を使用することもできる。

【0075】

記載のヌクレオチド配列のバリアントは、配列表で同定された配列などのＨＰＰＤ酵素をコードする同定されたヌクレオチド配列に対して、好ましくは、少なくとも約８０％、又は８５又は９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するであろう。

【0076】

本発明に記載されるタンパク質と「実質的に同じアミノ酸配列」を有するタンパク質は、本明細書において使用される場合、本発明のタンパク質に対して、少なくとも９０％、特に、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９７％の配列同一性を有するタンパク質を指し、ここで、配列同一性パーセントは、ＧＣＧのWisconsinパッケージのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA）バージョン１０．０（ＧＣＧデフォルト使用）のblosum62スコアリングマトリックス用いて決定される。タンパク質に関する「配列同一性」は、本願全体を通して使用される場合、この特定の分析を用いた同一アミノ酸のパーセントを指す。ＤＮＡ配列に関する「配列同一性」は、本明細書において使用される場合、ＧＣＧのWisconsinパッケージのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA）バージョン１０．０（ＧＣＧデフォルト使用）のnwsgapdnaスコアリングマトリックスを用いて決定される。

【0077】

本発明の目的のために、２つの関連するヌクレオチド又はアミノ酸配列の「配列同一性」（パーセントで表される）は、２つの最適にアラインされた配列内の、同一の残基を有する位置の数を比較する位置の数で割った値（×１００）を指す。ギャップ、即ち、一方の配列には残基が存在するが、他方の配列には存在しないアラインメントの位置は、非同一残基の位置とみなされる。２つの配列のアラインメントは、Needleman and Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch 1970）により実施される。上記のコンピュータ支援配列アライメントは、Wisconsinパッケージバージョン１０．１（Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, USA）の一部のＧＡＰなどの標準ソフトウェアプログラムを用いて、ギャップ開始ペナルティー（gap creation penalty）を５０、ギャップ伸長ペナルティー（gap extension penalty）を３としたデフォルトスコアリングマトリックスを用いて容易に実施することができる。

【0078】

本発明のＨＰＰＤ酵素をコードするヌクレオチド配列に相同のヌクレオチド配列は、ゲノム配列データのin silico分析により同定することができる。

【0079】

相同ヌクレオチド配列は、また、同定された本発明のＨＰＰＤ酵素をコードするヌクレオチド配列又はその一部をプローブとして使用して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることにより同定及び単離することができる。そのような一部は、好ましくは、本発明のＨＰＰＤコード遺伝子配列のコード領域由来の、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７のコード領域由来の少なくとも４０個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有するべきである。しかし、プローブは、ＨＰＰＤコード核酸、例えば、上記のＨＰＰＤ遺伝子のいずれかの約５０、６０、７５、１００、２００又は５００個の連続ヌクレオチド由来のより長いヌクレオチド配列領域を含んでもよい。好ましくは、プローブは、異なるＨＰＰＤタンパク質をアラインすることにより同定することができる高度に保存された領域をコードするヌクレオチド配列を含むべきである。

【0080】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書において使用される場合、プローブと標的配列間で少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９７％の配列同一性がある場合に、ハイブリダイゼーションが全体的に起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mM クエン酸三ナトリウム）、５０mM リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Denhardt溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μg/mlの変性させた剪断キャリアＤＮＡ（例えば、サケ精子ＤＮＡ）を含む溶液中で、一晩インキュベーションして、その後、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でハイブリダイズ支持体を、好ましくは、２回、約１０分間洗浄することである。他のハイブリダイゼーション及び洗浄条件はよく知られており、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)の特に１１章に例示されている。

【0081】

そのようなバリアント配列は、また、プライマーとしての酵素をコードするＨＰＰＤ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド、例えば、非限定的に、配列番号１、２、３、１５、１６、１７又はその相補体のヌクレオチド配列から選択される約２０〜約５０個の連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを使用したＤＮＡ増幅により得ることができる。

【0082】

本発明は、また、１つ以上のアミノ酸が挿入、欠失又は置換されている、配列番号４又は配列番号１８のＨＰＰＤアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列である、バリアントＨＰＰＤ酵素を包含する。本文において、アミノ酸配列のバリアントは、任意のアミノ酸の置換、付加又は欠失があるにもかかわらず、本明細書に記載のアミノ酸配列と同様の触媒活性を有する、ポリペプチド、酵素又はタンパク質を指す。好ましくは、バリアントアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、又は８５又は９０％又は９５％の配列同一性を有する。また、好ましくは、バリアントアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ＨＰＰＤ酵素活性を有する。ＨＰＰＤ酵素活性を決定する方法は当技術分野でよく知られており、WO 2009/144079又はWO 2002/046387に詳しく記載されているアッセイを含む。

【0083】

置換は、アミノ酸が異なる天然又は特殊アミノ酸残基で置換されているアミノ酸変化を包含する。そのような置換は、本発明のＨＰＰＤタンパク質に含有されるアミノ酸残基が類似の性質の別の天然アミノ酸で置換されている「保存的」に分類することができる。例えば、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ又はＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒ。本発明により包含される置換は、また、本発明のＨＰＰＤタンパク質に存在するアミノ酸残基が、異なる性質のアミノ酸、例えば、異なるグループの天然アミノ酸で置換されている（例えば、荷電又は疎水性アミノ酸をアラニンで置換する）「非保存的」であってもよい。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基の置換であるが、集合又は分散した複数の残基の置換であってもよい。アミノ酸の欠失は、通常、約１〜１０個程度のアミノ酸残基の欠失であるが、一方で、挿入はいずれの長さが挿入されてもよい。欠失及び挿入は、Ｎ末端、Ｃ末端で起こってもよく、内部の欠失又は挿入でもよい。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ又はカルボキシ末端融合よりも小さく、１〜４個程度のアミノ酸残基の挿入であろう。「類似アミノ酸」は、本明細書において使用される場合、類似のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸、即ち、極性、非極性又は実質的に中性の側鎖を有するアミノ酸を指す。「非類似アミノ酸」は、本明細書において使用される場合、異なるアミノ酸側鎖を有するアミノ酸を指し、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、非極性側鎖を有するアミノ酸と非類似である。極性側鎖は、通常、細胞内の水性環境と相互作用することができる、タンパク質の表面に存在する傾向がある（「親水性」アミノ酸）。一方、「非極性」アミノ酸は、類似の非極性の仲間と相互作用することができるタンパク質の中心内部に存在する傾向がある（「疎水性」アミノ酸）。極性側鎖を有するアミノ酸の例は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン及びトレオニンである（疎水性のシステインを除いて全ての親水性）。非極性側鎖を有するアミノ酸の例は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びトリプトファンである（中性のグリシンを除いて全て疎水性）。

【0084】

また、本発明のＨＰＰＤ酵素を特異的に認識する抗体が本発明に包含される。

【0085】

本発明は、また、植物を形質転換するための方法における、植物にＨＰＰＤ阻害剤である除草剤に対する耐性を付与することが可能なマーカー遺伝子又はコード配列として本発明のＨＰＰＤをコードする核酸の使用、及び本発明のＨＰＰＤをコードする核酸配列を含む植物でのＨＰＰＤ阻害剤の使用に関する。

【0086】

本発明の一実施態様においては、そのような使用におけるＨＰＰＤ阻害剤は、トリケトン又はピラゾリネート、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン又はスルコトリオン、ビシクロピロン及びテフリルトリオンである。当然のことながら、この配列が、また、有用な農学特性を有する１つ以上のタンパク質をコードする他の遺伝子マーカー及び／又は配列との組み合わせで使用することができることを理解されたい。

【0087】

作物の商業的生産では、信頼性の高い農薬管理下で、作物農地から不要な植物（即ち、「雑草」）を除去することが望まれる。理想的な処理は、農地全体に適用することができる処理であるが、作物に影響を与えず、不要な植物のみを除去することができる処理であろう。そのような処理システムの１つは、除草剤に耐性を有する作物の使用を含み、それによって、除草剤が除草剤耐性作物の農地に散布されたとき、除草剤に非耐性の雑草が死滅するか、又は重大な損傷を受ける一方で、該作物が成長し続けるであろう。理想的には、そのような処理システムは、雑草の防除により適応性と経済性の最良の可能な組み合わせが提供されるように、除草剤特性を変更する利点を有するであろう。例えば、個々の除草剤は農地で異なる寿命を有しており、いくつかの除草剤は長く持続して、農地に適用後も比較的長期間有効であるが、一方で、急速に他の化合物及び／又は非活性な化合物に分解される除草剤もある。理想的な処理システムは、栽培者が除草剤の選択を特定の状況に合わせて調整することができるように異なる除草剤の使用が可能であろう。

【0088】

多数の除草剤耐性作物が現在市販されているが、多くの市販の除草剤及び除草剤／作物の組み合わせに関する１つの問題は、個々の除草剤が、典型的に、共通の雑草種に対して不十分な活性スペクトラムを有することである。以前から使用されてきた各除草剤の多くの場合で、除草剤に耐性の雑草種の集団及びバイオタイプがさらに蔓延するようになった（例えば、Tranel and Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen and Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311参照）。２つ以上の除草剤に耐性を有するトランスジェニック植物が記載されている（例えば、W02005/012515参照）。しかし、作物生産のあらゆる局面の改善、雑草の防除の選択、残留雑草の防除の拡張、及び作物収量の改善が引き続き求められている。

【0089】

本発明のＨＰＰＤタンパク質又は遺伝子は、植物内で、そのような植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質又はＲＮＡをコードする他の遺伝子と組み合わせることが有利である。形質転換植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質又はＲＮＡをコードする遺伝子の中で、化学構造に基づきＨＰＰＤ阻害型除草剤とは異なる１つ以上の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、及び特定の昆虫に対する耐性を付与するもの、特定の病気に対して耐性を付与するもの、線虫又は昆虫防除を提供するＲＮＡをコードするＤＮＡなどを挙げることができる。

【0090】

そのような遺伝子は、特に、公開されているＰＣＴ特許出願WO 91/02071及びWO95/06128に記載されている。

【0091】

形質転換植物細胞及び植物に、特定の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の中で、グルホシネート除草剤に対する耐性を付与するWO2009/152359に記載のｂａｒもしくはＰＡＴ遺伝子又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ遺伝子、グリホセート及びその塩などの標的としてＥＰＳＰＳを有する除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（US 4,535,060、US 4,769,061、US 5,094,945、US 4,940,835、US 5,188,642、US 4,971,908、US 5,145,783、US 5,310,667、US 5,312,910、US 5,627,061、US 5,633,435）、又はグリホセートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（US 5,463,175）を挙げることができる。

【0092】

標的としてＥＰＳＰＳを有する除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中で、より具体的には、植物ＥＰＳＰＳ、特に、トウモロコシＥＰＳＰＳ、特に、２つの突然変異、具体的には、アミノ酸１０２位の突然変異とアミノ酸１０６位の突然変異を含むトウモロコシＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（WO 2004/074443）であり、本明細書下記で二重突然変異トウモロコシＥＰＳＰＳ又は２ｍＥＰＳＰＳと称する特許出願US 6566587に記載の遺伝子、又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから単離されたＥＰＳＰＳをコードし、米国特許第5,633,435号の配列番号２及び配列番号３で記載される遺伝子（ＣＰ４とも呼ぶ）を挙げることができる。

【0093】

標的としてＥＰＳＰＳを有する除草剤に対する耐性を付与する適切なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列の中で、より具体的には、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のＥＰＳＰＳ ＧＲＧ２３をコードする遺伝子、さらには、突然変異体ＧＲＧ２３ ＡＣＥ１、ＧＲＧ２３ ＡＣＥ２、又はＧＲＧ２３ ＡＣＥ３、特に、WO2008/100353に記載されるようなＧＲＧ２３の突然変異体及びバリアント、例えば、WO2008/100353の配列番号２９のＧＲＧ２３（ａｃｅ３）Ｒ１７３Ｋを挙げることができる。

【0094】

ＥＰＳＰＳをコード、より具体的には、上記遺伝子をコードするＤＮＡ配列の場合、これらの酵素をコードする配列の前に、トランジットペプチドをコードする配列、特に、米国特許第5,510,471号又は第5,633,448号に記載の「最適化されたトランジットペプチド」が先行することが有利である。

【0095】

WO 2007/024782では、グリホセート及び少なくとも１つのＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害剤に耐性を有する植物が開示されている。より具体的には、ＧＡＴ（グリホセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）ポリペプチド及びＡＬＳ阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する植物が開示されている。

【0096】

米国特許第6,855,533号では、突然変異ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＬＳ／ＡＨＡＳ遺伝子を含有するトランスジェニックタバコ植物が開示されている。

【0097】

米国特許第6,153,401号では、代謝により、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）に対する耐性を付与する２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を含有する植物が開示されている。

【0098】

US 2008/0119361及びUS 2008/0120739では、代謝により、ジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）に対する耐性を付与するジカンバモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を含有する植物が開示されている。

【0099】

上述の除草剤の耐性特性の全てを、本発明の主題であるＨＰＰＤ耐性を達成する特性と組み合わせることができる。

【0100】

昆虫の耐性特性に関するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の中で、より具体的には、文献に広範に記載されており、当業者によく知られているＢｔタンパク質を挙げることができる。またＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓなどの細菌から抽出されたタンパク質も挙げることができる（WO 97/17432 & WO 98/08932）。

【0101】

昆虫に対する新規な耐性特性を付与する対象のタンパク質をコードするそのようなＤＮＡ配列の中で、より具体的には、文献に広範に記載されており、当業者によく知られているＢｔ Ｃｒｙ又はＶＩＰタンパク質を挙げることができる。これらは、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質又はＣｒｙ１Ｆタンパク質から誘導されるハイブリッド（例えば、US 6,326,169；US 6,281,016；US 6,218,188に記載のハイブリッドＣｒｙ１Ａ−Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、又はその毒性フラグメント）、Ｃｒｙ１Ａ型タンパク質又はその毒性フラグメント、好ましくは、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質又はＣｒｙ１Ａｃタンパク質から誘導されるハイブリッド（例えば、US 5,880,275に記載のハイブリッドＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質）又はEP451878に記載されるようなＣｒｙ１ＡｂもしくはＢｔ２タンパク質又はその殺虫性フラグメント、WO02/057664に記載されるようなＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ又はＣｒｙ２Ａｇタンパク質又はその毒性フラグメント、WO 2007/140256に記載のＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（配列番号７）又はその毒性フラグメント、ＮＣＢＩ登録番号ＡＢＧ２０４２８のＶＩＰ３Ａａ１９タンパク質、ＮＣＢＩ登録番号ＡＢＧ２０４２９のＶＩＰ３Ａａ２０タンパク質（WO 2007/142840の配列番号２）、ＣＯＴ２０２又はＣＯＴ２０３のコットンイベントで産生されたＶＩＰ３Ａタンパク質（それぞれ、WO 2005/054479及びWO 2005/054480）、WO01/47952に記載されるようなＣｒｙタンパク質、Estruch等(1996)、Proc Natl Acad Sci U S A. 28;93(11):5389-94及びUS 6,291,156に記載されるようなＶＩＰ３Ａａタンパク質又はその毒性フラグメント、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ由来の殺虫性タンパク質（WO98/50427に記載されるような）、Ｓｅｒｒａｔｉａ種株（特に、Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ由来）又はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ種株、例えば、WO98/08932に記載されるようなＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ由来のＴｃ−タンパク質（例えば、Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench-Constant and Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33）を含む。また、いくつかの（１〜１０、好ましくは、１〜５）アミノ酸が、上記配列、特に、その毒性フラグメントの配列のいずれかと異なっているか、又はトランジットペプチド、例えば、色素体トランジットペプチド、又は別のタンパク質又はペプチドに融合している、これらのタンパク質のいずれか１つの任意のバリアント又は突然変異体も本明細書に含まれる。

【0102】

本発明は、また、コード配列、ならびに、５’及び／又は３’位、少なくとも５’位に、宿主生物、特に、植物細胞又は植物で機能することが可能な異種調節要素を含み、該コード配列が、上記で定義されるようなＨＰＰＤをコードする少なくとも１つの核酸配列を含有する、キメラ遺伝子（又は発現カセット）に関する。

【0103】

特定の実施態様においては、本発明は、宿主生物が、細菌、酵母、Ｐｉｃｈｉａ属、真菌、バキュロウイルス、in vitro細胞、プロトプラスト、植物細胞、植物、植物の一部及びその植物種子から選択される、上述されるキメラ遺伝子に関する。

【0104】

別の特定の実施態様においては、本発明は、キメラ遺伝子が、本発明のＨＰＰＤをコードする核酸配列の５’位に、植物トランジットペプチドをコードする核酸配列を含有し、この配列が、トランジットペプチド／ＨＰＰＤ融合タンパク質の発現が可能となるようにプロモーター領域と本発明のＨＰＰＤをコードする配列間に配置される、上述されるキメラ遺伝子に関する。

【0105】

さらに特定の実施態様においては、本発明は、単独で又はＨＰＰＤ阻害剤に異なる作用を有する１つ以上の他の公知の除草剤と組み合わせて、本発明のＨＰＰＤ耐性遺伝子を含む植物、植物の一部又は植物種子でのＨＰＰＤ阻害型除草剤の使用、又はそのような植物、植物の一部又は種子が成長するか、又は播種される土壌でのＨＰＰＤ阻害型除草剤の使用に関する。より特定の実施態様においては、用いられるＨＰＰＤ阻害型除草剤は、トリケトン（トリケトンＨＰＰＤ阻害剤と呼ぶ）、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、特に、テンボトリオン、ジケトンのクラス、例えば、ジケトニトリル、イソオキサゾールのクラス、例えば、イソキサフルトール、又はピラゾリネートのクラス（ピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤と呼ぶ）、例えば、ピラスルホトール、ピラゾレート、トプラメゾン、ベンゾフェナップからなる群より選択される。さらにより具体的には、本発明は、そのようなＨＰＰＤ阻害剤耐性の植物、植物の一部又は植物種子に対する、テンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリル、ビシクロピロン、テフリルトリオン、ベンゾフェナップ、ピラスルホトール、ピラゾレート及びスルコトリオンの適用に関する。

【0106】

植物細胞及び植物でプロモーターとして機能する調節配列としては、植物で自然に発現している任意の遺伝子のプロモーター配列、特に、植物の葉で特に発現しているプロモーター、例えば、細菌、ウイルス又は植物起源の「構成的」プロモーター、又は「光依存性」プロモーター、例えば、植物のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）小サブユニット遺伝子のプロモーター、又は使用することができる任意の適切な公知の発現可能なプロモーターを使用することができる。植物起源のプロモーターの中で、EP 0 507 698 A1に記載されるようなヒストンプロモーター、コメアクチンプロモーター（US 5,641,876）、又は植物のユビキチンプロモーター（US 5,510,474）が挙げられる。植物ウイルス遺伝子のプロモーターの中で、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ １９Ｓ又は３５Ｓ、Sanders等(1987)、Nucleic Acids Res. 15(4):1543-58)、サーコウイルス（AU 689 311）、又はキャッサバベインモザイクウィルス（ＣｓＶＭＶ、US 7,053,205）のプロモーターが挙げられる。

【0107】

本発明の一実施態様においては、植物の特定の領域又は組織に特異的なプロモーター配列、例えば、種子特異的なプロモーター（Datla, R. et al., 1997、Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296）、特に、ｎａｐｉｎプロモーター（EP 255 378 A1）、ファゼオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター（WO 92/17580）、アルブミンプロモーター（WO 98/45460）、オレオシンプロモーター（WO 98/45461）、ＳＡＴ１プロモーター又はＳＡＴ３プロモーター（PCT/US98/06978）を使用して、本発明のＨＰＰＤタンパク質を発現させることができる。

【0108】

また、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ）、キチナーゼ、グルカナーゼ、プロティナーゼ阻害剤（ＰＩ）、ＰＲ１ファミリー遺伝子、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）及びｖｓｐＢプロモーター（US 5 670 349、表３）、ＨＭＧ２プロモーター（US 5 670 349）、リンゴβ−ガラクトシダーゼ（ＡＢＧ１）プロモーター及びリンゴアミノシクロプロパンカルボン酸シンターゼ（ＡＣＣシンターゼ）プロモーター（WO 98/45445）から有利に選択される誘導プロモーターを使用することもできる。

【0109】

本発明によれば、また、プロモーターとコード配列間に位置している他の調節配列、例えば、転写アクチベーター（「エンハンサー」）、例えば、特許出願WO 87/07644に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の翻訳アクチベーター、又は、例えばCarrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597に記載のタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻訳アクチベーター、又はトウモロコシのａｄｈ１イントロンもしくはコメアクチンのイントロン１などのイントロンを、プロモーターと組み合わせて使用することができる。

【0110】

さらに特定の実施態様においては、本発明の遺伝子は植物中に、複数、好ましくは、２コピーで存在しており、これらの各々は、異なる植物で発現可能なプロモーターで制御されている。

【0111】

さらに特定の実施態様においては、本発明のキメラ遺伝子は、ＨＰＰＤタンパク質をコードする任意のさらなるキメラ遺伝子と組み合わせることができ、好ましくは、これらの異なる遺伝子は、植物中で活性である異なる調節要素で制御されている。

【0112】

さらに特定の実施態様においては、本発明のキメラ遺伝子は、同一又は異なる植物で発現可能なプロモーターの制御下にある、ＣＹＰ４５０トウモロコシモノオキシゲナーゼ（ｎｓｆ１遺伝子）遺伝子と組み合わせることができる。

【0113】

調節ターミネータ又はポリアデニル化配列としては、細菌起源の任意の対応する配列、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのｎｏｓターミネータなど、ウイルス起源の任意の対応する配列、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータなど、又は植物起源の任意の対応する配列、例えば、公開されている特許出願EP 0 633 317 A1に記載されるヒストンターミネータなどを使用することができる。

【0114】

「遺伝子」という用語は、本明細書において使用される場合、典型的には、少なくともプロモーター領域を含む、タンパク質に翻訳することができるＲＮＡを転写可能な、５’及び／又は３’調節配列によってフランキングされたＤＮＡコード領域を指す。「キメラ遺伝子」は、本発明のＨＰＰＤコードＤＮＡに関する場合、そのネイティブ宿主細胞においてＨＰＰＤタンパク質の発現を駆動する、天然の細菌の５’及び／又は３’調節配列とは異なる５’及び／又は３’調節配列を有するＨＰＰＤコードＤＮＡ配列を指す（また、「異種プロモーター」又は「異種調節配列」とも呼ぶ）。

【0115】

「配列Ｘを含むＤＮＡ／タンパク質」及び「配列Ｘを含む配列を有するＤＮＡ／タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、他のヌクレオチド又はアミノ酸配列が、５’（又はＮ末）及び／又は３’（又はＣ末）端に含まれうるように（例えば、Ｎ末端トランジット又はシグナルペプチド）、そのヌクレオチド又はアミノ酸配列に少なくとも配列Ｘを含む又は含有するＤＮＡ又はタンパク質を指す。「含む（comprising）」という用語は、本明細書において使用される場合、「含む（including）」の意味で非制限的な言葉であり、具体的に列挙される以外の他の要素がまた存在することができることを意味する。「からなる（consisting of）」という用語は、本明細書において使用される場合、限定的な言葉であり、即ち、具体的に列挙される要素のみが存在する。「配列Ｘを含むタンパク質をコードするＤＮＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、転写及び翻訳後に、少なくともアミノ酸配列Ｘを含有するタンパク質を生じるコード配列を含むＤＮＡを指す。タンパク質をコードするＤＮＡは天然のＤＮＡである必要はなく、半合成、全合成又は人工ＤＮＡであってもよく、そして、イントロン及び５’及び／又は３’フランキング領域を含むことができる。「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において使用される場合、一本鎖又は二本鎖形態でありうるＤＮＡ又はＲＮＡ分子の配列を指す。

【0116】

本発明のＨＰＰＤタンパク質は、当技術分野で公知の手順（例えば、公開されているＰＣＴ特許出願WO 96/10083を参照）に従ってシグナルペプチドを備えていてもよく、又は他のペプチド、例えば、該タンパク質を葉緑体に輸送する葉緑体トランジットペプチド（例えば、Van Den Broeck et al., 1985, Nature 313, 358、又は米国特許第5、510,471号の改変葉緑体トランジットペプチド）、分泌シグナルペプチド、又は該タンパク質を他の色素体、ミトコンドリア、ＥＲもしくは別の細胞小器官に標的化するペプチドで置換されていてもよく、又はメチオニンアミノ酸又はメチオニン−アラニンジペプチドで置換されていてもよい。細胞内小器官を標的とする又は植物細胞外又は細胞壁へ分泌するシグナル配列、好ましくは、Klosgen等（1989, Mol. Gen. Genet. 217, 155-161）、Klosgen及びWeil（1991, Mol. Gen. Genet. 225, 297-304）、Neuhaus & Rogers（1998, Plant Mol. Biol. 38, 127-144）、Bih等（1999, J. Biol. Chem. 274, 22884-22894）、Morris等（1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333）、Hesse等（1989, EMBO J. 8 2453-2461）、Tavladoraki等（1998, FEBS Lett. 426, 62-66）、Terashima等（1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523）、Park等（1997, J. Biol. Chem. 272、6876-6881）、Shcherban等（1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 9245-9249）（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）により記載されるシグナル配列、特に、コーン、コットン、ダイズ又はコメの標的又は分泌タンパク質由来のシグナルペプチド配列が、天然の標的又は分泌タンパク質に見出されている。そのような植物シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、植物で発現するためにＨＰＰＤタンパク質をコードするキメラ遺伝子内に挿入することができる。

【0117】

例示において特に指示しない限り、組換えＤＮＡを製造及び操作する手順の全ては、Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY (1989)、及びAusubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの１及び２巻に記載の標準的手順により実施することができる。植物分子生物学研究の標準的な材料及び方法は、R.R.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)（BIOS Scientific Publications Ltd (UK)及びBlackwell Scientific Publications (UK)による共同出版）に記載されている。ＰＣＲ技術の手順は、「PCR protocols: a guide to methods and applications」, Edited by M.A. Innis、D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (Academic Press, Inc., 1990) に見出すことができる。

【0118】

「耐性（tolerance）」、「耐性がある（tolerant）」又は「低感受性」という用語は互換的に使用され、異なる濃度の様々なＨＰＰＤ阻害剤の存在下で、各ＨＰＰＤタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸で形質転換した菌株又は植物の目に見える指標表現型に従ってスクリーニングされる、ＨＰＰＤの内在的耐性の相対レベルを意味する。これらの指標表現型（褐色の呈色、増殖阻害、白化、除草効果など）と関連する用量反応及び用量反応の相対的シフトは、従来より、異なる除草剤の濃度範囲での、植物の損傷、分裂組織の白化症状などに基づく通常の方法で、例えば、ＧＲ５０（生育を５０％減少させる濃度）又はＭＩＣ（最小発育阻止濃度）値によって表され、ここで、値の増加は、発現されたＨＰＰＤの内在的耐性の増加に対応する。これらのデータは、例えば、ｘ軸にプロットされる「用量」とｙ軸にプロットされる「死滅パーセント」、「除草効果」、「緑色植物の発芽数」などを有する用量／反応曲線から得られるＧＲ５０値によって表すことができ、ここで、ＧＲ５０値の増加は、発現されたＨＰＰＤの内在的耐性レベルの増加に対応する。除草剤は、発芽前又は出芽後に適切に適用することができる。

【0119】

同様に、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸もしくは遺伝子、又は本発明のＨＰＰＤタンパク質の耐性レベルは、タバコなどの試験植物、又はダイズもしくはコットンなどの作物の遺伝子組換え、再生、育種及び散布試験を介してスクリーニングされ、これらの結果によれば、そのような植物は、テンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリル及び／又はビシクロピロンのようなＨＰＰＤ阻害剤に対して、ＨＰＰＤタンパク質をコードする外来遺伝子を全く含有しない植物より、又は本発明のＨＰＰＤ ＤＮＡと同じプロモーターの制御下でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＨＰＰＤコードＤＮＡを含む遺伝子を含有する植物より、少なくとも２〜４倍耐性が高い。

【0120】

「宿主生物」又は「宿主」は、本発明のＨＰＰＤを産生する目的のために本発明の核酸又はキメラ遺伝子を導入することができる、任意の単細胞又は多細胞異種生物であると理解される。これらの生物は、特に、細菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、酵母、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、真菌、特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、バキュロウイルス、又は、好ましくは、植物細胞及び植物である。

【0121】

「植物細胞」は、本発明によれば、植物に由来又は見出され、カルスなどの未分化組織、胚、植物の一部、植物又は種子などの分化組織を生成することができるか、又はその一部である任意の細胞であると理解される。これは、プロトプラスト及び花粉、培養植物細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏで成長したプロトプラストならびに完全な植物に再生することができる植物細胞を含む。

【0122】

「植物」は、本発明によれば、光合成することができる任意の分化多細胞生物、特に、単子葉植物又は双子葉植物、とりわけ、動物又はヒトの食物を意図する又は意図しない栽培植物、例えば、トウモロコシ又はコーン、コムギ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．植物、例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ又はＢｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、ダイズ類、コメ、サトウキビ、ビートルート、タバコ、コットン、野菜植物、例えば、キュウリ、リーキ、ニンジン、トマト、レタス、コショウ、メロン、スイカなどであると理解される。トランスジェニック植物は、本明細書において使用される場合、ゲノムに安定に挿入された外来又は異種遺伝子を含む植物を指す。

【0123】

一実施態様においては、本発明は、植物の形質転換に関する。植物で自然に発現される遺伝子の任意のプロモーター配列、又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ又は植物ウイルスプロモーターを含む、植物で自然に発現される遺伝子のプロモーター要素の任意のハイブリッド又は組み合わせ、又は植物の除草剤耐性遺伝子の転写の制御に適切な任意のプロモーター（本明細書において、「植物で発現可能なプロモーター」と呼ぶ）を、本発明の植物において、プロモーター配列として使用することができる。そのような適切な植物で発現可能なプロモーターの例は上述されている。本発明の一実施態様においては、そのような植物で発現可能なプロモーターは、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードするコード配列に操作可能に連結され、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子を形成する。

【0124】

本発明によれば、プロモーター調節配列と組み合わせて、プロモーターとコード配列間に位置している他の調節配列、例えば、イントロン配列、又は転写アクチベーター（エンハンサー）を使用することも可能である。そのような適切な調節配列の例は上述されている。

【0125】

細菌又はウイルス起源の任意の対応する配列、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のｎｏｓターミネータ、又は植物起源の任意の対応する配列、例えば、特許出願EP 0 633 317 A1に記載されるヒストンターミネータなどを転写終結（及びポリアデニル化）調節配列として使用することができる。

【0126】

本発明の一特定の実施態様においては、配列番号６、配列番号７、配列番号２０又は配列番号２１のタンパク質などのトランジットペプチドＨＰＰＤ融合タンパク質の発現を可能にするために、トランジットペプチドをコードする核酸配列が本発明の外因性ＨＰＰＤをコードする核酸配列の５’（上流）で用いられ、このトランジットペプチド配列は、プロモーター領域と外因性ＨＰＰＤをコードする配列間に配置される。トランジットペプチドにより、ＨＰＰＤを色素体、特に、葉緑体に移動させることが可能となり、融合タンパク質は色素体に本発明のＨＰＰＤタンパク質が導入されたときにトランジットペプチドと本発明のＨＰＰＤタンパク質間で開裂される。トランジットペプチドは、単一ペプチド、例えば、ＥＰＳＰＳトランジットペプチド（米国特許第5,188,642号に記載）、又は植物のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼスモールサブユニット（ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕ）のトランジットペプチド（必要に応じて、成熟ＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのＮ末端部分の数個のアミノ酸を含む（EP 189 707 A1））であってもよく、又はいくつかのトランジットペプチドの融合物、例えば、特許第EP 508 909 A1号に記載されるような、色素体位置を有する成熟タンパク質のＮ末端配列の一部に融合した第一の植物トランジットペプチドと、この一部分に融合している第二の植物トランジットペプチドを含むトランジットペプチドであってもよく、そして、より具体的には、トウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのトランジットペプチドに融合しているトウモロコシＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのＮ末端の２２個のアミノ酸に融合したヒマワリＲｕＢｉｓＣＯ ｓｓｕのトランジットペプチドを含む、最適化されたトランジットペプチドであってもよい（特許第EP 508 909 A1号においてそのコード配列と共に記載される）。

【0127】

本発明は、また、トランジットペプチドＨＰＰＤ融合タンパク質及びそのような融合タンパク質をコードする核酸又は植物で発現可能なキメラ遺伝子に関し、この融合タンパク質の２つの要素は上記で定義されている。

【0128】

本発明は、また、クローニング、形質転換及び／又は発現ベクターに関し、該ベクターは上記で定義される少なくとも１つのキメラ遺伝子を含有する。上記キメラ遺伝子の他に、このベクターは複製起点を含有することができる。このベクターは、本発明のキメラ遺伝子を導入することにより形質転換されたプラスミドもしくはプラスミドの一部、コスミドもしくはバクテリオファージ、又はウイルスであってもよい。形質転換ベクターは当業者によく知られており、文献に幅広く記載されている。特に、植物細胞又は植物の形質転換に使用することができる形質転換ベクターは、植物細胞又は植物の形質転換に用いることができ、自己の複製及び発現要素を追加で含有するウイルスであってよい。本発明によれば、植物細胞又は植物を形質転換するためのベクターは、好ましくは、プラスミド、例えば、不活化ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｉプラスミドである。

【0129】

本発明は、また、本発明のＨＰＰＤタンパク質、例えば、上記で定義される配列番号４又は配列番号１８、配列番号５、６、７，１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする配列を含むキメラ遺伝子を含む、宿主生物、特に、植物細胞、種子又は植物、及び農地において、作物を成長させ、植物生産物、例えば、ダイズ類、コメ、コムギ、オオムギもしくはトウモロコシ穀粒、又はコットンボールを収穫するための本発明の植物又は種子の使用に関し、ここで、一実施態様においては、前記使用は、雑草を防除するための、ＨＰＰＤ阻害型除草剤のそのような植物への適用を含む。本発明の一実施態様においては、そのような使用におけるＨＰＰＤ阻害剤は、トリケトン又はピラゾリネート、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾン又はスルコトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ベンゾフェナップ及びテフリルトリオン、特に、テンボトリオンである。

【0130】

従って、本発明は、上述の少なくとも１つのＨＰＰＤキメラ遺伝子、又は上述の少なくともＨＰＰＤ核酸配列を含有することを特徴とする宿主生物、特に、植物細胞、種子又は植物に関する。

【0131】

特定の実施態様においては、本発明は、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸への変換を触媒する特性を保持し、そして、植物を、特に、トリケトン又はピラゾリネート、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾン又はスルコトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ベンゾフェナップ及びテフリルトリオン、特に、テンボトリオンに対して、本発明のＨＰＰＤタンパク質を含まない同じ種の植物より高い耐性を有するようにする、本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含有することを特徴とする植物細胞又は植物に関し、そして、本発明のＨＰＰＤを含有するそのような植物は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤、特に、トリケトン又はピラゾリネート、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾン又はスルコトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ベンゾフェナップ及びテフリルトリオン、特に、テンボトリオンに対して農学的に許容しうる耐性を有する。

【0132】

別の特定の実施態様においては、本発明は、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸への変換を触媒する特性を保持し、そして、宿主植物の内因性ＨＰＰＤ、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＨＰＰＤ、特に、配列番号１１のアミノ酸配列（アミノ酸１２６位〜アミノ酸５６８位）、又は配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列（アミノ酸１３４位〜アミノ酸５７５位）を含むＨＰＰＤよりＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が低い、本発明のＨＰＰＤをコードする少なくとも１つの核酸配列を含有することを特徴とする植物細胞又は植物に関する。

【0133】

特定の実施態様においては、本発明は、本明細書で定義される本発明のＨＰＰＤをコードする少なくとも１つの核酸配列を含有することを特徴とする宿主植物細胞、種子又は宿主植物に関し、ここで、本発明のＨＰＰＤは、宿主植物の内因性ＨＰＰＤよりも、イソオキサゾール、ジケトニトリル、トリケトン又はピラゾリネートのクラス、より具体的には、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、スルコトリオン、ピラスルホトール、ビシクロピロン、テフリルトリオン、トプラメゾン、２-シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−ＣＦ_３フェニル）プロパン−１，３−ジオン及び２-シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ_２ＣＨ_３−４−２，３ Ｃｌ_２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、さらにより具体的には、テンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリル、ビシクロピロン、トプラメゾン、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、スルコトリオン、テフリルトリオン及びピラスルホトール、最も具体的には、テンボトリオン、メソトリオン及びビシクロピロンのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する感受性が低い。

【0134】

別の特定の実施態様においては、本発明は、上述の本発明のＨＰＰＤをコードする少なくとも１つの核酸配列、さらにはＰＤＨ（プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）酵素をコードする核酸配列に操作可能に連結された上述の植物で発現可能なプロモーターを含むキメラ遺伝子（US 2005/0257283）を含有することを特徴とする植物細胞又は植物に関する。

【0135】

本発明は、また、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子を含む形質転換細胞を含有する植物、特に、形質転換細胞から再生された植物、及びその子孫植物又は種子に関する。再生は、例えば、上記参考文献で記載される種の性質に依存する任意の適切な方法により達成することができる。特に、植物細胞の形質転換及び植物の再生の方法に関して下記特許及び特許出願を引用することができる：

【表7】

【0136】

本発明は、また、本発明のＨＰＰＤキメラ遺伝子を含む、トランスジェニック植物を培養及び／又は交配することにより得られるトランスジェニック植物又はその一部及びトランスジェニック植物の種子に関する。

【0137】

本発明は、また、本発明の植物、その一部又は種子から得られる最終産物、例えば、食物又は油に関する。

【0138】

本発明に従って得ることができる形質転換植物は、単子葉植物類、例えば、コムギ、オオムギ、サトウキビ、コメ、タマネギ及びコーン又はトウモロコシ、又は双子葉植物類、例えば、タバコ、ダイズ類、アルファルファ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．植物、例えば、菜種、コットン、テンサイ、クローバー、野菜などであってよい。

【0139】

本発明は、生物に上記で定義されるような少なくとも１つの核酸配列又は１つのキメラ遺伝子を組み込むことにより、宿主生物、特に、植物細胞又は植物を形質転換するための方法に関し、ここで、専門文献、特に、本願に引用される文献に詳しく記載されている任意の適切な公知の手段により、例えば、本発明のベクターを使用して形質転換を達成することが可能である。

【0140】

本発明による形質転換の方法の１つは、ＤＮＡが付着した又はＤＮＡを含有する固体又は液体粒子を、細胞、プロトプラスト又は組織に衝突させることを含む。別の形質転換の方法は、植物に導入する手段として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴｉプラスミド又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓＲｉプラスミドに挿入されたキメラ遺伝子を使用することを含む。マイクロインジェクション又はエレクトロポレーション、又はＰＥＧを用いて直接遺伝子を導入する方法などの他の方法を使用してもよい。当業者であれば、選択の宿主生物、特に、植物細胞又は植物を形質転換するための任意の適切な方法を選択することができる。例として、ダイズの形質転換技術がEP 1186666 A1に開示される実施例１〜３に詳しく記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。コメの場合では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Hiei et al., 1994 Plant J 6:271-282, 及び Hiei et al., 1997 Plant Mol Biol. 35:205-21、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）、エレクトロポレーション（US 5,641,664及びUS 5,679,558、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）、又は衝突（Christou et al., 1991、Biotechnology 9:957、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）を実施することができる。単子葉植物、特に、コメの形質転換の適切な技術は、WO 92/09696に記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。コットンの場合では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Gould J.H. and Magallanes-Cedeno M., 1998 Plant Molecular Biology reporter, 16:1-10 及び Zapata C., 1999, Theoretical Applied Genetics, 98(2):1432-2242、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）、ポリブレン及び／又は処理媒介（treatment-mediated）形質転換（Sawahel W.A., 2001, - Plant Molecular Biology reporter, 19:377a-377f、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）が記載されている。

【0141】

本発明の特定の実施態様においては、本発明のＨＰＰＤは葉緑体内に標的化される。これは、トランジットペプチドをコードする核酸配列を本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸配列に融合させて、上述の融合タンパク質をコードする核酸を得ることにより行ってもよい。

【0142】

あるいは、本発明のＨＰＰＤは、色素体、例えば、葉緑体ゲノムの形質転換を用いて、色素体、例えば、葉緑体で直接発現させてもよい。適切な方法は、ＤＮＡで被覆した固体粒子又はＤＮＡを含む液体粒子による植物細胞又は組織の衝突、及び相同的組換えによる本発明のタンパク質をコードする導入遺伝子の組み込みを含む。適切なベクター及び選択システムは当業者に知られている。タバコ植物の葉緑体ゲノムへのそのような組み込みに使用することができる手段及び方法の例は、WO 06/108830に提供されており、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0143】

本発明は、また、植物が上述の本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子で形質転換されることを特徴とする、ＨＰＰＤ阻害剤に対する植物を得るための方法に関する。

【0144】

従って、本発明は、また、植物が、５’位、場合により、３’位に、宿主生物で機能することが可能なコード配列ならびに異種調節要素を含む、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子を含有することを特徴とし、該コード配列が上述の本発明のＨＰＰＤをコードする遺伝子を定義する少なくとも１つの核酸配列を含むことを特徴とする、ＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する植物を得るための方法に関する。

【0145】

本発明の一実施態様においては、上記方法におけるＨＰＰＤ阻害剤は、トリケトン又はピラゾリネート除草剤、好ましくは、テンボトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、ピラスルホトール、ピラゾレート、ジケトニトリル、ベンゾフェナップ又はスルコトリオン、特に、テンボトリオンである。

【0146】

本発明によれば、また、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子である第一の導入遺伝子、及びＰＤＨ（プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）酵素をコードする核酸に操作可能に連結された植物で発現可能なプロモーターを含むキメラ遺伝子である第二の導入遺伝子を含む植物が得られることを特徴とする、上述のＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する植物を得るための方法が提供される。そのような２つの導入遺伝子を含む植物は、当技術分野でよく知られているように、植物を１つの導入遺伝子でトランスフェクションし、次に、このトランスジェニック植物を第二の導入遺伝子で再度形質転換することによるか、又は植物を２つの導入遺伝子で同時に形質転換する（同じ又は２つの異なる形質転換ＤＮＡ又はベクターで）ことによるか、又は第一の導入遺伝子を含む植物を、第二の導入遺伝子を含む植物と交配させることにより得ることができる。

【0147】

本発明は、また、植物を植えるもしくは種子を播種する農地又は作物の中で、ＨＰＰＤ阻害剤、特に、上記で定義されるＨＰＰＤ阻害型除草剤をそのような農地又は植物作物に適用することにより、雑草を選択的に除去する又は雑草の発芽を防除するための方法に関し、本方法は、このＨＰＰＤ阻害型除草剤を、作物を播種する前（本明細書下記で、播種前適用と呼ぶ）、作物の発芽前（本明細書下記で、発芽前適用と呼ぶ）、又は作物の発芽後（本明細書下記で、出芽後適用と呼ぶ）のいずれかに、本発明に従って形質転換された植物に適用することを特徴とする。

【0148】

本発明は、また、本発明において上述される形質転換種子を含む領域又は農地を管理するための方法に関し、本方法は、前記領域又は農地に、本発明において上述される本発明のＨＰＰＤ核酸又はキメラＨＰＰＤ遺伝子を含有する種子又は植物に重大な影響を与えることなく、前記雑草に毒性である用量のＨＰＰＤ阻害型除草剤を適用することを含む。

【0149】

本発明は、また、本発明のキメラ遺伝子で形質転換された植物を栽培するための方法に関し、本方法は、本発明のキメラ遺伝子を含む種子を前記植物の栽培に適切な農地の領域に播種し、そして、雑草が存在する場合、前記農地の前記領域に、前記形質転換種子又は前記形質転換植物に重大な影響を与えることなく、雑草に毒性である用量の標的が上記で定義されるＨＰＰＤである除草剤を適用し、次に、所望の成熟期に達したときに栽培植物又は植物の一部を収穫して、必要に応じて、収穫した植物から種子を分離することを含む。

【0150】

上記方法において、標的がＨＰＰＤ酵素である除草剤を、本発明に従って、作物を播種する前、作物の出芽前又は作物の出芽後のいずれかに適用することができる。

【0151】

本発明は、また、油、特に、ダイズ類、コーン又はコットン油、又は食物を得るための方法に関し、本方法は、作物、特に、ダイズ類作物を成長させ、本発明のＨＰＰＤタンパク質を発現させ、場合により、そのような作物をＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理して、穀物を収穫し、そして、穀物を製粉して食物を製造し、油を抽出することを含む。また、本発明のキメラ遺伝子を含む、全体、破砕又は粉砕された種子又は穀物も、本発明の一部である。

【0152】

従って、本発明は、上述の形質転換植物を成長させ、場合により、そのような植物をＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理して、穀物を収穫し、そして、穀物を製粉して食物を製造し、油を抽出することを含む、油又は食物を得るための方法に関する。

【0153】

さらに、本発明において、イソキサフルトール、テンボトリオン、メソトリオン、ピラスルホトール、スルコトリオン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、トプラメゾン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオンから選択されるＨＰＰＤ阻害型除草剤を含む上記方法が提供される。

【0154】

また、本明細書において、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤を含む本発明の上記方法が提供される。

【0155】

本発明の意義の範囲内において、「除草剤」は、それ自身で除草活性な物質又はその効果を変える添加剤、例えば、その活性を増加させる薬剤（相乗作用剤）又はその活性を制限する薬剤（毒性緩和剤）と組み合わされたそのような物質であると理解される。当然ながら、実際のそれらの適用のために、上記除草剤は、農芸化学で慣例的に用いられてきた製剤補助剤（formulation adjuvant）とそれ自体公知の方法で組み合わされることが理解される。

【0156】

トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるようなＨＰＰＤ阻害型除草剤が、広範な経済的に重要な単子葉及び双子葉の一年生有害植物に対して優れた除草活性を有する。活性物質は、また、根茎、根株又は他の宿根器官から新芽を生じ、防除することが困難である多年生有害植物に効果的に作用する。

【0157】

従って、本発明は、また、不要な植物を防除するための又は本発明のＨＰＰＤを含む植物の作物における植物の成長を調節するための方法に関し、この方法では、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンである１つ以上のＨＰＰＤ阻害型除草剤が、植物（例えば、単子葉植物又は双子葉植物の雑草又は不要な作物などの有害植物）、種子（例えば、穀物、種子又は植物の珠芽、例えば、塊茎又は芽が出た新芽の一部）又は植物が成長する領域（例えば、栽培下の領域）に適用される。この内容において、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤を、例えば、播種前（必要に応じて、土壌に混入させることにより）、発芽前又は出芽後に適用することができる。トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤で防除することができる、単子葉植物及び双子葉植物の雑草の個々の典型例は、本明細書により言及されるが、この言及は特定の種のみを限定するものではない：

【0158】

以下の属の単子葉の有害植物：Ａｅｇｉｌｏｐｓ、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ、Ａｐｅｒａ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ｃｅｎｃｈｒｕｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｙｐｅｒｕｓ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、Ｅｌｅｏｃｈａｒｉｓ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｅｒｉｏｃｈｌｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｉｍｂｒｉｓｔｙｌｉｓ、Ｈｅｔｅｒａｎｔｈｅｒａ、Ｉｍｐｅｒａｔａ、Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ、Ｌｅｐｔｏｃｈｌｏａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｓｐａｌｕｍ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｒｏｔｔｂｏｅｌｌｉａ、Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ、Ｓｃｉｒｐｕｓ、Ｓｅｔａｒｉａ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ。

【0159】

以下の属の双子葉植物の雑草：Ａｂｕｔｉｌｏｎ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ、Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｎｏｄａ、Ａｎｔｈｅｍｉｓ、Ａｐｈａｎｅｓ、Ａｔｒｉｐｌｅｘ、Ｂｅｌｌｉｓ、Ｂｉｄｅｎｓ、Ｃａｐｓｅｌｌａ、Ｃａｒｄｕｕｓ、Ｃａｓｓｉａ、Ｃｅｎｔａｕｒｅａ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ、Ｃｉｒｓｉｕｍ、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｄａｔｕｒａ、Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ、Ｅｍｅｘ、Ｅｒｙｓｉｍｕｍ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ、Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ、Ｇａｌｉｎｓｏｇａ、Ｇａｌｉｕｍ、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ、Ｉｐｏｍｏｅａ、Ｋｏｃｈｉａ、Ｌａｍｉｕｍ、Ｌｅｐｉｄｉｕｍ、Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ、Ｍｅｎｔｈａ、Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ、Ｍｕｌｌｕｇｏ、Ｍｙｏｓｏｔｉｓ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ、Ｐｌａｎｔａｇｏ、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ、Ｐｏｒｔｕｌａｃａ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｏｒｉｐｐａ、Ｒｏｔａｌａ、Ｒｕｍｅｘ、Ｓａｌｓｏｌａ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｅｓｂａｎｉａ、Ｓｉｄａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｎｃｈｕｓ、Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ、Ｔａｒａｘａｃｕｍ、Ｔｈｌａｓｐｉ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｕｒｔｉｃａ、Ｖｅｒｏｎｉｃａ、Ｖｉｏｌａ、Ｘａｎｔｈｉｕｍ。

【0160】

本発明のＨＰＰＤタンパク質、ＤＮＡ又はキメラ遺伝子を含み、また、ＨＰＰＤ阻害型除草剤と異なる除草剤に対して、１つ以上のさらなる除草剤耐性を示しても良い本発明のトランスジェニック作物において、有用な植物及び観賞植物、例えば、穀類、例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、モロコシ及びキビ、コメ及びトウモロコシ、又はテンサイ、コットン、ダイズ類、菜種、ジャガイモ、トマト、エンドウの作物及び他の野菜の経済的に重要なトランスジェニック作物に、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤を使用することが好ましい。

【0161】

本発明に記載されるＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性以外の植物の特性に関して、既存の植物と比較して特性が改変された新規植物を産生する従来の方法は、例えば、伝統的な育種法及び突然変異体の作製である。あるいは、特性が改変された新規植物は、遺伝子組換え方法を利用して作製することができる（例えば、EP-A-0221044 A1、EP-A-0131624 A1参照）。例えば、いくつかの事例を以下に記載する：
−植物で合成されるデンプンを改変するための、作物の遺伝子組換え改変（例えば、WO 92/11376、WO 92/14827、WO 91/19806）、
−特定のグルホシネート型（例えば、EP-A-0242236、EP-A-242246参照）又はグリホセート型（WO 92/00377）又はスルホニル尿素型（EP-A-0257993、US-A-5013659）除草剤に耐性であるトランスジェニック作物、
−植物を特定の害虫に耐性を有するようにする、バチルスチューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）毒素（Ｂｔ毒素）又はそのハイブリッドもしくは突然変異体産生能を有するトランスジェニック作物、例えば、コーン、コットン又はダイズ類（EP-A-0193259）、
−脂肪酸組成が改変されたトランスジェニック作物（WO 91/13972）、
−耐病性を増加させる、新規構成成分又は二次代謝産物、例えば、新規フィトアレキシンを有する遺伝子改変作物（EPA 309862、EPA0464461）、
−より高収量及びより高ストレス耐性の特徴を有する、光呼吸が低下した遺伝子改変植物（EPA 0305398）、
−薬学的又は診断上重要なタンパク質を産生するトランスジェニック作物（「分子ファーミング」）、
−より高収量又は良好な品質を特徴とするトランスジェニック作物、
−新規特性の組み合わせ、例えば、前記の新規特性の組み合わせを特徴とするトランスジェニック作物（「遺伝子スタッキング」）。

【0162】

特性が改変された新規トランスジェニック植物を作製することができる多くの分子生物学技術が基本的に公知である；例えば、I. Potrykus and G. Spangenberg (eds.) Gene Transfer to Plants, Springer Lab Manual (1995), Springer Verlag Berlin, Heidelberg, 又は Christou, 「Trends in Plant Science」 1 (1996) 423-431) 参照。

【0163】

そのような組換え操作を実施するために、核酸分子をプラスミドに導入することができ、これにより、突然変異誘発又はＤＮＡ配列の組換えによる配列改変が可能になる。例えば、塩基置換を実施してもよく、部分配列を除去してもよく、又は標準的方法を用いて天然もしくは合成配列を加えてもよい。ＤＮＡフラグメントを互いに連結させるために、フラグメントにアダプター又はリンカーを加えることができる；例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 又は Winnacker 「Gene und Klone」, VCH Weinheim 2. ed., 1996参照。

【0164】

遺伝子産物に対する活性が低下した植物細胞の作製は、例えば、少なくとも１つの対応するアンチセンスＲＮＡ、共抑制効果を達成するためのセンスＲＮＡ、又は二本鎖サイレンシングＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）を産生するアンチセンスとセンスＲＮＡの両方の組み合わせの発現により、又は前記遺伝子産物の転写物を特異的に切断する少なくとも１つの対応する構成的リボザイムの発現により達成することができる。これを実施するために、最初に、存在することができるあらゆるフランキング配列を含む、遺伝子産物のコード配列の全てを含むＤＮＡ分子、又はコード配列の一部のみを含むＤＮＡ分子を使用することができ、これらの部分は、細胞でアンチセンス効果を得るために十分に長い必要がある。また、遺伝子産物のコード配列と高い相同性を有するが、完全に同一ではないＤＮＡ配列を使用することも可能である。

【0165】

植物で核酸分子を発現する場合、得られるタンパク質は植物細胞の任意の区画に局在することができる。しかし、特定の区画に局在化を達成するために、例えば、コード領域をＤＮＡ配列に連結させて、特定の区画に局在化させることが可能である。そのような配列は、当業者に公知である（例えば、Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106 参照）。しかし、また、核酸分子を、植物細胞の細胞小器官で発現させることもできる。

【0166】

トランスジェニック植物細胞を公知の技術により再生して、インタクトな植物を得ることができる。基本的に、トランスジェニック植物は、単子葉植物又は双子葉植物を含む任意の植物種の植物であってもよい。

【0167】

従って、本発明のキメラＨＰＰＤ遺伝子の他に、改変された特性を有するトランスジェニック植物を、相同（＝天然）遺伝子又は遺伝子配列の過剰発現、抑制もしくは阻害、又は非相同（＝外来）遺伝子又は遺伝子配列の発現の結果として得ることができる。

【0168】

本発明の植物、植物細胞又は種子に関して、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤を、例えば、２，４−Ｄもしくはジカンバなどの成長調節剤に対して、又は必須の植物酵素、例えば、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ＥＰＳＰシンターゼもしくはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）を阻害する除草剤に対して、又はスルホニル尿素、グリホセートもしくはグルホシネート及び類似の活性物質の群由来の除草剤に対して耐性であるトランスジェニック作物において用いることが好ましい。

【0169】

従って、本発明は、また、有害植物（即ち、雑草）を防除するための、本発明のＨＰＰＤ耐性植物に適用される除草剤の使用に関し、これは、また、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、イソオキサゾールのクラス、例えば、イソキサフルトール、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性である以外に、第二又はさらなる除草剤耐性を含むトランスジェニック作物まで拡張される。

【0170】

トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤を、水和剤、乳剤、噴霧液、粉剤又は顆粒剤の形態の従来の製剤で用いることができる。

【0171】

トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤は、有効な生物学及び／又は物理化学パラメーターに応じて様々な方法で製剤化することができる。可能な製剤の例は、水和剤（ＷＰ）、水溶剤（ＳＰ）、水溶性濃縮剤、濃縮乳剤（ＥＣ）、エマルション（ＥＷ）、例えば、水中油型及び油中水型エマルション、噴霧液、濃縮懸濁剤（ＳＣ）、油又は水ベース分散剤、油混和性液剤、カプセル懸濁剤（ＣＳ）、粉剤（ＤＰ）、種子粉衣製品、散布及び土壌適用用の顆粒剤、ミクロ顆粒剤、噴霧顆粒剤、被覆顆粒剤及び吸着顆粒剤の形態の顆粒剤（ＧＲ）、水分散性顆粒剤（ＷＧ）、水溶性顆粒剤（ＳＧ）、ＵＬＶ製剤、マイクロカプセル剤及びワックス剤である。

【0172】

これらの個々の製剤タイプは基本的に公知であり、例えば、Winnacker-Kuchler, 「Chemische Technologie」[Chemical technology], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986; Wade van Valkenburg, 「Pesticide Formulations」, Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, 「Spray Drying」 Handbook, 3rd Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. London に記載されている。

【0173】

また、不活性物質、界面活性剤、溶剤及びさらなる添加剤などの必要な製剤補助剤も公知であり、例えば、Watkins, 「Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers」, 2nd Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, 「Introduction to Clay Colloid Chemistry」; 2nd Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, 「Solvents Guide」; 2nd Ed., Interscience, N.Y. 1963; McCutcheon's 「Detergents and Emulsifiers Annual」, MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley and Wood, 「Encyclopedia of Surface Active Agents」, Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schonfeldt, 「Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte」[Interface-active ethylene oxide adducts], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker-Kuchler, 「Chemische Technologie」[Chemical technology], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4th Ed. 1986 に記載されている。

【0174】

これらの製剤に基づいて、また、他の殺虫活性物質、例えば、殺虫剤、ダニ駆除剤、除草剤、殺菌剤及び毒性緩和剤、肥料及び／又は成長調節剤との組み合わせ剤を、例えば、調合済み又はタンクミックス形態で調製することも可能である。

【0175】

水和剤は、水に均一に分散可能であり、そして、活性物質以外に、また希釈剤又は不活性物質の他に、イオン性及び／又は非イオン性界面活性剤（湿潤剤、分散剤）、例えば、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポリオキシエチル化脂肪族アルコール、ポリオキシエチル化脂肪族アミン、脂肪族アルコールポリグリコールエーテルサルフェート、アルカンスルホナート、アルキルベンゼンスルホナート、リグノスルホン酸ナトリウム、２，２’−ジナフチルメタン−６，６’−ジスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム又はオレオイルメチルタウリン酸ナトリウムを含む製剤である。水和剤を調製するために、除草活性物質を、例えば、ハンマーミル、ブロワーミル及びエアジェットミルなどの通常用いられる装置で微粉砕し、そして、同時に又はその後で製剤補助剤と混合する。

【0176】

濃縮乳剤は、活性物質を、１つ以上のイオン性及び／又は非イオン性界面活性剤（乳化剤）を添加した、有機溶媒、例えば、ブタノール、シクロヘキサノン、ジメチルホルムアミド、キシレン、又は高沸点の芳香族物質もしくは炭化水素、又は有機溶媒の混合物に溶解させて調製される。使用することができる乳化剤の例は、アルキルアリールスルホン酸カルシウム、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム、又は非イオン性乳化剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、脂肪アルコールポリグリコールエーテル、プロピレンオキシド／エチレンオキシド縮合物、アルキルポリエーテル、例えば、ソルビタン脂肪酸エステルなどのソルビタンエステル、又は例えば、ポリオキシエチレソルビタン脂肪酸エステルなどのポリオキシエチレンソルビタンエステルである。

【0177】

粉剤は、活性物質を、例えば、タルク、自然粘土、例えば、カオリン、ベントナイト及びピロフィライト又は珪藻土などの微粉砕した固体物質と共に粉砕することにより得られる。

【0178】

濃縮懸濁剤は、水又は油ベースであることができる。これらは、例えば、市販のビーズミルを用いて湿式粉砕法により、必要に応じて、例えば、上記の他の製剤のタイプの場合において既に列挙した界面活性剤を添加して調製することができる。

【0179】

エマルション、例えば、水中油型エマルション（ＥＷ）は、例えば、水性有機溶媒、必要に応じて、例えば、上記の他の製剤のタイプの場合において既に言及した界面活性剤を用いて、スターラー、コロイドミル及び／又はスタテイックミキサーにより調製することができる。

【0180】

顆粒剤は、吸着性の粒状の不活性物質に活性物質を噴霧することにより、又は砂、カオリナイトもしくは粒状の不活性物質などの担体表面に、固着剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムもしくは鉱油を利用して濃縮活性物質を適用することにより調製することができる。適切な活性物質は、また、肥料顆粒剤の製造に通常用いられる方法で、所望であれば、肥料との混合物で造粒することができる。

【0181】

水分散性顆粒剤は、一般的に、噴霧乾燥法、流動床造粒法、ディスク造粒法、高速撹拌機による混合法、及び固体不活性物質を用いない押出し法などの通常用いられる方法により調製される。

【0182】

ディスク顆粒剤、流動床顆粒剤、押出し顆粒剤及び噴霧顆粒剤の調製については、例えば、「Spray-Drying Handbook」 3rd ed. 1979, G. Goodwin Ltd., London; J.E. Browning, 「Agglomeration」, Chemical and Engineering 1967, pages 147 et seq.; 「Perry's Chemical Engineer's Handbook」, 5th Ed., McGraw-Hill, New York 1973, p.8-57 に記載の方法を参照されたい。

【0183】

作物保護製品の製剤のさらなる詳細については、例えば、G.C. Klingman, 「Weed Control as a Science」, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, pages 81-96 and J.D. Freyer, S.A. Evans, 「Weed Control Handbook」, 5th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1968, pages 101-103 を参照されたい。

【0184】

一般的に、農薬製剤は、０．１〜９９重量％、特に、０．１〜９５重量％の本発明の化合物を含む。

【0185】

水和剤では、活性物質の濃度は、例えば、約１０〜９０重量％であり、残りが通常の製剤構成成分で１００重量％としている。濃縮乳剤の場合は、活性物質の濃度は、約１〜９０重量％であり、好ましくは、５〜８０重量％であることができる。粉剤形態の製剤は、１〜３０重量％の活性物質、好ましくは、多くの場合で、５〜２０重量％の活性物質を含み、そして、噴霧液形態の製剤は、約０．０５〜８０重量％、好ましくは、２〜５０重量％の活性物質を含む。水分散性顆粒剤の場合は、活性物質含量は、活性化合物が液体又は固体形態であるか、そして、使用される造粒補助剤、増量剤などにより部分的に依存している。水分散性顆粒剤の場合は、例えば、活性物質含量は、１〜９５重量％、好ましくは、１０〜８０重量％である。

【0186】

さらに、前記の活性物質製剤は、必要に応じて、各場合において通常用いられる補助剤、例えば、固着剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、浸透剤、防腐剤、凍結防止剤、溶剤、増量剤、担体、着色剤、消泡剤、蒸発防止剤ならびにｐＨ及び粘度調節剤を含む。

【0187】

これらの製剤に基づいて、また、例えば、本発明のＨＰＰＤ耐性植物に調合済み又はタンクミックス形態で適用される、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤と、他の殺虫活性物質、例えば、殺虫剤、ダニ駆除剤、除草剤、殺菌剤、ならびに毒性緩和剤、肥料及び／又は成長調節剤との組み合わせ物を調製することも可能である。

【0188】

トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤と組み合わせて、混合製剤又はタンクミックスの形態で、本発明のＨＰＰＤ耐性植物に適用することができる活性物質は、例えば、Weed Research 26 (1986) 441-445又は「The Pesticide Manual」, 14th edition, The British Crop Protection Council and the Royal Soc. of Chemistry, 2003 及びその中で引用される文献に記載の、アセト乳酸シンターゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、セルロースシンターゼ、エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、グルタミンシンテターゼ、ｐ-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、フィトエンデサチュラーゼ、光化学系（photosystem）Ｉ、光化学系ＩＩ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼなどの阻害に基づく公知の活性物質である。本発明の化合物と組み合わせることができる公知の除草剤又は植物成長調節剤は、例えば、下記活性物質（該化合物は、国際標準化機構（ＩＳＯ）に従って一般名称又は化学名で、必要であれば、そのコード番号と共に標記される）であり、常に、酸、塩、エステル及び異性体、例えば、立体異性体及び光学異性体などの全ての使用形態を含む。この内容において、１つ及び場合により、いくつかの使用形態を例を挙げて記載する：

【0189】

アセトクロル、アシベンゾラル、アシベンゾラル−Ｓ−メチル、アシフルオルフェン、アシフルオルフェン−ナトリウム、アクロニフェン、アラクロール、アリドクロル、アロキシジム、アロキシジム−ナトリウム、アメトリン、アミカルバゾン、アミドクロル、アミドスルフロン、アミノシクロピラクロル、アミノピラリド、アミトロール、スルファミン酸アンモニウム、アンシミドール、アニロホス、アスラム、アトラジン、アザフェニジン、アジムスルフロン、アジプロトリン、ＢＡＨ−０４３、ＢＡＳ−１４０Ｈ、ＢＡＳ−６９３Ｈ、ＢＡＳ−７１４Ｈ、ＢＡＳ−７６２Ｈ、ＢＡＳ−７７６Ｈ、ＢＡＳ−８００Ｈ、ベフルブタミド、ベナゾリン、ベナゾリン−エチル、ベンカルバゾン、ベンフルラリン、ベンフレセート、ベンスリド、ベンスルフロン−メチル、ベンタゾン、ベンズフェンジゾン、ベンゾビシクロン、ベンゾフェナップ、ベンゾフルオル、ベンゾイルプロプ、ビフェノックス、ビラナホス、ビラナホス−ナトリウム、ビスピリバック、ビスピリバック−ナトリウム、ブロマシル、ブロモブチド、ブロモフェノキシム、ブロモキシニル、ブロムロン、ブミナホス、ブソキシノン、ブタクロール、ブタフェナシル、ブタミホス、ブテナクロール、ブトラリン、ブトロキシジム、ブチレート、カフェンストロール、カルベタミド、カルフェントラゾン、カルフェントラゾン−エチル、クロメトキシフェン、クロランベン、クロラジホップ、クロラジホップ−ブチル、クロルブロムロン、クロルブファム、クロルフェナック、クロルフェナック−ナトリウム、クロルフェンプロップ、クロルフルレノール、クロルフルレノール−メチル、クロリダゾン、クロリムロン、クロリムロン−エチル、クロロメクワット−クロリド、クロルニトロフェン、クロロフタリム、クロルタール−ジメチル、クロロトルロン、クロルスルフロン、シニドン、シニドン−エチル、シンメチリン、シノスルフロン、クレトジム、クロジナホップ、クロジナホップ−プロパルギル、クロフェンセット、クロマゾン、クロメプロップ、クロプロップ、クロピラリド、クロランスラム、クロランスラム−メチル、クミルロン、シアナミド、シアナジン、シクラニリド、シクロエート、シクロスルファムロン、シクロキシジム、シクルロン、シハロホップ、シハロホップ−ブチル、シペルコート、シプラジン、シプラゾール、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、ダイムロン（daimuron）／ダイムロン（dymron）、ダラポン、ダミノジド、ダゾメット、ｎ−デカノール、デスメジファム、デスメトリン、デトシル−ピラゾレート（ＤＴＰ）、ジ−アレート、ジカンバ、ジクロベニル、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ−Ｐ、ジクロホップ、ジクロホップ−メチル、ジクロホップ−Ｐ−メチル、ジクロスラム、ジエタチル、ジエタチル−エチル、ジフェノキスロン、ジフェンゾコート、ジフルフェニカン、ジフルフェンゾピル、ジフルフェンゾピル−ナトリウム、ジメフロン、ジケグラック−ナトリウム、ジメフロン、ジメピペレート、ジメタクロル、ジメタメトリン、ジメテナミド、ジメテナミド−Ｐ、ジメチピン、ジメトラスルフロン、ジニトラミン、ジノセブ、ジノテルブ、ジフェナミド、ジプロペトリン、ジクワット、ジクワット−ジブロミド、ジチオピル、ジウロン、ＤＮＯＣ、エグリナジン−エチル、エンドタール、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、エタルフルラリン、エタメツルフロン−メチル、エテホン、エチジムロン、エチオジン、エトフメセート、エトキシフェン、エトキシフェン−エチル、エトキシスルフロン、エトベンザニド、Ｆ−５３３１、即ち、Ｎ−［２−クロロ−４−フルオロ−５−［４−（３−フルオロ−プロピル）−４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−テトラゾール−１−イル］−フェニル］エタンスルホンアミド、フェノプロップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェノキサプロップ−エチル、フェノキサプロップ−Ｐ−エチル、フェントラザミド、フェヌロン、フラムプロップ、フラムプロップ−Ｍ−イソプロピル、フラムプロップ−Ｍ−メチル、フラザスルフロン、フロラシュラム、フルアジホップ、フルアジホップ−Ｐ、フルアジホップ−ブチル、フルアジホップ−Ｐ−ブチル、フルアゾレート、フルカルバゾン、フルカルバゾン−ナトリウム、フルセトスルフロン、フルクロラリン、フルフェナセット（チアフルアミド）、フルフェンピル、フルフェンピル−エチル、フルメトラリン、フルメツラム、フルミクロラック、フルミクロラック−ペンチル、フルミオキサジン、フルミプロピン、フルオメツロン、フルオロジフェン、フルオログリコフェン、フルオログリコフェン−エチル、フルポキサム、フルプロパシル、フルプロパネート、フルピルスルフロン、フルピルスルフロン−メチル−ナトリウム、フルレノール、フルレノール−ブチル、フルリドン、フルロクロリドン、フルロキシピル、フルロキシピル−メプチル、フルルプリミドル、フルルタモン、フルチアセット、フルチアセット−メチル、フルチアミド、ホメサフェン、ホラムスルフロン、ホルクロルフェニュロン、ホサミン、フリルオキシフェン、ジベレリン酸、グルホシネート、Ｌ−グルホシネート、Ｌ−グルホシネート−アンモニウム、グルホシネート−アンモニウム、グリホセート、グリホセート−イソプロピルアンモニウム、Ｈ−９２０１、ハロサフェン、ハロスルフロン、ハロスルフロン−メチル、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、ハロキシホップ−エトキシエチル、ハロキシホップ−Ｐ−エトキシエチル、ハロキシホップ−メチル、ハロキシホップ−Ｐ−メチル、ヘキサジノン、ＨＮＰＣ−９９０８、ＨＯＫ−２０１、ＨＷ−０２、イマザメタベンズ、イマザメタベンズ−メチル、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、イマゾスルフロン、イナベンフィド、インダノファン、インドール酢酸（ＩＡＡ）、４−インドール−３−イル酪酸（ＩＢＡ）、ヨードスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウム、イオキシニル、イソカルバミド、イソプロパリン、イソプロチュロン、イソウロン、イソキサベン、イソキサクロルトール、イソキサフルトール、イソキサピリホップ、ＫＵＨ−０４３、ＫＵＨ−０７１、カルブチラート、ケトスピラドックス、ラクトフェン、レナシル、リニュロン、マレイン酸ヒドラジド、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、ＭＣＰＢ−メチル、−エチル及び−ナトリウム、メコプロップ、メコプロップ−ナトリウム、メコプロップ−ブトチル、メコプロップ−Ｐ−ブトチル、メコプロップ−Ｐ−ジメチルアンモニウム、メコプロップ−Ｐ−２−エチルヘキシル、メコプロップ−Ｐ−カリウム、メフェナセット、メフルイジド、メピコート−クロリド、メソスルフロン、メソスルフロン−メチル、メタベンズチアズロン、メタム、メタミホップ、メタミトロン、メタザクロル、メタゾール、メトキシフェノン、メチルダイムロン、１−メチルシクロプロペン、イソチオシアン酸メチル、メトベンズロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトラクロル、Ｓ−メトラクロル、メトスラム、メトキスロン、メトリブジン、メトスルフロン、メトスルフロン−メチル、モリネート、モナリド、モノカルバミド、モノカルバミド二水素硫酸、モノリニュロン、モノスルフロン、モニュロン、ＭＴ１２８、ＭＴ−５９５０、即ち、Ｎ−［３−クロロ−４−（１−メチルエチル）−フェニル］−２−メチルペンタンアミド、ＮＧＧＣ−０１１、ナプロアニリド、ナプロパミド、ナプタラム、ＮＣ−３１０、即ち、４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１−メチル−５−ベンジルオキシピラゾール、ネブロン、ニコスルフロン、ニピラクロフェン、ニトラリン、ニトロフェン、ニトロフェノラト−ナトリウム（異性体混合物）、ニトロフルオルフェン、ノナン酸、ノルフラゾン、オルベンカルブ、オルソスルファムロン、オリザリン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキサスルフロン、オキサジクロメホン、オキシフルオルフェン、パクロプトラゾール、パラコート、パラコートジクロリド、ペラルゴン酸（ノナン酸）、ペンディメタリン、ペンドラリン（pendralin）、ペノキススラム、ペンタノクロル、ペントキサゾン、ペルフルイドン、ペトキサミド、フェニソファム、フェンメディファム、フェンメディファム−エチル、ピクロラム、ピコリナフェン、ピノキサデン、ピペロホス、ピリフェノプ、ピリフェノプ−ブチル、プレチラクロル、プリミスルフロン、プリミスルフロン−メチル、プロベナゾール、プロフルアゾール、プロシアジン、プロジアミン、プリフラリン（prifluraline）、プロホキシジム、プロヘキサジオン、プロヘキサジオン−カルシウム、プロヒドロジャスモン、プロメトン、プロメトリン、プロパクロル、プロパニル、プロパキザホップ、プロパジン、プロファム、プロピソクロル、プロポキシカルバゾン、プロポキシカルバゾン−ナトリウム、プロピザミド、プロスルファリン、プロスルホカルブ、プロスルフロン、プリナクロル、ピラクロニル、ピラフルフェン、ピラフルフェン−エチル、ピラゾリナート（ピラゾレート）、ピラゾスルフロン−エチル、ピラゾキシフェン、ピリバムベンズ、ピリバムベンズ−イソプロピル、ピリベンゾキシム、ピリブチカルブ、ピリダフォル、ピリデート、ピリフタリド、ピリミノバック、ピリミノバック−メチル、ピリミスルファン、ピリチオバック、ピリチオバック−ナトリウム、ピロキサスルホン、ピロックススラム、キンクロラック、キンメラック、キノクラミン、キザロホップ、キザロホップ−エチル、キザロホップ−Ｐ、キザロホップ−Ｐ−エチル、キザロホップ−Ｐ−テフリル、リムスルフロン、サフルフェナシル、セクブメトン、セトキシジム、シデュロン、シマジン、シメトリン、ＳＮ−１０６２７９、サルフ−アレート（ＣＤＥＣ）、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホメツロン−メチル、スルホサート（グリホセート−トリメシウム）、スルホスルフロン、ＳＹＮ−５２３、ＳＹＰ−２４９、ＳＹＰ−２９８、ＳＹＰ−３００、テブタム、テブチウロン、テクナゼン、テプラロキシジム、ターバシル、テルブカルブ、テルブクロル、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、ＴＨ−５４７、テニルクロル、チアフルアミド、チアザフルロン、チアゾピル、チジアジミン、チジアズロン、チエンカルバゾン、チエンカルバゾン−メチル、チフェンスルフロン、チフェンスルフロン−メチル、チオベンカルブ、チオカルバジル、トラルコキシジム、トリ−アレート、トリアスルフロン、トリアジフラム、トリアゾフェナミド、トリベヌロン、トリベヌロン−メチル、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリクロピル、トリジファン、トリエタジン、トリフロキシスルフロン、トリフロキシスルフロン−ナトリウム、トリフルラリン、トリフルスルフロン、トリフルスルフロン−メチル、トリメツロン、トリネキサパック、トリネキサパック−エチル、トリトスルフロン、チトデフ（tsitodef）、ウニコナゾール、ウニコナゾール−Ｐ、ベルノレート、ＺＪ−０１６６、ＺＪ−０２７０、ＺＪ−０５４３、ＺＪ−０８６２及び下記化合物。

【化1】

【0190】

本発明のＨＰＰＤ耐性植物が成長する領域に適用される、トリケトンのクラス、例えば、テンボトリオン、スルコトリオン及びメソトリオン、又はピラゾリネートのクラス、例えば、ピラスルホトール及びトプラメゾン、特に、テンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びメソトリオンから選択される、より具体的には、テンボトリオンであるＨＰＰＤ阻害型除草剤の必要な施用量は、例えば、温度、湿度、使用される除草剤の性質などの外的条件の作用に応じて変更される。それは、広範な範囲内、例えば、０．００１〜１．０kg/haの活性物質、そして、それ以上の範囲内で変更することができるが、好ましくは、０．００５〜７５０g/haである。

【0191】

本発明のＨＰＰＤ耐性植物へのＨＰＰＤ阻害型除草剤とＨＰＰＤ阻害型除草剤と異なる除草剤との組み合わせ適用の場合、これらの混合物は、非ＨＰＰＤ阻害型除草剤の存在によって作物に被害をもたらす可能性がある。そのような作物被害を低減／除去するために、適切な毒性緩和剤を加えてもよい。これらの毒性緩和剤は解毒有効量で用いられ、穀類（コムギ、オオムギ、ライムギ、コーン、コメ、キビ）、アルファルファ、テンサイ、サトウキビ、菜種、コットン及びダイズ類、好ましくは、コーン、コットン、テンサイ又はダイズ類などの経済的に重要な作物において、使用される除草剤／殺虫剤の植物毒素副作用を低減する。

【0192】

毒性緩和剤は、好ましくは、下記からなる群より選択される：
Ａ）式（Ｓ−Ｉ）：

【化2】

[式中、記号及び指数は下記の意味を有する：
ｎ_Ａは、０〜５、好ましくは、０〜３の自然数であり；
Ｒ_Ａ^１ は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、ニトロ又は（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキルであり；
Ｗ_Ａは、Ｎ又はＯ型の１〜３個のヘテロ環原子を有する部分不飽和又は芳香族５員複素環からなる群からの二価の非置換又は置換複素環基であり、ここで、少なくとも１つの窒素原子及び多くとも１個の酸素原子が環に存在しており、好ましくは、下記（Ｗ_Ａ^１）〜（Ｗ_Ａ^４）からなる群からの基であり、

【化3】

ｍ_Ａは、０又は１であり；
Ｒ_Ａ^２は、ＯＲ_Ａ^３、ＳＲ_Ａ^３もしくはＮＲ_Ａ^３Ｒ_Ａ^４であるか、又は少なくとも１つの窒素原子及び好ましくは、Ｏ及びＳからなる群からの最大３個のヘテロ原子を有する、飽和もしくは不飽和の３〜７員複素環であり、これは、（Ｓ−Ｉ）において、窒素原子を介してカルボニル基に結合しており、そして、非置換であるか、又は（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１-Ｃ_４）−アルコキシ、そして、場合により置換されているフェニルからなる群からの基により置換されており、好ましくは、式ＯＲ_Ａ^３、ＮＨＲ_Ａ^４又はＮ（ＣＨ_３）_２、特に、式ＯＲ_Ａ^３の基であり；
Ｒ_Ａ^３ は、水素であるか、又は好ましくは、全部で１〜１８個の炭素原子を有する非置換もしくは置換脂肪族炭化水素基であり；
Ｒ_Ａ^４は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルコキシ又は置換もしくは非置換フェニルであり；
Ｒ_Ａ^５は、Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_８）−ハロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ−（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキル、シアノ又はＣＯＯＲ_Ａ^９であり、ここで、Ｒ_Ａ^９は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_８）−ハロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_６）−ヒドロキシアルキル、（Ｃ_３−Ｃ_１２）−シクロアルキル又はトリ−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルシリルであり；
Ｒ_Ａ^６、Ｒ_Ａ^７、Ｒ_Ａ^８は、同一であるか、又は異なっており、そして、水素、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_８）−ハロアルキル、（Ｃ_３−Ｃ_１２）−シクロアルキル又は置換もしくは非置換フェニルである]
で表される化合物、好ましくは：
ａ）ジクロロフェニルピラゾリン−３−カルボン酸のタイプの化合物、好ましくは、１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（エトキシカルボニル）−-５−メチル−２−ピラゾリン−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−１）（「メフェンピル−ジエチル」、Pestic. Man.参照）などの化合物及び関連化合物（WO 91/07874に記載される）；
ｂ）ジクロロフェニルピラゾールカルボン酸の誘導体、好ましくは、１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−メチルピラゾール−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−２）、１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−イソプロピルピラゾール−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−３）、１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１，１−ジメチルエチル）ピラゾール−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−４）、１−（２，４-ジクロロフェニル）−５−フェニルピラゾール−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−５）などの化合物及び関連化合物（EP-A-333 131及びEP-A-269 806に記載される）；
ｃ）トリアゾールカルボン酸のタイプの化合物、好ましくは、フェンクロラゾール（−エチルエステル）、即ち、１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−トリクロロ-メチル−（１Ｈ）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−６）などの化合物及び関連化合物（EP-A-174 562及びEP-A-346 620に記載される）；
ｄ）５−ベンジルもしくは５−フェニル−２−イソオキサゾリン−３−カルボン酸又は５，５−ジフェニル−２−イソオキサゾリン−３−カルボン酸のタイプの化合物、好ましくは、５−（２，４−ジクロロベンジル）−２−イソオキサゾリン−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−７）又は５−フェニル−２−イソオキサゾリン−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−８）などの化合物及び関連化合物（WO 91/08202に記載される）、又は５，５−ジフェニル−２−イソオキサゾリンカルボン酸エチル（Ｓ１−９）（「イソキサジフェン（isoxadifen）−エチル」）又は５，５−ジフェニル−２−イソオキサゾリンカルボン酸ｎ−プロピル（Ｓ１−１０）、又は５−（４−フルオロフェニル）−５−フェニル−２−イソオキサゾリン−３−カルボン酸エチル（Ｓ１−１１）（特許出願WO-A-95/07897に記載される）。

【0193】

Ｂ）式（Ｓ−ＩＩ）：

【化4】

[式中、記号及び指数は下記の意味を有する：
Ｒ_Ｂ^１は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、ニトロ又は（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキルであり；
ｎ_Ｂは、０〜５、好ましくは、０〜３の自然数であり；
Ｒ_Ｂ^２は、ＯＲ_Ｂ^３、ＳＲ_Ｂ^３もしくはＮＲ_Ｂ^３Ｒ_Ｂ^４であるか、又は少なくとも１つの窒素原子及び好ましくは、Ｏ及びＳからなる群からの最大３個のヘテロ原子を有する、飽和もしくは不飽和の３〜７員複素環であり、これは、（Ｓ−ＩＩ）において、窒素原子を介してカルボニル基に結合しており、そして、非置換であるか、又は（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシもしくは場合により置換されているフェニルからなる群からの基により置換されており、好ましくは、式ＯＲ_Ｂ^３、ＮＨＲ_Ｂ^４又はＮ（ＣＨ_３）_２、特に、式ＯＲ_Ｂ^３の基であり；
Ｒ_Ｂ^３は、水素であるか、又は好ましくは、全部で１〜１８個の炭素原子を有する非置換もしくは置換脂肪族炭化水素基であり；
Ｒ_Ｂ^４は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルコキシ又は置換もしくは非置換フェニルであり；
Ｔ_Ｂは、非置換であるか、又は１もしくは２つの（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル基又は［（Ｃ_１−Ｃ_３）−アルコキシ］カルボニルにより置換されている（Ｃ_１−又はＣ_２）−アルカンジイル鎖である]
で表されるキノリン誘導体、好ましくは：
ａ）８−キノリノキシ酢酸（Ｓ２）のタイプの化合物、好ましくは、（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸１−メチルへキシル（一般名「クロキントセット−メキシル」（Ｓ２-１）（Pestic. Man.参照）、
（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸１，３−ジメチルブタ−１−イル（Ｓ２−２）、（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸４−アリルオキシブチル（Ｓ２−３）、
（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸１−アリルオキシプロパ−２−イル（Ｓ２−４）、
（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸エチル（Ｓ２−５）、
（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸メチル（Ｓ２−６）、
（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸アリル（Ｓ２−７）、
（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸２−（２−プロピリデンイミノキシ）−１−エチル（Ｓ２−８）、（５−クロロ−８−キノリノキシ）酢酸２−オキソプロパ−１−イル（Ｓ２−９）及び関連化合物（EP-A-86 750、EP-A-94 349及びEP-A-191 736又はEP-A-0 492 366に記載される）、ならびにその水和物及び塩（WO-A-2002/034048に記載される）；
ｂ）（５−クロロ−８−キノリノキシ）マロン酸のタイプの化合物、好ましくは、（５−クロロ−８−キノリノキシ）マロン酸ジエチル、（５−クロロ−８−-キノリノキシ）マロン酸ジアリル、（５−クロロ−８−キノリノキシ）マロン酸メチルエチルなどの化合物及び関連化合物（EP-A-0 582 198に記載される）。

【0194】

Ｃ）式（Ｓ−ＩＩＩ）：

【化5】

[式中、記号及び指数は下記の意味を有する：
Ｒ_Ｃ^１は、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−ハロアルケニル、（Ｃ_３−Ｃ_７）−シクロアルキル、好ましくは、ジクロロメチルであり；
Ｒ_Ｃ^２、Ｒ_Ｃ^３は、同一であるか、もしくは異なっており、そして、水素、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルキニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−ハロアルケニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルカルバモイル−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルケニルカルバモイル−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、ジオキソラニル−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、チアゾリル、フリル、フリルアルキル、チエニル、ピペリジニル、置換もしくは非置換フェニルであるか、又はＲ_Ｃ^２及びＲ_Ｃ^３は、一緒になって、置換もしくは非置換複素環、好ましくは、オキサゾリジン、チアゾリジン、ピペリジン、モルホリン、ヘキサヒドロピリミジンもしくはベンゾオキサジン環を形成する]
で表される化合物、好ましくは：
発芽前毒性緩和剤（土壌作用毒性緩和剤）としてよく使用されるジクロロアセトアミドのタイプの活性化合物、例えば、
「ジクロルミド」（Pestic. Man.参照）（＝Ｎ，Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミド）、
「Ｒ−２９１４８」（＝３−ジクロロアセチル−２，２，５−トリメチル−１，３−オキサゾリジン、Stauffer社）、
「Ｒ−２８７２５」（＝３−ジクロロアセチル−２，２，−ジメチル−１，３−オキサゾリジン、Stauffer社）、
「ベノキサコール」（Pestic. Man.参照）（＝４−ジクロロアセチル−３，４−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン）、
「ＰＰＧ−１２９２」（＝Ｎ−アリル−Ｎ−［（１，３−ジオキソラン−２−イル）メチル］ジクロロアセトアミド、PPG Industries社）、
「ＤＫＡ−２４」（＝Ｎ−アリル−Ｎ−［（アリルアミノカルボニル）メチル］ジクロロアセトアミド、Sagro-Chem社）、
「ＡＤ−６７」又は「ＭＯＮ４６６０」（＝３−ジクロロアセチル−１−オキサ−３−アザ−スピロ［４，５］デカン、Nitrokemia又はMonsanto社）、
「ＴＩ−３５」（＝１−ジクロロアセチルアゼパン、TRI-Chemical RT社）、
「ジクロノン」（ジシクロノン）又は「ＢＡＳ１４５１３８」又は「ＬＡＢ１４５１３８」（＝３−ジクロロアセチル−２，５，５−トリメチル−１，３−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナン、BASF社）、及び
「フリラゾール」又は「ＭＯＮ１３９００」（Pestic. Man.参照）（＝（ＲＳ）−３−ジクロロアセチル−５−（２−フリル）−２，２−ジメチルオキサゾリジン）。

【0195】

Ｄ）式（Ｓ−ＩＶ）：

【化6】

[式中、
Ｘ_Ｄは、ＣＨ又はＮであり；
Ｒ_Ｄ^１は、ＣＯ−ＮＲ_Ｄ^５Ｒ_Ｄ^６又はＮＨＣＯ−Ｒ_Ｄ^７であり；
Ｒ_Ｄ^２は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルコキシ、ニトロ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルスルホニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシカルボニル又は（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルカルボニルであり；
Ｒ_Ｄ^３は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルケニル又は（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルキニルであり；
Ｒ_Ｄ^４は、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルコキシ、（Ｃ_３−Ｃ_６）−シクロアルキル、フェニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、シアノ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルチオ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルスルフィニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルスルホニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシカルボニル又は（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルカルボニルであり；
Ｒ_Ｄ^５は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルキル、（Ｃ_３−Ｃ_６）−シクロアルキル、（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルキニル、（Ｃ_５−Ｃ_６）−シクロアルケニル、フェニル又は窒素、酸素及び硫黄からなる群からのｖ_Ｄヘテロ原子を含有する３〜６員ヘテロシクリルであり、ここで最後に記載の７つの基は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_６）−ハロアルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_２）−アルキルスルフィニル、（Ｃ_１−Ｃ_２）−アルキルスルホニル、（Ｃ_３−Ｃ_６）−シクロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシカルボニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルカルボニル及びフェニル、そして、環状基の場合、さらに（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル及び（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキルからなる群からのｖ_Ｄ置換基により置換されており；
Ｒ_Ｄ^６は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルケニル又は（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルキニルであり、最後に記載の３つの基は、ハロゲン、ヒドロキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ及び（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルチオからなる群からのｖ_Ｄ基により置換されているか、又は
Ｒ_Ｄ^５及びＲ_Ｄ^６は、それらが有する窒素原子と一緒になって、ピロリジニル又はピペリジニル基を形成し；
Ｒ_Ｄ^７は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルアミノ、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルキル、（Ｃ_３−Ｃ_６）−シクロアルキルであり、ここで、最後に記載の２つの基は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、ハロゲン−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルコキシ及び（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルチオ、そして、環状基の場合、さらに（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル及び（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキルからなる群からのｖ_Ｄ置換基により置換されており；
ｎ_Ｄは、０、１又は２であり；
ｍ_Ｄは、１又は２であり；
ｖ_Ｄは、０、１、２又は３である]
で表されるＮ−アシルスルホンアミド及びその塩、これらの中で、好ましいのは、例えば、WO 97/45016により公知である、例えば、下記式（Ｓ−Ｖ）：

【化7】

[式中、
Ｒ_Ｄ^７は、（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルキル、（Ｃ_３−Ｃ_６）−シクロアルキルであり、ここで、最後に記載の２つの基は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、ハロゲン−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルコキシ及び（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルチオ、そして、環状基の場合、さらに（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル及び（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキルからなる群からのｖ_Ｄ置換基により置換されており；
Ｒ_Ｄ^４は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、ＣＦ_３であり；
ｍ_Ｄは、１又は２であり；
ｖ_Ｄは、０、１、２又は３である]
で表される、Ｎ-アシルスルホンアミドのタイプの化合物であり、
そして、また、
例えば、WO 99/16744により公知である、例えば、下記式（Ｓ−ＶＩ）：

【化8】

例えば、
[式中、
Ｒ_Ｄ^５＝シクロプロピル及び（Ｒ_Ｄ^４）＝２−ＯＭｅ（「シプロスルファミド」、Ｓ３−１）、
Ｒ_Ｄ^５＝シクロプロピル及び（Ｒ_Ｄ^４）＝５−Ｃｌ−２−ＯＭｅ（Ｓ３−２）、
Ｒ_Ｄ^５＝エチル及び（Ｒ_Ｄ^４）＝２−ＯＭｅ（Ｓ３−３）、
Ｒ_Ｄ^５＝イソプロピル及び（Ｒ_Ｄ^４）＝５−Ｃｌ−２−ＯＭｅ（Ｓ３−４）、そして
Ｒ_Ｄ^５＝イソプロピル及び（Ｒ_Ｄ^４）＝２−ＯＭｅ（Ｓ３−５）]
で表されるアシルスルファモイルベンズアミドのタイプの化合物であり、
そして、また
例えば、EP-A-365484より公知である、式（Ｓ−ＶＩＩ）：

【化9】

[式中、
Ｒ_Ｄ^８及びＲ_Ｄ^９は、互いに独立して、水素、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキル、（Ｃ_３−Ｃ_８）−シクロアルキル、（Ｃ_３−Ｃ_６）−アルケニル、（Ｃ_３−Ｃ_６）−アルキニルであり；
Ｒ_Ｄ^４は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、ＣＦ_３であり；
ｍ_Ｄは、１又は２である]
で表される、Ｎ−アシルスルファモイルフェニル尿素のタイプの化合物であり、
これらの中で、特に
１−［４−（Ｎ−２−メトキシベンゾイルスルファモイル）フェニル］−３−メチル尿素、
１−［４−（Ｎ−２−メトキシベンゾイルスルファモイル）フェニル］−３，３−ジメチル尿素、
１−［４−（Ｎ−４，５−ジメチルベンゾイルスルファモイル）フェニル］−３−メチル尿素、
１−［４−（Ｎ−ナフトイルスルファモイル）フェニル］−３，３−ジメチル尿素。

【0196】

Ｇ）ヒドロキシ芳香族化合物及び芳香族−脂肪族カルボン酸誘導体のクラスの活性化合物、例えば、３，４，５−トリアセトキシ安息香酸エチル、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ安息香酸、３，５−ジヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシサリチル酸、４−フルオロサリチル酸、１，２−ジヒドロ−２−オキソ−６−トリフルオロメチルピリジン−３−カルボキサミド、２−ヒドロキシケイ皮酸、２，４−ジクロロケイ皮酸（WO 2004084631、WO 2005015994、WO 2006007981、WO 2005016001に記載される）。

【0197】

Ｈ）１，２−ジヒドロキノキサリン−２−オンのクラスの活性化合物、例えば、１−メチル−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロキノキサリン−２−オン、１−メチル−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロキノキサリン−２−チオン、１−（２−アミノエチル）−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロキノキサリン−２−オン塩酸塩、１−（２−メチルスルホニルアミノエチル）−３−（２−チエニル）−１，２−ジヒドロ−キノキサリン−２−オン（WO 2005112630に記載される）。

【0198】

Ｉ）有害植物に対する除草作用の他に、コメなどの作物において毒性緩和剤作用も有する活性化合物、例えば、
「ジメピペレート」又は「ＭＹ−９３」（Pestic. Man.参照）（＝ピペリジン−１−チオカルボン酸Ｓ−１−メチル−１−フェニルエチル）（コメの除草剤モリネートによる損傷に対する毒性緩和剤として知られている）、
「ダイムロン」又は「ＳＫ２３」（Pestic. Man.参照）（＝１−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−ｐ−トイル尿素）（コメの除草剤イマゾスルフロンによる損傷に対する毒性緩和剤として知られている）、
「クミルロン」＝「ＪＣ−９４０」（＝３−（２−クロロフェニルメチル）−１−（１−メチル−１−フェニル−エチル）尿素（JP-A-60087254参照、コメの多くの除草剤による損傷に対する毒性緩和剤として知られている）、
「メトキシフェノン」又は「ＮＫ０４９」（＝３，３’−ジメチル−４−メトキシベンゾフェノン）（コメの多くの除草剤による損傷に対する毒性緩和剤として知られている）、
「ＣＳＢ」（＝１−ブロモ−４−（クロロメチルスルホニル）ベンゼン）（CAS Reg.No.54091-06-4、Kumiai社）（コメの多くの除草剤による損傷に対する毒性緩和剤として知られている）。

【0199】

Ｋ）WO-A-1998/38856に記載されるような、式（Ｓ−ＩＸ）：

【化10】

[式中、記号及び指数は下記の意味を有する：
Ｒ_Ｋ^１、Ｒ_Ｋ^２は、互いに独立して、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルアミノ、ジ−（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルアミノ、ニトロであり；
Ａ_Ｋは、ＣＯＯＲ_Ｋ^３又はＣＯＯＲ_Ｋ^４であり；
Ｒ_Ｋ^３、Ｒ_Ｋ^４は、互いに独立して、水素、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルキニル、シアノアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキル、フェニル、ニトロフェニル、ベンジル、ハロベンジル、ピリジニルアルキル又はアルキルアンモニウムであり；
ｎ_Ｋ^１は、０又は１であり；
ｎ_Ｋ^２、ｎ_Ｋ^３は、互いに独立して、０、１又は２である]
で表される化合物、好ましくは、（ジフェニルメトキシ）酢酸メチル（CAS Reg. No.:41858-19-9）。

【0200】

Ｌ）WO A-98/27049に記載されるような、式（Ｓ−Ｘ）：

【化11】

[式中、記号及び指数は下記の意味を有する：
Ｘ_Ｌは、ＣＨ又はＮであり；
ｎ_Ｌは、Ｘ＝Ｎである場合、０〜４の整数であり、そして、Ｘ＝ＣＨである場合、０〜５の整数であり；
Ｒ_Ｌ^１は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−ハロアルコキシ、ニトロ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルチオ、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルスルホニル、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルコキシカルボニル、場合により置換されているフェニル、場合により置換されているフェノキシであり；
Ｒ_Ｌ^２は、水素又は（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキルであり；
Ｒ_Ｌ^３は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_８）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_４）−アルキニル又はアリールであり、ここで、上記の炭素含有基の各々は、非置換であるか、又は１個以上もしくは、より好ましくは最大３個のハロゲン及びアルコキシからなる群からの同一又は異なる基により置換されている]
で表される化合物又はその塩。

【0201】

Ｍ）３−（５−テトラゾリルカルボニル）−２−キノロンのクラスの活性化合物、例えば、
１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−１−エチル−３−（５−テトラゾリルカルボニル）−２−キノロン（CAS Reg. No.:219479-18-2）、１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−１−メチル−３−（５−テトラゾリルカルボニル）−２−キノロン（CAS Reg. No.:95855-00-8）（WO-A-1999000020に記載される）。

【0202】

Ｎ）WO-A-2007023719及びWO-A-2007023764に記載されるような、式（Ｓ−ＸＩ）又は（Ｓ−ＸＩＩ）：

【化12】

[式中、
Ｒ_Ｎ^１は、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_４）−アルキル、メトキシ、ニトロ、シアノ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３であり；
Ｙ、Ｚは、互いに独立して、Ｏ又はＳであり；
ｎ_Ｎは、０〜４の整数であり；
Ｒ_Ｎ^２は、（Ｃ_１−Ｃ_１６）−アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルケニル、（Ｃ_３−Ｃ_６）−シクロアルキル、アリール、ベンジル、ハロベンジルであり；
Ｒ_Ｎ^３は、水素、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルである]
で表される化合物。

【0203】

Ｏ）以下：
１，８−ナフタル酸無水物、
ジチオリン酸Ｏ，Ｏ−ジエチルＳ−２−エチルチオエチル（ジスルホトン）、
メチルカルバミン酸４−クロロフェニル（メフェナート）、
チオリン酸Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−フェニル（ジエトラート）、
４−カルボキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−４−酢酸（ＣＬ−３０４４１５、CAS Reg. No.:31541-57-8）、
１−オキサ−４−アザスピロ［４．５］デカン−４−カルボジチオ酸２−プロペニル（ＭＧ−８３８、CAS Reg. No.:133993-74-5）、
［（３−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾチオピラン−４（３Ｈ）−イリデン）メトキシ］酢酸メチル（WO-A-98/13361より；CAS Reg. No.:205121-04-6）、
シアノメトキシイミノ（フェニル）アセトニトリル（シオメトリニル）、
１，３−ジオキソラン−２−イルメトキシイミノ（フェニル）アセトニトリル（オキサベトリニル）、
４’−クロロ−２，２，２−トリフルオロアセトフェノンＯ−１，３−ジオキソラン−２−イルメチルオキシム（フルキソフェニム）、
４，６−ジクロロ−２−フェニルピリミジン（フェンクロリム）
２−クロロ−４−トリフルオロメチル−１，３−チアゾール−５−カルボン酸ベンジル（（フルラゾール）、
２−ジクロロメチル−２−メチル−１，３−ジオキソラン（ＭＧ−１９１）
からなる群からの１つ以上の化合物（立体異性体を含む）、及び農業で通常使用されている塩。

【0204】

他の公知の活性化合物、例えば、殺菌剤、殺虫剤、ダニ駆除剤、殺線虫剤、鳥忌避剤、植物栄養剤及び土壌改良剤との混合物も、同様に可能である。

【0205】

いくつかの毒性緩和剤が既に除草剤として知られており、従って、有害植物に対する除草作用の他に、さらに作物に保護作用を示す。

【0206】

除草剤（混合物）と毒性緩和剤の重量比は、一般的に、除草剤施用量及び対象の毒性緩和剤の効力に依存し、広範に変更することができ、例えば、２００：１〜１：２００、好ましくは、１００：１〜１：１００、特に、２０：１〜１：２０の範囲である。毒性緩和剤は、式（Ｉ）で表される化合物又はその混合物と同様に、他の除草剤／殺虫剤と共に製剤化してもよく、そして、最終製剤又は除草剤とのタンクミックスとして提供及び使用することができる。

【0207】

式（Ｉ）で表される化合物の必要な施用量は、とりわけ、外的条件、例えば、温度、湿度及び使用される除草剤の種類に従って変更される。それは、広範な範囲内で変更することができ、例えば、０．００１〜１００００g/haの活性物質又はそれ以上であるが、好ましくは、０．５〜５０００g/ha、特に好ましくは、０．５〜１０００g/ha、さらに特に好ましくは、０．５〜５００g/haである。

【0208】

本発明のトランスジェニック植物が、他の除草剤に対する耐性を有するために１つ以上の他の遺伝子（例えば、植物に、グリホセート除草剤に対する耐性を付与する突然変異もしくは非突然変異ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子、又はグルホシネート除草剤に対する耐性を付与するｐａｔもしくはｂａｒ遺伝子）を含有する場合、又はトランスジェニック植物が別の除草剤に元来耐性（例えば、スルホニル尿素耐性）である場合、本発明の方法は、前記除草剤又は除草剤の組み合わせと併用した、ＨＰＰＤ阻害剤の同時又は経時的な段階適用を含むことができる（例えば、グリホセート及び／又はグルホシネート及び／又はスルホニル尿素除草剤）

【0209】

本発明は、また、前記ＨＰＰＤ阻害型除草剤のセレクションに基づいて、植物種の形質転換におけるマーカー遺伝子として本発明のＨＰＰＤをコードするキメラ遺伝子の使用に関する。

【0210】

本発明は、また、植物が、植物において本明細書で定義される本発明のＨＰＰＤを発現するキメラ遺伝子で形質転換されることを特徴とする、トリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する植物を得るための方法に関する。

【0211】

特定の実施態様においては、本発明は、本発明のＨＰＰＤが、配列番号４（アミノ酸２位〜アミノ酸４０１位）、又はコーン、コメ、コムギ、ダイズ類、サトウキビ、タマネギ、Ｂｒａｓｓｉｃａ種植物もしくはコットンのコドン使用に適合した本発明のＨＰＰＤをコードする合成ＤＮＡを含むことを特徴とする、トリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する植物を得るための前記方法に関する。

【0212】

別の特定の実施態様においては、本発明は、本発明のＨＰＰＤが、配列番号１８（アミノ酸２位〜アミノ酸４０２位）、又はコーン、コメ、コムギ、ダイズ類、サトウキビ、タマネギ、Ｂｒａｓｓｉｃａ種植物もしくはコットンのコドン使用に適合した本発明のＨＰＰＤをコードする合成ＤＮＡを含むことを特徴とする、トリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する植物を得るための前記方法に関する。

【0213】

別の特定の実施態様においては、本発明は、テンボトリオン、メソトリオン、ジケトニトリル、イソキサフルトール、スルコトリオン、テフリルトリオン及びビシクロピロンから選択されるトリケトンＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する植物を得るための前記方法に関する。

【0214】

別の特定の実施態様においては、本発明は、植物が、またＰＤＨ（プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）酵素、又は少なくともＰＤＨを有する酵素をコードする植物で発現可能なキメラ遺伝子を含むことを特徴とする、トリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性である植物を得るための前記方法に関する。

【0215】

本発明は、また、領域又は農地における雑草を防除するための方法に関し、本方法は、この領域又は農地に、上述の方法に従って得られたトリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する形質転換植物、又はそれらに由来する形質転換種子を播種し、そして、前記形質転換種子又は前記形質転換植物に重大な影響を与えることなく、雑草に毒性である用量の前記トリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤を適用することを含む。

【0216】

本発明は、また、上述の方法に従って得られたトリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する形質転換植物、又はそのような植物に由来する形質転換種子を成長させ、場合により、そのような植物又は種子をトリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤で処理して、穀物を収穫し、そして、穀物を製粉して食物を製造し、油を抽出することを含む、油又は食物を得るための方法に関する。

【0217】

本発明は、また、ＨＰＰＤ阻害剤が、テンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン及びスルコトリオンから選択されるトリケトンＨＰＰＤ阻害剤であることを特徴とする、上述するような本発明のＨＰＰＤの使用に関する。

【0218】

本発明は、また、本発明のＨＰＰＤをコードする配列を含むキメラ遺伝子を含有し、そして、また、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（本明細書においてＰＤＨと略する）酵素の過剰発現を可能にする宿主生物において機能する遺伝子を含有する、宿主生物、特に、植物細胞又は植物に関する。

【0219】

「ＰＤＨ酵素」という用語は、本明細書において使用される場合、プレフェン酸をＨＰＰに変換するＰＤＨ活性を示す任意の天然又は突然変異ＰＤＨ酵素を指す。特に、前記ＰＤＨ酵素は、任意の種類の生物に由来しうる。ＰＤＨ活性を有する酵素は、プレフェン酸基質の量の減少を測定するか、又は酵素反応から生じる生成物、即ち、ＨＰＰ又は補因子ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの１つの蓄積を測定することが可能な任意の方法により同定することができる。

【0220】

ＰＤＨ酵素をコードする多くの遺伝子が文献に記載されており、これらの配列は、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/で確認することができる。とくに知られているものは、Mannhaupt et al. (1989) Gene 85, 303-311に記載されるような酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（登録番号S46037）、Henner et al. (1986) Gene 49 (1) 147-152に記載されるような、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、特に、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ種（登録番号P20692）の細菌、Hudson et al. (1984) J. Mol. Biol. 180(4), 1023-1051に記載されるような、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に、Ｅ． ｃｏｌｉ種（登録番号KMECTD）の細菌、又はXia et al. (1992) J. Gen. Microbiol. 138(7), 1309-1316に記載されるような、Ｅｒｗｉｎｉａ属、特に、Ｅ． ｈｅｒｂｉｃｏｌａ種（登録番号S29934）の細菌のＰＤＨ酵素をコードする遺伝子である。

【0221】

本発明は、さらに、生物に、上記で定義されるような少なくとも１つの核酸配列又は１つのキメラ遺伝子を組み込み、さらに、それを、ＰＤＨ（プレフェン酸デヒドロゲナーゼ）酵素の発現を可能にする宿主生物において機能する遺伝子で、同時に又は連続して形質転換することにより、ＨＰＰＤ阻害剤に耐性を有する宿主生物、特に、植物細胞又は植物を得るための方法に関する。

【0222】

特定の実施態様においては、本発明は、トリケトン又はピラゾリネートＨＰＰＤ阻害剤、特に、テンボトリオン、メソトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソキサフルトール、ピラスルホトール又はスルコトリオンに耐性を有する宿主生物、特に、植物細胞又は植物を得るための方法に関する。

【0223】

ＨＰＰＤ酵素の過剰発現を可能にする遺伝子及びＰＤＨ酵素の過剰発現を可能にする遺伝子の両方で形質転換された宿主生物、特に、植物細胞又は植物を得るために使用することができる手段及び方法が、WO 04/024928に詳しく記載されており、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0224】

本明細書における任意の先行技術（又はそれから得られる情報）又は任意の公知事項に関する言及は、そのような先行技術（又は情報）又は公知の事項が、本発明の技術分野における共通の一般的知識の一部を構成するものであることの確認又は承認又はいかなる示唆を示すものでもなく、またそのように理解すべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0225】

【図1】図１は、プラスミドｐＳＥ４２０：：ＦＭＰ２２ｅのマップである。

【図2】図２は、タバコ植物に挿入されたＴ−ＤＮＡのマップである。

【図3】図３は、プラスミドｐＳＥ４２０：：ＦＭＰ２３ｅのマップである。

【図4】図４は、タバコ植物に挿入されたＴ−ＤＮＡのマップである。

【図5】図５は、実施例５〜１３の異なる植物に挿入されたタンパク質ＦＭＰ２２をコードする遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡのマップである；略語は下記意味を有する。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＧ、タバコ植物、Ｄ、Ｅ及びＦ、Ｚｅａ ｍａｙｓ植物、Ｈ、ダイズ植物、Ｉ、コメ植物、そしてＪ、コットン植物。３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＫａｎＲ：抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、ｎｏｓ：ノパリンシンターゼプロモーター、Ｔｅｒ：ターミネータ、Ｈ６：Ｈｉｓ ＴＡＧをコードする配列、ＯＴＰ：最適化されたトランジットペプチド、ＢＡＲ（ビアラホス耐性、WO 8705629）及びＰＡＴ（ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、EP 257542）：ビアラホス、ホスフィノトリシン又はグルホシネートに対する耐性を付与する遺伝子、２ｍＥＰＳＰＳ：Ｚｅａ ｍａｙｓ由来の二重突然変異（Ｔｈｒ１０２Ｉｌｅ及びＰｒｏ１０６Ｓｅｒ）ＥＰＳＰＳ（５−エノールピルビルシキミ酸シンターゼ）をコードする遺伝子（US20030027312）、２ｍＡＨＡＳ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の二重突然変異ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）をコードする遺伝子（Ｐｒｏ１９７Ａｌａ及びＴｒｐ５７４Ｌｅｕ；US 5378824）、ＨＡ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子由来のヒストンプロモーター、ＴＥＶ：タバコエッチウイルス、ＦＭＰ２２ｅ：その５’末端にＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する、Ｅ ｃｏｌｉで発現するように最適化されたＦＭＰ２２をコードする遺伝子、ＦＭＰ２２ｔ：その５’末端にＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する、双子葉植物で発現するように最適化されたＦＭＰ２２をコードする遺伝子、ＦＭＰ２２ｔ−ｈ、双子葉植物で発現するように最適化されたＦＭＰ２２をコードする遺伝子、ＦＭＰ２２ｍ、Ｚｅａ ｍａｙｓ植物で発現するように最適化されたＦＭＰ２２をコードする遺伝子、ＬＢ、左端、ＲＢ、右端。

【図6】図６は、実施例５〜１３の異なる植物に挿入されたタンパク質ＦＭＰ２３をコードする遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡのマップである；略語は下記意味を有する。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＧ、タバコ植物、Ｄ、Ｅ及びＦ、Ｚｅａ ｍａｙｓ植物、Ｈ、ダイズ植物、Ｉ、コメ植物、そして、Ｊ、コットン植物。３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＫａｎＲ：抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、ｎｏｓ：ノパリンシンターゼプロモーター、Ｔｅｒ：ターミネータ、Ｈ６：Ｈｉｓ ＴＡＧをコードする配列、ＯＴＰ：最適化されたトランジットペプチド、ＢＡＲ（ビアラホス耐性、WO 8705629）及びＰＡＴ（ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、EP 257542）：ビアラホス、ホスフィノトリシン又はグルホシネートに対する耐性を付与する遺伝子、２ｍＥＰＳＰＳ：Ｚｅａ ｍａｙｓ由来の二重突然変異（Ｔｈｒ１０２Ｉｌｅ及びＰｒｏ１０６Ｓｅｒ）ＥＰＳＰＳ（５−エノールピルビルシキミ酸シンターゼ）をコードする遺伝子（US 20030027312）、２ｍＡＨＡＳ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の二重突然変異ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）をコードする遺伝子（Ｐｒｏ１９７Ａｌａ及びＴｒｐ５７４Ｌｅｕ；US 5378824）、ＨＡ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子由来のヒストンプロモーター、ＴＥＶ：タバコエッチウイルス、ＦＭＰ２３ｅ：その５’末端にＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する、Ｅ ｃｏｌｉで発現するように最適化されたＦＭＰ２３をコードする遺伝子、ＦＭＰ２３ｔ：その５’末端にＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する、双子葉植物で発現するように最適化されたＦＭＰ２３をコードする遺伝子、ＦＭＰ２３ｔ−ｈ、双子葉植物で発現するように最適化されたＦＭＰ２３をコードする遺伝子、ＦＭＰ２３ｍ、Ｚｅａ ｍａｙｓ植物で発現するように最適化されたＦＭＰ２３をコードする遺伝子、ＬＢ、左端、ＲＢ、右端。

【0226】

配列表
配列番号１：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２：Ｅ． ｃｏｌｉ用に最適化され、加えて、５’末端にアラニン及び６個のヒスチジンアミノ酸をコードする核酸を含有する、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ用に最適化され、加えて、５’末端に最適化されたトランジットペプチド及びＨＩＳ Ｔａｇをコードする核酸配列を含有する、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号４：配列番号１由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤアミノ酸配列
配列番号５：配列番号２によりコードされるタンパク質
配列番号６：ＯＴＰ（最適化されたトランジットペプチド（WO 2009/144079））と融合した、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤアミノ酸配列（配列番号４）
配列番号７：配列番号３によりコードされるタンパク質
配列番号８：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号９：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＨＰＰＤアミノ酸配列
配列番号１０：配列番号８によりコードされ、加えて、最初のアミノ酸メチオニンのすぐ下流に追加のアラニン、続く６個のヒスチジンアミノ酸を有するタンパク質
配列番号１１：配列番号９で表され、加えて、タンパク質のＮ末端に位置するＯＴＰ配列を有するタンパク質
配列番号１２：配列番号１０で表され、加えて、タンパク質のＮ末端に直接位置するＯＴＰ配列を有するタンパク質
配列番号１３：プライマー配列Ｘｈｏ−ＯＴＰ−ｆｏｒ
配列番号１４：プライマー配列ＮｃｏＩ−ＯＴＰ−ｒｅｖ
配列番号１５：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号１６：Ｅ． ｃｏｌｉ用に最適化され、加えて、５’末端にアラニン及び６個のヒスチジンアミノ酸をコードする核酸を含有する、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤ）をコードする核酸配列
配列番号１７：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ用に最適化され、加えて、５’末端に最適化されたトランジットペプチド及びＨＩＳ Ｔａｇをコードする核酸配列を含有する、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号１８：核酸配列１５由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤアミノ酸配列
配列番号１９：配列番号１６によりコードされるタンパク質
配列番号２０：ＯＴＰ（最適化されたトランジットペプチド（WO 2009/144079））と融合したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤアミノ酸配列（核酸配列１８）
配列番号２１：配列番号１７によりコードされるタンパク質
配列番号２２：双子葉植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２３：Ｚｅａ ｍａｙｓ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２５：Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２６：Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２７：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２８：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号２９：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３０：ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３１：双子葉植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３２：Ｚｅａ ｍａｙｓ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３３：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３４：Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３５：Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３６：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３７：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３８：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列
配列番号３９：ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ植物用に最適化された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０ＨＰＰＤをコードする核酸配列

【実施例】

【0227】

本発明の様々な態様は、以下の実施例を利用してより理解されるだろう。これらの実施例において後述する全ての方法又は操作が例示として提供され、そして、同じ又は同等の結果に達するために利用できる様々な方法の中からの選択に対応する。この選択は結果の質に影響を与えず、結果として、同じ又は同等の結果に達するために当業者が任意の適切な方法を使用することができる。ＤＮＡフラグメントを操作するための方法の大部分は、「Current Protocols in Molecular Biology」Volumes 1 and 2, Ausubel F.M. et al., published by Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (1989)、又はMolecular cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, 1982、又はSambrook J. and Russell D., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Third edition) に記載されている。

【0228】

実施例１
配列番号５及び配列番号１９のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤ（ＦＭＰ２２ｅ及びＦＭＰ２３ｅと呼ぶ）ならびに配列番号１０により同定されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＨＰＰＤの調製
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＡｔＨＰＰＤコード配列（１３３５ｂｐ；Genebank AF047834；WO 96/38567）を最初に発現ベクターｐＱＥ−３０（QIAGEN, Hilden, Germany）のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識部位間にクローニングした。得られたベクターを「ｐＱＥ３０−ＡｔＨＰＰＤ」と呼ぶ。

【0229】

ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬで、それぞれ登録番号Ｑ０ＳＣ９２及びＱ０ＳＦ３９に列挙されるタンパク質をコードするオリジナルのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓＨＰＰＤ配列（１２０６ｂｐ及び１２０９ｂｐ）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２の最適化コドン使用（Eurofins MWG operon（Ebersberg, Germany）、GENEius software）を使用して改変及び合成し、改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Eurofins MWG operon、Ebersberg, Germany）にクローニングした。このベクターにおいて、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位に相当する配列のみがインサートの両端に残るように、ＭＣＳ（マルチクローニングサイト）に相当する配列を一部除去した。

【0230】

５’末端で、ＡＴＧのすぐ下流に、アラニンアミノ酸をコードする核酸配列及びＮ末端ＨＩＳ６−Ｔａｇ（６×ＨＩＳ、cac cac cac cat cac cat又はcac cat cac cac cac cacでコードされる）をコードする核酸配列を挿入した。ＡＴＧの上流に、制限酵素ＮｃｏＩ認識部位に相当する配列を得るために２つの追加のシトシン塩基対を付加させ、終止コドンの下流に、制限酵素ＸｂａＩの認識部位に相当する配列を付加した。得られたベクター「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＭＰ２２ｅ」及び「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＭＰ２３ｅ」を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ＤＮＡに相当する約３０００ｂｐのベクターサイズの長さに移動しないバンドをアガロースゲル電気泳動で分離した。次に、ＨＰＰＤをコードするＤＮＡをMinEluteTM Gel Extraction Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて精製し、同じ制限酵素で事前に切断したｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸベクター（下記参照）にクローニングした。

【0231】

クローニング及び発現ベクターｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ（５２６１ｂｐ）は、Invitrogen（Karlsruhe, Germany）のプラスミドｐＳＥ４２０に基づいている。このベクターの改変は、抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与し、スーパーリンカー領域（マルチクローニングサイト）の大部分を喪失しているｎｐｔＩＩ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Third edition)）の付加を含む。

【0232】

本プラスミドは、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーター及び全てのＥ． ｃｏｌｉ宿主株でｌａｃリプレッサーを与えるｌａｃＩ^ｑ遺伝子を有する。ｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）に結合し、標的遺伝子の発現を抑制する；この阻害は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導によりいくらか解消することができる。

【0233】

得られたベクターは、それぞれ、「ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ２２ｅ」及び「ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ２３ｅ」（図１及び３参照）と呼び、Escherichia coliＢＬ２１細胞の形質転換に使用した（Merck, Darmstadt, Germany）。

【0234】

参考例として使用したＡｔＨＰＰＤ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＨＰＰＤ）については、WO 2009/144079を参照されたい。

【0235】

ＨＰＰＤの発現を、ｐＱＥ３０−ＡｔＨＰＰＤ ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ２２ｅ又はｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ２３ｅを含有するＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＢＬ２１で実施した。ＯＤ値が０．５に達するまで細胞を増殖させ、次に、ｌａｃリプレッサーに結合し、ｌａｃオペロンからの解離を引き起こす１mMのＩＰＴＧで誘導することにより発現をｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーターから開始した。２８℃で１５時間かけて発現を実施した。

【0236】

プレスターター（pre-starter）培養液を調製するために、ＴＢ培地（１００μg×mL^-1カルベニシリン）２mLにＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＢＬ２１グリセロールストック５０μLを植菌した。プレスターター培養液を、１４０rpmで振とうしながら３７℃で１５時間インキュベートした。プレスターター培養液２００μlを使用して、スターター培養（１００μg×L^-1を添加したＴＢ５mL）を開始し、これを３７℃で３時間インキュベートした。本培養液を調製するために、ＴＢ培地（１００μg×mL^−１カルベニシリン）４００mLにスターター培養液４mLを植菌した。このスターター培養液を、１４０rpmで振とうしながら、ＯＤ_６００値が０．５に達するまで３７℃でインキュベートした。次に、組換えタンパク質の発現を１Ｍ ＩＰＴＧ溶液４００μlで誘導した。これらの条件下で、細胞をさらなる時間増殖させ、次に、温度を２８℃に下げて培養液を１４０rpmで１５時間振とうした。４℃、６０００×ｇで１５分間遠心して細胞を回収した。その後、細胞ペレットを−８０℃で保存した。

【0237】

天然型Ｈｉｓ_６−ＡｔＨＰＰＤ、Ｈｉｓ_６−ＦＭＰ２２ｅ及びＨｉｓ_６−ＦＭＰ２３ｅの単離及び精製
細胞の溶解
細菌の細胞壁を形成するペプチドグリカンのＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合を開裂する酵素である、リゾチームを使用して細胞を溶解した。次に、細菌細胞の内圧により細胞膜を破壊した。さらに、溶解バッファーは、タンパク質に損傷を与えることなく全ての形態のＤＮＡ及びＲＮＡを加水分解するエンドヌクレアーゼのBenzonase（登録商標）ヌクレアーゼを含有しており、これにより細胞溶解物の粘性を大きく低下させる。氷上で自然に溶解させた。

【0238】

Ｈｉｓ_６−タグタンパク質を精製するために、QIAexpress（登録商標）Ni-NTA Fast Start Kitを使用説明書に従って使用した。

【0239】

固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるＨｉｓ_６−タグタンパク質の精製
溶解反応物を遠心して得られた清澄な細胞溶解物（１０mL）を、QIAexpress（登録商標）Ni-NTA Fast Start Kit（Qiagen, Hilden, Germany）のNi-NTA Fast Start Columnにロードし、使用説明書に従って精製を行った。溶離バッファー２．５mLを用いてＨｉｓ_６−タグタンパク質を溶離させた。

【0240】

ゲルろ過によるＨＰＰＤ溶液の脱塩
溶離バッファー２．５mLを用いてNi-NTA Fast Start Columnから溶離させたＨＰＰＤ溶液を、使用説明書に従って、Sephadex G-25 PD-10カラム（GE Healthcare, Freiburg, Germany）にアプライした。全ての試料をゲルベッドに注入した後、保存バッファー３．５mLを用いて溶離させた。脱塩カラムから溶離させたＨＰＰＤ溶液を１mLアリコートにして−８０℃で凍結した。

【0241】

Bradfordタンパク質アッセイを用いたＨＰＰＤタンパク質濃度の決定
標準Bradfordアッセイ（Bradford, (1976), Anal Biochem 72: 248-254）を用いてタンパク質濃度を決定した。

【0242】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたＨＰＰＤ溶液の純度の決定
溶離タンパク質の完全性は、ゲルＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Novex ４〜１２％Bis-Tris Gels（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動により確認した（約１０μgのタンパク質をロードした）。タンパク質溶液１〜１０μLにLaemmli Sample Buffer１０μLを加え、混合物を９０℃で１０分間インキュベートした。短時間の遠心工程の後、NuPAGE（登録商標）MOPS SDSランニングバッファー（ｄｄＨ_２Ｏで２０×溶液から希釈した）を充填したXCell SureLock（商標）Novex Mini-CellゲルチャンバーにＳＤＳゲルを固定した後、その溝に全ての混合物をロードした。次に、ゲルチャンバーに電圧１５０ボルトを１時間かけた。タンパク質バンドを染色するために、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色液にゲルを浸漬した。ポリアクリルアミドゲルを脱染するために、タンパク質バンドが白色ゲル上で青色に見えるようになるまで、これをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０脱染液に浸漬した。

【0243】

実施例２
ＨＰＰＤ酵素「配列番号５」、「配列番号１９」及び「配列番号１０」のＨＰＰＤ阻害剤耐性の動力学的特性解析及び評価
標準分光光度アッセイ（WO2009/144079に詳しく記載されている方法）によりＨＰＰＤ活性を調べた。

【0244】

ＨＰＰＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ動力学的特性の決定
ＨＰＰＤ活性の測定のために、ＨＰＬＣアッセイを用いて異なるＨＰＰＤ酵素調製物のＫ_ｍ、Ｖ_ｍａｘ及びｋ_ｃａｔ値ならびに異なるＨＰＰＤ阻害剤のＫ_ｉ、Ｋ_１＝Ｋ_ｏｎ及びＫ_−１＝Ｋ_ｏｆｆを決定した。アッセイ混合物には、１mlの１５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８）、１０mMアスコルビン酸ナトリウム、６５０ユニットウシカタラーゼ（Sigma C30 (Sigma-Aldrich, Munich, Germany）、３４mgタンパク質/ml、２３，０００ユニット/mg）、及び適当量のＨＰＰ、精製ＨＰＰＤ酵素及びＨＰＰＤ阻害剤を含有した。Ｋ_ｍ、Ｖ_ｍａｘ及びｋ_ｃａｔ値を決定するために、アッセイ混合物のＨＰＰ濃度を１０〜４００μMの範囲で変更した。Ｋ_ｉ、Ｋ_１＝Ｋ_ｏｎ及びＫ_−１＝Ｋ_ｏｆｆ値を決定するために、２mMＨＰＰを使用した。アッセイ混合物にＨＰＰＤ酵素を添加して全てのアッセイを開始し、０〜２４０秒の様々な時点で、１０％過塩素酸２０μlを含有する反応アッセイチューブに反応混合物２００μlを添加して反応を止めた。沈殿したタンパク質を１０，０００ｇで５分間遠心してペレットにした。１０％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸（バッファーＡ）で平衡化した２５０×４mm Knauer（Berlin, Germany）Eurospher 100-5 C18カラムに上清１００μlをロードした。また、バッファーＡでの４分間の洗浄、次に、９５％メタノールでの３分間の洗浄、そして、さらなるバッファーＡでの２分間の洗浄により、１．５ml/分でカラムを溶離した。ＨＧＡ（ホモゲンチジン酸）及びＨＰＰ（ヒドロキシフェニルピルビン酸）の溶離を２９２nmでモニタリングした。約５分でＨＧＡが溶離し、その後ＨＰＰが溶離する。ＨＧＡピークの２９２nm吸光度対ＨＧＡ濃度を校正するために、ＨＧＡの濃度を基準にして標準曲線を作製した。

【0245】

Ｋ_ｍ及びＶ_ｍａｘ値を決定するために、異なる基質濃度でのＨＰＰＤの初期反応速度を生成ＨＧＡ対時間プロットから決定し、単一反応酵素の場合に、ID Business Solutions Ltd.(www.idbs.com) XLfitソフトウエアスイートを用いて、Michaelis-Menten式に当てはめた。Ｋ_ｉ、Ｋ_１＝Ｋ_ｏｎ及びＫ_−１＝Ｋ_ｏｆｆ値を測定するために、異なる阻害剤濃度でのＨＰＰＤ反応の経時変化を、ID Business Solutions Ltd. XLfitソフトウエアスイートを用いて、強固に結合した阻害剤のメカニズムＡ（競合阻害）の式に当てはめた（Cha, S. (1975) Tight-binding inhibitors - I. Kinetic behaviour. Biochemical Pharmacology 24, 2177-2185）。

【0246】

表１：ＨＰＰＤ酵素（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ「配列番号１０」及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ「配列番号５」及び「配列番号１９」）の動力学的特性評価ならびにＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオン及びジケトニトリルに対するそれらの個々の耐性

【0247】

下記表１において、「Ｋｍ」（Michaelis-Menten定数）は、酵素を特徴づけるために使用される動態パラメーターを意味し、反応の半最大速度を可能にする基質の濃度として定義される。Ｋｍは、さらに、反応速度がその最大値の半分に達する（Ｖ_ｍａｘ／２）基質濃度として定義され、ここで、Ｖｍａｘは反応の最大速度を意味する。

【0248】

Ｋ_ｏｎ＝Ｋ_１は、酵素−基質結合の会合速度定数に等しく、Ｋ_ｏｆｆ＝Ｋ_−１は、酵素−阻害剤複合体の解離の速度定数に等しい。Ｋｉは、阻害定数を規定する。

【0249】

【表8】

【0250】

上記表１において、細菌ＨＰＰＤ「配列番号１９」及び植物ＨＰＰＤ「配列番号１０」の動態パラメーターＫｍ及びＶｍａｘが、有意な違いを示さなかったが（それぞれ、６．３μM、３５μM）、細菌ＨＰＰＤ「配列番号１９」の試験ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性が、植物ＨＰＰＤ「配列番号１０」よりはるかに高かったことが分かる。

【0251】

いくつかのＨＰＰＤ阻害剤の存在下でのＨＰＰＤ活性の決定
この内容において、ｐＩ_５０値は、酵素活性を５０％阻害するのに必要な阻害剤濃度（モル濃度）のｌｏｇ値を意味する。

【0252】

ＨＰＰＤ阻害剤のｐＩ_５０値は、WO 2009/144079に詳しく記載されているアッセイを用いて、２mMの固定ＨＰＰ濃度及び３分間の固定インキュベート時間で、ID Business Solutions Ltd. XLfitソフトウエアスイートを用いて、ＨＰＰＤ活性対阻害剤濃度の用量応答プロットから決定した。

【0253】

表２：ＨＰＰＤ酵素（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ「配列番号１０」及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ「配列番号５」及び「配列番号１９」）のｐＩ５０の決定及び下記のいくつかのＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオン、ジケトニトリル、メソトリオン、ビシクロピロン、ピラスルホトール、スルコトリオン、ピラゾレート、テフリルトリオン及びベンゾフェナップに対するそれらの個々の耐性。記号「＞＞」は、値が指定のものよりはるかに高かったが、試験阻害剤の濃度（２．５×１０^−６、５．０×１０^−６、１．０×１０^−５、２．５×１０^−５、６．３×１０^−５、２．５×１０^−４Ｍ）の範囲内で正確に算出することができなかったことを意味する。

【0254】

【表9】

【0255】

表３：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号１０）及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（配列番号５及び配列番号１９）由来のＨＰＰＤの阻害剤の非存在下で測定された活性と比較した、５．０×１０^−６Ｍの阻害剤の存在下での阻害率の決定

【0256】

【表10】

【0257】

上記表２及び３において、細菌のＨＰＰＤ「配列番号５」及び「配列番号１９」が、全ての試験ＨＰＰＤ阻害剤に対して、同一の実験条件下でＨＰＰＤ「配列番号１０」を用いて観察される、全ての試験ＨＰＰＤ阻害剤濃度での植物と比較して、優れた耐性レベルを示したことが分かる。

【0258】

実施例３
タバコ植物におけるＨＰＰＤ阻害型除草剤耐性を評価するためのキメラ遺伝子の構築
Ａ）キメラ遺伝子の構築
ＯＴＰをコードする配列を含有するベクターｐＲＰ−ＲＤ２２４（WO 2009/144079に詳しく記載）を、制限酵素ＸｈｏＩの認識部位に相当する核酸配列の上流と制限酵素ＮｃｏＩの認識部位に相当する核酸配列の下流のＰＣＲ介在結合に使用した。得られたＰＣＲ産物を、使用説明書に従って、ベクターｐＣＲ（登録商標）Blunt II-TOPO（登録商標）（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）にクローニングした。得られたベクターを「ｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ＯＴＰ」と呼ぶ。正確な配列の挿入は、標準的なＤＮＡ配列解析により確認した。ＯＴＰに相当するＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、適切なゲル電気泳動により分離し、事前に、対応するＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で消化したプラスミドｐＲＴ１００（Toepfer, (1987), Nucleic Acids Res 15:5890）にクローニングした。プラスミドｐＲＴ１００はＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶ３５Ｓターミネータを含有する。得られたベクターを、その後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化した。ベクターｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ２２ｅ（図１参照）又はｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＦＭＰ２３ｅ（図３参照）を、それぞれ「配列番号２」又は「配列番号１６」に相当するＤＮＡフラグメントを得るために、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩに供した。得られたベクターを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２２ｅ：：ＣａＭＶ３５−ターミネータカセット（図２参照）又はＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２３ｅ：：ＣａＭＶ３５−ターミネータカセット（図４参照）を、事前に同じ酵素で消化し、脱リン酸化したバイナリーベクターｐＢｉｎ１９（Bevan (1984), Nucleic Acids Res. 12:8711-8721）にサブクローニングした。得られたベクターを「ＦＭＰ２２ｅｂｖ」及び「ＦＭＰ２３ｅｂｖ」と呼ぶ。

【0259】

ベクターｐＱＥ−３０−ＡｔＨＰＰＤを、ＮｃｏＩ制限酵素認識部位とＡｔＨＰＰＤのＮ末端Ｈｉｓ_６−Ｔａｇ〜５’末端及びＸｂａＩ制限酵素認識部位〜３’末端をコードする配列のＰＣＲ介在結合に使用した。

【0260】

ＡｔＨＰＰＤ遺伝子のＰＣＲ産物を、アガロースゲルから単離し、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、MinElute（商標）PCR Purification Kit（Qiagen, Hilden, Germany）で精製して、同じ制限酵素で切断したｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸベクターにクローニングした。

【0261】

生成したベクターを「ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ−ＡｔＨＰＰＤ」と呼び、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶ３５Ｓターミネータを含有する事前に開裂したベクターｐＲＴ１００（Toepfer et al., (1987), Nucleic Acids Res 15:5890）にクローニングした。生成したベクターを「ｐＲＴ１００−ＡｔＨＰＰＤ」と呼ぶ。

【0262】

ベクターｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ＯＴＰを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＯＴＰに相当するＤＮＡバンドを上記制限酵素で事前に開裂したベクターｐＲＴ１００−ＡｔＨＰＰＤにクローニングした。得られたベクターを、その後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、対象の発現カセットを、事前に開裂し、脱リン酸化したバイナリーベクターｐＢｉｎ１９にクローニングした。得られたベクターを「ＡｔＨＰＰＤｂｖ」と呼ぶ。

【0263】

バイナリーベクターＦＭＰ２２ｅｂｖ、ＦＭＰ２３ｅｂｖ及びＡｔＨＰＰＤｂｖを使用して、抗生物質カナマイシン及びリファンピシンを添加したＹＥＢ培地でセレクションした、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＥＨＡ１０１由来のＡＴＨＶ）コンピテントセルを形質転換した（特許出願US005925808Aに詳しく記載）。

【0264】

対象のバイナリーベクター（ＦＭＰ２２ｅｂｖ、ＦＭＰ２３ｅｂｖ又はＡｔＨＰＰＤｂｖ）を含有するこれらのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を使用して、約５×５mm^２のサイズのタバコＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ Ｌ． ｃｖ Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ植物のリーフディスクを形質転換した（Horsch et al., (1985), Science 227 ; 1229-1231に詳しく記載されている）。

【0265】

リーフディスクを、バイナリーベクターＦＭＰ２２ｅｂｖ、ＦＭＰ２３ｅｂｖ又はＡｔＨＰＰＤｂｖを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞と２日間共培養した。次に、リーフディスクを培地に移し、ＢＡＰ（１mg/mL；ベンジルアミノプリン）、カルベニシリン（２５０mg/mL）、セフォタキシン（cefotaxine）（２５０mg/mL）、カナマイシン（７５mg/mL）及びテンボトリオン（１０^−６Ｍ）を添加したＭＳ（Musharige and Skoog, (1962), Physiol Plant 15(3): 473-497）培地で６週間新芽を再生させた。

【0266】

再生したカルスを培地に移し、６〜１２週間根の発生を誘導した：カルベニシリン（２５０mg/mL）、セフォタキシン（２５０mg/mL）、カナマイシン（７５mg/mL）及びテンボトリオン（１０^−６ Ｍ）を添加したＭＳ（１／２）。この培地で６週間経過後、バイナリーベクターＡｔＨＰＰＤｂｖを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞で形質転換した新芽を、ＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオンが欠乏した同じ培地に移した。

【0267】

結果を以下の表４にまとめる。

【0268】

全ての実験期間中、リーフディスクを含有するプレートを、条件を調整した（明１６時間、暗８時間、２５℃）生育箱に置いた。

【0269】

カルスの発根
配列番号１１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、配列番号２１又は配列番号７（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）を含むＨＰＰＤをコードする核酸配列で形質転換した細胞由来の再生した芽カルスを、ＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオンをさらに添加した培地に移し、６〜１２週間根の成長を誘導した。配列番号１１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）により定義されるＨＰＰＤを含有するイベント又は形質転換カルスのいずれにおいても、上記の条件下で根の成長は観察されなかった。これに対して、同一の条件下で、配列番号７及び配列番号２１により定義されるＨＰＰＤを含有するカルスからは明らかに多数の正常な根が生じた（下記表４参照）。

【0270】

【表11】

【0271】

リーフディスクの再生
リーフディスクを、ＨＰＰＤ配列番号１１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、配列番号２１又は配列番号７（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）を含有する植物から切り取り、その後、ＢＡＰ（１mg/mL；ベンジルアミノプリン）、カルベニシリン（２５０mg/mL）、セフォタキシン（２５０mg/mL）を添加し、さらに下記列挙するＨＰＰＤ阻害剤（テンボトリオン（１０^−６Ｍ）、ジケトニトリル（５．１０^−６Ｍ）、メソトリオン（１０^−６Ｍ）及びビシクロピロン（１０^−６Ｍ））の１つを記載の濃度で含むＭＳ培地で、そして、ポジティブコントロールとしてＨＰＰＤ阻害剤を含有しない培地で標準的な培養条件下、６週間再生させた。実験終了後、再生のレベルを以下のように評価した：
「−」は、リーフディスクが、上記阻害剤を添加した培地上で、野生型タバコ植物由来のリーフディスクと同じ外観であることを意味する。
「＋＋＋＋」は、リーフディスクが、阻害剤を含有しない培地上で、野生型タバコ植物由来のリーフディスクと似ていることを意味する。
「＋」、「＋＋」及び「＋＋＋」は、再生したリーフディスクが、阻害剤の存在により、強く（＋）、中程度（＋＋）、そして弱く（＋＋＋）影響を受けたことを指す。

【0272】

実験の結果を表５にまとめる。

【0273】

表５：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号１１）又はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ配列番号７もしくは配列番号２１から得られるＨＰＰＤをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物由来のリーフディスクの再生に及ぼす様々なＨＰＰＤ阻害剤の効果

【0274】

【表12】

【0275】

配列番号７又は配列番号２１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）により定義されるＨＰＰＤを含有する植物の場合、試験ＨＰＰＤ阻害剤の全ての存在下で、未処理コントロールと比較して、同じ又はわずかに低下した再生を示したが、一方で、対応する配列番号１１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）により定義されるＨＰＰＤを含有する植物の場合では、未処理コントロールと比較して、再生を全く示さなかったが、明確に視認できる白化表現型が生じた。

【0276】

実施例４：耐性ＨＰＰＤタンパク質をコードする遺伝子を発現するトランスジェニックタバコ植物のＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を評価するための温室試験
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はＦＭＰ２２もしくはＦＭＰ２３ＨＰＰＤ酵素のいずれかを発現するトランスジェニック植物系列の調製。除草剤耐性のための温室試験

【0277】

テンボトリオン、イソキサフルトール及びビシクロピロンに対する反応
ＨＰＰＤをコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の遺伝子、又はＦＭＰ２２ ＨＰＰＤをコードするＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１由来の遺伝子ＦＭＰ２２ｅもしくは上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０（実施例３）由来の遺伝子ＦＭＰ２３ｅのいずれかを含有するＴ０タバコ植物を、温室（２８／２０℃）に移して、さらに成長させ種子を産生した。これらの種子を回収し、土壌（砂及びオスモコート（osmocote）Ｐｒｏと混合したＥＤ７３）に蒔き、温室（２８／２０℃）で発芽させた。３〜４週間後、上記土壌を含有する単一ポットに植物体を移した。２週間後、サイズ４〜６cm径の植物に、以下：
−硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油（raps oil）を添加したＷＰ２０（水和剤２０％）製剤から調製した、テンボトリオン、１００g AI/ha、又は
−硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加したＷＰ２０製剤から調製した、イソキサフルトール、１００g AI/ha、又は
−硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加したＷＰ２０製剤から調製した、ビシクロピロン、１００g AI/ha、又は
−硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加した、活性成分（ＡＩ）を含まないＷＰ２０製剤から製造した「ブラインド製剤」
のいずれかを散布し、次に、適度な光条件（２００００Ｌｕｘ）の生育箱に移した。

【0278】

異なる除草剤の適用（ＤＡＴ）の７日後に、形質転換植物の症状を、導入遺伝子を含有するタバコ植物と同時に、且つ、同じ条件下で散布した野生型タバコ植物で観察された反応と比較して評価した（１００％は、植物が野生型植物と同じ白化表現型を示したことを意味し、０％は、植物が、「ブラインド製剤」で処理した野生型植物と似ていることを意味し、そして、中間パーセントは観察された症状の程度を示す）。

【0279】

表６：野生型タバコ植物（Ａ）ならびにプロモーターＣａＭＶ３５Ｓ、ＯＴＰをコードする配列及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＨＰＰＤをコードする配列（Ｂ）、又はプロモーターＣａＭＶ３５Ｓ、ＯＴＰをコードする配列及びＨＰＰＤ ＦＭＰ２２をコードする配列ＦＭＰ２２ｅ（Ｃ）、又はプロモーターＣａＭＶ３５Ｓ、ＯＴＰをコードする配列及びＨＰＰＤ ＦＭＰ２３をコードする配列ＦＭＰ２３ｅ（Ｄ）を有する上記の発現カセットを代わりに含有するタバコイベントのＴ１集団。硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加したテンボトリオン又はイソキサフルトール１００g AI/haの散布による適用（ＤＡＴ）の７日後の除草損傷の評価。ＦＭＰ２２ｅ又はＦＭＰ２３ｅ遺伝子を含有する食物が、テンボトリオン及びイソキサフルトールに対してはるかに高い耐性を示したことが明らかである。カテゴリー（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に属する植物は、除草剤適用の前に各導入遺伝子の存在によるセレクションは行わなかった。

【0280】

【表13】

【0281】

【表14】

【0282】

【表15】

【0283】

【表16】

【0284】

ビシクロピロンに対する反応
野生型タバコ植物及びＨＰＰＤ ＦＭＰ２２をコードするＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１由来の遺伝子ＦＭＰ２２ｅを有するＴ１タバコ植物、又はＨＰＰＤ ＦＭＰ２３をコードするＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０由来の遺伝子ＦＭＰ２３ｅを有する植物の種子を、５０g/Lカナマイシンを添加したＭＳ培地（Murashige and Skoog 1964）に蒔いた。４週間後、発根した緑色の植物体を土壌に移して、上記温室で３週間成長させた後、ビシクロピロン（１００g AI/ha）、硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプスオイルを含有する混合物を散布した。処理の７日後、除草剤に反応して生じた表現型に基づいて植物を２つのカテゴリーに分類した。クラスＩは、除草剤処理に反応して損傷なし〜軽度の損傷を示す植物として定義し（損傷：０〜３０％）、クラスＩＩは、重度の損傷〜同じ処理を受けた野生型植物で確認される損傷と同等の損傷を示す植物として定義した（損傷：３１〜１００％）。この場合では、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡを含有する植物のみを除草剤処理に曝露した。

【0285】

一般的に、Ｔ−ＤＮＡインサートを含有する植物が、ＨＰＰＤ阻害型除草剤ビシクロピロンの農地施用量（field dose）の曝露に対して有意で十分な耐性レベルを示したことが分かる。

【0286】

【表17】

【0287】

ＨＰＰＤ ＦＭＰ２２又はＦＭＰ２３を含有する植物は、ＨＰＰＤ阻害型除草剤ビシクロピロンに耐性を示した。

【0288】

上記で示されたデータから要約すると、いくつかの独立したトランスジェニックイベントから得られた、ＦＭＰ２２ ＨＰＰＤをコードするＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０３０４１由来の遺伝子ＦＭＰ２２ｅを発現する、又はＦＭＰ２３ ＨＰＰＤをコードするＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＲＨＡ１株）、単離体ｒｏ０２０４０由来の遺伝子ＦＭＰ２３を発現する植物が、標準的な農業条件下で適用される用量の、いくつかのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して高い耐性を有することが分かる。

【0289】

実施例５：植物においていくつかの双子葉植物の最適化バリアントを発現するようにバイナリーベクターの構築、及びそのようなバリアントを含有するタバコ植物の耐性を評価するための温室試験
ＦＭＰ２２ｔ（配列番号３）、ＦＭＰ２７ｔ−ｈ（配列番号２２）、ＦＭＰ２３ｔ（配列番号１７）、ＦＭＰ２３ｔ−ｈ（配列番号３１）のｐＢｉｎ１９へのクローニング
ＨＰＰＤタンパク質ＦＭＰ２２をコードする、双子葉植物において発現するように最適化されたコドン使用を有する遺伝子を設計して、ＦＭＰ２２ｔ−ｈ（配列番号２２）と命名し、そして、その５’末端にＯＴＰ及びＨＩＳ ＴＡＧをコードする追加の配列を有する同じ遺伝子をＦＭＰ２２ｔ（配列番号３）と命名した。ＦＭＰ２２ｔ−ｈ遺伝子に相当する配列を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩを使用して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びターミネータを含有する前記ベクターｐＲＴ１００−ＯＴＰにクローニングした。得られたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ２２ｔ−ｈと呼ぶ。ＦＭＰ２２ｔに相当する配列を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを使用して、前記ベクターｐＲＴ１００にクローニングし、得られたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ２２ｔと呼ぶ。ＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＦＭＰ２２ｔ−ｈ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓ及びＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＨＩＳ６−ＦＭＰ２２ｔ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓに相当するフラグメントを、制限酵素ＳｂｆＩを使用して、ｐＢＩＮ１９ベクター（上記）にサブクローニングした。該バイナリーベクターを、それぞれ、ｐＢｉｎ１９−ＦＭＰ２２ｔ−ｈ（図５Ｃ）及びｐＢｉｎ１９−ＦＭＰ２２ｔ（図５Ｂ）と呼び、そして、これを使用して、例えば、上述のタバコ植物などの双子葉植物を形質転換することができる。次に、十分に成長した形質転換植物の、テンボトリオンなどのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を試験する。除草剤処理に反応して観察された症状の発生を評価して、同じ条件下の野生型植物の反応と比較する。

【0290】

ＨＰＰＤタンパク質ＦＭＰ２３をコードする、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を有する遺伝子を設計して、ＦＭＰ２３ｔ−ｈ（配列番号３１）と命名し、そして、その５’末端にＯＴＰ及びＨＩＳ ＴＡＧをコードする追加の配列を有する同じ遺伝子をＦＭＰ２３ｔ（配列番号１７）と命名した。ＦＭＰ２３ｔ−ｈ遺伝子に相当する配列を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩを使用して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びターミネータを含有する前記ベクターｐＲＴ１００−ＯＴＰにクローニングした。得られたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ２３ｔ−ｈと呼ぶ。ＦＭＰ２３ｔに相当する配列を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを使用して、前記ベクターｐＲＴ１００にクローニングし、得られたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ２３ｔと呼ぶ。ＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＦＭＰ２３ｔ−ｈ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓ及びＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＨＩＳ６−ＦＭＰ２３ｔ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓに相当するフラグメントを、制限酵素ＳｂｆＩを使用して、ｐＢＩＮ１９ベクター（上記）にサブクローニングした。該バイナリーベクターを、それぞれ、ｐＢｉｎ１９−ＦＭＰ２３ｔ−ｈ（図６Ｃ）及びｐＢｉｎ１９−ＦＭＰ２３ｔ（図６Ｂ）と呼び、そして、これを使用して、例えば、上述のタバコ植物などの双子葉植物を形質転換することができる。次に、十分に成長した形質転換植物の、テンボトリオンなどのＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を試験する。除草剤処理に反応して観察された症状の発生を評価して、同じ条件下の野生型植物の反応と比較する。

【0291】

植物形質転換及び１００ｇＡＩ／ＴＢＴを使用したＴ０のセレクション
例として、Ｔ−ＤＮＡ ＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＨＩＳ６−ＦＭＰ２２ｔ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓ、又はＴ−ＤＮＡ ＰｒｏｍＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＴＰ−ＨＩＳ６−ＦＭＰ２３ｔ−ＴｅｒＣａＭＶ３５Ｓを含有する発根植物を標準的な成長条件下の温室に移す。２週間の順化後、Ｔ０植物を、硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加したＷＰ２０（水和剤２０％）製剤から調製したテンボトリオン１００g/haを含有する混合物で処理する。処理の２週間後、除草剤の適用による症状を評価する。植物を４つのカテゴリーに分類する。「０」と評価される処理植物は、未処理タバコ植物と似ている。「１」と評価される植物は、除草剤の適用による一過性の軽度の白化表現型を示す。「２」と評価される植物は、永続的な軽度〜重度の白化症状を示す。最後に、「３」と評価される植物は、同じ処理を受けた野生型タバコ植物と似ている。結果を下記の表８にまとめる。

【0292】

【表18】

【0293】

結論として、ＦＭＰ２２又はＦＭＰ２３ ＨＰＰＤを発現するいくつかのタバコ植物は、テンボトリオンに耐性を有する。

【0294】

実施例６：Ｚｅａ ｍａｙｓ植物を形質転換するための、ＦＭＰ２２ ＨＰＰＤをコードする遺伝子ＦＭＰ２２ｅ、ＦＭＰ２２ｔ及びＦＭＰ２２ｍのベクターへのクローニング
ＦＭＰ２２ｅ（配列番号２）、ＦＭＰ２２ｔ（配列番号３）、ＦＭＰ２２ｍ−ｈ（配列番号２３）
ａ−ＦＭＰ２２ｅ−ｐＨｏｅ６／Ａｃ：Ｅ． ｃｏｌｉ用に最適化されたコドン使用、加えて、その５’末端にＯＴＰをコードする配列及びＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する遺伝子
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でＥ． ｃｏｌｉで発現するように最適化された、ＨＰＰＤ ＦＭＰ２２をコードする遺伝子を含有するベクターｐＲＴ１００−ＦＭＰ２２ｅを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２２ｅ：：ＣａＭＶ３５Ｓ−ターミネータカセットを、事前に同じ制限酵素で消化し、脱リン酸化したバイナリーベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（US 6,316,694）にさらにクローニングした。得られたベクターをｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２２ｅと呼ぶ。

【0295】

ｂ−ＦＭＰ２２ｔ−ｐＨｏｅ６／Ａｃ（配列番号３）：双子葉植物用に最適化されたコドン使用、加えて、その５’末端にＯＴＰをコードする配列及びＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する遺伝子
ＦＭＰ２２ｔ−ｐＲＴ１００。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍで発現するように最適化されたタンパク質ＦＭＰ２２をコードし、加えて、５’末端に最適化されたトランジットペプチド及びＨＩＳ Ｔａｇをコードする核酸配列を含有する遺伝子のバージョンを系列化し、ＦＭＰ２２ｔと呼ぶ。この配列の上流に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加し、そして、下流に制限酵素ＸｂａＩの認識配列を付加した。ＯＴＰ及びＦＭＰ２２ｔに相当するＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化して、適切なゲル電気泳動により分離し、事前にＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で消化したベクターｐＲＴ１００（Toepfer, (1987), Nucleic Acid Res 15:5890）にクローニングした。プラスミドｐＲＴ１００は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶ３５Ｓターミネータを含有する。得られたベクターをｐＲＴ１００−ＦＭＰ２２ｔと呼び、そして、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２２ｔ：：ＣａＭＶ３５Ｓ−ターミネータカセットに相当するＤＮＡを、事前に制限酵素処理したベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（US 6.316.694）にクローニングするためにベクターの残りから分離した。得られたベクターをｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２２ｔと呼ぶ（図５）。

【0296】

ｃ−ＦＭＰ２２ｍ−ｐＨｏｅ６／Ａｃ（配列番号２３）：単子葉植物用に最適化されたコドン使用、加えて、その５’末端にＯＴＰをコードする配列を有する遺伝子
ＦＭＰ２２ｍ−ｐＲＴ１００−ＯＴＰ（ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ）、次にＨｉｎｄＩＩＩ
ＦＭＰ２２をコードする単子葉植物で発現するように最適化された遺伝子（ＦＭＰ２２ｍと呼ぶ）のバリアントを系列化し、そして、開始コドンの上流にＮｃｏＩ制限酵素認識部位を付加し、一方で、終止コドンの下流に制限酵素ＸｂａＩの認識配列を付加した。ＦＭＰ２２ｍに相当するＤＮＡ配列を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、次に、ゲル電気泳動により分離して、最後に、ゲルから単離した。単離ＤＮＡフラグメントを、また事前に同じ制限酵素で消化したベクターｐＲＴ１００−ＯＴＰ（上記）と混合した。発現カセットＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２２ｍ：：ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを含有する、得られたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ２２ｍと呼び、これを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを使用して単離し、次に、除草剤グルホシネートに対する耐性を付与する、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）酵素をコードする遺伝子を含有する、事前に開裂し、脱リン酸化したベクターｐＨＯＥ６／Ａｃにさらにクローニングした（US 6,316,694）。得られたプラスミドをｐＨｏｅ／Ａｃ／ＦＭＰ２２ｍと呼ぶ（図５Ｆ）。

【0297】

Ｚｅａ ｍａｙｓ植物を形質転換するための、ＦＭＰ２３ ＨＰＰＤをコードする遺伝子ＦＭＰ２３ｅ、ＦＭＰ２３ｔ及びＦＭＰ２３ｍのベクターへのクローニング

【0298】

ＦＭＰ２３ｅ（配列番号１６）、ＦＭＰ２２ｔ（配列番号１７）、ＦＭＰ２２ｍ−ｈ（配列番号３２）
ａ−ＦＭＰ２３ｅ−ｐＨｏｅ６／Ａｃ：Ｅ． ｃｏｌｉ用に最適化されたコドン使用、加えて、その５’末端にＯＴＰをコードする配列及びＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する遺伝子
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でＥ． ｃｏｌｉで発現するように最適化された、ＨＰＰＤ ＦＭＰ２３をコードする遺伝子を含有するベクターｐＲＴ１００−ＦＭＰ２３ｅを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２３ｅ：：ＣａＭＶ３５Ｓ−ターミネータカセットを、事前に同じ制限酵素で消化し、脱リン酸化したバイナリーベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（US 6,316,694）にさらにクローニングした。得られたベクターをｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２３ｅと呼ぶ。

【0299】

ｂ−ＦＭＰ２３ｔ−ｐＨｏｅ６／Ａｃ（配列番号１７）：双子葉植物用に最適化されたコドン使用、加えて、その５’末端にＯＴＰをコードする配列及びＨｉｓ ＴＡＧをコードする配列を有する遺伝子
ＦＭＰ２３ｔ−ｐＲＴ１００。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍで発現するように最適化されたタンパク質ＦＭＰ２３をコードし、加えて、５’末端に最適化されたトランジットペプチド及びＨＩＳ Ｔａｇをコードする核酸配列を含有する遺伝子のバージョンを系列化し、ＦＭＰ２３ｔと呼ぶ。この配列の上流に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加し、そして、下流に制限酵素ＸｂａＩの認識配列を付加した。ＯＴＰ及びＦＭＰ２３ｔに相当するＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化して、適切なゲル電気泳動により分離し、事前にＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で消化したベクターｐＲＴ１００（Toepfer, (1987), Nucleic Acid Res 15:5890）にクローニングした。プラスミドｐＲＴ１００は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶ３５Ｓターミネータを含有する。得られたベクターをｐＲＴ１００−ＦＭＰ２３ｔと呼び、そして、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２３ｔ：：ＣａＭＶ３５Ｓ−ターミネータカセットに相当するＤＮＡを、事前に制限酵素処理したベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（US 6.316.694）にクローニングするためにベクターの残りから分離した。得られたベクターをｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２３ｔと呼ぶ（図５）。

【0300】

ｃ−ＦＭＰ２３ｍ−ｐＨｏｅ６／Ａｃ（配列番号３２）：単子葉植物用に最適化されたコドン使用、加えて、その５’末端にＯＴＰをコードする配列を有する遺伝子
ＦＭＰ２３ｍ−ｐＲＴ１００−ＯＴＰ（ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ）、次に、ＨｉｎｄＩＩＩ
ＦＭＰ２３をコードする単子葉植物で発現するように最適化された遺伝子（ＦＭＰ２３ｍと呼ぶ）のバリアントを系列化し、そして、開始コドンの上流にＮｃｏＩ制限酵素認識部位を付加し、一方で、終止コドンの下流に制限酵素ＸｂａＩの認識配列を付加した。ＦＭＰ２３ｍに相当するＤＮＡ配列を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、次に、ゲル電気泳動により分離して、最後に、ゲルから単離した。単離ＤＮＡフラグメントをまた事前に同じ制限酵素で消化したベクターｐＲＴ１００−ＯＴＰ（上記）と混合した。発現カセットＣａＭＶ３５Ｓ：：ＯＴＰ：：ＦＭＰ２３ｍ：：ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを含有する得られたベクターをｐＲＴ１００−ＯＴＰ−ＦＭＰ２３ｍと呼び、これを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを使用して単離し、次に、除草剤グルホシネートに対する耐性を付与する、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）酵素をコードする遺伝子を含有する、事前に開裂し、脱リン酸化したベクターｐＨＯＥ６／Ａｃ（US 6,316,694）にさらにクローニングした。得られたプラスミドをｐＨｏｅ／Ａｃ／ＦＭＰ２３ｍと呼ぶ（図６Ｆ）。

【0301】

トウモロコシの形質転換：
プラスミドｐＨｏｅ６／Ａｃ（US 6,316,694）、ｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２２ｅ、ｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２２ｔ、ｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２２ｍ、ｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２３ｅ、ｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２３ｔ、及びｐＨｏｅ６／Ａｃ／ＦＭＰ２３ｍを使用してトウモロコシ培養物を形質転換した。

【0302】

稔性トランスジェニックトウモロコシ植物のトウモロコシ培養、プロトプラスト単離、形質転換及び再生を、米国特許第6284945号「異種遺伝子を有する稔性トランスジェニックトウモロコシを含む、長期の、高効率な植物再生能を有するＺｅａ ｍａｙｓ（Ｌ．）、及びその調製」に従って実施した。

【0303】

ホスフィノトリシンを含有する培地で形質転換カルスをセレクションした。次に、再生した発根植物を土壌に移し、そして、標準的な条件下の温室（２８／２０℃）で成長させて、種子を産生した。種子が産生されるまで成植物を成長させて、さらなる播種用に種子を回収し、十分に発育した植物を各ＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理する。

【0304】

実施例７：コメ植物で発現されるＦＭＰ２２ｅ遺伝子を含有するベクターの構築
コメ植物形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２２ｅの発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、Ｅ ｃｏｌｉ細菌で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、Ｈｉｓ ＴＡＧをコードする配列、そして、さらに上流にＯＴＰをコードする配列、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。さらに、形質転換ベクターは、また、形質転換プロセスの間、グルホシネートに基づくセレクションを行うためのＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）を含有する（図５Ｉ参照）。該バイナリーベクターをｐＴＭＶ３７３と呼ぶ。ＨＰＰＤ酵素をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子を発現する発現カセットを含む以外は同様にして、同等のバイナリーベクターを構築した。

【0305】

コメ植物形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２３ｅの発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、Ｅ ｃｏｌｉ細菌で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、Ｈｉｓ ＴＡＧをコードする配列、そして、さらに上流にＯＴＰをコードする配列、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。さらに、形質転換ベクターは、また、形質転換プロセスの間、グルホシネートに基づくセレクションを行うためのＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）を含有する（図６Ｉ参照）。該バイナリーベクターをｐＴＭＶ３７４と呼ぶ。ＨＰＰＤ酵素をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子を発現する発現カセットを含む以外は同様にして、同等のバイナリーベクターを構築した。

【0306】

実施例８：コメ植物の形質転換
コメの形質転換は、当技術分野でよく知られている方法を用いて達成される。簡単に述べると、稔性回復系統６Ｇ４３１７の未熟胚を使用して、コメのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換を実施した。簡単に述べると、ドナー植物の円錐花序を、授粉の８〜１２日後に採取した。未熟種子の外花穎を除去した。その後、種子をＮａＯＣｌベースの溶液及びＴｗｅｅｎを使用して消毒した。種子をアセチルサリチル酸で前誘導した。次に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を、暗室内で、アセトシリンゴンの存在下、２４℃で４日間、前誘導した種子と共培養した。その後、胚の子葉鞘を除去し、洗浄して、次に、ホスフィノトリシンを添加した培地に入れ、１６時間の明期リズム下、２８℃で３週間置いた。次に、成長したカルスを胚から取り除き、そして、トリアシリン（triacillin）、ホスフィノトリシン、Ｌ−プロリン及び硫酸銅（ＩＩ）を含有する新しい培地に移した。

【0307】

それぞれのカルス系（callusline）及びテンボトリオン濃度ごとに、異なるカルス種からランダムに単離された３つの新芽を、テンボトリオンを含むＭＳ／２に移した。原則として、再生培地からＭＳ／２への新芽の移動は、カルスを再生培地に入れた９週間後に行った。

【0308】

培養物を２６．５℃（１６時間の明期）でインキュベートし、２週間後に生じた症状の評価を行った。

【0309】

移した新芽から新たに生育した葉を白化に基づいて採点し、３つのグループに分類した：
ａ）白化なし
ｂ）中程度の白化
ｃ）完全な白化

【0310】

カテゴリー「中程度の白化」内で、ごくわずかな白化症状しか示さない、従って、葉を緑にする傾向がある新しい葉を有する新芽と、新しい葉がほぼ完全に白化した新芽を区別した。

【0311】

【表19】

【0312】

温室試験におけるテンボトリオンに対する反応
Ｔ０発根植物体（ホスフィノトリシン単独又はテンボトリオンを添加したホスフィノトリシンでセレクション）を温室内の土壌に移した。順化後、十分に成長した植物を異なるＨＰＰＤ阻害型除草剤で処理した。例として、Ｔ０植物に、硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加した製剤型ＷＰ２０のテンボトリオン１００g AI/haを散布した。散布適用の７日後に、除草剤の適用による症状を評価し、同じ処理を受けた野生型植物で観察される症状と比較した。

【0313】

処理の７日後に除草剤に反応して生じた表現型に基づいて、植物を３つのカテゴリーに分類した。クラスＩを、損傷なしの植物として定義し、クラスＩＩを、除草剤処理に反応して一過性の軽度の損傷を示す植物として定義し（損傷：１０〜４０％）、クラスＩＩＩを、重度の損傷〜同じ処理を受けた野生型植物で観察される同様の損傷を示す植物として定義した（損傷：４１〜１００％）。

【0314】

一般的に、わずか１つのＴ−ＤＮＡインサートを含有する植物でさえも、ＨＰＰＤ阻害型除草剤テンボトリオンの農地施用量（field dose）の曝露に対して有意で十分な耐性レベルを示したことが分かる。

【0315】

【表20】

【0316】

結論として、タンパク質ＦＭＰ２２及びＦＭＰ２３を発現するコメ植物が、ＨＰＰＤ阻害型除草剤テンボトリオンの適用に対して、野生型コメ植物、又は感受性ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＨＰＰＤを発現する植物より耐性が高いことが分かる。

【0317】

実施例９：バイナリーダイズ形質転換ベクターの構築
ダイズ形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈ（配列番号２２）の発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、ＯＴＰをコードする配列、そして、さらに上流に植物内でのｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈのヌクレオチド配列は、配列番号２３に示される。さらに、形質転換ベクターは、また、形質転換プロセスの間、グルホシネートに基づくセレクションを行うためのＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）、及び形質転換植物に除草剤グリホセートに対する耐性を付与する２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のヒストンプロモーター）を含有する（図５Ｈ参照）。バイナリーベクターをｐＦＣＯ１１３と呼ぶ。

【0318】

ダイズ形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２３ｔ−ｈ（配列番号３１）の発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、ＯＴＰをコードする配列、そして、さらに上流に植物内でのｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。遺伝子ＦＭＰ２３ｔ−ｈのヌクレオチド配列は、配列番号３１に示される。さらに、形質転換ベクターは、また、形質転換プロセスの間、グルホシネートに基づくセレクションを行うためのＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）、及び形質転換植物に除草剤グリホセートに対する耐性を付与する２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のヒストンプロモーター）を含有する（図６Ｈ参照）。バイナリーベクターをｐＦＣＯ１１４と呼ぶ。

【0319】

実施例１０：ダイズＴ０植物の確立及びセレクション
ダイズの形質転換は、Paz等（2006, Plant cell Rep. 25:206）に記載される、ダイズの半種子外植体のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換を用いた方法などの当技術分野でよく知られている方法を用いて達成される。形質転換体は、選択マーカーとしてイソキサフルトールを使用して同定した。緑色の新芽の出現が観察され、除草剤イソキサフルトールに対する耐性の指標であることが実証された。ＦＭＰ２２ｔ−ｈに関して、全体で、１．８％のトランスジェニック試験新芽が、イソキサフルトールで処理していない野生型ダイズの新芽に匹敵する正常な緑化を示したが、一方で、同量のイソキサフルトールで処理した野生型ダイズの新芽は完全に白化した。このことから、ＦＭＰ２２タンパク質の存在により、イソキサフルトールのようなＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有することが可能になることが示される。ＦＭＰ２３ｔ−ｈに関して、全体で、１．９％のトランスジェニック試験新芽が、イソキサフルトールで処理していない野生型ダイズの新芽に匹敵する正常な緑化を示したが、一方で、同量のイソキサフルトールで処理した野生型ダイズの新芽は完全に白化した。このことから、ＦＭＰ２３タンパク質の存在により、イソキサフルトールのようなＨＰＰＤ阻害型除草剤に対して耐性を有することが可能になることが示される。

【0320】

耐性を有する緑色の新芽を発根培地に移すか、又は接ぎ木した。順化後、発根植物体を温室に移した。

【0321】

次に、導入遺伝子を含有する植物に、ＨＰＰＤ阻害型除草剤、例えば、施用量１００g AI/haのテンボトリオンを散布した。適用の１０日後、除草剤の適用による症状を評価し、同じ条件下の野生型植物で観察される症状と比較した。

【0322】

ＦＭＰ２２に関して、ＦＭＰ２２ ＨＰＰＤタンパク質を発現する１つのイベントが上記の緑色の新芽から得られ、温室に移した。順化の４週間後、即ち、３〜４節間の発育段階の植物を、硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加したＷＰ２０製剤から調製したテンボトリオン１００g AI/haで処理した。適用の１０日後、ＨＰＰＤ阻害型除草剤の適用により生じる症状を評価し、処理した非トランスジェニック野生型ダイズ植物で観察される症状と比較した。このイベントは、一過性の軽度の白化症状を示したが、テンボトリオン適用の１４日後に回復した。これらのデータから、ＦＭＰ２２が、ダイズ植物において、テンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を付与することが確認される。

【0323】

ＦＭＰ２３に関して、ＦＭＰ２３ ＨＰＰＤタンパク質を発現する６つのイベントが上記の緑色の新芽から得られ、温室に移した。順化の４週間後、即ち、３〜４節間の発育段階の植物を、硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加したＷＰ２０製剤から調製したテンボトリオン１００g AI/haで処理した。適用の１０日後、ＨＰＰＤ阻害型除草剤の適用により生じる症状を評価し、処理した非トランスジェニック野生型ダイズ植物で観察される症状と比較した。６つのイベントのうち１つが白化表現型を全く示さず、未処理の野生型ダイズ植物と似ている。１つのイベントが、一過性の軽度の白化症状を示したが、テンボトリオン適用の１４日後に回復した。残りの４つのイベントは、テンボトリオンで処理した後、非トランスジェニック野生型ダイズ植物と似た白化を示した。これらの全てのデータから、ＦＭＰ２３が、ダイズ植物において、テンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害型除草剤に対する耐性を付与することが確認される。

【0324】

実施例１１：バイナリーコットン形質転換ベクターの構築
コットン形質転換用のバイナリーベクターは、、例えば、遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈ（配列番号２２）の発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、ＯＴＰをコードする配列、そして、さらに上流に植物内でのｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈのヌクレオチド配列は、配列番号２２に示される。さらに、形質転換ベクターは、また、形質転換プロセスの間、グルホシネートに基づくセレクションを行うためのＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）、及び形質転換植物に除草剤グリホセートに対する耐性を付与する２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のヒストンプロモーター）を含有する（図５Ｊ参照）。

【0325】

コットン形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２３ｔ−ｈ（配列番号３１）の発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、ＯＴＰをコードする配列、そして、さらに上流に植物内でのｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。遺伝子ＦＭＰ２３ｔ−ｈのヌクレオチド配列は、配列番号３１に示される。さらに、形質転換ベクターは、また、形質転換プロセスの間、グルホシネートに基づくセレクションを行うためのＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）、及び形質転換植物に除草剤グリホセートに対する耐性を付与する２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のヒストンプロモーター）を含有する（図６Ｊ参照）。

【0326】

実施例１２：コットンＴ０植物の確立及びセレクション
コットンの形質転換は、当技術分野でよく知られている方法、特に好ましくは、ＰＣＴ特許出願WO 00/71733に記載の方法を用いて達成される。

【0327】

再生した植物を温室に移した。順化の後、十分に成長した植物に、ＨＰＰＤ阻害型除草剤、例えば、硫酸アンモニウム及びメチルエステルラプス油を添加したテンボトリオン１００g AI/haを散布した。散布適用の７日後に、除草剤で処理したことによる症状を評価し、同じ条件下で同じ処理を受けた野生型コットン植物で観察される症状と比較した。

【0328】

実施例１３：別々の作用機序の４つの除草剤に耐性を有する植物を生成するためのバイナリー形質転換ベクターの構築
双子葉植物形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈ（配列番号２２）の発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、ＯＴＰをコードする配列、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈのヌクレオチド配列は、配列番号２２に示される。さらに、形質転換ベクターは、また、遺伝子を発現する植物にグルホシネートに対する耐性を付与するＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）、形質転換植物に除草剤グリホセートに対する耐性を付与する二重突然変異トウモロコシＥＰＳＰＳ（Ｔｈｒ１０２Ｉｌｅ及びＰｒｏ１０６Ｓｅｒ）をコードする２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のヒストンプロモーター）、及びこの遺伝子を発現する植物に、スルホニル尿素又はイミダゾリノンクラスの除草剤に対する耐性を付与する、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより促進される耐性ＡＬＳ酵素（アセト乳酸シンターゼ、Ｐｒｏ１９７Ａｌａ、Ｔｒｐ５７４Ｌｅｕ）をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ２ｍＡＨＡＳ遺伝子カセットを含有する（図５Ｇ参照）。

【0329】

遺伝子カセットを、最後に、ベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（US 6,316,694）にクローニングして、この最後のベクターをｐＨｏｅ６／ＦＭＰ２２ｔ−ｈ／ＰＡＴ／ＥＰＳＰＳ／ＡＨＡＳと呼び、そして、これを使用して、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介法により双子葉植物を形質転換する。Ｔ０植物を土壌に移し、そして、順化させた後、十分に成長した植物に、例えば、ＨＰＰＤ阻害剤クラスの除草剤、次に、グリホセート、次に、グルホシネート、最後に、スルホニル尿素クラスの除草剤を順次散布した。

【0330】

双子葉植物形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２３ｔ−ｈ（配列癌号３１）の発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、ＯＴＰをコードする配列、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。遺伝子ＦＭＰ２３ｔ−ｈのヌクレオチド配列は、配列番号３１に示される。さらに、形質転換ベクターは、また、遺伝子を発現する植物にグルホシネートに対する耐性を付与するＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）、形質転換植物に除草剤グリホセートに対する耐性を付与する二重突然変異トウモロコシＥＰＳＰＳ（Ｔｈｒ１０２Ｉｌｅ及びＰｒｏ１０６Ｓｅｒ）をコードする２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のヒストンプロモーター）、及びこの遺伝子を発現する植物に、スルホニル尿素又はイミダゾリノンクラスの除草剤に対する耐性を付与する、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより促進される耐性ＡＬＳ酵素（アセト乳酸シンターゼ、Ｐｒｏ１９７Ａｌａ、Ｔｒｐ５７４Ｌｅｕ）をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ２ｍＡＨＡＳ遺伝子カセットを含有する（図６Ｇ参照）。

【0331】

遺伝子カセットを、最後に、ベクターｐＨｏｅ６／Ａｃ（US 6,316,694）にクローニングして、この最後のベクターをｐＨｏｅ６／ＦＭＰ２３ｔ−ｈ／ＰＡＴ／ＥＰＳＰＳ／ＡＨＡＳと呼び、そして、これを使用して、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介法により双子葉植物を形質転換する。Ｔ０植物を土壌に移し、そして、順化させた後、十分に成長した植物に、例えば、ＨＰＰＤ阻害剤クラスの除草剤、次に、グリホセート、次に、グルホシネート、最後に、スルホニル尿素クラスの除草剤を順次散布した。

【0332】

実施例１４：３つの異なる作用機序の除草剤に耐性を示すトランスジェニック植物の作製
タバコ形質転換用のバイナリーベクターは、例えば、遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈ（配列番号２２）又はＦＭＰ２３ｔ−ｈ（配列番号３１）の発現を促進するＣａＭＶ３５プロモーター、双子葉植物で発現するように最適化されたコドン使用を用いて構築し、そして、その５’末端に、ＯＴＰをコードする配列、そして、さらに上流に植物内でのｍＲＮＡの安定性を改善するための配列ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）、続いて、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータを付加した。遺伝子ＦＭＰ２２ｔ−ｈのヌクレオチド配列は配列番号２２に示され、ＦＭＰ２３ｔ−ｈのヌクレオチド配列は配列番号３１に示される。さらに、形質転換ベクターは、また、形質転換プロセスの間、グルホシネートに基づくセレクションを行うためのＰＡＴ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＣａＶＭ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータが続く）、及び形質転換植物に除草剤グリホセートに対する耐性を付与する２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子カセット（遺伝子を促進するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のヒストンプロモーター）を含有する（図５Ｈ参照（ＦＭＰ２２ｔ−ｈ）；及び図６Ｈ参照（ＦＭＰ２３ｔ−ｈ））。上記ベクターを使用し、実施例３に従って、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ植物から得られたリーフディスクを形質転換した。

【0333】

トランスジェニックタバコ植物を温室に移し、施用量１１２１g AI/haのグリホセートで処理した。そのような耐性タバコ植物から種子を産生し、収穫した。これらの種子を土壌に蒔き、温室で発芽させた。３〜４週間後、イベント当たり５０個の植物体を単一ポットに移した。２週間後、４〜６cmサイズの植物に以下のものを散布した：
−グルホシネート−アンモニウム １０００g AI/ha、
−グリホセート １１２１g AI/ha、
−テンボトリオン １００g AI/ha、又は
−テンボトリオン＋グリホセート １００g AI/ha＋１１２１g AI/ha

【0334】

９日後、各除草剤の適用により生じる症状を評価した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]