特許 5872611 リポソームに被包されたオリゴヌクレオチド及びエピトープを含む免疫増強用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5872611

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】リポソームに被包されたオリゴヌクレオチド及びエピトープを含む免疫増強用組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 9/00 20060101AFI20160216BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/155 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20160216BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160216BHJP

【ＦＩ】

   C07K9/00ZNA

   A61K39/145

   A61K39/155

   A61P31/16

   !C12N15/00 A

【請求項の数】2

【全頁数】94

(21)【出願番号】特願2014-75261(P2014-75261)

(22)【出願日】2014年4月1日

(62)【分割の表示】特願2012-520526(P2012-520526)の分割

【原出願日】2010年6月16日

(65)【公開番号】特開2014-196300(P2014-196300A)

(43)【公開日】2014年10月16日

【審査請求日】2014年4月25日

(31)【優先権主張番号】10-2009-0065495

(32)【優先日】2009年7月17日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】512013488

【氏名又は名称】インダストリー アカデミック コーポレーション ファウンデーション， ハルリム ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(72)【発明者】

【氏名】クォン ヒョン−ジュ

【審査官】 山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５１４５３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５２５１３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０８８５８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１１２０１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１４３７１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１５７４１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Collins et al，The Journal of Immunology，１９９２年 ６月 １日，Vol. 148, No. 11，p. 3336-3341

【文献】 Joseph et al，Vaccine，２００２年，Vol. 20，p. 3342-3354

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２、５、６、及び２３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含むインフルエンザＡウイルスに対するペプチドワクチン組成物。

【請求項2】

配列番号２、５、６、及び２３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リポソームに被包されたオリゴヌクレオチド及びエピトープを含む免疫増強用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

エピトープに基づくペプチドワクチンは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、並びにＢ細胞及びＴ細胞エピトープとしてのＭＨＣに対する結合能力を通じた免疫反応を誘導して調節する中枢であって、感染性及び悪性疾患の予防のために活発に研究されている（非特許文献１〜３参照）。化学的に不活性化されたワクチンは、臨床で広く使用されるが、ワクチンは、ウイルスの再活性化の危険、ワクチン安定性の維持のための費用、自己免疫疾患の発生及び一部ワクチンの不十分な予防効果などの短所を有する（非特許文献１、３及び４参照）。これらの短所を克服するために、過去３０年間Ｂ細胞及びＴ細胞の選択的な反応を誘導する特定サブセットのリンパ球を刺激するようにデザインされたエピトープを使用することにより、免疫反応を調節する目的で合成ペプチドが開発されてきた。したがって、ペプチドワクチンは、抗癌ワクチン（非特許文献５及び６参照）、並びにインフルエンザウイルス（非特許文献３参照）、マラリア（非特許文献７参照）、Ｂ型肝炎（非特許文献８参照）及びＨＩＶ（非特許文献９参照）のような感染性疾患に対する非常に強力で有用な予防及び治療剤として注目を浴びている。ペプチドワクチンは、多様な動物モデルに対して活発に研究されたが、これらのヒトに対する治療効能は制限的である。ペプチドワクチンの効能を改善させるために、リポソームがワクチン運搬体として提示され（非特許文献１０参照）、フラゲラ（非特許文献１１参照）及びＣｐＧ−ＤＮＡ（非特許文献１２参照）のような免疫補助剤が免疫反応の強化のために利用された。

【0003】

伝達運搬体としてのリポソームは、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を強化させるワクチンの開発に広範囲に評価されてきた（非特許文献１０及び１３参照）、被包されたリポソームは、伝達物質を周囲環境から保護してターゲット細胞に伝達することができる。

【0004】

一方、ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン； ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−β−ｏｌｅｏｙｌ−γ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）／ＣＨＥＭＳ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ；コレステリルヘミスクシネート）のようなｐＨ−敏感性リポソームは、内容物を細胞質に分泌して、低いｐＨ（５．０）で互いに脂質−混合されることが特徴である（非特許文献１４参照）。たくさんの研究者らは、ｐＨ−敏感性リポソームが細胞質への抗原伝達を改善させてＣＴＬ反応を誘導するということを明かした（非特許文献１５参照）。更に、ｐＨ−敏感性リポソームに被包されたハンターンウイルスのヌクレオカプシド蛋白質（Ｍ６）又はヒトパピローマウイルスＥ７から合成されたＣＴＬエピトープで免疫化されたマウスで効率的な抗原−特異的ＣＴＬ反応が報告された（非特許文献１６参照）。大食細胞及び樹枝状細胞による抗原の流入を向上させるために、陽イオン性リポソームが伝達運搬体として利用された。ＣＴＬ反応及び抗体生産は、リポフェクタミン、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ及びＥＰＣ／ＳＡ／Ｃなどの陽イオン性リポソームの被包により強化される（非特許文献１０参照）。

【0005】

リポソームがＡＰＣｓ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）に抗原を伝達する強力な運搬体であるが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）と免疫補助能力（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）を強化させるための目的としても研究された。ＣｐＧ−ＤＮＡは、その免疫刺激（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）活性によりフラゲラ、脂質Ａ、サイトカインのような免疫刺激因子より更に有用な潜在的治療剤として注目を浴びてきた（非特許文献１７及び１８参照）。多くの研究者らが、ＣｐＧ−ＤＮＡがＡＰＣの活性、Ｔｈ１免疫反応及び免疫グロブリン（Ｉｇ）イソタイプスイッチングを増加させるという事実を明らかにした（非特許文献１９〜２１参照）。強力な補助剤としての免疫刺激活性は、リポソーム−被包されたＣｐＧ−ＤＮＡにより強化される。Ｓｕｚｕｋｉらは、陽イオン性リポソームに被包されたＣｐＧ−ＤＮＡがＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの発現を誘導して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）が共に被包されたＣｐＧ−ＤＮＡ−リポソームは、ＯＶＡ−発現腫瘍に対して強力な細胞毒性を有するＯＶＡ−特異的ＣＴＬを誘導するという事実を明かした（非特許文献２２参照）。また、ＳＳＣＬ（ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）は、Ｂ細胞、樹枝状細胞及び大食細胞による流入（ｕｐｔａｋｅ）を増加させて、ＯＶＡとＣｐＧ−ＤＮＡの共同被包は、抗原−特異的ＩＦＮ−γ及びＩｇＧ生産を増大させる（非特許文献２３参照）。更に、Ｌｉらは、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームに共に被包されたＣｐＧ−ＤＮＡ及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ−由来のペプチドがＣＴＬ反応及びＩｇＧ生産を増加させるということを究明した（非特許文献２４参照）。

【0006】

ヌクレアーゼ抵抗性を有して細胞に効率的に流入させるためにオリゴヌクレオチドバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）内非−ブリッジ酸素（ｎｏｎｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｘｙｇｅｎｓ）が硫黄で置換されたホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）−変形のＣｐＧ−ＤＮＡ（ＰＳ−ＤＮＡ）は、臨床適用に有用に利用されてきた（非特許文献２５参照）。しかし、多様な研究結果は、ＰＳ−ＤＮＡが一過性巨脾（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ）、リンパ濾胞破壊（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）及び関節炎のようなバックボーン−関連副作用を誘導することを示した（非特許文献２６〜２８参照）。したがって、研究者らは、深刻な副作用無しに最適の先天性免疫反応を誘導するために、ホスホジエステル結合ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＰＯ−ＤＮＡ）の天然カウンターパート（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）を開発した。ＰＳ−ＤＮＡと異なって、ＰＯ−ＤＮＡによる効果は、ヒト細胞で現れなかった。しかし、リポソーム（ＤＯＴＡＰ又はリポフェクチン）に被包されたＰＯ−ＤＮＡ及び非−ＣｐＧ−ＤＮＡで刺激を受けたヒト細胞で効果的な免疫反応が誘導されることが報告された（非特許文献２９及び３０参照）。

【0007】

以前の研究で、本発明者らは、コンピューターを利用したＭ． ｂｏｖｉｓゲノムＤＮＡの分析を通じて天然のホスホジエステル結合ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＰＯ−ＤＮＡ）を同定して、免疫刺激活性を有するＭ． ｂｏｖｉｓゲノムＤＮＡ配列をスクリーニングした（非特許文献３１参照）。本発明者らは、実験分析を通じてＣｐＧモチーフを含む強力なＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）と命名）が、深刻な副作用無しに抗原−誘導されたＴｈ１反応を誘導する強力な補助剤として作用することを明かした（非特許文献３１及び３２参照）。本発明において、本発明者らは、ヒト及びマウス細胞で免疫反応を刺激する種々のリポソーム内に被包されたＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））の抗体生産能力を比較した。更に、本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソームに共同で被包されたＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））及び種々のペプチドがペプチド−特異的ＩｇＧ生産を増加させるということを究明する。上述の結果は、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームによる輸送及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）の補助剤効果によりペプチドワクチンの効率性が向上されて、感染性疾病の伝染、治療抗体の開発及び生物学的テロ武器の露出のような分野に即刻的に使用できることを意味する。

【0008】

本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８： ４４２−４４８ （１９９７）．

【非特許文献2】Ｂｉｊｋｅｒ， Ｍ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６： ５９１−６０３ （２００７）．

【非特許文献3】Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６： ９３９−９４８ （２００７）．

【非特許文献4】Ｃａｓｔｉｌｏｗ， Ｅ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． ３９： ２２５−２３９ （２００７）．

【非特許文献5】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １０： ９０９−９１５ （２００４）．

【非特許文献6】Ｚｈａｏ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ７： １５４７−１５５５ （２００８）．

【非特許文献7】Ｋａｓｈａｌａ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ ２０： ２２６３−２２７７ （２００２）．

【非特許文献8】Ｅｎｇｌｅｒ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３８： ４５７−４６５ （２００１）．

【非特許文献9】Ｐｉｎｔｏ， Ｌ． Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ １３： ２００３−２０１２ （１９９９）．

【非特許文献10】Ｃｈｉｋｈ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２： ３３９−３５３ （２００２）．

【非特許文献11】Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１： １０４３−１０５１ （１９９９）．

【非特許文献12】Ｓｐｅｉｓｅｒ， Ｄ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１５： ７３９−７４６ （２００５）．

【非特許文献13】Ｆｅｌｎｅｒｏｖａ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： ５１８−５２９ （２００４）．

【非特許文献14】Ｓｉｍｏｅｓ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５６： ９４７−９６５ （２００４）．

【非特許文献15】Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｄ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ３３３６−３３４１ （１９９２）．

【非特許文献16】Ｃｈａｎｇ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ １９： ３６０８−３６１４ （２００１）．

【非特許文献17】Ｋｒｉｅｇ， Ａ． Ｍ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０： ７０９−７６０ （２００２）．

【非特許文献18】Ｋｌｉｎｍａｎ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９： ２０１−２１６ （２００４）．

【非特許文献19】Ｃｈｕ， Ｒ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： １６２３−１６３１ （１９９７）．

【非特許文献20】Ｃａｒｓｏｎ， Ｄ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： １６２１−１６２２ （１９９７）．

【非特許文献21】Ｄａｖｉｓ， Ｈ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ８７０−８７６ （１９９８）．

【非特許文献22】Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４： ８７５４−９７６０ （２００４）．

【非特許文献23】Ｇｕｒｓｅｌ， Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７： ３３２４−３３２８ （２００１）．

【非特許文献24】Ｌｉ， Ｗ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ ２１： ３３１９−３３２９ （２００３）．

【非特許文献25】Ｋｒｉｅｇ， Ａ．Ｍ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｉｓｃｏｖ． ５： ４７１−４８４ （２００６）．

【非特許文献26】Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２： ２３６８−２３７４ （１９９９）．

【非特許文献27】Ｄｅｎｇ， Ｇ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５： ７０２−７０５ （１９９９）．

【非特許文献28】Ｒｏｎａｇｈｙ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６８： ５１−５６ （２００２）．

【非特許文献29】Ｙａｓｕｄａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４： ６１２９−６１３６ （２００５）．

【非特許文献30】Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７９： ３１−３５ （２００７）．

【非特許文献31】Ｌｅｅ， Ｋ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： ２１０７−２１１８ （２００６）．

【非特許文献32】Ｋｉｍ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３７９： ３６２−３６７ （２００９）．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らは、多様な癌及び感染性疾病などに対する予防及び治療を可能にする新規な免疫補助剤（ｉｍｍｕｎｏａｄｊｕｖａｎｔ）を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、蛋白質抗原のペプチドエピトープを同定して、前記ペプチドエピトープ及びオリゴヌクレオチドを特定組成のリポソームに被包させる場合、大きく増加された免疫促進活性を有することを確認することにより、本発明を完成した。

【0011】

したがって、本発明の目的は、免疫反応増強用組成物を提供することにある。

【0012】

本発明の他の目的は、免疫原性を有するエピトープのスクリーニング方法を提供することにある。

【0013】

本発明のまた他の目的は、蛋白質抗原に対する抗体のスクリーニング方法を提供することにある。

【0014】

本発明のまた他の目的は、蛋白質抗原に対する抗体の製造方法を提供することにある。

【0015】

本発明のまた他の目的は、インフルエンザＡウイルス、癌、Ｃ型肝炎ウイルス又はＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ、呼吸器多核体ウイルス）に対するペプチドワクチン組成物を提供することにある。

【0016】

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、更に明確にされる。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明の一様態によると、本発明は、陰イオン性界面活性剤及び中性リン脂質を含むリポソームに被包された（ｉ）免疫刺激オリゴヌクロチド及び（ｉｉ）エピトープを有効成分として含む免疫増強用組成物を提供する。本発明者らは、多様な癌及び感染性疾病などに対する予防及び治療を可能にする新規な免疫補助剤を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、蛋白質抗原のペプチドエピトープを同定して、前記ペプチドエピトープ及びオリゴヌクレオチドを特定組成のリポソームに被包させる場合、大きく増加された免疫促進活性を有することを確認した。

【0018】

本明細書において、用語‘陰イオン性界面活性剤（ａｎｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）’は、分子内に疎水性部分と親水性部分を両方とも含んで、全体分子に陰電荷を帯びる両親媒性を有する分子を意味する。好ましくは、本発明で使用できる陰イオン性界面活性剤は、ホスファチジルグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、カルジオリピン（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ）、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、ジアシルホスファチジルセリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、ジセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジアシルホスファチジン酸（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノロアミン（Ｎ−ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、ＮＳＰＥ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン）、ＮＧＰＥ（Ｎ−ｇｌｕｔａｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン）、ＬＰＧ（ｌｙｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、リシルホスファチジルグリセロール）及びＣＨＥＭＳ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ、コレステリルヘミスクシネート）を含むが、これらに限定されるものではない。より好ましくは、前記陰イオン性界面活性剤は、ＣＨＥＭＳである。

【0019】

本明細書において、用語‘中性リン脂質’は、分子内各原子が電荷を帯びないリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）だけではなく、双性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｓ）のように一部原子が電荷を帯びても全体分子の総電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）が０であるリン脂質を意味する。好ましくは、本発明で使用される中性リン脂質は、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＳＰＣ（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＭＰＣ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール、ＰＥＧ−ＰＥ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）及びＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含むが、これらに限定されるものではない。より好ましくは、本発明の中性リン脂質は、ＤＯＰＥである。

【0020】

本明細書において、用語‘リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）’は、脂質二重膜を形成することにより製造される脂質運搬体を意味する。一般に、リポソームは、生体親和的で、両親媒性を有しており、内部の親水性物質を含んだまま疎水性膜を通過することができる。リポソームの直径は、一般に２０ｎｍ〜２，０００ｎｍであるが、これに制限されず、製造方法及び運搬されるヌクレオチドの長さによって多様な大きさが可能である。

【0021】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のリポソームは、ＣＨＥＭＳ及びＤＯＰＥの混合物である。

【0022】

本発明で使用するリポソーム内におけるＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳのモル比率は、好ましくは７：３〜３：７であり、より好ましくは、４．５：５．５〜５．５：４．５であって、最も好ましくは、５．０：５．０である。

【0023】

本発明のリポソームの製造は、当業界に公知の多様な方法により製造することができ、好ましくは、有機溶媒−混合方法又は界面剤−混合方法を利用する（米国特許登録第５，７０５，３８５号；米国特許出願第０８／６６０，０２５号）。より好ましくは、リポソームは、ＤＯＰＥ及びＣＨＥＭＳを混合して、これを窒素ガスと共に蒸発させて無溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｆｒｅｅ）脂質フィルムを作った後、アルコール溶液で溶解させ、最終的に水溶性ヌクレオチド混合物と混合する過程を通じて製造する。

【0024】

本発明のリポソーム製造を、有機溶媒混合を通じて行う場合、これに利用される有機溶媒は、クロロホルム、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール又はブタノールを含む。好ましくは、前記有機溶媒は、エタノールである。

【0025】

本明細書において、用語‘被包（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）’は、効率的なインビボ運搬のために、運搬される物質を相対的に安定したシェル内に閉じ込める（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）ことを意味する。

【0026】

本明細書において、用語‘免疫刺激（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）’は、初期免疫反応を誘導するか、又は抗原に対する既存の免疫反応を測定可能な程度に増加させることを意味する。

【0027】

本発明で利用できる免疫刺激オリゴヌクレオチドは、当業界に公知のあらゆる免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。例えば、前記免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ヘアピン二次構造を形成するパリンドローム、ＣｐＧモチーフ、ＣｐＴモチーフ又は多重Ｇドメインを含むオリゴヌクレオチド、又は他に公知のＩＳＳ（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であってもよい。例えば、本発明で利用される免疫刺激オリゴヌクレオチドは、米国特許出願公開第２００８００４５４７３号、ＷＯ２００６／０６３１５２又はＷＯ１９９８／１８８１０に開示の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。

【0028】

前記ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドの具体的な例は、ＷＯ２００６／０８０５９６に開示の本発明者らはにより開発されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。例えば、次の一般式で表されるＣｐＧオリゴヌクレオチドが本発明で利用できる：ＨＫＣＧＴＴＣＲＴＧＣＳＧＭ［Ｒは、Ａ又はＧ；Ｓは、Ｃ又はＧ；Ｈは、Ａ、Ｔ又はＣ；Ｋは、Ｇ又はＴ；Ｍは、Ｃ又はＡ］。

【0029】

本発明で有効成分として利用される免疫刺激オリゴヌクレオチドは、天然（ｎａｔｕｒａｌ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ヌクレオチド、バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）変形されたヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｍ． Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３６５： ５６６−５６８（１９９３））、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ、ホスホロアミデートＤＮＡ、アミド連結されたＤＮＡ、ＭＭＩ連結されたＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、α−ＤＮＡ及びメチルホスホネートＤＮＡ、糖変形されたヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリルＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡ及びアンヒドロヘキシトールＤＮＡ）、及び塩基変形されたヌクレオチド（例えば、Ｃ−５置換されたピリミジン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニール−、ホルミル−、エチジル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−及びピリジル−を含む）、Ｃ−７置換基を有する７−デアザプリン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニール−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−を含む）、イノシン及びジアミノプリン）を含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、天然ヌクレオチドである。

【0030】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ホスホロジエステルバックボーン又はホスホロチオエートバックボーンを有する。

【0031】

本発明で利用される免疫刺激オリゴヌクレオチドの長さは、特に制限されず、好ましくは、８〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは、１５〜５０ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、１３〜２５ヌクレオチド長である。

【0032】

好ましくは、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、配列番号１４から配列番号１８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、配列番号１４のオリゴヌクレオチドである。

【0033】

本発明者らは、以前の研究で実験的分析により、ミコバクテリウムボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ゲノムＤＮＡ由来の潜在的ＣｐＧ−ＤＮＡがＴｈ１−反応性免疫補助物質として機能して、転写因子であるＮＦ−ｋＢを活性化させるということを究明した（Ｌｅｅ， Ｋ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： ２１０７−２１１８ （２００６）．参照）。

【0034】

具体的に、本発明で利用されるオリゴヌクレオチドは、ミコバクテリウムボビスゲノムＤＮＡ内４５３１位置の２０ｂｐ−オリゴヌクレオチドであるＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（配列番号１４）、前記配列のＣＧジヌクレオチド配列の一つがＧＣ配列で置換されたＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（ＧＣＯ）（配列番号１５）、ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１配列の３’−末端の７個塩基が削除されて、バックボーン内ブリッジ酸素（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｘｙｇｅｎ）が硫黄で置換されたＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ）Ｔ１３（配列番号１６）、ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１配列のＣＧジヌクレオチド配列の一つがＣＴ配列で置換されて、バックボーンのブリッジ酸素が硫黄で置換されたＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ）ＣＴ（配列番号１７）、及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１配列と相補的でありながら、バックボーンのブリッジ酸素が硫黄で置換されたＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ）ＣＳ（配列番号１８）である。本発明者らの実験的分析を通じて、ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１オリゴヌクレオチド／ペプチド／リポソーム複合体の投与が、他のオリゴヌクレオチドを有する複合体の投与より、総ＩｇＧのレベルを最も高く誘導するということを究明した。

【0035】

本明細書において、用語‘エピトープ’は、抗体と相互作用する抗原の部位を意味する。より詳しくは、エピトープは、免疫グロブリン又はＴ−細胞受容体に特異的に結合できる蛋白質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。また、本発明のエピトープは、免疫反応を増加させることのできるある分子又は物質を含む。例えば、本発明のエピトープは、ペプチド、これらのペプチドをエンコーディングする核酸及び糖蛋白質を含むが、これらに限定されるものではない。

【0036】

本明細書において、用語‘ペプチド’は、アミノ酸残基間のペプチド結合により形成された線形の分子を意味し、本明細書において、用語‘ペプチドエピトープ’は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の特異的反応を誘導できるエピトープを含むペプチドを意味する。

【0037】

本発明のペプチドエピトープの長さは、特に制限されず、好ましくは、７〜３０アミノ酸長さであり、より好ましくは、１０〜２５アミノ酸長さであって、最も好ましくは、１０〜１７アミノ酸長さである。

【0038】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のエピトープは、配列番号１から配列番号１３、及び配列番号１９から配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドエピトープである。

【0039】

本発明者らは、エピトープのスクリーニングのために、鳥インフルエンザＡウイルスのＨＡ蛋白質、豚（ｓｗｉｎｅ）インフルエンザＡウイルスのＨＡ蛋白質、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルスのＨＡ蛋白質、Ｈ７インフルエンザＡウイルスのＨＡ蛋白質、Ｈ９インフルエンザＡウイルスのＨＡ蛋白質、ヒト肝癌（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）のｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質、ヒトインテグリンβ４（ｈＩＢ４）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白質、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の付着（Ｇ）糖蛋白質（ｈＲＳＶ−Ｇ）及びＲＳＶの融合蛋白質（ＨＲＳＶ−Ｆ）由来のペプチドを合成した。以後、投与時に免疫反応を増加させるペプチドを選別して、配列番号１から配列番号６及び配列番号１９から配列番号３７のアミノ酸配列からなるペプチドは、インフルエンザＡウイルスに対する免疫増強効果を有して、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むペプチドは、肝癌に対する免疫増強効果を有し、配列番号４２から配列番号４６のアミノ酸配列を含むペプチドは、ヒトインテグリン蛋白質β４に対する免疫増強効果を有して、配列番号１２のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｃ型肝炎ウイルスに対する免疫増強効果を有して、配列番号１３及び配列番号３８から配列番号４１のアミノ酸配列を含むペプチドは、ＲＳＶに対する免疫増強効果を有する。

【0040】

本発明の組成物には、その他の薬物又は他の免疫補助剤が含まれて、追加的な免疫刺激効果を提供することができる。免疫補強剤の種類は、当分野に広く公知されている（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ − Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， １９９５， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ６， Ｅｄｓ． Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｆ．， ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ， ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。好ましくは、本発明の組成物に含まれる免疫補強剤は、アルミニウム塩又はカルシウム塩（例えば、ヒドロキシド又はホスフェート）を含む。

【0041】

好ましい免疫補強剤の具体的例は、下記のようである：アルミニウム塩又はカルシウム塩（ヒドロキシド又はホスフェート）、水中油（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョン（ＷＯ ９５／１７２１０， ＥＰ ０ ３９９ ８４３）又はリポソームのような微粒性キャリア（ＷＯ ９６／３３７３９）、南アメリカ樹木のＱｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ由来の免疫学的に抗原補強剤活性を有したサポニン分画（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）、３ Ｄｅ−Ｏ−アシル化されたモノホスホリル脂質Ａ、ムラミルジペプチド、３Ｄ−ＭＰＬ（３−Ｏ−デアシル化されたモノホスホリル脂質Ａ）を含むが、これらに限定されるものではない。

【0042】

本発明の免疫増強用組成物は、多様な状態又は疾患の治療に適用でき、前記状態又は疾患の例は、以下のようであるが、これらに限定されるものではない：
（ｉ）癌（例えば、胃癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸部癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌及び尿管癌）；
（ｉｉ）ウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ又はＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、天然痘（ｖａｒｉｏｌａ）又はワクシニアのようなオルソポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）又は伝染性軟いぼウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ））、ピコルナウイルス（例えば、リノウイルス又はエンテロウイルス）、オルソミキソウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルス）、パラミキソウイルス（例えば、５−パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス（ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、はしかウイルス及びＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、コンジローマ、尋常性いぼ又は足底疣贅を誘発するパピローマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス又はデングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ））又はレトロウイルス（例えば、ＨＩＶのようなレンチウイルス））により誘発される感染性疾患；
（ｉｉｉ）バクテリア（例えば、エスケリチア、エンテロバクター、サルモネラ、スタフィロコッカス、シゲラ、リステリア、エアロバクター、ヘリコバクター、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、ナイセリア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、カンピロバクター、ビブリオ、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス又はボルデテラ属）により誘発される感染性疾患；
（ｉｖ）クラミジアのような他の感染性疾患、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症及びクリプトコッカス脳膜炎を含むが、これに限定されない真菌性疾病、又はマラリア、ニューモシスチス性肺炎、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症及びトリパノゾーマ肝炎を含むが、これらに限定されない寄生虫性疾患；
（ｖ）アトピー性皮膚炎又は湿疹、好酸球増加症、喘息、アレルギー、アレルギー鼻炎及びＯｍｅｎｎ様症候群のようなＴ_ｈ２媒介のアトピー疾患；
（ｖｉ）アロペシアグレアタ（ａｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン疾患、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、腹腔スプルー皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ−ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫異常症候群、慢性炎症性脱髄多発性神経病症、チャーグ・ストラウス症候群（Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状狼瘡、本態性複合寒冷グロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑症、ＩｇＡ神経炎、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエル病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、タイプＩ又は免疫−媒介糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結晶性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎と皮膚筋炎、一次性無ガンマグロブリン血症、一次性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、リウマチ性関節炎、サルコイド症、強皮症、スティッフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、一時的動脈炎、巨大細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、白斑症及びウェゲナー肉芽腫症のような自己免疫疾患；
（ｖｉｉ）喘息、エンセフィリチス（ｅｎｃｅｐｈｉｌｉｔｉｓ）、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルス又はバクテリア感染による慢性炎症を含む炎症性疾患；及び
（ｖｉｉｉ）慢性傷を含むケロイド及び他の形態の傷跡生成抑制及び傷治癒の促進のような傷治癒に係わる疾患。

【0043】

好ましくは、本発明の組成物は、癌、ウイルス疾患、バクテリア疾患、感染性疾患又は自己免疫疾患に利用される。

【0044】

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９ｔｈ ｅｄ．， １９９５）に詳細に記載されている。

【0045】

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与することができ、好ましくは非経口投与であって、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。

【0046】

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の経口投与量は、好ましくは、１日当たり、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。

【0047】

本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を更に含むことができる。

【0048】

本発明の他の様態によると、本発明は、以下の段階を含む免疫原性を有するエピトープのスクリーニング方法を提供する：
（ａ）陰イオン性界面活性剤及び中性リン脂質を含むリポソームに（ｉ）免疫刺激オリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）エピトープ候補物質としてのペプチドを被包させる段階と、
（ｂ）前記（ｉ）免疫刺激オリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）エピトープ候補物質としてのペプチドが被包されたリポソームを利用して、ヒトを除く動物を免疫化させる段階と、
（ｃ）前記免疫化された動物における免疫反応を測定する段階。

【0049】

本発明のエピトープ又はペプチド、免疫刺激オリゴヌクレオチド及びリポソームは、上述の本発明の免疫増強用組成物で記載した内容と共通するため、過度なる重複を避けるためにその記載を省く。

【0050】

リポソーム−被包された免疫刺激オリゴヌクレオチド又はペプチドにより免疫化させる方法は、当業界に知られた多様な免疫投与方法を含み、好ましくは非経口投与である。非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。

【0051】

本発明で利用される‘ヒトを除く動物（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ａｎｉｍａｌ）’は、当業界で一般に利用される多様な動物を含み、好ましくは哺乳動物であって、最も好ましくは、マウス、ラビット又はラットである。

【0052】

本発明で免疫化された動物における免疫反応測定は、例えば、前記選別されたリポソーム−被包されたペプチドを投与した対象動物から血清を採取して、抗−ペプチド抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価を測定する方法を通じて行われる。好ましくは、抗体の力価を測定する方法は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、側面移動分析法（Ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｔｅｓｔ）、ＭＩＡ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）及び免疫沈降法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されるものではない。より好ましくは、ＥＬＩＳＡ分析法が利用できる。

【0053】

特定ペプチド配列が抗−ペプチド抗体の力価を増加させる場合、前記特定ペプチドは、エピトープ又はペプチドワクチンとみなされる。

【0054】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、以下の段階を含む蛋白質抗原に対する抗体のスクリーニング方法を提供する：
（ａ）陰イオン性界面活性剤及び中性リン脂質を含むリポソームに（ｉ）免疫刺激オリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）エピトープ候補物質として前記蛋白質抗原のペプチドを被包させる段階と、
（ｂ）前記（ｉ）免疫刺激オリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）エピトープ候補物質としてのペプチドが被包されたリポソームを利用して、ヒトを除く動物を免疫化させる段階と、
（ｃ）前記免疫化された動物における免疫反応を測定して、免疫原性を示すペプチドエピトープを選別する段階と、
（ｄ）前記選別されたペプチドエピトープと分析対象の抗体とを接触させる段階と、
（ｅ）前記段階（ｄ）の結果物と前記蛋白質抗原とを接触させる段階と、
（ｆ）前記蛋白質抗原と前記分析対象の抗体との結合を分析する段階。

【0055】

本発明のスクリーニング方法は、多様な方式で行うことができ、特に当業界に公知された多様な結合アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって高速（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）方式で行うことができる。

【0056】

本発明の蛋白質抗原又は候補抗体は、検出可能な標識で標識化することができる。例えば、前記検出可能な標識は、化学的標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｃ^１４、Ｉ^１２５、Ｐ^３２及びＳ^３５）、蛍光標識（例えば、クマリン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ロダミン６Ｇ、ロダミンＢ、ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｄａｂｓｙｌ及びＦＡＭ）、発光標識、化学発光標識、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識又は金属標識（例えば、金及び銀）である。

【0057】

検出可能に標識化された蛋白質抗原又は候補抗体を利用する場合、蛋白質抗原と抗体間の結合は、標識から出るシグナルを検出して分析することができる。例えば、標識としてアルカリンホスファターゼが利用される場合は、ＢＣＩＰ（ｂｒｏｍｏｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質を利用してシグナルを検出する。標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合は、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート）、レソルフィンベンジルエーテル、ルミノール、Ａｍｐｌｅｘレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＨＹＲ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）及びナフトール／ピロニンのような基質を利用してシグナルを検出する。

【0058】

択一的に、分析対象抗体の蛋白質抗原との結合有無は、相互作用物（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔｓ）のラベリング無しに分析することもできる。例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を利用して、分析対象の抗体が蛋白質抗原に結合するかどうかを分析することができる。マイクロフィジオメーターは、ＬＡＰＳ（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ）を利用して、細胞がその環境を酸性化する速度（ａｃｉｄｉｆｙｉｎｇ ｒａｔｅ）を測定できる分析道具である。酸性化速度の変化は、候補抗体と蛋白質抗原間の結合に対する指示子（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）として利用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｈ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２ （１９９２）．参照）。

【0059】

蛋白質抗原に対する候補抗体の結合能力は、リアルタイム分子間相互作用分析（ＢＩＡ）を利用して分析することができる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３：２３３８−２３４５ （１９９１）．、Ｓｚａｂｏ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：６９９−７０５ （１９９５）．参照）。ＢＩＡは、相互作用物（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔｓ；例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ）のラベリング無しに実時間で特異的相互作用を分析する技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）における変化は、分子間の実時間反応に対する指示子として利用できる。

【0060】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、以下の段階を含む蛋白質抗原に対する抗体の製造方法を提供する：
（ａ）陰イオン性界面活性剤及び中性リン脂質を含むリポソームに（ｉ）免疫刺激オリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）エピトープ候補物質として前記蛋白質抗原のペプチドを被包させる段階と、
（ｂ）前記（ｉ）免疫刺激オリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）エピトープ候補物質としてのペプチドが被包されたリポソームを利用して、ヒトを除く動物を免疫化させる段階と、
（ｃ）前記免疫化された動物における免疫反応を測定して、免疫原性を示すペプチドエピトープを選別する段階と、
（ｄ）前記選別されたペプチドエピトープを利用して、ヒトを除く動物を免疫化させて抗体を生産する段階。

【0061】

本発明によると、本発明の方法で免疫化された対象動物から抗体を収得する段階は、当業界に通常的に使用されるエタノール沈殿法、イオン交換樹脂吸着クロマトグラフィー法、又はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムを利用したクロマトグラフィー法を含む多様な方法を利用することができる。また、特異抗原−結合されたアガロースビーズカラムを利用した吸着クロマトグラフィー法を利用して、哺乳動物の血漿から純粋な免疫グロブリンだけを分離することができる。一方、免疫グロブリンは、哺乳動物の抹消血液リンパ球又はＢ細胞から得られた抗体蛋白質に対する遺伝情報を有したｃＤＮＡライブラリーから情報を得た後、これに基づいて遺伝工学的に製造することもできる。上述の方法により製造された遺伝的組み換え免疫グロブリン蛋白質は、哺乳動物の免疫グロブリンのアミノ酸塩基配列又はこれを一部突然変異させてヒト化された遺伝的組み換え免疫グロブリン蛋白質を含む（Ｖａｕｇｈａｎ ＴＪ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｓｉｇｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：５３５−５３９（１９９８））。精製された抗体は、使用時まで冷蔵中の氷上で貯蔵できる。更に、本発明の方法は、前記免疫化された動物からＢ細胞を分離して単一クローン抗体、ヒト化された抗体又は親和力増加抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を生成させる段階を追加的に含むことができる。

【0062】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号１から配列番号９、そして配列番号１９から配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含むインフルエンザＡウイルスに対するペプチドワクチン組成物を提供する。

【0063】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号４２から配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含むヒトインテグリン蛋白質β４に対するペプチドワクチン組成物を提供する。

【0064】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む肝癌（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）に対するペプチドワクチン組成物を提供する。

【0065】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列からなるペプチドを含むＣ型肝炎ウイルスに対するペプチドワクチン組成物を提供する。

【0066】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号１３及び配列番号３８から配列番号４１のアミノ酸配列からなるペプチドを含むＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）に対するペプチドワクチン組成物を提供する。

【0067】

本発明のペプチドワクチンは、上述の本発明の免疫増強用組成物で記載した内容と共通するため、過度なる重複を避けるためにその記載を省く。

【0068】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、インフルエンザＡウイルス感染症、癌、肝癌、Ｃ型肝炎ウイルス感染性疾患又はＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）感染性疾患の予防又は治療方法を提供する。

【発明の効果】

【0069】

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ａ）本発明は、免疫増強用組成物、免疫原性を有するエピトープ、これらのスクリーニング方法及びこれらの製造方法、そして蛋白質抗原に対する抗体及びこれらのスクリーニング方法及びこれらの製造方法を提供する。
（ｂ）本発明の組成物及び方法は、免疫強化を通じて癌、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）を始めとした多様な免疫欠乏関連疾患の予防又は医療に効果的に利用できる。

【図面の簡単な説明】

【0070】

【図1a】図１ａは、リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１）とＨＥＬ（ｈｅｎ ｅｇｇ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）複合体により腹腔免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの体液反応を示した図である。ＨＥＬ−ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）−リポソーム複合体がマウス腹腔に１０日間隔で３回にわたって投与された。その後、ＩｇＧの生産を測定することにより、総ＩｇＧの力価が増加したことを確認した。本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に被包されたＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）をＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）と表記した。

【図1b】図１ｂは、リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１）とＨＥＬ（ｈｅｎ ｅｇｇ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）複合体により腹腔免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの体液反応を示した図である。ＨＥＬ−ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）−リポソーム複合体がマウス腹腔に１０日間隔で３回にわたって投与された。その後、ＩｇＧ（図１ａ）、ＩｇＧ１（図１ｂ）、ＩｇＧ２ａ（図１ｃ）の生産を測定することにより、ＩｇＧ１の生産が増加したことを確認した。本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に被包されたＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）をＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）と表記した。

【図1c】図１ｃは、リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１）とＨＥＬ（ｈｅｎ ｅｇｇ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）複合体により腹腔免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの体液反応を示した図である。ＨＥＬ−ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）−リポソーム複合体がマウス腹腔に１０日間隔で３回にわたって投与された。その後、ＩｇＧ２ａの生産を測定することにより、Ｔｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産が増加したことを確認した。本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に被包されたＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）をＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）と表記した。

【図2a】図２ａは、ペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体を製造するために、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮し、鶏インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）／ベトナム／２００４菌株のヘマグルチニン（ＨＡ）から選別されたエピトープ候補を同定するための結果を示す。前記選別されたエピトープ候補の１０種（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ５８、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ１１３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３３６、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３６３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７７、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８４、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８７及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３９４）をそれぞれペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔投与した後、血清を採取した。ＩｇＧの量を分析した結果、各ペプチド−特異的総ＩｇＧの量が増加した。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に基づいて、ナンバリングされる。

【図2b】図２ｂは、ペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体を製造するために、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮し、鶏インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）／ベトナム／２００４菌株のヘマグルチニン（ＨＡ）から選別されたエピトープ候補を同定するための結果を示す。前記選別されたエピトープ候補の１０種（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ５８、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ１１３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３３６、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３６３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７７、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８４、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８７及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３９４）をそれぞれペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔投与した後、血清を採取した。各ペプチド−特異的なＩｇＧ１の量を分析した結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に基づいて、ナンバリングされる。

【図2c】図２ｃは、ペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体を製造するために、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮し、鶏インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）／ベトナム／２００４菌株のヘマグルチニン（ＨＡ）から選別されたエピトープ候補を同定するための結果を示す。前記選別されたエピトープ候補の１０種（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ５８、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ１１３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３３６、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３６３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７７、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８４、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８７及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３９４）をそれぞれペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔投与した後、血清を採取した。ＩｇＧの量を分析した結果、各ペプチド−特異的にＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産が増加した。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に基づいて、ナンバリングされる。

【図2d】図２ｄは、ペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体を製造するために、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮し、鶏インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）／ベトナム／２００４菌株のヘマグルチニン（ＨＡ）から選別されたエピトープ候補を同定するための結果を示す。前記選別されたエピトープ候補の１０種（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ５８、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ１１３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３３６、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３６３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７７、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８４、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８７及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３９４）をそれぞれペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔投与した後、血清を採取した。ＩｇＧの量を分析した結果、各ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価が増加した。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に基づいて、ナンバリングされる。

【図2e】図２ｅは、ペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体を製造するために、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮し、鶏インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）／ベトナム／２００４菌株のヘマグルチニン（ＨＡ）から選別されたエピトープ候補を同定するための結果を示す。前記選別されたエピトープ候補の１０種（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ５８、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ１１３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３３６、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３６３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７７、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８４、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３８７及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３９４）をそれぞれペプチド−ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔投与した後、血清を採取した。また、本発明者らは、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチド特異的ＩｇＧ（ＩｇＧ２ａ）の更に多い量が２次反応及び３次反応で生産されたかどうかを調べた。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に基づいて、ナンバリングされる。

【図3a】図３ａは、多様なリポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（６：４比率）、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：０比率）、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（０：１比率）、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＡＰ又はポロキサマ４０７）と複合されたＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））とペプチド（Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３）をＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、採取された血清からＩｇＧの量を分析した結果である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳのモル比が１：１である場合、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド処理群で総ＩｇＧの量が最も高かった。

【図3b】図３ｂは、多様なリポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（６：４比率）、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：０比率）、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（０：１比率）、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＡＰ又はポロキサマ４０７）と複合されたＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））とペプチド（Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３）をＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、採取された血清からＩｇＧの量を分析した結果である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳのモル比が１：１である場合、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド処理群で総ＩｇＧの力価が最も高かった。

【図4】図４は、ＰＯ−ＤＮＡ、ＰＳ−ＤＮＡ又は多様な非−ＣｐＧ−ＤＮＡｓと複合されたペプチド（Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３）とリポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１））をＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、採取された血清からＩｇＧの量を分析した結果である。非−ＣｐＧ−ＤＮＡより、ＰＯ−ＤＮＡ ４５３１（Ｏ）又はＰＳ−ＤＮＡ ４５３１（Ｓ）と複合体をなしたＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド処理群で総ＩｇＧの量が最も高かった。Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド特異的ＩｇＧ生産にＭＢ−ＯＤＮ ４５３１の補助効果は、ＣＣ配列依存的であって、バックボーン変形非依存的であった。

【図5a】図５ａは、Ｈ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレインにおいて、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する保存配列及び保存配列−特異的ＩｇＧ生産を示す結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応するＨ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレイン内１７個のアミノ酸保存配列が、表３及び表４に記載のように合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＮＹ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＯＨ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ３７０、Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０及びｈＨ５Ｎ１−ＨＫ ＨＡ３７０；５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド特異的総ＩｇＧの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図5b】図５ｂは、Ｈ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレインにおいて、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する保存配列及び保存配列−特異的ＩｇＧ生産を示す結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応するＨ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレイン内１７個のアミノ酸保存配列が、表３及び表４に記載のように合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＮＹ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＯＨ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ３７０、Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０及びｈＨ５Ｎ１−ＨＫ ＨＡ３７０；５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド特異的総ＩｇＧ１の量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図5c】図５ｃは、Ｈ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレインにおいて、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する保存配列及び保存配列−特異的ＩｇＧ生産を示す結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応するＨ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレイン内１７個のアミノ酸保存配列が、表３及び表４に記載のように合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＮＹ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＯＨ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ３７０、Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０及びｈＨ５Ｎ１−ＨＫ ＨＡ３７０；５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド特異的総ＩｇＧ２ａの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図5d】図５ｄは、Ｈ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレインにおいて、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する保存配列及び保存配列−特異的ＩｇＧ生産を示す結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応するＨ１Ｎ１ストレイン及びＨ５Ｎ１ストレイン内１７個のアミノ酸保存配列が、表３及び表４に記載のように合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＮＹ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＯＨ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ３７０、Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０及びｈＨ５Ｎ１−ＨＫ ＨＡ３７０；５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド特異的ＩｇＧの力価がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図6a】図６ａは、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）とｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する保存配列の複合体で免疫化されたマウス血清から、ＩｇＧ生産上の効果を測定した結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応するインフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１ストレイン（表５）及び多様なインフルエンザＡウイルス亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ；表６）から見られる１４個のアミノ酸保存配列が合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド特異的総ＩｇＧの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図6b】図６ｂは、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）とｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する保存配列の複合体で免疫化されたマウス血清から、ＩｇＧ生産上の効果を測定した結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応するインフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１ストレイン（表５）及び多様なインフルエンザＡウイルス亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ；表６）から見られる１４個のアミノ酸保存配列が合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド特異的総ＩｇＧ１の量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図6c】図６ｃは、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）とｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する保存配列の複合体で免疫化されたマウス血清から、ＩｇＧ生産上の効果を測定した結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応するインフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１ストレイン（表５）及び多様なインフルエンザＡウイルス亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ；表６）から見られる１４個のアミノ酸保存配列が合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド−特異的総ＩｇＧ２ａの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図6d】図６ｄは、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）とｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する保存配列の複合体で免疫化されたマウス血清から、ＩｇＧ生産上の効果を測定した結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応するインフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１ストレイン（表５）及び多様なインフルエンザＡウイルス亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ；表６）から見られる１４個のアミノ酸保存配列が合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド特異的総ＩｇＧの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図7a】図７ａは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する保存配列とＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）のＩｇＧ生産上の効果を測定した結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０（又はｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）エピトープに相応するインフルエンザＡウイルス亜型（Ｈ７及びＨ９；それぞれ表６及び表９）から見られる１７個のアミノ酸保存配列が合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド−特異的総ＩｇＧの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図7b】図７ｂは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する保存配列とＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）のＩｇＧ生産上の効果を測定した結果である。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ストレインのｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０（又はｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）エピトープに相応するインフルエンザＡウイルス亜型（Ｈ７及びＨ９；それぞれ表６及び表９）から見られる１７個のアミノ酸保存配列が合成された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１比率）複合体に共同で被包された各ペプチド（５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（本願発明では、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ペプチドと表されている）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化した。最終免疫化させて、１０日後採取された抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）において、抗−各ペプチド−特異的総ＩｇＧの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。

【図8a】図８ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与を通じて生産された抗血清によるＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質及びＨ１Ｎ１ ＨＡ蛋白質の特異的認知を示す凝集抑制分析及びウイルス中和分析を示す結果である。また、図８ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体により生産された各抗血清が組み換えＨ５Ｎ１ウイルス（ｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）及びＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスにより誘導された鶏赤血球の凝集反応を抑制することを示す結果である。

【図8b】図８ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与を通じて生産された抗血清によるＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質及びＨ１Ｎ１ ＨＡ蛋白質の特異的認知を示す凝集抑制分析及びウイルス中和分析を示す結果である。また、図８ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体により生産された各抗血清がｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスによるＭＤＣＫ細胞の感染を抑制することを示す結果である。

【図8c】図８ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与を通じて生産された抗血清によるＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質及びＨ１Ｎ１ ＨＡ蛋白質の特異的認知を示す凝集抑制分析及びウイルス中和分析を示す結果である。また、図８ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体により生産された各抗血清がｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスによるＭＤＣＫ細胞の感染を抑制することを示す結果である。

【図8d】図８ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与を通じて生産された抗血清によるＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質及びＨ１Ｎ１ ＨＡ蛋白質の特異的認知を示す凝集抑制分析及びウイルス中和分析を示す結果である。また、図８ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体により生産された各抗血清がｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスによるＭＤＣＫ細胞の感染を抑制することを示す結果である。

【図8e】図８ｅは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与を通じて生産された抗血清によるＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質及びＨ１Ｎ１ ＨＡ蛋白質の特異的認知を示す凝集抑制分析及びウイルス中和分析を示す結果である。また、図８ｅは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体により生産された各抗血清がｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスによるＭＤＣＫ細胞の感染を抑制することを示す結果である。

【図8f】図８ｆは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与を通じて生産された抗血清によるＨ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質及びＨ１Ｎ１ ＨＡ蛋白質の特異的認知を示す凝集抑制分析及びウイルス中和分析を示す結果である。図８ｆは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体により生産された各抗血清がｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスによるＭＤＣＫ細胞の感染を抑制することを示す結果である。

【図9a】図９ａは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効果を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫化させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）を鼻腔（ｎａｓａｌ）投与した。図９ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスは、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも生存したことを示す結果である。

【図9b】図９ｂは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効果を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫化させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）を鼻腔（ｎａｓａｌ）投与した。図９ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも体重が回復されることを示す結果である。

【図9c】図９ｃは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効果を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫化させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）を鼻腔（ｎａｓａｌ）投与した。図９ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔投与にも肺組織が正常であることを示す染色写真である。

【図9d】図９ｄは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効果を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫化させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）を鼻腔（ｎａｓａｌ）投与した。図９ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与して３日後又は６日後に肺組織からウイルスが減少されたことを示す結果である。

【図10a】図１０ａは、Ａ／ＷＳＮ／１９３３ Ｈ１Ｎ１ウイルス（ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス）で適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１０ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスは、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した後にも生存したことを示す結果である。

【図10b】図１０ｂは、Ａ／ＷＳＮ／１９３３ Ｈ１Ｎ１ウイルス（ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス）で適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１０ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した後にも体重が回復されることを示す結果である。

【図10c】図１０ｃは、Ａ／ＷＳＮ／１９３３ Ｈ１Ｎ１ウイルス（ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス）で適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１０ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスの鼻腔投与にも肺組織が正常であることを示す染色写真である。

【図10d】図１０ｄは、Ａ／ＷＳＮ／１９３３ Ｈ１Ｎ１ウイルス（ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス）で適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１０ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与して３日後又は６日後に肺組織からウイルスが減少されたことを示す結果である。

【図11a】図１１ａは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効果を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）を鼻腔投与した。図１１ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスは、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも生存したことを示す結果である。

【図11b】図１１ｂは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効果を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）を鼻腔投与した。図１１ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも体重が回復されることを示す結果である。

【図11c】図１１ｃは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効果を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）を鼻腔投与した。図１１ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔投与にも肺組織が正常であることを示す染色写真である。

【図12a】図１２ａは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスで適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１２ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスは、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した後にも生存したことを示す結果である。

【図12b】図１２ｂは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスで適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１２ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した後にも体重が回復されることを示す結果である。

【図13a】図１３ａは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又はｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）で感染されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏを鼻腔投与した。図１３ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスは、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも生存したことを示す結果である。

【図13b】図１３ｂは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又はｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）で感染されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏを鼻腔投与した。図１３ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも体重が回復されることを示す結果である。

【図13c】図１３ｃは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又はｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）で感染されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏを鼻腔投与した。図１３ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔投与にも肺組織が正常であることを示す染色写真である。

【図14a】図１４ａは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスで適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１４ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスは、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した後にも生存したことを示す結果である。

【図14b】図１４ｂは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスで適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１４ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した後にも体重が回復されることを示す結果である。

【図14c】図１４ｃは、ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスで適応されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔投与した。図１４ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（（ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔投与にも肺組織が正常であることを示す染色写真である。

【図15a】図１５ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体−投与されたマウスにおいて、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）の鼻腔投与後に採取された抗血清により凝集抑制程度を測定した結果である。

【図15b】図１５ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体−投与されたマウスにおいて、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスの鼻腔投与後に採取された抗血清により凝集抑制程度を測定した結果である。

【図16a】図１６ａは、各エピトープのＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産上の影響を示す結果である。マウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を投与して免疫化させて１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）（図１５ａ）及び１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス（図１５ｂ）を鼻腔投与した後、採取された血清及びＢＡＬＦ（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）でＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産が顕著に増加したことを示す結果である。

【図16b】図１６ｂは、各エピトープのＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産上の影響を示す結果である。マウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を投与して免疫化させて１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）（図１５ａ）及び１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス（図１５ｂ）を鼻腔投与した後、採取された血清及びＢＡＬＦ（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）でＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産が顕著に増加したことを示す結果である。

【図16c】図１６ｃは、各エピトープのＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産上の影響を示す結果である。マウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を投与して免疫化させて１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）（図１５ａ）及び１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス（図１５ｂ）を鼻腔投与した後、採取された血清及びＢＡＬＦ（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）でＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産が顕著に増加したことを示す結果である。

【図16d】図１６ｄは、各エピトープのＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産上の影響を示す結果である。マウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を投与して免疫化させて１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）（図１５ａ）及び１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス（図１５ｂ）を鼻腔投与した後、採取された血清及びＢＡＬＦ（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）でＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産が顕著に増加したことを示す結果である。

【図16e】図１６ｅは、各エピトープのＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産上の影響を示す結果である。マウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を投与して免疫化させて１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）（図１５ａ）及び１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス（図１５ｂ）を鼻腔投与した後、採取された血清及びＢＡＬＦ（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）でＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産が顕著に増加したことを示す結果である。

【図16f】図１６ｆは、各エピトープのＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産上の影響を示す結果である。マウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を投与して免疫化させて１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）（図１５ａ）及び１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルス（図１５ｂ）を鼻腔投与した後、採取された血清及びＢＡＬＦ（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）でＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の生産が顕著に増加したことを示す結果である。

【図17a】図１７ａは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを二ヶ月目に鼻腔投与した。図１７ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスは、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも生存したことを示す結果である。

【図17b】図１７ｂは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを二ヶ月目に鼻腔投与した。図１７ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与した後にも体重が回復されることを示す結果である。

【図17c】図１７ｃは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを二ヶ月目に鼻腔投与した。図１７ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔投与にも肺組織が正常であることを示す染色写真である。

【図17d】図１７ｄは、ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染されたマウスにＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体投与によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で２回にわたって腹腔投与して免疫させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを二ヶ月目に鼻腔投与した。図１７ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム複合体を投与したマウスが１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔投与して３日後又は６日後に肺組織からウイルスが減少されたことを示す結果である。

【図18a】図１８ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−エピトープ−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を利用したエピトープ−特異的抗体生産が、ウイルスを利用した生産より更に効果的であることを示す結果である。図１８ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ＵＶ−不活性化させたｒＨ５Ｎ１ウイルス−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）−不活性化されたＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）で１０日間隔で３回にわたって腹腔投与されたマウスにおいて、ウイルスに結合する総ＩｇＧ及びＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産量が増加したことを示す結果である。

【図18b】図１８ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−エピトープ−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を利用したエピトープ−特異的抗体生産が、ウイルスを利用した生産より更に効果的であることを示す結果である。図１８ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ＵＶ−不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルス−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体で１０日間隔で３回にわたって腹腔投与されたマウスにおいて、総ＩｇＧの力価が増加したことを示す結果である。

【図18c】図１８ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−エピトープ−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を利用したエピトープ−特異的抗体生産が、ウイルスを利用した生産より更に効果的であることを示す結果である。図１８ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−エピトープ（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を利用してワクチン化された血清において、各ペプチドに結合する総ＩｇＧの力価が増加したことを示す結果である。

【図18d】図１８ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−エピトープ−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を利用したエピトープ−特異的抗体生産が、ウイルスを利用した生産より更に効果的であることを示す結果である。図１８ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−エピトープ（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を利用してワクチン化された血清において、各ペプチドに結合する総ＩｇＧの力価が増加したことを示す結果である。

【図19a】図１９ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別した候補エピトープ３種（表１０）において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）−Ｅ１蛋白質の３個の候補エピトープからエピトープ選別を示す結果である。前記選択された３個の候補エピトープ（ＨＣＶ−Ｅ１ ５７、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２、ＨＣＶ−Ｅ１ ２６９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清からＨＣＶ−Ｅ１ ５７ペプチド−特異的総ＩｇＧの生産が増加した。また、総ＩｇＧの量は、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２ペプチドでワクチン化されたマウス血清で増加した。

【図19b】図１９ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別した候補エピトープ３種（表１０）において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）−Ｅ１蛋白質の３個の候補エピトープからエピトープ選別を示す結果である。前記選択された３個の候補エピトープ（ＨＣＶ−Ｅ１ ５７、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２、ＨＣＶ−Ｅ１ ２６９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。Ｔｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの量は、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２ペプチドでワクチン化されたマウス血清で増加した。

【図19c】図１９ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別した候補エピトープ３種（表１０）において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）−Ｅ１蛋白質の３個の候補エピトープからエピトープ選別を示す結果である。前記選択された３個の候補エピトープ（ＨＣＶ−Ｅ１ ５７、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２、ＨＣＶ−Ｅ１ ２６９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。Ｔｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの力価は、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２ペプチドでワクチン化されたマウス血清で増加した。

【図19d】図１９ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別した候補エピトープ３種（表１０）において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）−Ｅ１蛋白質の３個の候補エピトープからエピトープ選別を示す結果である。前記選択された３個の候補エピトープ（ＨＣＶ−Ｅ１ ５７、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２、ＨＣＶ−Ｅ１ ２６９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。更に、本発明者らは、ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）とペプチド（ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２）を多様なリポソームを利用してそれぞれ複合体を製造し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価は、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳの比率が１：１である場合に最も高く表れた。

【図20a】図２０ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したＨＲＳＶ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） Ｇ及びＦ蛋白質において３個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された３個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清からＨＳＲＶ−Ｇ１ペプチド−特異的総ＩｇＧの生産が増加した。

【図20b】図２０ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したＨＲＳＶ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） Ｇ及びＦ蛋白質において３個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された３個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清からＨＳＲＶ−Ｇ１ペプチド−特異的ＩｇＧ２ａの生産が増加した。また、Ｔｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産がＨＳＲＶ−Ｇ１ペプチドでワクチン化されたマウス血清で増加した。

【図20c】図２０ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したＨＲＳＶ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） Ｇ及びＦ蛋白質において３個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された３個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。また、ＨＳＲＶ−Ｇ１ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価及びＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産がＨＳＲＶ−Ｇ１ペプチドでワクチン化されたマウス血清で増加した。

【図21a】図２１ａは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したＨＲＳＶ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） Ｆ蛋白質において１７個の候補エピトープ（表１１及び表１２）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された１７個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回又は４回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、４個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ、ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ−２、ＨＳＲＶ−Ｆ７及びＨＳＲＶ−Ｆ９）に特異的に結合する総ＩｇＧの生産が増加した。

【図21b】図２１ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したＨＲＳＶ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） Ｆ蛋白質において１７個の候補エピトープ（表１１及び表１２）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された１７個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回又は４回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、４個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ、ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ−２、ＨＳＲＶ−Ｆ７及びＨＳＲＶ−Ｆ９）に特異的に結合する総ＩｇＧ及びＩｇＧ２ａの生産が増加した。

【図21c】図２１ｃは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したＨＲＳＶ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） Ｆ蛋白質において１７個の候補エピトープ（表１１及び表１２）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された１７個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回又は４回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、４個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ、ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ−２、ＨＳＲＶ−Ｆ７及びＨＳＲＶ−Ｆ９）に特異的に結合する総ＩｇＧ及びＩｇＧ２ａの生産が増加した。

【図21d】図２１ａ〜２１ｄは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したＨＲＳＶ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） Ｆ蛋白質において１７個の候補エピトープ（表１１及び表１２）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された１７個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回又は４回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、４個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ、ＨＳＲＶ−Ｆ３ａ−２、ＨＳＲＶ−Ｆ７及びＨＳＲＶ−Ｆ９）に特異的に結合する総ＩｇＧ及びＩｇＧ２ａの生産が増加した。

【図22a】図２２は、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したヒトインテグリンβ４（殆どの癌腫細胞で発現される）において６個の候補エピトープ（表１３）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された６個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに４回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、４個の候補エピトープ（ｈＩＢ４−ＶＷＡ−１−２、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−１−３、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−２、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−３、及びｈＩＢ４−ＥＧＦ−１）に特異的に結合する総ＩｇＧの量が増加した。

【図22b】図２２ｂは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ペプチド−リポソーム複合体を基にしたワクチンを開発するために、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して選別したヒトインテグリンβ４（殆どの癌腫細胞で発現される）において６個の候補エピトープ（表１３）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された６個の候補エピトープ（ＨＳＲＶ−Ｇ１、ＨＳＲＶ−Ｇ１５０、ＨＳＲＶ−Ｆ９９）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに４回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、４個の候補エピトープ（ｈＩＢ４−ＶＷＡ−１−２、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−１−３、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−２、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−３、及びｈＩＢ４−ＥＧＦ−１）に特異的に結合する総ＩｇＧの力価が増加した。

【図23a】図２３ａは、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して肝癌に特異的に発現されると知られたｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質において６個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された６個の候補エピトープ（ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ１、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−１、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−２、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−４、及びｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−５）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−及びｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−５ペプチド−特異的総ＩｇＧの生産が増加した。

【図23b】図２３ｂは、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して肝癌に特異的に発現されると知られたｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質において６個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。前記選択された６個の候補エピトープ（ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ１、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−１、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−２、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−４、及びｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−５）のそれぞれをＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム複合体に製造して、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−及びｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−５ペプチド−特異的ＩｇＧ２ａの生産が増加した。また、総ＩｇＧの力価及びＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産が、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチドでワクチン化されたマウス血清で増加した。

【図23c】図２３ｃは、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して肝癌に特異的に発現されると知られたｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質において６個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。本発明者らは、ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）とペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３）を多様なリポソームを利用してそれぞれ複合体を製造し、ＢＡＬＢ／ｃ マウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清において、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３−特異的総ＩｇＧの力価は、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳの比率が１：１である場合に最も高く表れた。

【図23d】図２３ｄは、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して肝癌に特異的に発現されると知られたｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質において６個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。本発明者らは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３−ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））、ＭＢ−ＯＤＮ４５３１ＧＣ（Ｏ）又はＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｓ）とリポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１））と複合体を製造してマウスに投与した後、血清を採取した。血清において、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価は、ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）で最も高く表れた。

【図23e】図２３ｅは、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して肝癌に特異的に発現されると知られたｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質において６個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。本発明者らは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を製造し、ＴＬＲ９ノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。前記ＴＬＲ９ノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価は測定されなかったが、これは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体による抗体生産がＴＬＲ９に依存的であることを意味する。

【図23f】図２３ｆは、疎水性、親水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して肝癌に特異的に発現されると知られたｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質において６個の候補エピトープ（表１０）からエピトープ選別を示す結果である。本発明者らは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体を製造し、ＴＬＲ９ノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。前記ＴＬＲ９ノックアウトＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価は測定されなかったが、これは、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体による抗体生産がＴＬＲ９に依存的であることを意味する。

【図24a】図２４ａは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたエピトープとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産上にＭＨＣクラスＩＩ−媒介の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）及びＴｈ１分化の効果を分析した結果である。図２４ａは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチドとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）に対する反応で、ＩｇＧ生産の動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す結果である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチドとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）を、３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与した。血清は、免疫化時期に対して相対的な一日前に腹腔から４回にわたって採取されて、ペプチド−特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＭの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。上述の実験は、２回又は３回にわたって行われ、類似した結果を示した。

【図24b】図２４ｂは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたエピトープとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産上にＭＨＣクラスＩＩ−媒介の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）及びＴｈ１分化の効果を分析した結果である。図２４ｂは、ＣＤ４^＋細胞の一時的欠乏が、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチドとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）を利用した免疫化によるＩｇＧ生産を抑制することを示す結果である。上述の実験は、２回又は３回にわたって行われ、類似した結果を示した。

【図24c】図２４ｃは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたエピトープとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産上にＭＨＣクラスＩＩ−媒介の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）及びＴｈ１分化の効果を分析した結果である。マウス当たりＧＫ１．５（抗−ＣＤ４抗体）１００μｇが、免疫化時期に対して相対的に三日又は一日前、そして一日又は三日後に腹腔から４回にわたって投与された。０日目（投与）に、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチドとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３で表現される）が３匹のマウスに１０日間隔で３回にわたって投与された。前記マウスから血清が採取されて、ペプチド−特異的総ＩｇＧの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。正常ＩｇＧが対照群として利用された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたＨＣＶＥ２−２０２ペプチドとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産において、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩＩ−制限されたＴ細胞活性化が必要である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたＨＣＶＥ２−２０２ペプチド（５０μｇ）とＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ＨＣＶＥ２−２０２で表現される）がＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＨＣクラスノックアウトマウス（ＭＨＣ−ＩＩ ＫＯ）（ｎ＝３）に１０日間隔で３回にわたって腹腔投与された。上述の実験は、２回又は３回にわたって行われ、類似した結果を示した。

【図24d】図２４ｄは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたエピトープとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産上にＭＨＣクラスＩＩ−媒介の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）及びＴｈ１分化の効果を分析した結果である。マウス当たりＧＫ１．５（抗−ＣＤ４抗体）１００μｇが、免疫化時期に対して相対的に三日又は一日前、そして一日又は三日後に腹腔から４回にわたって投与された。０日目（投与）に、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチドとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３で表現される）が３匹のマウスに１０日間隔で３回にわたって投与された。前記マウスから血清が採取されて、ペプチド−特異的総ＩｇＧの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。正常ＩｇＧが対照群として利用された。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたＨＣＶＥ２−２０２ペプチドとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産において、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩＩ−制限されたＴ細胞活性化が必要である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたＨＣＶＥ２−２０２ペプチド（５０μｇ）とＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ＨＣＶＥ２−２０２で表現される）がＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｃ５７ＢＬ／６ ＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウス（ＯＴ−ＩＩ ＴＧ）（ｎ＝３）に１０日間隔で３回にわたって腹腔投与された。上述の実験は、２回又は３回にわたって行われ、類似した結果を示した。

【図24e】図２４ｅは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたエピトープとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産上にＭＨＣクラスＩＩ−媒介の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）及びＴｈ１分化の効果を分析した結果である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド（５０μｇ）とＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）免疫化によるＩｇＧ生産において、ＳＴＡＴ６ではなくＳＴＡＴ４が必要である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド（５０μｇ）とＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３で表現される）がＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｃ５７ＢＬ／６ ＳＴＡＴ４ノックアウトマウス（ＳＴＡＴ４ ＫＯ；図２３ｅ）（ｎ＝３）に１０日間隔で３回にわたって腹腔投与された。前記マウスから血清が採取されて、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。上述の実験は、２回又は３回にわたって行われ、類似した結果を示した。

【図24f】図２４ｆは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたエピトープとＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化によるＩｇＧ生産上にＭＨＣクラスＩＩ−媒介の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）及びＴｈ１分化の効果を分析した結果である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド（５０μｇ）とＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）免疫化によるＩｇＧ生産において、ＳＴＡＴ６ではなくＳＴＡＴ４が必要である。ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド（５０μｇ）とＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３で表現される）がＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｃ５７ＢＬ／６ ＳＴＡＴ６ノックアウトマウス（ＳＴＡＴ６ＫＯ）（ｎ＝３）に１０日間隔で３回にわたって腹腔投与された。前記マウスから血清が採取されて、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの量がＥＬＩＳＡを利用してアッセイされた。上述の実験は、２回又は３回にわたって行われ、類似した結果を示した。

【図25a】図２５ａは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体が肝癌細胞のＴＭ４ＳＦ５蛋白質を認識して、肝癌細胞（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）の機能を調節することを示す結果である。ＴＭ４ＳＦ５の発現がＲＴ−ＰＣＲを通じてＨｕｈ−７及びＳＮＵ−７６１細胞で観察された。

【図25b】図２５ｂは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体が肝癌細胞のＴＭ４ＳＦ５蛋白質を認識して、肝癌細胞（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）の機能を調節することを示す結果である。ＴＭ４ＳＦ５の発現がＲＴ−ＰＣＲを通じてＨｕｈ−７及びＳＮＵ−７６１細胞で観察された。

【図25c】図２５ｃは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体が肝癌細胞のＴＭ４ＳＦ５蛋白質を認識して、肝癌細胞（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）の機能を調節することを示す結果である。ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的単一クローン抗体がＨｕｈ−７及びＳＮＵ−７６１細胞内ＴＭ４ＳＦ５を認識することができるということをＦＡＣＳで確認した。

【図25d】図２５ｄは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体が肝癌細胞のＴＭ４ＳＦ５蛋白質を認識して、肝癌細胞（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）の機能を調節することを示す結果である。図２５ｄは、肝癌細胞にｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的単一クローン抗体を処理した場合、ＴＭ４ＳＦ５を発現するＨｕｈ−７（肝癌細胞）の成長が抑制されることを、ＭＴＴアッセイを通じて確認した結果である。

【図25e】図２５ｅは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体が肝癌細胞のＴＭ４ＳＦ５蛋白質を認識して、肝癌細胞（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）の機能を調節することを示す結果である。図２５ｅは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド特異的単一クローン抗体処理により、Ｈｕｈ−７細胞のＳ−期が減少することを示す結果である。

【図25f】図２５ｆは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体が肝癌細胞のＴＭ４ＳＦ５蛋白質を認識して、肝癌細胞（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）の機能を調節することを示す結果である。図２５ｆは、ＴＭ４ＳＦ５を発現する肝癌細胞（Ｈｕｈ−７）にｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド特異的単一クローン抗体を処理した場合、アクチンの形が、ＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞から見られるように、広く広げられた多角形形態（ｏｖｅｒｓｐｒｅａｄ ｐｏｌｙｇｏｎａｌ ｓｈａｐｅ）を支持するストレス線維の明確な輪郭（ｏｕｔｌｉｎｅ）を表すことを示す結果である。非正常的なアクチンの束化は、ｈＴＭ４ＳＦ５を発現する肝癌細胞から観察されると知られている反面、広く広げられた多角形形態を支持する明らかな輪郭のストレス線維が、ｈＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞からアクチン染色により検出される。抗−ｈＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３抗体を処理したｈＴＭ４ＳＦ５−発現細胞（Ｈｕｈ−７）は、ｈＴＭ４ＳＦ５（ＳＮＵ−７３９）を発現しない細胞のアクチン形態と類似した明らかな輪郭のストレス線維を強く誘導した。上述の結果は、前記抗体がｈＴＭ４ＳＦ５−発現細胞でターゲッティングされることを意味する。

【図26a】図２６ａは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体がヒト肝癌細胞の成長をインビボで抑制することを示す結果である。異種移植を通じて、Ｈｕｈ−７細胞を有する胸腺のないヌードマウスに１０ｍｇ／Ｋｇ ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体を７日目に３日間隔で５回にわたって処理した後、腫瘍移植を行った。

【図26b】図２６ｂは、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体がヒト肝癌細胞の成長をインビボで抑制することを示す結果である。異種移植を通じて、Ｈｕｈ−７細胞を有する胸腺のないヌードマウスに１０ｍｇ／Ｋｇ ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体を７日目に３日間隔で５回にわたって処理した後、腫瘍移植を行った。腫瘍の大きさが±２，０００ｍｍ^３に達した時、前記マウスを犠牲させて、腫瘍の重量を測定した。

【図27a】図２７ａは、ＢＮＬ−ＨＣＣ細胞で感染された同種移植肝癌細胞モデルにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化させた後、５０質量％マトリゲルを含むＢＮＬ−ＨＣＣ細胞（５×１０^６）を背中部位の右側脇（ｄｏｒｓａｌ ｒｉｇｈｔ ｆｌａｎｋ）に皮下に接種した。前記マウスを、腫瘍細胞の移植後７週目に犠牲させて、腫瘍の重量を測定した。

【図27b】図２７ｂは、ＢＮＬ−ＨＣＣ細胞で感染された同種移植肝癌細胞モデルにおいて、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体によるワクチン化予防効能を示す結果である。ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−リポソーム複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与して免疫化させた後、５０質量％マトリゲルを含むＢＮＬ−ＨＣＣ細胞（５×１０^６）を背中部位の右側脇（ｄｏｒｓａｌ ｒｉｇｈｔ ｆｌａｎｋ）に皮下に接種した。前記マウスを、腫瘍細胞の移植後７週目に犠牲させて、腫瘍の重量を測定した。

【発明を実施するための形態】

【0071】

以下、実施例を通じて本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

【実施例】

【0072】

実施例１：オリゴジオキシヌクレオチド及び試薬
オリゴジオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）は、Ｓａｍｃｈｕｌｌｙ Ｐｈａｒｍ（Ｓｅｏｕｌ， Ｋｏｒｅａ）で合成した。ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１は、三つのＣｐＧモチーフ（下線で表示）を含む２０塩基からなっている： ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＧＣＣＴ。本発明で使用されたＭＢ−ＯＤＮ ４５３１配列は、ホスホジエステルバックボーン（Ｏ）であっても、ホスホロチオエート−変形されたバックボーン（Ｓ）であってもよい。ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）のホスホロチオエート形態は、ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ）である。ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１ＧＣは、ＣＧ配列の一つがＧＣ配列に順番が逆転された（下線で表示）ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１の誘導体である： ＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＴＧＴＣＧＧＣＣＴ。蛍光物質又はビオチンタグ（ｔａｇｓ）は、各ＯＤＮの３’−末端にコンジュゲーションされた。ＯＤＮｓのエンドトキシンの含量は、リムルス・アメボサイト（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ）アッセイ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）により測定された通り、ＯＤＮ １ｍｇ当たり１ｎｇ以下である。

【0073】

〔表１〕
合成ＯＤＮ誘導体

ＣＧジヌクレオチド配列のＧＣ又はＣＴ配列への変化は、下線の太字で表示される。ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ）ＣＳは、ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１に相補的な配列である。変形：無し、ホスホジエステルバックボーン連結；及びＳ、ホスホロチオエートバックボーン変形。

【0074】

実施例２：候補エピトープの選別及びペプチド合成
エピトープスクリーニングのためのペプチド配列は、親水性、疎水性、２次構造、抗原性指標（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）及び両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃｉｔｙ）に基づいて選別した。エピトープ−基盤のペプチドの効果を確認するために、本発明者らは、種々のインフルエンザＡストレインのＨＡ蛋白質（表２、３、４、５、６、７、８及び９）、肝癌のｈＴＭ４ＳＦ５（ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ５）蛋白質、ＨＣＶの外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白質、ＲＳＶの付着（Ｇ）糖蛋白質（Ｇ（ｈＲＳＶ−Ｇ））（表１０）、ＲＳＶの融合蛋白質Ｆ（ＨＲＳＶ−Ｆ）（表１１及び表１２）及びヒトインテグリンβ４（ｈＩＢ４）（表１３）から１４個又は１７個のアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。インフルエンザＡウイルスＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較に基づいてナンバリングされる。ペプチドは、自動ペプチド合成機（Ｐｅｐｔｒｏｎ ＩＩＩ−Ｒ２４， Ｐｅｐｔｒｏｎ， Ｄａｅｊｅｏｎ， Ｋｏｒｅａ）を利用して、Ｆｍｏｃ固体−相（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ）方法で合成した。合成されたペプチドからレジン保護膜を除去した後、ペプチドを９０％以上の純度で精製して、Ｖｙｄａｃ Ｃ８分析ＲＰカラムを利用した逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ） ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ， ＳＨＩＭＡＤＺＵ Ｃｏｒｐ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）で分析した。前記合成されたペプチドは、質量分析機（ＨＰ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ／ＭＳＤ， Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｒｏｓｅｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ）を利用して同定した。

【0075】

〔表２〕
Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ ｈＨ５Ｎ１のＨＡ蛋白質の候補エピトープ

【0076】

本発明のエピトープスクリーニング方法に利用されるペプチド配列は、親水性、疎水性、２次構造、抗原性指標及び両親媒性に基づいてＡ／ベトナム／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質（ＮＣＢＩデータベース、ＡＡＷ８０７１７）から選択された（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｐｏｅ．ｏｒｇ／ｍａｉｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１ ＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較に基づいてナンバリングされる。

【0077】

〔表３〕
インフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１ストレイン及びＨ１Ｎ１ストレイン内ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する配列の保存性

インフルエンザＡウイルスＨＡ蛋白質のアミノ酸配列は、ヒトＨ３配列（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）との配列比較に基づいてナンバリングされる。

【0078】

〔表４〕
豚−起源インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ストレイン内ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する配列の保存性

（分離ナンバー）^*は、現在まで分離された豚−起源インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウイルス１，７５０個のストレインのうち、特異配列を含むストレインナンバーを示す。

【0079】

〔表５〕
Ａ／ベトナム／１２０３／２００４から得られたｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープと他のＨ５Ｎ１ストレインから得られた相応する配列間の配列比較（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）

（分離ナンバー）^*は、現在まで分離されたヒトＨ５Ｎ１ウイルス２７９個のストレインのうち、特異配列を含むストレインナンバーを示す。

【0080】

〔表６〕
インフルエンザＡウイルス亜型内Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する配列の保存性

【0081】

〔表７−１〕
現在まで報告されたＨ１Ｎ１ストレイン内Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する配列の保存性

（分離ナンバー）^*は、現在まで分離されたヒトＨ１Ｎ１ウイルス２，２０９個のストレインのうち、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する特異配列を含むストレインナンバーを示す。
〔表７−２〕
現在まで報告されたＨ１Ｎ１ストレイン内Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する配列の保存性

（分離ナンバー）^*は、現在まで分離されたヒトＨ１Ｎ１ウイルス２，２０９個のストレインのうち、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する特異配列を含むストレインナンバーを示す。

【0082】

〔表８〕
現在まで報告された豚−起源インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ストレイン内Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する配列の保存性

（分離ナンバー）^*は、現在まで分離された豚−起源インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウイルス１，７５１個のストレインのうち、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３エピトープに相応する特異配列を含むストレインナンバーを示す。

【0083】

〔表９〕
現在まで報告されたインフルエンザＡウイルス亜型内Ａ／Ｈ１Ｎ１ ＨＡ３７０エピトープに相応する配列の保存性

【0084】

〔表１０〕
ヒト肝癌のｈＴＭ４ＳＦ５、ＨＣＶの外皮蛋白質（Ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＨＣＶ−Ｅ）、そしてヒトＲＳＶの付着糖蛋白質Ｇ（ｈＲＳＶ−Ｇ）及び融合蛋白質（ＨＲＳＶ−Ｆ）の候補エピトープ

【0085】

〔表１１〕
ｈＲＳＶ Ａ長いストレインＦ蛋白質（ｈＲＳＶ Ａ ｓｔｒａｉｎ ｌｏｎｇ Ｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）の候補エピトープ

エピトープスクリーニングのためのペプチド配列が、親水性、疎水性、２次構造、抗原性指標及び両親媒性に基づいてｈＲＳＶ Ａ長いストレインＦ蛋白質から選択された。

【0086】

〔表１２〕
ｈＲＳＶ Ａ長いストレイン内候補エピトープの配列変異性

【0087】

〔表１３〕
ヒトインテグリンβ４（ｈＩＢ４）の候補エピトープ

【0088】

実施例３： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド（又は蛋白質）−リポソーム複合体の製造
本発明で利用されたリポソームは、下記のようである：ＣＨＥＭＳ、Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ及びＤＳＰＣは、Ｓｉｇｍａから購入した。ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＰＥＧ−ＰＥは、Ａｖａｎｔｉ−Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ， ＡＬ， ＵＳＡ）から購入した。ＣｐＧ−ＤＮＡ及び蛋白質（又はペプチド）は、製造者の説明書にしたがって、ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ＵＳＡ）、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）又はリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）と複合体として製造された。ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＣ／ＣＨＥＭＳ／ＰＥＧ−ＰＥ、Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＰＥＧ−ＰＥ又はＤｃ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＰＥＧ−ＰＥに共同で被包されたＣｐＧ−ＤＮＡ及び蛋白質（又はペプチド）から構成されたリポソーム複合体は、以前報告された方法にしたがって製造されて（Ｓｉｍｏｅｓ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５６： ９４７−９６５ （２００４）．及びＧｕｒｓｅｌ， Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７： ３３２４−３３２８ （２００１）．参照）変形された。簡略に説明すると、ＤＯＰＥ及びＣＨＥＭＳを１：１のモル比率で混合し、混合物を窒素ガスと共に蒸発させて、無溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｆｒｅｅ）脂質フィルムを作った。その後、エタノール（最終濃度１０％）で混合し、同一な容量の水溶性ＣｐＧ−ＤＮＡ及び蛋白質（又はペプチド）混合物に再混濁して、３０分間常温で強く掻き混ぜた。ｐＨを７．０の調整した後、前記リポプレックス溶液を超音波分解機で３０秒間弱く超音波分解させた。その後、０．２２μｍフィルターでろ過し、液体窒素で冷凍−解凍（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗｅｄ）を３回繰り返した（Ｓｉｍｏｅｓ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５６： ９４７−９６５ （２００４）．及びＧｕｒｓｅｌ， Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７： ３３２４−３３２８ （２００１）．参照）。

【0089】

実施例４：ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド（又は蛋白質）−リポソーム複合体による体液性免疫反応の誘導
<４−１>免疫化（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）
マウスは、特定病原菌のない条件で飼育した。４週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈ−２^ｂ）をＣｅｎｔｒａｌ Ｌａｂ． Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ， Ｋｏｒｅａ）から購入した。本発明者らの動物実験は、ハンリム大学校動物実験委員会の承認を受けた。

【0090】

４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスにＨＥＬ（ｈｅｎ ｅｇｇ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）（５０μｇ／マウス）とＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）（５０μｇ／マウス）混合物又はＨＥＬ−ＭＢ−ＯＤＮ４５３１−リポソーム複合体を１０日間隔で３回にわたって腹腔内投与した。１０日経過後、心臓パンチング（ｈｅａｒｔ ｐｕｎｃｈｉｎｇ）方法で血液を採取して、遠心分離し、血球細胞を沈殿させて血清を獲得した。獲得した血清から抗−ＨＥＬ抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価をＥＬＩＳＡで確認した。

【0091】

<４−２> ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから血清を獲得して−７０℃に保管した。ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価を測定するために、本発明者らは、ＨＥＬ（１０μｇ／ｍｌ）で９６−ウェル免疫プレート（ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ； Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をコーティングした後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで前記プレートをブロッキングした。前記血清を各プレートの上側列に添加した後、前記血清とＰＢＳＴを１：３で混合して連続的に希釈した血清希釈液を下の列に添加した。本発明者らは、常温で４時間プレートで反応し、ＰＢＳＴで洗浄した。次に、本発明者らは、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションされたヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体、抗−マウスＩｇＧ１抗体又は抗−マウスＩｇＧ２ａ抗体を添加して、２時間プレートで反応した。本発明者らは、１−Ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）を利用して発色アッセイ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）を行って、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎマイクロプレート判読機（ＧＭＩ Ｉｎｃ．， Ｒａｍｓｅｙ， ＭＩ， ＵＳＡ）を利用して４０５ｎｍで吸光度を測定した（Ｃｈｕ， Ｒ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： １６２３−１６３１ （１９９７）．参照）。

【0092】

ＨＥＬ−ＭＢ−ＯＤＮ４５３１及びリポソーム複合体を腹腔内に注射して免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスの体液性免疫反応を調べた。ＨＥＬ単独又はＨＥＬ−ＭＢ−ＯＤＮ４５３１混合物、ＨＥＬ−リポソーム複合体を注射する場合に比べて、ＨＥＬ−ＭＢ−ＯＤＮ４５３１−リポソーム複合体を注射した時、ＨＥＬに対する抗体の量が著しく増加したが、これは、体液性免疫反応においてＭＢ−ＯＤＮ４５３１−リポソーム複合体の免疫補助剤効能を見せる結果である。不完全フロイントアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）は、６０年前から現在まで使用されている代表的な免疫補助剤である。しかし、前記免疫補助剤の問題は、細胞性免疫増強が起こらず、ヒトに使用できないという点である。ＭＢ−ＯＤＮ４５３１−リポソーム複合体は、免疫細胞刺激を通じて細胞性免疫反応を誘導するだけではなく、体液性免疫能を増加させる免疫補助剤としての機能を有する。また、ＭＢ−ＯＤＮ４５３１−リポソーム複合体は、Ｔｈ１免疫反応−特異的ＩｇＧ２ａの抗体生産に効果的である。

【0093】

<４−３>マウスと免疫化
マウスは、特定病原菌のない条件で飼育した。４週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈ−２^ｂ）をＣｅｎｔｒａｌ Ｌａｂ． Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ， Ｋｏｒｅａ）から購入した。本発明者らの動物実験は、ハンリム大学校動物実験委員会の承認を受けた。

【0094】

前記マウスにペプチド（５０μｇ／マウス）−ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ））−リポソーム複合体を１０日間隔で３回又は４回にわたって腹腔内投与した。

【0095】

<４−４>抗原−特異的Ｉｇ ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから得られた血清は、ＰＢＳ／０．２質量％アジ化ナトリウムと１：１０で混合して希釈した後、−２０℃に保管した。ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの総量を測定するために、本発明者らは、各ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）をコーティングした後、１質量％ＢＳＡ及び０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳＴで前記プレートをブロッキングした。前記血清とＰＢＳＴを１：４００で混合して希釈した後、前記血清希釈液を各プレートのウェルに添加した。

【0096】

総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを検出するために、本発明者らは、ビオチン−コンジュゲーションされたラット抗−マウスＩｇＧ抗体、ラット抗−マウスＩｇＧ１抗体及びラット抗−マウスＩｇＧ２ａ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ＳａｎＤｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を１：５，０００で希釈して使用した。

【0097】

ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの力価を測定するために、本発明者らは、各蛋白質又はペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）をコーティングした後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで前記プレートをブロッキングした。前記血清を各プレートの上側列に添加した後、前記血清とＰＢＳＴを１：３で混合して連続的に希釈した血清希釈液を下の列に添加した。本発明者らは、常温で２時間プレートで反応し、ＰＢＳＴで洗浄した。次に、本発明者らは、ビオチン−コンジュゲーションされたラット抗−マウスＩｇＧ抗体、ラット抗−マウスＩｇＧ１抗体又はラット抗−マウスＩｇＧ２ａ抗体を添加して、２時間プレートで反応した。３回洗浄後、本発明者らは、ストレプトアビジン−コンジュゲーションされたＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を各プレートに添加して１時間反応した。発色アッセイをＴＭＢ溶液（ＫＰＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を利用して行い、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ； Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ２５０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ， ＰＡ， ＵＳＡ）を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0098】

実施例５：ＣｐＧ−ＤＮＡ−Ｈ５Ｎ１（又は他のインフルエンザストレイン） ＨＡ蛋白質ペプチド−リポソーム複合体を利用したエピトープスクリーニング
<５−１> ＣｐＧ−ＤＮＡ−Ｈ５Ｎ１（又は他のインフルエンザストレイン） ＨＡペプチド−リポソーム複合体の免疫化
候補エピトープ（表２から表９）は、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して、多様なインフルエンザＡウイルスのＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）蛋白質から選別して、前記実施例３と同様にＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体を製造した。前記製造されたＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体（５０μｇ／マウス）をＢａｌｂ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与した。最後の投与後１０日経過時、心臓パンチング方法で血液を採取して、遠心分離し、血球を沈殿させて血清を獲得した。前記獲得した血清から抗−ペプチド抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価及び量をＥＬＩＳＡで測定した。

【0099】

<５−２> ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから得られた血清は、ＰＢＳ／０．２質量％アジ化ナトリウムと１：１０で混合して希釈した後、−２０℃に保管した。本発明者らは、各ペプチド（１０μｇ／ｍｌ；炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）を９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）に添加した後、１６時間４℃で反応した。その後、各ペプチドに特異的に結合する総ＩｇＧ（図２ａ、２ｄ、２ｅ、５ａ、５ｄ、６ａ、６ｄ及び７）、ＩｇＧ１（図２ｂ、２ｅ、５ｂ、６ｂ及び７）及びＩｇＧ２ａ（図２ｃ、２ｅ、５ｃ、６ｃ及び７）の量及び力価を実施例<４−４>に記載のように分析した。

【0100】

鳥インフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１／ベトナム／２００４ストレインのＨＡ蛋白質から得られたペプチドのうち、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ５８、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３３６及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチドが総ＩｇＧ（図２ａ及び図２ｄ）及びＩｇＧ２ａ（図２ｃ）の量及び力価を増加させた。ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチドに相応するＨ１Ｎ１ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＮＹ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＯＨ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ３７０、Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ３７０）及びＨ５Ｎ１ウイルスに存在するｈＨ５Ｎ１−ＨＫ ＨＡ３７０ペプチド（表３及び表４）が総ＩｇＧ（図５ａ及び図５ｄ）の量及び力価を増加させた。また、Ｔｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産が増加することを確認することができた（図５ｃ）。更に、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチドに相応するＨ５Ｎ１ウイルスストレインに存在するｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−１、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−２、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−４、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−６、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−７、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−９及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３−１１ペプチド（表５）、そしてｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチドに相応する多様なインフルエンザＡウイルスストレインに存在するｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−Ｔｈａｉ ＨＡ２３３、Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ２３３、ｍＨ２Ｎ５ ＨＡ２３３、ｈＨ７Ｎ７ ＨＡ２３３、ｈＨ９Ｎ２ ＨＡ２３３及びｓＨ１５Ｎ２ ＨＡ２３３ペプチド（表６）も総ＩｇＧの量を増加させた（図６ｄ）。

【0101】

また、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチドに相応するＨ７Ｎ７及びＨ９Ｎ２ウイルスに存在するｈＨ７Ｎ７ ＨＡ３７０、ｈＨ９Ｎ２−ＳＴ ＨＡ３７０及びｈＨ９Ｎ２−ＨＫ ＨＡ３７０ペプチド（表９）も総ＩｇＧの量を増加させた（図７ａ）。ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチドに相応するＨ７Ｎ７及びＨ９Ｎ２ウイルスに存在するｈＨ７Ｎ７ ＨＡ ２３３及びｈＨ９Ｎ２ ＨＡ２３３（表６）も総ＩｇＧの量を増加させた（図７ｂ）。

【0102】

実施例６：ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体による体液性免疫反応誘導でリポソーム種類及びＣｐＧ−ＤＮＡ種類による影響評価
ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）を多様な種類のリポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（６：４、１：１、１：０及び０：１）、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＡＰ及びポロキサマ４０７）で前記実施例３と同様にそれぞれ複合体を製造し、前記実施例<４−３>のようにＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド−特異的総ＩｇＧ（図３ａ）の量を測定した結果、前記血清においてＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳの比率が１：１で総ＩｇＧの量が最も高く表れた。また、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳの比率が１：１でＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価が最も高く表れた（図３ｂ）。

【0103】

ペプチド（Ｈ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１））と表１に提示された種々のＰＯ−ＤＮＡｓ、又はＰＳ−ＤＮＡｓで前記実施例３と同様にそれぞれ複合体を製造し、前記実施例<４−３>のようにＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。前記実施例<４−４>のように血清からＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド−特異的総ＩｇＧの量を確認した結果、ＰＯ−ＤＮＡ ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）とＰＳ−ＤＮＡ ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ）を利用した複合体で最も高く表れた（図４）。上述の結果から、ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体においてＰＯ−ＤＮＡ又はＰＳ−ＤＮＡのＣＧ配列が重要な役割を行うということが分かった。

【0104】

実施例７：ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体により生産された抗体の血球凝集反応抑制及びウイルス中和作用分析
<７−１>組み換えＨ５Ｎ１ウイルス
Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）及びＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスの遺伝子切片（ｓｅｇｍｅｎｔｓ）がウイルスレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）のためにプラスミドでクローニングされて８個のプラスミド逆方向遺伝学的（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）方法を利用して遺伝子再編成（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）された（Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ ２０： ３１６５−３１７０ （２００２）．参照）。前記プラスミド由来のウイルスが、１０日齢の胚芽鶏エッグの尿膜腔（ａｌｌａｎｔｏｉｃ ｃａｖｉｔｉｅｓ）に群集した。上述の再編成ウイルスは、“ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ”を含み、これは、鳥類系（ａｖｉａｎ−ｌｉｎｅａｇｅ） Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子切片及びＰＲ８内７個の遺伝子切片に相応する遺伝子切片を有する。

【0105】

<７−２>血球凝集反応抑制アッセイ
血球凝集反応−抑制アッセイは、公知の方法にしたがって行われた（Ｐａｌｍｅｒ， Ｄ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｓｅｒ． ６： ５１−５２ （１９７５）．参照）。簡略に説明すると、ウイルスを４ ＨＡユニットで希釈し、同一な容量の二倍希釈された受容体−破壊酵素（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）を処理した血清試料と共に常温で１時間培養した。同一な容量の０．５質量％鶏赤血球をウェルに添加して、３０分間培養し、ＨＩ力価を測定した。

【0106】

<７−２>ウイルス中和アッセイ
ＭＤＣＫ細胞に対して、ウイルス中和アッセイを公知の方法により行った（Ｋｉｄａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２２： ３８−４７ （１９８２）．参照）。約１００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍｌのインフルエンザウイルス（ｒＨ５Ｎ１ウイルス及びＡ／ＷＳＮ／１９３３）を同一容量の２倍順次希釈された熱−不活性化された血清試料と共に３７℃で１時間反応した。培養後、前記混合物を１０質量％ＦＢＳ及びＴＰＣＫ（Ｌ−ｔｏｓｙｌａｍｉｄｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ、１μｇ／ｍｌ）−処理されたトリプシンで補充された最小培地（ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ， ＭＥＭ）でＭＤＣＫ細胞のコンフルエント単一膜に添加した。前記細胞を細胞変性（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ）効果を測定する前に、細胞を７２時間培養した。中和百分率は、下記の方程式を利用して計算した：中和（％、抑制率）＝［（ウイルスだけが処理された区のプラーク数−順次に希釈された血清−混合されたウイルス処理区のプラーク数） ／ ウイルスだけが処理された区のプラーク数］×１００。

【0107】

ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で前記実施例３のようにそれぞれ複合体を製造し、前記実施例<４−３>と同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。血清におけるｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３ペプチド−特異的抗体がｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３により誘導された血球凝集反応を抑制させることを確認することができた（図８ａ）。

【0108】

ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３又はＡ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で前記実施例３のようにそれぞれ複合体を製造し、前記実施例<４−３>と同様にＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド−特異的抗体をｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３（図８ｂ）に予め反応させた後、ＭＤＣＫ細胞に感染させた時、血清におけるウイルス力価が低く表れることを確認し、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３ペプチド−特異的抗体がウイルスを中和させる機能をするということを確認した。

【0109】

ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチド−特異的抗体をｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３（図８ｃ）に予め反応させた後、ＭＤＣＫ細胞に感染させた時、血清におけるウイルス力価が低く表れることを確認し、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチド−特異的抗体がウイルスを中和させる機能をするということを確認した。

【0110】

ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３０又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３０）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）を投与した血清がマウスに適応されたｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３と予め反応させた後、ＭＤＣＫ細胞に感染させた時、ウイルス力価が低く表れることを確認し、各ペプチド− 特異的抗体がウイルスの中和作用をすることを確認した（図８ｄ及び図８ｅ）。

【0111】

更に、ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）を投与した血清がマウスに適応されたｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ及びＡ／ＷＳＮ／１９３３と予め反応させた後、ＭＤＣＫ細胞に感染させた時、ウイルス力価が低く表れることを確認し、Ａ／Ｈ１Ｎ１−ＴＸ ＨＡ２３３ペプチドに対する抗体がウイルスの中和作用をすることを確認した（図８ｆ）。

【0112】

実施例８： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体のワクチン効能評価
<８−１>ワクチン接種及びウイルスチャレンジ実験
４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームに被包された５０μｇのＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）に添加した５０μｇのペプチドを１０日間隔で２回にわたって腹腔注射した。２回目免疫化して１０日後、マウスに鼻腔吸入の方法で１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスでチャレンジした。

【0113】

<８−２>ウイルスチャレンジ後、体重及び生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ）の測定
感染後、マウスの臨床的症状と体重を毎日観察した。１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔感染後３日目から、マウスの体重が減少し始めて、１２日後に全て死ぬことを観察した。しかし、ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３又はｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３０）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）を２回にわたって接種し、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔に感染させた時、９日までは体重が減少したが、以後段々回復されて生存することが分かった（図９ａ、図９ｂ、図１１ａ、図１１ｂ、図１３ａ及び図１３ｂ）。

【0114】

そしてＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）を２回にわたって接種し、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔に感染させた時、体重が最初に減少したが、以後段々回復されて生存することが分かった（図１０ａ、図１０ｂ、図１２ａ、図１２ｂ、図１３ａ、図１３ｂ、図１４ａ及び図１４ｂ）。

【0115】

また、ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）を２回にわたって接種し、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔に感染させた時、生存率は５０％であることが分かった（図１２ａ）。

【0116】

そして、ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）を２回にわたって接種し、ｒＨ５Ｎ１ウイルスＰＲ８／Ｈ５Ｌｏを鼻腔に感染させた時、生存率は３８％であることが分かった（図１３ａ）。

【0117】

<８−３>肺組織染色
マウスを、指定された時間にジエチルエーテル吸入麻酔により死亡させて、全体肺組織を収得した。病理組織学的調査のために、前記肺組織を４％緩衝ホルマリン溶液で固定させて、伝統的な方法によってパラフィンに入れて４μｍの厚みで切った。標本をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３又はｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で２回にわたって接種されたマウスに１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔に感染させた時、前記肺組織が正常状態に回復されることを観察した（図９ｃ、図１０ｃ、図１１ｃ）。

【0118】

更に、ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３又はｈＨ５Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム複合体で１０日間隔で２回にわたって接種されたマウスに１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔に感染させた時、前記肺組織が正常状態に回復されることを観察した（図１３ｃ及び図１４ｃ）。

【0119】

<８−４>マウス組織からウイルス力価の測定
マウス１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスの鼻腔感染後３日及び６日目に、肺組織を分離して、１ｍｌ ＰＢＳに均質化させてウイルスの力価を分析した。ウイルス又は肺組織均質液の順次的に１０倍希釈された懸濁液が６−ウェルプレート内ＭＤＣＫ細胞のコンフルエント単一膜に添加された後、吸収のために常温で１時間（１０分毎に振ってやる）反応させた。前記懸濁液を除去して、細胞に２質量％オキソイド（ｏｘｏｉｄ）アガ、５質量％ＮａＨＣＯ_３、１質量％ＤＥＡＥデキストラン及びＴＰＣＫ（１μｇ／ｍｌ）−処理されたトリプシンを含むＭＥＭを添加した。前記ディッシュを３７℃で３日間反応した後、前記ディッシュ内細胞を１ｍｌのクリスタルバイオレットで１５分間染色して、プラーク（ｐｌａｑｕｅｓ）を視覚化させた。前記プラークの数がウイルスの力価を決定するためにカウンティングされた。ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で２回にわたって接種された後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔に感染させたマウスにおいて、肺組織のウイルス力価が減少された（図９ｄ又は図１０ｄ）。

【0120】

<８−５>血球凝集反応抑制アッセイ
ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で２回にわたって接種された後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔に感染させたマウスにおいて、生産された抗体により誘導された血球凝集反応の抑制が顕著に増加した（図１５ａ）。

【0121】

ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で２回にわたって接種された後、１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔に感染させたマウスにおいて、生産された抗体により誘導された血球凝集反応の抑制が明らかに増加した（図１５ｂ）。

【0122】

<８−６>抗体測定
マウスをＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０、ｈＨ１Ｎ１−ＷＳＮ ＨＡ２３３又はｈＨ１Ｎ１−ＨＫ ＨＡ２３）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で２回にわたって接種させた後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスを鼻腔に感染させた。前記感染後、６日目にマウスから血清を収得した。また、ＢＡＬＦ（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）を分離してｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２２９又はｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７１ペプチド−特異的抗体（総ＩｇＧ及びＩｇＡ）の量を測定した。１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスで感染させた場合、血清内総ＩｇＧの量及びＢＡＬＦ内ＩｇＡの量が顕著に増加した（図１６ａ、１６ｃ及び１６ｆ）。１０ＬＤ５０ ｍａＡ／ＷＳＮ／１９３３ウイルスで感染させた場合、血清内総ＩｇＧの量及びＢＡＬＦ内ＩｇＡの量が明らかに増加した（図１６ｂ、１６ｄ、１６ｅ及び１６ｆ）。

【0123】

実施例９： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体のワクチン化のメモリー効能の評価
<９−１>ワクチン接種及びウイルスチャレンジ実験
４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームに被包された５０μｇのＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）に添加した５０μｇのペプチドを１０日間隔で２回にわたって腹腔注射した。２回目免疫化して二ヶ月後、マウスに鼻腔吸入の方法で１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスでチャレンジした。

【0124】

<９−２>ウイルスチャレンジ後体重及び生存率の測定
感染後、マウスの臨床的症状と体重を毎日観察した。１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔感染後３日目から、マウスの体重が減少し始めて、１４日後に全て死ぬことを観察した。しかし、ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）を２回にわたって接種し、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔に感染させた時、１１日までは体重が減少したが、以後段々回復されて生存することが分かった（図１７ａ及び図１７ｂ）。

【0125】

<９−３>肺組織染色
マウスを、指定された時間にジエチルエーテル吸入麻酔により死亡させて、全体肺組織を収得した。病理組織学的調査のために、前記肺組織を４％緩衝ホルマリン溶液で固定させて、伝統的な方法によってパラフィンに入れて４μｍ厚みで切った。標本をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で２回にわたって接種されたマウスに１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔に感染させた時、前記肺組織が正常状態に回復されることを観察した（図１７ｃ）。

【0126】

<９−４>マウス組織におけるウイルス力価の測定
マウス１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルス又は１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスの鼻腔感染後３日及び６日目に、肺組織を分離して、１ｍｌ ＰＢＳに均質化させてウイルスの力価を分析した。ウイルスの力価は、実施例<８−４>と同様にプラークアッセイを通じて測定した。ＰＯ−ＤＮＡ−ペプチド（ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）で２回にわたって接種された後、１０ＬＤ５０ ｒＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔に感染させたマウスにおいて、肺組織のウイルス力価が、感染後６日目に顕著に減少された（図１７ｄ）。

【0127】

実施例１０： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体を利用したエピトープ効能の評価
<１０−１>組み換え鳥インフルエンザＡウイルスの不活性化
ウイルスを不活性化させるために、ｒＨ５Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／Ｈ５Ｌｏ）が２５４ ｎｍのＵＶ波長に５分間５ｃｍの距離で露出された。ウイルス感染性（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）の不活性化は、プラークアッセイで確認した。

【0128】

<１０−２>免疫化
４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルス又は不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルスとリポソーム複合体混合物又は不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルス−ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（５０μｇ／マウス）−リポソーム複合体を腹腔内投与した。同量の不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルスとＭＢ−ＯＤＮ４５３１混合物を１０日間隔で３回にわたって投与した。１０日経過後、心臓パンチング方法で血液を採取し、遠心分離して沈殿させ、血清を獲得した。前記獲得された血清から抗−組み換えＨ５Ｎ１ウイルス抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の量及び力価を確認するために、実施例<４−４>の方法でＥＬＩＳＡを行った。

【0129】

<１０−３>ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから得られた血清は、ＰＢＳ／０．２質量％アジ化ナトリウムと１：１０で混合して希釈した後、−２０℃に保管した。本発明者らは、各選択されたペプチド（ｒＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３又はｒＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０）又は不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルス（１０μｇ／ｍｌ；炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）を９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）に添加した後、１６時間４℃で反応した。その後、ｒＨ５Ｎ１ウイルス又は各ペプチドに特異的に結合する総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ（図１８）の生産を実施例<４−４>に記載のように分析した。

【0130】

総ＩｇＧの量及び力価（図１８ａ及び図１８ｂ）、そしてＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産が、不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルスで接種された血清において増加することを確認することができた。

【0131】

鳥インフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１／ベトナム／２００４ストレインのＨＡ蛋白質のうち、ｈＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３及びｈＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチドが各ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価を増加させる反面、不活性化されたｒＨ５Ｎ１ウイルスで免疫化された血清では、ｒＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３又はｒＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチド−特異的抗体の力価は変化がなかったが（図１８ｃ及び１８ｄ）、これは、ｒＨ５Ｎ１ ＨＡ２３３又はｒＨ５Ｎ１ ＨＡ３７０ペプチド−特異的抗体がＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）−各ペプチド−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）複合体で免疫化された血清で増加するということを示す。

【0132】

実施例１１： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体を利用したＨＣＶのエピトープスクリーニング
<１１−１> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ＨＣＶペプチド−リポソーム複合体の免疫化
ＨＣＶ Ｅ１及びＥ２蛋白質のうち、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して、三つの候補エピトープ（表１０）を選別して、前記実施例３と同様にＣｐＧ−ＤＮＡ−ＨＣＶペプチド−リポソーム複合体を製造した。前記製造されたＣｐＧ−ＤＮＡ−ＨＣＶペプチド−リポソーム複合体（５０μｇ／マウス）を、前記実施例<４−３>と同様にＢａｌｂ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与した。最後の投与後１０日経過時、心臓パンチング方法で血液を採取して、遠心分離し、血球を沈殿させて血清を獲得した。前記獲得した血清から抗−ペプチド抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価をＥＬＩＳＡで確認した。

【0133】

<１１−２> ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから得られた血清は、ＰＢＳ／０．２質量％アジ化ナトリウムと１：１０で混合して希釈した後、−２０℃に保管した。本発明者らは、各選択されたペプチド（１０μｇ／ｍｌ；炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）を９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）に添加した後、１６時間４℃で反応した。その後、各ペプチドに特異的に結合する総ＩｇＧ（図１９ａ）、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ（図１９ｂ及び図１９ｃ）の生産を実施例<４−４>に記載のように分析した。

【0134】

総ＩｇＧの力価（図１９ｃ）、そしてＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産がＨＣＶ−Ｅ２蛋白質から選択されたＨＣＶ−Ｅ２ ２０２ペプチドで免疫化された血清において増加することを確認することができた。

【0135】

<１１−３> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体−誘導された体液性免疫反応誘導において、リポソーム種類による影響の評価
ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１−ペプチド（ＨＣＶ−Ｅ１ ２０２）を種々のリポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１）、ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（１：１）、ＤＳＰＣ：ＣＨＥＭＳ：ＰＥＧ−ＰＥ（１：１：１）、Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＰＥ（１：１：１）、Ｄｃ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＰＥ（１：１））で前記実施例３のようにそれぞれ複合体を製造し、前記実施例<４−４>と同様にＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。前記血清からＨＣＶ−Ｅ２ ２０２ペプチド−特異的総ＩｇＧ力価を確認した結果、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳの比率が１：１の場合、ＨＣＶ−Ｅ２ ２０２ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価が最も高く表れた（図１９ｄ）。

【0136】

実施例１２： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体を利用したｈＲＳＶのエピトープスクリーニング
<１２−１> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ｈＲＳＶペプチド−リポソーム複合体の免疫化
ＲＳＶのＧ蛋白質及びＦ蛋白質のうち、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して、２０個の候補エピトープ（表１０、表１１及び表１２）を選別して、前記実施例３と同様にＣｐＧ−ＤＮＡ−各ｈＲＳＶペプチド−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）複合体を製造した。前記製造されたＣｐＧ−ＤＮＡ−各ｈＲＳＶペプチド−リポソーム複合体（５０μｇ／マウス）を、前記実施例<４−３>と同様にＢａｌｂ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与した。最後の投与後１０日経過時、心臓パンチング方法で血液を採取して、遠心分離し、血球を沈殿させて血清を獲得した。前記獲得した血清から抗−ペプチド抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価をＥＬＩＳＡで確認した。

【0137】

<１２−２>ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから得られた血清は、ＰＢＳ／０．２質量％アジ化ナトリウムと１：１０で混合して希釈した後、−２０℃に保管した。本発明者らは、各選択されたペプチド（１０μｇ／ｍｌ；炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）を９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）に添加した後、１６時間４℃で反応した。その後、各ペプチドに特異的に結合する総ＩｇＧ（図２０ａ及び図２１）、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ（図２１ｂ及び図２１ｃ）の生産を実施例<４−４>に記載のように分析した。

【0138】

総ＩｇＧの力価（図２０ａ、図２１ａ及び図２１ｄ）、そしてＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産（図２０ｂ、図２０ｃ、図２１ｂ、図２１ｃ及び図２１ｄ）がｈＲＳＶ Ｇ蛋白質及びＦ蛋白質から選択されたＨＲＳＶ−Ｇ１、ＨＲＳＶ−Ｆａ３、ＨＲＳＶ−Ｆａ３−２、ＨＲＳＶ−Ｆ７及びＨＲＳＶ−Ｆ９ペプチドで免疫化された血清において増加することを確認することができた。

【0139】

実施例１３：ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体を利用したヒトインテグリンβ４のエピトープスクリーニング
<１３−１> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ｈＩＢ４ペプチド−リポソーム複合体の免疫化
大部分の癌腫細胞で発現されるヒトインテグリンβ４蛋白質（ｈＩＢ）のうち、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して、６個の候補エピトープ（表１３）を選別して、前記実施例３と同様にＣｐＧ−ＤＮＡ−各ｈＩＢ４ペプチド−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）複合体を製造した。前記製造されたＣｐＧ−ＤＮＡ−各ｈＩＢ４ペプチド−リポソーム複合体（５０μｇ／マウス）を、前記実施例<４−３>と同様にＢａｌｂ／ｃマウスに１０日間隔で３回又は４回にわたって腹腔投与した。最後の投与後１０日経過時、心臓パンチング方法で血液を採取して、遠心分離し、血球を沈殿させて血清を獲得した。前記獲得した血清から抗−ペプチド抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価をＥＬＩＳＡで確認した。

【0140】

<１３−２> ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから得られた血清は、ＰＢＳ／０．２質量％アジ化ナトリウムと１：１０で混合して希釈した後、−２０℃に保管した。本発明者らは、各選択されたペプチド（１０μｇ／ｍｌ；炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）を９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）に添加した後、１６時間４℃で反応した。その後、総ＩｇＧの量（図２２ａ）及び力価（図２２ｂ）を実施例<４−４>に記載のように分析した。

【0141】

総ＩｇＧの量（図２２ａ）及び力価（図２２ｂ）が、ｈＩＢ４蛋白質から選択されたｈＩＢ４−ＶＷＡ−１−２、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−１−３、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−２、ｈＩＢ４−ＶＷＡ−３及びｈＩＢ４−ＥＧＦ−１ペプチドで免疫化された血清において増加することを確認することができた。

【0142】

実施例１４： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体を利用した肝癌−特異的ＴＭ４ＳＦ５蛋白質のエピトープスクリーニング
<１４−１> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ＴＭ４ＳＦ５ペプチド−リポソーム複合体の免疫化
肝癌細胞のＴＭ４ＳＦ５蛋白質のうち、親水性、疎水性、２次構造、抗原性及び両親媒性を考慮して、６個の候補エピトープ（表１０）を選別して、前記実施例３と同様にＣｐＧ−ＤＮＡ−ＴＭ４ＳＦ５ペプチド−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）複合体を製造した。前記製造されたＣｐＧ−ＤＮＡ−各ＴＭ４ＳＦ５ペプチド−リポソーム複合体（５０μｇ／マウス）を、前記実施例<４−３>と同様にＢａｌｂ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与した。最後の投与後１０日経過時、心臓パンチング方法で血液を採取して、遠心分離し、血球を沈殿させて血清を獲得した。前記獲得した血清から抗−ペプチド抗体（総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の力価をＥＬＩＳＡで確認した。

【0143】

<１４−２> ＥＬＩＳＡ
前記マウスを、注入後１０日目に犠牲させた。前記マウスから得られた血清は、ＰＢＳ／０．２質量％アジ化ナトリウムと１：１０で混合して希釈した後、−２０℃に保管した。本発明者らは、各選択されたペプチド（１０μｇ／ｍｌ；炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）を９６−ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）に添加した後、１６時間４℃で反応した。その後、各ペプチドに特異的に結合する総ＩｇＧ（図２３ａ）、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ（図２３ｂ）の量を実施例<４−４>に記載のように分析した。

【0144】

総ＩｇＧの力価（図２３ａ）、そしてＴｈ１免疫反応に係わるＩｇＧ２ａの生産（図２３ｂ）が、ＴＭ４ＳＦ５蛋白質から選択されたＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３又はＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−５ペプチドで接種された血清において増加することを確認することができた。

【0145】

<１４−３> ＣｐＧ−ＤＮＡ−−ペプチド−リポソーム複合体−誘導された体液性免疫反応において、リポソーム種類による影響の評価
ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１−ペプチド（ＴＭ４ＳＦ５）を種々のリポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１）、ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（１：１）、ＤＳＰＣ：ＣＨＥＭＳ：ＰＥＧ−ＰＥ（１：１：１）、Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＰＥ（１：１：１）、Ｄｃ−Ｃｈｏｌ：ＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＰＥ（１：１））で前記実施例３のようにそれぞれ複合体を製造し、前記実施例<４−４>と同様にＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。前記血清からＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧ力価を確認した結果、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳの比率が１：１の場合、ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価が最も高く表れた（図２３ｃ）。

【0146】

<１４−４> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体−誘導された体液性免疫反応誘導において、ＣｐＧ−ＤＮＡ種類による影響の評価
ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（１：１））と表１に提示された種々のＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）、ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（ＧＣＯ））又はＰＳ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ））で前記実施例３のようにそれぞれ複合体を製造して、前記実施例<４−４>と同様にＢＡＬＢ／ｃマウスに３回にわたって腹腔投与した後、血清を採取した。前記実施例<４−４>と同様に、血清からＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド−特異的総ＩｇＧの力価を確認した結果、ＰＯ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ））又はＰＳ−ＤＮＡ（ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｓ））を利用した複合体で最も高く表れた（図２３ｄ）。

【0147】

<１４−５> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体による体液性免疫反応において、ＴＬＲ９の影響の評価
ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）が注入されたマウスから、抗体生産上のＴＬＲ９の機能を調べるために、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃ ＴＬＲ９ノックアウトマウス及び野生型マウスを利用してＩｇＧ生産を分析した。予想の通り、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）が注入されたＴＬＲ９ノックアウトマウスは全くＩｇＧを生産しなかったため、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）のＩｇＧ−生産能は、ＴＬＲ９に絶対的に依存的であった（図２３ｅ）。これと対照的に、ＩＦＡと組み合わされたＨＥＬの注入は、野生型マウス及びＴＬＲ９ノックアウトマウスにおいて、ＩｇＧ生産を増加させた（図２３ｆ）。

【0148】

<１４−５> ＣｐＧ−ＤＮＡ−ペプチド−リポソーム複合体−誘導された体液性免疫反応において、ＭＨＣクラスＩＩ−媒介された提示及びＴｈ１分化上の影響評価
ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたエピトープ及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）による免疫化に対する反応で抗体生産の動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を評価するために、本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与した。前記ＢＡＬＢ／ｃマウスは、２次及び３次反応で非常に多い量のペプチド−特異的ＩｇＧ（ＩｇＧ２ａ）を生産した（図２４ａ）。次に、本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）に対する反応で、ＩｇＧ生産においてＭＨＣクラスＩＩ−媒介された提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の必要性を調べた。図２４ｂから分かるように、抗−ＣＤ４抗体がＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与されて誘導されたＣＤ４＋細胞の欠乏は、ペプチド−特異的ＩｇＧの生産を顕著に減少させた。また、本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）による免疫化に対する反応から、ＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウス及びＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウスにおいてＩｇＧ及びＩｇＧ２ａの生産減少を確認した（図２４ｃ及び図２４ｄ）。更に、本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）による免疫化に対する反応で、ＩｇＧ生産においてＴｈ１分化の連関性（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）を調べた。本発明者らは、ＳＴＡＴ４ノックアウトマウスでＩｇＧ及びＩｇＧ２ａの生産減少（図２４ｅ）を確認したが、これは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）による免疫化に対する反応において、ＳＴＡＴ４がＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進するいうことを意味する。しかし、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）−誘導されたＩｇＧ生産は、ＳＴＡＴ６ノックアウトマウスでは観察されなかった（図２４ｆ）。上述の結果は、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたＢ細胞エピトープ及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）免疫化に対する反応で、ＩｇＧ（ＩｇＧ２ａ）生産はＣＤ４＋細胞 ＭＨＣクラスＩＩ−媒介された提示及びＴｈ１分化を必要とするということを意味する。

【0149】

実施例１５： マウス抗−ｈＴＭ４ＳＦ５単一クローン抗体（ｍＡｂｓ）の生産
本発明者らは、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド（５０μｇ）及びＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）（５０μｇ）をＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回にわたって腹腔投与した後、標準ハイブリドーマ技術にしたがって、抗−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的単一クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞をスクリーニングした（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｗ． Ｍ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｐ．２．５．１−２．５．１７． Ｉｎ Ｊ．Ｅ． Ｃｉｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ． Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅ． Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， ＆ Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ． Ｉｎｃ．， Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ． （２００１）．参照）。前記抗−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的単一クローン抗体（ＩｇＧ２ａ）が、蛋白質Ａカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ， ＵＳＡ）を利用して、腹水液（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）から精製された。

【0150】

実施例１６： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ＴＭ４ＳＦ５ペプチド−リポソーム複合体により生産された単一クローン抗体のＴＭ４ＳＦ５蛋白質認識分析
<１６−１>ヒト肝癌細胞株においてＴＭ４ＳＦ５発現の分析
ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ； Ｈｕｈ−７）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ； Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ＵＳＡ）から購入した。ヒト肝細胞株（Ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ；ＳＮＵ−３９８、ＳＮＵ−４２３、ＳＮＵ−７３９及びＳＮＵ−７６１）は、韓国細胞株バンク（Ｓｅｏｕｌ， Ｋｏｒｅａ）から購入した。前記Ｈｕｈ−７、ＳＮＵ−３９８、ＳＮＵ−４２３、ＳＮＵ−７３９及びＳＮＵ−７６１細胞は、１０質量％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ； Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ， ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。ヒト正常肝細胞（Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）は、販売者の説明書にしたがって培養した。全ての細胞は、９５％空気と５％ ＣＯ_２の大気状態で３７℃で培養した。ｈＴＭ４ＳＦ５ ｍＲＮＡの発現を分析するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＭＤ， ＵＳＡ）を利用して抽出し、ｃＤＮＡ製造は、公知の方法で行った（Ｋｉｍ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｎｖｅｓｔ． ３８： １３２−１５２ （２００９）．参照）。標準ＰＣＲ反応は、下記のプライマーセットを利用して２５サイクルを行った：ヒトβ−アクチン、５’−ＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧ−３’及び５’−ＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴ−３’（５００ ｂｐ）；ｈＴＭ４ＳＦ５。前記Ｈｕｈ−７及びＳＮＵ−７６１細胞株において、ＴＭ４ＳＦ５ ｍＲＮＡの発現が高く表れることを、ＲＴ−ＰＣＲを通じて確認した（図２５ａ）。

【0151】

<１６−２> ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチドを認識する単一クローン抗体のＴＭ４ＳＦ５蛋白質認識の確認（ＦＡＣＳ分析）
抗体結合分析において、肝癌細胞を、０．１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、Ｆｃ受容体との結合をブロッキングするために、１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で２０分間反応した。ブロッキング後、細胞を、精製された抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体<実施例１５>と共に１時間反応した。その後、細胞を、０．１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣ−コンジュゲーションされたヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に４℃で３０分間反応した。ＲＴ−ＰＣＲを通じてＴＭ４ＳＦ５のｍＲＮＡ発現が確認されたＨｕｈ−７及びＳＮＵ−７６１に、精製した抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体が結合することを、ＦＡＣＳ分析を通じて確認した（図２５ｃ）。

【0152】

実施例１７： ＣｐＧ−ＤＮＡ−ＴＭ４ＳＦ５ペプチド−リポソーム複合体により生産された抗体の肝癌細胞の成長抑制効能の評価
<１７−１>抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド単一クローン抗体による細胞成長の抑制
抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体（１０μｇ／ｍｌ）を７２時間処理した後、ＭＴＴアッセイを通じて、ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７及びＳＮＵ−７３９）の成長を分析した。

【0153】

肝癌細胞を４８−ウェルプレートで７２時間培養した後、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ； Ｓｉｇｍａ）溶液を各プレートに添加して、３７℃で４時間更に反応した。培地を除去した後、ホルマザンクリスタルをＤＭＳＯに可溶化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅ）させた。色の変化は、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ， ＰＡ， ＵＳＡ）を利用して、６５０ｎｍの基準波長（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）下で５７０ｎｍの波長をモニタリングした。ＴＭ４ＳＦ５を発現するＨｕｈ−７細胞株の成長が抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体処理により抑制されるということを、ＭＴＴアッセイを通じて確認した（図２５ｄ）。これと対照的に、ＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞株（ＳＮＵ−７３９）は、影響を受けなかった（図２５ｄ）。

【0154】

<１７−２>抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体による細胞周期の調節
肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７及びＳＮＵ−７３９）に抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体（１０μｇ／ｍｌ）を７２時間処理した後、細胞周期を観察した。本発明者らは、前記細胞を、ＲＮａｓｅ（２００ μｇ／ｍｌ）−ＰＢＳに溶かしたよう化プロピジウム（ＰＩ； ２０μｇ／ｍｌ）溶液と反応させることにより、ＤＮＡ含量を分析した。細胞を常温で３０分間染色して、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。細胞周期の分布データは、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ ３．０ソフトウェアを利用して分析した。

【0155】

各群で細胞周期段階の分布を比較した。ＴＭ４ＳＦ５を発現するＨｕｈ−７細胞株において、抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体処理を通じてＳ期がアレストされるということを観察した。対照的に、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ−７３９細胞株では、細胞周期に影響がなかった（図２５ｄ）。

【0156】

<１７−３>抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体による肝癌細胞の機能阻害分析
ＴＭ４ＳＦ５を発現する肝癌細胞が細胞−細胞接触抑制能力を失い、肝癌細胞に成長することが知られていた（Ｌｅｅ， Ｓ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１８： １３５４−１３６５ （２００８）．参照）。ＴＭ４ＳＦ５を発現する肝癌細胞は、非正常的なアクチン束（ａｃｔｉｎ ｂｕｎｄｌｉｎｇ）を有する反面、ＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞は、広く広げられた多角形形態（ｏｖｅｒｓｐｒｅａｄ ｐｏｌｙｇｏｎａｌ ｓｈａｐｅ）を支持するストレス線維（ｓｔｒｅｓｓ ｆｉｂｅｒ）の明確な輪郭（ｏｕｔｌｉｎｅ）を示す（４１）。したがって、本発明者らは、肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７及びＳＮＵ−７３９）に抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体（１０μｇ／ｍｌ）を７２時間処理した後、細胞のアクチンを観察した。

【0157】

細胞を抗−ｈＴＭ４ＳＦ５抗体（１０μｇ／ｍｌ）で処理する一日前に、１２−ウェルプレート内ガラスカバースリップで培養した。細胞を前記抗体で７２時間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで固定させて、０．１質量％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。その後、ロダミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ， ＵＳＡ）−コンジュゲーションされたファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ， ＵＳＡ）で染色した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｎｏ． ３３２５８で染色した。前記マウンティングされた試料は、ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ ＮＬＯ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してスキャンした。

【0158】

ｈＴＭ４ＳＦ５を発現する肝癌細胞（Ｈｕｈ−７）に抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体を処理した場合、ｈＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞でのように、アクチンが広く広がった多角形形態を支持する明らかな輪郭のストレス線維として検出されるが、これは、前記抗体がｈＴＭ４ＳＦ５−発現細胞でターゲットされることを意味する（図２５ｆ）。上述の結果は、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソーム複合体に共同で被包されたＭＢ−ＯＤＮ４５３１（Ｏ）及びｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３（５０μｇ）により発生された抗体がｈＴＭ４ＳＦ５蛋白質の検出に有用に利用できて、細胞内における抗体−媒介されたｈＴＭ４ＳＦ５ターゲッティングが肝癌細胞の機能的変化と関連されているが、前記変化は、細胞機能の多様性を変化させることのできる細胞成長を大きく減少させることができるということを意味する。

【0159】

実施例１８： ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−特異的抗体によるインビボ肝癌細胞の成長抑制効能の評価
<１８−１>ヌードマウス（ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ）において異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）実験
５×１０^６個のヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７）をヌードマウスの右側脇に皮下注射した。癌の直径が５ｍｍまで育った後、試料は三つの群［ＰＢＳ、正常ＩｇＧ及び抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体処理群（ｎ＝５／処理群）］に分けた。各処理群は、ＰＢＳ及び各抗体（１００ｍｇ／Ｋｇマウス）を３日間隔で５回にわたって前記癌組織（５ｍｍ）に注入した。５週間観察しながら、癌の総量（ｖｏｌｕｍｅ；直径）を、カリパース（ｃａｌｉｐｅｒｓ）を利用して測定した。異種移植実験の分析を通じて、腫瘍成長をインビボで減少させるには、肝癌細胞への抗−ＴＭ４ＳＦ５ Ｒ２−３ペプチド抗体ターゲッティングだけで十分であることを究明した（図２６ａ及び図２６ｂ）。

【0160】

実施例１９： ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−リポソーム複合体によるワクチン化を通じて、インビボ肝癌細胞の成長抑制効能の評価
<１９−１>マウス腫瘍自己移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）実験
４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）複合体を１０日間隔で３回にわたって腹腔注入した。３回目免疫化させて１０日後に、５０質量％マトリゲルを含むＢＮＬ−ＨＣＣ細胞（５×１０^６個）をＢＡＬＢ／ｃマウスの右側脇に皮下注射した。７週間観察しながら癌の総量（ｖｏｌｕｍｅ；直径）を、カリパース（ｃａｌｉｐｅｒｓ）を利用して測定した。ＭＢ−ＯＤＮ ４５３１（Ｏ）−ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３ペプチド−リポソーム（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ）複合体で免疫化されたマウスは、処理されなかったマウスと比較し、腫瘍成長（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）が顕著に減少した（図２７ａ及び図２７ｂ）。

【0161】

以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ好ましい実施形態に過ぎず、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図2d】

【図2e】

【図3a】

【図3b】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図9a】

【図9b】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図12a】

【図12b】

【図13a】

【図13b】

【図14a】

【図14b】

【図15a】

【図15b】

【図17a】

【図17b】

【図18b】

【図18c】

【図18d】

【図19a】

【図19b】

【図19c】

【図19d】

【図20a】

【図20b】

【図20c】

【図21a】

【図22b】

【図23a】

【図23b】

【図23c】

【図23d】

【図23e】

【図23f】

【図24b】

【図25d】

【図26b】

【図27b】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図4】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図8d】

【図8e】

【図8f】

【図9c】

【図9d】

【図10c】

【図10d】

【図11c】

【図13c】

【図14c】

【図16a】

【図16b】

【図16c】

【図16d】

【図16e】

【図16f】

【図17c】

【図17d】

【図18a】

【図21b】

【図21c】

【図21d】

【図22a】

【図24a】

【図24c】

【図24d】

【図24e】

【図24f】

【図25a】

【図25b】

【図25c】

【図25e】

【図25f】

【図26a】

【図27a】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]