特許 5872655 異形成の進行を評価する方法および疾患段階の決定に用いるキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5872655

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】異形成の進行を評価する方法および疾患段階の決定に用いるキット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20160216BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20160216BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20160216BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20160216BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20160216BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/569 L

   G01N33/543 597

   G01N33/53 Y

   G01N33/48 P

   G01N33/574 D

【請求項の数】8

【外国語出願】

【全頁数】72

(21)【出願番号】特願2014-191878(P2014-191878)

(22)【出願日】2014年9月19日

(62)【分割の表示】特願2011-513504(P2011-513504)の分割

【原出願日】2009年6月12日

(65)【公開番号】特開2015-38485(P2015-38485A)

(43)【公開日】2015年2月26日

【審査請求日】2014年10月16日

(31)【優先権主張番号】61/131,991

(32)【優先日】2008年6月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/192,912

(32)【優先日】2008年9月22日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515149281

【氏名又は名称】オンコヘルス コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＯｎｃｏＨｅａｌｔｈ Ｃｏｒｐ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(72)【発明者】

【氏名】チェン シュリン

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５０５２４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３４９４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５２６２８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０３１１６６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０５０４５４４７（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０３２０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２１１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５２２９８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of General Virology，２００５年，Vol.86，p3235-3241

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５６９

Ｇ０１Ｎ ３３／４８

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト対象の子宮頸部臨床サンプルの染色パターンに基づいて異形成の進行を評価する方法であって、
（ｉ）ヒト対象の子宮頸部の臨床サンプルに免疫学的分析を行う工程と、
（ｉｉ）１個以上の未変性形態の精製組み換え型パピローマウイルスタンパク質に対して生成する１個以上のモノクローナル抗体を用いて臨床サンプルからの一つ以上のヒト細胞の染色を得る工程と、
を含み、
前記１個以上のモノクローナル抗体は、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質と結合でき、ヒトパピローマウイルス性タンパク質は、ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９，ＨＰＶ−６６およびＨＰＶ−６８からなる群より選択されるＨＰＶ型に関連し、
（ｉｉｉ）核部分と細胞質部分とを有する細胞のサンプルの染色の場所を検出する工程と、
（ｉｖ）前記臨床サンプルからの一つ以上のヒト細胞の前記核部分の染色された細胞の割合と前記細胞質部分の染色された細胞の割合とを比較することにより、染色パターンを検出する工程と、
を含む、方法。

【請求項2】

前記免疫学的分析が、免疫化学（ＩＨＣ）分析、免疫細胞（ＩＣＣ）分析およびフローサイトメトリ分析、から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記１個以上のモノクローナル抗体は、抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体、抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ヒト対象から臨床サンプルを提供して、臨床サンプルは形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物を含む臨床サンプルを処理して、スライドガラス上の細胞の薄層に塗布する工程と；
１個以上の未変性形態の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対して生成した１個以上の抗体を用いて免疫化学分析を行う工程であって、少なくとも１個の抗体はパピローマウイルス初期ウイルス性タンパク質と結合できる工程と；
形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物を含むスライドガラス上で臨床サンプルに存在する１個以上のパピローマウイルス型から１個以上のパピローマウイルス性タンパク質をそのままで染色する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。

【請求項5】

形態学的に異常または正常なヒト細胞の混合物から各細胞を分離することによって、それぞれの個々の細胞を検出する１個以上のフローサイトメトリ分析を行う工程と；
臨床サンプルからの液体溶液内に含まれる形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物における１個以上のパピローマウイルス型から、１個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する工程をさらに含む請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ヒト対象におけるパピローマウイルス感染により生じる疾患の段階の決定に用いるキットであって、
１個以上の抗ＨＰＶモノクローナル抗体を備え、モノクローナル抗体は１個以上の未変性形態の精製組み換え型パピローマウイルスタンパク質に対して生成し、
前記１個以上の抗ＨＰＶモノクローナル抗体は、抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体、抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
１個以上の抗ＨＰＶモノクローナル抗体は、ヒト対象の臨床サンプルの免疫学的分析に使用され、
１個以上の抗ＨＰＶモノクローナル抗体の少なくとも一つは、前記臨床サンプルからの一つ以上のヒト細胞の核部分を染色でき、
１個以上の抗ＨＰＶモノクローナル抗体の少なくとも一つは、前記臨床サンプルからの一つ以上のヒト細胞の細胞質部分を染色でき、
臨床サンプルに存在する１個以上のパピローマウイルス型から１個以上のパピローマウイルス性タンパク質をそのままで染色する、キット。

【請求項7】

前記ヒト対象の臨床サンプルは、組織および細胞を含有し、臨床サンプルの固定化溶液への沈殿およびスライドガラス上の組織の薄片への塗布、臨床サンプルの液体溶液への沈殿およびスライドガラス上の細胞の薄層への塗布、並びに、臨床サンプルの液体溶液への沈殿および液体溶液中の各細胞の分離からなる群より選択される処理を行って処理される、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

前記１個以上のパピローマウイルス型は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−６６からなる群より選択され、
ヒト対象におけるパピローマウイルス感染により生じる疾患の段階の検出および決定は、初期ＨＰＶ感染、後期ＨＰＶ感染、初期段階子宮頸部細胞病変、後期段階子宮頸部細胞病変、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、重度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、子宮頸部上皮内癌形成ステージ１（ＣＩＮ１）、子宮頸部上皮内癌形成ステージ２（ＣＩＮ２）、子宮頸部上皮内癌形成ステージ３（ＣＩＮ３）、進行した子宮頸癌、腺癌（ＡＤＣ），扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

上皮特異細胞での上皮の増殖を誘起するヒトパピローマ（乳頭腫）ウイルス（ＨＰＶ）による感染は、子宮頸癌に対して重要な役割を果たす。約９９パーセントの確認された子宮癌は、生検確認した扁平上皮病変（ＳＩＬ）または子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を有するＨＰＶ感染に関連する。約１％の人口は陰部疣贅を有し、女性の約４％は、軽度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）もしくは重度の扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）または異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）等の子宮頸癌前駆病変を有する。一般的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の持続感染は、子宮頸癌前駆病変の発達に関して重要であると考えられている。ＬＳＩＬを有する女性に対して高リスクなＨＰＶの感染は、ＨＳＩＬに進行することがある。事実、いくつかはＨＳＩＬまで進行するが、ＬＳＩＬヒト対象の多くが寛解する。９９．７％の子宮頸癌はＨＰＶ陽性であるが、宿主遺伝子内へのウイルス遺伝子の統合は、ＨＳＩＬまたは癌へ進行する発現に重要な遺伝子を促進するのに必要である。持続ＨＰＶ感染した１０人の女性のうち１人だけが、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）グレード２およびグレード３（それぞれＣＩＮ２，ＣＩＮ３）等の重度のＣＩＮ病変に進行し、これらの内皮病変の場合の一部は最終的に子宮頸癌に進行する。

【0002】

たった約１５種類のＨＰＶ型による感染（１００以上の利用可能なＨＰＶ型のうちの一つ）は、高リスクで子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）または子宮頸癌に進行する。それらのうち、報告された約７０％の子宮頸癌および報告されたＣＩＮ２およびＣＩＮ３の５０％は、２つの高リスクＨＰＶ型、すなわち、ＨＰＶタイプ１６およびＨＰＶタイプ１８によって起こる。しかし、いくつかの進行性子宮頸癌の場合は、低リスクのＨＰＶ型によって感染したと報告されているが、いくつかの高リスクのＨＰＶ型の感染は、子宮頸癌に決して進行しない。これらの２個の一般的な高リスクＨＰＶ型による感染は、腫瘍成長または癌の進行に関連しない。高リスク型によるＨＰＶ感染を特定するだけでなく特定の発癌タンパク質を発現するそれらのＨＰＶ感染ヒト対象を特定するのが重要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

したがって、これらの発癌タンパク質は、高いグレードの細胞病変もしくは子宮頸癌に関連する疾患に発展するリスクを予測する子宮頸癌バイオマーカーとして機能するため、臨床サンプルにおけるＨＰＶに関連する発癌タンパク質の発現を検出する必要がある。また、子宮頸癌バイオマーカーとしての侵襲性子宮頸癌および／またはＨＰＶに関連する発癌タンパク質の存在を検出し、また、子宮頸癌となる内皮病変の悪性転換に対するリスクを予測する抗ＨＰＶ抗体および適切なＨＰＶ免疫学的分析を開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明の実施形態は、組み換え型ＨＰＶタンパク質に対する様々なモノクローナル抗体を用いてＨＰＶタンパク質をｉｎ ｓｉｔｕで検出する様々な免疫測定を提供し、高リスクおよび／または低リスクのＨＰＶ型による感染が一つの特異的なモノクローナル抗体および／または一般的なｐａｎ抗体によって検出できるようにするものである。一つの実施形態において、ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の検出方法には、ヒト対象の臨床サンプル上での免疫学的分析を行う工程および、ＨＰＶ初期ウイルス性タンパク質に結合できる１個以上のモノクローナル抗体を用いて臨床サンプルからヒト細胞の核部分を染色する工程を有する。他の実施形態において、ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の検出方法は、１個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対して生成した１個以上の抗体を用いてヒト対象の臨床サンプルからヒト細胞上で免疫化学分析を行う工程および、核部分の染色を臨床サンプルからのヒト細胞の細胞質部分の染色を比較する工程を有する。ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の他の検出方法は、Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できる２個以上の抗体を用いてヒト対象の臨床サンプル上の免疫化学分析を行う工程および、２個以上の抗体によってヒト細胞の染色を比較する工程を有し、２個以上の抗体のうち少なくとも１個によるヒト細胞の陽性染色はヒト対象におけるパピローマウイルス感染を示すものとする。

【0005】

一つの態様において、本発明は、後期疾患のヒト対象からのＨＰＶ感染したヒト細胞の細胞質部分を染色する免疫学的分析において用いることができる抗ＨＰＶモノクローナル抗体を提供する。他の態様において、一つの病期でのＨＰＶ感染を示すヒト対象からのヒト細胞の核部分を染色する免疫学的分析において用いることができる抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体および抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体を提供する。ＨＰＶ感染したヒト対象の核部分の染色は初期ＨＰＶ感染を示すが、ＨＰＶ感染した細胞質部分の染色はＨＰＶ感染による後期疾患への異形成進行を示す。免疫学的分析において用いる抗ＨＰＶモノクローナル抗体は、抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体、抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体、抗ＨＰＶ Ｌ１モノクローナル抗体およびそれらの組み合わせである。他の態様において、本発明は子宮頸癌進行を検出するのに用いるバイオマーカーとしての抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体および抗ＨＰＶ Ｅ７タンパク質を提供する。加えて、本発明は、免疫化学分析および免疫細胞分析等の１個以上の免疫化学分析の実施方法を提供する。ＨＰＶウイルス性タンパク質に対して高い特異性のモノクローナル抗体も提供して、ＨＰＶ検出免疫学的分析に用いる。一つの実施形態において、上皮組織サンプルの核部分を抗ＨＰＶモノクローナル抗体で染色して、概してＨＰＶ感染を示す。他の実施形態において、上皮組織の細胞質部分を抗ＨＰＶモノクローナル抗体で染色してＨＰＶ感染による形質不全進行を示す。

【0006】

さらに他の態様において、臨床サンプル上で免疫学的分析を行うキットを提供し、ヒト対象からのＨＰＶ感染したヒト細胞の核部分を染色してＨＰＶ感染を示すことができ、また、ＨＰＶ感染したヒト細胞の細胞質部分を染色して後期疾患のＨＰＶ感染を示すことができる抗ＨＰＶモノクローナル抗体を有する。一つの態様において、ヒト対象におけるパピローマウイルス感染を示すキットは、ヒト対象の臨床サンプル上の免疫学的分析を行う抗ＨＰＶモノクローナル抗体を有し、臨床サンプルからの１個以上のヒト細胞の核部分を染色して、核部分の染色をヒト細胞の細胞質部分の染色と比較することができる。

【0007】

本発明はまた、子宮頸部細胞または子宮頸部組織におけるＨＰＶタンパク質を検出するＨＰＶ免疫細胞（ＩＣＣ）分析、ＨＰＶフローサイトメトリ分析、ＨＰＶ免疫化学（ＩＨＣ）分析も提供する。加えて、ＨＰＶウイルス性タンパク質に高い特異性を有するモノクローナル抗体も提供し、ＨＰＶ ＩＣＣまたはＨＰＶフローサイトメトリ分析において用いる。一つの実施形態において、ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の検出方法は、１個以上の抗体を用いてヒト細胞の薄層を有するスライドガラス上の生物学的サンプルに存在する１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質をｉｎ ｓｉｔｕで検出して、ヒト細胞の薄層を染色する免疫細胞分析によって行う。この方法は、ヒト対象から臨床サンプルを提供し、臨床サンプルは形態学的に異常および正常の細胞の混合物内に入れる工程と、混合物をスライドガラス上の細胞の薄層に入れる工程と、１個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対して生成した１個以上の抗体を用いて免疫化学分析を行い、形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物を含むスライドガラス上の臨床サンプルに存在する１個以上のパピローマウイルス型をｉｎ ｓｉｔｕで染色する工程を有する。

【0008】

他の実施形態において、ヒト対象におけるパピローマウイルス感染の検出方法は、ヒト対象から臨床サンプルを提供する工程および１個以上の抗体を化学物質でタグを付け、臨床サンプルを形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物を含む液体溶液内で処理する工程を有する。形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物は、１個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対して生成した１個以上の抗体を用いて染色する。この方法はさらに、１個以上のフローサイトメトリ分析を行って、形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物から各細胞を分離することによってそれぞれの独立した細胞を検出する工程と、臨床サンプルからの液体溶液において含まれる形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物において１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する工程を有する。

【0009】

一つの実施形態において、１個以上の抗体は、１個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対して生成し、少なくとも１個の抗体は、パピローマウイルス性初期タンパク質を認識することができる。他の実施形態において、１個以上の抗体を化学物質でタグを付け、ヒト対象の生物学的サンプルにからの１個以上のヒト細胞を液体溶液において準備して、１個以上の抗体の生物学的サンプルの１個以上のヒト細胞に存在する１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質との結合が、タグを付けた１個以上の抗体と反応する化学物質の存在によって検出できるようにする。他の実施形態において、化学物質には、染色剤、蛍光色素原、および１個以上のフローサイトメトリ分析において１個以上のヒト細胞をその後分離して特定する他の化学物質がある。加えて、免疫細胞分析を行うキットを提供する。キットは、前−抗体ブロッキング溶液、後−抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、二次抗体としてのＨＲＰもしくはビオチンまたは他の物質と結合した抗マウスまたは抗ラビット免疫グロブリン、二次抗体を検出する基質として用いる適切な化学物質を含む溶液を含む。

【0010】

さらに他の実施形態において、キットを、ヒト対象におけるパピローマウイルスを検出するために提供し、形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物を有する溶液内で処理し、形態学的に異常および正常なヒト細胞の混合物を有するスライドガラス上の臨床サンプルに存在する１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質をｉｎ ｓｉｔｕで染色するスライドガラス上の薄層細胞に入れる、ヒト対象からの臨床サンプル上の免疫化学分析を行うためにパピローマウイルス性初期タンパク質に結合できる抗ＨＰＶモノクローナル抗体を有する。

【0011】

本発明はまた、子宮頸部細胞または子宮頸部組織等の生物学的サンプルにおけるＨＰＶタンパク質の存在を検出する、ＨＰＶブロット膜分析、タンパク質チップマイクロアレイ分析、ＨＰＶビーズ分析、ＨＰＶ側方流動迅速試験、ＨＰＶ鉛直流迅速試験、ＨＰＶマイクロ流体迅速試験、直接的酵素免疫測定（ＥＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）も提供する。加えて、これらの分析を行うキットおよび装置も提供する。一つの実施形態において、１個以上のパピローマウイルス性タンパク質を検出する方法を提供し、１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質に結合でき、臨床サンプルに存在する１個の抗ＨＰＶ抗体を提供する工程と、細胞溶解物溶液に存在する抗ＨＰＶ抗体または様々なタンパク質をその上にコーティングした固体表面を提供する工程と、臨床サンプルを、１個以上のパピローマウイルス性タンパク質を有する様々なタンパク質を含む細胞溶解物溶液内で処理する工程を有する。この方法はさらに、抗ＨＰＶ抗体を細胞溶解物溶液と反応させ、固体表面上で抗ＨＰＶ抗体を有する１個以上のパピローマウイルス性タンパク質の複合体を形成し、固体表面上で複合体を検出して、臨床サンプルに存在する１個以上のパピローマウイルス性タンパク質の存在を確認する工程を有する。

【0012】

他の実施形態において、生物学的サンプルにおける１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する方法を提供し、この方法は、細胞溶解物溶液において処理した生物学的サンプルを提供する工程と、固体表面上に固定した第１抗ＨＰＶ抗体を提供して、細胞溶解物溶液と反応させる工程と、細胞溶解物溶液を第２抗ＨＰＶ抗体と反応させる工程を有する。両方の抗体は、１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質に結合することができる。この方法はさらに、固体表面上で第１および第２抗ＨＰＶ抗体を有する１個以上のパピローマウイルス性タンパク質の複合体を形成する工程と、生物学的サンプルにおける１個以上のパピローマウイルス性タンパク質の存在に対する固体表面上の複合体の形成を検出する工程を有する。

【0013】

加えて、生物学的サンプルにおける１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する側方流動装置を本発明の一つの実施形態に従って提供する。側方流動装置は、ストリップの一端に固定化した第１抗ＨＰＶ抗体を有するストリップの第１固体表面およびストリップのもう一端に第２抗ＨＰＶ抗体を有するストリップの第２固体表面で、第１ＨＰＶ抗体を有する複合体内に形成するストリップの固体表面上で側方に流す生物学的サンプルから処理した細胞溶解物溶液と反応できる第２固体表面を有する。他の実施形態において、生物学的サンプルにおける１個以上のパピローマウイルス型からの１個以上のパピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する鉛直粒迅速試験装置を提供し、この装置は、生物学的サンプルから処理した細胞溶解物溶液と反応するその上に固定化した第１抗ＨＰＶ抗体を有する膜の固体表面と、固体表面を鉛直に流れ膜の固体表面上の第１抗ＨＰＶ抗体との複合体内で形成する膜の固体表面上に細胞溶解物溶液を加える第２抗ＨＰＶ抗体を有する。

【0014】

一つの態様において、第１抗ＨＰＶ抗体は、１個以上の第１パピローマウイルス遺伝子によってコードした１個以上の第１組み換え型タンパク質に対して生成し、第１抗ＨＰＶ抗体が固体表面上で細胞溶解物において１個以上のパピローマウイルス性タンパク質を捕捉できるようにする。他の態様において、第２抗ＨＰＶ抗体は、同じパピローマウイルス遺伝子によってコードした同じ第１組み換え型タンパク質に対して生成し、第２抗ＨＰＶ抗体が細胞溶解物において１個以上のパピローマウイルス性タンパク質と結合および検出できるようにする。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】図１Ａは、抗Ｅ７抗体を用いてＩＨＣによってマイクロアレイ染色した組織からの扁平上皮癌（ＳＣＣ）組織の画像である。

【図1B】図１Ｂは、図１ＡからのＳＣＣ対象の正常上皮（腫瘍組織から１５ｍｍ離れた）の画像である。

【図1C】図１Ｃは、同じ抗Ｅ７抗体を用いてＩＨＣによってマイクロアレイ染色した組織からの他のＳＣＣサンプルの画像である。

【図1D】図１Ｄは、図１Ｃからの細胞質において染色した腫瘍細胞の拡大画像である。

【図2A】図２Ａは、抗Ｅ７抗体を用いてＩＨＣによって染色した組織からの腺腫内癌（ＡＤＣ）サンプルの腫瘍細胞の画像である。

【図2B】図２Ｂは、図２ＡからのＡＤＣサンプルの正常上皮（腫瘍から１５ｍｍ離れた）に対応する画像である。

【図2C】図２Ｃは、図２Ａからの腺腫内癌腫瘍の細胞質染色の拡大画像である。

【図3A】図３Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＩＨＣ分析におけるマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＣＩＮ３組織の異形成の染色画像である。

【図3B】図３Ｂは、ＣＩＮ３異形成の特定の核染色を示す、図２Ａの異形成上皮の拡大画像である。

【図4A】図４Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＩＨＣ分析におけるマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いたＣＩＮ２組織の異形成細胞の染色画像である。

【図4B】図４Ｂは、同じマウスモノクローナル抗体ＩＨＣ分析を用いた図１ＡのＣＩＮ２サンプルの異形成組織に隣接した正常上皮の染色画像である。

【図4C】図４Ｃは、本発明の他の実施形態に従ったＩＨＣ分析における図１Ａの一つとしての同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いたＣＩＮ３組織の異形成上皮の染色結果を示す図である。

【図4D】図４Ｄは、本発明の他の実施形態に従ったＩＨＣ分析における図１Ｃの一つとしての同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた他のＣＩＮ３組織の異形成上皮の染色結果を示す図である。

【図5A】図５Ａは、本発明の一つの実施形態に従ったＩＣＣ分析における抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた、液体溶液における、ＡＳＣＵＳと診断された臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図5B】図５Ｂは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析における抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた図５Ａにおいて示したのと同じ臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図6A】図６Ａは、本発明の一つの実施形態に従ったＩＣＣ分析における抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた、液体溶液における、ＣＩＮ２と診断された臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図6B】図６Ｂは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析における抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた、液体溶液における、ＣＩＮ２と診断された他の臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図7A】図７Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析における抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた、液体溶液における、ＣＩＮ３と診断された臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図7B】図７Ｂは、図７Ａにおいて用いたものと同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた、液体溶液における、ＣＩＮ３と診断された臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図7C】図７Ｃは、図７Ｂにおいて用いたのと同じ臨床サンプル上で同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体で染色した他のＩＣＣ染色画像である。

【図7D】図７Ｄは、図７Ｂにおいて用いたのと同じ臨床サンプル上で同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体で染色した他のＩＣＣ染色画像である。

【図7E】図７Ｅは、図７Ｂにおいて用いたのと同じＣＩＮ３サンプル上であるが、本発明の他の実施形態に従った抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体で染色した他のＩＣＣ染色結果を示す図である。

【図7F】図７Ｆは、図７Ｅにおいて示したと同じＣＩＮ３サンプル上で同じ抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体で染色した他のＩＣＣ染色画像である。

【図7G】図７Ｇは、図７Ｂにおいて示したのと同じＣＩＮ３サンプル上であるがＩＣＣ分析において抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体で染色した染色結果を示す図である。

【図8】図８は、腺腫癌と診断され本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体で染色した臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図9A】図９Ａは、扁平内皮癌（ＳＣＣ）と診断され本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体で染色した臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図9B】図９Ｂは、図９Ａにおいて用いたのと同じＳＣＣサンプルで、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体で染色した染色結果を示す図である。

【図9C】図９Ｃは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いた図９Ａにおいて用いたのと同じＳＣＣサンプルの染色結果を示す図である。

【図10A】図１０Ａは、正常と診断され本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体で染色した臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図10B】図１０Ｂは、図６Ａにおいて用いたのと同じサンプルで、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体で染色した染色結果を示す図である。

【図11A】図１１Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体での他の子宮頸部かき取りサンプルの細胞質部分の染色を示す図である。

【図11B】図１１Ｂは、抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体での図１１Ａで用いたものと同じサンプルの核部分の染色を示す図である。

【図11C】図１１Ｃは、抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体での他の子宮頸部かき取りサンプルの細胞質部分の染色を示す図である。

【図12A】図１２Ａは、ＣＩＮ１と診断され本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析において抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体で染色した臨床サンプルの染色結果を示す図である。

【図12B】図１２Ｂは、同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた図１２Ａにおいて示したのと同じＣＩＮ１サンプルの他のＩＣＣ染色画像を示す図である。

【図12C】図１２Ｃは、同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた図１２Ａにおいて示したのと同じＣＩＮ１サンプルの他のＩＣＣ染色画像を示す図である。

【図12D】図１２Ｄは、図１２Ａにおいて示したのと同じＣＩＮ１サンプルであるが、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣにおける抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いて染色した染色結果を示す図である。

【図12E】図１２Ｅは、同じ抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた図１２Ｄにおいて示したのと同じＣＩＮ１サンプルの他のＩＣＣ染色画像を示す図である。

【図12F】図１２Ｆは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析における抗ｐ−１６マウスモノクローナル抗体を用いた図１２Ａにおいて示したのと同じＣＩＮ１サンプルの染色結果を示す図である。

【図13A】図１３Ａは、本発明の一つの実施形態に従った抗ＨＰＶ Ｌ１マウスモノクローナル抗体を用いたＨＰＶ Ｌ１を検出するドットプロット分析の結果を示す図である。

【図13B】図１３Ｂは、図１において用いたのと同じ抗ＨＰＶ Ｌ１抗体を用いたＨＰＶ Ｌ１を検出する他のドットプロット分析の結果を示す図である。

【図14A】図１４Ａは、本発明の他の実施形態に従った抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いたＨＰＶ Ｅ６を検出する図１３Ａに示したのと同じドットプロットを用いた結果を示す図である。

【図14B】図１４Ｂは、本発明の他の実施形態に従った図１４Ａにおいて用いたのと同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いたＨＰＶ Ｅ６を検出する図１３Ｂに示したのと同じドットプロットを用いた結果を示す図である。

【図15】図１５は、本発明の他の実施形態に従った抗ＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出する抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体でドットした図１３Ａおよび図１４Ａにおいて示したのと同じドットプロットの結果を示す図である。

【図16】図１６は、本発明の他の実施形態に従った様々なＨＰＶタンパク質および様々な細胞内因性タンパク質を検出する１０個の子宮頸部かき取りからの細胞溶解物上で行った抗体マイクロアレイ分析の平均蛍光強度の結果を示すグラフである。

【図17】図１７は、本発明の他の実施形態に従ったＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出する図１６において示した１０個の細胞溶解物サンプルのそれぞれに対する抗体マイクロアレイ分析の平均蛍光強度の結果を示す他のグラフである。

【図18】図１８は、本発明の他の実施形態に従ったＨＰＶ Ｅ７タンパク質および細胞ｐ１６ ＩＮＫ４ａタンパク質を検出する図１６において示した１０個の細胞溶解物サンプルのそれぞれに対する抗体マイクロアレイ分析の平均蛍光強度の結果を示す他のグラフである。

【図19】図１９は、本発明の他の実施形態に従ったＨＰＶ Ｌ１タンパク質および細胞ｐ５３タンパク質を検出する図１６において示した１０個の細胞溶解物サンプルのそれぞれに対する抗体マイクロアレイ分析の平均蛍光強度の結果を示す他のグラフである。

【図20】図２０は、本発明の他の実施形態に従ったＨＰＶ Ｅ７タンパク質およびＲｂタンパク質の細胞リン脂質を検出する図１６において示した１０個の細胞溶解物サンプルのそれぞれに対する抗体マイクロアレイ分析の平均蛍光強度の結果を示す他のグラフである。

【図21】図２１は、サンプルＳ２に対する抗体マイクロアレイ分析の蛍光強度結果を示す他のグラフである。

【図22】図２２は、本発明の他の実施形態に従った細胞ｐ２１ ＷＡＦ１およびｐ５３タンパク質を検出する図１６において示した１０個の細胞溶解物サンプルのそれぞれに対する抗体マイクロアレイ分析の平均蛍光強度の結果を示す他のグラフである。

【図23】図２３は、本発明の他の実施形態に従ったコーティングおよび検出に対する抗ＨＰＶ ラビットポリクローナル抗体を用いたＨＰＶ陰性血清サンプル（ＰＣＲによる）と比較した、ＳＣＣ（扁平上皮細胞癌）またはＨＰＶ陽性（ＰＣＲによる）と診断されたヒト血清サンプルにおけるＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ分析の結果を示す図である。

【図24】図２４は、コーティング抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｌ１マウスモノクローナル抗体、および検出抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｌ１ラビットポリクローナル抗体を用いた組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドウィッチビーズ分析の結果を示す図である。

【図25】図２５は、コーティング抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｅ６マウスモノクローナル抗体および検出抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｅ６ラビットポリクローナル抗体を用いた組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドウィッチビーズ分析の結果を示す図である。

【図26】図２６は、コーティング抗体としての抗ＨＰＶ１８ Ｅ６マウスモノクローナル抗体および検出抗体としての抗ＨＰＶ１８ Ｅ６ラビットポリクローナル抗体を用いた組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドウィッチビーズ分析の結果を示す図である。

【図27】図２７は、コーティング抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｅ７マウスモノクローナル抗体および検出抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｅ７ラビットポリクローナル抗体を用いた組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドウィッチビーズ分析の結果を示す図である。

【図28】図２８は、コーティング抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｅ６マウスモノクローナル抗体および検出抗体としての抗ＨＰＶ１６ Ｅ６ラビットポリクローナル抗体を用いた組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドウィッチビーズ分析の結果を示す図である。

【図29】図２９は、検出抗体としての抗ＨＰＶ１８ Ｅ６マウスモノクローナル抗体およびコーティング抗体としての抗ＨＰＶ１８ Ｅ６ラビットポリクローナル抗体を用いた組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドウィッチビーズ分析の結果を示す図である。

【図30A】図３０Ａは、金粒子を結合させた膜上にストリップしたラビット抗ＨＰＶ Ｌ１ポリクローナル抗体を用いたＨＰＶ Ｌ１組み換え型タンパク質（左から右へ８７５，４３５，０μｇ／ｍＬ）を検出するワンステップ側方流動分析の結果を示す図である。

【図30B】図３０Ｂは、図３０Ａにおいて示したのと同じストリップを用いた正常（ＨＰＶ陰性として既知）血清（右）と比較したＳＣＣ（扁平上皮細胞癌）患者（左）からのヒト血清サンプルにおけるＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出するワンステップ側方流動分析の結果を示す図である。

【図30C】図３０Ｃは、検出のために金粒子を結合させた膜上にストリップしたマウス抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＨＰＶ Ｅ６組み換え型タンパク質（左から右へ１０，２，０μｇ／ｍＬ）を検出するワンステップ側方流動分析の結果を示す図である。

【図30D】図３０Ｄは、図３０Ｃにおいて示したのと同じストリップを用いた正常（ＨＰＶ陰性として既知）血清（右）と比較したＳＣＣ（扁平上皮細胞癌）患者（左から第１および第２）からのヒト血清サンプルにおけるＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出するワンステップ側方流動分析の結果を示す図である。

【図30E】図３０Ｅは、検出のために金粒子を結合させた膜上にストリップした他のマウス抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＨＰＶ Ｅ６組み換え型タンパク質（左から右へ８７５，４３５，０μｇ／ｍＬ）を検出するワンステップ側方流動分析の結果を示す図である。

【図30F】図３０Ｆは、検出のために金粒子を結合させた膜上にストリップしたマウス抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体を用いたＨＰＶ Ｅ７組み換え型タンパク質（左から右へ０，６６０，６６，６．６，０．６６μｇ／ｍＬ）を検出するワンステップ側方流動分析の結果を示す図である。

【図30G】図３０Ｇは、図３０Ｆにおいて示したのと同じストリップを用いた既知のＨＰＶ陰性血清（右）と比較した既知の陽性ヒト血清サンプル（左）からのＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出するワンステップ側方流動分析の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

１．抗血清および抗ＨＰＶ抗体を生成し、モノクローナル抗体に対してハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために免疫原として用いるＨＰＶ組み換え型タンパク質
ＨＰＶ組み換え型タンパク質は、限定することはないが、Ｅ２，Ｅ６、Ｅ７，Ｌ１，Ｌ２等の初期遺伝子および／または後期遺伝子のＨＰＶタンパク質である、いずれかの種類のＨＰＶタンパク質であり、様々なＨＰＶ型からでよい。全長Ｅ６，Ｅ７および／またはＬ１ポリペプチド配列は、タンパク質精製間の望ましくない凝集化、タンパク質の不安定性、低度の発現、精製タンパク質の低い免疫原反応のために獲得および精製が非常に難しいと考えられている。例えば、多くの初期Ｅ６発癌タンパク質が、多くのシステインアミノ酸を有し、これによってＥ６発癌タンパク質の正しいトポグラフィー（地図）は、多くのジスルフィド結合特性の形成を必要とする。加えて、初期Ｅ６およびＥ７タンパク質の小ペプチドを用いた特定の免疫学的分析の結果、非常に低い分析特異性および感度となり、臨床的ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のツールとして望ましくない。したがって、本発明は、部分配列または全長配列のＨＰＶ発癌タンパク質を有する組み換え型ハイブリッドタンパク質等の組み換え型タンパク質を提供する。

【0017】

１）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ６初期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子の１５７アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた４７４塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ６タンパク質も得た。すべてのクローン化手順は、"Molecular Cloning", A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989において開示されたプロトコールに従って行う。加えて、ＨＰＶ１８ Ｅ６遺伝子もクローン化し、ＤＮＡ配列を確認した。

【0018】

２）ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ７初期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子の９９アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた２９４塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ７タンパク質も得た。加えて、異なるＨＰＶ型からのＥ７ ＤＮＡフラグメントも異なる臨床サンプルまたはソースからクローン化した。

【0019】

３）ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ７後期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｌ１遺伝子の５３１アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた１５９６塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ７タンパク質も得た。加えて、異なるＨＰＶ型からのＬ１ ＤＮＡフラグメントも異なる臨床サンプルまたはソースからクローン化した。

【0020】

ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の組み換え型Ｎ−末端フラグメントもＨｉｓタグした発現システムから得た。ＨＰＶ−１６ Ｌ１ Ｎ−末端組み換え型タンパク質の分子量は、約３４ｋＤである。Ｌ１ Ｃ−末端フラグメントも得た。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｌ１タンパク質も得て、抗血清、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対する免疫原として用いた。

【0021】

本願明細書で記載する１個以上の組み換え型タンパク質は、例えば、当該技術において既知の、大腸菌、酵母、バキュロウイルス、および／または哺乳動物細胞培養等における細菌発現システム、ウイルス発現システム、酵母発現システム、哺乳動物発現システム等の様々な適切なシステムにおいて発現する。ポリペプチドは、他の方法によって得ることができるが、本発明の実施形態は、それらの天然形である１個以上の組み換え型タンパク質を提供し、免疫学的分析におけるＨＰＶ感染したヒト対象の組織からの抗体に結合を確認するのに望ましい。例えば、ＧＳＴ，ＭＢＰ，またはＨｉｓタグしたＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１８ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１組み換え型タンパク質は、ＩＰＴＧ駆動誘導を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現した。タンパク質の発現を誘導後、タグＨＰＶ組み換え型タンパク質は、培養した細胞の溶解後の可溶画分から得て、約０．１〜１ｍｇ／ｍＬ以上の最終濃度まで精製した。組み換え型ＨＰＶタンパク質の純度は、ＰＡＧＥ分析を基にして９０％以上であると推測した。組み換え型ＨＰＶタンパク質は、臨床サンプルにおけるＨＰＶ抗体の存在を検出し、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を生成する免疫原としても用いた。

【0022】

本願明細書で記載する様々な発現ベクターにおける様々な組み換え型パピローマウイルスタンパク質を得る細胞培養液を、その後最大１リットルもしくは１０リットル、または１００リットル以上まで増やし、多量の精製する可溶組み換え型タンパク質を得た。細胞溶解後の可溶画分は、適切な発現システムで様々なクロマトグラフィーに通して、ＨＰＶ組み換え型タンパク質に沿って発現したタグに結合させた。その後、タグＨＰＶ組み換え型タンパク質をカラムから溶出し、１００ｍＬまたは１０ｍＬから１ｍＬまで濃縮した。精製可溶組み換え型ＨＰＶタンパク質をさらに濃縮し、中性ｐＨでの緩衝液またはＰＢＳ緩衝液で透析し、ＨＰＶタンパク質に対する抗血清を生成する免疫原として用いた。このように、可溶組み換え型ＨＰＶタンパク質を、可溶画分から精製し、ｉｎ ｖｉｖｏの性質のそのままの折り畳み状態に近いように折り畳んだ。

【0023】

高品質な精製組み換え型ＨＰＶタンパク質の獲得は、ＨＰＶ感染を検出する共通のエピトープまたは特定のエピトープを認識する様々な種類のモノクローナル抗体の生成において重要である。精製組み換え型ＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶ感染臨床サンプルからのＨＰＶ抗体への結合を確認するために試験した。したがって、この精製組み換え型ＨＰＶタンパク質は、抗血清を上げる免疫原として用いるのに適切であり、ｉｎ ｖｉｖｏのＨＰＶウイルス性タンパク質を認識できる抗体を生成する。

【0024】

２．抗ＨＰＶポリクローナル抗体生成
大腸菌において発現した組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１を精製、濃縮およびＰＢＳで透析し、免疫原として用いた。免疫付与を標準的なプロトコールにしたがって行った。得られた各血清をＥＬＩＳＡ分析によって試験し、その後定期的なブースティングおよび出血させた。適切な滴定量からの生成出血を収集した；処理した血清をタンパク質Ａカラムまたは親和カラムを介して免疫グロブリン（ｌｇ）精製を行うのに用いた。精製ｌｇＧをＨＰＶ免疫分析に対する抗ＨＰＶ抗体として用いた。

【0025】

モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗血清を獲得、精製および試験して、ＨＰＶ感染、細胞病変、炎症または癌疾患発展の発病に関係なくＨＰＶ感染を検出した。他の研究者は、抗ＨＰＶモノクローナル抗体を開発しようと試みたが、モノクローナル抗体の生成に十分なＨＰＶタンパク質の生成に失敗したため失敗してきた；彼らは免疫原が免疫原性でなかったため高い特異性を有するモノクローナル抗体の生成に失敗した；または、初期段階ＨＰＶ感染した臨床サンプルに存在するＨＰＶタンパク質の天然形を認識できない抗体を生成した。変異ペプチドに対して上昇するいくつかの抗体の未、後期段階子宮頸がんを認識できるが、それらの抗体が野生型ＨＰＶ天然タンパク質またはいずれかの初期段階ＨＰＶ感染かどうかは確証できない。加えて、後期段階ＨＰＶ検出は、疾患の医療介入および治療するには遅すぎる。

【0026】

本願明細書で記載する抗体の臨床的用途は、適切な臨床サンプルを用いて、ＥＬＩＳＡ分析、免疫細胞化学分析、免疫組織化学分析等のＨＰＶ免疫学的分析によって評価した。本発明の方法から得た新規のモノクローナル抗体および抗血清は、臨床サンプルに存在するＨＰＶウイルス性タンパク質に相互作用および結合することができ、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）等の初期段階細胞病変および後期段階ＨＰＶに関連した子宮頸癌を有することを確認する。本願明細書で記載するモノクローナル抗体および抗血清は、ＨＰＶに関連する発病および初期および後期の両方における子宮頸癌の発展を検出およびスクリーニングする有効なツールを提供し；疾患の進行に介入する手段および初期治療を提供する機械を提供する。

【0027】

３．ＨＰＶモノクローナル抗体の開発
大腸菌において発現した組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１を精製、濃縮およびＰＢＳで透析し、免疫原として用いた。マウスの免疫付与を標準的なプロトコールにしたがって行った。得られた各血清の滴定をＥＬＩＳＡ分析によって試験し、その後定期的なブースティングおよび出血させた。マウスの血清の滴定は最適となり、腫瘍細胞を有するマウスの脾臓細胞の融合を標準的なプロトコールにしたがって行った。融合細胞、例えばハイブリドーマ細胞のクローン化をさらに培養した。

【0028】

１）ハイブリドーマのスクリーニング
本発明において説明する、ｐａｎを有するハイブリドーマ細胞を生成し、様々なＨＰＶタンパク質に特異的に結合する抗ＨＰＶ抗体生成ハイブリドーマ細胞を得るため、ハイブリドーマクローンを、元の免疫原だけでなく陽性スクリーニングのさらなるＨＰＶタンパク質および陰性スクリーニングの無関係のタンパク質等の様々なタンパク質でスクリーニングした。例えば２個以上の精製ＨＰＶ組み換え型タンパク質を、各ハイブリドーマクローンに対してスクリーニングして、抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよび獲得し、こうして得られた各抗体生成ハイブリドーマ細胞株の特異性を試験および理解するために用いた。

【0029】

２）ハイブリドーマ細胞株ストック：免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡ，ＥＩＡおよび他の分析）によって判断した所定の陽性反応および所定の陰性反応を示すハイブリドーマ細胞株クローンを選択して単一細胞にクローン化した。各単一細胞クローンをその後、組織培養によって成長した。細胞数はｍＬ当たり百万に到達し、細胞を凍結して−８０°Ｃまたは強力ストックとして液体窒素においた。

【0030】

３）腹水生成：各ハイブリドーマ細胞株を組織培養において成長させ、マウスに腹水生成させるように注射した。腹水を収集して、タンパク質Ｇカラムによって免疫グロブリン精製に対して処理した。各ハイブリドーマ細胞株からの精製免疫グロブリンをイソタイプして、ＨＰＶ免疫学的分析に用いた。

【0031】

４．各抗ＨＰＶ抗体の特異性
一つの実施形態において、ＨＰＶ ＩＨＣ分析を行うキットを提供する。このキットは、抗原回復剤、前−抗体ブロッキング溶液、後−抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、二次抗体としてのＨＲＰもしくはビオチンまたは他の物質と結合した抗マウスまたは抗ラビット免疫グロブリン、二次抗体を検出する基質として用いる適切な化学物質を含む溶液を含む。

【0032】

抗原回復剤は、低いｐＨまたは中性ｐＨもしくは高いｐＨ緩衝液における溶液を含む。前−抗体ブロッキング溶液は、細胞が抗体に非特異的に結合するのをブロックする特定のタンパク質もしくはＢＳＡ、または血清または他の化学物質を含む。後−抗体ブロッキング溶液は、一次抗体の培養に用いるタンパク質または血清を含まない前−抗体ブロッキング溶液と同様の溶液である。ＨＰＶ抗体を含む溶液は、濃縮して、または試薬を準備して希釈する。抗ＨＰＶ抗体はまた、基質として用いた以下の適切な化学物質を検出するＨＲＰもしくはビオチン、または他の化学物質で直接タグを付ける。二次抗体を含む溶液は、濃縮して、または試薬を準備して希釈する。基質として用いる適切な化学物質を含む溶液は、１コンポーネントもしくは２コンポーネントとしてのＤＡＢ（３，３´−ジアミノベンジジン）、１コンポーネントもしくは２コンポーネントとしてのＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）基質または他の基質がある。一度子宮頸部組織を処理および固定したら、免疫化学（ＩＨＣ）分析を、一定時間抗原回復緩衝液でスライドガラス上の組織を沸騰させて行う。スライドガラスをその後室温まで冷却し、一定時間前−ブロッキング溶液でブロッキングし、その後ＨＰＶ抗体で培養した。その後、スライドガラスをＰＢＳもしくはＨ_２Ｏまたは他の溶液で３〜５回洗浄し、いずれかの未結合ＨＰＶ抗体を除去した。その後、スライドガラスを、例えば抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ等の二次抗体で培養し、検出のための適切な基質で培養した。例として、ＤＡＢは、ペルオキシダーゼまたは過酸化水素の存在下で酸化させ、その結果、茶色のアルコール溶解性沈殿物が酵素活性状態で堆積する。沈殿物は、存在する酵素の量によって明茶色から暗琥珀色に色が変化する。顕微鏡で観察した琥珀色の沈殿物は、スライドガラス上の組織切片の細胞に存在するＨＰＶタンパク質とのＨＰＶ抗体の特異的な結合を示す。この分析は、結合反応が加速するように室温または高温で行う。このＨＰＶ ＩＨＣ分析は手で行う、またはＩＨＣオートメーションによって操作し、ｉｎ ｓｉｔｕでＨＰＶ感染およびＨＰＶ発癌タンパク質を検出する強力なツールを提供する。したがって、ＨＰＶ ＩＨＣ染色分析は、確認試験として非常に有効である。異形成細胞を特定するため、ＨＰＶ ＩＨＣ染色は、ＨＰＶ感染の状態および／またはＨＰＶ発癌タンパク質の発現に対するさらなる情報を提供する。したがって、子宮頸部異形成の様々な段階におけるＨＰＶ Ｅ６およびＥ７発癌タンパク質の過剰な発現は、ＣＩＮおよび／または子宮頸癌発展の進行を示す。

【0033】

サンプル選択および準備：本発明において提供する抗ＨＰＶ抗体が異なる段階のＣＩＮまたは癌からｉｎ ｓｉｔｕでＨＰＶタンパク質を検出できるかどうかを分析するため、ＩＨＣ分析上で試験する子宮頸部組織には、ＣＩＮ２（穏やかに見られる病変を有する子宮頸部上皮内癌ステージ２）およびＣＩＮ３（重度に見られる病変を有する子宮頸部上皮内癌ステージ３）、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ、子宮頸癌における最も一般的な癌）および腺癌（ＡＤＣ、腺型の癌）からなる子宮頸癌からなる。４ミクロンに切断したパラフィン組織ブロックをスライドガラス上に置き、６０°Ｃで一晩焼いた。脱パラフィン水和物の切片を脱マスクし、その後標準的なＩＨＣ染色手順に従った。ＨＰＶタンパク質に対する精製モノクローナル抗体を希釈して、一次抗体として用いた。染色手順は、二次抗体溶液、洗浄後、各切片に対して適切な試薬を入れた。切片ができたらすぐ、精製水にスライドガラスを浸し、ヘマトキシン、脱水物で切片を対比染色し、カバースリップを載せた。

【0034】

組織マイクロアレイ。一つの反応における多くのサンプルに対して均一な分析を行うため、組織マイクロアレイを生成して一つのスライドガラス上の多くのサンプルにスポットした。ＣＩＮ２，ＣＩＮ３または浸潤癌からの全８４サンプルを処理するため、３個の組織マイクロアレイを準備した：一つは３０個の独立したＣＩＮ２およびそれらの周囲の正常上皮を含み、一つは３０個の独立したＣＩＮ３およびそれらの周囲の正常上皮を含み、一つは１２個の子宮頸部扁平上皮細胞癌およびそれらの周囲の正常上皮に相当するものをおよび、１２個の腺癌およびそれらの正常上皮に相当するもの、肉眼的腫瘍境界から少なくとも１５ｍｍ離れた膣または子宮頸部粘膜を含む。内癌形成に対する一つの組織スポットおよびその正常なものを示す他のスポットを各ＣＩＮに対して取った。浸潤癌の場合、腫瘍組織の２スポットおよび正常部分の１スポットを取った。２ｍｍ周囲の阻止スポットを、ＨＰＶ ＤＮＡタイピングに対する組織スライドを取った後に対応するパラフィン固定組織ブロックから回収した。

【0035】

ＨＰＶ ＤＮＡテスト。各場合に対するＨＰＶ ＤＮＡタイピングは、ナイロン膜上に１３型特異性のオリゴヌクレオチドを有する。Ｅａｓｙ Ｃｈｉｐ（登録商標）ＨＰＶブロットまたはＨＲ−ＨＰＶチップを用いた修飾ＭＹ１１／ＧＰ６＋ＰＣＲ逆ブロット分析によって特定した。全細胞ＤＮＡを増幅するための核酸のソースとして、またその後、検出するためハイブリダイゼーションして用いた。

【0036】

ＩＨＣスコアおよびデータの解釈。組織マイクロアレイスライド上の各ドットの染色は、顕微鏡下で有資格の解剖病理学者によって観察した。腫瘍細胞または異形成細胞の範囲は、スコア０〜３の染色強度で染色した細胞のパーセンテージで示した。対応する異形成または腫瘍から１５ｍｍ離れた隣接する正常上皮または正常組織もスコアした。すべてのデータは、有資格の病理学者によってスコアした。染色した１０％は、分析の陽性または陰性を画定するためにカットした。すべてのデータを表１〜１７において示す。

【0037】

浸潤子宮頸癌におけるＨＰＶタンパク質の検出を行うため、最も一般的な子宮頸癌と思われる扁平内皮細胞癌（ＳＣＣ）の組織をＨＰＶ ＩＨＣ分析を行うように処理した。図１Ａ〜１Ｄは、マウスモノクローナルＨＰＶ Ｅ７抗体を用いた扁平上皮細胞癌組織のＩＨＣ染色を示す。図１Ａは、抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した組織マイクロアレイからのＳＣＣ組織の画像である。図１Ｂは、図１ＡからのＳＣＣ対象の正常上皮（腫瘍組織から１５ｍｍ離れた）の画像を示す。図１Ｃは、同じ抗Ｅ７抗体を用いてＩＨＣによってマイクロアレイ染色した組織からの他のＳＣＣサンプルの画像である。図１Ｄは、図１Ｃからの細胞質において同じ抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって染色した腫瘍細胞の拡大画像である。結果は、Ｅ７発癌タンパク質の発現は腫瘍細胞またはＳＣＣ組織において検出できることを示す。黒色矢印は、腫瘍細胞におけるＥ７タンパク質の特異的な染色を示し、白色矢印は、染色されていない正常細胞を示す。これらの結果は、ＳＣＣ子宮頸部組織からのＨＰＶタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの存在がＩＨＣ分析において用いるマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって検出できることを示す。

【0038】

他の型の浸潤子宮頸癌におけるＨＰＶタンパク質の検出を行うため、図２Ａ〜２Ｃは、同じマウスモノクローナルＨＰＶ Ｅ７抗体を用いた子宮頸部腺癌のＩＨＣ染色を示す。結果は、Ｅ７発癌タンパク質の発現は、腺癌組織の腫瘍細胞において検出できることを示す。黒色矢印は腫瘍細胞におけるＥ７タンパク質の特異的な染色を示し、白色矢印は染色されない正常細胞を示す。図２Ａは、図１において示したのと同じ抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体を用いてＩＨＣによって染色した腺腫内癌（ＡＤＣ）サンプルの腫瘍細胞の画像である。図２Ｂは、図２ＡからのＡＤＣサンプルの正常上皮（腫瘍から１５ｍｍ離れた）に対応する画像である。図２Ｃは、図２Ａからの腺腫内癌腫瘍の細胞質染色の拡大画像である。拡大画像は、正常上皮または間質細胞等の他の細胞ではなく腫瘍細胞の細胞質において発現したＥ７タンパク質の場所を示す。これらのデータは、Ｅ７モノクローナル抗体によるＩＨＣ染色がＳＣＣにおいて見られる類似の染色パターンを示す腺腫内癌の主要細胞を検出することができることを示す。

【0039】

各浸潤癌の各対象からのＨＰＶ ＩＨＣ結果を分析するため、表１は、図１Ａ〜Ｄおよび図２Ａ〜２Ｃにおいて示した抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＣ，Ｎの後に％で示した、細胞質（Ｃ）および核（Ｎ）を染色するＩＨＣスコアした２４ケースの浸潤癌サンプルからのデータを示す。他の抗Ｅ７抗体、ＭＡｂｌおよびＭＡｂ７等の抗ＨＰＶ Ｅ６抗体および抗ＨＰＶ Ｌ１抗体等のさらなる抗ＨＰＶ抗体も同じ組織マイクロアレイ上で試験した。様々な抗ＨＰＶ抗体によるＩＨＣ染色をするため、他の抗ＨＰＶ抗体を用いた腫瘍細胞の細胞質染色からのＩＨＣスコアも示した。ＨＰＶ ＤＮＡタイピングの結果もその対応する場合に対して表において示した。

【0040】

表１において示したデータのように、核および細胞質の染色の両方が抗Ｅ７抗体によって染色したＳＣＣおよびＡＤＥ染色した腫瘍細胞のすべての対象において見られる。しかし、腫瘍細胞の核の染色と比較して、腫瘍細胞の細胞質における染色は多くない（染色パーセンテージ）。その隣接する正常上皮細胞におけるＨＰＶ Ｅ７タンパク質の検出は核においてのみ見られ、上皮細胞の細胞質においては見られない。細胞質の染色は、対応する正常な隣接細胞と比較して腫瘍細胞において最も区別できる。これらのデータは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質の発現がＳＣＣおよびＡＤＥ組織の腫瘍細胞の細胞質および核において検出されたことを示す。腫瘍細胞の細胞質において発現するが、正常な隣接する上皮および間質細胞において発現しないＥ７タンパク質の局在化は腫瘍特異性を示す。抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって検出した正常な隣接する上皮および腫瘍細胞の核に存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質は、発癌タンパク質が発現したＨＰＶ感染を示す。同様の染色パターンは、表１において示すように他のＨＰＶ抗体を用いたときにも見られた。データは、本願明細書で記載するＨＰＶ ＩＨＣ分析は、子宮頸がん組織の腫瘍細胞に存在するＥ６，Ｅ７等のＨＰＶ初期遺伝子およびＬ１等の後期遺伝子タンパク質を検出できることを示す。

【0041】

ＨＰＶ ＩＨＣの結果をＨＰＶ ＤＮＡタイピングと比較すると、抗Ｅ７抗体は、試験するサンプルに存在するすべてのＨＰＶ型と陽性反応する。例えば、本願明細書で記載する抗Ｅ７モノクローナル抗体は、癌に関連するＨＰＶ型（高リスクＨＰＶ型）である、少なくともＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−４５などによって１個のＨＰＶ感染を検出できる。１個の抗Ｅ７モノクローナル抗体はまた、高リスク、低リスク、および非発癌タンパク質α−パピローマウイルス等のＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５９などの組み合わせ等の２個以上のＨＰＶ型によるＨＰＶ感染も検出する。しかし、多くのＨＰＶ型による感染には、少なくとも１個の型が高リスクＨＰＶ型である。これらのデータは、本発明において説明する抗Ｅ７抗体が型に特異的でなく、子宮頸癌における最も一般的な高リスクＨＰＶ型からのＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出する強力なツールを提供する。

【0042】

重度の異形成子宮頸部組織（ＨＳＩＬ；重度扁平上皮内病変、ステージ３）を有する非浸潤におけるＨＰＶタンパク質の検出を行うため、図３は、同じマウスモノクローナルＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＣＩＮ３組織のＩＨＣ染色を示す。結果は、Ｅ７発癌タンパク質の発現がステージ３のＣＩＮ組織において検出されることを示す。黒色矢印は異形成細胞におけるＥ７タンパク質の特異的な染色を示し、白色矢印は染色されていない正常細胞を示す。図３Ａは、浸潤子宮頸部組織に対して図１および図２において示したのと同じ抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＩＨＣによって染色した子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ３）組織の異形成細胞の画像である。図３Ｂは、図３ＡのＣＩＮ３組織の隣接する正常上皮の画像である。これらの結果は、ＣＩＮ３子宮頸部組織からのＨＰＶ Ｅ７タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕの存在は、本願明細書で記載するＩＨＣ分析において用いたマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって検出できることを示す。

【0043】

【表1】

【0044】

表２は、ＣＩＮサンプルのパップスミアによって確認した３０個のヒト対象からのＨＰＶ ＩＨＣ結果を示す：抗Ｅ７抗体で染色したＭ，Ｃ，Ｎの後に％で示す細胞膜（Ｍ），細胞質（Ｃ），および核（Ｎ）の染色）。さらなる抗ＨＰＶ抗体には、ＭＡｂ１およびＭＡｂ７等の抗ＨＰＶ Ｅ６抗体および抗ＨＰＶ Ｌ１抗体も同じ組織マイクロアレイ上で試験する。様々な抗ＨＰＶ抗体によるＩＨＣ染色を行うため、他のＨＰＶ抗体を用いた腫瘍細胞の細胞質染色からのＩＨＣスコアも示した。ＨＰＶ ＤＮＡタイピングの結果も対応する場合に対して表に示した。この結果は、異形成細胞の核よりも細胞質において多くの染色が見られることを示す。浸潤癌組織において以前見られたように、その隣接する正常上皮細胞におけるＨＰＶ Ｅ７タンパク質は核においてしか見られず、上皮細胞の細胞質においては見られなかった。細胞質の染色は、対応する正常な隣接細胞と比較して異形成細胞において最も区別できる。異形成の細胞質において発現するが正常な隣接する上皮および間質細胞において発現しないＥ７タンパク質の局在化はＨＳＩＬ特異性を示す。これらのデータは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質の発現がＣＩＮ３組織の異形成細胞の細胞質および核において検出されたことを示す。

【0045】

抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって検出した正常な隣接する上皮および異形成細胞の核に存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質は、発癌タンパク質が発現したＨＰＶ感染を示す。異形成細胞の細胞質において検出されるＨＰＶ Ｅ７タンパク質の高レベルの発現の場合、異形成の進行のリスクを示唆する。同様の染色パターンは、他のＨＰＶ抗体を用いたときにも見られた。データは、本願明細書で記載するＨＰＶ ＩＨＣ分析は、子宮頸がん組織の腫瘍細胞に存在するＥ６，Ｅ７等のＨＰＶ初期遺伝子およびＬ１等の後期遺伝子タンパク質を検出できることを示す。

【0046】

ＨＰＶ ＩＨＣの結果をＨＰＶ ＤＮＡタイピングと比較すると、抗Ｅ７抗体は、試験するサンプルに存在するすべてのＨＰＶ型と陽性反応する。例えば、本願明細書で記載する抗Ｅ７モノクローナル抗体は、癌に関連するＨＰＶ型（高リスクＨＰＶ型）である、少なくとも１個のＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−５８などによって１個のＨＰＶ感染を検出できる。１個の抗Ｅ７モノクローナル抗体はまた、最も一般的な高リスクＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−５８などの組み合わせ等の２個以上のＨＰＶ型によるＨＰＶ感染も検出する。これらのデータは、抗Ｅ７抗体が型に特異的でなく、ＣＩＮ３組織における最も一般的な高リスクＨＰＶ型からのＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出する強力なツールを提供する。

【0047】

【表2】

【0048】

わずかな異形成（ＣＩＮ２のステージ２）を有するＨＳＩＬにおけるＨＰＶタンパク質の検出を行うため、図４は、マウスモノクローナルＨＰＶ Ｅ６抗体を用いたＣＩＮ２組織のＩＨＣ染色を示す。結果は、Ｅ６発癌タンパク質の発現がＣＩＮのステージ２における初期に検出されることを示す。図４Ａは、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いた免疫細胞分析染色（ＩＨＣ）によって染色した子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）組織の異形成細胞の画像である。図４Ｂは、図４ＡのＣＩＮ２サンプルの異形成組織からの隣接する正常上皮の画像である。図４Ｃは、同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した他のＣＩＮ２サンプルの異形成上皮の画像である。図４Ｄは、図４Ｃにおける異形成上皮の拡大画像である。黒色矢印は異形成細胞におけるＥ６タンパク質の特異的な染色を示し、白色矢印は染色されていない正常細胞を示す。ＣＩＮ３におけるＣＩＮ２の同様の染色パターンは、異形成細胞の細胞質において発現するが、正常上皮または間質細胞等の他の細胞においては発現しないＥ６タンパク質の局在化を示す。これらの結果は、ＣＩＮ２子宮頸部組織からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕの存在は、本願明細書で記載するＩＨＣ分析において用いたマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって検出できることを示す。

【0049】

ＣＩＮ２の各対象からのＨＰＶ ＩＨＣ結果を分析するため、表３は、抗Ｅ７抗体で染色したＭ，Ｃ，Ｎの後に％で示す細胞膜（Ｍ），細胞質（Ｃ），および核（Ｎ）の染色に対するＩＨＣスコアを有するＣＩＮサンプルの３０個の場合からのデータを示す。さらなる抗ＨＰＶ抗体には、ＭＡｂ１およびＭＡｂ７等の抗ＨＰＶ Ｅ６抗体および抗ＨＰＶ Ｌ１抗体も同じ組織マイクロアレイ上で試験する。表３は、様々な抗ＨＰＶ抗体によるＩＨＣ染色を行い、他のＨＰＶ抗体を用いた形成細胞の細胞質染色からのＨＰＶ ＤＮＡタイピングおよびＩＨＣスコアの結果も示した。核染色は試験するすべてのＣＩＮ２サンプルの異形成において見られたが、抗Ｅ６または抗Ｅ７抗体による細胞質の染色は特定の部分しか見られなかった。この結果は、ＣＩＮ２において見られる異形成細胞の細胞質よりも核に多くの染色が見られることを示す。

【0050】

【表3】

【0051】

ＳＣＣ，ＡＤＣ，およびＣＩＮ３において、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質は、内皮細胞の核においてのみ見られ細胞質においては見られない隣接する正常内皮細胞において見られることを示す。抗Ｅ６タンパク質を用いたＣＩＮ２における細胞質の染色は、対応する正常な隣接細胞と比較して異形成細胞において最も区別できる。異形成の細胞質において発現するが正常な隣接する上皮および間質細胞において発現しないＥ６タンパク質の局在化はＨＳＩＬ特異性を示す。これらのデータは、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質の発現がＣＩＮ２組織の異形成細胞の細胞質および核において検出されることを示す。異形成細胞お細胞質において検出されるＨＰＶ Ｅ６タンパク質の高レベルの発現の場合、異形成進行を示唆する。Ｅ６，Ｅ７等の初期タンパク質およびＬ１等の後期タンパク質は、本願明細書で記載するＨＰＶ ＩＨＣ分析によってＣＩＮ２異形成細胞において検出できる。

【0052】

ＨＰＶ ＩＨＣおよびＨＰＶ ＤＮＡタイピングの結果を比較すると、抗Ｅ７抗体は、試験するサンプルに存在するすべてのＨＰＶ型と陽性反応する。例えば、本願明細書で記載する抗Ｅ７モノクローナル抗体は、癌に関連するＨＰＶ型（高リスクＨＰＶ型）である、少なくとも１個のＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８などおよび、高リスクＨＰＶ型でないＨＰＶ６およびＨＰＶ５３によって１個のＨＰＶ感染を検出できる。１個の抗Ｅ７モノクローナル抗体はまた、最も一般的な高リスクＨＰＶ型および低リスクＨＰＶ型であるＨＰＶ６，ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−６６，ＨＰＶ−６８などの２個以上のＨＰＶ型によるＨＰＶ感染も検出する。これらのデータは、本発明において説明する抗Ｅ７抗体が型に特異的でなく、ＣＩＮ２組織における一般的な高リスクＨＰＶ型および低リスクＨＰＶ型からのＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出することができる。発癌タンパク質の発現の結果である異形成細胞の形成は、異なるＨＰＶ型の変化よりも可能である。この結果は、細胞質部分における検出不可能な発癌タンパク質を有する高リスク型による感染に対して起こる回復を説明する。したがって、本願明細書で記載するＨＰＶ ＩＨＣ分析は、ＨＰＶ感染の検出および異形成進行の特定に対する臨床情報を提供する。

【0053】

細胞質染色は、対応する正常細胞と区別可能な異形成細胞においてのみ見られるため、細胞質染色は異形成進行における分析を行うのに用いた。異なる段階のＣＩＮまたは癌組織における異形成細胞の特異的な細胞質染色を比較するため、表１〜３からのデータをさらに分析性能を得るために分析した。各対象からの染色１０％以上のパーセンテージは陽性と考え、さもなければ１０％未満のサンプルに対しては陰性であるとする。

【0054】

【表4】

【0055】

【表5】

【0056】

表４において示したデータのように、分析の陽性率は、ＣＩＮ２，ＣＩＮ３およびＳＣＣまたはＡＤＥそれぞれに対してＣＩＮの重度で３８％、５２％、１００％まで増加する。陽性的中率（ＰＰＶ）および陰性的中率（ＮＰＶ）も表において示し、細胞質のパーセンテージ染色を用いて分析特異性を示す。ＨＰＶ Ｅ７の発現を示すため、発癌タンパク質は他の抗Ｅ７モノクローナル抗体によって検出し、同じ組織マイクロアレイを試験して、表５において示し、ＣＩＮ２，ＣＩＮ３，ＳＣＣおよび腺癌それぞれに対して陽性率７２％，４８％，６７％，８３％を有する他のＥ７抗体の分析性能を示した。陽性的中率（ＰＰＶ）および陰性的中率（ＮＰＶ）は、この抗体を用いた分析特異性が良くないことを
示す。

【0057】

【表6】

【0058】

【表7】

【0059】

ＨＰＶ Ｅ６発癌タンパク質の発現の評価は抗Ｅ６モノクローナル抗体によって検出し、同じ組織マイクロアレイを試験し、２個の抗Ｅ６抗体の分析性能を示す表６および７において示す。データが示すように、浸潤癌サンプルからのＣＩＮ２、ＣＩＮ３および腫瘍細胞からの異形成細胞の細胞質において発現するＥ６タンパク質は、本発明において記載する抗Ｅ６抗体によって検出できる。ＣＩＮの重度で増加する抗Ｅ７ ＩＨＣ分析の陽性率を示す同じ傾向が抗Ｅ６抗体を用いた分析においても見られる。２個の抗Ｅ６抗体は、ＣＩＮの重度に対して分析の陽性率が増加する同じ傾向を示すが、１個の抗Ｅ６抗体はもう一方よりも良い分析性能を与える。ＭＡｂ１は、ＭＡｂ７投与から異なるエピトープを認識でき、異なる分析性能を与える。しかし、両方のモノクローナル抗体は、表において示すように高い陽性的中率（ＰＰＶ）および高い陰性的中率（ＮＰＶ）を与える。抗Ｅ７抗体を用いたＩＨＣ分析の全陽性的中率（ＰＰＶ）は、抗Ｅ６抗体を用いるよりも高い。Ｅ７タンパク質は子宮頸癌の初期検出に対するバイオマーカーとして機能するように初期に発現することができる。

【0060】

異なる段階のＣＩＮに存在するＬ１ウイルス性タンパク質の発現を検出するため、同じ組織マイクロアレイも抗Ｌ１抗体を用いてＩＨＣ分析上で試験した。細胞質のＬ１染色からのＩＨＣスコアもすべてのサンプル上の陽性率を分析して得た。異なる段階のＣＩＮにおけるｉｎ ｓｉｔｕで発現したＨＰＶ初期および後期タンパク質の相互関係を調べるため、表８は、ＣＩＮ２，ＣＩＮ３および浸潤癌に対する細胞質におけるＥ７発現およびＬ１発現のＩＨＣ分析の陽性率を示す。Ｅ７は子宮頸癌の初期検出に対する良いバイオマーカーであると考えられ、本発明において記載したＨＰＶ ＩＨＣ分析を用いて様々な段階のＣＩＮおよび浸潤癌組織におけるＥ７およびＬ１発現の相互関係を比較する。ＣＩＮサンプルのＬ１ ＩＨＣ陽性に対して、表８において示すように、ＣＩＮ２の約６０％（１５のうち９）、ＣＩＮ３の５８％（１９のうち１１）がＥ７ ＩＨＣ分析で陽性を示す。浸潤癌サンプルのＬ１細胞質陽性に対して、ＳＣＣ（１１のうち１１）および腺癌（１０のうち１０）の両方の１００％がＥ７細胞質陽性であり、癌進行のＥ７発現の１００％の相互関係を示す。データは、ＣＩＮ２／３のＬ１およびＥ７の細胞質陽性の両方が、ＩＨＣ分析でそれらのＬ１陽性であるがＥ７陰性であるものと比較してさらなる異形成進行にリスクが高いことを示す。

【0061】

表８は、細胞質におけるＥ７発現およびＥ６発現陽性のサンプルの相互関係を示す。データが示すように、Ｅ７細胞質陽性サンプルに対して、ＣＩＮ２の約４５％（１１のうち５）、ＣＩＮ３の５７％（１４のうち８）がＥ６細胞質発現で陽性を示すが、１００％のＳＣＣ（１１のうち１１）または９０％の腺癌（１０のうち９）がＥ６細胞質発現を示す。これらのデータは、Ｅ６が初期異形成の間はＥ７よりも発現するが、後期段階の子宮頸癌においては共に発現することを示す。

【0062】

【表8】

【0063】

一つの反応におけるサンプルのすべての段階に対する均一な分析条件を得るため、組織マイクロアレイを生成して同じスライドガラス上にＣＩＮ２，ＣＩＮ３および浸潤癌からの多くのサンプルをスポットした。２個の組織マイクロアレイを準備した：一つは１０個の独立したＣＩＮ２，ＣＩＮ３およびＳＣＣおよびそれらの周囲の正常上皮を含み、一つは１０個の独立したＣＩＮ２，ＣＩＮ３およびＡＤＥおよびそれらの周囲の正常上皮を含む。ＨＰＶ ＩＨＣ分析は、ＨＰＶに関連する異形成または子宮頸癌に特異的であることを確認するため、様々な正常ヒト組織からの９０以上のサンプルを有するさらなる組織マイクロアレイも試験して、ＨＰＶ ＩＨＣ分析の陰性対象として用いた。抗Ｅ６および抗Ｅ７抗体を用いた同じＨＰＶ ＩＨＣ分析は、上述したようにＩＨＣ染色パーセンテージを得るためにこれらの組織マイクロアレイ上に用いた。核および／または細胞質における１０％以上のＩＨＣ染色は分析の陽性としてスコアした。

【0064】

【表9】

【0065】

【表10】

【0066】

まとめると、本願明細書で試験したすべての組織マイクロアレイからのＩＨＣデータを表９〜１４において示した。表９は、子宮頸癌進行および組織病変の間の様々な生検サンプル上のモノクローナル抗ＨＰＶ−Ｅ７を用いたＩＨＣ染色の結果を示す。表９におけるデータは、ｉｎ ｓｉｔｕでのＨＰＶ Ｅ７タンパク質の存在は、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３から扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）または腺癌（ＡＣＣ）等の浸潤癌組織まで様々な段階の子宮頸部組織で分析の陽性率が増加して検出できる。ＣＩＮ２およびＣＩＮ３それぞれのサンプルに対して約７２％および９０％の陽性率である。癌組織（ＳＣＣおよびＡＤ）に対して、１００％のサンプルが抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いてＩＨＣによって陽性に染色し、１００％の癌がＨＰＶ発癌タンパク質を発現することを示す。これらのデータは、本発明において記載するＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＩＨＣ分析は、様々な段階における組織からの子宮頸癌の診断を確認する強力なツールを提供することを示す。

【0067】

分析性能を得るため、表９からのデータをさらに分析した。表１０は、ＣＩＮ２陰性サンプルとして正常のヒト組織を用いた表９からのＩＨＣ染色結果のまとめを示す。データは、抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＩＨＣ染色方法がＣＩＮ２＋に対して８７％の重度および９２％の特異性のＩＨＣ分析を提供することを示す。これらのデータは、子宮病変ＣＩＮ２以上であることを確認するためＨＰＶタンパク質を検出するのに有効である。

【0068】

データをさらに分析するため、表１１は、本発明において記載した抗ＨＰＶ Ｅ７抗体の使用が９５％の重度、９２％特異性および９３％の陽性的中率および９５％の陰性的中率を有するＣＩＮ３＋（ＣＩＮ３および浸潤癌を含む）の免疫組織化学分析を提供することを示す表９および表１０からの免疫組織化学染色結果のまとめを示す。これらのデータは、この分析が、異なる段階の子宮頸部病変を確認するＨＰＶタンパク質を検出する臨床用途に有効であることを示唆する。

【0069】

【表11】

【0070】

Ｅ６タンパク質の発現が本発明において記載した抗Ｅ６抗体を用いた免疫組織化学分析によって検出できるか確認するため、同じ組織マイクロアレイを、抗Ｅ６抗体を用いたＩＨＣ分析上で行った。例示的な他のＨＰＶ免疫組織化学分析として、表１２〜１４は、抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す。データが示すように、ＨＰＶ抗Ｅ６は、ＨＰＶ抗Ｅ７に匹敵する免疫組織化学の結果を与える。

【0071】

表１２は、子宮頸癌進行および組織病変の間の様々な生検サンプル上のマウス抗ＨＰＶ−Ｅ６抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す。データは、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質が、免疫組織化学分析において用いるマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体によって検出できることを示す。ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕでの存在は、様々な段階の子宮頸部組織から検出できる。データが示すように、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質は、ＣＩＮ，ＣＩＮ３から扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）または腺癌（ＡＤ）等の子宮頸部組織までで陽性率が増加してサンプルに存在する。ＣＩＮ２およびＣＩＮ３のサンプルに対してそれぞれ約６５％および７０％の陽性率である。癌組織に対して、９６％のＳＣＣ組織サンプルが抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いた免疫組織化学によって陽性に染色するが、ＡＤサンプルの７１％しか陽性に染色せず、ＨＰＶ Ｅ６発癌タンパク質はＡＤよりもＳＣＣにおいてより支配的に発現することを示す。これらのデータは、本発明において記載したＨＰＶ Ｅ６抗体を用いた免疫組織化学分析は、様々な重症度における組織からの子宮頸部組織の診断を確認するためのツールを提供することを示す。

【0072】

【表12】

【0073】

【表13】

【0074】

データをさらに分析するため、表１３は、表１１および１２からのＩＨＣ染色結果のまとめを示す。データが示すように、抗ＨＰＶ Ｅ６抗体の使用は、ＣＩＮ２＋に対して７３％の重度、８７％の特異性の免疫組織化学分析を与える。これらのデータは、この分析が、異なる段階の子宮頸部病変を確認するＨＰＶタンパク質を検出する臨床用途に有効であることを示唆する。

【0075】

【表14】

【0076】

データをさらに分析するため、表１４は、本発明において記載した抗ＨＰＶ Ｅ６抗体の使用が７７％の重度、９２％の特異性および９１％のＰＰＶおよび７９％のＮＰＶを有するＣＩＮ３以上の免疫組織化学分析を提供することを示す表１３からの免疫組織化学染色結果のまとめを示す。データは、この分析が、異なる段階の子宮頸部病変を確認するＨＰＶタンパク質を検出する臨床用途に有効であることを示唆する。
５．ＨＰＶ ＩＣＣ分析

【0077】

サンプル準備：標準的な従来のパップスメアサンプルおよび液体細胞サンプルの２種類のサンプルをＩＣＣ分析に用いる。スライドガラス上の直接的なスメアから収集した子宮頸部かき取り細胞または液体溶液を２つに分け、一つは細胞パパニコロー染色、もう一つは本発明において記載したＨＰＶ抗体を用いた細胞組織化学染色とした。パパニコロー染色からの結果であるパップスメアに対して、サンプルを０〜１７にスコアし、（１）〜（３）を正常、（４）およびそれ以上を異常と考えた。例えば、ＬＳＩＬ：軽度扁平上皮内病変、ＨＳＩＬ：重度扁平上皮内病変、ＣＩＮ１：子宮頸部上皮内癌形成、ＣＩＮ２：より悪性となる病変を伴う子宮頸部上皮内癌形成、ＣＩＮ３：異形成を伴う子宮頸部上皮内癌形成がある。浸潤癌には、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、腺癌（ＡＤＣ）およびその他がある。例えば、異常細胞は未確定で、ＡＳＣＵＳ：異型扁平上皮細胞、パップスメアにおいて異常または非典型的な細胞は、不合理であり未確定である。未確定な程度のＡＧＵＳ：異型腺癌細胞がある。異常細胞の特定に対して、ＨＰＶ ＩＣＣ染色は、ＨＰＶ感染および／またはＨＰＶ発癌タンパク質の発現の状態に対してさらなる情報を提供する。したがって、ＨＰＶ ＩＣＣ染色分析はＬＳＩＬまたはＨＳＩＬ異常細胞を検出するのに非常に有効である、および／またはパパニコロー染色と比較してＡＳＣＵＳ，またはＡＧＵＳ等の未確定の異常細胞の検出に対して有効である。

【0078】

ＩＣＣ方法を用いた免疫分析の実施例として、子宮頸部かき取りからの細胞直接スライドガラス上にスメアした、または本願明細書で記載するＩＣＣ手順に従って液体溶液内に収集し、遠心分離し、洗浄し、免疫染色した。液体溶液によって収集した子宮頸部かき取りを製造装置に従って処理した。子宮頸部細胞をその後、サイトスピンまたは薄膜プレップ技術によって単層内に処理した。スライドガラス上の細胞の薄層を固定して、ＨＰＶ ＩＣＣプロトコールに従って抗ＨＰＶ抗体によって染色した。染色した細胞を顕微鏡で可視化した。

【0079】

一つの実施形態において、ＩＣＣ分析を行うキットを提供する。キットは、前−抗体ブロッキング溶液、後−抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、二次抗体としてのＨＲＰもしくはビオチンまたは他の物質と結合した抗マウスまたは抗ラビット免疫グロブリン、二次抗体を検出する基質として用いる適切な化学物質を含む溶液を含む。

【0080】

抗ＨＰＶ抗体は、基質として用いた以下の適切な化学物質を検出するＨＲＰもしくはビオチン、または他の化学物質で直接タグを付ける。前−抗体ブロッキング溶液は、細胞が抗体に非特異的に結合するのをブロックする特定のタンパク質もしくはＢＳＡ、または血清または他の化学物質を含む。後−抗体ブロッキング溶液は、一次抗体の培養に用いるタンパク質または血清を含まない前−抗体ブロッキング溶液と同様の溶液である。ＨＰＶ抗体を含む溶液は、濃縮して、または試薬を準備して希釈する。二次抗体を含む溶液は、濃縮して、または試薬を準備して希釈する。基質として用いる適切な化学物質を含む溶液は、１コンポーネントもしくは２コンポーネントとしてのＤＡＢ（３，３´−ジアミノベンジジン）、１コンポーネントもしくは２コンポーネントとしてのＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）基質または他の基質がある。

【0081】

一度子宮頸部かき取りからのヒト細胞をスライドガラス上の細胞の単層または薄層上に処理および固定したら、免疫組織化学（ＩＣＣ）分析を、ＨＰＶ抗体で培養する前に、一定時間、前抗体ブロッキング溶液でスライドをブロッキングすることによって行う。その後、スライドガラスをＰＢＳもしくはＨ_２Ｏまたは他の溶液で３〜５回洗浄し、いずれかの未結合ＨＰＶ抗体を除去した。その後、スライドガラスを、例えば抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ等の二次抗体で培養し、検出のための適切な基質で培養した。例として、ＤＡＢは、ペルオキシダーゼまたは過酸化水素の存在下で酸化させ、その結果、茶色のアルコール溶解性沈殿物が酵素活性状態で堆積する。沈殿物は、存在する酵素の量によって明茶色から暗琥珀色に色が変化する。顕微鏡で観察した琥珀色の沈殿物は、スライドガラス上の組織切片の細胞に存在するＨＰＶタンパク質とのＨＰＶ抗体の特異的な結合を示す。この分析は、結合反応が加速するように室温または高温で行う。このＨＰＶ ＩＣＣ分析は手で行う、またはＩＣＣオートメーションによって操作し、子宮頸部のかき取りからの上皮細胞において局所化したｉｎ ｓｉｔｕのＨＰＶ感染およびＨＰＶ発癌タンパク質をスクリーニングする強力なツールを提供する。

【0082】

ＨＰＶ ＩＣＣ分析は、内癌の初期、中間期および後期からの異なる段階の異形成に適用できる。これらのサンプルには、限定することはないが、例えば、ＬＳＩＬ，またはＣＩＮ１またはＡＳＣＵＳ等の初期段階、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３またはＨＳＩＬ等の中間期、またはＳＣＣもしくはＡＤＥまたは他等の後期がある。本願明細書で記載するＩＣＣ分析は、様々なサンプル、または様々な液体溶液における様々な段階からの、液体溶液における異なる段階のサンプルに対する染色に用いて、本発明におけるＩＣＣ分析を行うために準備した。

【0083】

ＨＰＶ ＩＣＣ分析は、例えば、ＡＳＣＵＳ（異型扁平上皮細胞；パップスメアにおける異常または異型細胞は不合理で重度が未確定である）またはＡＧＵＳ（異型腺癌）等の標準的な細胞パパニコロー染色によって未確定な異常細胞を特定するのに有効であり、ＨＰＶ ＩＣＣ分析はＡＳＣＵＳサンプルを試験するのに用いる。図５Ａにおいて示すように、ＩＣＣ分析の結果は、パパニコロー染色によってＡＳＣＵＳと診断された特定の子宮頸部かき取りは抗Ｅ６抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色できる。図５Ｂは、（パパニコロー染色によってＡＳＣＵＳと診断された）子宮頸癌かき取り細胞が抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色できることを証明する図５Aにおいて示したのと同じサンプルからのＩＣＣ分析の結果を示す。図５Ａおよび図５Ｂにおいて、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する異常細胞（黒色矢印で示した）は陽性に染色し、正常細胞（小さい核を有する大きい、不規則な形の細胞）は白色矢印で示したように陰性に染色した。図５Ａおよび図５Ｂの両方は、ＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７タンパク質の両方がパップスメアＡＳＣＵＳのサンプルからの異常細胞において検出されることを示す。これらの結果は、Ｅ６およびＥ７発癌タンパク質が発現したＨＰＶ感染細胞を含むこのＡＳＣＵＳサンプルが、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６およびマウス抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体をそれぞれ用いて、本発明において記載したＩＣＣ分析によってｉｎ ｓｉｔｕで検出できることを示す。

【0084】

ＨＰＶ ＩＣＣ分析がＨＳＩＬ細胞を検出できることを示すため、図６Ａは、他の液体溶液において準備したパパニコロー染色によってＣＩＮ２と診断された子宮頸部かき取り細胞が抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色できることを示す。図６Ａにおいて示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有するＣＩＮ２、ＨＳＩＬ異常細胞（黒色矢印で示した）は核および細胞質に対して陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７を用いて液体溶液の様々なソースにおいて、中間段階の腫瘍からの異常細胞において検出できることを示す。

【0085】

他の実施例として、図６Ｂは、他の液体溶液において準備した子宮頸部かき取り細胞の他のＣＩＮ２サンプルが抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色できることを示す。図６Ｂにおいて示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する互いに結合した形のＣＩＮ２、ＨＳＩＬ異常細胞（黒色矢印で示した）は核および細胞質に対して陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６を用いて液体溶液の様々なソースにおいて、中間段階の腫瘍からの異常細胞において検出できることを示す。

【0086】

本願明細書で記載するＩＣＣ分析が、液体溶液における中間期から後期の子宮頸部上皮内（ＣＩＮ）細胞を特定できることを示すため、異なる液体溶液におけるＣＩＮ子宮頸部かき取りサンプルも準備して本発明において記載するＩＣＣ分析を行った。図７Ａは、（パパニコロー染色によってＣＩＮ３と診断された）特定の子宮頸部かき取り細胞が抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色できることを示す。図７Ｂ〜７Ｅは、同じマウスモノクローナル抗体を用いた他のＣＩＮ３を示す。図において示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する互いに結合した形のＣＩＮ３、ＨＳＩＬ異常細胞（黒色矢印で示した）は核および細胞質に対して陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６を用いて液体溶液の様々なソースにおいて、中間期／後期の腫瘍からの異常細胞において検出できることを示す。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６を用いて液体溶液のＣＩＮ３からの異常細胞において検出できることを示す。

【0087】

図７Ｅは、抗ＨＰＶ Ｅ７を用いて図７Ｂにおいて示したのと同じＣＩＮ３サンプルからのＩＣＣ染色の結果を示す。図３Ｆは、同じ抗ＨＰＶ Ｅ７を用いて図３Ｅにおいて示したのと同じＩＣＣ染色の結果の他の画像を示す。図において示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する互いに結合した形のＣＩＮ３、ＨＳＩＬ異常細胞（黒色矢印で示した）は核および細胞質に対して陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７を用いて液体溶液の様々なソースにおいて、中間期／後期の腫瘍からの異常細胞において検出できることを示す。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６を用いて液体溶液のＣＩＮ３からの異常細胞において検出できることを示す。ｐ１６も後期の腫瘍において過剰に発現することを示すため、同じＣＩＮ３サンプルを、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色に用いた。図７Ｇは、図７Ｂ〜７Ｆにおいて示したのと同じＣＩＮ３サンプルから抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いてＩＣＣ染色した結果を示す。図において示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する互いに結合した形のＣＩＮ３、ＨＳＩＬ異常細胞（黒色矢印で示した）は核および細胞質に対して陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するｐ１６タンパク質が、中間期から後期の腫瘍からの異常細胞において検出できることを示す。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７およびｐ１６タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗体を用いて液体溶液のＣＩＮ３からの異常細胞において検出できることを示す。

【0088】

他の実施例として、本願明細書で記載するＩＣＣ分析が液体溶液における子宮頸癌細胞の検出に使用できることを示すため、異なる液体溶液における異なる子宮癌のＣＩＮ子宮頸部かき取りサンプルも準備して本発明において記載するＩＣＣ分析を行った。図８は、（パパニコロー染色によって腺癌と診断された）子宮頸癌細胞が抗Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色できることを示す。図８において、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する異常細胞（黒色矢印で示した）は陽性に染色した。互いに結合した形のＨＳＩＬ異常細胞も陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６を用いて液体溶液において、腺癌子宮頸部細胞において検出できることを示す。

【0089】

本願明細書で記載するＩＣＣ分析が液体溶液における他の種類の子宮頸癌の検出に使用できることを示すため、図９Ａは、他の種類の子宮頸癌細胞であるＳＣＣ（パパニコロー染色によって扁平上皮細胞癌と診断された）が抗Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いて陽性にＩＣＣ染色できることを示す。図９Ｂは、抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた同じＳＣＣサンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。図９Ｃは、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いた同じＳＣＣサンプルのＩＣＣ染色の結果を示す、図において示すように、ＨＳＩＬ ＳＣＣ細胞は、核および細胞質に対して陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６または抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いて液体溶液における様々な種類の子宮頸癌細胞から検出できることを示す。ｐ１６も後期の腫瘍において過剰に発現することを示すため、同じＳＣＣサンプルを、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色に用いた。図９Ｃは、図９Ａ〜９Ｂにおいて示したのと同じＳＣＣサンプルの抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色した結果を示す。これらの結果は、存在するＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびｐ１６タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗体を用いて液体溶液の異なる種類の子宮頸癌からの異常細胞においてｉｎ ｓｉｔｕで検出できることを示す。

【0090】

本願明細書で記載するＩＣＣ分析がＨＰＶ抗体の子宮頸部かき取り細胞のｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶタンパク質との特異的な結合であることを示すため、液体溶液からの正常な子宮頸部細胞も得てＩＣＣ分析上で試験した。図１０Ａは、液体溶液において準備したすべての子宮頸部かき取り細胞（パニコロー染色によって正常と診断された）が抗Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いてＩＣＣ染色陰性であったことを示す。図１０Ｂにおいて、同じサンプルを抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いてＩＣＣによって染色した。これらの結果は、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質もＨＰＶ Ｅ７タンパク質も正常な子宮頸部かき取り細胞からのｉｎ ｓｉｔｕで存在しないことを示し、ＩＣＣ分析は、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６またはマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いて陰性染色の結果を示す。したがって、本発明において記載するＩＣＣ分析は、本願明細書で記載するＨＰＶ特異的な抗体を用いてＨＰＶタンパク質を染色するための特異的な染色方法である。

【0091】

細胞レベルでＩＣＣ染色を行うため、図１１Ａは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いた液体溶液からの子宮頸部かき取り細胞の細胞質染色を示す。図１１Ｂは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７によって染色した図１１Ａからの同じサンプルの核染色を示す。図１１Ｃは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７を用いた他のサンプルからの細胞質染色の画像を示す。図において示すように、高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する異常細胞（黒色矢印で示した）は陽性に染色したが、正常細胞（大きい、小さい核を有する不規則な形の細胞）は白色矢印で示したように陰性に染色した。これらの結果は、互いに結合した形のＨＳＩＬ異常細胞も陽性に染色した。これらの結果は、ＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７タンパク質が本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６およびマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いて細胞質および／または核において検出できることを示す。

【0092】

ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７発癌タンパク質が特定のＬＳＩＬ（低度の扁平上皮細胞癌）またはＣＩＮ１（子宮内皮細胞癌、中程度の細胞異常）において発現することを示すため、図１２Ａ〜１２Ｃは、抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いて液体溶液においてＣＩＮ１と診断された臨床サンプルのＩＣＣ染色の結果を示す。図１２Ｂ〜１２Ｃは、同じ抗ＨＰＶ Ｅ６マウスモノクローナル抗体を用いた図１２Ａにおいて示したのと同じＩＣＣ染色の結果の他の画像である。図１２Ｄは、抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いた図１２Ａにおいて示したのと同じＣＩＮ１サンプルからのＩＣＣ染色の結果を示す。図１２Ｅは、同じ抗ＨＰＶ Ｅ７マウスモノクローナル抗体を用いて図１２Ｄにおいて示したのと同じＩＣＣ染色の結果の他の画像である。図において示すように、互いに結合した形または高いＮ／Ｃ（核／細胞質）比を有する異常なＬＳＩＬ、ＣＩＮ１細胞（黒色矢印で示した）は核および細胞質に対して陽性に染色した。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７タンパク質が、ＩＣＣ分析において本願明細書で記載するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７抗体を用いて液体溶液における初期の腫瘍において検出できることを示す。ｐ１６が初期の腫瘍において発現することを示すため、同じＣＩＮ１サンプルを、抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いたＩＣＣ染色に用いた。図１２Ｆは、図１２Ａ〜１２Ｅにおいて示したのと同じＣＩＮ１サンプルから抗ｐ１６マウスモノクローナル抗体を用いてＩＣＣ染色した結果を示し、ｐ１６タンパク質はこのＣＩＮ１サンプルの初期腫瘍において検出できないことを示す。これらの結果は、ｉｎ ｓｉｔｕで存在するＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７およびｐ１６タンパク質が、本願明細書で記載するＩＣＣ分析を用いてマウス抗ＨＰＶ Ｅ６または抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体を用いて初期の腫瘍からの異常細胞において検出できることを示す。

【0093】

免疫細胞（ＩＣＣ）分析はＨＰＶ感染を検出するだけでなく、ｉｎ ｓｉｔｕのＨＰＶ発癌タンパク質も検出する。したがって、ＩＣＣ分析だけで、または様々な特異的および一般的な抗ＨＰＶ抗体と組み合わせて、標準的なＨＰＶ ＤＮＡ試験またはパップスメア分析と比較して、ＨＰＶ検出に対する強力なツールとなる。

【0094】

【表15】

【0095】

表１５は、液体溶液における様々な子宮頸部かき取りサンプル上でマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いたＩＣＣ分析の結果を示す。表１５における結果は、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質が、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いた免疫細胞化学ＩＣＣ）分析によってスライドガラス上に固定した単離細胞上をｉｎ ｓｉｔｕで検出できることを示す。ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕの存在は、様々な液体溶液における様々な段階の子宮頸部かき取りサンプルから検出できる。同じ子宮頸部かき取りサンプルは、パップスメアとＩＣＣ染色結果を比較するため標準的なパパニコロー染色によっても処理した。表１５において示すように、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質は、それぞれ、正常な子宮頸部かき取り、ＡＳＣＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ，ＣＩＮ１，ＩＮ２／３サンプルにおいて徐々に高い陽性率で存在する。

【0096】

パップスメアでＣＩＮ２／３であると診断したサンプルに対しては約１００％の陽性率であり、パップスメアで正常であると診断したサンプルは約１４％しか同じ抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いたＩＣＣによって陽性染色しない。ＡＳＣＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプルに対して、約３３％〜５０％のこれらのサンプルが、表１５において示したＣＩＮ１，２／３サンプルに対して用いたのと同じ抗ＨＰＶ Ｅ６抗体によって陽性に染色し、これらのＡＳＣＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプル対象における発癌タンパク質の発現はさらなる癌進行となることを示す。ＡＳＣＵＳと診断されたパップスメアおよび陰性と診断されたＩＣＣ染色（抗ＨＰＶ Ｅ６）のサンプルに対して、進行した病変に発展するリスクが低い。

【0097】

【表16】

【0098】

【表17】

【0099】

表１６は、表１５からのＩＣＣ染色の結果のまとめを示す。データが示すように、本発明において説明する抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いたＩＣＣ染色方法は、ＣＩＮ２＋に対する９５％の感度および８３％の特異性のＩＣＣ分析を提供する。これらのデータは、この分析が、繰り返すパップスメア染色に伴って一般的な集団から子宮頸癌をスクリーニングするためにＨＰＶタンパク質を検出するのに有効である。ＨＰＶ検出ＩＣＣ分析の他の実施例として、表１７および表１８は、ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色の結果を示す。データが示すように、ＨＰＶ抗Ｅ７は、示したＨＰＶ抗Ｅ６に匹敵するＩＣＣ結果をああ得る。表１７は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質が、それぞれ、正常な子宮頸部かき取り、ＡＳＣＵＳ、ＡＳＣ−Ｈ，ＣＩＮ１，ＩＮ２／３サンプルにおいて徐々に高い陽性率で存在することを示す。パップスメアでＣＩＮ２／３であると診断したサンプルに対しては約９４％の陽性率であり、パップスメアで正常であると診断したサンプルは１１％しか同じ抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＩＣＣによって陽性染色しない。ＡＳＣＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプルに対して、約４０％のこれらのサンプルが、表１７において示したＣＩＮ１，２／３サンプルに対して用いたのと同じ抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって陽性に染色し、これらのＡＳＣＵＳまたはＡＳＣ−Ｈサンプル対象における発癌タンパク質の発現はさらなる癌進行となることを示す。ＡＳＣＵＳと診断されたパップスメアおよび陰性と診断されたＩＣＣ染色（抗ＨＰＶ Ｅ７）のサンプルに対して、進行した病変に発展するリスクが低い。データが示すように、本発明において説明する抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いたＩＣＣ染色方法は、ＣＩＮ２＋に対する９１％の感度および８９％の特異性のＩＣＣ分析を提供する。これらのデータは、この分析が、繰り返すパップスメア染色に伴って一般的な集団から子宮頸癌をスクリーニングするためにＨＰＶタンパク質を検出するのに有効である。

【0100】

【表18】

【0101】

【表19】

【0102】

本発明におけるＨＰＶ ＩＣＣ分析が初期の子宮頸癌のスクリーニングに適切かどうかを試験するため、パップスメアで正常なサンプルを用いてＨＰＶ ＤＮＡテストと比較した。表１９において示すように、試験したすべてのパップスメアで正常なサンプル（３２のうち３２）は、抗ＨＰＶ抗体を用いて陰性染色した。３２個のサンプルのうち、12サンプルは抗ＨＰＶ Ｅ６抗体で染色し、１６サンプルはＨＰＶ Ｅ７抗体で染色し、４サンプルは抗ＨＰＶ Ｌ１抗体で染色した。これらのデータは、本発明において説明するＩＣＣ染色分析が非常に特異的であることを示す。同じサンプル上でＨＰＶ ＤＮＡテストと比較すると、パップスメアで正常なサンプルの１９％（３２のうち６）がＨＰＶ ＤＮＡテスト上で陽性を示す。本研究で用いたハイグレードのＨＰＶ ＤＮＡテストはｈｃ２であり、ＦＤＡのみがＨＰＶ ＤＮＡテストを認めた。それらのＨＰＶ ＤＮＡ陽性に対して、パップスメアで正常およびＨＰＶ ＩＣＣで陰性なサンプルに対して、ＨＰＶ ＤＮＡ分析の陽性またはＨＰＶ発癌タンパク質の発現がないＨＰＶ感染のＤＮＡ検出を誤っている可能性がある。これらのデータは、本願明細書で記載するＨＰＶ ＩＣＣ分析がＨＰＶ ＤＮＡテストと比較して良い陽性的中率を提供し、子宮頸癌のスクリーニングに対して良い臨床的信頼性を提供する。

【0103】

６．ＨＰＶフローサイトメトリ分析
ＨＰＶタンパク質を検出する免疫分析の他の実施例として、ＨＰＶフローサイトメトリ分析を行った。製造ガイドラインに従った液体溶液において収集した子宮頸部かき取りからの細胞を遠心分離、洗浄、同様のＩＣＣ染色手順に従って免疫染色した。細胞をスライドガラス上に塗布する代わりに、細胞をフローサイトメトリによる分析の染色から溶液において保存する。ＨＰＶフローサイトメトリを行うため、溶液における子宮頸部細胞を固定し、ブロックし、抗ＨＰＶ抗体と培養し、その後適切な二次抗体およびフローサイトメトリによって検出する基質化学物質と培養した。このＨＰＶフローサイトメトリ分析の利点は、高い訓練をした細胞学者がスライドガラスを観察する必要性がないことである。

【0104】

一つの実施形態において、ＩＣＣフローサイトメトリを行うキットを提供する。このキットは、前−抗体ブロッキング溶液、後−抗体ブロッキング溶液、一次抗体としての抗ＨＰＶ抗体、二次抗体としてのＨＲＰもしくはビオチンまたは他の物質と結合した抗マウスまたは抗ラビット免疫グロブリン、フローサイトメトリによって二次抗体を検出する基質として用いる適切な化学物質を含む溶液を含む。

【0105】

例として、関節標識は２個の培養工程を必要とする；最初は一次抗体でその後二次抗体と培養する。二次抗体は蛍光色素（ＦＩＴＣ，ＰＥ，Ｃｙ５など）を結合させた。抗ＨＰＶ抗体も、基質として用いる適切な化学物質を検出するための蛍光、またはビオチン、または他の化学物質で直接タグを付ける。前−抗体ブロッキング溶液は、細胞が抗体に非特異的に結合するのをブロックする特定のタンパク質もしくはＢＳＡ、または血清または他の化学物質を含む。後−抗体ブロッキング溶液は、一次抗体の培養に用いるタンパク質または血清を含まない前−抗体ブロッキング溶液と同様の溶液である。ＨＰＶ抗体を含む溶液は、濃縮して、または試薬を準備して希釈する。二次抗体を含む溶液は、濃縮して、または試薬を準備して希釈する。

【0106】

例として、ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質は、蛍光色素（ＦＩＴＣ，ＰＥ，Ｃｙ５などを結合した）で標識化した二次抗体である特異的な抗体によって検出する。フローサイトメトリによって分析した細胞は、染色してもしなくても大きさまたは他のパラメータによってゲートして細胞集団を見ることができる。小さい細胞サイズの細胞集団からの染色強度は、分析における正常細胞の対照として大きい細胞サイズを有する細胞集団と比較できる。この分析は、個々の細胞に対する特異的な染色を提供する。染色したまたは未染色の細胞の数を数えて、染色強度も分析によって定量化する。この分析は、顕微鏡、細胞学者を必要とせずに染色結果をスコアできる。フローサイトメトリから強力なコンピュータソフトウエアは、偏見のないまたは細胞学において訓練したヒトなしで分析するすべてのデータを提供する。この分析は、ＨＰＶに関連するタンパク質を検出するためのスクリーニングテストまたは付随する試験としての臨床設定においてよく用いられるだろう。

【0107】

他の実施例として、細胞を染色した後、暗所において４°Ｃで細胞縣濁液を保管して、できる限り早くフローサイトメトリ上で細胞を分析するのが良い。フローサイトメトリ前が１時間以上であれば、細胞を固定する必要がある。これは少なくとも数日保存できる。これが光散乱および不活性な最もバイオハザードの化学物質を安定化させる。異なる化学物質の固定は、異なる分析に対する最適化が必要である。フォーマット１：パラホルムアルデヒド０．０１％〜１％を１０〜１５分間、サンプルにつき１００μＬ。フォーマット２：アセトンまたはメタノール：１ｍＬの氷冷したアセトン１ｍＬを各サンプルに加える。穏やかに混合する。−２０°Ｃで５〜１０分間置く。遠心、ＰＢＳ１％ＢＳＡにおいて２回洗浄する。

【0108】

細胞内染色のため、細胞をまず固定して、可溶性抗原または短い半減期を有する抗原の安定性をとる。これは、元の細胞位置における標的タンパク質を保持する。細胞内抗原の検出は、染色前に細胞透過化の工程を必要とする。抗体は、透過化緩衝液において準備し、細胞が透過性であるようにする。細胞集団上でゲートすると、フローサイトメトリ上の細胞の光散乱プロファイルは透過化の後に変化する。細胞質小器官および微小体における抗原は、抗原によって固定化および透過化が必要である。エピトープは、アクセス可能である必要がある。

【0109】

固定化は染色分析の質に重要である。固定化に利用できるいくつかの方法がある：（１）ホルムアルデヒドおよびその後の洗浄剤：０．０１％のホルムアルデヒドにおいて１０〜１５分間固定（これはタンパク質を安定化する）、その後、洗浄剤によって膜破壊。洗浄剤：トリトンまたはＮＰ−４０（ＰＢＳ内０．１〜１％）。これらはまた核膜を溶解し、核抗原に非常に適切である。細胞膜および細胞質がなくなると光散乱が減少してしまい、非特異的な蛍光も減少することに留意されたい。Ｔｗｅｅｎ２０、サポニン、ジギトニンおよびレウコペルムは中程度の膜可溶剤である。ＰＢＳ内０．５％で用いる。これらは、抗原に対して十分なコアを与え、細胞膜を溶解することなく貫通する。細胞質または細胞膜の細胞質表面における抗原として適切である。また、可溶な核物質としても適切である。（２）ホルムアルデヒド（０．０１％）およびその後のメタノール。メタノールの後洗浄剤。１ｍＬの氷冷メタノールを各サンプルに加える。穏やかに混合する。−２０°Ｃで１０分間置く。遠心、ＰＢＳ１％ＢＳＡにおいて２回洗浄する。アセトン固定および透過化：１ｍＬの氷冷アセトンを各サンプルに加える。穏やかに混合する。−２０°Ｃで５〜１０分間置く。遠心、ＰＢＳ１％ＢＳＡにおいて２回洗浄する。

【0110】

７．１個の抗ＨＰＶ抗体を用いた固体表面上のＨＰＶタンパク質の検出
１）直接ＥＩＡ：１個以上のＨＰＶタンパク質をマイクロタイタープレート上にコートして１個以上の抗ＨＰＶ抗体によって検出する。子宮頸部かき取りからの臨床サンプルを直接ＥＩＡ上でＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１の検出のために得た。様々なサンプルソースからの子宮頸部細胞には、液体細胞溶解溶液における子宮頸部かき取り細胞、輸送媒体における子宮頸部かき取り細胞（ＨＰＶ ＤＮＡテストサンプルに対して用いる）、または溶菌緩衝液における子宮頸部かき取り細胞がある。本願明細書で記載する直接ＥＩＡを行うため、生検を処理、遠心分離、洗浄、および検体としての細胞溶解物を生成するように溶解した。細胞溶解物におけるタンパク質を定量化し、各ウェルにおける各サンプルをコーティングするための同量のタンパク質を用いてマイクロタイタープレートにコーティングした。プレートを遮断し、示したように各ＨＰＶモノクローナル抗体およびその後ＨＲＰ結合した二次抗体（例えば抗マウスＩｇＧまたは抗ラビットＩｇＧ）によって検出した。ＴＭＢ基質を加え、その後、標準的な反応停止溶液を加えた。ＯＤ４５０をＥＬＩＳＡプレートリーダーによって行った。

【0111】

実施例として、液体溶液において収集した様々な段階の子宮頸部腫瘍からの子宮頸部細胞を処理して、ＨＰＶ ＤＮＡおよびＨＰＶタンパク質の検出に対する細胞溶解物を得た。ＨＰＶ ＤＮＡ検出に対して、タッチダウンＰＣＲプロトコールを用いた。直接ＥＩＡによるＨＰＶタンパク質検出に対して、細胞溶解物をマイクロタイタープレート上に直接コーティング、ブロックして、その後特異的なＨＰＶ抗体は、ＨＲＰを結合した二次抗体によって用いた。ＯＤ４５０は、一次抗体およびその後二次抗体を加えてまたは加えることなく、細胞溶解物でコーティングしたマイクロタイタープレートから取った。細胞溶解物からの様々なタンパク質がマイクロプレート上にコートされるため、一次ＨＰＶ抗体を持たない各サンプルは、二次抗体を有する細胞溶解物の非特異的な結合として考えられる。ＨＰＶタンパク質の抗ＨＰＶ抗体との特異的な結合に対するＯＤを得るため、二次抗体の非特異的な結合からのＯＤの控除によって得た各サンプルのネットＯＤを、一次抗体とのＨＰＶタンパク質の特異的な結合として考えた。各ＰＣＲ陰性サンプルからのネットＯＤを得た。ＰＣＲ陰性サンプルからの平均ＯＤを、分析のベースラインとして用いた。ＰＣＲ陰性サンプルからの平均ＯＤの２倍以上のネットＯＤのサンプルは陽性と考え、さもなければ本願明細書で記載するＥＩＡに対して陰性とした。

【0112】

実施例として、組織学またはパップスメア染色によって異常細胞、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ１，ＣＩＮ２，ＣＩＮ３，ＳＣＣおよび腺癌等と診断された臨床サンプルを得て、マイクロタイタープレート上に直接コートする細胞溶解物を処理した。臨床的診断またはパップスメア結果と比較して、ＰＣＲによるＨＰＶ ＤＮＡの検出およびＥＩＡによるＨＰＶタンパク質の検出を表２０に示した。データは、ＨＰＶ ＤＮＡの７９％（２４のうち１９）がポリクロ―ナル抗Ｅ７抗体によって検出したＨＰＶタンパク質と関連することを示す。これらのＨＰＶ ＤＮＡおよびＨＰＶタンパク質の不一致に対して（２１％；２４のうち５）、３（５のうち）はＰＣＲ陽性、ＥＩＡ陰性であり（Ｎｏ．９／ＣＩＮ１，Ｎｏ．
１２／ＣＩＮ２，およびＮｏ．１３／ＣＩＮ２）、発現しないまたは検出不可能なＥ７発癌タンパク質によるＨＰＶ感染を示す。Ｎｏ．４（ＡＳＣＵＳ）およびＮｏ．１０（ＣＩＮ１／ＡＳＣＵＳ）等のＰＣＲ陰性、ＥＩＡ陽性に対して、ＰＣＲまたはＨＰＶ ＤＮＡの損失を伴ったＥ７の発癌タンパク質の発現の誤りであるとする。

【0113】

【表20】

【0114】

ＨＰＶ ＤＮＡ陽性であるがＨＰＶ ＥＩＡ陰性であるサンプルに対して、ＨＰＶ ＤＮＡ分析の陽性またはＨＰＶ発癌タンパク質が発現していないＨＰＶ ＤＮＡ検出が陽性である可能性がある。これらのデータは、本願明細書で記載するＨＰＶ ＥＩＡが子宮頸癌のスクリーニングに対するさらなる臨床的信頼性を提供することを示す。ＨＰＶ発癌タンパク質を検出して腫瘍ＨＳＩＬの進行が起こっているかを追随するのが重要である。これらのデータは、ＨＰＶ発癌タンパク質が子宮頸癌および他のＨＰＶに関連する癌のスクリーニングおよび初期検出に対して良いバイオマーカーであることを示す。ＰＣＲおよびＥＩＡの両方が陰性であるが、ＡＳＣＵＳ、またはＣＩＮと診断された場合、ＨＰＶ ＤＮＡおよびＨＰＶ発癌タンパク質検出の損失は、子宮頸部かき取りサンプリングもしくは患者の治療のために起こる、またはパップスメアの陽性結果が誤りである。しかし、試験するサンプルが多いことが義務的である。

【0115】

２）ドットプロット分析：膜上に細胞溶解物をスポットし、１個以上の抗ＨＰＶ抗体を用いて生物学的サンプルからＨＰＶタンパク質を検出する。
読み取りに装置を必要としない結果を示す迅速試験を開発するため、ドットプロット分析は、色基質による視覚的結果を得る膜上の細胞溶解物からのＨＰＶタンパク質を検出する実現可能性を示す。実施例として、液体溶液において収集した様々な段階の子宮頸部腫瘍からの子宮頸部細胞を処理して、膜上にスポットする細胞溶解物を得た。膜は、ブロッキング溶液でブロットをブロッキングする前に空気乾燥した。抗ＨＰＶ抗体を加えて、抗ＨＰＶ抗体に結合できる二次抗体によってブロットと反応させた。ブロットは各工程間で洗浄して、抗体の膜上への非特異的な結合を防いだ。最終工程において、ＴＭＢ基質をブロットに加えて、青色スポットがこのドットプロット分析において用いた抗ＨＰＶ抗体と結合する細胞溶解物の陽性反応を示す。組み換え型ＨＰＶタンパク質も膜上にスポットして、陽性または陰性対照として用いた。

【0116】

図１３Ａは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｌ１抗体を用いたＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出するドットプロットに結果を示す。示すように、第１列からのドットは、液体溶液における様々なＳＣＣ子宮頸部かき取りからの細胞溶解液であり、第２列からのドットは、それぞれＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄで示した左から右へ２０，２，０．２および０μｇ／ｍＬの濃度の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質である。ブロットの第２列において示した結果のように、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質は０．２μｇ／ｍＬまたはそれ以下の精製組み換え型タンパク質を図１３Ａにおいて用いたマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｌ１抗体と高い陽性で反応する。これらのデータは、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１および細胞溶解物からのＨＰＶ Ｌ１タンパク質が図１３Ａにおいて示すようにマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｌ１抗体を用いてドットブロット分析によって検出できることを示す。

【0117】

図１３Ｂは、図１３Ａにおいて示したのと同じマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｌ１抗体を用いたＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出する他のドットブロットの結果を示す。示すように、第１列および第２列からのドットは、液体溶液における様々なＳＣＣ子宮頸部かき取りからの細胞溶解物である。ブロットの第３列において、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１８ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、それぞれＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅで示し、左から右へスポットした。ブロットの第３列において示した結果のように、組み換え型ＨＰＶ Ｌ１タンパク質であるスポット３Ｅは、検出可能なスポットを持たないＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１６ Ｅ６またはブロットの第３列上で示した非常に弱いスポットのＨＰＶ１８ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６と比較して、分析において用いたマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｌ１抗体と陽性反応する。分析のバックグラウンドまたは非特異的な結合を示す弱いスポットを用いて、臨床サンプル２Ｃおよび２Ｅは、ＨＰＶ１６ Ｌ１組み換え型タンパク質ほど強いスポットを示す。図１３Ａは、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１および細胞溶解物の両方からのＨＰＶ Ｌ１タンパク質がマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｌ１抗体を用いたドットブロット分析によって検出できることを示す。

【0118】

ドットブロット分析上でＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出するため、図１４Ａは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体でのドットブロットに結果を示す。示すように、第１列からのドットは、液体溶液における様々なＳＣＣ子宮頸部かき取り（図１の第１列と同じ）からの細胞溶解液であり、第２列からのドットは、それぞれＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄで示した左から右へ２０，２，０．２および０μｇ／ｍＬの濃度の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質である。ブロットの第２列において示した結果のように、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質は、陽性に２０，および２μｇ／ｍＬ、弱く０．２μｇ／ｍＬまたはそれ以下の精製組み換え型タンパク質を、図３において用いたマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体反応する。これらのデータは、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６および細胞溶解物からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質が図１４Ａにおいて示すようにマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いたドットブロット分析によって検出できることを示す。

【0119】

図１３Ｂにおいて示したのと同じドットプロットを、ドットプロット分析上でＨＰＶ Ｅ６タンパク質の検出を行うのに用いた。図１４Ｂは、図１４Ａにおいて示したのと同じマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いたＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出する他のドットブロットの結果を示す。ブロットの第３列において示した結果のように、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、スポット３Ａは、図１３Ｂの第３列上で示した非常に弱いスポットのＨＰＶ１８ Ｅ６および検出可能なスポットを持たない他の組み換え型タンパク質と比較して、分析において用いたマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体と陽性反応する。これらの結果は、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体との特異的な反応を示し、ＨＰＶ Ｌ１またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質と架橋反応しないことを示す。分析のバックグラウンドまたはＨＰＶ１８ Ｅ６の架橋反応結合を示す弱いスポットを用いて、サンプル２Ｃおよび２Ｅは、他の中程度のスポットおよび検出可能なスポットがない２Ｄと比較して非常に強いスポットを示す。これらのデータは、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質を含む７０％の臨床サンプルが図１４Ｂにおいて示したマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６ Ｅ６抗体を用いたドットブロット分析によって検出できることを示す。

【0120】

ドットブロット分析上のＨＰＶ Ｅ７タンパク質の検出を行うため、図１３Ｂおよび図１４Ｂにおいて示したのと同じドットプロットを用いて、図１５において示すようにＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出するマウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体でのブロットを行った。図１５におけるブロットの第３列において示した結果のように、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質であるスポット３Ｄは、ブロットの第３列上で示した検出可能なスポットを持たない他のＨＰＶ組み換え型タンパク質または非常に弱いスポットのＨＰＶ１６ Ｌ１であるスポット３Ｅと比較して、分析において用いたマウスモノクローナル抗ＨＰＶ １８ Ｅ７抗体と陽性反応する。これらの結果は、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体とのＨＰＶ Ｅ７タンパク質の特異的な結合を示すが、ＨＰＶ Ｌ１またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質との架橋反応は示さない。分析におけるバックグラウンドまたはＨＰＶ１８ Ｅ７抗体の架橋結合を示す弱いスポットを用いると、サンプル２Ｃおよび２Ｅは、検出不可能なスポットを有する他のものと比較して非常に強いスポットを示す。これらのデータは、図１５において示したように、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を含むサンプル２Ｃおよび２Ｅがマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１８ Ｅ７抗体を用いたドットブロット分析によって検出できることを示す。
３）抗体マイクロアレイ：生物学的サンプルからの標識化した細胞におけるＨＰＶタンパク質および細胞内因性タンパク質上の抗体のスポッティング

【0121】

例えば、タンパク質チップ分析において、コートする／結合するタンパク質の表面は、例えば、表面化学処理したガラスまたは膜であり、捕捉剤またはタンパク質と共有的にもしくは非共有的に結合またはコートする。適切な緩衝液における組み換え型タンパク質、抗原、抗体または他のタンパク質等の捕捉剤に浸したファインピンを有するスポット機械は、処理した表面にこのタンパク質または抗体を結合させるのに概して用いる。マイクロタイタープレートフォーマットにおいて説明した他の表面のように、スポットし補足したタンパク質または抗体は、タンパク質チップの表面化学処理した表面に強く結合し、非特異的な結合を除去する洗浄後であっても、処理表面上で捕捉タンパク質の標的タンパク質、抗体、または抗原との相互作用および特異的な結合を可能にし、Ｃｙ３またはＣｙ５と結合する検出システムで検出できる。特異的な相互作用の検出は、マイクロアレイスキャナを介したスポットした／浸した画像の蛍光強度によって獲得および測定する。

【0122】

実施例として、抗体マイクロアレイは、ＨＰＶタンパク質および他の細胞内タンパク質の検出に関するタンパク質チップ分析フォーマットとして用いることができる。まず、試験する細胞、サンプルまたは培養細胞を収集、遠心分離、洗浄および溶解して、分析物としての細胞溶解物を生成した。細胞溶解物におけるタンパク質を定量化して、予めスポットした抗体表面上のこの標識化したタンパク質の結合を検出するためにビオチンまたはＣｙ３，Ｃｙ５またはいずれかの他のクロマゲンで標識化した。タンパク質チップ分析に対するタンパク質チップの表面は、異なる分析または定量化技術に対して膜またはガラスである。

【0123】

表２１は、様々なＨＰＶタンパク質および様々な宿主細胞タンパク質の存在を検出するタンパク質チップ分析の結果を示す。ＨＰＶおよび様々な細胞内タンパク質に対して抗体で予めスポットした抗体アレイを用いて、ヒト子宮頸部かき取り臨床サンプルにおけるこれらのＨＰＶタンパク質および宿主細胞タンパク質の存在を検出した。液体溶液から得た角質化した扁平上皮細胞癌（グレード２またはグレード３）と診断された子宮頸部かき取りの１０個のサンプルすべて（表２１上でＳ１〜Ｓ１０と示した）を処理および溶解して、その後の検出のために適切に（ビオチン標識化等の）標識化したタンパク質溶解物を生成した（例えば、ストレプトアビジン−Ｃｙ３）。限定することはないが、ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１６Ｌ１，ｐ６３，ｐ５３，ｐ２１ＷＡＦ１，ｐ１６ＩＮＫ４ａ，リン酸化Ｒｂ，非リン酸化Ｒｂ等の当タンパク質に対して予めスポットした抗体を有するヒトサンプルからのタンパク質の結合を示す蛍光強度を得て表２１において示す。ＨＰＶ感染したこれらのタンパク質の発現レベルにおける変化を示す、マイクロアレイ上に予めスポットした特異的な抗体との特異的なタンパク質の結合に対する蛍光強度を比較および分析して図６〜１２において示した。

【0124】

【表21】

【0125】

試験した１０個のサンプルからの各タンパク質の発現を比較するため、各サンプルからの特異的なタンパク質に対する平均蛍光強度を得て、図１６において示したグラフの標準偏差バーでタンパク質発現レベルを示した。結果は、１０個の子宮頸部かき取りサンプルの細胞溶解物からの様々なＨＰＶタンパク質および様々な細胞内因性タンパク質は、本願明細書で記載する抗体マイクロアレイ分析上で検出できることを示す。図１６において示すように、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１６Ｅ７は他の細胞内タンパク質と比較して過剰に発現している。

【0126】

異なるサンプルにおけるＨＰＶ１６の変化を調べるため、図１７は、図１６において示した子宮頸部かき取り細胞からの細胞溶解物におけるＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出するための各サンプルの蛍光強度を示す。結果は、抗体マイクロアレイ上の子宮頸癌患者からの細胞溶解物において発現したＨＰＶタンパク質、とくにＬ１ウイルス性タンパク質とのＨＰＶ抗体（抗ＨＰＶ Ｌ１抗体）の結合を示す。ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、サンプルＳ１，Ｓ３，Ｓ６において高く発現し、サンプルＳ４，Ｓ５およびＳ９に対して中程度に発現したが、この分析において用いたＨＰＶ１６抗体によって認識されない異なるＨＰＶ種類であるＳ２，Ｓ７およびＳ８において低く発現した。

【0127】

ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質は、子宮頸癌におけるＨＰＶの発癌タンパク質において重要な役割を果たす。ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７発癌タンパク質の細胞内タンパク質との相互作用を研究するため、本願明細書で記載する抗体マイクロアレイ分析を、ＨＰＶ発癌タンパク質と直接相互作用するｐ５３もしくはＲｂ等の細胞内タンパク質および、またはＨＰＶ感染に作用されるｐ１６、ｐ２１等の細胞内タンパク質等の同時の検出に対するツールを提供する。ｐ１６ＩＮＫ４ａは、子宮頸癌の検出に対するサロゲートとして一般的に用いられる。ＨＰＶウイルス性タンパク質を調べるため、このＥ６またはＥ７発癌タンパク質は子宮頸癌を検出する良いバイオマーカーとして機能し、本願明細書で記載する抗体マイクロアレイ（タンパク質分析）は、様々なＨＰＶタンパク質および様々な細胞内
タンパク質を含む多くのタンパク質を同時に検出する。図１８は、１０個のＳＣＣサンプルにおけるＨＰＶ Ｅ７およびｐ１６タンパク質の検出および比較を示す、各サンプル（１〜１０）からの蛍光強度は、ＨＰＶ１６ Ｅ７抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体の抗体マイクロアレイ上の子宮頸癌患者からの細胞溶解物において発現したタンパク質との結合を示す。１０個のサンプル試験に対して、各サンプルは、ｐ１６抗体よりもＨＰＶ Ｅ７抗体に強い蛍光強度を示し、ｐ１６より多くのＨＰＶ Ｅ７タンパク質が発現したことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ Ｅ７は子宮頸癌を検出するのに良いマーカーとして機能することを示す。

【0128】

子宮頸癌におけるＨＰＶによって感染したｐ５３を調べるため、図１９はＨＰＶ１６およびｐ５３抗体の両方に対する蛍光強度を示し、ＨＰＶ感染した臨床サンプルにおけるＨＰＶ１６のｐ５３抑制による過剰発現を示す。ＨＰＶ１６およびｐ５３の発現を比較すると、結果は、ＨＰＶ１６感染ではない異なる種類のＨＰＶである臨床サンプルＳ７およびＳ８を除いたほとんどの臨床サンプルにおいて、ｐ５３は高いレベルで発現したＨＰＶ１６よりもずっと低い意レベルで発現することを示す。しかし、すべての臨床サンプルにおける低いｐ５３発現は、ほとんどのｐ５３タンパク質が子宮頸癌進行の転移の間ＨＰＶ Ｅ６発癌タンパク質によって分解されることを示す。

【0129】

Ｅ７および網膜芽腫（Ｒｂ）タンパク質および子宮頸癌におけるＨＰＶによって作用されたリン酸化Ｒｂの相互作用を調べるため、図２０は、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびｐＲｂ抗体に対する蛍光強度を示し、ＨＰＶ１６ Ｅ７はＲｂが不活性のとき発現し、低濃度の抗Ｒｂリン酸塩特異性抗体によって認識されることを示す。ＨＰＶ１６ Ｅ７発現をＲｂ−リン酸塩と比較すると、ＨＰＶ１６ Ｅ７の過剰発現は、サンプルＳ２において高い。データは、Ｅ７経路によるＲｂの不活性化（Ｒｂ−リン酸所抗体との反応において低い）は、子宮頸癌に進行する悪性形質転換を引き起こす。

【0130】

実施例として子宮頸癌に対するタンパク質チップ分析の発現プロファイルを調べるため、図２１は、サンプルＳ２に対する選択したＨＰＶタンパク質および細胞内タンパク質の発現プロファイルを示す。結果は、ＨＰＶ Ｅ７およびｐ１６は過剰に発現したが、他の細胞内タンパク質は抑制されたことを示す。図８，図２０および図２１の結果をまとめると、サンプルＳ２におけるＨＰＶ Ｅ７タンパク質の過剰発現は、Ｒｂを不活性化し、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現を誘起し、その結果悪性形質転換および子宮頸癌の進行を導く。高くＨＰＶ Ｅ７を発現するサンプルＳ１は、Ｒｂから独立した経路を通るが、高くｐ１６ＩＮＫ４ａを発現しない。

【0131】

子宮頸癌における他の細胞内タンパク質ｐ２１ ＷＡＦ１およびｐ５３との関連性を調べるため、図１２は、子宮頸部かき取り細胞からの細胞溶解物を用いて細胞内ｐ２１ ＷＡＦ１およびｐ５３タンパク質を検出する各サンプルの蛍光強度を示す。図２２において示すように、ｐ２１ＷＡＦ１を発現する１０個のうち９サンプル（サンプル１を除く）がｐ５３の発現と大きく関連する。これらのデータは、ｐ２１ＷＡＦ１阻害を通したＨＰＶ Ｅ６経路による腫瘍抑制ｐ５３の分解が、子宮頸癌進行に対する悪性形質転換を引き起こすことを示す。

【0132】

タンパク質チップ分析は、癌進行の形質転換におけるＨＰＶ感染によって誘起されたおよび／または阻害されたＨＰＶタンパク質および細胞内タンパク質を検出するツールを提供することができる。本発明において説明したタンパク質チップ分析を用いた研究結果は、本研究における子宮頸がんの患者は様々な経路を適用し、進行が異なる。この技術は、他のＨＰＶに関連する癌の形質転換を伴う経路を予想するのに適用できる。アルゴリズムは、癌進行寛の経路を伴うすべての患者の症状を予想できるように開発する。したがって、一人ひとりに特化した薬剤の特別な治療を勧めることができる。
８．二次抗ＨＰＶ抗体によって検出する表面上に補足した一次抗ＨＰＶ抗体を用いた生物学的サンプルからのＨＰＶタンパク質の検出

【0133】

実施例として、抗原サンドイッチ分析は、タンパク質チップ、膜および／またはマイクロタイタープレートなどの底面等の表面上に対象の抗原を結合する親和性を有する捕捉抗体またはスポット抗体等の一次抗体をコーティングする工程を有する。対象の抗原は、例えば、初期遺伝子または後期遺伝子等のＨＰＶウイルス性遺伝子によってコードした、例えば、パピローマウイルス性タンパク質、発癌タンパク質、カプシドタンパク質である。表面上の未結合部分をブロッキング後、分析する臨床サンプルを捕捉抗体に結合させるように塗布し、対象の抗原へ結合することによって二次抗体または検出抗体によって検出する免疫複合体を形成させる。その後、一次および二次抗体または捕捉抗体および検出抗体の対は、サンドイッチのように対象の抗原と相互作用する。捕捉またはスポット抗体は、検出抗体および２個の抗体がＨＰＶウイルス性タンパク質、ＨＰＶ発癌タンパク質、カプシドタンパク質およびそれら等の対象の抗原に特異的に結合できるように、同じまたは異なる。

【0134】

次に、サンドイッチ結合抗体−抗原複合体を、検出抗体に対して親和性を有し色素化学発光、蛍光および多くの種類の基質を用いて標準的な免疫複合体検出による測定を行う、二次抗体によって検出する。最終的な読み取りまたは可視化は、適切な吸光リーダーを有する装置によって、または直接目で見て行い、対照サンプルと比較する。陽性結果は、対象の抗原の一次抗体、捕捉抗体、および検出抗体との結合を示し、臨床サンプルにおける対象の抗原の存在を示す。逆に、陰性結果は、対象の抗原の一次抗体への結合がないことを示し、臨床サンプルにおける対象の抗原がないことを示す。

【0135】

１）ＥＬＩＳＡ：二次抗ＨＰＶ抗体によるＨＰＶタンパク質を検出する一次抗ＨＰＶ抗体のマイクロタイタープレート上のコーティング
マイクロタイタープレート上のサンドイッチＥＬＩＳＡを行うため、ＳＣＣまたはＨＰＶ ＰＣＲ陽性またはＨＰＶ ＰＣＲ陰性と診断された血清を希釈して、血清サンプルに存在するＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質を検出する分析物として用いた。ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析において行う分析フォーマットは、一次抗体としてのＥ６，Ｅ７またはＬ１に対するラビットポリクロ―ナル抗体、その後、分析物（血清）およびＨＲＰを結合した他の抗体によって検出するそれに関連する二次抗ＨＰＶ抗体をコーティングした。基質および停止剤と培養後、ＯＤ４５０をマイクロタイタープレートによって取った。図８において示した実施例として、結果は、ラビットポリクロ―ナル抗ＨＰＶ抗体をコーティングおよび検出に用いたＨＰＶ陰性血清（ＰＣＲによる）と比較したＳＣＣ（扁平上皮細胞癌）またはＨＰＶ陽性（ＰＣＲによる）と診断されたヒト血清サンプルにおけるＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡを示す。

【0136】

図２３は、Ｅ６，Ｅ７発癌タンパク質およびＬ１ウイルス性タンパク質の存在は、対照としてＨＰＶ ＰＣＲ陰性サンプルからの血清を用いて、ＳＣＣまたはＨＰＶ ＰＣＲ陽性サンプルと診断された患者からの血清において検出できることを示す。データは、Ｅ７はＥ６またはＬ１と比較して血清から検出されたタンパク質である。ＳＣＣおよびＨＰＶ ＰＣＲの両方が陽性のサンプルは、ＰＣＲ陰性サンプルからの血清と比較して高いＥ６およびＥ７タンパク質を有する。ＳＣＣはＨＰＶ ＰＣＲ陰性血清と比較して高いＬ１検出を有するが、ＨＰＶ ＰＣＲ陽性サンプルはＨＰＶ ＰＣＲ陰性サンプルと比較して高く発現しないことに留意されたい。しかし、Ｌ１タンパク質の発現は、Ｅ６またはＥ７どちらの場合も高くない。これらのデータは、Ｌ１の発現は、ウイルス感染の段階および／またはサイクルによって血清に存在するまたは存在しないことを示す。しかし、ＳＣＣおよびＨＰＶ ＰＣＲ両方が陽性であるサンプルからの血清における発癌タンパク質Ｅ６またはＥ７の検出は、Ｅ６またはＥ７が血清におけるＨＰＶ検出に対する良いマーカーを示すことを示唆する。これは、血清からのＥ６，Ｅ７発癌タンパク質の検出に対する最初の報告である。分析には多くの血清サンプルが必要である。

【0137】

２）フロービーズ分析：二次抗ＨＰＶ抗体によるＨＰＶタンパク質を検出するビーズ上の一次抗体コーティング
実施例として、ビーズ表面にコートした一次抗体は、生物学的サンプルの細胞溶解物におけるＨＰＶタンパク質と反応し、二次抗ＨＰＶ抗体を捕捉するビーズの表面上に複合体を形成する。複合体は、二次抗ＨＰＶ抗体を予め標識化したとき直接検出できる、または、二次抗ＨＰＶ抗体に結合できる予め標識化した抗体を加えることによって検出できる。予め標識化した抗体は、限定することはないが西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、蛍光およびそれらの組み合わせ等の検出剤で標識化する。実施例として、ビーズの固体表面上に存在する複合体は、抗マウスまたは抗ラビットＰＥを二次抗体として用いてＦＡＣＳ（蛍光活性細胞分類）によって検出できる。多くのＨＰＶタンパク質がビーズ上に補足されたら、異なる蛍光染色によって標識化された多くの二次抗ＨＰＶ抗体がＦＡＣＳによって同時に検出できる。したがって、ＦＡＣＳによるビーズ分析は、生物学的サンプルからの１個以上のＨＰＶタンパク質を検出する強力な分析を提供する。

【0138】

様々なＨＰＶタンパク質の検出に用いる本願明細書で記載するビーズ分析を示すため、ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１に対する様々な抗体をコーティングおよび検出個抗体として用いて、ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出した。図２４〜２７は、ＦＡＣＳによる、それぞれＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質を検出するビーズ分析の結果を示す。実施例として、図２４は、コーティング抗体としてのラビットポリクロ―ナル抗ＨＰＶ Ｌ１抗体および検出抗体としてのマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６ Ｌ１抗体を用いて、その後二次抗体である抗マウス接合ＰＥ剤を用いて、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドイッチビーズ分析の結果を示す。示したデータのように、ＦＡＣＳによって検出するビーズ表面上に捕捉する精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を含むサンプルは、分析の陰性対照としての緩衝液を含むサンプル（図２４の左のピーク）からの高い蛍光ＰＥを有する離散的なピーク（図２４の右側のピーク）を示す。結果が、特異的な検出タンパク質を含むサンプル（幾何平均約２９５８）および存在するタンパク質を検出しない対照サンプル（幾何平均約１２）で約２５０倍の蛍光差異を示す。データは、このビーズフォーマットが、臨床サンプルに存在する様々な量のＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出することができる分析のダイナミックレンジを提供することを示す。

【0139】

他の実施例として、図２５は、コーティング抗体としてのラビットポリクロ―ナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体および検出抗体としてのマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６ Ｅ６抗体を用いて、その後二次抗体である抗マウス接合ＰＥ剤を用いて、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドイッチビーズ分析の結果を示す。示したデータのように、ＦＡＣＳによって検出するビーズ表面上に捕捉する精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を含むサンプルは、分析の陰性対照としての緩衝液を含むサンプル（図２５の左側のピーク）からの高い蛍光ＰＥを有する離散的なピーク（図２５の右側のピーク）を示す。結果が、特異的な検出タンパク質を含むサンプル（幾何平均約１１４）および存在するタンパク質を検出しない対照サンプル（幾何平均約１７）で約９倍の蛍光差異を示す。データは、このビーズフォーマットが、臨床サンプルに存在する様々な量のＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出することができる分析のダイナミックレンジを提供することを示す。

【0140】

図２６は、コーティング抗体としてのラビットポリクロ―ナル抗ＨＰＶ１８ Ｅ６抗体および検出抗体としてのマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１８ Ｅ６抗体を用いて、その後二次抗体である抗マウス接合ＰＥ剤を用いて、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドイッチビーズ分析の結果を示す。示したデータのように、ＦＡＣＳによって検出するビーズ表面上に捕捉する精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を含むサンプルは、分析の陰性対照としての緩衝液を含むサンプル（図２６の左側のピーク）からの高い蛍光ＰＥを有する離散的なピーク（図２６の右側のピーク）を示す。結果が、特異的な検出タンパク質を含むサンプル（幾何平均約２２９４）および存在するタンパク質を検出しない対照サンプル（幾何平均約１４８）で約１５倍の蛍光差異を示す。データは、このビーズフォーマットが、臨床サンプルに存在する様々な量のＨＰＶ １８ Ｅ６タンパク質を検出することができる分析のダイナミックレンジを提供することを示す。

【0141】

図２７は、コーティング抗体としてのラビットポリクロ―ナル抗ＨＰＶ１６ Ｅ７抗体および検出抗体としてのマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６ Ｅ７抗体を用いて、その後二次抗体である抗マウス接合ＰＥ剤を用いて、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドイッチビーズ分析の結果を示す。示したデータのように、ＦＡＣＳによって検出するビーズ表面上に捕捉する精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質を含むサンプルは、分析の陰性対照としての緩衝液を含むサンプル（図２７の左側のピーク）からの高い蛍光ＰＥを有する離散的なピーク（図２７の右側のピーク）を示す。結果が、特異的な検出タンパク質を含むサンプル（幾何平均約６７３）および存在するタンパク質を検出しない対照サンプル（幾何平均約５．５）で約１２２倍の蛍光差異を示す。データは、このビーズフォーマットが、臨床サンプルに存在する様々な量のＨＰＶ １６ Ｅ７タンパク質を検出することができる分析のダイナミックレンジを提供することを示す。

【0142】

抗体を検出するためにコーティングからの抗体を変えることによって異なる分析フォーマットの分析性能変化を調べるため、図２８および図２９は、それぞれ図２５および図２６と比較してＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６を検出する異なる分析を示す。実施例として、図２８は、検出抗体としてのラビットポリクロ―ナル抗ＨＰＶ１６ Ｅ６抗体およびコーティング抗体としてのマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１６ Ｌ１抗体を用いて、その後二次抗体である抗マウス接合ＰＥ剤を用いて、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドイッチビーズ分析の結果を示す。示したデータのように、ＦＡＣＳによって検出するビーズ表面上に捕捉する精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を含むサンプルは、分析の陰性対照としての緩衝液を含むサンプル（図２８の左側のピーク）からの高い蛍光ＰＥを有する離散的なピーク（図２８の右側のピーク）を示す。結果が、特異的な検出タンパク質を含むサンプル（幾何平均約２７５５）および存在するタンパク質を検出しない対照サンプル（幾何平均約１２２３）で約２倍の蛍光差異を示す。ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質のビーズ分析上の検出に関する図２８を図２５と比較すると、データは、図２５において示したビーズフォーマットは、臨床サンプルに存在する様々な量のＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出することができる分析の良いダイナミックレンジを提供することを示す。

【0143】

他の実施例として、図２９は、検出抗体としてのラビットポリクロ―ナル抗ＨＰＶ１８ Ｅ６抗体およびコーティング抗体としてのマウスモノクローナル抗ＨＰＶ１８ Ｌ１抗体を用いて、その後二次抗体である抗マウス接合ＰＥ剤を用いて、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を検出するＦＡＣＳによるサンドイッチビーズ分析の結果を示す。示したデータのように、ＦＡＣＳによって検出するビーズ表面上に捕捉する精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を含むサンプルは、分析の陰性対照としての緩衝液を含むサンプル（図２９の左側のピーク）からの高い蛍光ＰＥを有する離散的なピーク（図２９の右側のピーク）を示す。結果が、特異的な検出タンパク質を含むサンプル（幾何平均約３８０３）および存在するタンパク質を検出しない対照サンプル（幾何平均約７８７）で約５倍の蛍光差異を示す。ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質のビーズ分析上の検出に関する図２９を図２６と比較すると、データは、図２６において示したビーズフォーマットは、臨床サンプルに存在する様々な量のＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出することができる分析の良いダイナミックレンジを提供することを示す。
３）ＨＰＶ感染を検出する迅速流動分析：迅速免疫学分析は、ストリップにおいて膜上に垂直にまたは横方向に行う。側方流動または拡散ワンステップ迅速免疫学的分析も、結果を得るのに５〜１５分間かかり用いるのが簡単であり、限定的な訓練を必要とするが装置を必要としない免疫クロマトグラフストリップ試験と呼ぶ。分析の基本的な主旨は、パップスメアからの綿棒サンプルと反応する捕捉剤を含む固相ニトロセルロース膜またはストリップを含む。患者サンプルが標的因子を含めば、 ニトロセルロースにおける捕捉剤は標的因子と反応し、複合体が拡散または毛細管現象を通してニトロセルロース膜において形成および移動する。

【0144】

膜またはスティックは、それぞれもしくは一緒に、サンプル収集の間に試験するヒト対象に投与するおよび／または綿棒と結合させ、設計した免疫学的反応が開始して、試験結果が、例えば試験するヒト対象の子宮頸部内に検鏡および綿棒を挿入後すぐ等、即座に得られるようにする。したがって、ワンステップ迅速免疫学的分析は、主要なスクリーニング試験として機能を果たす。ワンステップ迅速免疫学的分析は、本願明細書で記載するパップスメア組織試験、免疫学的分析および核酸ハイブリダイゼーション分析またはそれらの組み合わせ等の、さらなるＨＰＶ確認試験の前に行うことができる。

【0145】

鉛直迅速免疫学的試験は、そこに捕捉剤をコートまたはスポットするための捕捉／結合表面としての膜を有する装置において行う。装置はさらに、膜の底面にパッドを含み、サンプルおよび分析試薬が膜を通って流れるようにする。サンプルにおいて含まれ捕捉剤と特異的に相互作用および結合するいずれの標的タンパク質、抗体または抗原も流れず、非特異的な結合を除去する洗浄の後であさえも、膜表面上に捕捉および保持される。ＨＲＰまたは他の物質を結合した二次抗体を膜上に塗布して、表面上に保持され色素物質によって可視化されたタンパク質−抗体複合体を検出する。

【0146】

本願明細書で提供するワンステップ迅速免疫学的分析は、いずれの特別な試験装置を必要としない市販の妊娠検査薬に類似した非侵襲的および容易な分析である。ワンステップ迅速免疫学的分析は、一般的なＨＰＶ抗原、高リスクＨＰＶ型、またはＨＰＶに関連する抗体の直接的な定量検出に対するｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫クロマトグラフ分析である。ワンステップ迅速免疫学的分析は、ポイントオブケア（その場）診断および／または小さなクリニックもしくは研究室等でのパップスメア試験の補助試験として用いることができる。ワンステップ迅速免疫学的分析は、簡単に希釈してまたはせずに得たサンプルを加えて、設計した反応が起こる反応時間を待って結果を見るために室温での試験条件が適切である。

【0147】

側方迅速免疫学的試験は、その表面上の設計した位置にすでに塗布／コートした捕捉タンパク質または抗体を有する膜ストリップを用いたワンステップ試験である。この試験で必要なワンステップは、標的タンパク質または抗体を有するサンプルと側副金粒子と結合した検出抗体を組み合わせて、組み合わせた混合体を、膜ストリップの表面の設計された位置まで膜ストリップを通って側方に流れるようにサンプル液に対して塗布する工程である。捕捉−標的−検出タンパク質−抗体免疫複合体は、捕捉抗体または抗体がコートされた設計位置上で形成および保持される。陽性結果をこれらの設計位置で可視化し、洗浄または分離は必要ないため、ワンステップと呼ぶ。試験の全手順は、数分間、例えば１５分以内であり、この試験はワンステップ迅速試験とも呼ぶ。

【0148】

ワンステップ迅速免疫学的分析は、分析を行うのが簡単、迅速および容易であり、ポイントオブケア（その場）の用途に便利である。概して、試験サンプルを本願明細書で記載するように検出抗体と簡単に混合し、混合物を塗布して、予め画定した反応時間（例えば分単位などで）室温等の最適化した培養温度で表面上に予め固定する。反応は、用いる検出抗体の量および分析反応条件によって短くなるように最適化する。
Ａ）ワンステップＨＰＶ側方流動分析：膜上に一次抗ＨＰＶ抗体をストリップして、側副金粒子と結合した二次抗ＨＰＶ抗体によってＨＰＶタンパク質を検出する

【0149】

ワンステップ迅速免疫学的分析は、例えば本願明細書で記載する精製ＨＰＶ抗体、組み換え型タンパク質、またはＨＰＶに関連する抗体およびタンパク質などの捕捉剤をストリップし、例えばＨＰＶ関連抗体およびＨＰＶ関連タンパク質などの標的因子を捕捉し、その後免疫分析検出する膜またはスティック試験である。

【0150】

実施例として、図３０Ａ〜３０Ｇは、ワンステップ側方流動上での本発明において説明した抗体を用いたＨＰＶタンパク質の検出を示す。図３０Ａは、膜上にストリップしたラビット抗Ｌ１ポリクローナル抗体および検出のために結合した金粒子を用いた、ＨＰＶ Ｌ１組み換え型タンパク質を検出するワンステップ側方流動の結果を示す。上側の線で示した試験対象（ＴＣ）、上から二番目の線（矢印）は左で分析の陽性検出を示すが、可視帯を持たない右側の矢印は分析の陰性を示す。Ｌ１組み換え型タンパク質の濃度は左から右へ６，３，１．５，０．７５，０．３７５，０μｇ／ｍＬである。これらのデータは、ワンステップＨＰＶ側方流動分析が３７５ｎｇ／ｍＬまたはそれ以下の濃度でＨＰＶ Ｌ１組み換え型タンパク質を検出できることを示す。

【0151】

実施例として、側方流動が臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出できることを示すため、図３０Ｂは、図３０Ａにおいて示したのと同じ膜上にストリップしたラビット抗Ｌ１ポリクローナル抗体を用いた、臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出するワンステップ側方流動の結果を示す。上側の線で示した試験対象（ＴＣ）、上から二番目の線（矢印）はＳＣＣ患者の血清サンプルからのＬ１タンパク質の陽性検出を示す（左側）。可視帯を持たないＰＣＲによってＨＰＶ陰性とわかった血清は、分析の陰性対照として用いる（右側）。これらのデータは、ワンステップＨＰＶ側方流動分析がＨＰＶ陰性血清と比較してＳＣＣ血清サンプルからＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出できることを示す。

【0152】

側方流動が臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｌ１タンパク質を検出できることを示すため、図３０Ｃは、膜上にストリップしたマウス抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体および検出のために結合した金粒子を用いた、ＨＰＶ Ｅ６組み換え型タンパク質を検出するワンステップ側方流動の結果を示す。上側の線で示した試験対象（ＴＣ）、上から二番目の線（矢印）は左で分析の陽性検出を示すが、可視帯を持たない右側の矢印は分析の陰性を示す。Ｅ６組み換え型タンパク質の濃度は左から右へ１０，２，０μｇ／ｍＬである。これらのデータは、ワンステップＨＰＶ側方流動分析が２μｇ／ｍＬまたはそれ以下の濃度でＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出できることを示す。

【0153】

さらに側方流動が臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出できることを示すため、図３０Ｄは、図３０Ｃにおいて示したのと同じ膜上にストリップしたマウス抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体を用いた、臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出するワンステップ側方流動の結果を示す。上側の線で示した試験対象（ＴＣ）、上から二番目の線（矢印）はＳＣＣ血清サンプルからのＥ６タンパク質の陽性検出を示す（左側の第１および第２）。可視帯を持たないＰＣＲによってＨＰＶ陰性とわかった血清は、分析の陰性対照として用いる（右側）。これらのデータは、ワンステップＨＰＶ側方流動分析がＨＰＶ陰性血清と比較してＳＣＣ血清サンプルからＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出できることを示す。

【0154】

図３０Ｅは、膜上にストリップした他のマウス抗ＨＰＶ Ｅ６モノクローナル抗体および検出のために結合した金を用いた、ＨＰＶ Ｅ６組み換え型タンパク質を検出するワンステップ側方流動の結果を示す。上側の線で示した試験対象（ＴＣ）、上から二番目の線（矢印）は左で分析の陽性検出を示すが、可視帯を持たない右側の矢印は分析の陰性を示す。Ｅ６組み換え型タンパク質の濃度は左から右へ８７５，４３８，０μｇ／ｍＬである。これらのデータは、ワンステップＨＰＶ側方流動分析が４３５μｇ／ｍＬまたはそれ以下の濃度でＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出できることを示す。

【0155】

側方流動が臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出できることを示すため、図３０Ｆは、膜上にストリップしたマウス抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体および検出のために結合した金粒子を用いた、ＨＰＶ Ｅ７組み換え型タンパク質を検出するワンステップ側方流動の結果を示す。上側の線で示した試験対象（ＴＣ）、上から二番目の線（矢印）は左で分析の陽性検出を示すが、可視帯を持たない右側の矢印は分析の陰性を示す。Ｅ７組み換え型タンパク質の濃度は左から右へ０，６６０，６６，６．６，０．６６μｇ／ｍＬである。これらのデータは、ワンステップＨＰＶ側方流動分析が６６０ｎｇ／ｍＬまたはそれ以下の濃度でＨＰＶ Ｅ６タンパク質を検出できることを示す。

【0156】

さらに側方流動が臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出できることを示すため、図３０Ｇは、図３０Ｆにおいて示したのと同じ膜上にストリップしたマウス抗ＨＰＶ Ｅ７モノクローナル抗体を用いた、臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出するワンステップ側方流動の結果を示す。上側の線で示した試験対象（ＴＣ）、上から二番目の線（矢印）はＰＣＲによってＨＰＶ陽性とわかっている血清サンプルからのＥ７タンパク質の陽性検出を示す（左側）。可視帯を持たないＰＣＲによってＨＰＶ陰性とわかった血清は、分析の陰性対照として用いる（右側）。これらのデータは、ワンステップＨＰＶ側方流動分析がＨＰＶ陰性血清と比較してＳＨＰＶ陽性とわかっている血清からＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出できることを示す。

【0157】

本願明細書で得られたＨＰＶ初期および／または後期遺伝子由来の抗体および精製組み換え型タンパク質を用いた１個以上の免疫学的分析は、ＨＰＶ感染が起こる信頼できる指標として機能する。加えて、ＨＰＶに関連する悪性腫瘍または前癌細胞形質転換を分析できる。本発明の最も有効な態様の一つは、子宮頸癌、扁平上皮および腺癌の両方とｋｏｌｉｏｃｙｔｏｓｉｓ；ｈｙｐｅｒｋｅｒｏｔｏｓｉｓ；上皮内癌または上皮病変を含む前
癌状態等の発癌ＨＰＶ感染に関連する内皮細胞異常の診断である。

【0158】

ＨＰＶ感染の初期診断は、子宮頸癌の予防および治療に重要である。子宮頸がんを予防する方法は、過去もしくは現在のＨＰＶ感染および／または前癌病変を有する対象に加えて世界中で幅広い範囲で改良したＨＰＶ試験／スクリーニングを必要とする。重要なことに、１２〜１５年間の女性におけるＨＰＶの感染は侵襲性癌に発達する前に必要であることがわかっている。したがって、前癌を治療する化学療法または放射線に頼るよりも、ＨＰＶ感染に対するバイオマーカーを分析して初期に女性を前もってスクリーニングし、初期にＨＰＶ感染を治療し、子宮頸癌への進行を予防することができるのが重要である。

【図7B】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図30D】

【図30E】

【図30F】

【図30G】