特許 5872685 免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5872685

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160216BHJP

   C12N 15/117 20100101ALI20160216BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/265 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/17 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/04 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/112 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/108 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20160216BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N15/00 J

   C12Q1/68 Z

   A61K39/00 H

   A61K39/02

   A61K39/12

   A61K39/265

   A61K39/17

   A61K39/04

   A61K48/00

   A61K39/112

   A61K39/108

   A61K31/711

   A61K31/7125

【請求項の数】10

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2014-511898(P2014-511898)

(86)(22)【出願日】2012年5月25日

(65)【公表番号】特表2014-516534(P2014-516534A)

(43)【公表日】2014年7月17日

(86)【国際出願番号】EP2012059800

(87)【国際公開番号】WO2012160184

(87)【国際公開日】20121129

【審査請求日】2014年2月4日

(31)【優先権主張番号】11167605.2

(32)【優先日】2011年5月26日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/490,387

(32)【優先日】2011年5月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】230105223

【弁護士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】シユリール，カルラ・クリステイーナ

(72)【発明者】

【氏名】イルク，トーマス・シモン

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０７９２９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５４２２３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０６７２８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５１７６３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３５２４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０２００１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０２１２８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５３２０６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０２３５７７４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５１２０９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０２１２０２８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 The Journal of Immunology，２０１０年 ５月，Vol.185，pp.460-467

【文献】 J. Poult. Sci.，２００９年，Vol.46，pp.69-80

【文献】 Molecular Immunology，２００９年，Vol.46，pp.3163-3170

【文献】 Antisense & Nucleic Acid Drug Development，２００１年，Vol.11, No.5，pp.333-340

【文献】 J. Immunol. Methods.，２０１０年，Vol.358, No.1-2，pp.93-103

【文献】 Infect. Immun.，２００６年，Vol.74, No.2，pp.940-946

【文献】 Vet. Immunol. Immunopathol.，２００７年，Vol.115, No.3-4，pp.216-222

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ａ６１Ｋ ３１／７１１

Ａ６１Ｋ ３１／７１２５

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３９／０２

Ａ６１Ｋ ３９／０４

Ａ６１Ｋ ３９／１０８

Ａ６１Ｋ ３９／１１２

Ａ６１Ｋ ３９／１２

Ａ６１Ｋ ３９／１７

Ａ６１Ｋ ３９／２６５

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ｃ１２Ｎ １５／１１７

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式
^５’［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’
を有し、式中、
ｘ＝３から２０；
ｚ＝０から１０；
ｎ＝２から１００；
である、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、またはその医薬的に許容可能な塩。

【請求項2】

ｘ＝３から１０；
ｚ＜５；
ｎ＝３から１８；
であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド。

【請求項3】

^５’［Ｇ］_ｘおよび^３’［Ｇ］_ｚヌクレオチドがホスホロチオエート結合を有し、他のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を有する、請求項１または請求項２に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。

【請求項4】

前記オリゴデオキシヌクレオチドが、担体またはハプテンに結合されている、請求項１から請求項３の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。

【請求項5】

請求項１から請求項３の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクター。

【請求項6】

感染症を防ぐまたは感染症と闘うためのワクチンであって、前記ワクチンは、
免疫刺激量の、請求項１から請求項４の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫学的量の抗原成分若しくは抗原成分をコードするポリヌクレオチド、および／または
請求項５に記載のベクターおよび免疫学的量の抗原成分もしくは抗原成分をコードするポリヌクレオチド、ならびに
医薬的に許容可能な担体を含むことを特徴とするワクチン。

【請求項7】

前記抗原成分が、野生型の形態で家禽類に対する病原性を有するウイルスまたは微生物であるか、このウイルスまたは微生物に由来することを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。

【請求項8】

前記ウイルスまたは微生物が、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウスのう病（ガンボロ）、ニワトリ貧血エージェント、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、アイメリア属種、オルニソバクテリウム・ライノトラキア（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マイコプラズマ・シノビエ （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属種および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。

【請求項9】

薬剤として使用するための、請求項１から請求項４の何れかに記載の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、または請求項５に記載のベクター。

【請求項10】

家禽類において感染症を防ぐまたは感染症と闘うために使用するための、請求項１から請求項４の何れかに記載の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、または請求項５に記載のベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド、このようなオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターおよびワクチン、薬剤としてのこれらの使用、感染症を防ぐまたは感染症と闘う際のこれらの使用、ならびにこのようなオリゴデオキシヌクレオチドの検出方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

過去２０年の間に、免疫系科学において、脊椎動物の免疫系は、病原体の独特な特性に対する受容体介在性認識を介して、微生物感染を検出し、かつ迅速な免疫活性化を誘発するメカニズムを有することが明らかとなってきており、これがいわゆる、同系（ｃｏｇｎａｔｅ）宿主病原体認識受容体（ＰＲＲ）と相互作用する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）である（非特許文献１、非特許文献２）。

【0003】

ある種の型の病原体デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が、これらＰＡＭＰの間で共通していることが現在明らかである。１９９５年に、細菌ＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧモチーフが、マウスのＢ細胞活性化を誘発することが報告された（非特許文献３）。この研究により初めて、細菌免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡの特異的認識と、哺乳類のＤＮＡにおける以前に認識されたＣｐＧの抑制および広範なＣｐＧメチル化との関連が生み出された。最も有効なＢ細胞刺激性非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）は、配列要素ＧＡＣＧＴＴを有することが示された。

【0004】

当該分野における次の先例となる論文は、大阪（日本）のアキラシズオ研究室によって発表された（非特許文献４）。遺伝子クローニングおよびマウスにおけるターゲット遺伝子ノックアウトアプローチによって、ＣｐＧ−ＯＤＮに対するマウスの細胞反応が、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって媒介されることが明白に示された。その後、ＣｐＧ−ＯＤＮは、主にＮＦカッパ−Ｂ経路を介したＴＬＲ９シグナリングのアゴニストであることが示された（非特許文献５）。その後１０年のうちに、基本的な研究トピックおよび一般的な潜在的免疫療法用途について非常に数多くの研究が発表された（例えば、非特許文献６から非特許文献８の総説；非特許文献９から非特許文献１５）。いくつかの総説記事が、ＣｐＧ−ＯＤＮの抗感染用途（非特許文献１６）、癌治療におけるＴＬＲ９アゴニストの利用（非特許文献１７、非特許文献１８）、喘息およびアレルギー治療のためのＴＬＲ９活性化（非特許文献１９から非特許文献２１）、ならびにワクチンアジュバント（非特許文献２２から非特許文献２７）に注目している。

【0005】

ＣｐＧ ＯＤＮは、獣医学的用途、特にウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ニワトリおよび魚類における免疫刺激剤およびワクチンアジュバントとして記載および考察されている（非特許文献２８から非特許文献３３）。

【0006】

ニワトリにおける獣医学的利用の分野では、ニワトリをニューカッスル病から保護するための例えばワクチンでのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの使用が記載されている（非特許文献３４）。最近、ニワトリにおいて、ＴＬＲ２１が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの認識において、哺乳類のＴＬＲ９に対する機能的相同体としての機能を果たしていることが示された（非特許文献３５）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｉｗａｓａｋｉ Ａ，Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７，２９１−２９５．

【非特許文献2】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ．，Ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｙｍｐｔｏｔｅ：２０ ｙｅａｒｓ ｌａｔｅｒ．２００９．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０，７６６−７７５．

【非特許文献3】Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，Ｙｉ Ａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｏｎ Ｓ．，Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ，Ｊ．，Ｂｉｓｈｏｐ Ｇ．Ａ．，Ｔｅａｓｄａｌｅ Ｒ．，Ｋｏｒｅｔｚｋｙ Ｇ．Ａ．，Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．，１９９５．ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｒｉｇｇｅｒ ｄｉｒｅｃｔ Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３７４，５４６−５４９．

【非特許文献4】Ｈｅｍｍｉ Ｈ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｏ．，Ｋａｗａｉ Ｔ．，Ｋａｉｓｈｏ Ｔ．，Ｓａｔｏ Ｓ．，Ｓａｎｊｏ Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｍ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｋ．，Ｗａｇｎｅｒ Ｈ．，Ｔａｋｅｄａ Ｋ．，Ａｋｉｒａ Ｓ．，２０００．Ａ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ４０８，７４０−７４５．

【非特許文献5】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ．，２００１．ＣｐＧ ＤＮＡ：ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１５−１６．

【非特許文献6】Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，２００２．ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，７０９−７６０．

【非特許文献7】Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，２００３．ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ？Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，８３１−８３５．

【非特許文献8】Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，２００６．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．５，４７１−４８４．

【非特許文献9】Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．，２００４．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅｓ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，２４９−２５８．

【非特許文献10】Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ．，２００５．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ＴＬＲ９．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，６７３−６８２．

【非特許文献11】Ｗｉｌｓｏｎ Ｈ．Ｌ．，Ｄａｒ Ａ．，Ｎａｐｐｅｒ Ｓ．Ｋ．，Ｍａｒｉａｎｅｌａ Ｌｏｐｅｚ Ａ．，Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．，Ｍｕｔｗｉｒｉ Ｇ．Ｋ．，２００６．Ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，１８３−２１３．

【非特許文献12】Ｋｉｎｄｒａｃｈｕｋ Ｊ．，Ｐｏｔｔｅｒ Ｊ．，Ｗｉｌｓｏｎ Ｈ．Ｌ．，Ｇｒｉｅｂｅｌ Ｐ．，Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．，Ｎａｐｐｅｒ Ｓ．，２００８．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ＣｐＧｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，５９０−６００．

【非特許文献13】Ｄｏｒｎ Ａ．，Ｋｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｓ．，２００８．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ−，ｎｏｎ−ＣｐＧ−，ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０，１０−２０．

【非特許文献14】Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ．，Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，２００９．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＴＬＲ９ ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，１９５−２０４．

【非特許文献15】Ｗｉｌｓｏｎ Ｋ．Ｄ．，ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｓ．Ｄ．，Ｔａｍ Ｙ．Ｋ．，２００９．Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２３３−２４２．

【非特許文献16】Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，２００７ａ．Ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｏｃ．４，２８９−２９４．

【非特許文献17】Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，２００７ｂ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＴＬＲ９ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７，１１８４−１１９４．

【非特許文献18】Ｗｅｉｎｅｒ Ｇ．Ｊ．，２００９．ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２６３−２６７．

【非特許文献19】Ｋｌｉｎｅ Ｊ．Ｎ．，２００７．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｓｔｈｍａ ｕｓｉｎｇ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３９，２７９−２８６．

【非特許文献20】Ｋｌｉｎｅ Ｊ．Ｎ．，Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．，２００８．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ａｓｔｈｍａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．２１，４３４−４３９．

【非特許文献21】Ｆｏｎｓｅｃａ Ｄ．Ｅ．，Ｋｌｉｎｅ Ｊ．Ｎ．，２００９．Ｕｓｅ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｓｔｈｍａ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２５６−２６２．

【非特許文献22】Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ，Ｃｕｒｒｉｅ Ｄ．，Ｇｕｒｓｅｌ Ｉ．，Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ Ｄ．，２００４．Ｕｓｅ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９，２０１−２１６．

【非特許文献23】Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．，２００６．Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，１３５−１５４．

【非特許文献24】Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｃ．Ａ．，２００７．ＴＬＲ９ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９，４５−５２．

【非特許文献25】Ｗａｇｎｅｒ Ｈ．，２００９．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣｐＧ−ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２４３−２４７．

【非特許文献26】Ｍｕｔｗｉｒｉ Ｇ．，ｖａｎ Ｄｒｕｎｅｎ Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｕｒｋ Ｓ．，Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．，２００９．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２２６−２３２．

【非特許文献27】Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ．Ｍ．，Ｋｌａｓｃｈｉｋ Ｓ．，Ｓａｔｏ Ｔ．，Ｔｒｏｓｓ Ｄ．，２００９．ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２４８−２５５．

【非特許文献28】Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．，Ｇｏｍｉｓ Ｓ．，Ｈｅｃｋｅｒ Ｒ．，２００３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８２，８７０−８７５．

【非特許文献29】Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ａ．Ｃ．，Ｓｅｃｏｍｂｅｓ Ｃ．Ｊ．，２００６．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ＣｐＧｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１１２，８７−１０１．

【非特許文献30】Ｇｒｉｅｂｅｌ Ｐ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎｌｉｅ Ｒ．，Ｍａｎｕｊａ Ａ．，Ｎｉｃｈａｎｉ Ａ．，Ｍｏｏｋｈｅｒｊｅｅ Ｎ．，Ｐｏｐｏｗｙｃｈ Ｙ．，Ｍｕｔｗｉｒｉ Ｇ．，Ｈｅｃｋｅｒ Ｒ．，Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．，２００５．Ｂｏｖｉｎｅ ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１０８，１１−１６．

【非特許文献31】Ｍｕｔｗｉｒｉ Ｇ．，Ｐｏｎｔａｒｏｌｌｏ Ｒ．，Ｂａｂｉｕｋ Ｓ．，Ｇｒｉｅｂｅｌ Ｐ．，ｖａｎ Ｄｒｕｎｅｎ Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｕｒｋ Ｓ．，Ｍｅｎａ Ａ．，Ｔｓａｎｇ Ｃ．，Ａｌｃｏｎ Ｖ．，Ｎｉｃｈａｎｉ Ａ．，Ｉｏａｎｎｏｕ Ｘ．，Ｇｏｍｉｓ Ｓ．，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ Ｈ．，Ｈｅｃｋｅｒ Ｒ．，Ｐｏｔｔｅｒ Ａ．，Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．，２００３．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＣｐＧ ＤＮＡ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌｓ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．９１，８９−１０３．

【非特許文献32】Ｓｉｎｇｈ Ｍ．，Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｄ．Ｔ．，２００３．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３３，４６９−４７８．

【非特許文献33】Ｗｅｒｌｉｎｇ Ｄ．，Ｊｕｎｇｉ Ｔ．Ｗ．，２００３．ＴＯＬＬ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｌｉｎｋｉｎｇ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．９１，１−１２．

【非特許文献34】Ｌｉｎｇｈｕａ Ｚｈａｎｇら，２００７．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｅｗｃａｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ＳＰＦ ｃｈｉｃｋｅｎ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１１５，２１６−２２２．

【非特許文献35】Ｂｒｏｗｎｌｉｅ，Ｒ．，Ｚｈｕ Ｊ．，Ａｌｌａｎ Ｂ．，Ｍｕｔｗｉｒｉ Ｇ．Ｋ．，Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．，Ｐｏｔｔｅｒ Ａ．，Ｇｒｉｅｂｅｌ Ｐ．，２００９．Ｃｈｉｃｋｅｎ ＴＬＲ２１ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＴＬＲ９ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６，３１６３−３１７０．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

免疫調節剤としての特異的ＣｐＧ ＯＤＮの設計は、従来、完全にランダムなものであった。これは特に、非哺乳類ＣｐＧ ＯＤＮについて当てはまる。その理由は多くの要因からなり：先ず第１に、ヒトＴＬＲの免疫調節性ＣｐＧモチーフと非ヒトＴＬＲの免疫調節性ＣｐＧモチーフとの相関関係について知識がなく、非哺乳類種については放っておかれていること；第２に、非常に低い濃度のＣｐＧ ＯＤＮの影響を選択的に試験できるほどノイズレベルの十分に低いバックグラウンドで利用可能な細胞系がないこと；さらに、利用可能な高スループットのスクリーニング法がなく、たとえあったとしても、非哺乳類種の免疫調節剤として、ＣｐＧ ＯＤＮのインビボ有効性とインビトロ有効性との間に明白な相関関係がないこと、である。

【0009】

従って、高い免疫調節効果を有することで、低ドーズでも効果のある新規なＣｐＧ ＯＤＮが明らかに必要とされている。そして、ＣｐＧ−活性のインビトロ活性とインビボ活性との相関関係を示すという獣医学的目的のために、選択的かつ感度の良いＣｐＧ ＯＤＮ選択系が必要とされている。

【0010】

本発明の目的の１つは、このような新規のＣｐＧ ＯＤＮを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

この点で、本発明の一実施形態は、式
^５’［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’
を有し、式中、ｎ＝２から１００、ｘ＝３から２０、およびｚ＝０から１０である、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、およびその医薬的に許容可能な塩に関するものである。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｃｈｉＴＬＲ２１のプラスミドマップである。

【図2】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。

【図3】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。

【図4】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。

【図5】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。

【図6】リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、Ｘ２３−４からＸ２３Ｎ−２７の効果を示す図である。

【図7】リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、Ｘ２３−４からＸ２３Ｎ−２７の効果を示す図である。

【図8】リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、Ｘ２３−４からＸ２３Ｎ−２７の効果を示す図である。

【図9】Ｘ２３−４からＸ２３Ｎ−２７のＥＣ_５０値（ピコモル）を示す図である。

【図10】Ｘ４−ｐｅｎｔ（標準コントロール）、Ｘ２３−ｓｉｘ、Ｘ２３−ｎｉｎｅ−３４５５およびＸ２３−ｎｉｎｅ−３４５１のＥＣ_５０値を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

「免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド」は、シグナル伝達カスケードの開始を刺激する非メチル化シチジン−リン酸−グアノシンジヌクレオチド配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドを指し、これにより転写因子（ＮＦ−κＢまたはインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）等）の活性化が導かれる。この活性化が今度は、炎症性サイトカインの発現および他細胞の活性化イベントをもたらす。ＮＦ−κＢ結合部位およびＮＦ−κＢによって影響される遺伝子発現は、とりわけＳｃｈｉｎｄｌｅｒおよびＢａｉｃｈｗａｌ（１９９４）によって説明されている。

【0014】

用語オリゴデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドの短い核酸ポリマー（すなわち、リン酸基および交換可能な有機塩基と結合したデオキシリボースを多数含む分子）を意味する。このような有機塩基として、置換ピリミジンまたは置換プリンがある。例としてそれぞれ、シトシンおよびチミン、ならびにアデニンおよびグアニンがある。

【0015】

本発明に係るオリゴヌクレオチドは、修飾を含んでよい。このような修飾の例として、例えば、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルヌクレオシド間ブリッジにおける修飾がある。このような修飾はとりわけ、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートによるリン酸ジエステルの置換えに関連する。

【0016】

他の修飾として例えば、デホスホブリッジによるホスホジエステルブリッジの置換えがある。デホスホブリッジの例として、メチルヒドロキシルアミン、ホルムアセタールおよびジメチレンスルホン基がある。

【0017】

さらに他の修飾として、天然のヌクレオシド塩基の、非天然のヌクレオシド塩基（イノシン、５−フルオロシトシン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、２−チオウラシル、ジヒドロウラシル、５−ブロモ−シトシン、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン等）による置換えに関する修飾がある。

【0018】

また、他の修飾として、糖単位（β−リボース糖またはβ−Ｄ−２’−リボース糖単位）の修飾糖単位（例えばＬ−２’−デオキシリボースまたは２’−Ｌ−アラビノース等）による置換えに関する修飾がある。

【0019】

オリゴヌクレオチドのさらなる見識を与えるテキストとして、例えば「ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版，２００３，Ｃａｒｌ Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｓ．Ｄｒｅｋｓｌｅｒ，Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ＩＳＢＮ ９７８−０８７９６９６５４−２）がある。

【0020】

ＣｐＧモチーフを有する構造^５’｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎ^３’が、本発明に係るＯＤＮの活性のある免疫刺激部分を表す。従って、本発明は、このいわゆる「バックボーン」を含む免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。

【0021】

本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドのバックボーンは、構造^５’｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎ^３’が少なくとも２回、好ましくは３回存在しなければならないことがわかった。従って、ｎは少なくとも２であるべきである。また、ｎが増大すると、オリゴデオキシヌクレオチドの活性が増大することもわかった。この効果は、ｎが増大すると安定する。従って、基本的に、バックボーン構造の数ｎは少なくとも２であるべきである。好ましくは、ｎの範囲は３≦ｎ≦１００である。これは単に、合成配列がより長くなるほど製造がより困難になるという事実によるためである。実際には、好ましくはｎの範囲は３≦ｎ≦１８である。より好ましくは、ｎの範囲は４≦ｎ≦１８であり、さらにより好ましくは、ｎの範囲は５≦ｎ≦１８であり、なおさらにより好ましくは、ｎの範囲は６≦ｎ≦１８である。

【0022】

本発明に係るＣｐＧ ＯＤＮの識別は、とりわけ、ＮＦ−κＢ活性化の検出に現在使用されている検出系よりも選択的な検出系を用いることによって可能となった。Ｂｒｏｗｎｌｉｅら（２００９）は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼベースのリポータ系を記載している。他の系は例えば、ＩＬ−８転写測定、サイトカイン分泌、またはＮＯ分泌の検出に基づくものである。

【0023】

これに反し、本発明では、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ベースの検出系を用いた。ＳＥＡＰは、哺乳類の系におけるリポータ酵素である（Ｙａｎｇら，１９９７）。この系は、驚くほど感度が良いことがわかっており、また、驚くべきことに、試験したＣｐＧ ＯＤＮのインビトロ活性とインビボ活性との間で密接な相関関係が与えられる。ＳＥＡＰ系は、基質としてパラ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）と共に用いられた。

【0024】

既存の系に対する別の改善が、ＳＥＡＰ遺伝子を有するプラスミドの細胞内への導入および細胞内での安定した維持であった。これまで、全ての検出系が、リポータ遺伝子による細胞の一過性トランスフェクションを用いていた。これは、リポータ遺伝子の、細胞内への導入および細胞内での安定した維持によって初めて、ドーズ／応答曲線が作成され得たことによるものである。このような曲線は、種々のＣｐＧ ＯＤＮ活性間で信頼できる比較がなされ得るとすれば、不可欠なものである。

【0025】

従って、本発明の実施例部において詳細に記載される方法および細胞系は、種々のＣｐＧ ＯＤＮ間の信頼できる逐次比較を初めて可能にするものである。

【0026】

用いられる系のさらなる詳細が、実施例部に与えられている。

【0027】

構造^５’［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’の５’末端のＧの数が増大すると、ＣｐＧ ＯＤＮの活性が増大することがわかった。ｘ値は好ましくは少なくとも３であるべきであり、Ｇの数が増大して最大２０Ｇになるまで、ＣｐＧ ＯＤＮの活性が向上する。従って、より好ましくは、ｘは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である（進むにつれ好ましい順である）。

【0028】

また、構造^５’［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’の３’末端のＧの数が増大すると、ＣｐＧ ＯＤＮの活性が（わずかに）減少することもわかった。ｚ値は好ましくは１０以下であるべきであり、Ｇの数が減少して０Ｇになるまで、ＣｐＧ ＯＤＮの活性が向上する。従って、より好ましくは、ｚは９、８、７、６、５、４、３、２、１または０である（進むにつれ好ましい順である）。

【0029】

前述のように、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルヌクレオシド間ブリッジにおける数種類の修飾が可能である。しかし、基本的に、合成方法により、通常の一般的な２ヌクレオチド間の結合タイプは：リン酸ジエステル（ＰＤＥ）結合およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）結合である。ＣｐＧ ＯＤＮの安定性および免疫刺激効果を向上させるために、合成オリゴデオキシヌクレオチドの構成ブロックに通常ホスホロチオエートが与えられて、ＰＴＯ結合が形成される。

【0030】

しかしながら、驚くべきことに、^５’［Ｇ］_ｘおよび^３’［Ｇ］_ｚヌクレオチドだけがＰＴＯ結合によって結合され、他のヌクレオチドがＰＤＥ結合によって結合されると、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの有効性がさらに増大することがわかった。（このような場合、^５’［Ｇ］_ｘと｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’との結合はＰＴＯであり、^５’［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧと［Ｇ］_ｚ^３’との結合はＰＤＥである。）
従って、本実施形態の別の好ましい形は、^５’［Ｇ］_ｘおよび^３’［Ｇ］_ｚヌクレオチドがホスホロチオエート結合を有し、他のヌクレオチドはリン酸ジエステル結合を有する本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドに関するものである。

【0031】

通常、インビトロ試験系およびインビボの双方において、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、ナノモルの量で活性がある。

【0032】

しかしながら、驚くべきことに、本発明に係るＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、ピコモル（サブナノモル）の量でなお一層の活性がある；このＥＣ_５０は１ｎＭ未満である。

【0033】

オリゴデオキシヌクレオチドの最大半量濃度（ＥＣ_５０）とは、リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１またはＨＤ１１−ｐＮｉｆＴｙ２Ｈｙｇ）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰ（の有色産物（４０５ｎｍで吸光する）を生産する）量を誘導するのに必要なオリゴデオキシヌクレオチドの、最大半量酵素反応速度をもたらす量である。オリゴデオキシヌクレオチドのＥＣ_５０がこれらの細胞において１ｎＭ未満であるならば、ピコモル（サブナノモル）の量で活性があると考えられる。

【0034】

本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドを、反応性化学基を介して、担体またはハプテンに結合することは確実に可能である。このような結合により、組み合わせた分子の免疫刺激効果は増進する。

【0035】

そのような成分の単なる例として、例えばジゴキシゲニン、アミノヘキシル、テキサスレッドおよびビオチンがある。好ましい担体またはハプテンは、３’−および５’−標識化テキサスレッドならびに５’−標識化ジゴキシゲニンである。オリゴデオキシヌクレオチドのハプテン／担体への結合は、当該技術において周知である。

【0036】

本発明の別の実施形態は、本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターに関するものである。このようなベクターは、核酸分子（プラスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは分子生物学で用いられる他の任意のベクター等）であってよい。単なる例として、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターは例えば、細菌中で増やされ得るプラスミド等のＤＮＡ分子であってよい（本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドがクローン化されている）。このようなプラスミドは好ましくは活性な複製起源を有し、これにより大量のプラスミドが宿主内に存在することになる。このような細菌の大規模な増殖に続くプラスミドの単離が、本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドの合成生産の代替方法を提供する。

【0037】

本発明の目的の１つは、感染症を防ぐまたは感染症と闘うためのワクチン中の良好な免疫刺激性成分として、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報と併せて用いられ得る新規のＣｐＧ ＯＤＮ、および医薬的に許容可能な担体を提供することである。

【0038】

通常、用語抗原成分は、ヒトまたは動物に投与された場合に、免疫応答を誘導、刺激または増進することができる少なくとも１つのエピトープを含む物質の組成物を指す。

【0039】

抗原成分は、任意の種類の抗原成分であってよいが、好ましくは、野生型の形態でヒトまたは動物に対する病原性を有する微生物またはウイルスに由来するものである。

【0040】

抗原成分は、完全な病原体（好ましくは不活性化または弱毒化された形態である）、病原体の抽出物、または病原体の免疫原性タンパク質であってよい。

【0041】

抗原成分が病原体の免疫原性タンパク質である場合、その免疫原性タンパク質は好ましくは、インビトロ培養細胞中で発現されて、インビトロ培養細胞から回収される。

【0042】

従って、別の実施形態は、感染症を防ぐまたは感染症と闘うためのワクチンに関するものであり、前記ワクチンは、免疫刺激量の本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチド、および／または本発明に係るベクター、免疫原性量の抗原成分もしくは抗原成分をコードする遺伝的情報、ならびに医薬的に許容可能な担体を含むことを特徴とする。

【0043】

当然、オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量と抗原成分の免疫原性量とは、相互に強く関連付けられる。本発明の利点の１つは、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの存在が、感染症を防ぐまたは感染症と闘うのに必要な抗原成分の量を少なくすることができることである。

【0044】

感染症を防ぐまたは感染症と闘うのに必要な抗原成分の量は、抗原成分の免疫原性量と呼ばれる。

【0045】

オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量は、抗原成分の免疫原性量（すなわち、感染症を防ぐまたは感染症と闘うのに必要な抗原成分の量）を減少させることができる量である。

【0046】

そのため、基本的に、表現「オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量」および「免疫原性量」は、互いに関連させて見なければならない。

【0047】

勿論、ワクチンが、抗原成分をコードする遺伝的情報を含む場合、この遺伝的情報によって発現される抗原成分の量は、感染症を防ぐまたは感染症と闘うに十分であるべきであり；それはすなわち、免疫原性量でなければならない。

【0048】

本発明に係る非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドが免疫刺激性であるという事実は、これによりワクチン中の抗原成分の免疫学的有効性が増進されることを意味する。この理由で、本発明に係るワクチンは、多くの場合、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドが存在しない場合よりも少ない抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報を含むこととなる。従って、場合によっては、このような抗原成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを加えなければ、免疫原性特性が低いことがあるので、所望の免疫原性レベルに達しないにもかかわらず、結局のところ多量に与えられなければならない。そのような場合、抗原成分は、通常の高い濃度で投与されるが、しかしながらここで所望のレベルの免疫原性を得るために本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドと共に与えられる。

【0049】

従って、本発明に係るオリゴヌクレオチドと共に投与される抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報の量は、経験則として、オリゴヌクレオチドがない場合に与えられる量以下であろう。特異的ワクチンの製造に従事する当業者であれば、その特異的ワクチン量がわかるであろう。また、実施例は、例えば、（例えば３つの異なる不活化ウイルスワクチン（ニューカッスル病ウイルスワクチン、感染性気管支炎ウイルスワクチンおよびシチメンチョウ鼻気管炎ワクチン）において）用いられる抗原成分量についての十分なガイダンスを与えている。

【0050】

抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報と共に投与される必要がある本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの量は、選択されるオリゴデオキシヌクレオチドおよび抗原成分の双方に依存する。

【0051】

本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの非常に適切な量は、通常１から１００ナノモルの間で変化するであろう。非常に良好なインビボ結果は例えば、３０のデオキシヌクレオチドの平均長さを有する、１から１０μｇの本発明のオリゴデオキシヌクレオチド（インビトロ試験においてナノモル範囲で活性があることが示された）で得られた。

【0052】

オリゴデオキシヌクレオチドが、ピコモル範囲で活性があるオリゴデオキシヌクレオチドの群から選ばれる場合、当業者は、１ナノモルより下、１ナノモルをずっと下回る量（すなわち、ピコモル量）を、ナノモル量を試験する前に試験する価値があるかもしれないということに気付くであろう。

【0053】

本発明に係るワクチンは、医薬的に許容可能な担体を含む。この担体の性質はとりわけ、投与経路に依存する。投与経路が経口経路または鼻腔内経路を介するものである場合、担体は、滅菌水、生理的塩類液またはバッファのような簡単なものであってよい。注射が好ましい経路である場合、担体は好ましくは等張性であるべきであり、かつ注射に適するようなｐＨ制限を有するべきである。しかしながら、このような担体は当該技術において広く知られている。

【0054】

本発明に係るワクチンは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報、および本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドに加えて、アジュバントを含んでよい。アジュバントは一般に、非特異的な方法で宿主の免疫応答を増大させる物質である。

【0055】

多くのアジュバントが当該技術において適していることが知られている（フロイントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマーおよびポリアニオン、例えばデキストラン硫酸、ｃａｒｂｏｐｏｌおよびピラン、水酸化アラム（ａｌｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）等）。また、多用されるのは、リン酸アラム、サポニン、植物油（トコフェロール等）および鉱油である。非常に有効なアジュバントは、水中油エマルジョンおよび特に油中水エマルジョンであり、さらに水中油アジュバントおよび油中水アジュバントとも呼ばれる。このようなエマルジョンは当該技術において周知である。従って、好ましくは、ワクチンは油中水アジュバントを含む。

【0056】

好ましくは、抗原成分は、野生型の形態で家禽類に対する病原性を有するウイルスまたは微生物であるか、このウイルスまたは微生物に由来する。

【0057】

より好ましくは、前記ウイルスまたは微生物は、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウスのう病（ガンボロ）、ニワトリ貧血エージェント、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、アイメリア属種、オルニソバクテリウム・ライノトラキア（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）（トリ感染症病原菌）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マイコプラズマ・シノビエ （Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属種および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群から選択される。

【0058】

また、本発明の別の実施形態は、薬剤として使用するための本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関するものである。

【0059】

また、本発明の別の実施形態は、家禽類において感染症を防ぐまたは感染症と闘う際に使用するための本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関するものである。

【0060】

これまで、全ての検出系は、リポータ遺伝子による細胞の一過性トランスフェクションを用いていた。このような一過性の系では、ＣｐＧ ＯＤＮの有効性の信頼できる逐次比較が可能ではない。前述したように、既存の系に対する主要な改善は、リポータ遺伝子を有するプラスミドの、細胞内への導入および細胞内での安定した維持であった。安定とは、何回かの細胞分裂周期の後にプラスミドが細胞中に存在したままであることを意味するものである。

【0061】

プラスミドの安定した維持が、１つまたは複数の選択剤（抵抗遺伝子がプラスミド上に存在することによる抗生物質等）の圧力下で細胞を増殖させることによって、頻繁に得られる。プラスミドを損失すると、プラスミドを失った細胞が死ぬこととなる。残りの生存細胞にはプラスミドがまだ存在することとなる。

【0062】

安定維持の別の方法として、線状化プラスミドによるトランスフェクションがあろう。このようなプラスミドは通常、細胞のゲノム中に統合されるので、安定して維持される。従って、本発明のさらに別の実施形態は、ＴＬＲ２１−受容体と、ＮＦ−κＢリポータ遺伝子をコードするプラスミドとを含む細胞に関するものであり、プラスミドは細胞中に安定して維持される。このような細胞は、ＣｐＧ分子のスクリーニング、より具体的には本発明に係るＣｐＧ分子のスクリーニングにおいて使用するのに非常に適している。

【0063】

実施例は、細胞中に安定して維持され得る、リポータ遺伝子をコードするプラスミドを含むこのような細胞を得る方法について、十分なガイダンスを与えている。

【0064】

上でも言及したように、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に基づく検出系が、使用される検出系に非常に適していることが示された。

【0065】

従って、好ましくは、リポータ遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子である。

【0066】

基本的に、ＴＬＲ２１を有し、かつこれを発現する任意の細胞または細胞系（上述したように、ＮＦ−κＢリポータ遺伝子、好ましくはＳＥＡＰ遺伝子を有するプラスミドの導入、および好ましくはその安定した維持を可能とする）が、ＴＬＲ２１特異的ＣｐＧ ＯＤＮを試験するのに適している。

【0067】

ＴＬＲ２１特異的ＣｐＧ ＯＤＮを試験するのに適したそのような細胞系の好ましい例として、ニワトリ細胞系ＨＤ１１がある。

【0068】

従って、好ましくは、検出系において使用するための細胞系は、リポータ遺伝子をコードする安定したプラスミドを含むＨＤ１１細胞系である。

【0069】

ニワトリ細胞系（ＨＤ１１細胞系等）は、ニワトリＴＬＲの全パネルを示す。これにより、ある種の条件において、ある種のバックグラウンド活性が生じ得る。

【0070】

従って、哺乳類細胞系のような非家禽類細胞系が、より好ましい細胞系である。このような哺乳類細胞系の例として、ＴＬＲ２１がクローン化されているＨＥＫ２９３細胞がある。このような細胞系は、ＴＬＲ２１活性化シグナルに対する選択性がより特異的である。

【0071】

従って、より好ましくは、検出系において使用するための細胞系は、安定して維持されるリポータ遺伝子を含み、かつＴＬＲ２１がクローン化されている哺乳類細胞系ＨＥＫ２９３である。

【0072】

本発明のさらに別の実施形態は、本発明に係る免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法に関するものであり、当該方法は、ａ）本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドを細胞に接触させるステップと、ｂ）リポータ遺伝子の産物のレベルを検出するステップとを含む。

【0073】

この方法の好ましい形において、リポータ遺伝子の産物はＳＥＡＰである。
本実施形態のより好ましい形は、本発明に係る免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法に関するものであり、細胞は、ニワトリ細胞系ＨＤ１１、またはニワトリＴＬＲ２１がクローン化されているＨＥＫ２９３細胞系の細胞である。

【0074】

実施例
実施例１
ニワトリＴＬＲ２１の遺伝子クローニングおよび非相同発現
ニワトリＴＬＲ研究における最近の進展により、ＴＬＲ２１が、鳥種において、哺乳類ＴＬＲ９の機能的相同体であることが示唆されている（Ｋｅｅｓｔｒａ ２００８、Ｂｒｏｗｎｌｉｅら ２００９）。

【0075】

ＴＬＲ２１遺伝子クローニングの概略
Ｇｅｎｂａｎｋデータベース配列ＮＭ＿００１０３０５５８に基づいて、プライマーペアを、ニワトリＴＬＲ２１遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用に合成した：
Ｇａ−ＴＬＲ２１−ｆｏｒ１
ＧＡＡＧＣＴＴ（ＡＣＣ）［ＡＴＧ］ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣ
Ｇａ−ＴＬＲ２１−ｒｅｖ１
ＧＧＣＧＧＣＣＧ［ＣＴＡ］ＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧ
プライマーは、フランキング位置制限クローニング部位（下線）、ならびにコザック配列（丸括弧）、開始コドンおよび終止コドン（角括弧）を与えるように設計した。これらのプライマーおよびテンプレートとしてニワトリ脾臓総ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。予想されるサイズ（約３０００ｂｐ）のＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ内にクローン化し、５つの独立したプラスミドクローン（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４）を配列決定した。

【0076】

用いたニワトリＴＬＲ２１のＤＮＡ配列。

【0077】

ＡＡＧＣＴＴ（ＡＣＣ）［ＡＴＧ］ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＴＣＧＣＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＧＣＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＴＣＴＣＡＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＴＧＴＡＡＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＧＣＴＴＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＧＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＴＧＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＧＧＴＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＴＴＴＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧ［ＴＡＧ］ＣＧＧＣＣＧＣ

【0078】

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏ−ｃｈｉＴＬＲ２１によるＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−Ｚｅｏ（クローン細胞系）のトランスフェクション
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞２９３は、１９７０年代にウイルストランスフォーメーション（Ｇｒａｈａｍら，１９７７）によって生み出されたものであり、現在、細胞系リポジトリ（ＡＴＣＣ等）を経由して、研究コミュニティが利用できるものである。

【0079】

ｐＮｉｆｔｙ２は、ＮＦκＢ転写因子活性化（多くの免疫刺激性作用（そのなかでも、Ｔｏｌｌ様受容体活性化）のホールマークである）の検出を可能にするプラスミドである。ＮＦκＢ活性化に関する転写／翻訳に依存的なｐＮｉｆＴｙ２中のリポータ遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。詳細は、このプラスミドを販売している企業（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）のデータシートに記載されている。ｐＮｉｆｔｙ２によるトランスフォーメーション／トランスフェクションイベントを、細菌および哺乳類細胞の双方において、増殖培地へのゼオシンの添加により選択する。

【0080】

ＨＥＫ２９３細胞を、標準的な方法（リポフェクション）によってｐＮｉｆＴｙ２によりトランスフェクトし、安定した細胞系を選択し、ＮＦ−κＢ／ＳＥＡＰ軸の機能性を、ヒト腫瘍壊死因子α（Ｓｉｇｍａ）による刺激によって確立した。刺激した細胞の培養上清中の分泌ＳＥＡＰを、発色基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ、５ｍＭ）（アルカリ性バッファ（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．６、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）中）を用いるマイクロタイタープレート比色アッセイによって判定した。発色（λ＝４０５ｎｍ）を、マイクロタイタープレートリーダによって監視した。また、この読取りを用いて、高いシグナル対ノイズ比のクローン系を（限界希釈法によって）選択した。これらの選択したクローンの１つ（ダブ（ｄｕｂｂｅｄ）クローン１１）を、ニワトリＴＬＲ２１を用いるさらなる研究に用いた。

【0081】

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｎｅｏは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した標準的な哺乳類発現ベクターである。このベクター内へのニワトリＴＬＲ２１遺伝子のサブクローニングを、ＰＣＲによって導入したフランキング位置Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（開始コドン）およびＮｏｔ Ｉ（終止コドン）部位を介して行った（図１参照）。

【0082】

続いて、このプラスミドをクローンＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｚｅｏ系内にトランスフェクトし（リポフェクション）、組換え細胞を、ゼオシンおよびＧ４１８双方の増殖培地中への添加により選択した。生じたポリクローナル組換え細胞系の機能性を、ＯＤＮ−Ｘ４およびＯＤＮ−ＨＥＫ１−ＰＴＯによる培養物の刺激、ならびにＳＥＡＰの検出によって評価した。続いて、優れたクローン系を、限界希釈法とその後の刺激およびＳＥＡＰ検出とによって識別した。

【0083】

ＳＥＡＰは、哺乳類系におけるリポータ酵素である（Ｙａｎｇら，１９９７）。ＳＥＡＰは、分泌型ヒト胚アルカリホスファターゼである。この主要な利点は、高い安定性および非常に高い特異的活性であり、これらにより検出の感度およびロバスト性が確実なものとなる。ＳＥＡＰ検出用のいくつかの基質が記載されているが、経済的かつロバストなｐＮＰＰを選択した（その反応産物ｐ−ニトロフェノラートが高い感度（ε４０５＝１８５００Ｍ−１ｃｍ−１）で検出されるからである）。発明者らの試験セットアップでは、カイネティックアッセイを実行する（より広い定量化ダイナミックレンジをもたらすからである）。

【0084】

ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−Ｚｅｏ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏ−ｃｈｉＴＬＲ２１（ＰｖｕＩで線状化した）によりトランスフェクトし、培地を３５０μｇ／ｍｌゼオシンおよび６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８で補充することにより、ポリクローナル細胞系を選択した。ＯＤＮ−Ｘ４（ＰＤＥ）およびＯＤＮ−ＨＥＫ１（ＰＴＯ）により細胞を刺激することによって、機能性試験を実行した。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）が、選択した細胞によって生産されたが、親ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−Ｚｅｏ細胞系によっては生産されなかった。単一細胞クローニングを実行し、個々のクローンを、ＯＤＮ−Ｘ４（ＰＤＥ）（ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧ）およびＯＤＮ−ＨＥＫ１（ＰＴＯ）（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）に対する反応性について分析した。

【0085】

４６のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のうち、わずか３つが明らかにＯＤＮ刺激に反応し、さらに３つから４つの細胞系がより弱いシグナルを示した。従って、選択したクローンの８５％が機能的でなかった。

【0086】

さらなる全ての研究用に、クローン細胞系３８（ＯＤＮ−Ｘ４（ＰＤＥ）およびＯＤＮ−ＨＥＫ１（ＰＴＯ）刺激に対する反応に関して飛びぬけた最も高いＳＥＡＰ読取りシグナルを生じた）を用いた。

【0087】

図２から図５は、種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要を示す。

【0088】

実施例２
モチーフ^５’［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’に基づくこの一連のホモポリマーにおいて、３’−ｄＧランを、試験した全てのＯＤＮについて、１Ｇにまで短くした。

【0089】

例えば：例Ｘ２３Ｎ−５は、［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’を表し、式中、ｘ＝７、ｚ＝０およびｎ＝２である：Ｇ_７｛ＴＣＧＴＣＧ｝_２ＴＣＧ
例えば：例Ｘ２３Ｎ−７は、［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’を表し、式中、ｘ＝７、ｚ＝０およびｎ＝３である：Ｇ_７｛ＴＣＧＴＣＧ｝_３ＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−５ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−７ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−９ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−１１ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−１３ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−１５ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−１７ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−１９ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−２１ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−２３ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−２５ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｘ２３Ｎ−２７ ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
図６から図８は、リポータ細胞ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、Ｘ２３−４からＸ２３Ｎ−２７の効果を示す。

【0090】

驚くべきことに、図６から、ｎ＝３であると免疫刺激効果が予想外に高いと結論することができる。この効果は、図９（下記参照）において、予想外に低いＥＣ_５０値ではっきりと定量化されている。

【0091】

さらに、図６から図８から、ｎ＝３からｎ＝１３にまで増大すると、活性がより一層増大する（＝ＥＣ_５０の低下）と結論することができる。この増大は、かなり早くに下げ止まりを示す（ｎが５の値に達したとき）。

【0092】

図９は、Ｘ２３−４からＸ２３Ｎ−２７のＥＣ_５０値（ピコモル）を示す。

【0093】

図９からわかるように、ｎ＝４の値でＥＣ_５０は２００ｐＭをほんのわずかに超えるだけであり、ｎ＝１０の値を過ぎてから、ＥＣ_５０値は１００ｐＭをわずかに下回るプラトーに達する。

【0094】

実施例３
モチーフ^５’［Ｇ］_ｘ｛ＴＣＧＴＣＧ｝_ｎＴＣＧ［Ｇ］_ｚ^３’に基づくこの一連のホモポリマーにおいて、ｎ＝４のまま、３’−Ｇの数を変えた。

【0095】

以下の構築体を試験した：
Ｘ２３−ｓｉｘ ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ−３’
（＝Ｘ２３、標準形１）
Ｘ４−ｐｅｎｔ ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧ−３’
（＝標準形２）
Ｘ２３−ｎｉｎｅ−３４５５ ５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ−３’
（→ｎ＝４、ｘ＝５、ｚ＝４）
Ｘ２３−ｎｉｎｅ−３４５１ ５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ−３’
（→ｎ＝４、ｘ＝５、ｚ＝０）
図１０は、リポータ細胞ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、３’−Ｇの数を変えた効果を示す。

【0096】

これらのＣｐＧモチーフについて、ＥＣ_５０は以下の通りである：
Ｘ４−ｐｅｎｔ（標準コントロール） ３４０ｐＭ
Ｘ２３−ｎｉｎｅ−３４５５（ｎ＝４、ｘ＝５、ｚ＝４） ＜＜１００ｐＭ
Ｘ２３−ｎｉｎｅ−３４５１（ｎ＝４、ｘ＝５、ｚ＝０） ＜＜１００ｐＭ
この結果から、３’−Ｇの数は、ｚ＝４または４未満であるならば、ＥＣ_５０に特に関連しないと推論することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]