特許 5872700 新規バクテリオファージ及びそれを含む抗菌組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5872700

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】新規バクテリオファージ及びそれを含む抗菌組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20160216BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20160216BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20160216BHJP

   A23K 50/10 20160101ALI20160216BHJP

   A23K 20/00 20160101ALI20160216BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/00ZNA

   A61K35/76

   A61P31/04

   A61P31/04 171

   A23K1/18 B

   A23K1/16 304B

【請求項の数】8

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2014-530608(P2014-530608)

(86)(22)【出願日】2012年9月20日

(65)【公表番号】特表2014-527815(P2014-527815A)

(43)【公表日】2014年10月23日

(86)【国際出願番号】KR2012007555

(87)【国際公開番号】WO2013042964

(87)【国際公開日】20130328

【審査請求日】2014年3月19日

(31)【優先権主張番号】10-2011-0094648

(32)【優先日】2011年9月20日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM 11208P

(73)【特許権者】

【識別番号】508139664

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＣＪ ＣＨＥＩＬＪＥＤＡＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，シ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，チェ ウォン

(72)【発明者】

【氏名】チョ，ヨン ウク

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヨン サ

(72)【発明者】

【氏名】シン，ウン ミ

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００５２５４１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００５２５４２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００５２５４３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００５２５４４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１６６７０９（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ７／００−７／０８

Ａ２３Ｋ １／００−１／２４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サルモネラコレラスイス（Salmonella choleraesuis）に特異的殺菌力を有し、寄託番号ＫＣＣＭ１１２０８Ｐである、分離したバクテリオファージ。

【請求項2】

請求項１のバクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス、サルモネラニューポート及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサルモネラ菌により引き起こされる感染性疾病の予防又は治療用組成物。

【請求項3】

前記サルモネラコレラスイス又はサルモネラティフィムリウムにより引き起こされる感染性疾病はサルモネラ症又はサルモネラ食中毒であり、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス及びサルモネラニューポートにより引き起こされる感染性疾病は細菌性感染型サルモネラ食中毒である、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

請求項１のバクテリオファージを有効成分として含む抗生物質。

【請求項5】

請求項１のバクテリオファージを有効成分として含む、家畜用飼料又は飲料水。

【請求項6】

請求項１のバクテリオファージを有効成分として含む、消毒剤又は洗浄剤。

【請求項7】

請求項１のバクテリオファージを必要とする動物（ヒトを除く）に投与する段階を含む、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス、サルモネラニューポート及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサルモネラ菌により引き起こされる感染性疾病の予防又は治療方法。

【請求項8】

請求項２の組成物を必要とする動物（ヒトを除く）に投与する段階を含む、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス、サルモネラニューポート及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサルモネラ菌により引き起こされる感染性疾病の予防又は治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規バクテリオファージ及びそれを含む抗菌組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

サルモネラ菌の遺伝子塩基構成成分は、ＧＣ含量が５０〜５２％であり、大腸菌（Escherichia coli）及び赤痢菌（Shigella）に類似する。サルモネラ属菌は、ヒトのみならず様々な家畜に感染して様々な疾病を引き起こす病原性微生物である。サルモネラ菌種であるサルモネラエンテリカ（Salmonella enterica）は、血清学的分類によりサルモネラガリナルム（Salmonella gallinarum）、サルモネラプロラム（Salmonella pullorum）、サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium, ST）、サルモネラエンテリティディス（Salmonella enteritidis, SE）、サルモネラティフィ（Salmonella typhi）、サルモネラコレラスイス（Salmonella choleraesuis, SC）、サルモネラダービー（Salmonella derby, SD）などを含む多くの血清型（serovar）を有する。これらのうち、豚特有のコレラスイスやダービーなどが疾病を引き起こして農家や消費者に莫大な被害をもたらすこともあり、家禽特有のガリナルムやプロラム、対象動物が多様な人獣共通血清型であるティフィムリウムやエンテリティディス、ヒト特有のティフィなどが被害をもたらすこともある（非特許文献１）。

【0003】

近年、豚に直接的な被害をもたらし、食肉衛生において重要なサルモネラ菌は、飼育中に豚の消化器官内に存在していたサルモネラ菌が屠殺過程で豚肉を汚染する可能性が高いため、２００３年７月１日から韓国の全屠殺場にＨＡＣＣＰ（食品危害要素重点管理制度）が導入されている（非特許文献２）。

【0004】

サルモネラ感染による豚の急性又は慢性の消化器伝染病は、豚パラチフス（paratyphoid）とも呼ばれ、胃腸炎及び敗血症を特徴とし、主に肥育期に多く発生する。特に、この疾病の一部の原因菌は、食肉を通じてヒトの食中毒を引き起こすことがあるので、公衆保健学的にも重要な疾病である。多くの種類のサルモネラが原因菌となり得る。とりわけ、豚コレラ菌としてよく知られた菌であるサルモネラコレラスイス 及びサルモネラティフィスイス（Salmonella typhisuis）は、サルモネラによる急性敗血症の主な原因菌である。急性腸炎型は、肥育期の家畜に主に発生し、食欲が一定せず、激しい水様性下痢と高熱、脱力、肺炎及び神経症状を伴う。重症の場合、皮膚変色が生じる。サルモネラティフィムリウム、サルモネラエンテリティディス、サルモネラダービーなどは、主に慢性腸炎を引き起こす原因菌である。

【0005】

サルモネラ感染症は基本的にサルモネラ菌に汚染された飼料、水などにより経口感染するので、このような伝播経路に対する対策が強く求められている。汚染された原料飼料や水又は菌を保菌している成豚が重要な感染源となり得る。急性感染期にある豚は、糞便１ｇ当たり１０６個のサルモネラコレラスイス又は１０７個のサルモネラティフィムリウムを排出する。しかし、人工的感染を試みた様々な実験における正常な感染は、１０８〜１０１１個のサルモネラを用いた場合にのみ可能であった。１０３個のサルモネラを豚に接種した実験において、接種された豚は病症を示さなかったが、共に飼育されていた他の豚はサルモネラに特異的な臨床症状を示した。これらは、農場で自然感染した豚においてサルモネラに特異的な臨床症状を示した。この結果は、農場で自然感染した豚においてサルモネラが莫大な量に増えて他の豚を感染させ得ることを示唆する（非特許文献３）。

【0006】

現在、韓国の養豚は、豚生殖器・呼吸器症候群（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome: PRRS）や豚サーコウイルス（Porcine circovirus: PCV2）のような深刻なウイルス疾病により多くの経済的被害を受けており、これらの疾病を中心に疾病管理が行われている。これらの細菌性疾患は飼料添加抗生物質の使用禁止が始まるとウイルス疾病に相当する被害をもたらし得るので、未然に疾病の発生状況の把握や疾病管理が行われなければならない（非特許文献４，非特許文献５）。

【0007】

一方、バクテリオファージは、特定の細菌にのみ感染して細菌の成長を抑制する細菌特異的なウイルスであり、通常はファージと略して呼ばれ、細菌宿主内でのみ自己増殖することができる。バクテリオファージの発見以来、それを感染症の治療剤として用いるための研究が進められている。しかし、広範囲の宿主範囲（broad target spectrum）を有する抗生物質の性質に比べ、宿主特異性（specific target spectrum）を有するバクテリオファージは競争力に劣り、関心を得ることができなかった。抗生物質又は抗菌剤は、細菌感染による感染性疾患の治療に広く用いられている。しかし、抗生物質の誤用・乱用により抗生物質耐性菌の問題が深刻化し、食品内の抗生物質残留による人体への影響に対する懸念が高まっている。しかし、現在用いられている飼料添加抗生物質を除去すると、実験や実際に過去に他国で発生したように、抗生物質により抑制されていたサルモネラをはじめとする細菌性疾病の発生増加が予想される。よって、具体的かつ実践可能なサルモネラ管理ガイドラインの確立が切実に求められている（非特許文献４）。

【0008】

こうした背景から、バクテリオファージの研究が再び関心を集めている。バクテリオファージを用いて大腸菌０１５７：Ｈ７菌を制御するための７種のバクテリオファージが２００２年度に米国で特許登録（特許文献１）を受け、Ｎｙｍｏｘ社は様々な微生物を制御する２種のバクテリオファージに対して２００５年度に米国で特許登録（特許文献２）を受けた。バクテリオファージに関する研究が盛んに行われるようになると、産業界でもバクテリオファージを用いた様々な商品が開発されるようになった。欧州のＥＢＩ ｆｏｏｄ Ｓｙｓｔｅｍ社はバクテリオファージを用いてリステリア菌による食中毒を防止する食品添加剤製品であるＬｉｓｔｅｒｉｘ−Ｐ１００を開発し、最初に米国ＦＤＡの承認を得た。同じ概念のリステリア菌制御食品添加型バクテリオファージ製品であるＬＭＰ−１０２を開発し、ＧＲＡＳ（Generally regarded as safe）の認証を得た。また、２００７年には、ＯｍｎｉＬｙｔｉｃｓ社が屠殺過程中の牛肉製品の大腸菌０１５７汚染を予防するための洗浄液としてバクテリオファージを用いた製品を開発し、米国農務省食品安全検査局（ＦＳＩＳ）の承認を得た。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ｐｈａｇｅ ＮＣＩＭＢ３０００８とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｉｒｉｃｕｍ ｐｈａｇｅ ＮＣＩＭＢ３０００８は、それぞれ２００３年と２００５年に欧州で飼料保存剤として登録され、飼料内の汚染されたクロストリジウム（Clostridium）菌の制御を目的とする製品として開発された。これらの研究は、バクテリオファージを用いて抗生物質治療の難しい細菌や畜産物などを汚染する人獣共通感染菌などを食品加工段階で制御する研究が進められていることを示すものである。

【0009】

しかし、ほとんどのバクテリオファージの研究が大腸菌、リステリア菌、クロストリジウム菌を制御することに主力を注いでおり、サルモネラ菌もまた人獣共通感染菌であり、それによる被害は減少していない。前述したように、サルモネラは様々な薬剤に対して耐性を示しやすいので、現在韓国においては、伝染病予防法施行令（大統領令第１６９６１号）、伝染病予防法施行規則（保健福祉部令第１７９号）及び国立保健院職制（大統領令第１７１６４号）により耐性監視を行っている。よって、サルモネラ菌を制御できるバクテリオファージの開発が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許第６４８５９０２号明細書

【特許文献2】米国特許第６９４２８５８号明細書

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Zoobises Report; Unitied Kingdom 2003

【非特許文献2】イェ・ジェギル，豚サルモネラ菌感染症の特徴と対策，月刊養豚，2004

【非特許文献3】イ・ジュンボク，近年頻発する豚サルモネラ及び増殖性回腸炎の対策，大韓養豚協会，2009

【非特許文献4】イ・ジュンボク，近年頻発する豚サルモネラ及び増殖性回腸炎の対策，建国大学校獣医科大学伝染病実験室，畜産食品安全，2010

【非特許文献5】Robert W. Wills, Veterinary Microbiology, 1999

【非特許文献6】J AnimalSci 43: 910-926, 1976

【非特許文献7】J Anim Sci 56: 735-739, 1983

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

抗生物質の誤用・乱用による抗生物質耐性菌の問題、食品内の抗生物質の残留問題、及び過去の抗生物質のように広範囲の宿主範囲の問題を解決するために、本発明者らは家畜の主要な疾病を引き起こすサルモネラ菌を選択的に死滅させることのできる新規バクテリオファージを自然界から分離した。また、それらの形態的、生化学的及び遺伝的特性を確認した結果、前記バクテリオファージがそれらの有益菌に影響を与えることなく、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス（Salmonella infantis, SI）及びサルモネラニューポート（Salmonella newport, SN）の全てを死滅させることができるだけでなく、耐酸性及び耐熱性に優れることが確認された。また、前記バクテリオファージは、サルモネラティフィムリウムにより引き起こされる家畜のサルモネラ症及び家畜由来のサルモネラ食中毒の予防又は治療を目的として使用される組成物、並びにサルモネラ菌の増殖を効果的に予防及び制御できる様々な製品、すなわち動物飼料添加剤、動物用飲料水、畜舎消毒剤及び肉加工製品用洗浄剤にも適用できることを確認し、本発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、サルモネラコレラスイスに対して殺菌力を有する新規バクテリオファージを提供することを目的とする。

【0014】

また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス又はサルモネラニューポートにより引き起こされる感染性疾病の予防又は治療用組成物を提供することを目的とする。

【0015】

さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む抗生物質を提供することを目的とする。

【0016】

さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家畜用飼料又は飲料水を提供することを目的とする。

【0017】

さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、消毒剤又は洗浄剤を提供することを目的とする。

【0018】

さらに、本発明は、前記バクテリオファージ又は前記組成物を用い、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス又はサルモネラニューポートにより引き起こされる感染性疾病を予防又は治療する方法を提供することを目的とする。

【発明の効果】

【0019】

本発明の新規バクテリオファージは、有益菌には影響を与えず、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス又はサルモネラニューポートに特異的な殺菌力を有し、耐酸性、耐熱性及び耐乾性に優れる。よって、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス又はサルモネラニューポート感染性疾病であるサルモネラ症又はサルモネラ食中毒の予防又は治療に活用できるだけでなく、家畜用飼料、家畜用飲料水、消毒剤、及び洗浄剤などにも広く用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ΦＣＪ１１の電子顕微鏡写真であり、形態学的に正二十面体の頭部（isometric capsid）と非収縮性の尾部（long non-contractile tail）とから構成される形態型（morphotype）Ｂ１のサイフォウイルス科（Siphoviridae）に属するものである。

【図2】ΦＣＪ１１のサルモネラ菌に対する溶菌斑形成の有無を示す写真であり、Ａ、ＢはＳＣ、ＣはＳＧ、ＤはＳＴ、ＥはＳＩ、Ｆ、ＧはＳＤ、ＨはＳＮである。ＳＣ、ＳＴ、ＳＩ、ＳＤ及びＳＮにおいては溶菌斑を形成するが、ＳＧにおいては溶菌斑を形成しないことが確認された。

【図3】分離されたバクテリオファージΦＣＪ１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、バクテリオファージのタンパク質パターンを示すものである。３３ｋＤａ、５５ｋＤａ及び６９．５ｋＤａの主タンパク質であることが観察された。バイオラッド（BIO-RAD）社のプレシジョン ｐｌｕｓ プロテイン スタンダードをマーカーとして用いた。

【図4】分離されたバクテリオファージΦＣＪ１１のＰＦＧＥ結果であり、ΦＣＪ１１の全ゲノムサイズは約１４０ｋｂｐである。バイオラッド（Bio-rad）社のＣＨＥＦ ＤＮＡ サイズスタンダード−ラムダ ラダーをサイズマーカーとして用いた。

【図5】ΦＣＪ１１のゲノムＤＮＡの各プライマーセットを用いたＰＣＲ結果を示す図であり、Ａは配列番号５と６のプライマーセット、Ｂは配列番号７と８のプライマーセット、Ｃは配列番号９と１０のプライマーセット、Ｄは配列番号１１と１２のプライマーセットである。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤレーンの全てが約１ｋｂｐ以上２ｋｂｐ以下のＰＣＲ産物を有する。

【図6】バクテリオファージΦＣＪ１１の耐酸性実験結果であり、ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．０、９．０、９．８及び１１．０における生存バクテリオファージ数を示すものである。対照群と比較して、ｐＨ５．５まではバクテリオファージΦＣＪ１１の活性が消失しなかったが、ｐＨ４とｐＨ３．５で活性が低下し、ｐＨ３．０以下では活性が完全に消失した。

【図7】バクテリオファージΦＣＪ１１の耐熱性実験結果であり、３７、４５、５３、６０及び７０℃にて０、１０、３０、６０及び１２０分間の時間別に静置した場合の生存バクテリオファージ数を示すものである。６０℃にて２時間まで露出しても活性が維持されることが確認された。

【図8】バクテリオファージΦＣＪ１１の耐乾性実験結果であり、スピードバックコンセントレーターを用いて乾燥処理し、乾燥後に乾燥前の力価と相対的な安定性を比較したところ、活性が６０℃にて１時間まで維持されることが確認された。

【図9】ＳＤ系統のラットを対象にΦＣＪ１１を単回経口投与した場合の毒性試験の体重変化結果であり、ΦＣＪ１１の投与前、並びに投与１、３、７、１０及び１４日後の体重を観察したところ、対照群に比べて有意な差異は認められなかった（■；対照群の雄，□；ΦＣＪ１１の雄，●；対照群の雌，○；ΦＣＪ１１の雌）。

【発明を実施するための形態】

【0021】

上記目的を達成するための一実施態様として、本発明は、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス又はサルモネラニューポートに特異的な殺菌力を有する新規バクテリオファージを提供する。

【0022】

本発明者らは、養豚場の糞便と下水から試料を採取し、試料から宿主細胞であるＳＣを溶菌するバクテリオファージを分離し、それらがＳＴ、ＳＤ、ＳＩ及びＳＮを溶菌できることを見出し（図２及び表１）、前記バクテリオファージ（ΦＣＪ１１）を電子顕微鏡で形態学的に観察した結果、形態型（morphotype）Ｂ１のサイフォウイルス科（Siphoviridae）に属することを確認した（図１）。また、ΦＣＪ１１のタンパク質パターンを分析した結果、バクテリオファージの主要構造タンパク質として、約６９．５ｋＤａ、５５ｋＤａ及び３３ｋＤａのタンパク質を含むことが確認され（図３）、ΦＣＪ１１の全ゲノムサイズを分析した結果、約９７〜１４５．５ｋｂｐのサイズを有することが確認された（図４）。さらに、これらの遺伝的特性を分析した結果、配列番号１〜４の核酸分子を全ゲノムの一部として含むことが確認され（実施例６）、配列番号１〜４に基づいて他種との類似性を比較した結果、現在まで明らかにされているバクテリオファージとは多少の相違があることから、新規バクテリオファージであることを見出した（表２）。前記遺伝的特性をより具体的に分析した結果、ΦＣＪ１１に特異的なプライマーセット、具体的には配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、及び配列番号１１と１２のプライマーセットでＰＣＲを行うと、特定のサイズのＰＣＲ産物であるそれぞれ１．４ｋｂｐ、１．２ｋｂｐ、１．２５ｋｂｐ及び１．５ｋｂｐの産物が得られることが見出された（図５）。

【0023】

一方、前記ΦＣＪ１１をＳＣ、ＳＴ、ＳＤ、ＳＩ及びＳＮに感染させると、溶菌斑（ファージプラークといい、軟寒天において１つのバクテリオファージにより宿主細胞が溶菌して形成される透明帯）の形成が確認された（図２）。ΦＣＪ１１を様々なｐＨ範囲及び温度範囲で安定性を調査した結果、ｐＨ３．５〜１１．０（図６）及び３７℃〜７０℃の広範囲で安定して生存（図７）するだけでなく、乾燥時にも安定性を維持する特性を有することが確認された（図８）。また、野生分離株のＳＣ、ＳＴ、ＳＤ、ＳＩ及びＳＮにも感染することが見出された（表３）。

【0024】

最後に、前記ΦＣＪ１１をニュージーランドホワイト系特定病原菌不在（ＳＰＦ）ウサギに皮膚刺激性と眼粘膜刺激試験を行った結果、皮膚刺激指数（Ｐ．Ｉ．Ｉ．）は０．３３で非刺激性を示し、眼反応を観察した結果、急性眼刺激指数であるＩ．Ａ．Ｏ．Ｉ．は全観察期間において洗眼群及び非洗眼群のどちらも０で非刺激性と評価された。ΦＣＪ１１を経口投与したところ、増体変化はなかった（図９）。また、死亡個体数、一般症状（表４）及び臓器異常（表５）は観察されず、毒性のないことが確認された。

【0025】

よって、本発明者は養豚場の糞便と下水から試料を採取し、ＳＣ、ＳＴ、ＳＤ、ＳＩ及びＳＮに対する特異的な殺菌力を有するバクテリオファージを分離し、このような特徴を有する前記バクテリオファージを「バクテリオファージ(Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ )ΦＣＪ１１」と命名し、２０１１年９月９日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, ソウル市西大門区弘済1洞361-221）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１２０８Ｐ号として寄託した。

【0026】

上記目的を達成するための他の実施態様として、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス及びサルモネラニューポートからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされた感染性疾病の予防又は治療用組成物を提供する。

【0027】

本発明のバクテリオファージは、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス及びサルモネラニューポートを特異的に死滅させることのできる抗菌活性を有するので、これらの菌により引き起こされる疾病を予防又は治療する目的で用いることができる。好ましくは、サルモネラコレラスイス又はサルモネラティフィムリウムによる疾病としては、豚のサルモネラ症又はサルモネラ菌食中毒が挙げられ、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス、サルモネラニューポートによる疾病としては、豚の急性又は慢性腸炎が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0028】

本明細書において使用される用語「サルモネラ症（salmonellosis）」とは、サルモネラ菌感染による発熱、頭痛、下痢及び嘔吐を伴う症状を意味する。すなわち、サルモネラ菌属の細菌により引き起こされる疾病を総称するものであり、サルモネラ症は、腸チフスなどの症状を示す敗血症型と食中毒である急性胃腸炎型に大別され、腸炎、食中毒及び急性菌血症などが含まれる。

【0029】

本明細書において使用される用語「予防」とは、組成物の投与により疾病を抑制したり、発病を遅延させる全ての行為を意味する。

【0030】

本明細書において使用される用語「治療」とは、組成物の投与により前記疾病の症状を好転させたり、前記疾病を抑制又は軽減したり、好適に変更させる全ての行為を意味する。

【0031】

本発明の前記組成物は、１×１０２〜１×１０１２ＰＦＵ／ｍｌのΦＣＪ１１を含み、好ましくは１×１０６〜１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌのΦＣＪ１１を含む。

【0032】

一方、本発明の前記組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。

【0033】

本明細書において使用される用語「薬学的に許容される担体」とは、生物体を刺激することなく、投与された化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。液状溶液として製剤化される組成物において薬学的に許容される担体としては、無菌及び生体に適合するものであり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール及びそれらの成分の少なくとも１つの混合物を用いることができる。必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を組成物にさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、又は丸薬、カプセル、顆粒、錠剤などの経口剤形に製剤化することができる。

【0034】

本発明の予防又は治療用組成物は、疾患部位に塗布又は噴霧する方法で用いることができ、その他、経口投与又は非経口投与により投与することができる。非経口投与には、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は局所投与が含まれる。

【0035】

本発明の組成物の好適な塗布、噴霧及び投与量は、製剤化方法、投与方式、対象となる動物及び患者の年齢、体重、性別、症状、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感度などの様々な要因により異なる。当該分野における通常の技術を有する医師又は獣医は、目的とする治療に必要な組成物の有効量を容易に決定、処方することができる。

【0036】

本発明の組成物を有効成分として含む経口投与用剤形としては、例えば錠剤、トローチ剤、薬用ドロップ剤、水性又は油性懸濁液、粉末又は顆粒、エマルジョン、硬質又は軟質カプセル、シロップ又はエリキシル剤が挙げられる。錠剤やカプセルなどの剤形においては、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース、又はゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムのような賦形剤、トウモロコシデンプン又はサツマイモデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、又はポリエチレングリコールワックスのような潤滑油が有用である。カプセル剤形の場合は、前述した化合物以外に脂肪油などの液体担体をさらに含んでもよい。

【0037】

本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形は、皮下注射、静脈注射、筋肉注射などの注射剤形、坐剤の剤形、呼吸器から吸入可能なエアゾール剤などのスプレー剤形に製剤化することができる。注射剤形は、本発明の組成物を安定剤又は緩衝剤と共に水に混合して溶液又は懸濁液とし、それをアンプル又はバイアルの単位投与形態に製剤化することができる。エアゾール剤などのスプレー剤形の場合、水分散した濃縮物又は湿潤粉末を噴射するための推進剤などが添加剤と共に用いられる。

【0038】

上記目的を達成するためのさらに他の実施態様として、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む抗生物質を提供する。

【0039】

本明細書において使用される用語「抗生物質」とは、薬剤形態で動物に提供されて菌を死滅させることのできる製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤及び抗菌剤を総称するものである。前記動物は、ヒトを含む哺乳動物である。本発明のバクテリオファージは、従来の抗生物質に比べてサルモネラ菌に対する特異性が非常に高いので、有益菌を死滅させることなく、特定の病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性又は抵抗性を引き起こさないので、従来の抗生物質に比べて製品寿命（life cycling）の長い新規抗生物質として用いることができる。

【0040】

上記目的を達成するためのさらに他の実施態様として、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料又は飲料水を提供する。

【0041】

畜産、水産業で用いられる飼料添加用抗生物質は予防目的で用いられている。しかし、予防目的の抗生物質投与は、耐性菌が発生する可能性を高め、家畜に残留する抗生物質がヒトに届くという問題がある。抗生物質が肉類により人体に吸収されると、抗生物質耐性を引き起こして疾病の拡散を招く。また、多くの種類の抗生物質は飼料と混合して用いられるので、多剤耐性菌の発生確率が高まるという問題がある。よって、より環境にやさしく、従来の抗生物質の使用における問題を解決することのできる新たな飼料添加用抗生物質として本発明の前記バクテリオファージを用いることができる。

【0042】

本発明の家畜用飼料は、バクテリオファージを飼料添加剤形態で別途に製造して飼料に混合したり、飼料製造時に直接添加して製造することができる。本発明の飼料内バクテリオファージは、液状又は乾燥状態であり、乾燥した粉末形態が好ましい。乾燥方法としては、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥及び凍結乾燥が用いられるが、これらに限定されるものではない。本発明のバクテリオファージは、粉末形態で飼料重量の０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％の成分比で混合することができる。また、前記家畜用飼料は、本発明のバクテリオファージ以外に、飼料の保存性を向上させることのできる通常の添加剤をさらに含んでもよい。

【0043】

本発明の飼料添加剤には、非病原性の他の微生物をさらに添加することができる。添加できる微生物は、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素及び糖転換酵素を生産するバチルスサブティリス（Bacillus subtilis）、ウシの胃のような嫌気条件で生理的活性及び有機物分解能を有するラクトバチルス菌株（Lactobacillus sp.）、家畜の体重を増加させ、牛の生産量を増加させ、飼料の消化吸収率を向上させる効果を奏するアスペルギルスオリザエ（Aspergillus oryzae）などの糸状菌（非特許文献６）、並びにサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母（非特許文献７）からなる群から選択される。

【0044】

本発明におけるΦＣＪ１１を含む飼料には、穀物類、堅果類、食品加工副産物、藻類、繊維質類、製薬副産物、油脂類、デンプン類、ミール類、穀物副産物などの植物性飼料と、タンパク質類、無機物類、油脂類、ミネラル類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類、食品廃棄物などの動物性飼料とが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0045】

本発明におけるΦＣＪ１１を含む飼料添加剤には、品質低下を防止するために添加する結着剤、乳化剤、保存剤などがあり、効用増大のために飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴ糖などがあり、その他に飼料混合剤などをさらに含んでもよく、これらに限定されるものではない。

【0046】

また、飲料水に混合して供給することにより、腸内サルモネラ菌の数を持続的に減少させることができ、サルモネラに汚染されていない家畜を生産することができる。

【0047】

上記目的を達成するためのさらに他の実施態様として、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤又は洗浄剤を提供する。

【0048】

上記目的を達成するためのさらに他の実施態様として、本発明は、前記バクテリオファージ又は前記組成物を用い、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス又はサルモネラニューポートによる感染性疾病を治療する方法を提供する。

【0049】

具体的には、前記本発明の治療方法は、サルモネラコレラスイス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラダービー、サルモネラインファンティス又はサルモネラニューポートによる感染性疾患が発病した個体に前記バクテリオファージ又は前記組成物を薬学的有効量で投与する段階を含む。

【0050】

本発明の前記バクテリオファージ又は組成物は、薬学的製剤の形態で動物に投与したり、家畜の飼料又は飲料水に混合してそれを摂取させる方法で投与することができ、飼料添加剤の形態で飼料に混合して投与することが好ましい。

【0051】

本発明の前記バクテリオファージ又は組成物の投与経路は、標的組織に到達するものであれば、経口又は非経口の様々な経路を介して投与することができる。具体的には、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入などの経路を介して通常の方式で投与することができる。

【0052】

前記治療方法で投与される本発明の前記バクテリオファージ又は組成物の好適な一日総投与量が適切な医学的判断の範囲内で担当の医師により決定されることは、当業者にとって明らかなことである。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に又は同時に用いられる薬物などの様々な因子と医薬分野で周知の類似因子に応じて異なる量で適用することが好ましい。

【0053】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0054】

実施例１：サルモネラ菌に感染するバクテリオファージの分離
実施例１−１：バクテリオファージのスクリーニング及び単一バクテリオファージの分離
豚農場及び近所の下水終末処理場から得た試料５０ｍｌを遠心分離管に移し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、上清を０．４５μｍフィルターで濾過した。サルモネラコレラスイス（「ＳＣ」）振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌと１０×Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ及びＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ：ＬＢ培地）２ｍｌに試料濾液１８ｍｌを混合した。これを３７℃にて１８時間培養し、その後培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、その上清を０．２μｍフィルターで濾過した。ＬＢプレートに０．７％寒天（アガー）（ｗ／ｖ）３ｍｌ、ＳＣ振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌ（「トップアガー 」）の混合液を注入して固めた。その後、その上に試料培養濾液１０μｌを滴下し、３７℃にて１８時間培養し、培養したトップアガーで成長した宿主細胞がバクテリオファージにより溶菌する現象を観察するソフトアガーオーバーレイ（soft agar overlay）方法を行った。

【0055】

溶菌が起こった試料培養濾液を適切に希釈し、ＳＣ振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌを混合し、その後ソフトアガーオーバーレイを行って単一溶菌斑を得た。１つの溶菌斑は１つのバクテリオファージから構成されるので、単一バクテリオファージを純粋分離するために、１つの溶菌斑を採取して４００μｌのＳＭ溶液（ＮａＣｌ，５．８ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２ｇ／Ｌ，１Ｍ トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）５０ｍｌ／Ｌ）に入れ、室温にて４時間静置して単一バクテリオファージを純粋分離した。分離したバクテリオファージを大量確保するために、単一バクテリオファージ溶液の上清１００μｌを採取し、その後０．７％寒天１２ｍｌ、ＳＣ振盪培養液５００μｌと混合し、直径１５０ｍｍのＬＢ培地でソフトアガーオーバーレイを行った。溶菌が完了したプレートに１５ｍｌのＳＭ溶液を分注した。その後、室温にて４時間徐々に振盪してトップアガー中のバクテリオファージを溶出させた。バクテリオファージが溶出したＳＭ溶液を回収し、次いで最終体積の１％となるようにクロロホルム（chloroform）を添加して１０分間十分に混合し、その後４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。こうして得られた上清を０．４５μｍフィルターで濾過して冷蔵保管した。

【0056】

実施例１−２：バクテリオファージの大量培養
選別されたバクテリオファージをＳＣを用いて大量培養した。ＳＣを振盪培養し、１．５×１０１０ｃｆｕ（コロニー形成単位）となるように分注して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後これを４ｍｌのＳＭ溶液に再懸濁した。これにバクテリオファージを９．０×１０８ＰＦＵ（プラーク形成単位）で接種してＭ．Ｏ．Ｉ．(感染多重度)＝０．００１とし、その後３７℃にて２０分間静置した。これを１５０ｍｌのＬＢ培地が入ったフラスコに接種し、その後３７℃にて５時間培養した。最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加し、２０分間振盪した。ＤＮａｓｅ ＩとＲＮａｓｅ Ａをそれぞれ最終濃度１μｇ/ｍｌとなるように添加し、３７℃にて３０分間静置した。最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）となるようにＮａＣｌとＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を添加し、その後４℃にてさらに３時間静置した。４℃、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、その後上清を除去した。５ｍｌのＳＭ溶液に沈殿物を再懸濁し、室温にて２０分間静置した。これに４ｍｌのクロロホルム（Chloroform）を添加し、その後十分に混合し、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターで濾過し、グリセリン密度勾配法（密度：４０％，５％のグリセリン）を用いた超遠心分離（３５，０００ｒｐｍ，１時間，４℃）によりバクテリオファージを精製し、それを「バクテリオファージΦＣＪ１１」と命名した。精製したバクテリオファージΦＣＪ１１は３００μｌのＳＭ溶液に再懸濁し、その後力価を測定した。前記ΦＣＪ１１は、２０１１年９月９日付けで韓国微生物保存センターに寄託番号第ＫＣＣＭ１１２０８Ｐ号として寄託した。

【0057】

実施例２：ΦＣＪ１１のサルモネラ菌感染有無の調査
選別されたバクテリオファージがＳＣ以外の他の種のサルモネラ菌に対して溶菌活性を有するか確認するために、他種のサルモネラ菌に交差感染を試みた。その結果、ΦＣＪ１１は、ＳＣ（サルモネラコレラスイス）、ＳＴ（サルモネラティフィムリウム）、ＳＤ（サルモネラダービー）、ＳＮ（サルモネラニューポート）、ＳＩ（サルモネラインファンティス）、ＳＡ（サルモネラアリゾナ）及びＳＢ（サルモネラボンゴール）には感染し、ＳＥ（サルモネラエンテリティディス）、ＳＧ（サルモネラガリナルム）及びＳＰ（サルモネラプロラム）には感染しなかった（表１及び図２）。

【0058】

【表1】

【0059】

また、図２はΦＣＪ１１のサルモネラ菌に対する溶菌斑形成の有無を示す写真である。図２に示すように、Ａ、ＢはＳＣ、ＣはＳＧ、ＤはＳＴ、ＥはＳＩ、Ｆ、ＧはＳＤ、ＨはＳＮであり、ＳＣ、ＳＴ、ＳＩ、ＳＤ及びＳＮにおいては溶菌斑を形成するが、ＳＧにおいては溶菌斑を形成しないことが確認された。

【0060】

実施例３：ΦＣＪ１１の形態観察
精製されたΦＣＪ１１をＳＭバッファ溶液に希釈し、その後これをｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄに取り付け、２％酢酸ウラニルで３〜５秒間染色し、乾燥した。その後、透過型電子顕微鏡（LIBRA 120, Carl Zeiss transmission electron Microscope，８０ｋＶ，倍率×１２０，０００〜×２００，０００）で検鏡した（図１）。図１はΦＣＪ１１の電子顕微鏡写真である。図１に示すように、分離されたΦＣＪ１１の形態は、形態学的に正二十面体の頭部と非収縮性の尾部とから構成される形態型Ｂ１のサイフォウイルス科に属することが確認された。

【0061】

実施例４：ΦＣＪ１１のタンパク質パターン分析
力価（titer）１０１１ＰＦＵ／ｍｌの精製されたΦＣＪ１１溶液１５μｌと５Ｘ ＳＤＳ試料溶液３μｌを混合し、その後５分間加熱した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次にクマシーブルー（coomassie blue）染色溶液を用いてゲルを常温で１時間染色した（図３）。図３は分離されたバクテリオファージΦＣＪ１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、ここで、マーカーとしてはバイオラッド（BIO-RAD）社のプレシジョン ｐｌｕｓ プロテイン スタンダードを用いた。図３に示すように、前記バクテリオファージのタンパク質パターンは、３３ｋＤａ、５５ｋＤａ及び６９．５ｋＤａの主タンパク質であることが確認された。

【0062】

実施例５：ΦＣＪ１１の全ゲノムＤＮＡサイズの分析
精製されたΦＣＪ１１のゲノムＤＮＡは超遠心分離により抽出した。具体的には、精製されたΦＣＪ１１培養液にＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０））、プロテイナーゼＫ及びＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）をそれぞれ最終濃度が２０ｍＭ、５０μｇ／ｍｌ及び０．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、その後５０℃にて１時間静置した。同量のフェノール（ｐＨ８．０）を添加し、その後十分に混合し、次いで室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清に同量のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）を添加して十分に混合し、その後室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、得られた上清に同量のクロロホルムを十分に混合し、次に室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、得られた上清に全体体積の１／１０の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の冷９５％エタノールを添加し、次に−２０℃にて１時間静置した。その後、０℃にて１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を完全に除去した。その後、底のＤＮＡを５０μｌのＴＥ（トリス-EDTA, ｐＨ８．０）溶液に溶解した。抽出したＤＮＡを１０倍に希釈し、ＯＤ２６０で吸光度を測定して濃度を測定した。１μｇの全ゲノムＤＮＡを１％パルスフィールドゲル電気泳道法（ＰＦＧＥ）アガロースゲルにロードし、その後ＢＩＯＲＡＤ ＣＨＥＦ ＤＲ ＩＩ ＰＦＧＥ システムにおいてスイッチ時間ランプ ５０〜９０秒、６Ｖ／ｃｍ（２００Ｖ）の条件で１４℃にて２２時間展開させた。サイズを確認するためのマーカーとしては、ＣＨＥＦ ＤＮＡ サイズスタンダードであるＢＩＯ−ＲＡＤ社のラムダラダー (Ｌａｍｂｄａ ｌａｄｄｅｒ)を用いた（図４）。図４は分離されたバクテリオファージΦＣＪ１１のＰＦＧＥ結果である。図４に示すように、４８．５〜１，０００ｋｂｐの間にある約１４０ｋｂｐのＤＮＡが確認された。

【0063】

実施例６：ΦＣＪ１１の遺伝学的解析
分離したΦＣＪ１１の遺伝子的特性を分析するために、ΦＣＪ１１のゲノムＤＮＡ ５μｇをＰｓｔ Ｉ、Ｘｂａ ＩとＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩとＳａｌ Ｉの制限酵素で同時に処理した。ベクターとしては、ｐＣＬ１９２０（プロメガ社）をＰｓｔ Ｉ、Ｘｂａ ＩとＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩとＳａｌ Ｉの制限酵素で切断し、その後ＣＩＰ（calf intestinal alkaline phosphatase）で処理したものを用いた。切断されたゲノムＤＮＡとベクターの量が３：１となるように反応条件を調整して混合し、その後１６℃にて２時間ライゲーション（ligation）を行った。これを大腸菌の一種であるＤＨ５α細胞に導入した。このように形質転換した形質転換体をそれぞれスペクチノマイシン（spectinomycin）で処理したＬＢプレート培地にＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を塗布して青白コロニー選別法でコロニーを選別した。選別されたコロニーをそれぞれの抗生物質含有培養培地で１６時間振盪培養した。ここで、プラスミド精製キット（プロメガ社）を用いてプラスミドを抽出した。

【0064】

前記プラスミドは、ＦＴＲ１３５とＦＴＲ１３６（配列番号１３と１４）のプライマーセットを用いてＰＣＲでクローニングの可否を確認した。挿入断片のサイズが１ｋｂｐ以上のもののみ選別し、前記プライマーセットを用いて塩基配列を分析した。こうして得られた遺伝子塩基配列を配列番号１〜４に示す。それぞれ１〜２ｋｂｐ以下のサイズであった。これをＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｘとｂｌａｓｔｎプログラムで解読し、塩基配列の相同性を分析した結果を表２に示す。

【0065】

【表2】

【0066】

実施例７：ΦＣＪ１１特異的プライマー塩基配列の作製
ΦＣＪ１１を同定するために、ΦＣＪ１１に特異的なプライマーを配列番号１〜４を基に作製した。配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、及び配列番号１１と１２をそれぞれプライマーセットとしてＰＣＲを行った。０．１μｇのバクテリオファージの全ゲノムＤＮＡと０．５ｐｍｏｌｅとなるようにプライマーをｐｒｅ−ｍｉｘ（Bioneer社）に添加し、最終体積が２０μｌとなるように調整した。これを、９４℃、３０秒間の変性、５５℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、１分３０秒間の重合の条件で３０サイクルでＰＣＲを行った（図５）。図５はΦＣＪ１１のゲノムＤＮＡの各プライマーセットを用いたＰＣＲ結果を示す図である。Ａは配列番号５と６のプライマーセット、Ｂは配列番号７と８のプライマーセット、Ｃは配列番号９と１０のプライマーセット、Ｄは配列番号１１と１２のプライマーセットである。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤレーンの全てが約１〜２ｋｂｐのＰＣＲ産物を有する。図５に示すように、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、及び配列番号１１と１２のプライマーセットを用いた場合、全て約１ｋｂｐ以上２ｋｂｐ以下程度のＰＣＲ産物が得られた。

【0067】

実施例８：バクテリオファージのｐＨ安定性
実施例８：ΦＣＪ１１が豚の胃腸内の低いｐＨで安定性を有するかを確認するために、広範なｐＨ範囲（ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．２、９．０、９．８及び１１．０）で安定性調査実験を行った。様々なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム緩衝（ｐＨ２．１、ｐＨ４．０、ｐＨ５．５及びｐＨ６．４））、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５、ｐＨ３．０及びｐＨ３．５））、リン酸ナトリウム緩衝液（Sodium phosphate buffer（ｐＨ６．９及びｐＨ７．４））、トリス−ＨＣｌ溶液（トリス-HCl（ｐＨ８．２、ｐＨ９．０、ｐＨ９．８及びｐＨ１１．０）））をそれぞれ０．２Ｍとなるように作製した。各ｐＨの溶液１８０μｌと１．０×１０１１ＰＦＵ／ｍｌの力価のバクテリオファージ溶液２０μｌを混合し、各ｐＨの溶液の濃度が１Ｍとなるようにし、その後常温で２時間静置した。これらを段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μｌずつ滴下し、その後３７℃にて１８時間培養し、溶菌の有無により力価を測定した（図６）。図６はバクテリオファージΦＣＪ１１の耐酸性実験結果であり、ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．０、９．０、９．８及び１１．０における生存バクテリオファージ数を示すものである。対照群と比較して、ｐＨ５．５まではバクテリオファージΦＣＪ１１の活性が消失しなかったが、ｐＨ４とｐＨ３．５で活性が低下し、ｐＨ３．０以下では活性が完全に消失した。図６に示すように、ｐＨ５．５までは活性が消失せずに非常に安定しているのに対して、ｐＨ３．０以下のｐＨでは活性が消失することが確認された。

【0068】

バクテリオファージの熱安定性
実施例９：バクテリオファージの製品剤形のうち飼料添加剤として用いる場合にバクテリオファージの剤形過程で発生する熱に対する安定性を確認する実験を行った。１．０×１０１１ＰＦＵ／ｍｌの濃度のΦＣＪ１１の溶液２００μｌを３７℃、４５℃、５３℃、６０℃及び７０℃の温度条件下でそれぞれ０分間、１０分間、３０分間、６０分間及び１２０分間静置した。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μｌずつ滴下し、その後３７℃にて１８時間培養し、溶菌の有無により力価を測定した（図７）。図７はバクテリオファージΦＣＪ１１の耐熱性実験結果であり、３７、４５、５３、６０及び７０℃にて０、１０、３０、６０及び１２０分間の時間別に静置した場合の生存バクテリオファージ数を示すものである。図７に示すように、６０℃にて２時間まで露出しても活性が維持されることが確認された。

【0069】

バクテリオファージの乾燥耐性
実施例１０：バクテリオファージの製品剤形のうち飼料添加剤として用いる場合にバクテリオファージの剤形過程で発生する乾燥条件に対するΦＣＪ１１の安定性を確認した。耐熱性確認実験から得た結果に基づき、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器を用いて乾燥実験を行った。１．０×１０１１ＰＦＵ／ｍｌの力価のΦＣＪ１１の溶液２００μｌを６０℃にて２時間真空で乾燥したペレット（pellet）をＳＭ溶液２００μｌに入れ、４℃にて１日間完全に再懸濁させて力価を測定した（図８）。図８はバクテリオファージＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器を用いて乾燥したΦＣＪ１１の耐乾性実験結果である。図８に示すように、乾燥後に乾燥前の力価と相対的な安定性を比較したところ、活性が６０℃にて１時間まで維持されることが確認された。

【0070】

バクテリオファージの感染範囲の調査
実験例１１：ΦＣＪ１１が実験に用いられたＳＣ（ATCC SC10708）以外にも、ソウル大学校獣医科大学鳥類疾病学室の野生分離株２株、サルモネラコレラスイス５株、サルモネラティフィムリウム１７株、サルモネラインファンティス４株、サルモネラニューポート６株、サルモネラダービー２株、及びサルモネラダブリン３株に対して溶菌活性の有無を確認した。各菌株の振盪培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μｌを混合し、ソフトアガーオーバーレイ方法で１０１０ＰＦＵ／ｍｌの力価のΦＣＪ１１溶液を１０μｌずつ滴下し、その後３７℃にて１８時間培養して溶菌斑形成の有無を観察した（表３）。ＳＣ ８株において溶菌斑形成が確認された。

【0071】

【表3】

【0072】

実施例１２：バクテリオファージの毒性評価
サルモネラ症及びサルモネラ食中毒予防用バクテリオファージであるΦＣＪ１１に関する毒性試験に多く用いられており、豊富な試験基礎資料が蓄積されているので、実験結果の解析が容易なニュージーランドホワイト系特定病原菌不在（ＳＰＦ）ウサギにおける皮膚刺激試験と眼粘膜試験を行った。ウサギの腹部の正常皮膚（非擦過皮膚）及び擦過皮膚に、試験物質を０．５ｍｌ／ｓｉｔｅの用量で塗布した２．５ｃｍ×２．５ｃｍのガーゼを覆って皮膚と接触させた。一般症状においては変化認められず、試験物質投与１日後に軽微な体重減少があったが、試験物質の閉鎖的投与によるストレスが原因であると判断された。皮膚反応評価においては、皮膚刺激指数（P.I.I.）が０．３３の非刺激性であった。眼粘膜刺激性を調査するために、ウサギの左眼球に投与し、その後試験物質を投与していない右眼球と比較評価した。試験の結果、全試験期間を通して試験物質投与に関する一般症状及び体重の異常変化は認められず、試験物質投与後の眼反応の観察の結果、急性眼刺激指数Ｉ．Ａ．Ｏ．Ｉ（The Index of Acute Ocular Irritation）は「０」で非刺激性と評価された。よって、新規に分離したバクテリオファージΦＣＪ１１は毒性がないことが確認された。

【0073】

また、ФＣＪ１１をＳＤ系統のラットに単回経口投与した際に現れる概略的な毒性を評価するための試験を行った。ФＣＪ１１を１×１０１１ＰＦＵ／ｋｇで投与する試験物質投与群と、賦形剤であるビヒクル［２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）＋２ｍＭ ＭｇＣｌ２]のみを投与する賦形剤対照群を設定し、各群１０匹（雌雄各５匹）に単回経口投与し、その後２週間の死亡率、一般症状、体重変化及び解剖検査所見を観察して比較した。投与当日は投与３０分後に観察を始めて１時間後まで継続し、その後６時間後までは１時間毎に観察し、１４日間は１日１回一般症状を観察して記録した（表４及び表５）。

【0074】

【表4】

【0075】

【表5】

【0076】

表４及び表５に示すように、死亡個体は発生せず、ΦＣＪ１１による毒性症状や特異な臨床症状はなかった。その結果を表４と表５に示す。投与前、並びに投与１、３、７、１０及び１４日後に体重を測定して記録した。その結果、対照群と比較して、有意な体重変化の差異は観察されなかった。

【0077】

一方、体重変化の観察の結果、ΦＣＪ１１が食欲を減少させたり、体重を変化させる毒性反応を引き起こさないことが分かった。それを図９に示す。図９はＳＤ系統のラットを対象にΦＣＪ１１を単回経口投与した場合の毒性試験の体重変化結果である。図９に示すように、ΦＣＪ１１の投与前、並びに投与１、３、７、１０及び１４日後の体重を観察したところ、対照群に比べて有意な差異は認められなかった（■；対照群の雄，□；ΦＣＪ１１の雄，●；対照群の雌，○；ΦＣＪ１１の雌）。

【0078】

よって、新規に分離したバクテリオファージΦＣＪ１１の概略の致死量（ＡＤＬ）は雌雄どちらにおいても１×１０¹¹ＰＦＵ／ｋｇを上回るとものと判断され、毒性がないことが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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