特許 5872725 鰹節由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】5872725

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】鰹節由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/81 20060101AFI20160216BHJP

   C12N 9/99 20060101ALI20160216BHJP

   C07K 5/062 20060101ALI20160216BHJP

   C07K 5/065 20060101ALI20160216BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20160216BHJP

   A23L 33/17 20160101ALI20160216BHJP

   C07K 5/083 20060101ALI20160216BHJP

   C12P 21/06 20060101ALI20160216BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20160216BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 38/55 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 35/60 20060101ALI20160216BHJP

   C12N 9/64 20060101ALN20160216BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/81ZNA

   C12N9/99

   C07K5/062

   C07K5/065

   C07K7/06

   A23L1/305

   C07K5/083

   C12P21/06

   C12P21/00 A

   C12P21/02 A

   A61K37/64

   A61P3/10

   A61P43/00 111

   A61K35/60

   !C12N9/64 Z

【請求項の数】7

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2015-127871(P2015-127871)

(22)【出願日】2015年6月25日

【審査請求日】2015年6月29日

(31)【優先権主張番号】特願2015-36914(P2015-36914)

(32)【優先日】2015年2月26日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000114732

【氏名又は名称】ヤマキ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100064388

【弁理士】

【氏名又は名称】浜野 孝雄

(74)【代理人】

【識別番号】100194113

【弁理士】

【氏名又は名称】八木田 智

(72)【発明者】

【氏名】関 英治

(72)【発明者】

【氏名】藤原 佳史

(72)【発明者】

【氏名】朝田 仁

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２０１９２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０６６０７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−１８２７４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２５４３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１９９７８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−１５５７８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本食品科学工学会第５７回大会講演集,2010.09.01,p.74(2Ea6)

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／８１

Ｃ０７Ｋ ５／００

Ｃ０７Ｋ ７／００

Ｃ１２Ｐ ２１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物であって、
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ及びＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏを、当該組成物の乾燥物に基づき１乃至１０質量％の量でそれぞれ含有し、且つα−グルコシダーゼ阻害活性（ＩＣ５０）が１．５ｍｇ／ｍＬ以上である、前記鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物。

【請求項2】

Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ及びＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏを、当該組成物の乾燥物に基づき１乃至１０質量％の量でそれぞれ含有し、且つα−グルコシダーゼ阻害活性（ＩＣ５０）が１．５ｍｇ／ｍＬ以上である、鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物の製造方法であって、
１）鰹節を６０℃〜１００℃の熱水で抽出し、さらに遠心分離によって上澄を取り除き、鰹だし粕を得る工程；
２）前記鰹だし粕を、至適条件下、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ属及びＡｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来のプロテアーゼであって食品工業用途のプロテアーゼによって酵素分解し、さらに遠心分離によって清澄液を得る工程；及び
３）前記清澄液を精製する工程；
を含むことを特徴とする、前記鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物の製造方法。

【請求項3】

前記プロテアーゼは、中性プロテアーゼであることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記３）の清澄液を精製する工程の後に、エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによる溶出を行う工程をさらに含む、請求項２又は３に記載の製造方法。

【請求項5】

前記組成物は、食後血糖値上昇抑制作用を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

請求項１に記載の組成物を含有することを特徴とする、医薬組成物。

【請求項7】

請求項１に記載の組成物を含有することを特徴とする、特定保健用食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）阻害組成物であって、従来から食材として用いられてきた安全性の高い鰹だし、又はその鰹だし粕由来の組成物、及びそれらの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、全世界において糖尿病が爆発的に増加している。日本では糖尿病患者６００万人、その予備軍は１２００万人〜１５００万人といわれている。糖尿病疾患によって、高血糖が長く続くことにより血管が徐々に障害を受け、さまざまな臓器に異常が生じる。
この糖尿病疾患の三大合併症として、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症が以前から知られているが、近年では、糖尿病疾患によって、動脈硬化症発症のリスクが高くなることも知られている。
そして糖尿病としては「膵β細胞の破壊的病変でインスリンの欠乏が生じて起こる」Ｉ型糖尿病と「膵β細胞の機能異常によるインスリン分泌能低下と肝、筋、脂肪組織等の標的臓器におけるインスリン感受性低下が併発することによって発症する」ＩＩ型糖尿病が存在する。
昨今、激増する糖尿病はＩＩ型に由来するものであり、糖尿病の９０〜９５％を占めていると考えられている。このＩＩ型糖尿病は「生活習慣病」といわれているように、ストレス、肥満、運動不足による基礎代謝能低下と、それに加えて、高カロリー食摂取等、現代型社会生活によって引き起こされている。

【0003】

このような糖尿病に関する研究分野において、消化管ホルモンであるインクレチンが注目されつつある。インクレチンはインスリン分泌を増強する消化管ホルモンの総称で、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌ポリペプチド（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ））やＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１））等が知られている。これらは、膵β細胞に発現する受容体を介したグルコース応答性インスリン分泌を促進し、食後の血糖上昇を抑制する。また、インスリン分泌促進以外に、膵β細胞の保護及び増殖作用といった活性を持っている。
しかしながら、インクレチンの問題点として、体内安定性が挙げられる。すなわち、インクレチンは体内に普遍的に存在するＤＰＰＩＶによって速やかに不活性なものへと分解され、数分間で半減してしまう。そこで、安定なＤＰＰＩＶ阻害剤の開発が進められている（特許文献１、非特許文献１）。

【0004】

他方、製剤あるいは食品として幅広く使用されているコラーゲン及びその熱変性体であるゼラチンは機能特性が高く、加工適性を向上させるため、タンパク質分解酵素を用いて処理したもの、あるいは酸−塩基分解により部分加水分解処理したものを使用することが多い（特許文献２〜４）。また、タンパク質であるため抗原性を有し、アレルギー体質のヒトの摂取には問題がある。そのため、コラーゲンをコラゲナーゼによって、低分子化することにより抗原性をなくしアレルギー患者向けのタンパク質源あるいは輸液製剤成分としての利用が開示されている（特許文献５）。
また、コラゲナーゼによるコラーゲンの分解物の生理活性については、フィブリン凝集阻害活性（特許文献６）、麻酔作用（非特許文献２）が知られている。

【0005】

一方で、ペプチド性のＤＰＰＩＶ阻害剤に関する報告が幾つかある（非特許文献３〜６）。
また、食品由来のペプチドによるＤＰＰＩＶ阻害剤に関する報告もある（特許文献７）。
ところでまた、ＤＰＰＩＶ阻害とは血糖上昇抑制の作用機序の点で異なるが、α−グルコシダーゼを阻害することにより血糖上昇を抑制する物質として、食品由来の豆鼓エキス及び難消化性デキストリン（特許文献８及び特許文献９）を挙げることができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１３巻，５７９頁，１９７６年

【非特許文献2】Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６９巻，５５１頁，１９８０年

【非特許文献3】Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２１８巻，１５６頁， １９８２年

【非特許文献4】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５２巻，７２３頁，１９８８年

【非特許文献5】Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３７２巻，３０５頁，１９９１年

【非特許文献6】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，３７巻，４２２頁，１９８４年

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特許第３６８１１１０号号公報

【特許文献2】特開平７−２７８０１２号公報

【特許文献3】特開昭６３−３９８２１号公報

【特許文献4】特許第３８０２７２１号号公報

【特許文献5】特開平７−８２２９９号公報

【特許文献6】特開平６−４６８７５号公報

【特許文献7】特開２００７−０３９４２４号公報

【特許文献8】特開２００１−１８６８７７号公報

【特許文献9】特開２０１０−０１８５２８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、化学合成品であるＤＰＰＩＶ阻害剤は非天然物であり、摂取する際の安全性に課題が残る。
ペプチド性のＤＰＰＩＶ阻害剤もまた、食品由来ではない場合、摂取した際の安全性の点で課題が残る。
さらにまた、α−グルコシダーゼ阻害作用を有する物質は、食品由来といえども、摂取後に低血糖などの副作用のおそれがある。
よって、天然成分由来の安全性の高いＤＰＰＩＶ阻害作用を有する物質が望まれていた。
この点、鰹だし、即ち、鰹節を熱水で抽出しただし汁、及び、粕として残存する鰹だし粕は従来から食品として利用されており、安全性の点から優れていると考えられる。

【0009】

よって、本発明は、鰹節由来であって、ＤＰＰＩＶ阻害活性が強くかつ安全性に優れたＤＰＰＩＶ阻害組成物及びその製造方法の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

即ち、本発明は、鰹節を６０℃〜１００℃の熱水で抽出し、さらに遠心分離によって上澄を得る工程から成る、鰹だし由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物に関する。
一態様において、本発明の組成物は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙの配列から成るペプチドを、好ましくは、当該組成物の乾燥物１００ｇ当り０．１乃至１０ｍｇ含有する。
本発明の別の態様は、 Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ及びＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏから成る群より選択される少なくとも１種のペプチドを含有する、鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物に関する。
好ましくは、前記組成物は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ及びＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏから成る群より選択される少なくとも１種のペプチドを、当該組成物の乾燥物に基づき１乃至１０質量％の量で含有する。
本発明のまた別の態様は、
１）鰹節を６０℃〜１００℃の熱水で抽出し、さらに遠心分離によって上澄を取り除き、鰹だし粕を得る工程；
２）前記鰹だし粕を、至適条件下、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ属及びＡｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来のプロテアーゼであって食品工業用途のプロテアーゼ、好ましくは中性プロテアーゼによって酵素分解し、さらに遠心分離によって清澄液を得る工程；及び
３）前記清澄液を精製する工程；
を経て得られる、鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物に関する。
好ましくは、本発明は、清澄液を精製する工程の後に、エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによる溶出を行う工程をさらに含む。
また、本発明は、上記組成物がα−グルコシダーゼ阻害作用を実質的に有しないことを特徴とする、組成物にも関する。
さらにまた本発明は、上記組成物が食後血糖値上昇抑制作用を有することを特徴とする、組成物に関する。
本発明のさらなる態様は、上記組成物のうちいずれかの組成物を含有することを特徴とする、医薬組成物に関する。
本発明のさらに別の態様は、
以下の工程：
１）鰹節を６０℃〜１００℃の熱水で抽出し、さらに遠心分離によって上澄を取り除き、鰹だし粕を得る工程；
２）前記鰹だし粕を、至適条件下、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ属及びＡｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ属からなる群より選択される少なくとも１種の菌株由来のプロテアーゼであって食品工業用途のプロテアーゼによって酵素分解し、さらに遠心分離によって清澄液を得る工程； 及び
３）前記清澄液を精製する工程；及び
４）エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによる溶出を行う工程；
を含むことを特徴とする、鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物の製造方法にも関する。

【0011】

本発明は、安全性の観点から、食材として古くから用いられ、食されている鰹だし、あるいは鰹だし粕由来の成分に着目し、研究を行った結果として、為された。
本発明において用いられる鰹節は、当業者に既知の手法により製造されたものであれば十分であり、もちろん市場に流通しているものでも構わない。

【0012】

鰹だしは、例えば、鰹節を適当に削ったものに水を加え、およそ５分間〜６０分間の間、およそ５０℃以上の温度に、好ましくは８０℃〜１００℃の温度に加熱し、熱水で抽出し、その後、遠心分離等によって、上澄として得ることが出来る。遠心分離に替え、又は遠心分離とともに、濾過を行ってもよい。また、鰹だしは、例えば,鰹節を適当に削ったものを、水を沸騰させて火を止め得られた沸騰水に入れ、鰹節が底に沈むまで１〜２分程度、そのまま置き、ふきん等で鰹節を静かに濾すことによって、得ることも出来る。
そして、鰹だしは、上述の鰹節を、水で加熱抽出して得られる水溶性タンパク質、アミノ酸、ペプチドであるということができる。
本発明においては、通常公知の方法により製造しただしを用いることも可能であり、市販品を用いることも可能である。

【0013】

医薬品又は特定保健用食品として許容され得る規格内にあれば、上述のようにして得られた鰹だしを、本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物として、そのまま用いてもよい。もちろん、必要に応じて鰹だしを精製して当該組成物を製造することもできる。
また、鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物については、だしとの混合物で用いることが可能である。

【0014】

こうして得られた鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、活性成分として、セリン−グリシン（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ，ＳＧ）の配列から成るペプチドを、当該組成物の乾燥物（水分約５質量％以下）１００ｇ当り０．１乃至１０ｍｇ、好ましくは、１乃至６ｍｇ含有する。当該組成物の乾燥は、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥などにより行われる。

【0015】

他方、鰹だし粕を原料として得られる本発明のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、本発明の鰹だしから成るＤＰＰＩＶ阻害組成物と比較して、数倍のＤＰＰＩＶ活性を有する。
鰹だし粕は、前記遠心分離によって上澄を除去した後に沈澱物として、又は濾過によって残留物として、得ることができる。そして、鰹だし粕を、特定のプロテアーゼを用いて酵素分解することによって、分解後に得られる組成物において、ＤＰＰＩＶ阻害活性が発現することとなる。

【0016】

そのようなプロテアーゼは、本発明においては、安全性の観点から、食品工業用途のものが選択される。特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ属及びＡｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ属からなる群より選択される菌株由来のプロテアーゼが好ましい。この中でも特に好ましいのは、
プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ属；至適温度４０℃〜６０℃（５０℃）；至適ｐＨ４〜７（ｐＨ６））、
スミチームＬＰ５０Ｄ （新日本化学工業社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ属；至適温度４５℃〜６０℃（５０℃）；至適ｐＨ５〜８（ｐＨ７））、
スミチームＦＰ（新日本化学工業社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ属；至適温度４５℃〜５５℃（５０℃）；至適ｐＨ４〜８（ｐＨ６））、
デナチームＡＰ（ナガセケムテックス社製； Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ属；至適温度４０〜５５℃；至適ｐＨ６〜８（ｐＨ７））、
プロチンＳＤ−ＡＣ１０Ｆ（天野エンザイム社製； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ属；至適温度４０℃〜６０℃；至適ｐＨ５．５〜９．０（ｐＨ８〜９））、
デナプシン２Ｐ（ ナガセケムテックス社製；Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ属；至適温度４０℃から６０℃（５０℃）；至適ｐＨ２〜４（ｐＨ３））
である。
これらプロテアーゼは、本発明の完成のために本発明者らによって選択されたもので、食品工業用途であって安全性が高く、且つ、鰹だし粕を酵素分解したときに、高いＤＰＰＩＶ阻害活性をその酵素分解組成物に付与し得る。
さらには、上記６種のプロテアーゼの中でも、より高いＤＰＰＩＶ阻害活性を付与し得るという観点から、中性プロテアーゼ、即ち、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ及びスミチームＬＰ５０Ｄ が最も好ましい。

【0017】

上記プロテアーゼによる処理条件は、プロテアーゼの特性に合せて適宜選択すればよい。酵素量及び処理時間については、特に限定はないが、酵素量は０．１％〜２％対原料タンパク質である。また、反応時間は２時間から２０時間が好ましい。また、反応温度は、３５℃〜６０℃が好ましい。
なお、プロテアーゼ処理は、加熱等により酵素を失活させることで終了させることができる。また、酵素反応後のｐＨは、その後の市販適用のために中和することが望ましい。

【0018】

プロテアーゼ処理で得られたプロテアーゼ分解物は、そのまま公知の手段で濾過又は遠心分離にかけて、未分解物を除去し、清澄液（上澄）を得る。そして、収率よく高活性のＤＰＰＩＶ阻害活性が得られる観点から、得られた清澄液を濃縮等し、さらに凍結乾燥又は噴霧乾燥することが望ましい。さらに各種の精製方法に供することで、ＤＰＰＩＶの阻害活性をより高めた画分を得ることもできる。樹脂精製法で精製することも好ましい。

【0019】

樹脂精製法で使用する樹脂としては、例えば、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、多孔性樹脂、特殊樹脂（キレート樹脂、合成吸着剤、蛋白分離剤）等が挙げられるが、回収した画分の脱塩処理工程が不要であることから、合成吸着剤を用いるのが好ましい。合成吸着剤としては、例えば、芳香族（スチレン−ビニルベンゼン）系、芳香族系修飾型、アクリル（メタクリル）系等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0020】

また、樹脂精製法において、ＤＰＰＩＶ阻害成分を含むプロテアーゼ分解物の樹脂への吸着は、公知の手法により行えばよい。
次いで、吸着したプロテアーゼ分解物の溶離には、酸、アルカリ又は種々の有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコールや、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、アセトン等のケトン類を用いることできるが、これらに限定されるものではない。又は、酸、アルカリとの混合溶媒としてもよい。なお、経済性と安全性の点からは、濃度５０％以下のエタノール水溶液又は水を用いて溶離するのが好ましい。樹脂精製法は、バッチ法又はカラム法にて行うことができる。回収した画分は減圧又は限外濾過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。

【0021】

好ましくは、プロテアーゼ処理後に得られた清澄液を、精製した後、エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによる溶出にかける。これによって、ＤＰＰＩＶ阻害性の有効成分である、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ及びＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏを含有する画分を効率的に得ることができる。

【0022】

なお本発明においては、メタノール、エタノール等の有機溶媒沈澱法によって、前記有機溶媒中に前記プロテアーゼ分解物を混合し、沈澱画分と上清画分を分離して、上清画分を回収することでＤＰＰＩＶ阻害の高い画分を得ることもできる。この場合、沈澱画分と上清画分とが分離するまでは有機溶媒混合物を静置することが好ましい。なお、静置温度は低温で行うことが好ましい。また、回収した上清画分は減圧又は限外濾過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。

【0023】

また、本発明の製造方法によって、鰹節からＤＰＰＩＶ阻害活性の高い組成物を、比較的簡便に且つ効率的に得ることができる。
本発明の製造方法に従い製造され市販されている鰹節若しくはそのだしを、そのまま食してもよいし、若しくは濃縮することによってＤＰＰＩＶ阻害活性の力価をより高めることができる。

【0024】

一方、本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物、又は鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物に含まれる活性成分の抽出及びその精製は、通常公知の方法を用いて行うことができる。
具体的には、例えば、鰹節の組織を粉砕した後、水洗、希塩溶液による抽出、酸あるいはアルカリ溶液による抽出、ペプシン、トリプシンやヒアルロニダーゼ等の酵素による抽出を行い、塩析や透析等の公知の精製手段を施して、活性成分を得ることができる。

【0025】

上記のとおり本発明のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、安全性に優れたものであり、しかもコラゲナーゼ処理されたコラーゲン又はゼラチンの分解物に比べて、高いＤＰＰＩＶ阻害活性を有する。

【0026】

本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ及びＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏから成る群より選択される少なくとも１種のペプチドを含有する。これらペプチドは、当該組成物の乾燥物に基づき、１乃至１０質量％の高濃度で含まれることを特徴とする。そのため、高いＤＰＰＩＶ阻害活性を有し、特定保健用食品の有効成分としてより期待される。さらに、α−グルコシダーゼ阻害作用を実質的に有しないため、摂取後の低血糖などのおそれが低い。なお、α−グルコシダーゼ阻害作用を実質的に有しないとは、α―グルコシダーゼ阻害活性（ＩＣ５０）が、およそ１．５ｍｇ／ｍＬ以上であることを意味する。また、当該組成物の乾燥は、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥などにより行われる。

【発明の効果】

【0027】

本発明の鰹だし由来の又は鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、哺乳動物の糖尿病予防・治療剤として有用である。
また、本組成物のＤＰＰＩＶ阻害作用が、ＤＰＰＩＶ阻害のみであり、α−グルコシダーゼ阻害活性を有しないため、低血糖などの副作用のおそれも低く、安全性は高いと考えられる。
また、本組成物は安全性が高いため、食品、菓子等に有効量を配合することができ、これらの食品、菓子等を継続的に摂取することで糖尿病の発症を予防し得る。
なお且つ、当該組成物はまた、ペプシン、トリプシン又はキモトリプシンといった消化管プロテアーゼに対する耐性が高く、これらプロテアーゼによる処理を受けたとしても、処理前と比較して、そのＤＰＰＩＶ阻害活性値が低下しないという利点を有する。
また、本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、一回のプロテアーゼ処理工程のみで上記利点を付与し、且つ活性が高く安全性に優れたＤＰＰＩＶ阻害剤である。
さらにまた、本発明の組成物は、血糖低下効能を有する製薬と比較して、活性がほどほど抑えられているため、副作用のおそれもより低く、特定保健用食品の有効成分としてより適するものといえる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】６種類のプロテアーゼを用いて得られた酵素分解組成物の濃度別のＤＰＰＩＶ阻害活性率を示す図である。

【図2】本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物のα−グルコシダーゼ阻害活性を示す図である。

【図3】本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物又は白湯を摂取後の血糖値変化を示す図である。

【図4】実施例７の本発明の鰹だし由来の組成物の溶出曲線を示す図である。

【図5】実施例７の鰹だし由来の組成物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析の結果を示した図である。

【図6】Ｎ５の各分画におけるＤＰＰＩＶ阻害活性とＹ−２画分のＩＣ５０値の算出式を示す図である。

【図7】Ｙ−２画分の凍結乾燥物についてのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析結果を示すクロマトグラムを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

実施例１．本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の製造
工業的スケールにおいては、鰹節（タンパク質１６０ｋｇ）に加水１０００％後、９５℃±３℃、３５分間で熱水抽出し、下記の比率の本発明に係る鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物を得た（表１）。また鰹だし粕とのタンパク質比率は、２５対７５であった。

【表1】

【0030】

実施例２−１．本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の消化管プロテアーゼ耐性試験
ヒトにおいて効果が発揮するためには、消化管プロテアーゼ耐性が必須である。本発明に係る鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の腸管プロテアーゼ耐性を調べるために、表２に示すとおりの条件及び消化酵素にて処理を行った。
即ち、鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の消化管プロテアーゼ耐性は、下記表２の方法で試料分取後、ＤＰＰＩＶ阻害活性を測定し阻害率を調べることにより図ることが出来る。

【表2】

【0031】

試験例１．ＤＰＰＩＶ阻害活性の測定
鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物、その消化管プロテアーゼ（ペプシン、トリプシン、キモトリプシン）処理品及び鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の食品工業用プロテアーゼ分解組成物を、凍結乾燥後、それらの１６ｍｇ、８ｍｇ、４ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬにそれぞれ溶解し、ＤＰＰＩＶ阻害活性測定のための試料とした。

【0032】

次に、各試料のＤＰＰＩＶ阻害活性を、ＤＰＰＩＶ阻害活性測定キット（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ製；Ｋ７８０−１００型）を用いて測定した。ＤＰＰＩＶを直線的な検量線が認められる反応時間の範囲において、所定の濃度に調製後、各Ｗｅｌｌに５０μＬずつ分取し、各試料（凍結乾燥品）を上記の濃度に調製後、２５μＬをＤＰＰＩＶが５０μＬ入った各Ｗｅｌｌに分注し（各試料の各濃度でｎ＝４回測定）、３７℃１０分間反応させた。
次に、疑似サンプル基質(インクレチンホルモン)（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−メチルクマリン）を所定の濃度調整後、２５μＬを分注し、反応時間０〜３０分の間、数回測定し、検量線直線が認められる反応時間間の増加率から、コントロール（阻害物質なし）と、各種試料の測定値から、ＤＰＰＩＶ測定阻害活性（％）を計算し、そのＤＰＰＩＶの５０％阻害活性が認められる各種試料濃度をＩＣ５０値として算出した。また、各試料の各濃度で４回測定し、得られた４回分のＩＣ５０値の平均値を算出し、これをＤＰＰＩＶ阻害活性（％）とした。

【0033】

なお、ＤＰＰＩＶ阻害測定は、測定条件励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍの蛍光マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）にて測定した。

【0034】

実施例２−２．本発明に係る鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物のＤＰＰＩＶ阻害活性
上記実施例２−１で調製した鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物のＤＰＰＩＶ阻害活性を、上記試験例１の測定方法で測定した。
結果を下記表３に示す。

【表3】

【0035】

上記表３に示すとおり、鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物それ自体のＤＰＰＩＶ阻害活性値（ＩＣ５０）は、３０４９μｇ／ｍＬであった。
これに対し、ペプシン処理後の阻害活性（力価）は、２８．３％向上し、ペプシン処理後トリプシン・キモトリプシン処理後の阻害活性（ＩＣ５０）は、２５８８μｇ／ｍＬであった。
よって、鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物のＤＰＰＩＶ阻害活性は、消化管プロテアーゼ処理により低下しないこと、即ち、体内に吸収後も、その活性を発現し得る可能性が示された。

【0036】

実施例３．鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の調製及びそのＤＰＰＩＶ阻害活性の測定
上記実施例１の表１に示されるとおりの、鰹だし抽出後に得られた鰹だし粕タンパク質を、各種のプロテアーゼを用いて可溶化し、ＤＰＰＩＶ阻害活性をそれぞれ測定した。
鰹だし粕（タンパク質７２％）に水１０倍量（対基質）加え、下記表４に示す各プロテアーゼ（いずれも食品工業用途）の至適ｐＨに調製後、当該プロテアーゼを用いて、５０℃にて１６時間反応させた。そしてその後、９８℃、１５分間でプロテアーゼを失活させ、遠心分離（１５０００回転、５分間）した後、得られた清澄液を、本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物とし、それらのＤＰＰＩＶ阻害活性を測定した。
各種試料の測定値から、ＤＰＰＩＶ測定阻害活性（％）を計算し、そのＤＰＰＩＶの５０％阻害活性が認められる各種試料濃度をＩＣ５０値として算出した。また、各試料の各濃度で４回測定し、得られた４回分のＩＣ５０値の平均値を算出し、これをＤＰＰＩＶ阻害率とした。なお、コントロール（阻害物質なし）のＤＰＰＩＶ測定阻害活性（％）を１００とした。
結果を下記表４に示す。

【表4】

【0037】

比較例１．他のプロテアーゼを用いて得られた鰹だし粕由来の組成物のＤＰＰＩＶ阻害活性の測定
用いるプロテアーゼを変更した他は実施例３と同様にして、比較例組成物を得、それらのＤＰＰＩＶ阻害活性を測定した。
結果を下記表５に示す。

【表5】

【0038】

上記表４及び表５の結果から、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ属又はＡｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ属のいずれかの菌株由来のプロテアーゼで酵素処理して得られる本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、その他の菌株由来のプロテアーゼを用いて得られた組成物と比べ、ＤＰＰＩＶ阻害活性がより高いことが判る。その他の菌株を用いた場合には、むしろ、ＤＰＰＩＶ阻害活性が低下したことが明らかとなった。
さらには、上記表４に示されるとおり、本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の中でも、中性プロテアーゼであるプロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ及びスミチームＬＰ５０Ｄを用いて分解した組成物について、ＤＰＰＩＶ阻害活性が特に強いことが判った。

【0039】

実施例４．実施例３で得られた本発明に係る鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の濃度依存性についての試験
上記実施例３で得られた本発明に係る鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の６種について、それらのＤＰＰＩＶ阻害の濃度依存性について試験を行った。
結果を下記表６及び図１に示す。

【表6】

【0040】

表６及び図１の結果から、濃度が高くなるほどＤＰＰＩＶ阻害活性が減少する傾向にあり、その阻害活性は、表４の結果を反映していた。

【0041】

また、上記６種の組成物のＤＰＰＩＶ阻害活性値（ＩＣ５０）及び力価を下記表７に示す。なお、最も活性が強かった組成物番号２のスミチームＬＰ５０Ｄを用いて得られた組成物の力価を１００とした。

【表7】

鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の濃度とＤＰＰＩＶ阻害活性に依存関係が認められた。ＩＣ５０値を算出すると、スミチームＬＰ５０Ｄ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来）に強い阻害活性が認められた。

【0042】

他方、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有する鰹だし粕のプロテアーゼＮＹ−１００による酵素分解物のＤＰＰＩＶ阻害値は、５２５．７μｇ／ｍＬであった。その中に存在する強力なＡＣＥ阻害ペプチドＶａｌ−ＴｒｐのＤＰＰＩＶ阻害活性は検出されなかった。精製過程（疎水性樹脂における水溶出画分の除去）で、ＤＰＰＩＶ阻害活性成分（親水性成分）が排除されていることが推察された（表８）。

【表8】

【0043】

実施例５．本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物のα−グルコシダーゼ阻害活性についての試験
食後血糖上昇抑制作用機構には、２糖類の酵素分解を阻害するα−グルコシダーゼ阻害と難消化性デキストリンよる糖の吸収を遅延させる効果が知られている。
食後の血糖が低い場合は、食事前の摂取による低血糖の副作用が認められているα−グルコシダーゼ阻害活性について、実施例１で得た本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の濃度別に値を測定した（図２）。
図２に示される結果から、本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物には、α−グルコシダーゼ活性を阻害する物質は、高濃度においても存在しないことが推察された。
なお、α−グルコシダーゼ阻害活性の測定は、Ｂｅｎａｖｅｎｔｅ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ．ａｌ，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，５６（１５），６１８５−２０５（２００８）に従い行った。

【0044】

本発明に係る鰹だし由来の及び鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物が、ＤＰＰＩＶ阻害作用を有する一方で、α−グルコシダーゼ阻害作用を有していないことは、特定保健用食品としては初の機構の組み合わせであり、副作用の非常に少ない優れた組成物であると考えられる（表９）。
これに対して、特定保健用食品の血糖上昇抑制成分である豆鼓エキス（特許文献８）及び難消化性デキストリン（特許文献９）は、α-グルコシダーゼ阻害活性を有するが、ＤＰＰＩＶ阻害活性を有していないことが明らかであり、この観点において、本発明に係る組成物は、これら物質と比べてより優れていると考えられる。

【表9】

【0045】

実施例６．本発明に係る鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の血糖上昇抑制作用についての試験
上記のとおり本発明に係る鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物にはＤＰＰＩＶ阻害活性が認められたことから、糖尿病患者及びその境界型糖尿病（糖尿病予備軍）患者にとって、当該本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物を摂取することによって、治療及び健康効果が期待される。
しかしながら、当該組成物に認められるにおいや味は比較的変性しやすく、サプリメントとして利用するには適しているとは言い難い。
そこで、本発明に係る当該組成物が凍結乾燥品としても、ヒト体内において、ＤＰＰＩＶ阻害性糖代謝改善作用（血糖上昇抑制作用）を有するか否かを明らかにするために、下記のとおり臨床試験を行った。

【0046】

（試験方法）
まず、被験者の空腹時の血糖値を、簡易自己血糖測定装置を用いて測定した。次いで、実施例１の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の凍結乾燥物４．５ｇに水１５０ｍＬを加えたものを摂取し、その３０分後に、米飯２００ｇ（約糖質７０ｇ）、ふりかけ２ｇを摂取し、さらにその後、３０、４５、６０、７５、９０、１２０分及び１５０分の血糖値を経時的に測定した。
別の指定日に、対照群として、実施例１の当該組成物の代わりに白湯を１５０ｍＬ摂取後、米飯２００ｇとふりかけ２ｇを食し、上記と同様に血糖値を測定した。

【0047】

（被験者）
被験者は、正常者及び境界型糖尿病（糖尿病予備軍）であり、医師の問診、血液検査で健常と認められた対象者とする。
試験は２日間に分けて行い、１日目（当日）と２日目（翌日又は約１週間後指定）の試験内容は上記のとおりであった。
また、本発明に係る鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物又は白湯と米飯の摂食前に、空腹時の血糖値を測定することから、当日の朝は絶食とした。前日２１時以降は摂食せず、前日からの摂食リズムが２日間ともに同じようになるようにした。

【0048】

（採血及び血糖値の測定）
採血は、各自専用のペン型採血針を用いて指先から行った。通常、採血量は米粒約半分の大きさ程度（約２μＬ）であり、採決後に使い捨ての専用試験紙を装着した簡易自己血糖測定装置を用いて血糖値を測定した。
空腹時血糖値を測定してから摂食後血糖値の経時的測定を完了するまでに約３時間半を要し、各測定の間隔における行動は自由とし、血糖値に大きく影響を及ぼすような運動や活動は控えるように制限した。

【0049】

（結果）
実施例１の組成物の凍結乾燥物を摂取した群の１４名中１２名に糖負荷後３０分から上昇抑制作用が示され、２時間経過後まで、対照群（白湯摂取群）に対して、５％の危険率で有意差が示された（有効率８５．７％）。２名の内、１名は摂取４５分から抑制効果を示し、その後、徐々に正常血糖値に復帰した。１名は変化がなかった。
実施例１の組成物の凍結乾燥物及び白湯摂取後の血糖値の変化を図３に示した。また、下記表１０に実施例１の組成物の凍結乾燥物及び白湯摂取後の血糖降下曲線面積を表した。５％の危険率で群間の有意差が認められた。
また、糖摂取なし且つ実施例１組成物の凍結乾燥物の摂取のみでは、血糖低下作用は示さなかった。

【表10】

【0050】

（結論）
上記臨床試験から、本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物と同様にその凍結乾燥品の摂取により、ヒトに対して血糖上昇抑制作用を示すことが明らかとなった。
さらに、摂食前後及び期間中に副作用及び自覚症状もなく、医師の問診においても異常となる所見は得られなかった。
糖摂取なし且つ実施例１組成物の凍結乾燥物の摂取のみでは、血糖低下作用を示さなかったことから、製薬で懸念される低血糖による副作用はなく、正常血糖者及び低血糖者に作用しないと考えられる。
また、その阻害作用が、ＤＰＰＩＶ阻害のみによるものであることが分かっており、トクホの血糖上昇抑制成分である豆鼓エキス（日本サプリメント）、難消化性デキストリン（松谷化学工業）の作用機序のようにα−グルコシダーゼ阻害によるものでないことが明らかであり、この観点から、本発明の鰹だし由来の及び鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物が、特定保健用食品としてより優れた製品となり得ることが示唆される。

【0051】

実施例７．鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物中の活性ペプチドの同定
鰹だしの凍結乾燥品１００ｍｇを水１ｍＬに溶解し、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５（１０ｍＬ）で平衡化した固相抽出管（ＳｕｐｅｌＴＭ Ｓｈｅｒｅ Ｃａｒｂｏｎ／ＮＨ２６ｍＬ ＳＰＥ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＳＵＰＥＬＣＯ）に負荷し（得られた画分１）、１００％エタノール（１５ｍＬ）溶出（得られた画分２）後、２Ｍ ＮａＣｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０（４ｍＬ）で溶出した（得られた画分３）。
各々の画分についてＤＰＰＩＶ阻害活性を測定した結果、コントロールを１００％として、それぞれの阻害活性は、５４、６６、３７％（ｐ＜０．００１）であり、画分３に高い値が得られた。そこで、当該画分３を逆相ＨＰＬＣに供した。条件は下記のとおりである。
ＩｎｔｅｒＳｕｓｔａｉｎＣ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）
移動相；Ａ：０．１％ギ酸溶液−Ｂ：アセトニトリル１００％液／Ａ０％−Ｂ１００％／３０ｍｉｎ
また、その溶出曲線を図４に示す。

【0052】

ピークに１〜５に対応する試料をそれぞれ分取し、ロータリーエバポレーターにて濃縮乾固し、それをＤＰＰＩＶ阻害活性試料とした。阻害活性を測定した結果、分画１にＤＰＰＩＶ阻害活性が認められた。また、分画１は、濃度依存的にＤＰＰＩＶ阻害が増加したことも分かった。
この分画１について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析とｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を行った。
サンプル:かつおだし分画１
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ
（１．７μｍ，２．１×５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）
質量分析：Ｘｅｖｏ Ｇ２−ｑＴＯＦ（Ｗａｔｅｒｓ）
スペクトル解析：ＢｉｏＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）
ピークのペプチド配列同定：ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析の結果を、図５に示した。

【0053】

上記クロマトグラフィーで確認されたピークに相当する画分のｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を行ったところ、当該画分に含まれている物質は、セリン−グリシン（ＳＧ）又はグリシン−セリン（ＧＳ）の配列をもつペプチドであることが推定されたが、さらに高感度（ｐＭ）Ｎ末端アミノ酸配列解析Ｐｒｏｃｉｓｅ４９１−ｃＬＣ（ＡＢＩ）により、当該画分に含まれている物質は、セリン−グリシン（ＳＧ）の配列からなるペプチドであることが決定した。

【0054】

合成したＳＧのＤＰＰＩＶ阻害活性（ＩＣ５０）を測定したところ、１５９５μＭであった。
これに対し、本実施例で得られた、上記同定したＳＧの阻害活性（ＩＣ５０）は２５８．７μｇ／ｍＬであり、実施例２−２の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の阻害活性値（３０４９．３μｇ／ｍＬ；上記表３参照のこと）の約１０倍であった。また、鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物中のＳＧの含有量は３．２６ｍｇ（当該組成物の乾燥物１００ｇ当り）であることから、寄与率は０．０３８％となり、当該組成物中の主要なＤＰＰＩＶ阻害成分の一つと推定された（表１１）。

【表11】

【0055】

実施例８．鰹だし粕をスミチームＬＰ５０Ｄにより分解して得た組成物の同定
実施例３及び４の結果から、組成物２（上記表７参照）のＤＰＰＩＶ阻害活性が高かったことを受け、当該組成物中のＤＰＰＩＶ阻害物質の同定を行った。
上記実施例１の表１に示されるとおりの、鰹だし抽出後に得られた鰹だし粕（タンパク質７２％）に水１０倍量（対基質）を加え、スミチームＬＰ５０Ｄの至適ｐＨ７に調節後、５０℃にて１６時間反応させた。そしてその後、９８℃、１５分間で失活させ、遠心分離（１５０００回転、５分間）した後、清澄液を得た（当該清澄液をＮ５と呼ぶ。上記組成物２に相当する）。

【0056】

次に、得られたＮ５について、エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによるＤＰＰＩＶ阻害活性画分の分離を行った。
水溶出分画と、１０％エタノール溶出分画により、ＤＰＰＩＶ阻害活性を９倍の比率で分け得て、酵素分解物（Ｎ５）のＩＣ５０の５倍高いＩＣ５０＝７３．７１μｇ／ｍＬの画分を得た（以降、この得られた画分をＹ−２画分と呼ぶ）（表１２）。酵素分解物（Ｎ５）からの収率は、２０％量得られ、阻害活性の回収率は、約１００％であった。

【表12】

【0057】

また他方、Ｙ−２画分取得の工業スケール精製方法を確立した。
Ｎ５酵素分解物（タンパク質量５ｋｇ）を、疎水性樹脂（充填剤ＳＰ２０７；三菱化学）１００Ｌを充填し平衡化したカラムに負荷し、下記表１３に記載のタイムコースで精製を行った。
非吸着画分を別取りし、吸着画分を１０％エタノール濃度溶出液で脱着、Ｙ−２画分を得た。その後、４サイクル分を減圧濃縮によりエタノールを除去、噴霧乾燥し、Ｙ−２画分の粉末を得た。

【表13】

【0058】

上記表１２中の、Ｎ５酵素分解物の各分画におけるＤＰＰＩＶ阻害活性とＹ−２画分のＩＣ５０値の算出式を、図６に示した。

【0059】

また、Ｙ−２画分の凍結乾燥物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析とｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を、下記の条件を設定して、行った。得られたクロマトグラムを、図７に示す。
サンプル：Ｙ−２画分の凍結乾燥物１０ｍｇ／ｍＬ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｍ−Ｃｌａｓｓ ＨＳＳ Ｔ３ ｃｏｌｕｍｎ
(１．８μｍ，０．７５×１５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ)
質量分析：Ｘｅｖｏ Ｇ２−ｑＴＯＦ（Ｗａｔｅｒｓ）
スペクトル解析：ＢｉｏＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）
ピークのペプチド配列同定：ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ

【0060】

得られた１５のピークについて（図７）、それぞれにＭＳスペクトルのｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を行った。その結果、１８種のペプチド配列が同定された。
これらペプチドについて、上記試験例１に記載されているのと同様の方法によって、ＤＰＰＩＶ阻害活性を測定し、その内、阻害活性が最も高かった７種のペプチドについて、さらに同定した。当該７種のペプチド配列及びＤＰＰＩＶ阻害活性を下記表１４に示す。

【表14】

【0061】

また、上記７種のペプチドの、Ｙ−２画分に対するＭＳ面積当たりの寄与率を求めた。寄与率は、当該７種のペプチドで約４０．０９〜４８．９５％であった。その中で、ＭＰＦ、ＬＰＬ及びＭＰＬの３種のトリペプチドは、３３．５２〜４０．９３％の寄与率を示した（表１５）。

【表15】

【0062】

また、Ｙ−２画分の乾燥物１００ｍｇ中の、７種のペプチドの含有量は、下記表１６に記載のとおりであった。

【表16】

【0063】

α−グルコシダーゼ阻害活性、ＤＰＰＩＶ阻害活性及び参照としてＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害活性について、本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物及び本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物と、特許文献８及び９に記載の組成物とを対比した。結果を下記表１７に示す。表中、本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物をＡとし、及び本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物をＹ−２とする。表中の％は、阻害率を表す。

【表17】

表１７より、α−グルコシダーゼ阻害活性を有しない本発明の組成物は、低血糖などのおそれがより低いといえる。

【0064】

本発明において得られた本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物（Ｙ−２画分）は、飲料として、そのままでも又は種々の調味料との混合物としても、摂取できる。

【0065】

（本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物及び鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物の飲食料及び医薬への応用について）
本発明の飲食用組成物（飲食料）は、表１６に示されたペプチドの一種以上を、１回の摂取量として０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ添加して製造される。
本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物及び鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物は、乾燥させることによって、取り扱いが容易で安定な固体ないし粉末形態とすることができ、当該形態の水への溶解性もよい。また、胃腸管からの吸収もよい。したがって、食品への添加の時期、及び方法に特別の制限はなく、粉末状、溶液状、懸濁液状等として、食品製造の原料段階、中間工程、最終工程に、食品分野で慣用の方法で添加することが可能である。
飲食品の形態としては、固形状、半流動状、流動状などを挙げることができる。固形状食品としては、シート状、タブレットやカプセルなどの錠剤、顆粒粉末などの形態の一般食品及び健康食品が挙げられる。半流動状食品としては、ペースト状、ゼリー状、ゲル状などの、また、流動状食品としては、ジュース、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤などの形態の一般食品及び健康食品が挙げられる。飲食物を栄養ドリンクや調味料として、本発明の組成物を継続して摂取することにより、血糖の上昇を抑制することも可能である。

【0066】

本発明によるＤＰＰＩＶ阻害剤である形の医薬組成物は、本発明のペプチドを、上記飲食用組成物と同様の量で含有する。本発明の医薬組成物は、患者のＤＰＰＩＶを阻害し、例えば血糖上昇抑制作用を発揮させるために、高血糖症状の方に食前に投与するとよく、あるいは本発明の医薬組成物の有効成分は天然物である鰹だし又は鰹だし粕由来であることから、継続して安全に使用することもできる。本発明の医薬組成物により血糖上昇を予防することができる。医薬組成物の形態は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ等の経口投与剤が好ましい。液剤は、用時溶解できる乾燥固体であってもよい。

【0067】

配合例．
本発明の鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物（Ｙ−２画分）の乾燥物（粉末品）を原料素材として用い、当該乾燥物１００ｍｇを配合した機能性食品を得た。加工食品として飲料、錠剤、スープ等にも用いられる。
Ｙ−２画分を配合した食品素材の配合割合を下記表１８に示した。

【表18】

上記の配合で、Ｙ−２画分１００ｍｇ含有の錠果（１個当たり１．４３ｇ）を５０万個製造出来る。
Ｙ−２画分の錠果・錠剤・カプセル製造について、Ｙ−２画分、食品素材を計量、混合・造粒・打錠・コート工程後、ＤＰＰＩＶ阻害活性、ペプチド量を測定して製品化できる。

【0068】

鰹節、本発明の鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物（鰹だし由来と略記）及び鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物（Ｙ−２画分）の各素材について、ＤＰＰＩＶ阻害活性と質量から換算表を示した。

【表19】

ＤＰＰＩＶ阻害を指標とした鰹節、鰹だし由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物及び鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物（Ｙ−２画分）の上記換算表から、Ｙ−２画分は、少量で食品素材としても使用しやすく、その汎用性は高いと思われる。

【0069】

（考察）製薬と比較した、特定保健用食品の成分としての本発明のペプチドの適用性について
効能重視の製薬と異なり、特定保健用食品はあくまでも食品であって、同様の効能を有する当該製薬と同等の効き目を必要としない。むしろ、安全性の点から、特定保健用食品の効き目は、製薬よりも１０００〜１００００倍ほど弱いことが望ましい。
現在、我が国で承認されているＤＰＰＩＶ阻害薬は７つあるが、いずれも製薬として強力なｎＭレベルで効果を発揮する。その強力な効果の反面、副作用のおそれも懸念される。
これに対し、本発明の７種のペプチドを含有する組成物（Ｙ−２画分）は、効果がμＭレベルであり、製薬の力価よりも１０００倍程度弱いことから、効き過ぎず、特定保健用食品の成分として、妥当である。今後の動物試験及び臨床試験で十分にその効果が証明されると考えられる。

【要約】      （修正有）

【課題】ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）阻害作用を有する、経口摂取して安全性の高い鰹だし又は鰹だし粕由来の組成物の提供。
【解決手段】鰹だし由来の又は鰹だし粕由来のＤＰＰＩＶ阻害組成物。以下の工程を含む、鰹だし粕由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害組成物の製造方法。１）鰹節を６０℃〜１００℃の熱水で抽出し、更に遠心分離によって上澄を取り除き、鰹だし粕を得る工程；２）前記鰹だし粕を、至適条件下、特定の群より選択される少なくとも１種の菌株由来のプロテアーゼであって食品工業用途のプロテアーゼによって酵素分解し、さらに遠心分離によって清澄液を得る工程；３）前記清澄液を精製する工程；及び４）エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによる溶出を行う工程
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】