特許 5873356 モニリエラ属真菌の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5873356

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】モニリエラ属真菌の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160216BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160216BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

【請求項の数】18

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2012-44053(P2012-44053)

(22)【出願日】2012年2月29日

(65)【公開番号】特開2013-179860(P2013-179860A)

(43)【公開日】2013年9月12日

【審査請求日】2014年12月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100076439

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 敏三

(74)【代理人】

【識別番号】100141771

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 宏和

(74)【代理人】

【識別番号】100131288

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 尚祐

(72)【発明者】

【氏名】中山 素一

(72)【発明者】

【氏名】細谷 幸一

(72)【発明者】

【氏名】矢口 貴志

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−１７４９０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Rosa C. A. et al. 'Moniliella acetoabutans strain CBS 169.66 small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence', GenBank [online], 2009年2月9日, GenBank Accession No.EU252153, [2015年9月10日検索], インターネット<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU252153.1>

【文献】 Shin K. S. 'Moniliella suaveolens var. suaveolens large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence', GenBank [online], 2004年1月1日, GenBank Accession No. AF335520, [2015年9月10日検索], インターネット<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/33340638>

【文献】 Thanh V. N. et al, 'Moniliella dehoogii strain KFP 211 26S ribosomal RNA gene, partial sequence', GenBank [online], 2012年5月14日, GenBank Accession No.JQ814874, [2015年9月10日検索], インターネット<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/386783631?sat=17&satkey=19115787>

【文献】 Int. J. Syst. Evol. Microbiol.，２００９年，vol.59(Pt 2)，p.425-9

【文献】 食総研報，２００８年，No.72，p.73-6

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、
下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに
下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対
からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてモニリエラ（Moniliella）属真菌の種レベルでの検出を行う、モニリエラ属真菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド

【請求項2】

検出を行うために、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてモニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、モニリエラ属真菌の種レベルでの検出を行う、請求項１記載の検出方法。

【請求項3】

前記増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって行う、請求項２記載の検出方法。

【請求項4】

前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行い、モニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、モニリエラ・アセトアブタンスの種レベルでの検出を行う、請求項３記載の検出方法。

【請求項5】

前記モニリエラ・アセトアブタンスの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列が下記（ａ１）又は（ｂ１）の塩基配列である、請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。
（ａ１）配列番号７に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ１）配列番号７に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【請求項6】

前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行い、モニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、モニリエラ・スアヴェオレンスの種レベルでの検出を行う、請求項３記載の検出方法。

【請求項7】

前記モニリエラ・スアヴェオレンスの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列が下記（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれかの塩基配列である、請求項１〜３及び６のいずれか１項記載の検出方法。
（ｃ１）配列番号８に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ１）配列番号８に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｃ２）配列番号９に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ２）配列番号９に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【請求項8】

前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を行い、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種の種レベルでの検出を行う、請求項３記載の検出方法。

【請求項9】

前記モニリエラ・スアヴェオレンス関連種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列が下記（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列である、請求項１〜３及び８のいずれか１項記載の検出方法。
（ｅ１）配列番号１０に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ１）配列番号１０に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｅ２）配列番号１１に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ２）配列番号１１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｅ３）配列番号１２に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ３）配列番号１２に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【請求項10】

下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド、下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド又は下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド

【請求項11】

前記オリゴヌクレオチドが核酸プライマーである、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド対。

【請求項12】

前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ａ１）及び／又は（ｂ１）の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、モニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）を検出するための核酸プライマーとして機能し得る、請求項１０又は１１記載のオリゴヌクレオチド対。
（ａ１）配列番号７に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ１）配列番号７に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【請求項13】

前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって前記（ａ１）及び／又は（ｂ１）の塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、モニリエラ・アセトアブタンスを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド対。

【請求項14】

前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、モニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）を検出するための核酸プライマーとして機能し得る、請求項１０又は１１記載のオリゴヌクレオチド対。
（ｃ１）配列番号８に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ１）配列番号８に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｃ２）配列番号９に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ２）配列番号９に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【請求項15】

前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって前記（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ１）及び（ｄ１）のいずれかの塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、モニリエラ・スアヴェオレンスを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項１４記載のオリゴヌクレオチド対。

【請求項16】

前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）を検出するための核酸プライマーとして機能し得る、請求項１０又は１１記載のオリゴヌクレオチド対。
（ｅ１）配列番号１０に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ１）配列番号１０に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｅ２）配列番号１１に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ２）配列番号１１に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｅ３）配列番号１２に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ３）配列番号１２に記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有しかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【請求項17】

前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって前記（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸の一部を増幅でき、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種を検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項１６記載のオリゴヌクレオチド対。

【請求項18】

請求項１０〜１７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド対を含むモニリエラ（Moniliella）属真菌検出キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、モニリエラ（Moniliella）属真菌の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

モニリエラ属真菌は自然界の土壌に広く分布し、野菜、果物等の農作物に付着し、これらの農作物を原材料とした飲食品を汚染し、飲食品製造環境からの検出例の多い真菌として知られている。モニリエラ属真菌の具体例としては、他の菌類に比べて高い酢酸耐性を有する好酸性のモニリエラ・アセトアブタンス（Moniliella acetoabutans）や、油を含有する食品からの検出例があるモニリエラ・スアヴェオレンス（Moniliella suaveolens）及びモニリエラ・スアヴェオレンス関連種（Moniliella suaveolens related species）などが挙げられる。これらの真菌は、酢酸等の内容液の耐菌性で制御することが難しく酸性食品等での汚染事故の原因となりうる。
したがって、飲食品の防腐・防黴体制を確立する上でモニリエラ属真菌の存在の有無を把握することは重要であり、酢酸耐性や油類の資化性など生物学的な特性が異なるモニリエラ属真菌を迅速かつ正確に検出する技術が要求されている。

【0003】

従来のモニリエラ属の真菌の検出方法は、培養を用いた形態学的な種分類が主である。この方法は形態学的な特徴が発生するまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには加熱や薬剤などによる損傷菌体等は形態形成能を失うケースが存在し、それら菌体は長期間培養を行っても特徴的な形態を形成しないことから、検出結果の正確性に問題があった。このように真菌の検出に長期間を要し、同定結果の正確性に問題がある形態学的な検出方法は、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるとは言いがたい。従って、こうした従来の迅速性と正確性の問題を解決した検出方法の確立が求められてきた。

【0004】

真菌類の迅速性及び正確性の高い検出方法としては、遺伝子の特定の塩基配列を標的とした増幅法（たとえばＰＣＲ法やＬＡＭＰ法）が知られている。例えば、特許文献１及び２には、特定の塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いて、モニリエラ属真菌を含む担子菌類や食品汚染糸状菌のゲノムＤＮＡ中の１８Ｓ ｒＲＮＡの特定部位を増幅することにより、真菌類を検出する方法が記載されている。しかし、モニリエラ属の真菌に特異的な遺伝子領域が解明されておらず、特許文献１及び２記載の方法ではユニバーサルプライマーを用いているためモニリエラ属真菌のみを検出することができない。したがって、モニリエラ属真菌を迅速かつ正確に検出することが困難であるという問題を有している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００７−１７４９０２号公報

【特許文献2】特開２００７−１７４９０３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記のように、モニリエラ属真菌は、菌種により酢酸耐性や油類の資化性など生物学的な特性が異なる。したがって、飲食品業界などにおいて、モニリエラ属真菌の制御（混入防止、殺滅、増殖阻止）には各菌種の微生物学的な特性に合せた制御方法を決定することが必要となる。したがって、飲食品業界などにおいて危害菌の迅速かつ正確なリスク評価を行うには、モニリエラ属真菌を菌種レベルで迅速かつ正確に検出することが重要となる。

【0007】

本発明は、飲食品汚染の原因菌の１種であるモニリエラ属真菌を種レベルで迅速かつ正確に検出しうる方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

このような課題に鑑み、本発明者等は、モニリエラ属真菌を種レベルで迅速かつ正確に検出しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。具体的には、本発明者らは、モニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列に基づく分子系統分類学的手法を用いて、鋭意検討を行った。その結果、各種モニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の中に、他種のモニリエラ属真菌のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する部位（以下、「可変部位」ともいう）が存在することを見出した。また、これらの可変部位をターゲットとすることでモニリエラ属真菌を種レベルで迅速かつ正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。

【0009】

本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてモニリエラ属真菌の種レベルでの検出を行う、モニリエラ属真菌の検出方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出に使用できるオリゴヌクレオチド

【0010】

また、本発明は、前記（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド若しくは前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対に関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むモニリエラ属真菌検出キットに関する。

【発明の効果】

【0011】

本発明の検出方法は、飲食品の汚染事故の原因菌の１つであるモニリエラ属真菌を種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。また、本発明オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、前記方法に好適に適用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】モニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列に基づいて作成した、モニリエラ属真菌の分子系統樹を示す図である。

【図2】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【図3】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【図4】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【図5】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【図6】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【図7】実施例における、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【図8】実施例における、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【図9】実施例における、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、モニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の特定の部分塩基配列、すなわち本領域に存在するモニリエラ属真菌にそれぞれ特異的な塩基配列部位（可変部位）にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド対を用いてモニリエラ属真菌の検出を行い、モニリエラ属真菌を種レベルで迅速かつ正確に検出する方法である。ここで、「可変部位」とは、２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中で塩基変異が蓄積しやすい部位であり、この部位の塩基配列は他菌種との間で大きく異なる。

【0014】

本発明における「モニリエラ属真菌」とは、担子菌類の１種で、酸性食品、乳製品、甘味食品からの検出例の報告の多い菌類である。
本明細書において、「ｒＤＮＡ」とは、タンパク質への翻訳の場であるリボゾームの遺伝情報をコードするＤＮＡであり、「２８Ｓ ｒＤＮＡ」とは、ｒＤＮＡのうち２８Ｓサブユニットの遺伝情報をコードするＤＮＡである。

【0015】

本明細書における「種」とは、モニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列について分子系統分類学的手法を用いて作成した分子系統樹に基づいて分類した、モニリエラ属真菌の菌種群を意味する。
前記分子系統樹の作成方法としては特に制限はなく、通常の方法により作成することができる。例えば、近隣結合法（neighbor-joining method）、最大節約法（Maximum parsimony）、最尤法（Maximum likelihood estimation）、ベイズ法、非加重結合法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）等を用いて作成することができる。本発明においては、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成することが好ましい。

【0016】

本発明におけるモニリエラ属とは出芽型分生子と分節型分生子を有する酵母状の真菌である。
この属のうち、「モニリエラ・アセトアブタンス」とは、茶色、滑面の厚膜胞子を形成する。本菌種は酢酸に耐性があり、マヨネーズやドレッシングなどの酢酸添加食品の腐敗菌となる菌種である。また、「モニリエラ・スアヴェオレンス」とは、厚膜胞子を形成せず、バターやマーガリンなどの油成分の多い食品からの分離例が多い菌種である。また、「モニリエラ・スアヴェオレンス関連種」とは、モニリエラ・スアヴェオレンスのタイプストレインと形態学的に差が認められないが、分子系統的にモニリエラ・スアヴェオレンスとは離れた単一の分岐群を形成する菌種である。

【0017】

なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

【0018】

本発明の検出方法は、モニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中の可変部位に対応する核酸で表されるオリゴヌクレオチド対を用いることを特徴とする。
発明者等は、モニリエラ属真菌各種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定し、種間での遺伝的距離と塩基配列の相同性の解析を行った。すなわち、シークエンシング法によりモニリエラ属真菌各種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定し、アライメント解析により一致する塩基領域の検討を行った。その結果、２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中に同一種内では保存性が高いが異なる種間で塩基配列の保存性が低く、種によって固有の塩基配列を有する可変部位を見い出した。この可変部位においてモニリエラ属真菌は種固有の塩基配列を有している。そのため、当該領域はモニリエラ属真菌を種レベルで迅速かつ正確に検出するための遺伝学的な指標として有用である。

【0019】

本発明の検出方法は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いる。

（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出に使用できるオリゴヌクレオチド

前記オリゴヌクレオチド対を使用してモニリエラ属真菌を種レベルで検出し、同定することにより、モニリエラ属真菌の検出が可能となる。なお、本明細書における「検出」とは、分類学上で使用される「同定」も含むものである。

【0020】

モニリエラ属真菌の１種である、モニリエラ・アセトアブタンスの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変部位を配列番号７に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号７に記載の塩基配列は、モニリエラ・アセトアブタンスIFM59903（CBS169.66）株の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を示す。
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Mac_F1ともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Mac_R1ともいう）はそれぞれ、配列番号７に記載の塩基配列のうち１２７位〜１４５位までの領域及び３５５位〜３７４位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、モニリエラ・アセトアブタンスとその他の種間での塩基配列の保存性が特に低い領域であること、これらの領域の塩基配列はモニリエラ・アセトアブタンスが固有に有する塩基配列であること、を本発明者らが見出した。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、モニリエラ・アセトアブタンスを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればモニリエラ・アセトアブタンスのに特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による同定が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、モニリエラ・アセトアブタンスのの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりモニリエラ・アセトアブタンスを検出することが可能となる。

【0021】

本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ａ１）又は（ｂ１）の塩基配列で表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ａ１）配列番号７に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｂ１）配列番号７に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつモニリエラ・アセトアブタンスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【0022】

モニリエラ属真菌の１種である、モニリエラ・スアヴェオレンスの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変部位を配列番号８及び９に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号８に記載の塩基配列は、モニリエラ・スアヴェオレンスIFM60291（CBS126.42）株の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を、配列番号９に記載の塩基配列は、モニリエラ・スアヴェオレンスIFM60293（CBS542.781）株の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列をそれぞれ示す。
前記（ｃ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Msu_F1ともいう）及び前記（ｄ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Msu_R1ともいう）はそれぞれ、配列番号８及び９に記載の塩基配列のうち１２７位〜１４４位までの領域及び４５１位〜４７１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、モニリエラ・スアヴェオレンスとその他の種間での塩基配列の保存性が特に低い領域であること、これらの領域の塩基配列はモニリエラ・スアヴェオレンスが固有に有する塩基配列であること、を本発明者らが見出した。したがって、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて、モニリエラ・スアヴェオレンスを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればモニリエラ・スアヴェオレンスに特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による同定が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、モニリエラ・スアヴェオレンスの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりモニリエラ・スアヴェオレンスを検出することが可能となる。

【0023】

本発明において、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれかの塩基配列で表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｃ１）配列番号８に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ１）配列番号８に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｃ２）配列番号９に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｄ２）配列番号９に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【0024】

モニリエラ属真菌の１種である、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変部位を配列番号１０〜１２に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号１０に記載の塩基配列は、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種IFM60348（CBS157.58）株のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の部分塩基配列を、配列番号１１に記載の塩基配列は、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種IFM60349（CBS221.32）株の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を、配列番号１２に記載の塩基配列は、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種IFM60350（CBS223.32）株の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列をそれぞれ示す。
前記（ｅ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Msu_sp._1Fともいう）及び前記（ｆ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Msu_sp._1Rともいう）はそれぞれ、配列番号１０に記載の塩基配列のうち１７位〜３９位までの領域及び４１５位〜４３４位までの領域、配列番号１１に記載の塩基配列のうち１７位〜３９位までの領域及び４０３位〜４２２位までの領域、配列番号１２に記載の塩基配列のうち１７位〜３９位までの領域及び４０３位〜４２２位までの領域、にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種とその他の種間での塩基配列の保存性が特に低い領域であること、これらの領域の塩基配列はモニリエラ・スアヴェオレンス関連種が固有に有する塩基配列であること、を本発明者らが見出した。したがって、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いて、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種を種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればモニリエラ・スアヴェオレンス関連種に特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による同定が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりモニリエラ・スアヴェオレンス関連種を検出することが可能となる。

【0025】

本発明において、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｅ１）配列番号１０に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ１）配列番号１０に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｅ２）配列番号１１に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ２）配列番号１１に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｅ３）配列番号１２に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列又はその相補配列
（ｆ３）配列番号１２に記載の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列

【0026】

本発明の検出方法に用いる前記（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、モニリエラ・アセトアブタンス、モニリエラ・スアヴェオレンス又はモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の種レベルでの検出に使用できれば、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつモニリエラ属真菌の種レベルでの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。

【0027】

前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。

【0028】

前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、モニリエラ属真菌の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。

【0029】

前記オリゴヌクレオチド対を用いてモニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列で表される核酸の存在を確認し、モニリエラ属真菌を種レベルで検出する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。

【0030】

本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プローブ及び／又は核酸プライマーとして用いることができる。

【0031】

核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでモニリエラ属真菌を種レベルで検出することができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。

【0032】

本発明の検出方法において、モニリエラ属真菌を種レベルで検出するために、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに／又は前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。モニリエラ・アセトアブタンスを検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いるのが好ましい。モニリエラ・スアヴェオレンスを検出するためには、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いるのが好ましい。モニリエラ・スアヴェオレンス関連種を検出するためには、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いるのが好ましい。

【0033】

被検体中のモニリエラ属真菌を種レベルで検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。上記核酸プローブはモニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の可変部位と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のモニリエラ属真菌を迅速かつ正確に種レベルで検出することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。

【0034】

本発明の検出方法において、モニリエラ属真菌の検出を行うため、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてモニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いモニリエラ属真菌の検出を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。

【0035】

本発明において、モニリエラ・アセトアブタンスを検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、モニリエラ・アセトアブタンスの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列（好ましくは、前記（ａ１）及び（ｂ１）のいずれかの塩基配列）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、モニリエラ・アセトアブタンスの種レベルでの検出を行うのが好ましい。ここで、（ｂ１）の塩基配列は、配列番号７に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列が好ましく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９７％以上であることが特に好ましい。ここで、本発明における「モニリエラ・アセトアブタンス」は、配列番号７に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を有するものの他、配列番号７に記載の塩基配列との相同性が８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列を２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ａ１）及び／又は（ｂ１）の塩基配列で表される核酸又はその一部を増幅でき、モニリエラ・アセトアブタンスを種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をモニリエラ・アセトアブタンス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。

【0036】

本発明において、モニリエラ・スアヴェオレンスを検出するためには、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、モニリエラ・スアヴェオレンスの２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列（好ましくは、前記（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれかの塩基配列）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、モニリエラ・スアヴェオレンスの種レベルでの検出を行うのが好ましい。ここで、（ｄ１）の塩基配列は、配列番号８に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列が好ましく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９７％以上であることが特に好ましい。また、（ｄ２）の塩基配列は、配列番号９に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列が好ましく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９７％以上であることが特に好ましい。ここで、本発明における「モニリエラ・スアヴェオレンス」は、配列番号８又は９に記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を有するものの他、配列番号８及び９の少なくとも一方に記載の塩基配列との相同性が８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列を２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれかの塩基配列で表される核酸又はその一部を増幅でき、モニリエラ・スアヴェオレンスを種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をモニリエラ・スアヴェオレンス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。

【0037】

本発明において、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種を検出するためには、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列（好ましくは、前記（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種の種レベルでの検出を行うのが好ましい。ここで、（ｆ１）の塩基配列は、配列番号１０に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列が好ましく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９７％以上であることが特に好ましい。また、（ｆ２）の塩基配列は、配列番号１１に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列が好ましく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９７％以上であることが特に好ましい。また、（ｆ３）の塩基配列は、配列番号１２に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列が好ましく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９７％以上であることが特に好ましい。ここで、本発明における「モニリエラ・スアヴェオレンス関連種」は、配列番号１０〜１２のいずれかに記載の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を有するものの他、配列番号１０〜１２の少なくともいずれかに記載の塩基配列との相同性が８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列を２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸又はその一部を増幅でき、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種を種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をモニリエラ・スアヴェオレンス関連種検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。

【0038】

ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で約５〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜６５℃（好ましくは５９〜６２℃）で約５〜６０秒、より好ましくは６１℃で６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約１０〜６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で約５〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜６５℃（好ましくは５９〜６２℃）で約５〜６０秒、より好ましくは６１℃で６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約１０〜６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。
前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で約５〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜６５℃（好ましくは５９〜６２℃）で約５〜６０秒、より好ましくは６１℃で６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約１０〜６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。

【0039】

本発明において、遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にモニリエラ・アセトアブタンスが含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約２５０bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。検体にモニリエラ・スアヴェオレンスが含まれる場合、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約３６０bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。検体にモニリエラ・スアヴェオレンス関連種が含まれる場合、前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約３８０bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。
このような操作を行うことにより、検体に検出対象真菌が含まれているかを確認することができる。

【0040】

本発明において、モニリエラ属真菌の同定を行うために、前記オリゴヌクレオチド対を用いて被検体の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を決定し、該部分塩基配列が前記（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列に含まれるか否かを確認することで、前記（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸の存在を確認しモニリエラ属真菌を種レベルで検出することもできる。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有する２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と前記（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列とを比較し、その一致又は相違に基づいて前記（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸の存在を確認しモニリエラ属真菌の種レベルの検出を行うものである。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに／又は前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列とを比較し、前記（ａ１）、（ｂ１）、（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）、（ｄ２）、（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記（ａ１）又は（ｂ１）の塩基配列で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をモニリエラ・アセトアブタンスと同定することができ、前記（ｃ１）、（ｄ１）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれかの塩基配列で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をモニリエラ・スアヴェオレンスと同定することができ、前記（ｅ１）、（ｆ１）、（ｅ２）、（ｆ２）、（ｅ３）及び（ｆ３）のいずれかの塩基配列で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をモニリエラ・スアヴェオレンス関連種と同定することができる。このようにして、モニリエラ・アセトアブタンス、モニリエラ・スアヴェオレンス及びモニリエラ・スアヴェオレンス関連種などのモニリエラ属真菌を種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。

【0041】

本発明において、増幅反応に用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。

【0042】

本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モニリエラ属真菌の検出を行うのに未精製の状態でも十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルムで処理したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。

【0043】

本発明のモニリエラ属真菌検出用キットは、前記本発明のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド対を核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。本発明のキットは、前記核酸プローブ及び／又は核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対によって検出反応が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだゲノムＤＮＡが挙げられる。

【実施例】

【0044】

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0045】

（１）分子系統樹の作成、及びモニリエラ属真菌の分類
モニリエラ属真菌の各菌種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列をDNA data bank of Japan(DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）のARSA検索、及びNL1プライマー（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’：配列番号１３）とNL4プライマー（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’：配列番号１４)（The fungal homorph：Mitotic and plemorphic speciation in fungal systematics.，Wallingford：CAB international参照）を用いたPCR（変性温度９５℃１分、アニーリング温度５３℃１分、伸長温度７２℃１分の35サイクル）で得られたPCR産物の解析により得た。PCR産物は、BigDye terminator Ver．1.1（商品名、Applied Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア‘ATGC Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
得られた塩基配列をClustal W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を使用してアライメント解析を行い、ソフトウェアNJPLOTを用いて近隣結合法による解析を行い、分子系統樹を作成した。作成した分子系統樹を図１に示す。
図１に示すように、供託機関にはモニリエラ・スアヴェオレンスとして登録されている菌株の中でも、IFM60348株、IFM60349株及びIFM60350株は、モニリエラ・スアヴェオレンスIFM60291（CBS126.42）株との間で、２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列の相同性がそれぞれ85.1％、85.1％及び85.3％と総じて低く、かつ分子系統樹では単一の分岐群を形成したため、モニリエラ・スアヴェオレンスとは別種と考えられる。そのため本発明では、これらの３株をモニリエラ・スアヴェオレンス関連種と呼称し、モニリエラ・スアヴェオレンスとは区別して独立した種として扱う。本種もチーズなどからの分離例があり、食品衛生上重要である。

【0046】

（２）モニリエラ属真菌に特異的な２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列の解析
下記の方法により、モニリエラ属真菌各種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を決定した。
ＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）斜面培地にて３０℃で２〜５日間暗所培養した菌体から、GenとるくんTM（タカラバイオ社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe TaqTM Ready-To-Go PCR Beads（GE Health Care UK LTD)を用いて、プライマーとしてNL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’：配列番号１３）及びNL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’：配列番号１４）を使用した。増幅条件は、変性温度９５℃、アニーリング温度５５℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto SegTM G-50（Amersham Pharmacia Biotech社製）を使用し精製した。ＰＣＲ産物は、BigDye terminator Ver．1.1（商品名、Applied Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア‘ATGC Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定したモニリエラ属真菌各種や、各種菌類の公知の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列情報をもとに、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行い、モニリエラ・アセトアブタンス、モニリエラ・スアヴェオレンス及びモニリエラ・スアヴェオレンス関連種にそれぞれ特異的な塩基配列を含有する２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域中の特定領域の塩基配列（配列番号１〜６）を決定した。

【0047】

（３）プライマーの設計
上記で決定したモニリエラ・アセトアブタンス、モニリエラ・スアヴェオレンス及びモニリエラ・スアヴェオレンス関連種にそれぞれ特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号１の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Mac_F1プライマー）、配列番号２の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Mac_R1プライマー）、配列番号３の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Msu_F1プライマー）、配列番号４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Msu_R1プライマー）、配列番号５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Msu_sp._1Fプライマー）、及び配列番号６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Msu_sp._1Rプライマー）を設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、０．０２μｍｏｌスケール）、購入した。
前記の各プライマーは、モニリエラ・アセトアブタンス、モニリエラ・スアヴェオレンス及びモニリエラ・スアヴェオレンス関連種の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の各特定領域の塩基配列に基づき設計したものである。

【0048】

（４）モニリエラ・アセトアブタンスの検出
設計したMac_F1プライマー及びMac_R1プライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちモニリエラ・アセトアブタンス、その他のモニリエラ属真菌、及び飲食品製造環境からの検出例の多い真菌等としては、表１〜３に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で２〜５日間暗所培養を行った。

【0049】

【表1】

【0050】

【表2】

【0051】

【表3】

【0052】

培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。

【0053】

ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Pre Mix Taq（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ及び無菌蒸留水１０μＬを混合し、Mac_F1プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及びMac_R1プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。

【0054】

ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic Acid sample loading buffer ５×（BIO RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１２５Ｖ、２５分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図２〜４に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図２は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図３は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図４は表３に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ Load 100bp molecular Ruler（商品名、BIO RAD社製）を用いた。

【0055】

その結果、モニリエラ・アセトアブタンスのゲノムＤＮＡを含む試料では、約２５０bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、モニリエラ・アセトアブタンス以外の真菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、特定のオリゴヌクレオチド対を用いることによって、モニリエラ・アセトアブタンスを種レベルで特異的に検出することができる。

【0056】

（５）モニリエラ・スアヴェオレンスの検出
設計したMsu_F1プライマー及びMsu_R1プライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちモニリエラ・スアヴェオレンス、その他のモニリエラ属真菌、及び飲食品製造環境からの検出例の多いでの事故事例で報告されている真菌等としては、表４及び５に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で２〜５日間暗所培養を行った。

【0057】

【表4】

【0058】

【表5】

【0059】

培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。

【0060】

ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Pre Mix Taq（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ及び無菌蒸留水１０μＬを混合し、Msu_F1プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及びMsu_R1プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。

【0061】

ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic Acid sample loading buffer ５×（BIO RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１２５Ｖ、２５分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図５及び６に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図５は表４に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図６は表５に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ Load 100bp molecular Ruler（商品名、BIO RAD社製）を用いた。

【0062】

その結果、モニリエラ・スアヴェオレンスのゲノムＤＮＡを含む試料では、約３６０bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、モニリエラ・スアヴェオレンス以外の真菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、特定のオリゴヌクレオチド対を用いることによって、モニリエラ・スアヴェオレンスを種レベルで特異的に検出することができる。

【0063】

（６）モニリエラ・スアヴェオレンス関連種の検出
設計したMsu_sp._1Fプライマー及びMsu_sp._1Rプライマーの有効性の評価に用いる真菌類、すなわちモニリエラ・スアヴェオレンス関連種、その他のモニリエラ属真菌、及び飲食品製造環境からの検出例の多い真菌等としては、表６〜８に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて３０℃で２〜５日間暗所培養を行った。

【0064】

【表6】

【0065】

【表7】

【0066】

【表8】

【0067】

培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。

【0068】

ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、Pre Mix Taq（商品名、タカラバイオ社製）１３μＬ及び無菌蒸留水１０μＬを混合し、Msu_sp._1Fプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ及びMsu_sp._1Rプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬを加え、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。

【0069】

ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic Acid sample loading buffer ５×（BIO RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１２５Ｖ、２５分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図７〜９に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図７は表６に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図８は表７に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図９は表８に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ Load 100bp molecular Ruler（商品名、BIO RAD社製）を用いた。

【0070】

その結果、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種のゲノムＤＮＡを含む試料では、約３８０bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種以外の真菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、特定のオリゴヌクレオチド対を用いることによって、モニリエラ・スアヴェオレンス関連種を種レベルで特異的に検出することができる。

【0071】

上記の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、モニリエラ属真菌の２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の部分塩基配列の存在を確認することができ、モニリエラ属真菌を種レベルで特異的に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、従来の方法と比較して、種レベルでより迅速かつより正確にモニリエラ属真菌を検出することが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]