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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5873499
(24)【登録日】2016年1月22日
(45)【発行日】2016年3月1日
(54)【発明の名称】抗がん剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/00 20060101AFI20160216BHJP
A61K 35/68 20060101ALI20160216BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20160216BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20160216BHJP
A61K 47/34 20060101ALI20160216BHJP
A61K 47/48 20060101ALI20160216BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20160216BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20160216BHJP
【ＦＩ】
A61K37/02ZNA
A61K35/68
A61K35/74 D
A61K39/39
A61K47/34
A61K47/48
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】8
【全頁数】22
(21)【出願番号】特願2013-530856(P2013-530856)
(86)(22)【出願日】2011年9月30日
(65)【公表番号】特表2013-543493(P2013-543493A)
(43)【公表日】2013年12月5日
(86)【国際出願番号】IN2011000680
(87)【国際公開番号】WO2012042540
(87)【国際公開日】20120405
【審査請求日】2014年9月25日
(31)【優先権主張番号】2754/MUM/2010
(32)【優先日】2010年10月1日
(33)【優先権主張国】IN
(73)【特許権者】
【識別番号】513075467
【氏名又は名称】アムリタ セラピューティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＲＩＴＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(72)【発明者】
【氏名】スリ アニル
(72)【発明者】
【氏名】カノジア ディーピカ
(72)【発明者】
【氏名】サルンケ プラバカー
(72)【発明者】
【氏名】マハリ シダート
(72)【発明者】
【氏名】マンナ スニル クマー
(72)【発明者】
【氏名】スロリア アヴァデシャ
(72)【発明者】
【氏名】チャクラバーティ アナンダ
【審査官】
加藤 文彦
(56)【参考文献】
【文献】
特開平０１−２８７０９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開昭６２−２４９９２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Kobayashi, K. et al.，Nucleotide sequence of MPB63 gene in Mycobacterium bovis BCG Tokyo.，Journal of Basic Microbiology，２００３年，43巻3号，pp. 249-254.
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ３５／６８
Ａ６１Ｋ ３５／７４
Ａ６１Ｋ ３９／３９
Ａ６１Ｋ ４７／３４
Ａ６１Ｋ ４７／４８
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３５／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び／又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する微生物起源のタンパク質、若しくは該タンパク質のバリアント
を含む、活性が増大し毒性が減少した抗がん剤であって、前記バリアントが、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含み、かつ抗がん活性に影響を与えることなく、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列において１０〜５０％の変異を有する、前記抗がん剤。
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する微生物起源のタンパク質、若しくは該タンパク質のバリアント
を含む、活性が増大し毒性が減少した抗がん剤であって、前記バリアントが、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含み、かつ抗がん活性に影響を与えることなく、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列において１０〜５０％の変異を有する、前記抗がん剤。
【請求項2】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する微生物起源のタンパク質が、寄生虫トキソプラズマ由来の表面タンパク質であり、ＳＡＧ１と呼ばれる、請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項3】
黒色腫、白血病、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、腎臓がん及び脳がんからなる群から選択されるがんに対して抗がん活性を示す、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
【請求項4】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗がん剤を含む医薬組成物。
【請求項5】
アジュバント（複数可）をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
ペグ化、アセチル化、リン酸化により修飾された、又は合成的に調製された、請求項１〜３のいずれかに記載の抗がん剤。
【請求項7】
黒色腫、白血病、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、腎臓がん又は脳がんの治療的及び／又は予防的処置のための、アジュバント又は賦形剤の存在下又は非存在下での静脈内（ｉｖ）、筋肉内、経口、皮下又は局所適用に有用である、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項8】
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び／又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する微生物起源のタンパク質、若しくは該タンパク質のバリアント
を含む、抗がん剤であって、前記バリアントが、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含み、かつ抗がん活性に影響を与えることなく、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列において１０〜５０％の変異を有する、前記抗がん剤。
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する微生物起源のタンパク質、若しくは該タンパク質のバリアント
を含む、抗がん剤であって、前記バリアントが、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドとを含み、かつ抗がん活性に影響を与えることなく、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列において１０〜５０％の変異を有する、前記抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に、微生物起源である広域スペクトル抗がん剤に関する。より特定すれば、本発明は、病原性及び非病原性の両方の細菌、ウイルス、並びに／若しくは寄生虫を含むがこれらに限定されない微生物により分泌されるタンパク質、又は該微生物における表面結合タンパク質に関する。本発明の抗がん剤は、細菌及び寄生虫から単離された精製タンパク質である。具体的には、本発明の薬剤は、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）ＢＣＧ、及びトキソプラズマ（Toxoplasma gondii）から単離されたタンパク質を少なくとも含む。該薬剤はまた、このようなタンパク質に由来するペプチド、合成的に調製されたペプチド、及びペグ化、アセチル化、リン酸化等により修飾されたタンパク質又はペプチドも包含する。該タンパク質又はさまざまなこの切断誘導体は、向上した有効性及び減少した毒性を有する。活性を有する精製タンパク質及びペプチドになされた修飾は、患者の血流において活性成分の半減期を延長させ、又は免疫原性（immunogenecity）を減少させる。
【0002】
本発明はまた、哺乳動物のがんを治療するための治療剤としての組成物、医薬組成物、及びこの適用方法も開示する。医薬組成物は、単独での、又は組み合わせた活性成分、すなわち、ペグ化、アセチル化、リン酸化形態を含むタンパク質、ペプチドと、生理学的及び薬学的に許容されるアジュバント又は賦形剤とを含む。
【背景技術】
【0003】
膀胱がんは、最も致死的な形態のがんの１つであり、米国におけるがん関連死の６番目に多い原因と考えられている（Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Murray, T., Thun, M.J. and Ward E. 2008. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 58:71-96）。がん対策のための薬剤の備蓄の中の主な手段（weapon）の１つは、１９７６年以来、膀胱の表在性尿路上皮がんと戦うための細菌ウシ型結核菌（カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ，Bacillus Calmette-Guerin））の使用である（Herr, H.W. and Morales, A. 2008. History of bacillus Calmette-Guerin and bladder cancer: an immunotherapy success story. J. Urol. 179:53-56；Kresowik, T.P. and Griffith, T.S. 2010. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) for urothelial carcinoma of the bladder. In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools, A.M. Fialho and A.M. Chakrabarty, Eds., pages 49-70, John Wiley & Sons Inc., New York）。抗がん療法として使用するには、生ＢＣＧ細胞は凍結乾燥粉末として得られ、空の膀胱に尿道カテーテルを通じて導入される。数分間から数時間までのさまざまな滞留期間後、ＢＣＧ細胞は排尿を通じて患者により排泄される。患者はこの後、膀胱鏡検査、従来の細胞診及びＦＩＳＨ分析によりモニターされる。ＢＣＧ効果は、殺腫瘍活性をもたらすサイトカインＩＬ８及びＴＲＡＩＬの放出など、膀胱における免疫反応の誘導を通じて媒介されると考えられている（Herr, H.W. and Morales, A. 2008. History of bacillus Calmette-Guerin and bladder cancer: an immunotherapy success story. J. Urol. 179:53-56；Kresowik, T.P. and Griffith, T.S. 2010. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) for urothelial carcinoma of the bladder. In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools, A.M. Fialho and A.M. Chakrabarty, Eds., pages 49-70, John Wiley & Sons Inc., New York）。この免疫応答は、ＢＣＧの反復点滴注入により大いに増幅される。これは、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦ、及びＩＦＮを含むサイトカインレベルの上昇（Shintani, Y., Sawada, Y., Inagaki, T., Kohjimoto, Y., Uekado, Y. and Shinka, T. 2007. Intravesical instillation therapy with bacillus Calmette-Guerin for superficial bladder cancer: Study of the mechanism of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Intl. J. Urol. 14:140-146；Bisiaux, A., Thiounn, N., Timsit, M.O., Eladaui, A., Chang, H.H. et al. 2009. Molecular analyte profiling of the early events and tissue conditioning following intravesical bacillus Calmette_Guerin therapy in patients with superficial bladder cancer. J. Urol. 181:1571-1580）、並びに好中球、リンパ球、及び単球／マクロファージのこの後の浸潤の重要性を示すものである。実際、ＢＣＧ刺激好中球は、ＴＲＡＩＬ依存的にインビトロで膀胱がん細胞を死滅させることが示されている（Ludwig, A.T., Moore, J.M., Luo, Y., Chen, X., Saltsgaver, N.A., O’Donnell, M.A. and Griffith, T.S. 2004. Tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand: A novel mechanism for Bacillus Calmette-Guerin-induced antitumor activity. Cancer Res. 64:3386-3390）。
【0004】
あいにく、膀胱がん治療のために生ＢＣＧ細胞を治療的に使用することは、膀胱炎及び肉眼的血尿から致死的なＢＣＧ敗血症にわたる多くの衰弱性の及び／又は重篤な副作用を伴う。膀胱内ＢＣＧ療法中のこのような主な副作用は、患者の３０％で治療に影響を及ぼす可能性があるが、軽度の膀胱炎、倦怠感、微熱及び他の副作用は、患者の約９０％でよく見られる（Bohle, A., Jocham, D. and Bock, P.R. 2003. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: A formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169:90-95；Sylvester, R.J., van der Meijden, A.P., Oosterlinck, W., Hoeltl, W. and Bono, A.V. 2003. The side effects of Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of Ta T1 bladder cancer do not predict its efficacy: Results from a European Organisation for Research and Treatment of Cancer Genito-Urinary Group Phase III trial. Eur. Urol. 44:423-428）。
【0005】
さらに、幾つかの最近の所見は、ＢＣＧ療法を行っても、ヒトにおける特定の一塩基多型（ＳＮＰ，single nucleotide polymorphism）は疾患進行を促進することがあり、このような患者における免疫応答を引き起こす生ＢＣＧ細菌の使用の効果を低下させることを支持している（Basturk, B., Yavascaoglu, I., Oral, B., Goral, G. and Oktay, B. 2006. Cytokine gene polymorphisms can alter the effect of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) immunotherapy. Cytokine 35:1-5；Decobert, M., Larue, H., Bergeron, A., Harel, F., Pfister, C., Rousseau, F., Lacombe, L. and Fradet, Y. 2006. Polymorphisms of the human NRAMP1 gene are associated with response to bacillus Calmette-Guerin immunotherapy for superficial bladder cancer. J. Urol. 175:1506-1511）。
【0006】
故に毒性及び有効性の問題は、膀胱がん免疫療法での生ＢＣＧ細胞の使用における主な妨げになっている。
【0007】
がん細胞を攻撃しその増殖を抑制するウシ型結核菌の能力は、この生物に特有のものではない。実際、サルモネラ属（Salmonella）、クロストリジウム属（Clostridia）、リステリア属（Listeria）などの多くの他の細菌は、免疫応答の誘導及び腫瘍の中心部での活発な増殖の両方によりがんを退縮させることが知られている（Mahfouz, M., Hashimoto, W., Das Gupta, T.K. and Chakrabarty, A.M. 2007. Bacterial proteins and CpG-rich extrachromosomal DNA in potential cancer therapy. Plasmid 57:4-17；Fialho, A.M. and Chakrabarty, A.M. 2010a. Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools. John Wiley & Sons, Inc., New York）。多くのウイルスでさえがん治療のために設計されている（Fialho, A.M. and Chakrabarty, A.M. 2010a. Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools. John Wiley & Sons, Inc., New York）。
【0008】
最近では、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）又は淋菌／ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）などの髄膜炎菌などの病原菌は、インビボ及びインビトロの両方で強い抗がん活性を示すアズリン又はＬａｚなどのタンパク質を産生することが報告されている（Chakrabarty, A.M. 2010. Bioengineered bugs, drugs and contentious issues in patenting. Bioengineered Bugs 1:2-8；Fialho, A.M. and Chakrabarty, A.M. 2010a. Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools. John Wiley & Sons, Inc., New York；Fialho, A.M. and Chakrabarty, A.M. 2010b. Promiscuous anticancer drugs from pathogenic bacteria: Rational versus intelligent drug design. In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools, A.M. Fialho and A.M. Chakrabarty, Eds., pages 181-198, John Wiley & Sons Inc., New York）。完全長タンパク質だけでなく、アズリンの異なる部分に由来する２８アミノ酸ペプチドＰ２８又は２６アミノ酸ペプチドＰ２６など、完全長タンパク質に由来するペプチドもがん細胞における侵入特異性（Taylor, B.N., Mehta, R.R., Yamada, T., Lekmine, F., Christov, K., Chakrabarty, A.M., Green, A., Bratescu, L., Shilkaitis, A., Beattie, C.W. and Das Gupta, T.K. 2009. Noncationic peptides obtained from azurin preferentially enter cancer cells. Cancer Res. 69:537-546）及び乳がん、黒色腫、前立腺がん、脳がん等などのがんにおける高い細胞毒性（Taylor, B.N., Mehta, R.R., Yamada, T., Lekmine, F., Christov, K., Chakrabarty, A.M., Green, A., Bratescu, L., Shilkaitis, A., Beattie, C.W. and Das Gupta, T.K. 2009. Noncationic peptides obtained from azurin preferentially enter cancer cells. Cancer Res. 69:537-546; Chaudhari, A., Mahfouz, M., Fialho, A.M., Yamada, T., Granja, A.T., Zhu, Y., Hashimoto, W., Schlarb-Ridley, B., Cho, W., Das Gupta, T.K. and Chakrabarty, A.M. 2007. Cupredoxin-cancer interrelationship: Azurin binding with EphB2, interference in EphB2 tyrosine phosphorylation, and inhibition of cancer growth. Biochemistry 46:1799-1810）を示す。がんに対する細菌手段と見なされるアズリンなどのタンパク質（Chakrabarty, A.M. 2010. Bioengineered bugs, drugs and contentious issues in patenting. Bioengineered Bugs 1:2-8；Fialho, A.M. and Chakrabarty, A.M. 2010b. Promiscuous anticancer drugs from pathogenic bacteria: Rational versus intelligent drug design. In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools, A.M. Fialho and A.M. Chakrabarty, Eds., pages 181-198, John Wiley & Sons Inc., New York）は、がん細胞の存在に反応して分泌される（Mahfouz, M., Hashimoto, W., Das Gupta, T.K. and Chakrabarty, A.M. 2007. Bacterial proteins and CpG-rich extrachromosomal DNA in potential cancer therapy. Plasmid 57:4-17）が、ナイセリア菌のタンパク質手段であるＬａｚは表面露出している（Hong, C.S., Yamada, T., Hashimoto, W., Fialho, A.M., Das Gupta, T.K. and Chakrabarty, A.M. 2006. Disrupting the entry barrier and attacking brain tumors: The role of the Neisseria H.8 epitope and the Laz protein. Cell Cycle 5:1633-1641）。ｐ２８の第Ｉ相ヒト臨床試験は、ＵＳ−ＦＤＡガイドラインに従って実施された。ｐ２８ペプチドは、毒性の欠如を示し、効く薬剤がなく６ヵ月未満の寿命であった進行期（ステージIV）がん患者１５名のうち、患者２名における部分的腫瘍退縮及び他の患者２名における完全退縮を示した。１週間に３回、４週にわたり５つの漸増用量で投与し、この後２週間中断した場合、数人の患者は腫瘍増殖の抑制を示したが、患者２名は腫瘍（もはや効く薬剤がなかった）の部分的退縮を示し、患者２名は腫瘍（もはや効く薬剤がなかった）の完全退縮を示した。腫瘍が完全に退縮した（無病になった）患者２名及びもう１名の患者（合計３名）は、１年半を超えて現在（２０１１年８月中旬）も生存している（Richards, JM., Warso, MA., Mehta, D., Christov, K., Schaeffer, CM., Yamada, T., Beattie, CW., Bressler, LR and Das Gupta, TK. 2011. A first-in-class, first-in-human phase I trial of p28, a non-HDM2-mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination in patients with metastatic refractory solid tumors. J. Clin. Oncol. 29:2511）。これは、アズリンに由来するｐ２８のような細菌ペプチドは特有の作用機序を有するため、薬剤耐性がんに対して効果がある（work）ことを示すものである。本発明者らは、新たに同定されたペプチドＭＢ３０が同様に挙動することを期待している。
【0009】
本出願人及び／又は本発明者らが知る限り、このような細菌により産生されるタンパク質／ペプチド手段を探し求める努力はなされてこなかった。しかし、可能性のある抗がん剤として使用されている微生物産物の能力を考慮して、本出願人／本発明者らは、病原体を含む微生物において分泌される若しくは表面結合した他のタンパク質手段、又は合成ペプチドとして設計することができ、生細菌の代わりに抗がん療法として使用するための抗がん活性を示すであろう他のタンパク質手段にたどり着くために念入りな研究を行った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Murray, T., Thun, M.J. and Ward E. 2008. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 58:71-96
【非特許文献2】Herr, H.W. and Morales, A. 2008. History of bacillus Calmette-Guerin and bladder cancer: an immunotherapy success story. J. Urol. 179:53-56
【非特許文献3】Kresowik, T.P. and Griffith, T.S. 2010. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) for urothelial carcinoma of the bladder. In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools, A.M. Fialho and A.M. Chakrabarty, Eds., pages 49-70, John Wiley & Sons Inc., New York
【非特許文献4】Shintani, Y., Sawada, Y., Inagaki, T., Kohjimoto, Y., Uekado, Y. and Shinka, T. 2007. Intravesical instillation therapy with bacillus Calmette-Guerin for superficial bladder cancer: Study of the mechanism of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Intl. J. Urol. 14:140-146
【非特許文献5】Bisiaux, A., Thiounn, N., Timsit, M.O., Eladaui, A., Chang, H.H. et al. 2009. Molecular analyte profiling of the early events and tissue conditioning following intravesical bacillus Calmette_Guerin therapy in patients with superficial bladder cancer. J. Urol. 181:1571-1580
【非特許文献6】Ludwig, A.T., Moore, J.M., Luo, Y., Chen, X., Saltsgaver, N.A., O’Donnell, M.A. and Griffith, T.S. 2004. Tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand: A novel mechanism for Bacillus Calmette-Guerin-induced antitumor activity. Cancer Res. 64:3386-3390
【非特許文献7】Bohle, A., Jocham, D. and Bock, P.R. 2003. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: A formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169:90-95
【非特許文献8】Sylvester, R.J., van der Meijden, A.P., Oosterlinck, W., Hoeltl, W. and Bono, A.V. 2003. The side effects of Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of Ta T1 bladder cancer do not predict its efficacy: Results from a European Organisation for Research and Treatment of Cancer Genito-Urinary Group Phase III trial. Eur. Urol. 44:423-428
【非特許文献9】Basturk, B., Yavascaoglu, I., Oral, B., Goral, G. and Oktay, B. 2006. Cytokine gene polymorphisms can alter the effect of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) immunotherapy. Cytokine 35:1-5
【非特許文献10】Decobert, M., Larue, H., Bergeron, A., Harel, F., Pfister, C., Rousseau, F., Lacombe, L. and Fradet, Y. 2006. Polymorphisms of the human NRAMP1 gene are associated with response to bacillus Calmette-Guerin immunotherapy for superficial bladder cancer. J. Urol. 175:1506-1511
【非特許文献11】Mahfouz, M., Hashimoto, W., Das Gupta, T.K. and Chakrabarty, A.M. 2007. Bacterial proteins and CpG-rich extrachromosomal DNA in potential cancer therapy. Plasmid 57:4-17
【非特許文献12】Fialho, A.M. and Chakrabarty, A.M. 2010a. Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools. John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献13】Chakrabarty, A.M. 2010. Bioengineered bugs, drugs and contentious issues in patenting. Bioengineered Bugs 1:2-8
【非特許文献14】Fialho, A.M. and Chakrabarty, A.M. 2010b. Promiscuous anticancer drugs from pathogenic bacteria: Rational versus intelligent drug design. In Emerging Cancer Therapy: Microbial Approaches and Biotechnological Tools, A.M. Fialho and A.M. Chakrabarty, Eds., pages 181-198, John Wiley & Sons Inc., New York
【非特許文献15】Taylor, B.N., Mehta, R.R., Yamada, T., Lekmine, F., Christov, K., Chakrabarty, A.M., Green, A., Bratescu, L., Shilkaitis, A., Beattie, C.W. and Das Gupta, T.K. 2009. Noncationic peptides obtained from azurin preferentially enter cancer cells. Cancer Res. 69:537-546
【非特許文献16】Chaudhari, A., Mahfouz, M., Fialho, A.M., Yamada, T., Granja, A.T., Zhu, Y., Hashimoto, W., Schlarb-Ridley, B., Cho, W., Das Gupta, T.K. and Chakrabarty, A.M. 2007. Cupredoxin-cancer interrelationship: Azurin binding with EphB2, interference in EphB2 tyrosine phosphorylation, and inhibition of cancer growth. Biochemistry 46:1799-1810
【非特許文献17】Hong, C.S., Yamada, T., Hashimoto, W., Fialho, A.M., Das Gupta, T.K. and Chakrabarty, A.M. 2006. Disrupting the entry barrier and attacking brain tumors: The role of the Neisseria H.8 epitope and the Laz protein. Cell Cycle 5:1633-1641
【非特許文献18】Richards, JM., Warso, MA., Mehta, D., Christov, K., Schaeffer, CM., Yamada, T., Beattie, CW., Bressler, LR and Das Gupta, TK. 2011. A first-in-class, first-in-human phase I trial of p28, a non-HDM2-mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination in patients with metastatic refractory solid tumors. J. Clin. Oncol. 29:2511
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
主な目的は、先行技術の限界を取り除く抗がん剤医薬組成物及びこの適用を提供することである。
【0012】
他の目的は、抗がん剤、特に微生物起源の広域スペクトル抗がん剤、より特定すれば、病原性及び非病原性の両方の細菌、ウイルス並びに／若しくは寄生虫を含むがこれらに限定されない微生物により分泌されるタンパク質、又は該微生物における表面結合タンパク質を提供することである。
【0013】
さらに別の目的は、細菌及び寄生虫から単離された精製タンパク質、詳細には、抗がん剤として有用なウシ型結核菌ＢＣＧ、及びトキソプラズマから単離されたタンパク質を提供することである。
【0014】
さらに他の目的は、抗がん剤として有用な、このようなタンパク質に由来するペプチド、合成的に調製されたペプチド、及びペグ化、アセチル化、リン酸化等により修飾されたタンパク質又はペプチドを提供することである。
【0015】
さらに別の目的は、向上した有効性及び減少した毒性を有する該タンパク質又はこのさまざまな切断誘導体を含む抗がん剤も提供することである。
【0016】
さらに他の目的は、患者の血流における半減期が延長され、免疫原性（immunogenecity）が減少した抗がん剤としての精製タンパク質及びペプチドを提供することである。
【0017】
本発明の他の目的はまた、哺乳動物のがんを治療するための治療剤としての組成物、医薬組成物、及びこの適用方法も開示する。
【0018】
医薬組成物は、単独での又は組み合わせた活性成分、すなわち、ペグ化、アセチル化、リン酸化形態を含むタンパク質、ペプチドと、生理学的及び薬学的に許容されるアジュバント又は賦形剤とを含む。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明は、配列番号１及び／若しくは配列番号２を有する微生物起源のタンパク質又はそのバリアントである、活性が増大し毒性が減少した抗がん剤に関する。
【0020】
配列番号１の抗がん剤は、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、及び／又はウシ型結核菌ＢＣＧの分泌タンパク質であってよく、ＭＰＴ６３と呼ばれ得る。
【0021】
配列番号２の抗がん剤は、寄生虫トキソプラズマ由来の表面タンパク質であってよく、及びＳＡＧ１と呼ばれ得る。
【0022】
配列番号１のバリアントは、配列番号３のＭＢ３０などのペプチドであり、かつ抗がん活性に影響を与えることなく、前記アミノ酸配列において１０〜５０％の変異を有する他の領域由来の他のペプチドである。
【0023】
配列番号２のバリアントは、配列番号４のＴＧ２０及び配列番号５のＴＧ２３などのペプチドであり、かつ抗がん活性に影響を与えることなく、前記アミノ酸配列において１０〜５０％の変異を有する他の領域由来の他のペプチドである。
【0024】
本発明の抗がん剤は、黒色腫、白血病、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、腎臓がん及び脳がんからなる群に対して抗がん活性を示す。
【0025】
本発明はまた、本明細書に前に記載されたような抗がん剤を含む医薬組成物にも関する。
【0026】
該医薬組成物は、アジュバント（複数可）をさらに含んでもよい。
【0027】
抗がん剤は、ペグ化、アセチル化、リン酸化により修飾されてもよく、又は合成的に調製されてもよい。このようになされた修飾は、対象の血流における活性成分の半減期を延長させ、及び／又は免疫原性を減少させる。
【0028】
該医薬組成物は、黒色腫、白血病、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、膀胱がん、前立腺がん、肝臓がん、腎臓がん及び脳がんの治療的及び／又は予防的処置のための、アジュバント又は賦形剤の存在下又は非存在下での静脈内（ｉｖ，intravenous）、筋肉内、経口、皮下又は局所適用に有用であり得る。
【0029】
本出願人は、分泌タンパク質ＭＰＴ６３及びこれに由来するＭＢ３０と呼ばれるペプチドが、抗がん活性を有し、哺乳動物においてがんを治療するのに使用することができることを発見した。同様に、本出願人らは、ＳＡＧ１と呼ばれる寄生虫トキソプラズマ由来の表面タンパク質、並びにこれに由来する２つのペプチドＴＧ２０及びＴＧ２３の抗がん活性も発見した。このようなタンパク質及びペプチドは、さまざまなヒトがんを治療するための優れた候補薬剤であることが証明された。本発明は故に、単離及び精製されたタンパク質又は合成ペプチドを含む抗がん剤及び医薬組成物としての微生物産物、並びにがんの治療にこれらを使用する方法を提供する。現在最も利用されている抗がん療法は、著しい毒性を有する及び／又は耐性を生じる傾向があることから、高活性及び低毒性を有する新たな抗がん生理活性ペプチドを開発することが極めて重要である。
【0030】
長期間にわたり研究を行っている本発明者らは、ヒト病原体ヒト型結核菌及びウシ株ウシ型結核菌の両方により産生される、これまでは未知の機能のマイコバクテリウム特異的分泌タンパク質、ＭＰＴ６３、並びにこれに由来するＭＢ３０と呼ばれるペプチドが、膀胱がん及び他のがん治療において効用を示すことを示すことができた。
【0031】
ＭＰＴ６３は、２〜３週間の培養後に分泌され、より長期の培養により減少する小さな（１６ｋＤａ）タンパク質である。このタンパク質は、免疫原性特性を有することが示されており、病原性に関与している。ＭＰＴ６３のホモログは、マイコバクテリウム・スメグマチス（M.smegmatis）、ウシ型結核菌及びマイコバクテリウム・アビウム（M.avium）のようなマイコバクテリア種で見出されたのみであることから、該タンパク質はマイコバクテリウムに特異的である。ＭＰＴ６３の偽遺伝子は、マイコバクテリウム・ラプレ（M.lapre）ゲノム内で見出されたが、タンパク質に翻訳されるとは考えられない。ＭＰＴ６３をコードするＤＮＡ配列の分析は、１５９個のアミノ酸（ａａ，amino acid）のタンパク質をコードするＯＲＦを明らかにした。ＯＲＦは、１３０個のａａからなる成熟タンパク質とこれに先行する２９個のａａからなるシグナルペプチドからなる。ＭＰＴ６３に関する機能情報をもたらすことを期待して、ＭＰＴ６３のＸ線結晶構造が、１．５オングストロームの解像度で測定された。ＭＰＴ６３の構造は、免疫グロブリン様フォールドに類似した２つの逆平行βシートからなるβサンドイッチ、及びさらなる小さな逆平行βシートである。免疫グロブリン構造は別として、ＭＰＴ６３は、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）βアダプチン、ウシアレスチン及び仮性結核菌インベイシンなどの細胞表面結合タンパク質と多少の構造的相同性を有する。ＭＰＴ６３はまた、真核生物のフィブロネクチン結合タンパク質、主要組織適合性ドメイン及びＴ細胞受容体とも構造的類似性を有する。ＭＰＴ６３の機能は、これまで知られておらず、この構造的特徴により予測することができなかった。その理由は、ＭＰＴ６３は極めて一般的な免疫グロブリン様折り畳みを有する（Protein Data Bankではこの構造は約２４％の構造に生じる）ためである。ＭＰＴ６３が類似するβサンドイッチ折り畳みは、多様な機能を有する多くのタンパク質の中心にある。
【0032】
興味深いことに、本発明者は、病原性細菌及びウイルスががんを退縮させることが示されただけでなく、少数の寄生虫もこの過程に関与していることも発見した。例えば、寄生虫である腸内蠕虫、及びヘリコバクター・フェリス（Helicobacter felis）によるマウスにおける同時感染は、マウスにおける前悪性病変である、胃萎縮を軽減することができる。蠕虫先行感染は、ヘリコバクター胃炎を減少させるが、ヘリコバクター・フェリスコロニー形成は減少させないことが示された。これは、恐らくＴｈ１からＴｈ２へ応答のバランスが移行することによるものである。しかし、緑膿菌によるアズリン又はウシ型結核菌によるＭＰＴ６３の分泌と同様に、蠕虫による抗がん剤（複数可）の産生は除外することができない。
【0033】
寄生虫による腫瘍退縮の興味深いケースは、トキソプラズマ症の原因病原体である偏性細胞内寄生虫、トキソプラズマによる、マウスにおけるＢ１６黒色腫細胞の退縮である。トキソプラズマ感染の非存在下では、マウスにおけるＢ１６黒色腫細胞による曝露は腫瘍形成をもたらした。しかし、トキソプラズマ感染マウスでは、Ｂ１６細胞は皮下腫瘍を形成しなかった。トキソプラズマ感染マウスにおける免疫系活性化が、Ｂ１６黒色腫細胞が腫瘍を形成しないことに関与しているかどうかを判定するため、ｉＮＯＳ又はパーフォリンなどの主な免疫機能を欠如し、リンパ球の細胞溶解機能が重度に低下したさまざまな突然変異マウスが使用された。これらの研究者らは、細胞傷害性Ｔリンパ球が非存在であり、ＮＫ細胞が細胞傷害性を持たないscid-beigeマウスも使用した。リンパ球の細胞溶解機能が重度に損なわれ、免疫機能が大きく低下したscid-beige及びパーフォリンノックアウトマウスにおいてさえ、トキソプラズマの抗がん活性は歴然であった。これは、トキソプラズマにより産生された活性な抗がん剤の存在を示唆している。血管形成を用いるさらなる実験は、トキソプラズマ感染マウスのマトリゲル（Matrigel）中のヘモグロビンレベルは、トキソプラズマ感染がない対照マウスより５０〜１００倍低く、病理組織学的に観察される脈管（vascular channel）がほとんどないことを示した。これは、トキソプラズマ感染は血管新生の系統的な抑制をもたらすが、抗血管新生剤（複数可）の性質又は起源は判定できないことを示唆した。循環抗血管新生因子は可溶性であり、細胞結合性ではなかったが、このような因子が、マウス細胞又はトキソプラズマにより産生されたかどうかは判定できないという幾つかの証拠があった。
【0034】
本発明者は、トキソプラズマの抗がん活性が、少なくとも一部において、ＳＡＧ１と呼ばれる表面抗原の存在に起因し得ることも示した。ＳＡＧ１は、宿主細胞付着に関与する、トキソプラズマでより顕著な表面タンパク質の１つであり、トキソプラズマの主要な病原性因子と考えられている。ＳＡＧ１は、トキソプラズマ株、特にタキゾイトにおいて高度に保存された３０ｋＤａの免疫優性表面抗原糖タンパク質（Ｐ３０としても知られている）である。単量体ＳＡＧ１は、２つのドメイン、Ｎ末端１３０アミノ酸ドメインＤ１及びＣ末端１２０アミノ酸ドメインＤ２を有する。注目すべきことに、ＳＡＧ１は、アズリンとの構造的類似性を示し、アズリンと相互作用するが、アズリン様タンパク質Ｌａｚとより一層強く相互作用する。ＳＡＧ１は、Ｌａｚに類似して表面結合性であり、抗がん剤アズリン及びＬａｚとの構造的類似性を示すため、Ｌａｚに類似しているならば、ＳＡＧ１が一部のヒトがんに対する抗がん活性を有し得るかどうかを判定することは、本出願人にとって非常に興味があった。ヒト患者において該タンパク質自体の起こり得る毒性を排除するため、２つのペプチドＴＧ２０及びＴＧ２３が、アズリン（及びアズリン様タンパク質Ｌａｚ）とＳＡＧ１の間の構造的類似性を利用して設計された。これらの２つのペプチドは、既知の抗がん活性を有するアズリンペプチドＰ２８及びＰ２６に多少類似した、ＳＡＧ１の潜在抗がん活性を有していると考えられた。
【0035】
さらに、ＳＡＧ１の異なる部分に由来するＴＧ２０及びＴＧ２３は、膀胱及び結腸がんに対し抗がん活性を示した。比較する目的で、アッセイにアズリン及びシスプラチンも含めた。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】膀胱がん細胞株ＨＴＢ−９に対するさまざまな濃度のペプチドの細胞毒性効果を示す図である。該細胞毒性効果は、対照であるシスプラチン及びアズリンに匹敵した。１×１０４個のがん細胞が播種され、２４時間後、培地は、さまざまな濃度の抗がんペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３、及びＭＢ３０）、陽性対照としてのアズリン及びシスプラチンと交換された。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づきＭＴＴアッセイを用いて推定され、ホルマザンは、２４時間、４８時間及び７２時間後に５７０ｎｍの吸光度により分光測定で検出された［バー−平均±Ｓ．Ｅ．］。
【図2】膀胱がん細胞株ＵＭ−ＵＣ−３に対するさまざまな濃度のペプチドの細胞毒性効果を示す図である。該細胞毒性効果は、対照であるシスプラチン及びアズリンに匹敵した。１×１０４個のがん細胞が播種され、２４時間後、培地は、さまざまな濃度の抗がんペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３、及びＭＢ３０）、陽性対照としてのアズリン及びシスプラチンと交換された。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づきＭＴＴアッセイを用いて推定され、ホルマザンは、２４時間、４８時間及び７２時間後に５７０ｎｍの吸光度により分光測定で検出された［バー−平均＋Ｓ．Ｅ．］。
【図3】結腸直腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５に対するさまざまな濃度のペプチドの細胞毒性効果を示す図である。該細胞毒性効果は、対照であるシスプラチン及びアズリンに匹敵した。１×１０４個のがん細胞が播種され、２４時間後、培地は、さまざまな濃度の抗がんペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３及びＭＢ３０）、陽性対照としてのアズリン及びシスプラチンと交換された。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づきＭＴＴアッセイを用いて推定され、ホルマザンは、２４時間、４８時間及び７２時間後に５７０ｎｍの吸光度により分光測定で検出された［バー−平均＋Ｓ．Ｅ．］。
【図4】結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ １１６に対するさまざまな濃度のペプチドの細胞毒性効果を示す図である。該細胞毒性効果は、対照であるシスプラチン及びアズリンに匹敵した。１×１０４個のがん細胞が播種され、２４時間後、培地は、さまざまな濃度の抗がんペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３及びＭＢ３０）、陽性対照としてのアズリン及びシスプラチンと交換された。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づきＭＴＴアッセイを用いて推定され、ホルマザンは、２４時間、４８時間及び７２時間後に５７０ｎｍの吸光度により分光測定で検出された［バー−平均＋Ｓ．Ｅ．］。
【図5】子宮頸がん細胞株ＳｉＨａに対するさまざまな濃度のペプチドの細胞毒性効果を示す図である。該細胞毒性効果は、対照であるシスプラチン及びアズリンに匹敵した。１×１０４個のがん細胞が播種され、２４時間後、培地は、さまざまな濃度の抗がんペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３及びＭＢ３０）、陽性対照としてのアズリン及びシスプラチンと交換された。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づきＭＴＴアッセイを用いて推定され、ホルマザンは、２４時間、４８時間及び７２時間後に５７０ｎｍの吸光度により分光測定で検出された［バー−平均±Ｓ．Ｅ．］。
【図6】子宮頸がん細胞株ＣａＳｋｉに対するさまざまな濃度のペプチドの細胞毒性効果を示す図である。該細胞毒性効果は、対照であるシスプラチン及びアズリンに匹敵した。１×１０４個のがん細胞が播種され、２４時間後、培地は、さまざまな濃度の抗がんペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３及びＭＢ３０）、陽性対照としてのアズリン及びシスプラチンと交換された。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づきＭＴＴアッセイを用いて推定され、ホルマザンは、２４時間、４８時間及び７２時間後に５７０ｎｍの吸光度により分光測定で検出された［バー−平均±Ｓ．Ｅ．］。
【図7】ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７、肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２及び乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対するＭＢ３０ペプチド及びＭＰＴ−６３タンパク質の細胞毒性効果を示す図である。１×１０４個のがん細胞が播種され、２４時間後、これは、さまざまな濃度のＭＢ３０ペプチド若しくはＭＰＴ６３タンパク質、又は陽性対照としてのシスプラチンで別々に処理された。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づきＭＴＴアッセイを用いて推定され、ホルマザンは、２４時間後に５７０ｎｍで吸光度を測定して分光測定で検出され、細胞毒性％が判定された。
【発明を実施するための形態】
【0037】
材料及び方法：ウシ型結核菌由来のＭＰＴ６３タンパク質（配列番号１）の完全アミノ酸配列を以下に示す。次のＭＰＴ６３配列において最初の２９個のアミノ酸（下線）は、分泌シグナルペプチド（リーダー）配列を形成し、ＭＢ３０ペプチド（成熟タンパク質のアミノ酸４４〜７３）配列が太字で強調されている。
【0038】
ＭＰＴ６３タンパク質に由来する３０個のアミノ酸のペプチド配列（ＭＢ３０ペプチドと呼ばれる）を以下に示す。ＭＢ３０ペプチド配列（配列番号３）：
GQVWEATATVNAIRGSVTPAVSQFNARTAD
【0039】
トキソプラズマ由来のＳＡＧ１タンパク質（配列番号２）の完全アミノ酸配列を以下に示す。MFPKAVRRAVTAGVFAAPTLMSFLRCGVMASDPPLVANQVVTCPDKKSTAAVILTPTENHFTLKCPKTALTEPPTLAYSPNRQICSAGTTSSCTSKAVTLSSLIPEAEDSWWTGDSASLDTAGIKLTVPIEKFPVTTQTFVVGCIKGDDAQSCMVTVTVQARASSVVNNVARCSYGANSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKDILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGCTGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGPAKSAAGTASHVSIFAMVIGLIGSFAACVA
【0040】
トキソプラズマのＳＡＧ１タンパク質に由来する２０個のアミノ酸のペプチド配列（ＴＧ２０と呼ばれる）を以下に示す。ＴＧ２０ペプチド配列（配列番号４）：NHFTLKCPKTALTEPPTLAY
【0041】
ＳＡＧ１タンパク質トキソプラズマに由来する２３個のアミノ酸のペプチド配列（ＴＧ２３と呼ばれる）を以下に示す。ＴＧ２３ペプチド配列（配列番号５）：TAGIKLTVPIEKFPVTTQTFVVG
【0042】
本発明を例示するため、生理活性ペプチドの抗がん活性を詳述する実験を以下に記載する。次の例は、このような活性を記載することを意図しており、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。タンパク質の単離及び精製は、以前に文献に記載されているが、ペプチドは全て営利会社により化学的に合成された。本発明者らは、ＭＰＴ−６３タンパク質をクローン化及び発現させ、この抗がん活性をさまざまながん細胞株において評価した。
【0043】
ＭＰＴ６３タンパク質のクローニング及び発現：ＭＰＴ６３遺伝子を、フォワードプライマー上にNdeI制限部位及びリバースプライマー上にHindIII制限部位を有する次のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
フォワードプライマー：5’-TCGATCCATATGGCCTATCCCATCACCGGA-3’、及び
リバースプライマー：5’-TCGATCAAGCTTCTACGGCTCCCAAATCAG-3’。
【0044】
NdeI及びHindIII ＰＣＲ産物は、pUC18クローニングベクターにライゲーションする。ＭＰＴ６３遺伝子をpUC18から切除し、予め制限したpET28a発現ベクターにライゲーションし、大腸菌BL21de3に形質転換する。ＭＰＴ６３精製のため、BL21de3の単一コロニーをＬＢブロスに播種し、ＯＤが０．５に達するまで３７℃で播種（inoculate）した。培養物は、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３７℃で一晩誘導した。
【0045】
一晩のインキュベーション期間後、培養物を遠心分離し、細胞ペレットを氷上で１５分間インキュベートした。細胞を、ベンゾナーゼ及びリゾチームを含む１０ｍｌ非変性溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートし、均一な懸濁を確保するために断続的に混合した。細胞ライセート（lysate）を３０分間、１４０００ｇ／４℃で遠心分離して細胞細片（debris）をペレット化した。細胞溶解物上清を、Qiagen社により供給されたＮｉ−ＮＴＡカラムに添加し、素通り画分を回収した。カラムを洗浄緩衝液で２回洗浄した。結合した６×Ｈｉｓタグ化タンパク質を、非変性溶出緩衝液である１ｍｌアリコートで２回溶出した。両方の溶出画分は、別々の管に回収した。工程の各ステップで、試料をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。この精製タンパク質は、さまざまな細胞株に対する細胞毒性効果を判定するために、１μＭ、５μＭ及び１０μＭの濃度でさらなる実験に使用した。
【0046】
細胞培養：膀胱がん細胞株HTB-9［悪性度II膀胱がん］、CRL-1749（UM-UC-3）［高悪性度膀胱がん］、並びに結腸直腸がん細胞株CCL-222（COLO 205）［ＤｕｋｅｓＤ型結腸直腸腺がん］、CCL-247（HCT-116）、SiHa、CaSki、MDA-MB-231、U87及びHepG2は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，American Type Culture Collection）から調達した。全ての細胞株は、以前に記載されているように（Garg, M., Kanojia, D., Seth, A., Kumar, R., Gupta, A., Surolia, A., and Suri, A. 2009. Heat-Shock Protein 70-2 (HSP70-2) Expression in Bladder Urothelial Carcinoma is Associated with Tumor Progression and Promotes Migration and Invasion. Eur J Cancer. 46:207-215；Kanojia, D., Garg, M., Gupta, S., Gupta, A., and Suri, A. 2010. Sperm-Associated Antigen 9 Is a Novel Biomarker for Colorectal Cancer and Is Involved in Tumor Growth and Tumorigenicity. Am J Pathol. 178:1009-1020 ）、標準的な条件下である、５％ＣＯ２、加湿した３７℃インキュベーター内で増殖させた。
【0047】
ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−９：６８歳男性患者の膀胱がん（悪性度II）から確立された、上皮様特性を有するヒト細胞株。この細胞株は、本来は腫瘍性である。これらの細胞は、機能的網膜芽細胞腫タンパク質Ｒｂ（retinoblastoma protein）を欠如する。HTB-9細胞は、ＩＬ２、ＩＬ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＭ−ＣＳＦを含むさまざまな増殖因子に反応して増殖する。Goselinkらは、HTB-9細胞の無血清馴化培地（conditioned medium）が、半固体培地における造血前駆細胞（ＨＰＣ，hematopoietic progenitor cell）の増殖を支持する血清に取って代わり得ることを示した（Goselink, H.M., van Damme, J., Hiemstra, P.S., Wuyts, A., Stolk, J., Fibbe, W.E., Willemze, R., Falkenburg, J.H. 1996. Colony growth of human hematopoietic progenitor cells in the absence of serum is supported by a proteinase inhibitor identified as antileukoproteinase. J Exp Med. 184:1305-1312）。
【0048】
ＡＴＣＣ：ＵＭ−ＵＣ−３：男性患者の高悪性度浸潤性膀胱がんから確立された、上皮様特性を有するヒト細胞株。これは、高３倍体ヒト細胞株であり、ＩＦＮ非反応性である。この細胞株は、本来は腫瘍性である。
【0049】
ＡＴＣＣ ＣＯＬＯ ２０５：７０歳男性患者のＤｕｋｅｓ Ｄ型結腸直腸腺がんに由来するヒト細胞株。該細胞はＣＳＡＰ陰性である。該細胞は、免疫ペルオキシダーゼ染色においてケラチン陽性である。ＣＯＬＯ ２０５細胞は、ＧＡ７３３−２腫瘍関連抗原に関連した３６０００ダルトン（Ｄａ）の細胞表面糖タンパク質を発現する。
【0050】
ＡＴＣＣ ＨＣＴ １１６：成人男性患者由来の結腸直腸がんから確立された、上皮様特性を有するヒト細胞株。該細胞は、免疫ペルオキシダーゼ染色においてケラチン陽性である。HCT 116細胞は、形質転換増殖因子（ＴＧＦ，transforming growth factor）ベータ１（ＴＧＦベータ１）及びベータ２（ＴＧＦベータ２）発現陽性である。この株は、ｒａｓプロトオンコジーンのコドン１３に変異を有し、このコドンにおける変異のＰＣＲアッセイのための陽性対照として使用することができる。
【0051】
ＡＴＣＣ：ＳｉＨａ：日本人患者から手術後に得られた一次組織試料の断片から確立されたヒト細胞株。電子顕微鏡観察は、細胞間結合における典型的なデスモソーム及び細胞質中の多数のトノフィラメントの存在を明らかにした。該株は、組み込まれたヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ，human papillomavirus）１６型ゲノム（ＨＰＶ−１６、１細胞あたり１〜２コピー）を含有することが報告されている。
【0052】
ＡＴＣＣ：ＣａＳｋｉ：４０歳白人女性患者に由来するヒト細胞株。該株は、小腸間膜における転移由来の細胞から確立された。該細胞は、組み込まれたヒト乳頭腫ウイルス１６型ゲノム（ＨＰＶ−１６、１細胞あたり約６００コピー）及びＨＰＶ−１８に関連した配列を含有することが報告されている。
【0053】
ＡＴＣＣ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：これは、５１歳白人女性患者由来の乳腺（乳房）腺がんから確立された、上皮様特性を有するヒト細胞株である。該細胞は、ＷＮＴ７Ｂがん遺伝子を発現する。
【0054】
ＡＴＣＣ：Ｕ８７：これは、正式にはＵ−８７ ＭＧとして知られているヒト神経膠芽腫細胞株である。これは上皮形態を有し、４４歳白人女性患者から得られた。
【0055】
ＡＴＣＣ：ＨｅｐＧ２：高分化肝細胞がんを有する１５歳白人米国人男性の肝臓組織に由来するヒト細胞株。これらの細胞は形態が上皮性であり、ヌードマウスにおいて非腫瘍形成性である。該細胞は、さまざまな主な血漿タンパク質；例えば、アルブミン、トランスフェリン、及び急性期タンパク質フィブリノーゲン、アルファ２マクログロブリン、アルファ１アンチトリプシン、トランスフェリン及びプラスミノーゲンを分泌する。
【0056】
細胞毒性アッセイ：この研究で実施した細胞毒性アッセイは、がん細胞株における表１の生理活性ペプチドの細胞傷害能を任意の濃度で評価するように設計した。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイを、種々の抗がんペプチドの細胞毒性の測定のために行った。水溶性テトラゾリウム塩、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］は、インタクトなミトコンドリア脱水素酵素により不溶性ホルマザンへ代謝される。ホルマザンを次いで、２−プロパノール＋４０ｍＭ ＨＣｌを添加し４時間インキュベーションして可溶化する。１×１０４個の細胞を播種し、２４時間後、培地を、さまざまな濃度の抗がんペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３及びＭＢ３０）、陽性対照としてのアズリン（抗がん活性を有することが知られている（Chakrabarty, A.M. 2010. Bioengineered bugs, drugs and contentious issues in patenting. Bioengineered Bugs 1:2-8））及び同様に既知の抗がん化合物であるシスプラチン（Sedletska, Y., Giraud-Panis, M.J. and Malinge, J.M. 2005. Cisplatin is a DNA-damaging antitumour compound triggering multifactorial biochemical responses in cancer cells: Importance of apoptotic pathways. Curr. Med. Chem. Anticancer Agents 5: 251-265）と交換した［表１］。細胞の生存能は、形成されたホルマザンに基づき推定し、ホルマザンは、２４時間、４８時間及び７２時間後に５７０ｎｍの吸光度により分光測定で検出した。２４時間、４８時間及び７２時間などの時点ごとに、１×１０４個の細胞を、ペプチドの任意の処理のために３つ組（triplicate）で各プレートにペプチドなしで播種した。これは、ペプチド処理ごとの細胞毒性のパーセントを計算するために、細胞毒性レベルの対照として使用した。完全長タンパク質ＭＰＴ−６３の細胞毒性もこのアッセイを用いて判定し、タンパク質がペプチドの代わりに使用された。実験は全て３つ組で行われ、３回繰り返された。
【0057】
【表1】
【0058】
結果：この研究におけるさまざまなペプチドでの処理は、ペプチドの抗がん特性を明らかにした。インビトロにおける細胞毒性結果の分析は、細胞増殖の減少を明確に明らかにした。実験は全て３つ組で行われ、３回繰り返された。
【0059】
ＭＴＴアッセイは、膀胱がん細胞ＨＴＢ−９において、他の陽性対照であるアズリン及びシスプラチンと共に、１．０及び１０．０マイクロモルの濃度で使用した場合、３つのペプチド（ＴＧ２０、ＴＧ２３、及びＭＢ３０、表１）全ての細胞毒性活性を示した。３つのペプチドは全て、４８及び７２時間後それぞれで、アズリン及びシスプラチンに匹敵する最大４０％及び６０％の細胞毒性を示した（図１）。このような結果は、１．０マイクロモルのように低いペプチド濃度で十分であり、より高い濃度は、実質的に細胞毒性を増加させないことを示した。また、細胞毒性レベルは、２４時間後では低いものの、７２時間までインキュベーションの時間が増えるにしたがって増加した（図１）。
【0060】
種々の膀胱がん細胞株における全てのこれらのペプチドの細胞毒性を評価するため、膀胱がん細胞株ＵＭ−ＵＣ−３を、１．０及び１０μＭ濃度のペプチドと共にインキュベートし、細胞毒性（cytoxicity）を２４、４８及び７２時間後にモニターした。２４時間後に、ＴＧ２３及びＭＢ３０ペプチドは、他のペプチドより高い細胞毒性レベル（アズリンに匹敵するがシスプラチンより低い）を示した。７２時間まで曝露が長引くと、３つのペプチドは全て、膀胱がん細胞株ＵＭ−ＵＣ−３において約４５％の細胞毒性を示した（図２）。
【0061】
黒色腫、前立腺又は白血病などのがんの退縮を可能にするウシ型結核菌ＢＣＧの生細胞の能力は、過去に報告されているが、このような効果は一貫していなかった。ヒト患者における一貫した有効性は、膀胱がんに対してのみであった。ＭＢ３０ペプチド又は他のペプチドが、他のがんに対して細胞毒性を示すかどうかを評価するため、３つのペプチド全ての細胞毒性も、ＣＯＬＯ ２０５と呼ばれる結腸がん細胞株において７２時間までさまざまな濃度で評価した。３つのペプチド全ては、４８時間のインキュベーション中、約１０〜２０％のさまざまな細胞毒性を示した（図３）。
【0062】
３つのペプチド全ての抗がん活性も、結腸がん細胞株ＨＣＴ １１６及び子宮頸がん細胞株（ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉ）において調べた。ペプチドＭＢ３０は、２４時間までインキュベートした場合、両方の濃度で結腸及び子宮頸がん細胞の約４０％（アズリンより高いがシスプラチンより若干低い）を死滅させた。他のペプチドＴＧ２０及びＴＧ２３は、より低い細胞毒性を示した（図４、５及び６）。このようなデータは、ＭＢ３０並びにＴＧ２０及びＴＧ２３のようなペプチドが、膀胱がん細胞及び他のがん細胞において著しい細胞毒性を示すことを明らかに示している。完全長ＭＰＴ−６３タンパク質を精製し、この細胞毒性をＵ８７、ＨｅｐＧ２及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株においてＭＢ３０ペプチドと比較した。ＭＰＴ−６３タンパク質も、テストした３つの細胞系（脳がん、肝臓がん及び乳がん）全てにおいて細胞毒性を示した（図７）。しかし、ＭＢ３０ペプチドは、２４時間後に、３つの細胞系（脳がん、肝臓がん及び乳がん）全てにおいて、完全長タンパク質ＭＰＴ−６３と比べてより良好な細胞毒性を示した（図７）。これは、完全長タンパク質及びＭＢ３０ペプチドが、さまざまながん細胞系において抗がん活性を示すことを示している。
【0063】
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【0064】
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【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]