特許 5873893 アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5873893

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/761 20150101AFI20160216BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160216BHJP

   C07K 14/075 20060101ALN20160216BHJP

   C12N 7/00 20060101ALN20160216BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160216BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/761ZNA

   A61K48/00

   A61K45/00

   A61P35/00

   !C07K14/075

   !C12N7/00

   !C12N15/00 A

【請求項の数】35

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2014-102460(P2014-102460)

(22)【出願日】2014年5月16日

(62)【分割の表示】特願2011-98212(P2011-98212)の分割

【原出願日】2004年11月15日

(65)【公開番号】特開2014-177481(P2014-177481A)

(43)【公開日】2014年9月25日

【審査請求日】2014年5月20日

(31)【優先権主張番号】10353262.5

(32)【優先日】2003年11月14日

(33)【優先権主張国】DE

(31)【優先権主張番号】102004018099.7

(32)【優先日】2004年4月14日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】501488619

【氏名又は名称】ホルム，ペル・ゾンネ

【氏名又は名称原語表記】ＨＯＬＭ，Ｐｅｒ Ｓｏｎｎｅ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(74)【代理人】

【識別番号】100078662

【弁理士】

【氏名又は名称】津国 肇

(74)【代理人】

【識別番号】100131808

【弁理士】

【氏名又は名称】柳橋 泰雄

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(74)【代理人】

【識別番号】100146031

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 明夫

(74)【代理人】

【識別番号】100122736

【弁理士】

【氏名又は名称】小國 泰弘

(74)【代理人】

【識別番号】100122747

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 洋子

(74)【代理人】

【識別番号】100132540

【弁理士】

【氏名又は名称】生川 芳徳

(74)【代理人】

【識別番号】100141357

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 音哉

(72)【発明者】

【氏名】ホルム，ペル・ゾンネ

【審査官】 加藤 文彦

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０８−５０７０７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００２／０５３７１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 HOWE J A，MOLECULAR THERAPY: THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY，２０００年１１月，V2 N5，P485-495

【文献】 HEISE C，NATURE MADICINE，米国，２０００年１０月，V6 N10，P1134-1139

【文献】 Virus Res., 33[1](1994) p.89-97

【文献】 J. Virol., 67[12] (1993) p.6922-6928

【文献】 Cell, 56[1] (1989) p.67-75

【文献】 WONG H K，JOURNAL OF VIROLOGY，米国，１９９４年 ８月，V68 N8，P4910-4920

【文献】 Cancer Res., 61[17](2001) p.6328-6330

【文献】 Clin. Cancer Res., 8[3](2002) p.718-728

【文献】 Clin. Cancer Res., 9[14](2003 Nov 1) p.5394-5401

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／７６１

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １４／０７５

Ｃ１２Ｎ ７／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍の処置のための医薬製造のための複製性アデノウイルスの使用であって、腫瘍またはその一部を形成する細胞が、核内にＹＢ−１を有し、アデノウイルスが、核内にＹＢ−１がない細胞内では複製できないが、核内にＹＢ−１を有する細胞内では複製し、アデノウイルスが、少なくとも一つのアデノウイルス遺伝子をトランス活性化する発ガン遺伝子タンパク質をコードしており、アデノウイルス遺伝子が、Ｅ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰを含む群から選ばれ、発ガン遺伝子タンパク質が、Ｅ１Ａであり、アデノウイルスが、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ ０１６及びｄｌ５２０からなる群より選ばれ、かつ、医薬が、少なくとも２つの薬学的に有効な化合物をさらに含むことを特徴とする、使用。

【請求項2】

アデノウイルスが、ＲＧＢペプチドをコードする、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

ＲＧＢペプチドが、ファイバーノブドメインのＨＩループ中に存在する、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項4】

アデノウイルスが、ｄｌ５２０及びｄｌ１１１９／１１３１からなる群より選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項5】

アデノウイルスが、ｄｌ５２０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ ０１６及びｄｌ５２０からなる群より選ばれるアデノウイルスが、さらに、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ欠損を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。

【請求項7】

Ｅ１Ａが、Ｅ１Ａ１２Ｓである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項8】

細胞が、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項9】

ウイルス発ガン遺伝子タンパク質Ｅ１Ａが、ＹＢ−１の核内局在化を誘導しないことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項10】

細胞がＲｂ陰性であり、かつ、細胞核がＹＢ−１陽性であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項11】

細胞がＲｂ陰性であり、かつ、細胞周期とは無関係に核内がＹＢ−１陽性であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項12】

腫瘍またはその一部を形成する細胞が、薬学的に有効な薬剤に対し耐性であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項13】

細胞が、膜結合輸送タンパク質であるＰ糖タンパク質の過剰発現を示すことを特徴とする、請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

薬学的に有効な薬剤が、抗腫瘍剤である、請求項１２又は１３に記載の使用。

【請求項15】

抗腫瘍剤が、細胞増殖抑制薬である、請求項１４に記載の使用。

【請求項16】

ウイルス発ガン遺伝子タンパク質が、組織および／または腫瘍特異的プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。

【請求項17】

アデノウイルスが、ＹＢ−１をコードし、ＹＢ−１が、組織および／または腫瘍特異的プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項18】

アデノウイルスが、少なくとも１つのタンパク質をコードしており、アデノウイルスのタンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ１Ｂ５５ｋDaおよびＥ３ＡＤＰタンパク質を含む群より選ばれることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項19】

核内へのＹＢ−１輸送の誘導後に、腫瘍が、核内にＹＢ−１を含むことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項20】

腫瘍又はその一部を形成する細胞が、薬学的に有効な薬剤に対する耐性を有する、請求項１〜１９のいずれか１項記載の記載の使用。

【請求項21】

耐性が、多重耐性であることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。

【請求項22】

薬学的に有効な薬剤が、抗腫瘍剤である、請求項２０又は２１に記載の使用。

【請求項23】

抗腫瘍剤が、細胞増殖抑制薬であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

アデノウイルスが、トランス遺伝子をコードする核酸を含んでいる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項25】

アデノウイルスが、トランス遺伝子の翻訳物および／または転写産物を含んでいる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項26】

トランス遺伝子が、プロドラッグ遺伝子、サイトカイン、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、金属プロテアーゼインヒビターの遺伝子、および血管新生インヒビターの遺伝子を含む群から選ばれる、請求項２４又は２５に記載の使用。

【請求項27】

トランス遺伝子が、ｓｉＲＮＡのための、アプタマーのための、アンチセンス分子のためのおよびリボザイムのための核酸を含む群より選ばれ、そしてｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子および／またはリボザイムが、標的分子を標的している、請求項２４又は２５に記載の使用。

【請求項28】

標的分子が、耐性関連因子、抗アポトーシス因子、発ガン遺伝子、血管新生因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ修復酵素、成長因子、成長因子レセプター、転写因子、金属プロテアーゼ、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含む群より選ばれる、請求項２７に記載の使用。

【請求項29】

標的分子が、マトリックス金属タンパク質キナーゼである、請求項２８に記載の使用。

【請求項30】

少なくとも２つの薬学的に有効な化合物が、それぞれ、独立して、サイトカイン、金属プロテアーゼインヒビター、血管新生インヒビター、細胞増殖抑制薬および細胞周期インヒビターを含む群より選ばれる、請求項２９に記載の使用。

【請求項31】

少なくとも２つの薬学的に有効な化合物が、細胞増殖抑制薬である、請求項３０に記載の使用。

【請求項32】

少なくとも２つの薬学的に有効な化合物の１つが、核内へのＹＢ−１の輸送を媒介する細胞増殖抑制薬である、請求項３１に記載の使用。

【請求項33】

核内へのＹＢ−１の輸送を媒介する細胞増殖抑制薬が、イリノテカンである、請求項３２に記載の使用。

【請求項34】

少なくとも２つの薬学的に有効な化合物のその他が、アデノウイルスが複製する感染される細胞の能力を増加させる、請求項３２〜３３のいずれか１項記載の使用。

【請求項35】

アデノウイルスが複製する感染される細胞の能力を増加させる細胞増殖抑制薬が、トリコスタチンＡである、請求項３４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はアデノウイルスならびにそれをコードする核酸、ならびに組換え体発ガンタンパク質の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍の治療には、現在多くの治療コンセプトが用いられている。手術に加え、化学療法および放射線治療がよく実施されている。しかしながらこれら技術全てに、無視できない副作用が伴う。複製特異的殺腫瘍ウイルスの使用が、腫瘍治療に新たなプラットホームを提供している。この方法では、腫瘍内選択的な上記ウイルスの複製が起こり、その結果ウイルスの複製、感染腫瘍細胞の溶解、および近接腫瘍細胞へのウイルスの放散が起こる。ウイルスの複製能力が腫瘍細胞に限定されることから、正常組織にはウイルスの複製は広がらず、従って溶解も起きない。

【0003】

現在、殺腫瘍を狙った複数のウイルス系が臨床試験にかけられている。かかるアデノウイルスの一例が、臨床第Ｉ相および第ＩＩ相試験で良い結果を上げているＤ１１５２０（Ｏｎｙｘ−０１５）である（Khuri, Fら、Nature Medicine 6、879〜885、2000年）。Ｏｎｙｘ−０１５は、Ｅ１Ｂ−５５kDa遺伝子を完全に欠失したアデノウイルスである。このアデノウイルスが完全にＥ１Ｂ５５kDaタンパク質を欠いていることは、ｐ５３欠失アデノウイルスベクターと一緒であれば複製すること、従って細胞を溶解することができるが（Kim, Dら、Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.17、391a、1998年）、正常細胞を損傷することはないという発見に基づいている。より具体的には、Ｅ１Ｂ−５５kDa遺伝子産物は、ｐ５３の阻害、ウイルスｍＲＮＡの輸送、および宿主細胞のタンパク質合成のスイッチングオフに関係している。ｐ５３の阻害は、ｐ５３とアデノウイルスがコードするＥ１Ｂ−５５kDaタンパク質から成る複合体、および／またはＥ１Ｂ−５５kDaとＥ４ｏｒｆ６．より成る複合体の形成を通じて起こる。ＴＰ５３がコードするｐ５３は、複合体制御メカニズムにとって開始点であり（Zambetti, G.Pら、FASEB J.7、855〜865、1993年）、ｐ５３はとりわけてもアデノウイルスのようなウイルスの細胞内複製が効率的に阻害する。ＴＰ５３は全てのヒト腫瘍の約５０％で欠失または突然変異しており、そのために化学療法または放射線治療では−望まれる−アポトーシスが起こらず、結果として腫瘍治療に成功しないことが多々ある。

【0004】

殺腫瘍アデノウイルスの別のコンセプトは、Ｅ１Ａタンパク質が特殊な欠失型として存在するか、または１もしくはそれ以上の突然変異を含み、それらがＲｂ／Ｅ２Ｆおよび／またはｐ１０７／Ｅ２Ｆおよび／またはｐ１３０／Ｅ２Ｆの結合に影響しない場合には、かかるアデノウイルスは感染細胞をＳ期に誘導せず、そして機能性のＲｂタンパク質を持たない腫瘍細胞内では複製できるという発見に基づいている。さらにＥ１Ａタンパク質はＮ末端を欠失することも、そしてＥ１Ａタンパク質のアミノ酸位置１〜７６の領域に１またはそれ以上の突然変異を含むこともでき、その結果それぞれｐ３００に対するＥ１Ａの結合を阻害し、そしてそれにより腫瘍細胞内での選択的複製を提供することができる。このようなアプローチは欧州特許第０ ９３１ ８３０号に例示されている。かかるウイルスの例としてはＡｄΔ２４、ｄ１９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７およびＣＢ０１６がある（Howe, J.A.ら、Molecular Therapy 2、485〜495、2000年; Fueyo、J.ら、Oncogene 19、2〜12、2000年; Heise, C.ら、Nature Medicine 6, 11341139、2001年; Balague, Cら、J.Virol.75、7602〜7611、2001年）。かくして、これら当分野既知の殺腫瘍に関するアデノウイルス系はＥ１Ａタンパク質内に明瞭な欠失を含んでいるが、その場合この種の欠失は、機能性Ｒｂタンパク質および非活性型Ｒｂタンパク質とＥ２Ｆとから成る複合体がそれぞれ、効率的なインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での複製を遮断すること、そしてＲｂ−欠失／突然変異細胞でのみアデノウイルスのインビボ複製を提供すること前提として作られている。これら従来技術によるアデノウイルス系は、Ｅ１Ａに基づき、初期Ｅ２プロモーター（Ｅ２初期プロモーター）およびフリーＥ２Ｆ（Dyson, N.Genes & Development、12、2245〜2262、1998年）を用いてインビボ複製を制御している。

【0005】

殺腫瘍アデノウイルス系の別の形態は、腫瘍細胞内での選択的複製を提供するウイルス発ガン遺伝子Ｅ１Ａを特異的に発現させる選択的プロモーターの使用に基づいている（Rodriguez, R.ら、Cancer Res.57、2259〜2563、1997年）。

【0006】

上記の如く、各コンセプトの基礎を成す作用様式に適った細胞背景を選択することが、アデノウイルスに関する殺腫瘍ウイルスの各種コンセプトにとって重要である。換言すれば、現在知られている各種アデノウイルス系は、明瞭な分子生物学的前提条件が揃っている場合にのみ使用することができるだろう。このことが、かかる系の使用を一部患者群に制限している。

【0007】

腫瘍疾患の治療に於ける特殊な問題は、細胞増殖抑制薬に対する腫瘍細胞の耐性に関する研究で特によく研究されている多剤耐性（英語でmultidrug resistance(MDR)）と呼ばれる耐性を患者が発症することである（Gottesman and Pastan、Annu.Rev.Biochem.62、385〜427、1993年）。この問題は、膜結合輸送タンパク質、いわゆるＡＢＣトランスポータに属するＰ−糖タンパク質の過剰発現に基づいている（Stein, U.ら、JBC 276、28562〜69、2001年、J.Wijnholds、Novartis Found Symp.243、69〜79、2002年）。Bargou, R.C.らおよびOda, Y.ら、（Bargou, R.C.ら、Nature Medicine 3、447〜450、1997年; Clin.Cancer Res.4、2273〜2277、1998年）は、ヒト転写因子ＹＢ−１の核内局在がＰ−糖タンパク質の発現活性化に関係していることを示した。別の研究は、ＹＢ−１がＵＶ照射、細胞分裂抑制薬投与（Koike, K.ら、FEBS Lett、390〜394、1997年）および高温（Stein, Uら、JBC 276、28562〜69、2001年）といった様々なストレス状態により核内に輸送されることを確認している。別の研究は、ＹＢ−１の核内局在が更に別のＡＢＣトランスポータに影響することを確認している。このＡＢＣトランスポータはＭＲＰ（英語でmultidrug resistance-relate potein：多剤耐性関連タンパク質）と呼ばれており、いわゆる非定型非Ｐ−糖タンパク質依存多剤耐性の形成に関係している（Stein、U.ら、JBC 276、28562〜69、2001年）。

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の基調をなす課題は、具体的には殺腫瘍活性薬剤を用いて生物、より具体的にはヒトおよび患者群の処置を可能にする技術的教示および、特に手段を提供することである。本発明の基調をなす別の課題は、細胞分裂抑制薬に耐性である腫瘍疾患を持つ患者、特に多剤耐性を持つ患者に殺腫瘍を起こすのに好適である手段を提供することである。

【0009】

本発明によれば、第１の局面の課題は薬物製造に適したウイルス、好ましくはアデノウイルスを使用することで解決されるが、この時ウイルスは核内にＹＢ−１を持たない細胞内では複製ができず、そしてウイルスは発ガン遺伝子または発ガン遺伝子産物、好ましくは発ガン遺伝子タンパク質をコードしており、それはＹＢ−１核陽性細胞でウイルス遺伝子の少なくとも１つ、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、そして遺伝子はＥ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰを含む群より選ばれる。

【0010】

第２の局面では、課題は核内にＹＢ−１を有する細胞での複製についてウイルス、好ましくはアデノウイルスを使用することで解決されるが、この時ウイルスは核内にＹＢ−１を持たない細胞では複製できず、そしてウイルスは発ガン遺伝子または発ガン遺伝子産物、特には発ガン遺伝子タンパク質をコードしており、それは少なくとも１つのウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化し、そのとき遺伝子はＥ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰを含む群より選ばれる。

【0011】

発明による上記２つの使用の実施態様では、ウイルス、好ましくはアデノウイルスは核内にＹＢ−１を有する細胞で複製する。

【0012】

発明による２つの使用の別の実施態様では、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質はＥ１Ａであり、そして／または発ガン遺伝子はＥ１Ａをコードする遺伝子であり、そして／または発ガン遺伝子タンパク質はＥ１Ａである。

【0013】

好適実施態様では、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合できる。

【0014】

別の実施態様では、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは、機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合できない。

【0015】

発明による２つの使用の別実施態様では、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質Ｅ１ＡはＹＢ−１の核内局在化を誘導しない。

【0016】

発明による２つの使用の更に別の実施態様では、薬物はその細胞がＲｂ−陽性またはＲｂ−陰性のいずれかである患者向けである。

【0017】

好適実施態様では、細胞は上記薬剤により影響を受ける状態の形成に関係する細胞である。

【0018】

発明による２つの使用の別実施態様では、細胞は核内でＲｂ−陰性であり、そしてＹＢ−１陽性であり、好ましくは細胞周期とは独立に核内でＹＢ−１陽性である。

【0019】

発明による２つの使用の更に別の実施態様では、薬剤は腫瘍の処置を目的とする。

【0020】

発明による２つの使用の更に別の実施態様では、細胞、特に腫瘍またはその一部を形成する細胞は、薬剤耐性であり、特に多剤耐性、好ましくは抗腫瘍剤に対し耐性であり、そしてより好ましくは細胞増殖抑制薬に対し耐性である。

【0021】

発明による２つの使用の好適実施態様では、細胞は膜結合輸送タンパク質であるＰ−糖タンパク質および／またはＭＲＰを発現、好ましくは過剰発現している。

【0022】

発明による２つの使用の別実施態様では、細胞はｐ５３−陽性またはｐ５３−陰性である。

【0023】

発明による２つの使用の実施態様の一つでは、発ガン遺伝子タンパク質は、野生型発ガン遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１または複数の突然変異または欠失を有しており、その場合欠失はＣＲ３領域の欠失およびＮ−末端の欠失、およびＣ−末端の欠失を含む群より選択されるのが好ましい。これに関連し、Ｅ１Ａ発ガン遺伝子タンパク質はＲｂに結合できることが好ましい。

【0024】

発明による２つの使用の別実施態様では、発ガン遺伝子タンパク質は、野生型発ガン遺伝子タンパク質と比較した場合、１または複数の突然変異または欠失を有しており、その場合欠失はＣＲ１領域および／またはＣＲ２領域であることが好ましい。発ガン遺伝子タンパク質Ｅ１ＡがＲｂに結合できないことは発明の範囲内である。

【0025】

発明による２つの使用の実施態様の一つでは、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａは、組織特異的および／または腫瘍特異的プロモーター、ならびに／あるいはＥ１Ａプロモーター、特に自然のＥ１Ａプロモーターの制御下にある。

【0026】

発明による２つの使用の別実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスはＹＢ−１をコードしている。

【0027】

発明による２つの使用の更に別の実施態様では、ＹＢ−１は組織特異的および／または腫瘍特異的プロモーターの制御下にある。

【0028】

発明による２つの使用の好適実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスはＥ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ１Ｂ５５ＫおよびアデノウイルスＥ３ＡＤＰタンパク質を含む群から選ばれるタンパク質を少なくとも１つコードしている。

【0029】

発明による２つの使用の別実施態様では、細胞は核内にＹＢ−１を有しており、特に腫瘍もしくはその一部を形成する細胞は核内にＹＢ−１を有している。

【0030】

発明による２つの使用の更なる実施態様では、腫瘍は核内へのＹＢ−１輸送の誘導により核内にＹＢ−１を有している。

【0031】

発明による２つの使用の好適実施態様では、核内へのＹＢ−１の輸送は放射線照射、細胞増殖抑制薬の投与、および高温から成る群より選ばれた少なくとも１つの手段を通じ開始される。

【0032】

発明による２つの使用の特に好適な実施態様では、上記手段は細胞、臓器または生体に適用される。

【0033】

発明による２つの使用の好適実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスは、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０、および機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物と結合できるウイルス性Ｅ１Ａ発ガン遺伝子の発現を欠いているウイルスを含む群より選ばれる。

【0034】

第三の局面では、課題はウイルス、好ましくはアデノウイルスを医薬の製造に使用することで解決されるが、この場合ウイルス、好ましくはアデノウイルスは、その複製がＥ２−後期プロモーターの活性化を通して、好ましくは主にＥ２−後期プロモーターの活性化を通じてＹＢ−１を介してまたはＹＢ−１による手段により制御されるようにデザインされている。実施態様の一つでは、ＹＢ−１はトランスジェニックＹＢ−１または細胞質、特に細胞質脱制御型ＹＢ−１のいずれかである。好ましくは、トランスジェニックＹＢ−１は、ベクター、好ましくはアデノウイルスによって細胞内で発現されるＹＢ−１を意味する。Ｅ２−後期プロモーターは野生型アデノウイルスに存在するアデノウイルスＥ２−後期プロモーター、またはここでトランス遺伝子の発現と関連付け記載されるＥ２−後期プロモーターであるのが好ましい。

【0035】

第四の局面では、課題はウイルスおよび特にはアデノウイルスを核内にＹＢ−１を有する細胞内での複製に使用することで解決されるが、この場合ウイルス、とりわけアデノウイルスは、複製がＥ２−後期プロモーターの活性化を通じて、好ましくはＥ２−後期プロモーターの活性化を主に通じてＹＢ−１により制御されるようにデザインされる。実施態様の一つでは、ＹＢ−１はトランスジェニックＹＢ−１または細胞質、特には細胞質脱制御ＹＢ−１のいずれかである。本明細書で用いる場合のトランスジェニックＹＢ−１は、ベクター、好ましくはアデノウイルスによって細胞内で発現されるＹＢ−１であるのが好ましい。Ｅ２−後期プロモーターは野生型アデノウイルスに存在するアデノウイルスＥ２−後期プロモーター、またはここでトランス遺伝子の発現の使用と関連付け記載されるＥ２−後期プロモーターであるのが好ましい。

【0036】

本発明の第三および／または第四の局面の好適実施態様では、アデノウイルスは本明細書に開示された如くにデザインされ、特には本発明に従った使用を目的としてデザインされる。

【0037】

第五の局面では、課題は次の特徴を有するウイルス発ガン遺伝子タンパク質、特に単離されたウイルス発ガン遺伝子タンパク質により解決される：
ａ）ＹＢ−１核陽性細胞内で、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ、Ｅ３ＡＤＰおよびＥ４ｏｒｆ６およびＥ４ｏｒｆ３を含む群から選ばれる少なくとも１つのウイルス遺伝子がトランス活性化されること；および
ｂ）核内、特にウイルス発ガン遺伝子タンパク質が存在している細胞の核内でのＹＢ−１の誘導を欠くこと。

【0038】

実施態様の一つでは、ウイルス発ガンタンパク質はＥ１Ａである。

【0039】

更なる実施態様では、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質は、野生型発ガン遺伝子タンパク質と比較した場合に１または複数個の突然変異または欠失を有しており、この場合の欠失はＣＲ３領域の欠失、Ｎ−末端の欠失およびＣ−末端の欠失を含む群より選ばれるのが好ましい。

【0040】

実施態様の一つでは、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質を介したＹＢ−１誘導は、Ｅ４ｏｆｒ６および／またはＥ１Ｂ５５ｋＤが有核細胞内に存在しない場合には起こらない。

【0041】

この場合にはウイルス発ガン遺伝子タンパク質はＲｂに結合できると解釈する。

【0042】

別実施態様では、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質は１または複数の突然変異または欠失を含み、この場合欠失はＥ１Ａ発ガン遺伝子タンパク質のＣＲ１領域および／またはＣＲ２領域内にあることが好ましい。この場合には、ウイルス発ガン遺伝子タンパク質はＲｂに結合できないと解釈する。

【0043】

第六の局面では、発明は、ウイルス、特に本発明に従って使用されるアデノウイルスをコードする核酸を含み、そしてヘルパーウイルスの核酸を１つ含むウイルス複製系、好ましくはアデノウイルス複製系の使用であって、上記ヘルパーウイルスの核酸がＹＢ−１をコードする核酸を含んでいる複製系に関する。

【0044】

実施態様の一つでは、ウイルス核酸、特にはアデノウイルス核酸、および／またはヘルパーウイルスの核酸は、複製可能なベクターとして存在する。

【0045】

第七の局面では、発明はウイルス、特にはアデノウイルスをコードする核酸を、発明に従って使用する医薬の製造、特には腫瘍処置を目的とする医薬の製造への使用に関する。

【0046】

実施態様の一つでは、細胞、特には腫瘍またはその一部を形成する細胞は、薬物、好ましくは抗ガン剤、より好ましくは細胞増殖抑制薬に対し耐性、特には多剤耐性である。

【0047】

第八の局面では、発明はウイルス、特にはアデノウイルスをコードする核酸を、発明に従って使用する、核内にＹＢ−１を有する細胞内での複製に関する使用であって、ウイルスが核内にＹＢ−１を持たない細胞に於いては複製欠失であり、そしてウイルスがＹＢ−１核陽性細胞に於いては少なくとも１つのウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化する発ガン遺伝子もしくは発ガン遺伝子産物をコードし、その場合の遺伝子はＥ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰを含む群から選ばれる使用に関する。

【0048】

第九の局面では、課題はウイルス、好ましくはアデノウイルスをコードする核酸を、発明に従い使用し医薬の製造に用いることで解決されるが、そのためにウイルスはその複製がＥ２−後期プロモーターの活性化を通じて、好ましくはＥ２−後期プロモーターの活性化を主に通じて、ＹＢ−１により制御されるようにデザインされている。実施態様の一つでは、ＹＢ−１はトランスジェニックＹＢ−１または細胞質、特には細胞質脱制御ＹＢ−１のいずれかである。ここで用いるトランスジェニックＹＢ−１とは、ベクター、好ましくはアデノウイルスベクターによって細胞内で発現されるＹＢ−１であることが好ましい。Ｅ２−後期プロモーターは、野生型アデノウイルス内に存在するアデノウイルスＥ２−後期プロモーター、またはトランス遺伝子の発現の使用と関連してここに記載されるＥ２−後期プロモーターであることが好ましい。

【0049】

第十の局面では、課題はウイルス、特にはアデノウイルスをコードする核酸の、細胞内での複製に関する発明に従って用いることによる使用により解決されるが、そのためにウイルスはその複製がＥ２−後期プロモーターの活性化を通じて、好ましくはＥ２−後期プロモーターの活性化を主に通じて、ＹＢ−１により制御されるようにデザインされている。実施態様の一つでは、ＹＢ−１はトランスジェニックＹＢ−１または細胞質、特には細胞質脱制御ＹＢ−１のいずれかである。ここで用いるトランスジェニックＹＢ−１はベクター、好ましくはアデノウイルスによって細胞内で発現されるＹＢ−１であることが好ましい。Ｅ２−後期プロモーターは、野生型アデノウイルス内に存在するアデノウイルスＥ２−後期プロモーター、またはトランス遺伝子の発現の使用と関連してここに記載されるＥ２−後期プロモーターであることが好ましい。

【0050】

第十一の局面では、課題は前記核酸の一つを含むベクターを、本発明の第一または第二の局面に従い使用することで解決される。

【0051】

第十二の局面では、発明は、発明に従い用いられるウイルス、特にはアデノウイルスと細胞を接触すべきものであるか、および／またはそれらを用いて処置すべきものであるかを決定することを目的とした、細胞、腫瘍組織または患者の細胞の特徴付けのためのＹＢ−１と相互作用する薬物の使用に関する。

【0052】

実施態様の一つでは、薬物は抗体、抗カリン（anticaline）、アプタマー、アプタザイムおよびシュピーゲルマー（spiegelmer）を含む群から選ばれる。

【0053】

第十三の局面では、課題は本発明によるウイルス発ガン遺伝子タンパク質またはそれをコードする核酸を、本発明の第一および第二局面に従って用いられるウイルス、特にはアデノウイルスの製造に使用することで解決される。

【0054】

実施態様の一つでは、ウイルスはトランス遺伝子をコードする核酸を含む。

【0055】

別の実施態様では、ウイルスはトランス遺伝子の翻訳産物および／または転写産物を含む。

【0056】

好適実施態様では、アデノウイルス複製系の核酸および／またはヘルパーウイルスの核酸は、トランス遺伝子またはトランス遺伝子をコードする核酸を含む。

【0057】

更に別の実施態様では、核酸はトランス遺伝子またはトランス遺伝子をコードする核酸を含む。

【0058】

別の実施態様では、トランス遺伝子はプロドラッグ遺伝子、サイトカイン、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、金属プロテアーゼインヒビターに関する遺伝子、および血管新生インヒビターに関する遺伝子を含む群より選ばれる。

【0059】

実施態様の一つでは、トランス遺伝子はｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子およびリボザイムに関する核酸を含む群より選ばれ、この場合のｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子および／またはリボザイムはあるターゲットとなる標的分子を持っている。

【0060】

更なる実施態様では、標的分子は耐性関連因子、抗アポトーシス因子、発ガン遺伝子、血管新生因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ修復酵素、成長因子およびそれらのレセプター、転写因子、金属プロテアーゼ、特にマトリックス金属プロテアーゼ、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、耐性関連因子は、Ｐ−糖タンパク質、ＭＲＰおよびＧＳＴを含む、およびそれらをコードする核酸を含む群より選ばれるのが好ましい。実施態様の一つでは、抗アポトーシス因子は、ＢＣＬ２を含み、更にそれをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、発ガン遺伝子はＲａｓ、特に突然変異型Ｒａｓ、ＲｂおよびＭｙｃを含み、またそれらをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、血管新生因子はＶＥＧＦおよびＨＭＧタンパク質を含む、ならびにそれらをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、ＤＮＡ合成酵素はテロメラーゼを含む、ならびにそれをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、ＤＮＡ修復酵素はＫｕ−８０を含み、またそれをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、成長因子はＰＤＧＦ、ＥＧＦおよびＭ−ＣＳＦを含み、またそれらをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、レセプターは特には成長因子に関するレセプターであり、この場合の成長因子はＰＤＧＦ、ＥＧＦおよびＭ−ＣＳＦを含み、またそれらをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、転写因子はＹＢ−１を含み、またそれをコードする核酸も含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、金属プロテアーゼはマトリックス金属プロテアーゼであることが好ましい。好適実施態様では、金属プロテアーゼはＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２を含み、またそれらをコードする核酸を含む群より選ばれる。実施態様の一つでは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、ｕＰａ−Ｒを含み、またそれをコードする核酸を含む群より選ばれる。

【0061】

さらに別の実施態様では、医薬は少なくとも１つの医薬活性化合物を追加して含む。

【0062】

好適実施態様では、医薬的に活性な化合物は、サイトカイン、金属プロテアーゼインヒビター、血管新生インヒビター、結腸直腸ガンに対するイリノテカンおよびＣＰＴ−１１ならびに白血病に対するダウノルビシンなどの細胞増殖抑制薬、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ活性を抑制し結腸直腸腫瘍に対して用いることができるＣＹＣ２０２ (McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468）およびＲａｆ−１を阻害し例えば乳ガンに対して有効なＢＡＹ ４３−９００６ (Wilhelm SM et al., Cancer Res. 2004, 64, 7099-7109）のような細胞周期インヒビター、２６Ｓプロテアソーム活性を抑制し、扁平上皮ガンに対して用いられるＰＳ−３４１(Fribley A et al., Mol Cell Biol 2004 Nov; 24(22): 9695-704) のようなプロテオソームインヒビター、ＥＧＦレセプターなどに対する組換え抗体 (乳ガンおよび前立腺腫瘍に対するハーセプチン; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; 頭部および頚部腫瘍に対するエルビタックス; Bauman M et al., Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266)、および特にｃ−キットを抑制し、胃腸の腫瘍に対して用いることができる、ＳＴＩ５７１のような情報伝達カスケードのインヒビター (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、特に前立腺腫瘍に対して用いることのできるエンドセリンインヒビターであるＡＢＴ−６２７(H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、ＶＥＧＦチロシン・キナーゼ・レセプターのリン酸化を阻害し、特に膠芽腫および前立腺ガンに対して用いることができるＳＵ５４１６(Bischof M et al Int. J. Radiat, Oncol. Biol. Phys. 2004; 60 (4): 1220-32)、ＥＧＦＲチロシン活性を阻害し、特に前立腺腫瘍に対して用いることができるＺＤ１８３９(H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、ｍＴＯＲを阻害し、前立腺腫瘍に対して用いることができるＣＣＩ−７７９およびＲＡＤ００１のようなラパマイシン誘導体；を含む群より選択される。本明細書に記述した様々なアデノウイルスおよび本発明に従って用いられるアデノウイルスを、それぞれ原則として、いずれの前述の化合物とも共に、本明細書において関連して上述したいずれの適応に対しても用いることができることは本発明の範囲内である。特に好ましい実施態様では、この適応は任意の以前に言及した医薬的に活性な化合物のいずれかに対して記述される適応である。

【0063】

実施態様の１つでは、医薬は少なくとも２つの薬剤の組合せを含む。その場合、各薬剤が、個々におよび独立して細胞増殖抑制薬を含む群より選択される。

【0064】

好ましい実施態様では、少なくとも薬剤の２つが異なる標的分子に作用する。

【0065】

別の実施態様では、少なくとも薬剤の２つが異なる作用様式によって活性を有する。

【0066】

実施態様の１つでは、少なくとも１つの薬剤が、ウイルスがその中で複製する細胞の感染される受容能力を増加させる。

【0067】

実施態様の１つでは、少なくとも１つの薬剤が、細胞内の成分の有効性に影響を及ぼし、好ましくは成分の有効性を増大させ、それによって成分はウイルスの取込みを仲介する。

【0068】

実施態様の１つでは、少なくとも１つの薬剤が、核の中へのＹＢ−Ｉの輸送を仲介し、好ましくは前記輸送を増大させる。

【0069】

実施態様の１つでは、少なくとも１つの薬剤がヒストンデアシラーゼインヒビターである。

【0070】

好適実施態様では、ヒストンデアシラーゼインヒビターが、トリコスタチン Ａ、ＦＲ ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、およびＰＸＤ１０１を含む群より選択される。

【0071】

実施態様の１つでは、少なくとも１つの薬剤が、トリコスタチンＡ（膠芽細胞腫に対して、Kim JH et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 2004, 59, 1174-1180)、ＦＲ ９０１２２８（膵臓腫瘍に対して、Sato N et al., Int. J. Oncol. 2004, 24, 679-685；ＭＳ−２７−２７５（前立腺腫瘍に対して、Camphausen K et al., Clinical Canver Research 2004, 10, 6066-6071)、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（白血病に対して、Nimmanapalli R et al., Cancer Res. 2003, 63, 5126-5135；ＰＸＤ１０１（卵巣腫瘍に対して、Plumb JA et al, Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 721-728)、スクリプタイド（乳ガンに対して、 Keen JC et al., Breast Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177-186)、アピシジン（メラノーマに対して、Kim SH et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 315, 964-970)およびＣＩ−９９４（様々な腫瘍に対して、Nemunaitis JJ et al., Cancer J. 2003, 9, 58- 66）を含む群より選択される。ヒストンデアセチラーゼインヒビターの作用様式については、特に Lindemann RK et al., Cell Cycle 2004, 3, 77-86 に記述されている。本明細書に記述される様々なアデノウイルスおよび本発明に従って用いられるアデノウイルスを、原則として前述の化合物と共に、本明細書でそれに関連して上述したいずれの適応に対しても用いることができることは、本発明の範囲内である。特に好ましい実施態様では、この適応は以前に言及した医薬的に活性なそれぞれの化合物に対して記述された適応である。

【0072】

実施態様の１つでは、少なくとも１つの薬剤はトポイソメラーゼインヒビターである。

【0073】

好ましい実施態様では、トポイソメラーゼインヒビターは、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、エトポシドおよびダウノルビシンを含む群より選択される。これらを様々な腫瘍、例えば結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣ガン、前立腺ガンに対して用いることができる。使用される分野については特に、Recchia F et al., British J. Cancer 2004, 91, 1442-1446; Cantore M et al., Oncology 2004, 67, 93-97; Maurel J. et al., Gynecol. Oncol 2004, 95, 114-119; Amin A. et al., Urol. Oncol. 2004, 22, 398-403; Kindler HL et al., Invest. New Drugs 2004, 22, 323-327, Ahmad T. et al., Expert Opin. Pharmacother. 2004, 5, 2333-2340; Azzariti A. et al., Biochem Pharmacol. 2004, 68, 135-144; Le QT et al., Clinical Cancer Res. 2004, 10, 5418-5424 に記述されている。ここに記述した様々なアデノウイルスおよび本発明に従って用いられるアデノウイルスは、それぞれ、原則として、前述の化合物と共に、本明細書でそれに関連して上述したいずれの適応に対しても用いることができることは、本発明の範囲内である。特に好ましい実施態様では、適応は、以前に言及した医薬的に活性な各々の化合物に対して記述されたものである。

【0074】

特に好適な実施態様では、適応は、前に言及した任意の医薬的に活性な化合物に対して記述された適応である。

【0075】

好適実施態様では、手段はトリコスタチンＡおよびイリノテカンおよびダウノルビシンを含む。

【0076】

実施態様の１つでは、ウイルス、特に本発明の態様の１つによるウイルス、が少なくとも２つの薬剤から分離されている。

【0077】

好的実施態様では、ウイルスの少なくとも１単位の投与量が、１つまたは少なくとも２つの薬剤の少なくとも１単位の投与量から分離されている。

【0078】

第１４の態様では、本発明は、ウイルス、特に本発明の任意の態様によるウイルス、および少なくとも２つの薬剤を含むキットに関する。その場合、任意の薬剤が、個々におよび独立して細胞増殖抑制薬を含む群より選択される。

【0079】

本発明はＹＢ−１核陽性腫瘍細胞でのＥ１Ａ−修飾アデノウイルスのＤＮＡ複製がＥ２−後期プロモーターの活性化に基づいているという驚くべき発見に拠っている。本明細書で使用する場合のＥ１Ａ−修飾アデノウイルスは、（ａ）ＹＢ−１核陰性細胞では複製しないか、またはＹＢ−１核陰性細胞に於いては対応する野生型細胞に比べて複製の低下、好ましくは大きな低下を示し、（ｂ）少なくとも１つのウイルス遺伝子をトランス活性化し、その場合の遺伝子は特にはＥ１Ｂ−５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰを含む群から選ばれ、そして／または（ｃ）アデノウイルスを通じて細胞内ＹＢ−１を核内に移動しない、アデノウイルスである。場合によっては、本発明で使用するアデノウイルスは、アデノウイルスがコードするＥ１Ａタンパク質の結合がＲｂへのＥ２Ｆの結合を妨害してＲｂとＥ２Ｆより成るそれぞれの複合体を解離することができるという特徴を更に有してもよい。上記特徴ａ）からｃ）のうちの少なくとも１つ、または複数、好ましくは特徴ａ）からｃ）の全てを有するアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を持たない細胞では複製できない。

【0080】

実施態様の一つでは、ここで用いる場合、大きな複製の低下とは特に、野生型と比較したときに２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍低下した複製を意味する。好適実施態様では、かかる複製の比較は、同一もしくは類似の細胞株、同一もしくは類似の感染ウイルス力価（感染多重度、ＭＯＩもしくはプラーク形成単位、pfu）および／または同一もしくは類似の一般的実験条件を用いて実施される。ここで使用する場合、複製とは、特には粒子形成を意味する。別の実施態様では、複製の評価はウイルス核酸合成の程度とすることができる。ウイルス核酸合成の程度を決定する方法、ならびに粒子形成を決定する方法は当業者周知である。

【0081】

ここに記載の発見、方法、使用または核酸、タンパク質、複製系等は、アデノウイルスに必ずしも限定されない。原則的には、かかる系はこれと共に包含される他のウイルスにも存在する。

【0082】

本発明によるウイルスを使用する場合、または本発明により本明細書に記載のウイルスを使用する場合には、先行技術によれば、１０〜１００pfu／細胞に対し１〜１０pfu／細胞の感染率で野生型の複製に匹敵する複製が実現できる。

【0083】

本明細書で使用する場合、細胞質ＹＢ−１は細胞によりコードされているＹＢ−１、好ましくは細胞によりさらに発現されるＹＢ−１を意味するものとし、この場合ＹＢ−１は細胞内に、アデノウイルス、好ましくは本書記載のアデノウイルスおよび／もしくはヘルペスウイルスが該当する細胞に感染する前に存在することが好ましい。しかしながら、細胞質ＹＢ−１が細胞内に導入された、または例えばウイルス、特にはアデノウイルスの感染といった外的方法を用いることによりかかる細胞が産生したＹＢ−１である場合も本発明の範囲内である。

【0084】

以下これに結びつけることを望むことなしに、本発明者はＥ２−初期プロモーター、即ち初期Ｅ２プロモーターは、本発明に従いここに使用されるウイルス複製との関係に於いて、ヒト細胞質Ｅ２Ｆ転写因子を通じて始動することはないと想定している。複製の始動は細胞のＲｂの状態とは無関係であり、即ちこのことは、ここに開示するウイルスを用い感染させた腫瘍細胞、およびその後好ましく溶解する腫瘍細胞は機能的Ｒｂタンパク質および非活性型Ｒｂタンパク質の両方を含んでよいことを意味する。さらに、アデノウイルスの複製は、ここに開示するアデノウイルスを使用した場合、またはここに開示の条件では、機能的ｐ５３タンパク質を必要とせず、またその存在の影響も受けない。その限りに於いて、技術的教示はＡｄΔ２４、ｄ１９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６型の殺ガンもしくは殺腫瘍性アデノウイルスの、または例えば欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のアデノウイルスの、あるいは無傷の機能的Ｒｂタンパク質はインビボでの効果的複製にとって障害であり、従ってＲｂ−陰性およびＲｂ−突然変異細胞でのみアデノウイルスはインビボ複製するという仮説の下にＥ１Ａタンパク質内に１または複数の欠失を導入したアデノウイルスの使用を基礎と成す原理とは、それぞれ異なっている。これらの先行技術のアデノウイルス系は、Ｅ１Ａに基づき、初期Ｅ２プロモーター（Ｅ２初期プロモーター）および「無Ｅ２Ｆ」を利用してアデノウイルスのインビボ複製を制御するものである。しかしながら、これら先行技術ウイルスは、本発明に従って用いること、即ち細胞周期と無関係に核内にＹＢ−１を含む細胞での複製に用いることもできるだろう。

【0085】

前記欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のウイルス、特にアデノウイルスは本発明に従い使用出来るだろう。より具体的には、前記特許に記載のウイルスは複製できず、そして機能的なＲｂ腫瘍抑制遺伝子産物と結合可能なウイルス発ガンタンパク質を発現していない。このアデノウイルスは具体的には、機能的腫瘍抑制遺伝子産物、特にはＲＢを結合できるウイルスＥ１Ａ発ガンタンパク質の発現を欠いているアデノウイルスであろう。ウイルスＥ１Ａ発ガンタンパク質は例えば、ｐ１０５Ｒｂタンパク質、ｐ１３０およびｐ１０７タンパク質の結合に関係する、Ａｄ５のアミノ酸位置３０〜８５、ヌクレオチド位置６９７〜７９０にあるＣＲ１ドメイン、ならびにＡｄ５内アミノ酸位置１２０から１３９、ヌクレオチド位置９２０〜９６７にあるＣＲ２ドメイン内に不活性化突然変異を含むことができる。アデノウイルスはタイプ２ｄｌ３１２から、またはアデノウイルスはタイプ５ＮＴｄｌ１０１０から指定することもできる。

【0086】

最終的に複製は核内にＹＢ−１を含む細胞、即ちＹＢ−１核陽性である細胞において、医薬製造、特には腫瘍疾患の処置用の医薬の製造を目的として発明のアデノウイルスを使用する場合、ならびに核内にＹＢ−１を有する細胞での複製のために発明に従いアデノウイルスを使用する場合に、細胞周期とは無関係に起こることが好ましい。かかるアデノウイルスは核内にＹＢ−１を持たず、ＹＢ−１は実質的に細胞質内にのみ存在している細胞では複製しないか、またはそのレベルが極めて低くなることに特に注意すべきである。この限りにおいて、これらウイルスが上手く複製するにはＹＢ−１が核内に存在することが必要である。これは例えば、以下詳しく概要を示すように、核内にＹＢ−１を発現させるか、または核内にＹＢ−１が存在するようにする手段を細胞にこうじることで実現できる。そのような手段としては、例えばアデノウイルス遺伝子に加えてＹｂ−１をコードする遺伝情報、特にＹＢ−１の発現に関する遺伝情報も含んでいる、本発明に従い使用するアデノウイルスを介したＹＢ−１のコード化および発現を挙げることができる。細胞核内へのＹＢ−１の輸送、誘導または発現を起こすその他手段としては、細胞およびかかる細胞を含む生体への細胞増殖抑制薬投与、放射線照射、高温等のストレス条件がある。

【0087】

本発明に関連して、特に腫瘍溶解に関連して使用するアデノウイルスは更に、それらが核内にＹＢ−１を持たない、換言すればＹＢ−１核陰性である細胞では複製しないという特徴を持つ。

【0088】

発明で使用されるアデノウイルスは更に、それらが本明細書で発ガン遺伝子タンパク質も呼ばれるウイルス発ガンタンパク質をコードすることも特徴としており、この場合上記発ガンタンパク質はＥ１Ａであることが好ましく、そして発ガン遺伝子タンパク質はウイルスの複製および／またはウイルス感染細胞の細胞溶解に影響を及ぼすことができるウイルス遺伝子の少なくとも１つを活性化できる。複製への影響は、ウイルスが、そのウイルスの発ガン遺伝子タンパク質が存在しない場合に比べ、発ガン遺伝子タンパク質が存在する場合により良く複製するものであることが好ましい。このプロセスは本明細書ではトランス活性化、そしてこのトランス活性化がＥ１Ａを通じて行われる場合には特にＥ１Ａトランス活性化とも呼ばれる。用語「トランス活性化する」または「トランス活性化」とは、各ウイルス発ガンタンパク質がウイルス発ガンタンパク質をコードする遺伝子そのものとは異なる１または複数のその他遺伝子の発現および／または転写に影響を及ぼす、即ちそれ／それらの発現および／または翻訳を好ましく制御する、そして特にはそれ／それらを活性化するプロセスを表す。かかるウイルス遺伝子はそれぞれＥ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ３ＡＤＰならびにこれら遺伝子および遺伝子産物のいずれかの組み合わせであることが好ましい。

【0089】

さらに、場合によっては、発明に従い用いるアデノウイルスの特徴は、腫瘍抑制因子Ｒｂにそして腫瘍抑制因子Ｒｂと結合することである。原則的には、本発明に従い使用するアデノウイルスがＲｂに結合すること、またはＲｂに結合しないことは共に本発明の範囲内である。アデノウイルスに関する両実施態様は、処理対象となる細胞のＲｂの状態とは無関係に用いることができる。

【0090】

Ｒｂに結合できなくするために、例えば次のようなＥ１Ａ発ガンタンパク質の欠失が考えられる：ＣＲ１領域内の欠失（Ａｄ５内アミノ酸位置３０〜８５）およびＣＲ２領域の欠失（ＡＤ５内のアミノ酸位置１２０〜１３９）。この様な欠失では、ＣＲ３領域はそのまま維持され、他の初期ウイルス遺伝子に対するトランス活性化機能を発揮できる。

【0091】

これに対し、Ｅ１ＡにＲｂへの結合能を付与する場合については、Ｅ１Ａ発ガンタンパク質に対する次の欠失が原理的に可能である：ＣＲ３領域（アミノ酸位置１４０〜１８５）の欠失；Ｎ−末端（アミノ酸位置１〜２９）の欠失；アミノ酸位置８５〜１１９の欠失；およびＣ−末端（アミノ酸位置１８６〜２８９）の欠失。ここに引用した領域は、ＲｂへのＥ２Ｆの結合を妨害しない。しかし、トランス活性化機能は維持されるが、野生型Ａｄ５に比べると低い。

【0092】

先行技術既知であるかかるウイルスは一般には複製欠失として知られている。しかし、本発明の利点は、かかるウイルスが好適な背景、特に細胞の背景があれば複製できることが認識されていることである。この種の好適細胞の背景は、核内にＹＢ−１が存在すること、好ましくは核内にＹＢ−１が細胞周期とは無関係に存在することより生じるか、または提供される。細胞または細胞系という用語は、ここで使用する場合、細胞の断片または細胞溶解物の断片、ならびにインビトロ、インビボまたはインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）に存在する細胞を含む。この限りにおいて細胞系または細胞という用語は、細胞培養体、組織培養体、臓器培養体、または単離された、グループ状態にある、または一部分である組織、臓器または生体であるインビボおよびインシトゥのその他組織または臓器内に存在する細胞、あるいは好ましくは生きている生物体内にその様な形で存在している細胞も含む。生体は好ましくは脊椎動物の生体であり、より好ましくは哺乳動物のものである。生体がヒトの生体であることが特に好ましい。

【0093】

更に、ここに提供する技術的教示に基づいて、ここに記載のアデノウイルスの複製特徴と、ＹＢ−１核陽性である細胞での従来技術のアデノウイルスの特徴とを持つ新規ウイルスを作成することも、本発明の範囲内である。換言すれば、既知アデノウイルスを基にして、ここに明示した本発明での使用に必要な特徴を有する更なるウイルスをデザインすることができる。

【0094】

本発明に関しては、発明で用いられる各種アデノウイルスの修飾Ｅ１Ａ発ガンタンパク質は、例えばＥ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ３ＡＤＰといった初期ウイルス遺伝子をＹＢ−１核陽性細胞内でトランス活性化できるものである。これに関しては、その他の点についてウイルスゲノムにそれ以上の変更がないことが望ましく、各アデノウイルスはその他の点については野生型のアデノウイルスまたはその誘導体と同様でよい。

【0095】

本発明の意味での発ガン遺伝子タンパク質のトランス活性化をコードしているか、またはかかる発ガン遺伝子タンパク質を含むここに記載のウイルスは、たとえばアデノウイルスＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および／または欧州特許第EP０ ９３１ ３８０号に記載のアデノウイルスを含み、それらはそれぞれＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３および／またはE4といった初期遺伝子をトランス活性化でき、そして野生型のアデノウイルス、特には野生型Ａｄ５と同等である。これらの例ではトランス活性化にはＥ１Ａタンパク質の特定の領域が関係している。各種血清型アデノウイルスに於いてＥ１Ａタンパク質中には極めて保存的である領域が３カ所ある。アミノ酸位置４１〜８０のＣＲ１領域、アミノ酸位置１２０〜１３９のＣＲ２領域、およびアミノ酸位置１４０〜１８８のＣＲ３領域である。トランス活性化機能は主にＥ１Ａの中にＣＲ３領域が存在することに基づいている。ＣＲ３のアミノ酸配列は上記アデノウイルスについては変更がない。その結果、核内または細胞質内のＹＢ−１の存在とは無関係に、初期遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４は活性化される。

【0096】

しかし組換え体アデノウイルスｄ１５２０では、ＣＲ３領域は削除されている。即ちｄｌ５２０はＣＲ３領域のアミノ酸配列を含まない、いわゆるＥ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現する。その結果ｄ１５２０は特にＥ２領域に対し極めて弱いトランス活性化機能しか発揮できず、その結果ＹＢ−１核陰性細胞では複製しない。ＹＢ−１核陽性細胞では、ＹＢ−１はＥ２領域をトランス活性化し、それによりｄｌ５２０は有効に複製できる。これがここでの開示の目的のための、それぞれｄｌ５２０と同様のシステムおよび５１２０をベースとするシステムを用いることの根拠である。既報の両アデノウイルス群、即ちデルタ２４（本明細書ではＡｄΔ２４とも称する）とｄｌ５２０間のより重要な違いは、ｄ１５２０に関しては、初期遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ３およびＥ４がＹＢ−１核陰性細胞に比べてＹＢ−１核陽性細胞でより強くトランス活性化されるという事実である。これに対しデルタ２４との間には全く、または極僅かな違いしかない。しかしｄｌ５２０の、より具体的にはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質のトランス活性化効果は、野生型アデノウイルスに比べ大きく低下している。しかしこのトランス活性化は、実施例１０に示す如く、ＹＢ−１核陽性細胞内での効果的複製を可能にするには十分である。本明細書に記載のＥ１Ａタンパク質およびそれをコードする核酸のデザイン、特にそのＥＩＡタンパク質が野生型発ガンタンパク質Ｅ１Ａに対し１もしくは複数の欠失、および／または突然を有しているような本明細書内のデザインであって、その欠失が好ましくはＣＲ３領域およびＮ−末端の欠失およびＣ−末端の欠失を含む群から選ばれる一つであり、具体的にはｄｌ５２０またはＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９２４、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および／または欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のアデノウイルスと関連し記載されるＥ１Ａタンパク質の好適なデザインの実施態様がウイルス、特にアデノウイルスの実施態様であり、その複製はＥ２−後期プロモーターの活性化を通じて、好ましくは主にＥ２−後期プロモーターの活性化を通じて制御される。アデノウイルスのこの形態の複製を可能にするＥ１Ａタンパク質の別の実施態様は、本明細書の開示に基づき、当業者により作り出すことができる。

【0097】

新たに構築され、本明細書では誘導体とも称され、且つ本発明にしがたい使用できる別のアデノウイルスは、一般的にはＥ１欠失、Ｅ１／Ｅ３欠失、および／またはＥ４欠失を有しており、即ち対応するアデノウイルスは機能的に活性なＥ１および／またはＥ３、および／またはＥ４発現産物および各産物をそれぞれ作り出すことができず、換言すれば、これらアデノウイルスは機能的に不活性なＥ１、Ｅ３および／またはＥ４発現産物のみ産生できるが、この時のそのような機能的に不活性なＥ１、Ｅ３および／またはＥ４発現産物とは、その転写レベルおよび／または翻訳レベルにおいて、たとえ発現産物として全く存在していない、あるいは野生型のアデノウイルスに存在する機能の少なくとも一つを欠いている形で存在していもよい。野生型アデノウイルスの発現産物の機能は当業者周知であり、そして例えばRussell, W, C、Journal of Virology、81、2573〜2604、2000年に記載されている。Russell（上記）はまた、参照によりここに組み込まれるアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターの構築の原理についても記載している。上記修飾型Ｅ１Ａ発ガンタンパク質、Ｅ１Ｂ−５５K、Ｅ４ｏｒｆ６、および／またはＥ３ＡＤＰ（アデノウイルス崩壊タンパク質（ＡＤＰ））（Tollefson, Aら、J.Virology、70、2296〜2306、1996年）をこの種のベクター内で、個々に、または組み合わせて発現させることも、本発明の範囲内である。これに関連して、ここに開示した個々に名前を挙げた遺伝子ならびにトランス遺伝子および／または治療用トランス遺伝子は、Ｅ１および／またはＥ３および／またはＥ４領域内にクローニングでき、好適プロモーターの助けをかり、または好適プロモーターの制御下に個別に発現させることができる。基本的には、領域Ｅ１、Ｅ３およびＥ４はアデノウイルス核酸内のクローニング部位として同等の好適性を有しており、クローニングに用いられない領域は、個々にまたは全体として、部分的におよび／または完全に欠失して存在することができる。これらの領域が存在する場合は、特にそれらの全体が存在する場合は、それらがインタクトで、好ましくは翻訳生成物および／または転写生成物を提供する、および／またはインタクトではなく、好ましくは翻訳生成物および／転写生成物を提供しない、のいずれかであるのは本発明の範囲内である。取り分け好適なプロモーターは本明細書の中でＥ１Ａ、特に修飾型Ｅ１Ａの制御および発現それぞれに関連付けて開示されているプロモーターである。

【0098】

最後に実施態様の一つでは、本発明に従い用いられるアデノウイルスは、Ｅ１Ｂに関する、特にＥ１Ｂ１９kDaに関する欠損体である。本明細書で使用する場合、欠損という用語はＥ１Ｂが野生型固有の特性の全てを有しているわけではないが、その特性の少なくとも一つを欠いている状態を意味する。アデノウイルスＢＣＬ２のホモログＥ１Ｂ１９ｋが、前アポプトーシスタンパク質ＢａｋおよびＢａｘとの相互作用により、Ｅ１Ａが誘導するアポトーシスを回避する。これにより、最大限の複製および／または粒子形成が感染細胞において可能である (Ramya Sundararajan and Eileen White, Journal of Virology 2001, 75, 7506-7516)。Ｅ１Ｂ１９ｋが欠失すると（もし存在する場合はそれがアデノウイルスの細胞死タンパク質の機能を、最小限にすることになるので）、ウイルスがより良好に放出される結果となる。そのような欠失によって、ウイルスが誘導する細胞変性効果が増大し (Ta-Chiang Liu et al., Molecular Therapy, 2004)、したがって感染腫瘍細胞がより著しく溶解する結果となる。さらに、Ｅ１Ｂｌ９ｋの欠失は、腫瘍細胞中においてはＴＮＦαがそのような組換えアデノウイルスの複製に影響を及ぼさなくなる原因となり、一方で正常細胞では、治療によって感染性ウイルスの複製および放出が減少する結果になる。その限りにおいて、選択性と特異性が増加する (Ta-Chiang Liu et al., Molecular Therapy 2004, 9, 786-803)。

【0099】

ここに開示した発明に使用するアデノウイルスは、基本的には幾つかの実施態様については当分野周知である。本発明に用いられるアデノウイルスは、特に野生型と比較しここに示す技術的教示に従って変更する場合には、組換え体アデノウイルスであることが好ましい。本発明にとって必須でないアデノウイルス核酸を欠失または突然変異させることは、当業者の技術的水準内である。かかる欠失は、例えばここにも記す様にＥ３およびE4をコードする核酸の一部にかかっても良い。Ｅ４の欠失は、かかる欠失がタンパク質Ｅ４ｏｒｆ６を超えていないこと、換言すれば発明に使用するアデノウイルスはＥ４ｏｒｆ６をコードすることが特に好ましい。好適実施態様では、これらアデノウイルス核酸は更にウイルスカプシドに封入してもよく、即ち感染粒子を形成してもよい。このことは本発明での核酸の使用にも当てはまる。一般に、アデノウイルス系は単一または複数の発現産物について欠失してもよいことを記しておく。これに関連して、この現象はかかる発現産物をコードする核酸が完全に突然変異しているか、もしくは欠失しているか、または実質的に発現産物がもはや生じない程度まで突然変異しているか欠失しているかに基づいているか、あるいは核酸レベル（プロモーターの欠失；シス作用要素）または翻訳系および転写系（トランス作用要素）のそれぞれについて、発現を制御するか、もしくは野生型とは異なる様式で作用するプロモーターもしくは転写因子を欠いていることに基づいていることに注意しなければならない。具体的には、後者の観点は背景となる細胞に依存している。

【0100】

本発明によるアデノウイルスでは、さらに周知の如く新規アデノウイルスもまた、その他アデノウイルスに関しここに記した程度に使用することができる。発明による新規アデノウイルスは、ここに示す技術的教示より生ずる。特に好ましい例は、例えば図１６および１７に示すウイルスＸｖｉｒ０３およびＸｖｉｒ０３／０１、実施例１１および１２に更に例示したデザイン原理である。

【0101】

ベクターＸｖｉｒ０３の場合は、ＣＭＶプロモーターを、ＩＲＥＳ配列により隔てられているＥ１Ｂ５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６の核酸をコードするＥ１領域内にクローニングする。これに関連して、Ｅ３領域は、部分的にまたは完全に欠失していてもよく、および／または完全にインタクトの形で存在していてもよい。これら２遺伝子の導入およびそこより産生される遺伝子産物それぞれによって、野生型ウイルスのものと好ましくは実質同じ複製効率を得るが、その場合複製の選択性は細胞、特に腫瘍細胞について維持されるため、ＹＢ−１核陽性細胞、より具体的にはＹＢ−１が脱制御状態にある細胞で複製が起こる。ＹＢ−１が脱制御状態にある細胞は、好ましくは正常細胞または非腫瘍細胞に比べて、好ましくはコンパートメント独立的（compartment-independent）に、ＹＢ−１の発現が上昇を示す細胞である。Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６もまた、Ｅ４領域へクローニングすることができ、その場合Ｅ３領域はインタクトのままであるか、または／および、部分的にまたは完全に欠失する。

【0102】

ウイルスＸｖｉｒ０３の更なる発展形は、好適実施態様において、その中に治療遺伝子またはトランス遺伝子が特異的プロモーター、特に腫瘍特異的または組織特異的プロモーター制御下にクローニングされているウイルスＸｖｉｒ０３／０１である。Ｅ４領域が機能的に非活性であり、好ましくは欠失しているウイルスもまた上記ウイルスの範囲内である。ここに記したトランス遺伝子はまたＥ４領域内にクローニングしてもよく、この場合クローニングをＥ３領域内へのトランス遺伝子のクローニングに追加し、またはそれに代替して行ってもよく、そして、それぞれの場合に、Ｅ３領域は部分的にまたは完全にインタクトのままである。本明細書で用いられるトランス遺伝子は、ウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子、（それらは、好ましくはゲノム中に存在せず、またそれぞれ、野生型ゲノムのそれらが現在特定のウイルス中で存在している部位には存在しない）、または治療用遺伝子でよい。

【0103】

治療遺伝子は、プロドラッグ遺伝子、サイトカインの遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、金属プロテアーゼインヒビターおよび／または血管新生インヒビターの遺伝子であろう。更にｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスおよびリボザイムを、ガン関連標的分子に向けて発現させてもよい。好ましくは、単一または複数の標的分子が、耐性関連因子、抗アポトーシス因子、発ガン遺伝子、血管新生因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ修復酵素、増殖因子とそれらのレセプター、転写因子、金属プロテアーゼ、特にマトリックス金属プロテアーゼ、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含む群より選ばれる。その好適実施態様は既に本明細書内に開示した。

【0104】

好適実施態様にて使用可能であろうプロドラッグ遺伝子は、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）である；Kimら、Trends in Molecular Medicine、8巻、No.4(Suppl)、2002年; Wybranietz.W.Aら、Gene Therapy、8、1654〜1664、2001年; Niculescu-Duvazら、Curr.Opin.Mol.Therapy、1、480.486、1999年; Koyamaら、Cancer Gene Therapy、7、1015〜1022、2000年; Rogersら、Human Gene Therapy、7、2235〜2245、1996年; Lockettら、Clinical Cancer Res、3、2075〜2080、1997年; Vijayakrishnaら、J.Pharmacol.And Exp.Therpeutics、304、1280〜1284、2003年。

【0105】

好適実施態様にて使用できるであろうサイトカインは、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＣＳＦ、インターフェロン−ガンマである；Gene Therapy、Advances in Pharmacology、40巻、編集者：J.Thomas Augsut、Academic Press; ZhangとDegroot、Endocrinolgy、144、1393〜1398、2003年; Descampsら、J.Mol.Med、74、183〜189、1996年; Majumdarら、Cancer Gene Therapy、7, 1086〜1099、2000年。

【0106】

好適実施態様にて使用できるであろうアポトーシス誘導遺伝子は、例えばデコリン（decorin): Tralhaoら、FASEB J、17、464〜466、2003年；網膜芽細胞種９４：Zhangら、Cancer Res、63、760〜765、2003年; BaxとBad: Zhangら、Hum.Gene Ther、20、2051〜2064、2002年；アポプチン（apoptin）：NotebornとPietersen、Adv.Exp.Med.Biol、465、153〜161、2000)；ＡＤＰ：Tothら、Cancer Gene Therapy、10、193〜200、2003年; bcl-xs: Sumantranら、Cancer Res、55、2507〜2512、1995年；Ｅ４ｏｒｆ４：BraithwaiteとRussell、Apoptosis、6、359〜370、2001年；ＦａｓＬ、Ａｐｏ−１およびＴｒａｉｌ：Boehringer Manheim、Guide to Apoptotic Pathways、Araiら、PNAC、94、13862〜13867、1997年、Bims; Yamaguchiら、Gene Therapy、10、375〜385、2003年; GNR163: Oncology News、17 Juni、2000年、がある。

【0107】

好適実施態様にて使用できるであろう腫瘍抑制遺伝子は、例えばＥ１Ａ、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ＭＤＡ−７がある。Opalkaら、Cell Tissues Organs、172、126〜132、2002年、Jiら、Cancer Res、59、3333〜3339、1999、Suら、Oncogene、22, 1164〜1180、2003年。

【0108】

好適実施態様にて使用できるであろう血管新生インヒビターは、例えばエンドスタチン、アンギオスタチン：Hajitouら、FASEB J、16, 1802〜1804、2002年およびVEGFに対する抗体がある(Ferrara、N、Semin Oncol 2002 Dec; 29(6 Suppl 16): 10−4。

【0109】

好適実施態様にて使用できるであろう金属プロテアーゼインヒビターは、例えばTimp-3、Ahonenら、Mol Therpy、5、705〜715、2002年; PAI-1; Soffら、J.Clin.Invest、96、2593〜2600、1995年; Timp-1、Brandt K.Curr.Gene Therapy、2、255〜271、2002年がある。

【0110】

本願に関して用いられるようなｓｉＲＮＡ（short interfering（短干渉）ＲＮＡ）は塩基相補正により相互にハイブリダイゼーションする、即ち実質的に塩基が対を成しており、好ましくは最長５０ヌクレオチド、好ましくは１８〜３０ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチド未満、そして最も好ましくは２１、２２もしくは２３ヌクレオチドの長さを有する２つのＲＮＡ鎖、好ましくは分離した２つのＲＮＡ鎖からなり、ここでそれらの特徴は単鎖のｓｉＲＮＡであり、特に鎖、より特には第二の単鎖とハイブリダイゼーションしてそれと塩基対合する長さが伸長した単鎖である。ｓｉＲＮＡは、特異的にｍＲＮＡの分解を誘導または媒介する。この時必要な特異性は、ｓｉＲＮＡの配列とその結合部位から提供される。分解対象となる標的配列は第一または第二のｓｉＲＮＡ形成鎖に対し実質的に相補的である。正確な作用様式は不明であるが、ｓｉＲＮＡは細胞が発生中にある特的の遺伝子座を阻害し、ウイルスからそれを保護するための生物学的戦略であると想定される。ｓｉＲＮＡを介したＲＮＡ干渉は、タンパク質の特異的抑制に、または遺伝子特異的二本鎖ＲＮＡを導入することによるタンパク質発現の完全なノックアウトにも用いられる。高等生物では、１９〜２３ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡは特に、非特異的な防御反応、いわゆるインターロイキン反応の活性化をもたらさないので特に好ましい。３‘末端に対称的な２−ｎｔ長のオーバーハングを有する２１ヌクレオチドから成る二本鎖ＲＮＡを迅速にトランスフェクションすることにより、哺乳動物細胞にＲＮＡ干渉を伝達でき、リボザイムやアンチセンス分子といった他技術に比べて高い効率を得ている（Elbashir、S.Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin、A. Weber K Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells、Nature 2001年、411: 494〜498）。標的遺伝子の発現を阻害するのに必要なＲＮＡ分子は極めて小数であった。特にｓｉＲＮＡ分子の一過性の干渉現象、および特異的配送特性を有するｓｉＲＮＡが外部からの投与に限定されないようにするために、先行技術では内因性のｓｉＲＮＡを発現できるベクターを使用している。例えば、センスおよびアンチセンス両方向の、ベクター内に導入される例えば９ヌクレオチド長のスペーサー配列により隔てられた、１９ヌクレオチド長の標的配列を含む６４ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが提供されている。得られた転写体は、例えば１９塩基対のステム構造を持つヘアピン構造に折りたたまれた。ループは細胞内で迅速に分解し、その結果機能的なｓｉＲＮＡが生成する（Brummelkampら、Science、296、550〜553、2002年）。

【0111】

ｐＲｂおよびＥ２Ｆそれぞれの活性は、リン酸化によって制御されている。低リン酸化型のｐＲｂは主にＧ１期とＭ期に存在している。これに対し、高リン酸化型のｐＲｂはＳ期とＧ２期に存在している。Ｅ２Ｆは、Ｅ２Ｆと低リン酸化型ｐＲｂから成る複合体から、ｐＲｂのリン酸化によって放出される。Ｅ２Ｆと低リン酸化型ｐＲｂより成る複合体からＥ２Ｆが放出されると、Ｅ２Ｆ依存遺伝子の転写が起こる。Ｅ１Ａタンパク質は低リン酸化型ｐＲｂに結合するだけでなく、その時はＥ１Ａタンパク質のＣＲ２領域を介したＥ１ＡとｐＲｂとの結合も普通に起こっている。さらに、それはＣＲ１領域にも、より低い親和性で結合する（Ben-IsraelとKleiberger、Frontiers in Bioscience、7、1369〜1395、2002年; HeltとGalloway、Carcinogenesis、24、159〜169、2003年）。

【0112】

本発明に従って用いるアデノウイルスの実施態様に於いて、そのアデノウイルスの一部を成すＹＢ−１をコードする核酸はまた核内へのＹＢ−１の輸送を媒介する核酸配列を含んでもよい。発明による核酸、アデノウイルスおよびアデノウイルス系、ならびに例えばＯｎｙｘ−０１５、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０および欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のアデノウイルスといった当分野既知のアデノウイルスは、アデノウイルスおよびアデノウイルス系として、即ち対応する核酸として、上記の如くまたはこれに関連する発明の核酸と組み合わせて使用できる。核輸送を媒介するのに好適な核酸配列は当業者周知であり、例えば（Whittaker、G.Rら、Virology、246、1〜23、1998年; Friedberg、E.C、TIBS 17、347、1992年; Jans、D.Aら、Bioessays 2000年6月; 22(6): 532〜44; Yoneda、Y、J.Biocehm.(Tokyo)1997年5月; 121(5): 811〜7; Boulikas、T、Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.1993; 3(3): 193〜227; Lyons RH、Mol.Cell Biol、7、2451〜2456、1987年）に記載されている。核輸送媒介核酸配列に関連して様々な原理を利用できる。この様な原理の一つは、ＹＢ−１をシグナルペプチドとの融合タンパク質の形で形成して核内に導入すること、およびそれにより本発明のアデノウイルスの複製が起こることである。

【0113】

発明に使用するアデノウイルスのデザインを実現するであろう別の原理は、好ましくは細胞質での合成から始まってＹＢ−１を細胞核内に誘導するか、またはＹＢ−１を細胞核内に移動して、そこでウイルス複製を促進するトランスポーター配列と一緒にＹＢ−１を与えることができる原理である。特に効果的な核輸送媒介核酸配列の例はＨＩＶのＴＡＴ配列であり、これはEfthymiadis、A、Briggs、LJ、Jans、DA、JBC 273、1623〜1628、1998年にその他好適核酸配列と共に記載されている配列である。発明に使用するアデノウイルスが核内輸送をコードするペプチドをコードしている核酸配列を含むことは、本発明の範囲内である。

【0114】

ＹＢ−１が完全長、特に野生型ＹＢ−１に対応する形態で存在することは、本発明の範囲内である。ＹＢ−１が、例えば短形または断頭形（truncated form）の様な誘導体として用いられること、または存在することは、本発明の範囲内である。本発明の範囲内で誘導体として用いられる、または存在するＹＢ−１は、Ｅ２−後期プロモーターに結合でき、その結果アデノウイルスＥ２領域の遺伝子発現を活性化できるＹＢ−１である。この種の誘導体は特に、本明細書に開示のＹＢ−１誘導体を含む。更なる誘導体は、アミノ酸配列のＮ−末端、Ｃ−末端または内部にある単独または複数個のアミノ酸を欠失することで作られるだろう。

【0115】

これまでに記したアデノウイルスがコードする各種の発現遺伝子および遺伝子産物に関しては、これらを組み合わせてコードすることも、また組み合わせて発現することもそれぞれ可能である。

【0116】

本明細書に開示されたアデノウイルスの医薬としての使用は、特に全身性の投与の場合に、アデノウイルスを適切にターゲティングすることにより改善できる。腫瘍細胞のアデノウイルスよる感染は、コサッキーウイルス−アデノウイルスレセプターＣＡＲおよびある種のインテグリンの存在に、ある程度依存する。これらが細胞内で、特に腫瘍細胞内で強く発現される場合は、感染は非常に低いタイター（pfu/細胞）で既に可能である。組換えアデノウイルスのいわゆるリターゲティングを得るために様々な戦略がこれまで実行されてきた。それは例えば非相同的配列のファイバーノブ領域への挿入、二重特異性抗体の使用、ポリマーによるアデノウイルスのコーティング、Ａｄファイバーへのリガンドの導入、血清型５ノブおよびファイバーのシャフトとノブの、それぞれ、血清型３ノブおよびＡｄ３５ファイバーのシャフトとノブによる置換、ならびにペントンベースの修飾、によるという戦略であった(Nicklin S. A. et al., Molecular Therapy 2001, 4, 534-542; Magnusson, M. K. et. al., J. of Virology 2001, 75, 7280-7289; Barnett B. G. et al., Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1575, 1-14)。そのようなさらなる実施態様および特徴を、本発明のアデノウイルスおよび本発明の種々の局面中で本発明に従って用いられるアデノウイルスに関連して、それぞれ実現することは本発明の範囲内である。

【0117】

本発明者は、さらに驚くべきことに、本明細書に記載するウイルス、特に本発明に従って用いられるウイルスの有効性を、少なくとも２つの薬剤と組み合わせて用いることにより増大させることができることを見出した。その場合、少なくとも２つの薬剤のそれぞれは、細胞増殖抑制薬を含む群より、個々におよび独立して選択される。

【0118】

本明細書の好ましい実施態様で用いられるように、細胞増殖抑制薬は特に化学的または生物学的化合物であって、それは細胞またはそのような細胞を含む生物への投与中にまたは投与後に、もはや成長していないおよび／またはもはや分裂していないおよび／または細胞分裂および／または細胞増殖が遅くなった細胞をもたらす。細胞増殖抑制薬は、前述のような細胞中のみでまたはそのような細胞を含む生物体中のみで細胞増殖抑制薬へ変化する化合物も含む。その限りにおいて、用語、細胞増殖抑制薬は、プレ細胞増殖抑制薬も含む。

【0119】

細胞増殖抑制薬は作用様式により群に分けられる。次の群に区別できるが、原則として、すべて本発明において用いることができる：

【0120】

− アルキル化剤、すなわち核酸およびタンパク質のリン酸、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシおよび水酸基のアルキル化により、細胞傷害作用を引き起こす化合物。そのような化合物はしばしばそれ自身が発ガン性である。細胞増殖抑制薬のこの群の代表例は、シス−プラチンおよびプラチン誘導体、シクロホスファミド、ダカルバジン、マイトマイシン、プロカルバジンである。

【0121】

− 代謝拮抗剤、すなわち、その構造類似性または結合能力により、代謝過程を妨害するか、代謝過程に影響する化合物。代謝拮抗剤の群の中では、構造上類似の代謝拮抗剤、構造を変化させる代謝拮抗剤および間接的に作用する代謝拮抗剤が区別される。構造上類似の代謝拮抗剤は、化学的な類似性により代謝物質と競合するが、代謝物質の機能は発揮しない。構造を変化させる代謝拮抗剤は代謝物質と結合してその機能または再吸収を妨げるか、または代謝物質を化学的に修飾する。間接的に作用する代謝拮抗剤は、例えばイオンの結合によって代謝物質の機能を妨害する。この群の代表例は、メトトレキサートなどの葉酸拮抗薬、フルオロウラシルなどのピリミジン類似体、アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン類似体である。

【0122】

− 有糸分裂インヒビター、すなわち細胞分裂を阻害する化合物。有糸分裂インヒビターの群の中では、細胞分裂毒素、紡錘体毒素および染色体毒素が区別される。この群の代表例は、タキサンおよびビンカアルカロイドである。タキサンを次に、タキソールおよびタキソテールの２つの主な群に分けることができる。特に好ましいタキソールはパクリタキセルであり、特に好ましいタキソテールはドセタキセルである。

【0123】

− ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに阻害作用を有する抗生物質。代表例は、例えばブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびマイトマイシンなどの、アントラサイクリンである。

【0124】

− トポイソメラーゼインヒビター、特にトポイソメラーゼＩインヒビター。トポイソメラーゼインヒビターは、３段階の過程によりＤＮＡの撚り回数の変化を触媒することにより、ＤＮＡの三次構造を決定する化合物である。基本的に、トポイソメラーゼの２つの形が区別される。Ｉ型のトポイソメラーゼは１つのＤＮＡ鎖のみを切断し、ＡＴＰに依存しないが、II型のトポイソメラーゼはＤＮＡの両方の鎖を切断し、その場合ＡＴＰに依存する。トポイソメラーゼＩインヒビターの典型例は、イリノテカンおよびトポテカンであり、そしてトポイソメラーゼ II インヒビターの典型例はエトポシドおよびダウノルビシンである。

【0125】

本発明の範囲内で、前述の群から少なくとも１つの、また好ましくは２つの薬剤が選択される。しかし、特に、３つ、４つまたは５つの種々の薬剤が選択されるのもまた、本発明の範囲内である。ウイルスと共に２つの薬剤だけを用いる本発明の実施態様について、次の意見を述べる。これらの考察は、２つを越える薬剤を用いる場合の実施態様にもまた、基本的に適用可能である。

【0126】

薬剤は、異なる標的分子を対象にするまたは標的とする、あるいは異なる分子を標的とすると文献に記載されている、というように、互いに異なっていることが好ましい。薬剤が、同じ標的分子に結合する２つ以上の異なる薬剤を含むのもまた、本発明の範囲内である。さらに、１つの薬剤が標的分子の第１の部位へ結合し、第２の薬剤が標的分子の第２の部位へ結合するのも本発明の範囲内である。

【0127】

少なくとも薬剤の２つが異なる作用様式を用いて活性を及ぼすのもまた本発明の範囲内である。好適実施態様において、活性を及ぼすとは、化合物の細胞増殖および／または細胞分裂を阻害または遅延する作用が異なる作用機構によって仲介されることを意味する。特に好ましい実施態様において、用語活性を及ぼすとは、ウイルス、特に、本発明に従うウイルス、本明細書に記述されているウイルス、および本発明に従って用いられるウイルス、の複製効率が、薬剤の１つおよび／または両方が使用されない場合と比較して増大していることを意味する。ウイルスの複製の効率の尺度として、好ましくは細胞溶解に必要なウイルスの数が用いられ、好ましくはpfu/細胞として表現される。

【0128】

特に好適な実施態様では、少なくとも２つの薬剤の少なくとも１つが、ウイルスの複製が起きる細胞の、好ましくは選択的な様式で起きる細胞の、好ましくは本明細書に記述したウイルスによるおよび／または本発明に従って用いられるウイルスによる感染力を増大させる薬剤である。これは、例えば細胞によるウイルスの取り込みを増大させることにより行うことができる。ウイルスの取り込みは、特にアデノウイルスは、例えばコクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）によって仲介される (Mizuguchi and Hayakawa, GENE 285, 69-77, 2002)。ＣＡＲの増大した発現が、例えばトリコスタチンＡにより引き起こされる (Vigushin et al., Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001)。

【0129】

さらなる実施態様では、少なくとも２つの薬剤の１つは、細胞内の成分の有効性を増大するものであり、その場合、成分はウイルス、好ましくは本明細書に記述したウイルス、および／または本発明に従って用いられるウイルス、の複製を増加させる成分である。

【0130】

さらなる実施態様では、少なくとも２つの薬剤のうちの１つは、核の中へのＹＢ−１の輸送を仲介するものである。そのような薬剤を、トポイソメラーゼインヒビター、アルキル化剤、代謝拮抗剤、および有糸分裂インヒビターを含む群より選択することができる。好ましいトポイソメラーゼインヒビターは、カンプトテシン、イリノテカン、エトポシド、およびそれぞれの類似物質である。好ましい有糸分裂インヒビターは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびドセタキセルである。好ましいアルキル化剤はシスプラチンおよびそれらの類似物質である。好ましい代謝拮抗剤は、フルオロウラシルおよびメトトレキサートである。

【0131】

特に好ましい実施態様では、少なくとも２つの薬剤の１つは細胞の感染力、特にＣＡＲの発現、を増大させるものであり、また少なくとも２つの薬剤の２番目は、核の中へのＹＢ−１の輸送を増大させるものであり、その場合好ましくは化合物として、好ましくは上述のようなそれぞれの必要な特性を示す化合物を用いる。

【0132】

さらなる実施態様では、少なくとも２つの薬剤の１つはヒストンデアシラーゼインヒビターである。好ましいヒストンデアシラーゼインヒビターは、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４およびＰＸＤ１０１を含む群より選択されるものである。トリコスタチンＡは、例えば Vigushin et al., Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001 に記載されており；ＦＲ９０１２２８は、例えば Kitazono et al., Cancer Res., 61, 6328-6330, 2001 に記載されており；ＭＳ−２７−２７５は、Jaboin et al., Cancer Res., 62, 6108-6115, 2002 に記載されており；ＰＸＤ１０１は、Plumb et al., Mol. Cancer Ther., 8, 721-728, 2003 に記載されており；ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４は、Atadja et al., Cancer Res., 64, 689-695, 2004 に記載されている。

【0133】

なお更なる実施態様では、少なくとも２つの薬剤の１つがトポイソメラーゼインヒビター、好ましくはトポイソメラーゼＩインヒビターである。好ましいトポイソメラーゼインヒビターは、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＤＸ−８９５Iｆおよびダウノルビシンを含む群より選択されるものである。イリノテカンおよびＳＮ−３８は、例えば Gilbert et al., Clinical Cancer Res., 9, 2940-2949, 2003 に記載されており；ＤＸ−８９５ＩＦは、van Hattum et al., British Journal of Cancer, 87, 665-672, 2002 に記載されており；カンプトテシンは、Avemann et al., Mol. Cell. Biol., 8, 3026-3034, 1988 に記載されており；９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンは、Rajendra et al., Cancer Res., 63, 3228-3233, 2003 に記載されており；ダウノルビシンは、M. Binaschi et al., Mol. Pharmacol., 51, 1053-1059 に記載されている。

【0134】

特に好ましい実施態様では、少なくとも２つの薬剤のうちの１つはヒストンデアシラーゼインヒビターであり、少なくとも２つの薬剤のうちの他の１つはトポイソメラーゼインヒビターである。

【0135】

ある実施態様では、本発明による手段および／または本発明によって準備される手段は、本発明に従ってウイルスと組み合わせた少なくとも２つの薬剤のうちの１つまたはいくつかから分離されているウイルスを含む。ウイルスは、ウイルスと組み合わせたいずれの薬剤からも分離されていることが好ましい。好ましくは、その分離は空間的分離である。空間的分離は、ウイルスが薬剤とは異なる包装中に存在するような状態であってよい。好ましくは、包装は１回投与単位であり、すなわち、ウイルスおよび薬剤を単一の用量または１回量として包装する。単回投与単位は、順に包装を作るために組み合わせてもよい。しかし、ウイルスの単一用量が、１つまたはいくつか薬剤の１つまたはいくつかの単一用量と組み合わせられるか、それと一緒に包装されることは、本発明の範囲内である。

【0136】

包装の種類は、当業者に既知の投与の方法に依存する。好ましくは、ウイルスは、凍結乾燥された形で、または適当な液相中に存在することになる。好ましくは、薬剤は、例えば錠剤またはカプセル剤として固体の形で存在することになるが、それに制限されない。あるいは、薬剤は液体の形でも存在することができる。

【0137】

全身的にまたは局所的にウイルスを投与することは、本発明の範囲内である。さらに、ウイルスと組み合わせた薬剤を全身にまたは局所的に、個々におよび互いに独立して、または一緒に投与することも本発明の範囲内である。投与の他の様式は当業者に既知である。

【0138】

ウイルスおよびそれと組み合わせた薬剤を時間を隔てる様式で、または同時に投与することもまた、本発明の範囲内である。時間を隔てる様式に関しては、薬剤はウイルスの投与に先立って投与することが好ましい。ウイルスにどれくらいの時間先立って薬剤を投与するかは、用いる薬剤の種類に依存し、当業者には使用する薬剤の作用様式から明白である。さらに少なくとも２つの薬剤の投与を、同時にまたは異なる時点で行うことができる。時間的に異なる投与に関して、その時点は、再び薬剤の根底にある作用様式に起因するものであり、それに基づいて当業者によって決定される。

【0139】

上記の考察は、医薬組成物としても本明細書に開示され、参照されている本発明による医薬に関連して示したが、ウイルスの複製に使用される、好ましくは本発明によるウイルスのインビトロの複製に使用される組成物を含む任意の組成物に、概して適用可能である。上記の考察はまた、本発明によるキットおよび本発明に従って用いられるキットにそれぞれ適用可能であり、それは本明細書に記述したウイルスおよび本発明に従って用いられるウイルスとは別に、本明細書に記述される１つの薬剤または薬剤の組合せもさらに含む。そのようなキットは、ウイルスおよび／またはすぐに使用できる形の１つまたはいくつかの薬剤、および好ましくは使用指示書を含む。更に、上記の実施態様は、さらに本明細書に開示される核酸および本発明に従って用いられる核酸、ならびに本発明による複製システムおよびそれをコードする核酸、ならびに、それぞれ本発明に従って用いられる複製システムおよび本発明に従って用いられるそれをコードする核酸にも当てはまる。

【0140】

アデノウイルスおよびアデノウイルス系という用語は、本発明内では実質的に同一の意味を持つものとする。アデノウイルスは特にカプシドおよび核酸を含む完全なウイルス粒子を意味するものとする。アデノウイルス系という用語は特に、核酸が野生型に対し変更されている事実に焦点を当てるものである。この種の変更は、プロモーター、制御配列および／またはオープンリーディングフレームといったコーディング配列の欠失および／または付加および／または突然変異に起因する、アデノウイルスゲノムの構造変化を含むことが好ましい。さらに、用語アデノウイルス系は、例えば遺伝子治療に用いられるベクターと結びつけて使用するのが好ましい。

【0141】

前述のコメントは、アデノウイルスおよびアデノウイルス系それぞれの使用ならびにデザインを含め、コーディング核酸にも当てはまり、またその逆も言える。

【0142】

本発明に関しては、本発明に使用するアデノウイルスおよびそれをコードする核酸それぞれは、かかる複製をもたらす、または別の核酸配列と組み合わせての複製をもたらすようないずれかのアデノウイルス核酸である。本明細書に説明したように、複製に必要な配列および／または遺伝子産物はヘルパーウイルスを利用して提供することができる。コーディング核酸配列と称するものであれば、そしてかかる核酸配列が既知であるものであれば、使用した配列と同一のものだけでなく、それより派生する配列もまた発明の範囲内である。この派生する配列という用語は、本明細書に於いては特に、非派生配列の機能に対応する機能を示す核酸またはポリペプチドである、遺伝子産物を依然として生ずる配列を意味する。このことは、当業者既知である簡単な通常試験により決定できる。かかる派生核酸配列の例は、同一遺伝子産物、特には同一アミノ酸配列をコードしているものの、遺伝子コードの縮重による異なる塩基配列を有しているものである。

【0143】

好適実施態様に於いて、本発明のアデノウイルスおよび本発明のアデノウイルス複製系、そして本発明でのそれらの使用に関してはそれぞれ、アデノウイルス核酸は発ガン遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質の発現を欠失しており、このことはそれが１２ＳのＥ１Ａタンパク質もしくは１３ＳのＥ１Ａタンパク質をコードしていないか、またはそれが１２ＳのＥ１Ａタンパク質と１３ＳＥ１Ａタンパク質のどちらもコードしていないか、または本明細書に記載のように修飾されていることを意味しており、そしてアデノウイルス複製システムがさらにヘルパーウイルスの核酸を含み、このヘルパーウイルスの核酸が発ガン遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列を含み、さらにヘルパーウイルスの核酸が次の特徴を有すると同時にアデノウイルスに対し同特性を付与すること、即ちＹＢ−１核陰性細胞では複製しないが、ＹＢ−１核陽性細胞では細胞周期と無関係に細胞内で複製し、少なくとも１つのウイルス遺伝子、特にはＥ１Ｂ５５kDa、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３および／またはＥ３ＡＤＰをトランス活性化し、そして／または細胞質ＹＢ−１を核内に移動しないという特性を付与することを意味する。ここに記したトランス遺伝子をヘルパーウイルスが個別または一緒にコードしていること、および／またはそれから発現することは本発明の範囲内である。

【0144】

本発明のこの様なアデノウイルス複製系の実施態様の一つでは、アデノウイルス核酸および／またはヘルパーウイルスの核酸は、さらに複製可能であるベクターとしても存在する。

【0145】

本発明に用いるアデノウイルスをコードするコーディング核酸配列がベクター内、好ましくは発現ベクター内に存在すること、そしてこの発現ベクターを本発明に従って使用することは、本発明の範囲内である。

【0146】

別の局面では本発明はさらに少なくとも２つのベクターを含むベクター群に関し、この場合上記ベクター群がここに記したアデノウイルス複製系を共に含んでおり、そして上記ベクター群は本発明に従い用いられる。アデノウイルス複製系の各構成成分は、個々のベクター、好ましくは発現ベクター内に配置されると解釈される。

【0147】

最後に、本発明はアデノウイルスについてここに記した同一の目的に関する細胞の使用についての別の局面に関するものであり、その場合細胞は発明に使用するここに記したアデノウイルスをコードする１または複数の核酸、および／または本発明による各アデノウイルス複製系、および／または各ベクターおよび／もしくはベクター群を含む。

【0148】

前記アデノウイルス構築体ならびに特にそれらの核酸およびそれをコードする核酸もまた細胞内、好ましくは腫瘍細胞に一部分導入してもよく、その場合各種個別構成成分が存在していることにより、それらはあたかも各構成成分は単一核酸および単一または複数のアデノウイルスに由来するように一つになって作用するだろう。

【0149】

発明に使用するアデノウイルス、アデノウイルス系、またはその一部分をコードする核酸は、ベクターとして存在するだろう。好ましくは、それらはウイルスベクターとして存在する。アデノウイルス核酸を含む核酸の場合、ウイルス粒子がベクターであることが好ましい。しかし、上記核酸がプラスミドベクター内にある場合も発明の範囲内である。いずれの場合も、ベクターは挿入した核酸の増幅、即ち挿入核酸の複製および場合によっては発現、それらの制御をもたらすそれぞれの要素を含んでいる。好適ベクター、特に発現ベクター、および対応する要素は当業者に周知であり、例えばGrunhaus, A、Horwitz, M.S、1994年、Adenoviruses as cloning vectors.In Rice, C.編集、Seminars in Virology, London: Saunders Scientific Publicationsに記載されている。

【0150】

ベクター群に関する発明の局面は、核酸の各種要素が必ずしも１つのベクターに含まれている必要がないという前述の実施態様に対応するものである。この場合、ベクター群は少なくとも２種類のベクターを含む。それ以外のことは、ベクターに関連して既に述べた事柄がベクターおよびベクター群にそのまま当てはまる。

【0151】

発明に用いられるアデノウイルスは、ここに開示した各種核酸および遺伝子産物により特徴付けられ、そしてそれ以外に含まれる要素は野生型のアデノウイルスと同様であり、全てが当業者周知である（Shenk、T.: Adnoviridae: The virus and their replication.Fields Virology、第三版、編集、Fields, B.N.、Knipe, D.M.、Howley, P.M.ら、Lippincott-Raven Publishers、Philadelphia、1996年、67章）。

【0152】

アデノウイルスの複製は極めて複雑な過程であり、一般にはヒト転写因子Ｅ２Ｆを利用する。ウイルス感染に際しては、まず「初期遺伝子」Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４が発現する。「後期遺伝子」群はウイルスの構造タンパク質の合成を担っている。初期および後期遺伝子両方の活性化に関しては、異なるＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードしている２つの転写単位Ｅ１ＡとＥ２Ａから成るＥ１領域が重要であるが、それはＥ２、Ｅ３およびＥ４がそれらにより誘導されるからである（Nevins、J.R.Cell 26、213〜220、1981年）。更にＥ１Ａタンパク質は休止細胞にＤＮＡ合成を誘導してＳ期に入らせることができる（上記BoulangerとBlair、1991年）。さらにそれらはＲｂクラスの腫瘍抑制因子と相互作用する（Whyte, P.ら、Nature 334、124〜127、1988年）。そうすると、細胞質転写因子であるＥ２Ｆが放出される。Ｅ２Ｆ因子は次に細胞遺伝子ならびにウイルス遺伝子の対応するプロモーター領域に結合し（特にアデノウイルスＥ２初期プロモーター）、転写および翻訳を開始させるだろう（Nevins、J.R.Science 258、424〜429、1992年）。

【0153】

Ｅ２領域の遺伝子産物は３種類の必須タンパク質をコードしていることから、それらは複製開始とその遂行に特に必要である。Ｅ２タンパク質の転写は２種類のプロモーター、ここではＥ２−初期プロモーターもしくは初期Ｅ２プロモーターとも呼ばれる「Ｅ２−初期Ｅ２Ｆ−依存」プロモーター、および「Ｅ２−後期」プロモーターにより制御されている（SwaminathanとThimmapaya、The Molecular Repertoire of Adnoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology、199巻、177〜194、Springer Verlag 1995年）。さらに、Ｅ４領域の産物は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ−５５kDaタンパク質と一緒になり、それぞれＥ２Ｆの活性およびｐ５３の安定性にとって重要な役割を果たす。例えば、Ｅ４領域にコードされているＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質がＥ２ＦおよびＤＰ１から成るヘテロダイマーとの直接相互作用によってプロモーターはより活性化される（SwaminathanおよびThimmapay、JBC 258、736〜746、1996年）。更にｐ５３は、Ｅ１Ｂ−５５kDaとＥ４ｏｒｆ６から成る複合体により不活性化され（Steegenga, W.T.ら、Oncogene 16、349〜357、1998年）、溶解性の感染周期が成功して終了する。さらにＥ１Ｂ−５５kDaタンパク質は、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質と相互作用してウイルスＲＮＡの核外への運び出しを促進することからも更に重要な機能を果たしているが、この場合細胞固有のＲＮＡは核内に維持される（BridgeおよびKetner、Virology 174、345〜353、1990年）。更に重要な発見は、Ｅ１Ｂ−５５kDa／Ｅ４ｏｒｆ６から成るタンパク質複合体がいわゆる「ウイルス封入体」内に局在していることである。このことから、これら構造体が複製および転写部位であることが推測される（OrnellesおよびShenk、J.Virology 65、424〜429、1991年）。

【0154】

複製にとって重要である、特にアデノウイルスの放出に関し重要である別の領域はＥ３領域である。Ｅ３領域は、より具体的にはインビトロでのアデノウイルス感染周期にとって必須ではない、即ち細胞培養に必須ではない比較的小型の各種タンパク質に関する遺伝情報を含んでいる。しかしそれらは特に免疫制御およびアポトーシス機能を有していることから、インビボでの急性期および／または潜伏感染期間中のウイルスの生存にとって重要な役割を果たしている（Marshall S.Horwitz、Virololgie、279、1〜8、2001年; Russell、上記）。約１１．６kDaの大きさを持つタンパク質が細胞死を誘導することが示されている。このタンパク質は、その機能故にＡＤＰ−英語でアデノウイルス致死タンパク質（Adenovirus death protein）−と呼ばれている（Tollefson、J.Virology、70、2296〜2306、1996年）。このタンパク質は主に感染周期の後期に形成される。さらに、このタンパク質の過剰発現は感染細胞をより溶解する（Doroninら、J.Virology、74、6147〜6155、2000年）。

【0155】

更に、本発明者はＥ１Ａ欠失ウイルス、即ち具体的には１２ＳのＥ１Ａタンパク質を持たず、そして１３ＳのＥ１Ａタンパク質を発現しないウイルスが、より高いＭＯＩで極めて効率的に複製できることを知った（Nevins J.R.Cell 26、213〜220、1981年）が、しかしこのことを臨床的に応用できなかった。この現象は文献の中では「Ｅ１Ａ−様活性」と呼ばれている。さらにＥ１Ａがコードする５種類のタンパク質の内２種類のタンパク質、即ち１２Ｓおよび１３Ｓタンパク質が、それぞれ他のアデノウイルス遺伝子の発現を制御および誘導することも分かった（Nevins, J.R.Cell 26、213〜220、1981年; Boulanger、P.およびBlair, E.; Biochem.J.275、281〜299、1991年）。これに関連して、トランス活性化機能が主に１３Ｓタンパク質のＣＲ３領域から提供されるものであることが示された（Wong HKおよびZiff EB.J Virol.、68、4910〜20、1994年）。１３Ｓタンパク質のＣＲ１および／またはＣＲ２領域、および／またはＣＲ３領域を特異的に欠失したアデノウイルスは、大部分が複製欠失であるが、それでも一部の細胞株ではウイルス遺伝子をトランス活性化し、それぞれ特にＥ２領域を促進する（Wong HKおよびZiff EB.J Virol.、68、4910〜20、1994年; Mymryk, J.S.およびBayley, S.T.、Virus Research 33、89〜97、1994年）。

【0156】

野生型アデノウイルスを細胞、一般的には腫瘍細胞に感染させると、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６が介在してＹＢ−１が核内に誘導され、ウイルス封入体の中に核内のＥ１Ｂ−５５Ｋと共に局在するようになり、それがインビトロおよびインビボの両方での細胞核内に於けるウイルスの効率的複製を可能にする。これに関連して、Ｅ４ｏｒｆ６がＥ１Ｂ−５５Ｋに結合すること（Weigel, S.およびDobbelstein, M.J. Virology、74、764〜772、2000年; Keith N.Leppard、Seminars in Virology、8、301〜307、1998年）、およびそれがＥ１Ｂ−５５Ｋの核内への運び込みと分布とを媒介し、それによりそれぞれ最適なウイルス産生とアデノウイルス複製が提供されることが初期に既に見出されていた。本発明の効率的なウイルス複製は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＹＢ−１間の相互作用によって、そして、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４ｏｒｆ６とＹＢ−１とから成る複合体によって、およびＹＢ−１と核内のＥ１Ｂ−５５Ｋが、いわゆるウイルス封入体内に同時に局在することによって、ならびに個々に記したウイルスのＹＢ−１核陽性細胞での複製に使用することによって、およびＹＢ−１核陽性細胞が関係する疾患の治療を目的とした医薬の製造に使用することによって可能となる。この様な細胞の背景により可能となった複製は、細胞溶解、ウイルスの放出、および近接細胞の感染および溶解をもたらし、結果として腫瘍細胞および腫瘍に感染した場合には、それぞれ腫瘍の最終的な溶解、即ちガン溶解が起こる。

【0157】

ＹＢ−１は逆位ＣＡＡＴ配列、いわゆるＹ−ボックスに結合する保存性の強い因子の群に属する。それらは転写ならびに翻訳両レベルにおいて通常の様式で活性化する（Wolffe, A.P.Trends in Cell Biology 8、318〜323、1998年）。活性化によりＹ−ボックス依存制御経路の数が増加することが見出されているが、増殖およびアポトーシス関連遺伝子の阻害時でも数が増加することが見出されている（Swamynathan、S.K.ら、FASEB J.12、515〜522、1998年）。従って、ＹＢ−１はｐ５３と直接相互作用しており（Okamoto、T.ら、Oncogene 19、6194〜6202、2000年）、Ｆａｓの遺伝子発現（Lasham, A.ら、Gene 252、1〜13、2000年）、ＭＤＲおよびＭＲＰ遺伝子発現（Stein, U.ら、JBC 276、28562〜69、2001年; Bargou, R.C.ら、Nature Medicine 3、447〜450、1997年）ならびにトポイソメラーゼおよび金属プロテアーゼの活性化（Mertens.P.R.ら、JBC 272, 22905〜22912、1997年; Shibao, L.ら、Int.J.Cancer 83、732〜737、1999年）に於いて重要な役割をはたしている。従って、ＹＢ−１はｍＲＮＡの安定性の制御（Chen, C-Y.ら、Genes & Development 14、1236〜1248、2000年）および修復プロセス（Ohga, T.ら、Cancer Res.56、4224〜4228、1996年）に関係している。

【0158】

腫瘍細胞でＹＢ−１が核内に局在することにより、特に１２ＳのＥ１Ａタンパク質および１３ＳのＥ１Ａタンパク質の両方ともが発現形態で存在しないかそして用いられない例（Holm, P.S.ら、JBC 277、10427〜10434、2002年）、および多剤耐性（多重耐性）でのタンパク質ＹＢ−１の過剰発現の例ではＥ１Ａ独立にウイルス複製が起こる。更に、例えばＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ−５５Ｋの様なアデノウイルスタンパク質はウイルス複製に対し有利な影響を及ぼし（Goodrum, F.D.およびOrnelles, D.A、J.Virology 73、7474〜7488、1999年）、この時機能的Ｅ１Ａタンパク質は他のウイルスの遺伝子産物（Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ３ＡＤＰおよびＥ１Ｂ−５５Ｋの様な）のスイッチングに関係していること（Nevins J.R.、Cell 26、213〜220、1981年）が知られている。しかしこの様なことは１３ＳのＥ１Ａが存在しない先行技術のＥ１Ａ−マイナスアデノウイルスでは起こらない。ＹＢ−１が核内に存在する多剤耐性細胞でのＹＢ−１核内局在は、Ｅ１Ａ−マイナスウイルスに複製および粒子形成を提供する。しかしこの場合、ウイルス複製および粒子形成の効率は、野生型のＡｄ５に比べると数倍低い。腫瘍細胞の核内に既に存在しているＹＢ−１と、または外部因子（細胞増殖抑制薬または放射線、または高温を作用させる）により腫瘍細胞内に誘導した、即ち特に細胞周期とは無関係に核内への存在を促すか、またはベクターを使ってトランス遺伝子として導入したＹＢ−１と、アデノウイルス遺伝子を始動するが、ウイルスの複製は行わない系、好ましくはアデノウイルス系とを組み合わせると、驚くべきことにＹＢ−１を通じてシステムが極めて効率的にウイルスの複製と粒子を形成し、ガン溶解を誘導した。とりわけても好適な細胞増殖抑制薬は次の群に属するものである：ダウノマイシンおよびアドリアマイシンといったアントラサイクリン類；シクロホスファミドのようなアルキル化剤；エトポシドの様なアルカロイド；ビンクリスチンおよびビンブラスチンの様なビン−アルカロイド；例えば５−フルオロウラシルおよびメトトレキセートの様な代謝拮抗剤；例えばシス−プラチンの様な白金誘導体；カンホテシンの様なトポイソメラーゼインヒビター；および例えばタキソールの様なタキサン類である。ここに開示した、ＹＢ−１核陽性細胞内でのみ複製できるアデノウイルス、特に組換え体アデノウイルスは、ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ−５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３およびＥ４ＡＤＰをトランス活性化するそれらの能力は、野生型アデノウイルス、特に野生型Ａｄ５の持つ同様のトランス活性化能力に比べ制限されている。本発明者は、今回驚くべきことにこれら制限された活性化能力が対応する遺伝子によって、特にＹＢ−１の核内局在と組み合わせて発現されるＥ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６によって補完されることを見出した。本明細書の実施例に示す様に、ウイルス複製および粒子形成は共にこの様な条件では野生型アデノウイルスの複製および粒子形成にほとんど匹敵するレベルまで増加する。

【0159】

ここに記したアデノウイルスと結びつけた医薬、またはここに記したアデノウイルスを本発明に従い使用し製造される医薬は一般的には全身投与されるものと解釈されるが、かかる医薬を局所に適用するか、または配送することも本発明の範囲である。かかる使用は、本発明の医薬を使用する診断および／または予防および／または治療を目的として、特にある状態、典型的には疾患の形成に関係する細胞に上記アデノウイルスで感染すること、および特にそれら細胞内で複製すること意図して、好ましくは随時に行われる。

【0160】

かかる医薬は、好ましくは腫瘍疾患の処置に用いられる。腫瘍疾患の中では、腫瘍疾患の基礎を成すメカニズム、特に病理学的メカニズムによってＹＢ−１が既に核内に局在している腫瘍、または外的手段により核内にＹＢ−１が生じている腫瘍が特に好ましく、この場合の手段はＹＢ−１を核内に運搬する、またはＹＢ−１を核内に誘導する、またはＹＢ−１を核内で発現するのに好適なものである。本明細書で使用する場合、腫瘍または腫瘍疾患という用語は、悪性および良性腫瘍の両方、ならびに各疾患を含むものとする。医薬はさらに少なくとも１つの医薬的に活性な化合物を含むものとする。かかる追加の医薬的に活性な化合物の種類および量は、かかる医薬が用いられる適用に依存する。医薬を腫瘍疾患の治療および／または予防に用いる場合、具体的にはシスプラスチンおよびタキソール、ダウノブラスチン、ダウノルビシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、および／もしくはミトキサントロンのような細胞増殖抑制薬、またはここに記したその他の細胞増殖抑制薬あるいは細胞増殖抑制薬の群を使用する。

【0161】

本発明の医薬は様々な製剤形状に存在でき、液体形状が好ましい。更に、医薬は安定化剤、緩衝剤、保存剤、および医薬製剤分野当業者に周知であるこの種の作用剤を含むだろう。

【0162】

本発明者は驚くべきことに、ここに記載のウイルスを発明に従い、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を持つ腫瘍に対し極めて高い成功率で応用できることを見出した。一般にＹＢ−１は細胞質内、特に核周囲の原形質内に存在する。細胞周期のＳ期の間は、ＹＢ−１は正常細胞および腫瘍細胞両方の細胞核内に見出すことができる。しかしそれは修飾型アデノウイルスを用いたウイルスによるガン溶解を誘導するには十分ではない。この様な不良な結果は、先行技術に記載のこの種の弱毒化アデノウイルスの効率が比較的低いことに起因している。換言すれば、ここに記載の弱毒化または修飾型ウイルスを投与する際に、ウイルス性のガン溶解に必要な分子生物学的条件を与えさえすれば、かかるアデノウイルス系を使用する、特に高い効率で使用することができる。ここに記載様に、発明に従って用いられるＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０および欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載の組換え体アデノウイルスといったアデノウイルスの場合は、上記条件は腫瘍疾患の例ではＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核局在する細胞に与えられる。このタイプの核内局在は、腫瘍細胞そのものに起因するものでも、またはここに記した発明による手段または薬物により誘導してもよい。即ち本発明は、発明のウイルス、特に先行技術に既に記載されている弱毒化または修飾型アデノウイルスを用いて良好に処置できる新規腫瘍および腫瘍疾患群、さらには患者を画定する。

【0163】

その一部は周知であり、そして本発明により治療可能であるアデノウイルスを用いて、または本明細書に初めて記載されたアデノウイルス、具体的にはＥｑＡタンパク質内に突然変異および欠失を有するが、Ｒｂ／Ｅ２ｆの結合を妨害せず、そしてＹＢ−１核陰性細胞では複製しないアデノウイルス、または本明細書内に規定された大きな複製低下を示し、および／または欠失型発ガンタンパク質、特にＥ１Ａを有する、例えばウイルスＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のアデノウイルスを用いて、本発明により治療可能なさらなる患者群は、ある条件を適用または放出することによりＹＢ−１が核内に移動する、または核内に誘導する、または核内に運ばれることが確実である患者である。この患者群に関連してこの種のアデノウイルスを使用することは、ウイルス複製の誘導がＹＢ−１の核内局在化とそれに続くＹＢ−１のＥ２−後期プロモーターへの結合に基づくという所見を根拠としている。この所見に基づけば、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６および欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のアデノウイルスといった本明細書に開示するアデノウイルスは、ＹＢ−１核陽性である細胞および／またはＹＢ−１が本発明に規定されるように脱制御されている細胞で複製できるだろう。その限りに於いてこれらアデノウイルスは、本発明に従って、これら特性を持つ細胞を含む疾患および患者群の処置に、特にこれら細胞が処置対象となる各疾患の成立に関係している時に用いることができる。本明細書に発明に有用であると記したアデノウイルス、そして使用するこれらウイルス、特に本明細書で初めて記載されたアデノウイルスを用いて処置可能であるさらなる患者群は、ＹＢ−１核陽性および／または以下記載の処置の結果としてＹＢ−１核陽性である患者であり、この場合かかる処置は好ましくは医学的処置であり、そして／または各ウイルスの投与を伴い実施される患者である。ＹＢ−１核陽性患者が、腫瘍を形成する複数の細胞が細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有する患者である場合も、本発明の範囲内である。とりわけこれら治療は、ここに記載の細胞増殖抑制薬投与と共に、そして／または腫瘍治療の一環として実施される。更に、放射線、好ましくは腫瘍療に使用するものである放射線は、この処置群に属する。放射線とは、具体的に高エネルギー照射を伴う放射線を意味し、好ましくは放射性放射線、好ましくは腫瘍治療に用いられる放射性放射線を意味する。高温および高温の適用、好ましくは腫瘍治療に用いられる高温も別の処置手段である。特に好ましい高温の実施態様は局所的適用である。最後にホルモン処置、特に腫瘍治療に用いられるホルモン処置は別の処置手段である。かかるホルモン処置に関連しては、抗エストロゲンおよび／または抗アンドロゲンが用いられる。タモキシフェンの様な抗エストロゲン剤は特に乳ガンの治療に、そして例えばフルタミドまたは酢酸シプロテロンの様な抗アンドロゲン剤は、前立腺ガンの治療に用いられる。

【0164】

腫瘍を形成する細胞の一部が元から、または核内への誘導および能動的導入後にＹＢ−１を含んでいること、または本開示の意味において脱制御したＹＢ−１を含む場合も本発明の範囲内である。好ましくは、腫瘍形成細胞の約５％以上、即ち６、７、８％等がＹＢ−１核陽性細胞またはＹＢ−１が脱制御状態にある細胞である。ＹＢ−１の核内への局在は、外側から加えられたストレス、および局所的に加えられたストレスにより誘導できる。この誘導は、例えば放射線、特にＵＶ照射、細胞増殖抑制薬、取り分けても本明細書に開示されたもの、および高温を用いて行うことができる。高温に関連しては、それは極めて特異的な様式、より具体的には局所に極めて特異的な様式で実現できることが必須であり、その結果ＹＢ−１はより特異的に細胞核内に局在するようになり、それによりアデノウイルスの複製に必要な条件、即ち細胞および腫瘍溶解に必要な条件が、好ましく局所に限定された形で提供される（Stein U、Jurchott K、Walther W、Bergmann S、Schlag PM、Royer HD.J Biol Chem.2001年、276(30)、28562〜9; Hu Z, Jin S, Scotto KW.J Biol Chem.2000年1月 28; 275(4): 2979〜85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K、Wada M、Kuwano M, Kohno K.J Biol Chem.1998年、273(11): 5997〜6000）。

【0165】

かくして本発明の医薬は、好ましくは各腫瘍細胞に於いて、前処理または併用処置を通じてＹＢ−１の輸送に影響を及ぼす形で患者および患者群に投与することもできるし、または、意図されていてもよい。

【0166】

この技術的教示に基づけば、当業者はその技術的水準の範囲内で、Ｅ１Ａに例えば欠失または点突然変異を含む好適な修飾を実行して、発明の使用と関係して用いられるアデノウイルスの各種実施態様を生成することができる。

【0167】

既に説明した如く、発明に従い使用するアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を有する細胞および細胞系それぞれの中で複製できる。本発明に従って使用するアデノウイルスが複製でき、そして腫瘍を溶解できるかどうかという問題にとって、Ｒｂ、即ち網膜細胞芽腫腫瘍抑制産物の有無に関する細胞状態は無関係である。さらに、発明に従い上記アデノウイルスを使用することに関連して感染細胞、感染対象となる細胞、または処置対象となる細胞のｐ５３の状態を考慮する必要はないが、それはここに開示したアデノウイルス系をＹＢ−１核陽性細胞、即ち細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を持つ細胞と結びつけて使用することにより、ｐ５３に関する状態ならびにＲｂに関する状態が本明細書に開示する技術的教示の性能に影響しなくなるからである。

【0168】

発ガン遺伝子および発ガン遺伝子タンパク質はそれぞれ、特にＥ１Ａは所有の天然アデノウイルスプロモーターの制御下、および／または腫瘍もしくは組織特異的プロモーターにより制御できる。好適な非アデノウイルス性のプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルスベースドプロモーターＶａＩおよび非ウイルス性ＹＢ−１プロモーター（Makino Y.ら、Nucleic Acids Res.1996年、15、1873〜1878）を含む群より選ぶことができる。ここに開示した発明の各局面およびいずれかの局面に関連して使用できるさらなるプロモーターには、テロメラーゼプロモーター、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、ガン胚抗原プロモーター（ＣＥＡ）（Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Int.J.Cancer、78、242〜247、1998年）、Ｌ−プラスチンプロモーター（Chung, I., Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy、6、90〜106、1999年）、アルギニンバソプレッシンプロモーター（Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. British J.Cancer、80、1935〜1944、1999年）、Ｅ２ｆプロモーター（Tsukadaら、Cancer Res.、62、3428〜3477）、ウロプラキンＩＩプロモーター（Zhangら、Cancer Res.、62、3743〜3750、2002年）およびＰＳＡプロモーター（Hallenbeck PL、Chang, YN、Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy、10、1721〜1733, 1999年）がある。更にドイツ特許出願番号ＤＥ１０１ ５０ ９８４．７に記載のＹＢ−１依存型Ｅ２−後期プロモーターは、本発明で使用可能なプロモーターである。

【0169】

テロメラーゼプロモーターはヒト細胞において極めて重要であることが知られている。故にテロメラーゼ活性はテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ）の転写制御を通じて制御されているが、上記遺伝子は酵素の触媒サブユニットである。テロメラーゼは８５％のヒト腫瘍細胞で発現している。これに対し、大部分の正常細胞では発現していない。例外は生殖細胞と胚組織である（Braunstein, I.ら、Cancer Research、61、5529〜5536、2001年; Majumdar, A.S.ら、Gene Therpy 8、568〜578、2001年）。ｈＴＥＲＴプロモーターに関するより詳細な研究から、開始コドンからの距離が２８３ｂｐおよび８２ｂｐのプロモーターの断片が、腫瘍細胞での特異的発現に十分機能することを示した（Braunstein I.ら、; Majunmdar ASら、上記）。故にこのプロモーターおよび上記特異的断片はそれぞれ、遺伝子、特にトランス遺伝子、好ましくはここに開示するトランス遺伝子の一つを腫瘍細胞内でのみ特異的に発現させるのに好適である。このプロモーターが、腫瘍細胞のみにおいて、発ガン遺伝子、好ましくはＥ１Ａ発ガン遺伝子の発現を可能にする。また、好適実施態様では、かかるアデノウイルスベクター内でのトランス遺伝子、特にＥ４ｒｏｆ６、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ、ＡＤＰおよびＹＢ−１を含む群から選ばれるトランス遺伝子の発現は、これらプロモーターのいずれかの制御下にある。トランス活性化発現遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質のオープンリーディングフレームがアデノウイルス系の一つ、または複数の遺伝子産物と共にフレーム内に存在するものも本発明の範囲内である。しかし、トランス活性化Ｅ１Ａタンパク質のオープンリーディングフレームは、それから独立してもよい。

【0170】

様々なトランス遺伝子、したがってＥ１Ｂ５５ｋＤ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＡＤＰその他もまた、特にそれらがウイルス遺伝子である場合は、原則として任意のそれぞれのウイルス、好ましくはアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＡｄ５からクローニングすることができる。さらに先行技術において多数のプラスミドが記述されており、それらはそれぞれの遺伝子を含んでおり、続いてそれらから遺伝子を得て、本発明のアデノウイルスへならびに本発明に従って用いられるウイルスへ導入することができる。Ｅ１Ｂ５５ｋＤを発現するそのようなプラスミドの例については、例えば Dobbelstein, M. et al., EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997 に記載されている。Ｅ１Ｂ５５ＫＤ遺伝子のコーディング領域を３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ領域は好ましくはアデノウイルス野生型ゲノム中で塩基位置３５０７〜４１０７に位置する）と一緒に、例えばこの遺伝子からプラスミドｐＤＣＲＥ１ＢからＢａｍ ＨＩにより切り取ることができる。Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子ならびに３’非コード領域を含む対応する断片が、アデノウイルス５型のヌクレオチド２０１９−４１０７に対応する。しかし、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子が制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＢｆｒＩおよびXｂａｌによりそれぞれ前記プラスミドから切り取られ、続いてアデノウイルスへクローンニングされることもまた本発明の範囲内である。さらにその類似体、特に３’ＵＴＲ領域の類似体を本発明中で用いることもまた本発明の範囲内である。３’ＵＴＲ領域の類似体は、３’ＵＴＲ領域と、特に遺伝子、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子の発現に関して、同じ効果を有する任意の配列である。そのような類似体を、当業者が型通りの実験によって、例えば３’ＵＴＲ領域を１つまたはいくつかのヌクレオチド分延長し、また切り詰め、次にこのようにして得られた類似体が依然として上記の３’ＵＴＲ領域と同一の効果を有するか否かをテストすることにより決定してもよい。実施態様の１つでは、用語３’ＵＴＲ領域はこのように任意の類似体も含む。

【0171】

もし逆の言及がなければ、本発明のウイルスについて言及される場合は、それをコードする核酸ならびにアデノウイルス粒子（これは好ましくはそれぞれの核酸を含む）の両方について言及される、ということは本発明の範囲内である。それぞれの核酸はまた、異なるベクターに組み入られて存在してもよい。

【0172】

ここに記載のアデノウイルスを発明に従い用いて溶解するのに好適である細胞の特徴は、実施態様の一つでは、それらは耐性であり、好ましくは多剤または多重耐性である。ここで言う耐性とは、ここに記した細胞増殖抑制薬に対する耐性を意味するのが好ましい。この多剤耐性は、該当する細胞を決定するためのマーカーとして利用でき、従ってかかる多剤耐性を示す腫瘍および患者群について利用できる膜結合型輸送タンパク質Ｐ−糖タンパク質の発現、好ましくは過剰発現と共に現れる。ここで使用する場合の耐性という用語は、古典的耐性とも呼ばれるＰ−糖タンパク質介在耐性と、ＭＲＰ介して伝達される耐性もしくはその他非Ｐ−糖タンパク質が介在する耐性を含む非定型耐性の両方を含む。ＹＢ−１の発現と相関するさらなるマーカーは、トポイソメラーゼＩＩアルファである。その場合、患者が発明のアデノウイルスの使用により良好に処置できるか否かを決定するスクリーニングに於いて、トポイソメラーゼＩＩアルファの発現は核内のＹＢ−１の決定に代わる方法または追加の方法として使用できる。Ｐ−糖タンパク質と同様の様式で基本的に用いることができるさらなるマーカーはＭＲＰである。少なくとも結腸直腸ガン細胞または結腸直腸ガン患者について想定されるさらなるマーカーは、例えばShibao K.ら、(Shibao Kら、Int, Cancer, 83、732〜737、1999年）が記載したようにＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）である（Hasan S.ら、Nature、15、387〜391、2001年）。最後に、ＭＤＲ（多剤耐性）の発現は、少なくとも乳ガンおよび骨肉腫細胞については、上記の意味でのマーカーである（Oda Yら、Clin.Cancer Res.、4、2273〜2277、1998年）。本発明に従い用いることができる可能性のあるさらなるマーカーはｐ７３である（Kamiya、M.、Nakazatp, Y.、J Neurooncology 59、143〜149(2002年); Stieweら、J.Biol.Chem.、278、14230〜14236、2003年）。

【0173】

従って本発明の特別な利点は、臨床的な意味に於いてもはや処置できないと考えられる患者、および先行技術の方法による腫瘍疾患のそれ以上の処置が不可能であり、合理的に成功が期待できない患者、特に細胞増殖抑制薬の使用がもはや合理的には不可能であり、腫瘍に影響を及ぼすまたは腫瘍を縮小させるという意味でもはや良好に治療が実施できない患者についても、ここに記載の様にして本発明によるアデノウイルスを用いることで治療できることである。ここでは、腫瘍という用語は一般に核内にもともとＹＢ−１を含んでいる、またはここに記載した様な外的な開放手段によって核内に、好ましくは細胞周期とは無関係にＹＢ−１を含むようになった腫瘍またはガン疾患を意味する。

【0174】

更に、ここに記載のウイルスは、原則として、腫瘍の治療に用いることができる。

【0175】

特に本明細書に記述されるウイルスによって治療することができる腫瘍は、神経系の腫瘍、目の腫瘍、皮膚の腫瘍、軟組織の腫瘍、胃腸の腫瘍、呼吸器系の腫瘍、骨格の腫瘍、内分泌系の腫瘍、女性生殖系の腫瘍、乳腺の腫瘍、男性生殖系の腫瘍、尿の排出系の腫瘍、造血系の腫瘍を含み、混合腫瘍および胚の腫瘍を含む群より選択される腫瘍が好適である。これらの腫瘍が特にここに定義されたような特に耐性のある腫瘍であることは本発明の範囲内である。

【0176】

神経系の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． 頭蓋ならびに脳（頭蓋内）の腫瘍、好ましくは星状細胞腫、オリゴデンドログリオーマ、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘膠腫、神経繊維腫、血管芽細胞腫、脂肪腫、クラニオファリンジオーマ、奇形腫および脊索腫；
２． 脊髄および脊柱管の腫瘍、好ましくは膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、繊維肉腫および多発性骨髄腫；ならびに
３． 末梢神経の腫瘍、好ましくは神経鞘膠腫、神経繊維腫、神経繊維肉腫および神経周囲の線維芽細胞腫。

【0177】

目の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． 眼瞼および眼瞼腺の腫瘍、好ましくは腺腫、腺ガン、乳頭腫、組織球腫、肥満細胞腫、基底細胞腫瘍、メラノーマ、扁平上皮細胞ガン、繊維腫および繊維肉腫；
２． 結膜および瞬膜の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、血管腫、血管肉腫、腺腫、腺ガン、繊維肉腫、メラノーマおよび乳頭腫；ならびに
３． 眼窩、視神経および眼球の腫瘍、好ましくは網膜芽細胞腫、骨肉腫、肥満細胞腫、髄膜腫、細網細胞腫瘍、神経膠腫、神経鞘膠腫、軟骨腫、腺ガン、扁平上皮細胞ガン、形質細胞腫瘍、リンパ腫、横紋筋肉腫およびメラノーマ。

【0178】

皮膚の腫瘍の群は、好ましくは：
組織球腫、脂肪腫、繊維肉腫、繊維腫、肥満細胞腫、悪性メラノーマ、乳頭腫、基底細胞腫瘍、角化棘細胞腫、血管周囲細胞腫、毛嚢腫瘍、汗腺腫瘍、皮脂腺の腫瘍、血管種、血管肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、プラスマ細胞腫およびリンパ管腫、などの腫瘍を含む。

【0179】

軟組織の腫瘍の群は、好ましくは、
歯槽の軟部組織肉腫、類上皮細胞肉腫、軟組織の軟骨肉腫、軟組織の骨肉腫、軟組織のユーイング肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、繊維肉腫、繊維腫、平滑筋肉腫、平滑筋腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性血管周囲細胞腫、血管腫、血管肉腫、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、悪性神経鞘膠腫、悪性メラノサイト性神経鞘膠腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫、などの腫瘍を含む。

【0180】

胃腸の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１. 口腔および舌の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、繊維肉腫、マーケル細胞腫瘍、誘導性繊維エナメル芽細胞腫、繊維腫、繊維肉腫、ウイルス性乳頭腫症、特発性乳頭腫症、鼻咽頭ポリープ、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫および肥満細胞腫；
２． 唾液腺の腫瘍、好ましくは腺ガン；
３． 食道の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、平滑筋肉腫、繊維肉腫、骨肉腫、バレットのガンおよび食道周囲腫瘍；
４． 膵臓外分泌腺の腫瘍、好ましくは腺ガン；ならびに
５． 胃の腫瘍、好ましくは腺ガン、平滑筋腫、平滑筋肉腫および繊維肉腫。

【0181】

呼吸器系の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． 鼻および鼻腔、喉頭および気管の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、繊維肉腫、繊維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、好酸性顆粒細胞腫（横紋筋腫）、腺ガンおよび筋芽細胞腫；ならびに
２． 肺の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞ガン、繊維肉腫、繊維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、好酸性顆粒細胞腫（横紋筋腫）、腺ガン、筋芽細胞腫、小細胞ガン、非小細胞ガン、気管支の腺ガン、気管支肺胞腺ガンおよび肺胞性腺ガン。

【0182】

骨格の腫瘍の群は、好ましくは：
骨肉腫、軟骨肉腫、傍骨性骨肉腫、血管肉腫、滑膜細胞肉腫、血管肉腫、繊維肉腫、悪性間葉腫、巨細胞腫、骨腫および多小葉骨腫、を含む。

【0183】

内分泌系の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． 甲状腺／副甲状腺の腫瘍、好ましくは腺腫および腺ガン；
２． 腎上体の腫瘍、好ましくは腺腫、腺ガンおよび褐色細胞腫（髄質副腎腫）；
３． 視床下部／下垂体の腫瘍、好ましくは腺腫および腺ガン；
４． 膵臓内分泌腺の腫瘍、好ましくはインスリノーマ（β細胞腫瘍、ＡＰＵＤｏｍ）およびゾリンジャー−エリソン症候群（膵臓デルタ細胞のガストリン分泌器官腫瘍）；ならびに、
５． 多発性内分泌腫瘍症（ＭＥＮ）および非クロム親和性傍神経節腫（chemodectoma）。

【0184】

女性の生殖系の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． 卵巣の腫瘍、好ましくは腺腫、腺ガン、嚢腺腫および未分化ガン；
２． 子宮の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、腺腫、腺ガン、繊維腫、繊維肉腫および脂肪腫；
３． 頚部の腫瘍、好ましくは腺ガン、腺腫、平滑筋肉腫および平滑筋腫；
４． 膣および陰門の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維平滑筋腫、繊維腫、繊維肉腫、ポリープおよび扁平上皮細胞ガン。

【0185】

乳腺の腫瘍の群は、好ましくは、
線維腺腫、腺腫、腺ガン、間充織腫瘍、ガン、ガン肉腫を含む。

【0186】

男性の生殖系の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． 睾丸の腫瘍、好ましくは精上皮腫、間細胞腫およびセルトリ細胞腫；
２． 前立腺の腫瘍、好ましくは腺ガン、未分化ガン、扁平上皮細胞ガン、平滑筋肉腫および移行細胞ガン；ならびに
３． 陰茎および外部生殖器の腫瘍、好ましくは肥満細胞腫および扁平上皮細胞ガン。

【0187】

尿の排出システムの腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． 腎臓の腫瘍、好ましくは腺ガン、移行細胞ガン（上皮性腫瘍）、繊維肉腫、軟骨肉腫（間葉腫瘍）、ウィルムス腫瘍、腎芽腫および腺肉腫（胚の多分化能芽細胞腫）；
２． 尿管の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維乳頭腫、移行細胞ガン；
３． 膀胱の腫瘍、好ましくは移行細胞ガン、扁平上皮細胞ガン、腺ガン、ブドウ房形（胚の横紋筋肉腫）、繊維腫、繊維肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、乳頭腫および血管肉腫；ならびに
４． 尿道の腫瘍、好ましくは移行細胞ガン、扁平上皮細胞ガンおよび平滑筋肉腫。

【0188】

造血系の腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１． リンパ腫、リンパ性白血病、非リンパ性白血病、骨髄増殖性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫。

【0189】

混合腫瘍および胚性腫瘍の群は、好ましくは血管肉腫、胸腺腫および中皮腫を含む。

【0190】

好ましくは、これら腫瘍は、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、骨肉腫、膠芽細胞腫、メラノーマ、小細胞肺ガンおよび結腸直腸ガンを含む群より選ばれる。更なる腫瘍はここに記した様な耐性の腫瘍であり、好ましくは多重耐性である腫瘍であり、特には上記の群の多重耐性の腫瘍である。

【0191】

発明は更に別の局面では、修飾型アデノウイルスの一つ、即ち例えばＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６または欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のウイルスの様な本発明に使用するアデノウイルスの一つを用いて処置できる患者をスクリーニングする方法であって；
−腫瘍組織のサンプルを検査するステップ、および
−ＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核内に局在しているか決定するステップ、を含む方法に関する。

【0192】

前記マーカーの存在はＹＢ−１に代わるものとして、またはＹＢ−１に追加するものとして検出できる。

【0193】

腫瘍組織またはその一部がＹＢ−１を核内に含む場合、特に細胞周期とは無関係に含む場合、ここに開示したアデノウイルスは本発明の実施に従い用いることができる。

【0194】

本発明の方法の実施態様では、腫瘍組織の検査はＹＢ−１に対する抗体、ＹＢ−１に対するアプタマー、ＹＢ−１に対するシュピーゲルマー（spiegelmer）、ならびにＹＢ−１に対する抗カリン（anticaline）を含む群より選ばれる作用物質を用いることで実施される。基本的には対応するマーカカーについては同一の手段を作り、それに従い用いることができる。抗体、特にモノクローナル抗体の製造方法は当業者周知である。ＹＢ−１またはマーカーを特異的に検出するさらなる手段は、標的構造、本例ではＹＢ−１または上記マーカーに高い親和性で結合するペプチドである。そのようなペプチドを作製するためにファージディスプレーのような周知方法が知られている。典型的には、開始時に個々のペプチドが８〜２０アミノ酸の長さを持ち、ライブラリーのサイズが１０²〜１０¹⁸、好ましくは１０⁸〜１０¹⁵種類のペプチドであるペプチドライブラリーを準備する。標的分子に結合するポリペプチドの特殊な形態は抗カリンと呼ばれ、例えばそれはドイツ特許出願番号ＤＥ１９７ ４２ ７０６号に記載されている。

【0195】

ＹＢ−１またはここに開示した対応するマーカーとの特異的結合に関する、従って細胞周期と無関係な細胞核内のＹＢ−１局在を検出するためのさらなる手段は、いわゆるアプタマー、即ち単鎖または二本鎖としてＲＮＡまたはＤＮＡの形で存在し、標的分子に特異的に結合するＤ−核酸である。アプタマーの作成は、例えば欧州特許第ＥＰ０ ５３３ ８３８号に記載されている。特殊な形状をしたアプタマーはアプタザイムと呼ばれ、これは例えばPiagenau, N.ら(2000年)、Angew.Chem.Int.Ed., 39、no.29、4369〜4373項に記載されている。それらがアプタマー部分とは別にリボザイム部分を含み、アプタマー部分と結合している標的分子との結合または放出によって触媒活性を獲得し、核酸基質を開裂してシグナルを生成するという意味において、アプタマーの特別な実施態様である。

【0196】

さらなる形状のアプタマーはいわゆるシュピーゲルマー、即ちＬ−核酸から作られている標的分子結合核酸である。かかるシュピーゲルマーの製造方法は、例えば国際特許出願第ＷＯ９８／０８８５６号に記載されている。

【0197】

腫瘍組織のサンプルは、穿刺または手術により得ることができる。ＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核内に局在しているか調べることは、顕微鏡技術および／または免疫組織分析、好ましくは抗体または上記その他手段を使って頻繁に実施される。核内のＹＢ−１を検出する、そして特にＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核内に局在しているか検出するためのさらなる手段は当業者に周知である。例えば、ＹＢ−１の局在は、スクリーニング時に染色組織切片で容易に検出できる。核内にＹＢ−１が存在する頻度は、局在が細胞周期とは無関係であることを既に示している。細胞周期とは無関係な核内ＹＢ−１を検出するための更なる選択肢は、ＹＢ−１を染色し、ＹＢ−１が核内に局在しているか検出し、そして細胞のフェーズを決定することである。この方法およびＹＢ−１の検出は、ＹＢ−１を検出するための上記手段を用いて実行してもよい。これら手段は、当業者周知の方法により検出される。前記のＹＢ−１と特異的に結合し、分析対象サンプル内、特には細胞内のその他構造には結合しない作用物質を用いることにより、これら手段を好適に標識する方法を用いてそれらの局在を、そしてそれらの持つＹＢ−１への特異的結合故にＹＢ−１の局在をも検出そして確立することができる。前記手段を標識する方法は、当業者周知である。

【0198】

本明細書に記述されているウイルスが、それらが本発明のウイルスであっても、またはそれらが本発明に従って用いられるウイルスであっても、疾病、好ましくは腫瘍疾病、より好ましくは腫瘍細胞の少なくとも一部が多重耐性を示す、特にＹＢ１が調節解除されている多剤耐性を示す腫瘍疾病に関連しても用いられることは、本発明の範囲内である。これは、ＹＢ１が好ましくは細胞周期と無関係に核の中に存在する細胞および疾病を参照する範囲で、細胞および腫瘍に関連して本明細書に記述されるいずれの他の態様にも当てはまる。

【0199】

以下、本発明を新規特徴、実施態様および利点を示す図面およびサンプルを参照しながら更に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0200】

【図1】本明細書でＡｄＥ１／Ｅ３−マイナスと呼ばれる、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスであるアデノウイルベクター、野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスｄｌ５２０の構造デザイン。

【図2】ｐ３００、ｐ１０７およびｐ１０５の結合に関する、Ｅ１Ａタンパク質の結合ドメイン。

【図3】Ｅ１／Ｅ３マイナスＡｄ５と呼ばれるＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄ５およびアデノウイルスｄｌ５２０感染後の、核内にＹＢ−１を持たないＵ２０Ｓ細胞。

【図4】Ｅ１／Ｅ３マイナスＡｄ５と呼ばれるＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄ５およびアデノウイルスｄｌ５２０感染後の、核内にＹＢ−１を有する２５７ＲＤＢ細胞。

【図5】アデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１感染後の２５７ＲＤＢ細胞およびＵ２ＯＳ細胞。

【図6】多剤耐性細胞および細胞株２５７ＲＤＢ、１８１ＲＤＢ、ＭＣＦ−７Ａｄ内にそれぞれＹＢ−１が存在するが、Ｕ２ＯＳおよびＨｅＬａ細胞の核内にはＹＢ−１が存在しないことを確認したＥＭＳＡ分析の結果。

【図7】野生型アデノウイルス、アデノウイルスｄｌ５２０およびアデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１のＥ１Ａタンパク質の構造デザイン。

【図8】追加発現したウイルスタンパク質存在時のアデノウイルスの複製効率を絶対量で示した棒グラフ。

【図9】追加発現したウイルスタンパク質存在時のアデノウイルスの複製効率を増加率で示した棒グラフ。

【図10】ダウノルビシンを加えていない、およびダウノルビシン４０ng/mlを加えた場合の、１０および３０pfu／細胞のｄｌ５２０、およびコントロール（Ｋ）をそれぞれ感染させクリスタルバイオレット染色した後のＵ２ＯＳ細胞増殖ウエルを示す図。

【図11】ダウノルビシンを加えていない、およびダウノルビシン４０ng/mlを加えた場合の、１０および３０pfu／細胞のｄｌ５２１０、およびコントロール（Ｋ）をそれぞれ感染させクリスタルバイオレット染色した後のＨｅＬａ細胞増殖ウエルを示す図。

【図12】ＰＢＳおよびｄｌ５２０でそれぞれ処理後の、起源（ＲＤＢ２５７およびＨｅＬａ）の異なる腫瘍の腫瘍容積の経時変化を示すグラフ。

【図13】それぞれＰＢＳおよび５×１０⁸pfuのｄｌ５２０で処理した後に、ＲＤＢ２５７細胞由来の腫瘍を発生した屠殺マウスの図。

【図14】ｄｌ５２０感染後のＲＤＢ２５７細胞およびＨｅＬａ細胞の細胞抽出物（皮下増殖した腫瘍）のサザンブロット分析の結果。

【図15】ＹＢ−１核陽性腫瘍細胞（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）およびＹＢ−１核陰性腫瘍細胞（ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ）でのｄｌ５２０および野生型アデノウイルスの複製効率および粒子形成を示す棒グラフ。

【図16】野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスベクターＡｄＸｖｉｒ０３の構造デザインを示す図。

【図17】アデノウイルスベクターＡｄＸｖｉｒ０３／０１の構造デザインを示す図。

【図18A】Ａｄ３１２(２０pfu／細胞)、Ｘｖｉｒ０３（５pfu／細胞）およびコントロール（非感染）に感染させ、クリスタルバイオレット染色を行った１８１ＲＤＢ細胞（図１８Ａ）および２７２ＲＤＢ細胞（図１８Ｂ）増殖ウエル。クリスタルバイオレット染色は感染５日後に実施した。

【図18B】Ａｄ３１２(２０pfu／細胞)、Ｘｖｉｒ０３（５pfu／細胞）およびコントロール（非感染）に感染させ、クリスタルバイオレット染色を行った１８１ＲＤＢ細胞（図１８Ａ）および２７２ＲＤＢ細胞（図１８Ｂ）増殖ウエル。クリスタルバイオレット染色は感染５日後に実施した。

【図19】イリノテカンによって細胞を処理された、および細胞を処理されないＵ３７３細胞におけるアデノウイルスｄｌ ５２０の複製行動のサザンブロット解析の結果を示す。

【図20】トリコスタチンＡによって細胞を処理された、および細胞を処理されないＵ３７３細胞におけるアデノウイルスｄｌ ５２０の複製行動のサザンブロット解析の結果を示す。

【図21】トリコスタチンで処理されたＵ３７３細胞の、コクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現についてＦＡＣＳ解析を行った結果を、ＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージとして表示する。

【図22】複製中のアデノウイルスｄｌ５２０およびイリノテカンおよびトリコスタチンの種々の組合せの効果を表示するための、細胞層の４枚の異なるパネルを示す。

【図23】Ｅ１Ｂ５５ＫのＯＲＦを、３’ＵＴＲ断片および位置３５３２の制限切断部位ＢｆｒＩと共に、模式的に表現したものである。

【図24】野生型Ａｄ５の配列位置３５０７〜４１７４に対応する、Ｅ１Ｂ５５ｋ−３’ＵＴＲ領域の配列を示す。

【実施例1】

【0201】

発明により使用されるアデノウイルスが含むＥ１Ａ修飾のタイプ
図１はＡｄＥ１／Ｅ３マイナス、即ちＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスと野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスｄｌ５２０の構造デザインを示している。

【0202】

アデノウイルスＡｄＥ１／Ｅ３マイナスは機能的Ｅ１Ａまたは機能的Ｅ１ＢもしくはＥ３をコードする領域を有しておらず、本実験では毒性に関するコントロールに用いられる。

【0203】

野生型Ｅ１Ａ遺伝子は、Ｅ１Ａ ＲＮＡの異なる位置でのスプライシングから生じる合計で５種類のタンパク質をコードしている。とりわけ２種類のタンパク質、即ち２８９アミノ酸タンパク質および２４３アミノ酸タンパク質が生成される。ｄｌ５２０はＥ１Ａ遺伝子のＣＲ３ストレッチ内に欠失を持つために１３Ｓ遺伝子産物を欠いているため、２８９アミノ酸タンパク質をコードしていない。発明に用いられるアデノウイルスｄｌ５２０は当業者からは１２Ｓ−Ｅ１Ａウイルスと呼ばれる。先行技術周知のアデノウイルスｄｌ３４７（WongおよびZiff、J.Virol.、68、4910〜4920、1994年）はまた１２Ｓ−Ｅ１Ａでもあり、これは本発明に使用することができる。

【0204】

１３Ｓ−Ｅ１ＡのｍＲＮＡによりコードされる２８９アミノ酸タンパク質の中には、各種アデノウイルスサブタイプに保存されている３つの領域がある。これらはＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３と呼ばれる。ＣＲ１およびＣＲ２は両Ｅ１Ａタンパク質（Ｅ１Ａ １２ＳおよびＥ１Ａ １３Ｓ）、即ち２８９アミノ酸および２４３アミノ酸タンパク質に存在するが、ＣＲ３領域は上記タンパク質のうちの大きい方だけに存在する。

【0205】

ＣＲ３領域はウイルス遺伝子、特にＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４の活性化に必要である。小型、即ち２４３アミノ酸タンパク質のみを含むウイルスは、極弱くしかウイルス遺伝子をトランス活性化できず、核内にＹＢ−１を持たない細胞でのアデノウイルス複製を促進しない。ＹＢ−１は腫瘍細胞でのみ核内に存在すること、そしてその中にのみ見出すことができることから、このベクターは腫瘍特異的複製の誘導に好適である。

【0206】

ｄｌ５２０はＣＲ３を欠失していることから、このアデノウイルスは本明細書で輸送とも呼ばれる細胞質ＹＢ−１の細胞核内への移動を行うことができず、それ故にＹＢ−１核陰性である細胞では複製できないことから、このウイルスは本発明で使用可能なウイルスであり、そしてこのウイルスは本発明に必要なトランス活性化に使用できる。

【実施例2】

【0207】

細胞のＲｂ状態に依存したアデノウイルスの作用様態
図２はｐ３００，ｐ１０７およびｐ１０５の結合に関係するＥ１Ａタンパク質の結合ドメインを示している。Ｐ３００およびＰ１０７は、細胞質結合タンパク質である。腫瘍抑制タンパク質である網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）の結合は、ＣＲ１およびＣＲ２を通じて媒介される。研究からｐＲｂおよびｐ１０７／ｐ３００は細胞転写因子Ｅ２Ｆと組み合わさり効率的に転写制御することが示されている。野生型Ｅ１Ａタンパク質はＥ２ＦのＲｂへの結合を妨害する。即ち放出されたＥ２ＦはＥ２初期プロモーターに結合して、アデノウイルスの複製を誘導する。

【0208】

Ｅ１Ａ発ガンタンパク質内の特定の欠失がＲｂ−陰性細胞で優先的に複製することが可能であり、そして本発明に用いることができる以下に述べるような組換え体アデノウイルスベクターを生成することが従来知られていた。例えばアデノウイルスベクターｄｌ９２２−９４７は、ＣＲ２領域（アミノ酸位置１２２〜１２９）内に欠失を持ち、ベクターＣＢ０１６はＣＲ１（アミノ酸位置２７〜８０）およびＣＲ２領域（アミノ酸位置１２２〜１２９）に欠失がある。ベクターＥ１Ａｄｌ０１／０７はＣＲ２領域（アミノ酸位置１１１〜１２３）内に欠失を持つ。更に、Ｎ−末端（アミノ酸位置４〜２５）に追加の欠失があることから、タンパク質ｐ３００への結合は認められない。アデノウイルスベクターＡｄΔ２４はＣＲ２領域（アミノ酸位置１２０〜１２７）に欠失を持っている。欧州特許第ＥＰ０ ９３１ ８３０号に記載のアデノウイルスベクターはＣＲ１領域よびＣＲ２領域に欠失を含んでいる。

【0209】

Ｅ２Ｆ／ＲＰの結合メカニズムおよびＥ１Ａを媒介するＥ２Ｆの放出は、本発明の基礎を成すメカニズムとは基本的に異なるものである。先行技術での予想とは異なり、ウイルス複製にとって必須ではないが、重要であるのはＲｂタンパク質からのＥ２Ｆの放出ではなく、ヒト転写因子であるＹＢ−１が核内に局在することである。この転写因子は、正常細胞に於いては、細胞周期の大部分について細胞質内にのみに存在している。アデノウイルスが感染すると、特定の条件の下にＹＢ−１は核内に導かれるか、例えば乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、骨肉腫、神経芽腫、メラノーマ、小細胞肺ガンおよび結腸直腸ガンを含むが、もとよりこれらに限定されないある種の腫瘍疾患といったある種の細胞システムでは核内に既に存在している。

【実施例3】

【0210】

Ｕ２ＯＳ細胞の感染
１００，０００個のＵ２ＯＳ細胞をウエルに播いた。翌日細胞に図３に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清ＤＭＥＭ培地５００μl中で、３７℃で１時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）２mlと交換した。３日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。

【0211】

図３から分かるように核内にＹＢ−１を持たないＵ２ＯＳ細胞は、本発明に使用できる２種類のアデノウイルス、即ちＥ１／Ｅ３マイナスと呼ばれるＥ１／Ｅ３欠失ウイルスおよびアデノウイルスｄｌ５２０で感染させた後にクリスタルバイオレット染色を行ったところ、溶解を示していなかった。この場合、まず培地を取り除いた。続いて細胞にクリスタルバイオレット液（５０％ＥＴＯＨ、３％ホルムアルデヒド、５％酢酸、１％クリスタルバイオレット）を重層して室温で５〜１０分間インキュベーションした。続いて６ウエル型プレートを水でよく濯いでから室温で乾かした。これから、本発明で使用するウイルスを誘導し、感染細胞を溶解させるには、ＹＢ−１の存在が必要であるという、本発明の基礎を成す発見が確認された。

【実施例4】

【0212】

２５７ＲＤＢ細胞の感染
１００，０００個の２５７ＲＤＢ細胞をウエルに播いた。翌日細胞に図４に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清ＤＭＥＭ培地５００μl中で、３７℃で１時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）２mlと交換した。３日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。

【0213】

この実験の結果を図４に示す。Ｅ１／Ｅ３を欠失したＥ１／Ｅ３マイナスと呼ばれるアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を持つ２５７ＲＤＢ細胞への感染については、低ＭＯＩ（pfu／細胞）では溶解を示さなかった。これに対し実施例３で示した、ＹＢ−１核陰性細胞では複製せず、同時に本発明に従い発ガン遺伝子タンパク質をトランス活性化するＥ１Ａをコードしているｄｌ５２０は、４０pfu／細胞というＭＯＩ（感染多重度）で実質完全な溶解をおこし、１０pfu／細胞のＭＯＩでも顕著な溶解を起こした。このことから、ｄｌ５２０およびここに記したｄｌ１１１９／１１３１またはＡｄＸｖｉｒといった同様のウイルスが必要とするＭＯＩは、Ｅ１欠失またはＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスに比べ約１桁（１０倍）低く、臨床使用が可能であると結論される。

【0214】

図７に示すように、ｄｌ５２０のタンパク質Ｅ１ＡはそのＣＲ３領域を欠失することを特徴とし、その結果本発明による使用に求められるトランス活性化およびＹＢ−１核陽性細胞での複製を起こす。

【実施例5】

【0215】

ｄｌ１１１９／１１３１による２５７ＲＤＢおよびＵ２ＯＳ細胞の感染
図５に示すように、Ｅ１Ａタンパク質のアミノ酸４〜１３８およびそれをコードする核酸を欠失しており、さらにアミノ酸２１８の後に停止コドンを含むために発現する断頭型（truncate）Ｅ１Ａタンパク質が完全なＥ１Ａタンパク質のＣＲ３領域を含んでいるアデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１をＹＢ−１核陰性Ｕ２ＯＳ細胞に感染した場合、２０pfu／細胞のＭＯＩでは溶解は起きなかった。陰性コントロールには非感染細胞層を用いた。

【0216】

これに対し核内にＹＢ−１を含む、即ちＹＢ−１核陽性である、２５７ＲＤＢの様な細胞系では、アデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１の影響を受けて、２０pfu／細胞のＭＯＩで細胞層は実質的に完全に溶解した。この限りにおいて本実施例は、図７に示す様に例えばＣＲ３領域のみを含み、そしてＣＲ１領域およびＣＲ２領域を欠いている修飾型Ｅ１Ａ発ガン遺伝子タンパク質が、発明によるアデノウイルスの複製に必要なＹＢ−１核陽性細胞でのトランス活性化を提供していることを示す別の証拠である。即ちアデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１は、本発明に使用可能である別のアデノウイルスである。ＣＲ３領域に関してｄｌ１１１９／１１３１と同様にデザインされているが、それと異なりＣＲ１領域および／またはＣＲ２領域も含んでいるウイルスを使用できることも、本発明の範囲内である。

【実施例6】

【0217】

多剤耐性細胞での核内ＹＢ−１の検出
本実施例は核内ＹＢ−１が転写因子としてｍｄｒ１プロモーター（多剤耐性プロモーター）内にあるＹ−ボックス（ＣＡＡＴ配列）に結合しなければならないという考察に基づいている。これを検出するために、いわゆるＥＭＳＡ分析（電気泳動移動度シフトアッセイ）を行った。これに関連して、核タンパク質を単離し、続いてタンパク質１〜１０μｇを短いＤＮＡ鎖（オリゴ）と共の３７℃でインキュベーションした。核内ＹＢ−１を決定するために以下のオリゴヌクレオチドを使用した；Ｕ２Ｏ３と反対のｍｄｒ１プロモーター（位置−８６〜−６７）：ＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡ（Ｘボックスには下線を付した）。

【0218】

その前にこのＤＮＡ断片の５’末端を³²Ｐで放射線標識した。続いて未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離した。タンパク質ＹＢ−１がオリゴヌクレオチド内の配列に結合すると、その結合は、結合したオリゴヌクレオチドに比べて非結合のオリゴヌクレオチドはゲル中をより早く移動することから検出できる（Holm, P.S.ら、JBC 277、10427〜10434、2002年; Bargou、R.C.ら、Nature Medicine 3、447〜450、1997年)。

【0219】

図６に示すように、ＥＭＳＡ分析よりＹＢ−１が多剤耐性細胞２５７ＲＤＢ、１８１ＲＤＢおよびＭＣＦ−７Ａｄ細胞の核内に存在すること、そして細胞株Ｕ２ＯＳおよびＨｅＬａ細胞には存在しないことが分かる。

【0220】

実施例４および５に示した結果は、アデノウイルスｄｌ５２０およびｄｌ１１１９／１１３１が２５７ＲＤＢの様なＹＢ−１核陽性細胞では複製してその溶解を誘導するが、Ｕ２０５では複製、溶解を誘導しないことを確認した。このことは、本発明のアデノウイルスの使用に関する所見が確認された。さらに結果は、野生型のアデノウイルスと比べて、修飾型または欠失型Ｅ１Ａ遺伝子産物を介したＹＢ−１核陽性細胞でのウイルス遺伝子の弱いトランス活性化が、例えば多剤耐性細胞を含む核内にＹＢ−１が存在する細胞での良好な複製および良好な細胞溶解をもたらすこと、そしてここに記したアデノウイルスがかかる腫瘍の溶解に利用できることを確認している。

【実施例7】

【0221】

Ｅ１−マイナスアデノウイルスの複製効率上昇
本実施例は初期ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６をプラスミドｐＥ４ｏｒｆ６によるトランスフェクションおよびＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄ−５５Ｋによる感染で置換えられることを示す。Ａｄ−５５ＫはＥ１Ｂ−５５ＫをＥ１にクローニングし、ＣＭＶの制御下に置いたＥ１／Ｅ３欠失ウイルスである（Dobbelstein, M. ら、 EMBO Journal, 16、 4276-4284、 1997年）。この置換は、ＡｄＹＢ−１、即ちＹＢ−１を発現するアデノウイルスがこれら初期遺伝子を発現していないという事実、および本発明者が核内にＹＢ−１を含む複製系でのこれら初期遺伝子を置換することで複製効率および粒子形成能率をそれぞれ野生型アデノウイルスであるＡｄ５型のそれと同程度まで上げることができることを認識していたという事実より必要であった。

【0222】

以下を実施した：
リポフェクタミンを用いた各１０⁵個のＵ２ＯＳ細胞へのプラスミドｐＥ４ｏｒｆ６のトランスフェクション。プラスミドｐＥｏｒｆ６はＣＭＶ制御下にある初期ウイルス遺伝子Ｅ４ｏｒｆ６をコードするＤＮＡ配列を保持している。プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６をトランスフェクションした２４時間後に、細胞にＹＢ−１発現Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄＹＢ−１（５０pfu／細胞）およびＥ１／Ｅ３欠失Ｅ１Ｂ−５５ＫアデノウイルスＡｄ−５５Ｋ（５０pfu／細胞）を感染させた。Ａｄ−５５ＫはＣＭＶ制御下にあるウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ−５５Ｋをトランス遺伝子として保持するＥ１／Ｅ３欠失ウイルスである。

【0223】

続いて感染５日後（＝トランスフェクション後）に細胞を培地（２ml）から取り出した。凍結と融解（凍結／融解）を交互に３回行って、単離細胞からのウイルス粒子を放出させた。次にプラークアッセイを２９３細胞を使って実施し、生成した感染粒子を決定した（プラーク形成単位／ml（pfu/ml））。結果は図８および９に示す。図８は絶対量で表した場合のプラークアッセイの結果である。ＡｄＹＢ−１単独感染例と最も大きな差は、プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６を感染させた例および２種類のウイルスＡｄＹＢ−１およびＡｄ−５５Ｋを同時感染させた例との間で観察された。図９は図８の結果を、ＡｄＹＢ−１の複製効率の倍率として複製効率の増加の形で表したものである。細胞にプラスミドｐＥ４ｏｒｆ６を感染させた後ＡｄＹＢ−１およびＥ１Ｂ−５５Ｋ（Ａｄ−５５Ｋ）を感染させると、最大２５倍高いpfu/mlを示した。

【0224】

これらの結果より、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６による置換はＥ１／Ｅ３−欠失アデノウイルスＡｄＹＢ−１感染後に形成されるウイルス数（pfu/ml）を最大２５倍増加すると結論できる。プラーク形成単位（pfu）生成に及ぼすＥ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６の追加効果は、これら２遺伝子産物単独の効果に比べて有意に高かった。

【0225】

ＥＧＦＰを発現するプラスミドを使ったコントロール実験は、選択した実験方法では、プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６でトランスフェクションされたのは僅かに細胞の１０％だけであることを明瞭に示した。Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞で形成された粒子の数は、ヒトアデノウイルス５型（野生型）のそれに匹敵した。このことから、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ−５５Ｋの発現は、ＹＢ−１の核内局在と組み合わさると、アデノウイルス、特にＥ１Ａ−欠失アデノウイルスの複製および粒子形成を、野生型Ａｄ５のそれに匹敵する程度まで誘導できるという、本発明の基礎を成す発見が確認された。

【実施例8】

【0226】

細胞増殖抑制薬投与によるＹＢ−１核陰性細胞では複製しないアデノウイルスのＹＢ−１核陽性細胞での複製増加
各種細胞増殖抑制薬の添加がヒト転写因子ＹＢ−１の核内局在化を誘導することは、先行技術において知られていた。本発明者が見出したように、核内に局在したＹＢ−１は、アデノウイルスのＥ２−後期プロモーターの活性化によりアデノウイルスの複製をコントロールする。両効果の組み合わせを利用すれば特異的な腫瘍溶解を得ることができる。

【0227】

ガン溶解アッセイを実施するに当たっては、以下の手順に従った：２００、０００個の細胞（それぞれＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ）を６ウエル型プレートの核ウエル内に接種した。翌日ダウノルビシン４０ng/ml（最終濃度）を加えた。３時間インキュベーションした後、それぞれの細胞をｄｌ５２０で、１０〜３０pfu／細胞の割合で感染させた。続いて細胞を、細胞増殖抑制薬を含まない培地でインキュベーションした。３〜５日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。

【0228】

図１０および１１から分かるように、ダウノルビシンの添加はＹＢ−１の核内局在化を通じてｄｌ５２０の複製を誘導した。即ちｄｌ５２０は、細胞増殖抑制薬と組み合わさった状態で、ダウノルビシン単独例に比べてより大きなガン溶解作用を発揮した。

【実施例9】

【0229】

ｄｌ５２０によるインビボのガン溶解
本インビボ試験で使用したＨｅＬａ（ＹＢ−１核陰性）および２５７ＲＤＢ（ＹＢ−１核陽性）細胞は、無菌細胞培養条件にて拡大した。細胞をマウス（系統ＣＤ１ＮｕＮｕ）に注射して皮下腫瘍を形成させる前に、細胞をトリプシン処理して集め、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ）に加え、細胞数を測定してからＰＢＳで１回洗浄した。続いて細胞を遠心分離してＰＢＳを除き、細胞を希望数する細胞数になるよう新鮮ＰＢＳ中に分配した。本研究で皮下注射した細胞の数は両細胞系統とも５×１０⁶細胞であった。注射は動物の一方の側腹部に行い、より区別し易いようにＨｅＬａ細胞は右側に、そして２５７ＲＤＢ細胞は左側に注射した。腫瘍の増殖を週２回調べ、ノギスを使って腫瘍の長さおよび幅を測定した。その結果を用い、次式より腫瘍の容積を計算した：
３／４π^＊ａ／２^＊（ｂ／２）² ａ＝長さ、ｂ＝幅

【0230】

腫瘍の大きさが２００〜５２０mm³に達した時点で、ウイルスおよび陰性コントロールであるＰＢＳをそれぞれ腫瘍内に投与した。注射量は同一で、１回５０μlであった。この作業を３連続日繰り返した。投与したウイルスの総量は５×１０⁸pfuであった。次に腫瘍の増殖を毎週２回の割合で記録し続け、その容積を計算した。試験最終日にマウスを屠殺して、腫瘍を取り出し詳しく分析した。

【0231】

結果は図１２および１３に示した。

【0232】

図１２は、腫瘍容積の経時変化を処理の種類別に示したグラフである。腫瘍がＲＤＢ２５７により形成された例では、ＰＢＳ注射時に腫瘍は約４３８mm³から１４６６mm³へと有意に増大した。本発明に従い用いられるベクターｄｌ５２０を作用させると、腫瘍の成長は有意に低下した。平均腫瘍サイズ３４４mm³から総容積５４３mm³へと、腫瘍サイズは僅かに２１％増加しただけであった。

【0233】

本実施例では、ＲＤＢ２５７を基本とする腫瘍にＰＢＳを投与したのと同様にＰＢＳを投与したＨｅＬａ細胞より成る腫瘍をコントロールとして用いた。ＨｅＬａ細胞を基本とする、ｄｌ５２０で処理された腫瘍は、まだ有意な腫瘍成長の増加を示し、３１１mm³から１９５４mm³に増加した。

【0234】

図１３はＲＤＢ２５７を用いて増殖した腫瘍を持つ、屠殺したヌードマウスの像である。本発明のアデノウイルスｄｌ５２０を作用させた後に、腫瘍の顕著な縮小が起こったことが明瞭に分かる。本例では、腫瘍容積の減少も見られた（ウイルスｄｌ５２０投与１日後：５１５mm³；ウイルスｄｌ５２０投与３０日後：３５０mm³）。

【実施例10】

【0235】

腫瘍ＤＮＡのサザンブロット
実施例９に於いて、発生中の腫瘍の中央部から採取した腫瘍サンプルよりＤＮＡを抽出した。抽出にはQiagen社のDneasy Tissueキットを用いた。ＤＮＡの単離は製造元の指示書に従い実施した。それによれば、ＤＮＡは細胞からアルカリ溶解により放出された。続いて単離したＤＮＡはカラムを使って精製される。次に単離したＤＮＡの濃度を２６０ｎｍの光度測定より決定した。分析はＤＮＡサンプル２μｇを用いて行い、サンプルは制限酵素Ｋｐｎ I、１０単位で消化した。次にサンプルを０．８％のアガロースゲルを用いて電気泳動により分離した。続いてＤＮＡをナイロン膜上にブロッティングした（Schleicher & Schuell社のシステムを用いて実施）。膜上にブロッティングされたＤＮＡを特異的な１５０１ｂｐのＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた。上記１５０１ｂｐのＤＮＡプローブは、Ａｄ５配列をコードするＥ２Ａ内にある３３６９ｂｐのＫｐｎ Ｉ断片と特異的に結合する。プローブはＰＣＲ（プライマー：５’−ＧＴＣ ＧＧＡ ＧＡＴ ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＧＴ、５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＴＴ ＣＧＣ ＴＴ）により準備し、³²Ｐを用いて射線標識した。次に膜を洗い、フィルムに感光した。

【0236】

腫瘍ＤＮＡのサザンブロットの結果は図１４に示した。分析より、レーン３、４および５が示すように、ｄｌ５２０だけが耐性細胞ＲＤＢ２５７でインビトロ複製することが確認された。レーン１は陽性コントロールのＡｄ−５ｄを、レーン６、７、および８はｄｌ５２０を感染したＨｅＬａ細胞由来のＤＮＡを示す。ＨｅＬａ細胞はＹＢ−１核陽性ではないため、ウイルスｄｌ５２０は複製せず、そのためＥ２Ａ配列は検出できなかった。

【0237】

ｄｌ５２０に関するさらなる結果を図１５に示した。プラークアッセイを利用して、ｄｌ５２０および野生型のアデノウイルスを感染させた後の粒子形成（pfu/ml）を調べた。各種ＹＢ−１核陽性（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）腫瘍細胞、ならびにＹＢ−１核陰性腫瘍細胞にｄｌ５２０および野生型アデノウイルスを感染させた。

【0238】

次の手順で実施した：
１００、０００〜２００、０００個の各細胞を６個のウエルを持つプレート（６ウエルプレート）、ＦＣＳを１０％含むＬ１５培地（耐性細胞）およびＤＭＥＭ（非耐性細胞）に接種した。２４時間後にｄｌ５２０および野生型アデノウイルスを感染させた（１０pfu／細胞）。感染３日後（インフェクション後）、凍結と融解を３回繰り返して細胞浮遊液よりウイルス粒子を放出させた。次に２９３細胞を使ってプラークアッセイを行い、形成した感染粒子（プラーク形成単位／ml（pfu/ml））を決定した。結果を図１５に示す。プラークアッセイの結果は、ｄｌ５２０がＹＢ−１核陽性細胞（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）では野生型アデノウイルスの場合と同様に複製することを示した。この限りにおいて、本発明に従ってここに記載のアデノウイルスを使用する場合には、野生型アデノウイルスと同様の複製効率が観察できた。

【実施例11】

【0239】

アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３の構造デザイン
図１６は、アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３の構造デザインを示す。アデノウイルスＸｖｉｒ０３は、いわゆるＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスである。このことは、アデノウイルス複製に機能するＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ（Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ１Ｂ１９Ｋタンパク質）およびＥ３タンパク質が作られないことを意味する。Ｅ１領域の欠失は３４２〜３５２８の範囲である；アミノ酸位置２７８６５〜３０９９５のＥ３領域の欠失。本明細書で使用する場合、用語「Ｅ１欠失ウイルス」とは、Ｅ１がもはや機能的に作用しないウイルスを意味する。これは、その他のほとんどインタクトな核酸配列およびアミノ酸配列で、それぞれ不活性化することにより達成できるが、しかしこのことは欠失したＥ１領域がコードするタンパク質が様々なサイズを持つことを意味することにもなる。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質およびそれらをコードする核酸を欠くことにより、Ｅ４ｏｒｆ６の様なＥ４領域は弱くにしか発現されないか（野生型アデノウイルスの１〜５％）、または全く発現されない。ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６はＸｖｉｒ０３内に導入された異種のＣＭＶプロモーター（Clontech: Plasmid pShuttle）によりＥ１領域内で発現する。上記ＣＭＶプロモーターに代わって、Ｅ１Ａの発現に関連して明細書中に開示したその他プロモーターを用いることができる。両遺伝子のオープンリーディングフレームは、いわゆるＩＲＥＳ配列（内部リボソーム進入部位）（Pelletier, J.およびSonenberg, N.Nature、1988年、334、320〜325）により互いに連結している。このエレメント（Ｎｏｖａｇｅｎ：ｐＣＩＴＥ）は１種類のｍＲＮＡから２種類のタンパク質を発現させる。

【0240】

ベクターは次のように作製した：Clontech 社のシステムＡｄｅｎｏ−Ｘ
プラスミドＥ１Ｂ５５ｋ−ｐＳｈｕｔｔｌｅを、Ｍ．Ｄｏｂｅｌｓｔｅｉｎ（マールブルグ大学）のｐＣＧＮＥ１Ｂより、ＸｂａＩおよびＢｆｒＩおよびＢａｍＨＩのみそれぞれを用いてＥ１Ｂ５５ｋのオープンリーディングフレームをＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のｐＳｈｕｔｔｌｅベクター内にクローニングして作製し、このとき、末端を平滑末端化して平滑末端化されたｐＳｈｕｔｔｌｅにクローニングした。続いてｐＳｈｕｔｔｌｅ内のＥ１Ｂ５５ｋをＡｐａＩを使って直線化し、ＮｈｅＩを使って平滑末端化して切断した。

【0241】

第二のベクターであるｐｃＤＮＡ３.１（＋）（Invitrogen）中に、前後して、Novagen 社製のｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）を鋳型に用いＴＡクローニング法によりＥｃｏＲＶ切断部位にＰＣＲ産物であるＩＲＥＳエレメントをクローニングし、そしてプラスミドｐＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６（M.Dobelstein、マールブルグ大学）より得たＥ４ｏｒｆ６を、ＢａｍＨＩを用いてクローニングした＝ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）内のＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６をＮｏｔＩを使って直線化し、末端を平滑末端化してから、断片ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６をＮｈｅＩで切り出した。断片ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６をオープンベクターＥ１Ｂ５５ｋ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（平滑端、ＮｈｅＩ）と連結した。続いてこうしてできたカセットを、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩを用いて、Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅより、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）−ポリＡと共にΔＥ１、ΔＥ３Ａｄｅｎｏ−Ｘ−プラスミド（Clontech）内にクローニングし、ＡｄｃｍｖＥ１Ｂ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６と名付けた。次にアデノウイルスをメーカー（Clontech）の指示書に従い作製した。ＰａｃＩを使って直線化した、発現エレメントＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ＢＧＨポリＡを有するアデノプラスミドをＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションし、トランスフェクション１１日後に融解させる細胞を培地と共に取り出してから凍結融解サイクルを繰り返しアデノウイルスを放出させた。

【0242】

QBIOGENE および Microbix のシステムＡｄＥａｓｙなどの他のシステムを、本発明によるアデノウイルス、好ましくは組換えアデノウイルス、特にカセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓを個々におよび／または共に含むものの製造に用いることができるということは、本発明の範囲内であり、また本明細書に提供される技術的な教示に関して当業者にとって実行可能である。さらに、個々のトランス遺伝子をカセット間で交換してもよい。本発明により、カセットがＥ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ１のデザインを有するようなアデノウイルスを製造し用いることができるのも、また本発明の範囲内である。

【0243】

本発明に関連して、カセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋを含む、いわゆるＥＩ／Ｅ３欠失組換えアデノウイルスを用いた。しかし、ウイルスがＥ１の欠失のみを含み、それはＥ３領域がインタクトに留まっていることを意味することは、実施態様の範囲内である。状況に応じて、Ｅ４領域が部分的におよび／または完全に欠失してもよい。

【0244】

様々なシステムを用いるベクターの作製では、以下のようにそれを進行させた。

【0245】

インタクトなＥ３領域を有するアデノウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ３’ＵＴＲの、Ｇｒａｈａｍ（Microbix社）のベクターシステムによる生成。

【0246】

ベクターＣＭＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡのｐＤｅｌｔａ Ｅ１ｓｐ１Ａ中へのクローニング
プラスミドＥ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）のために、３’ＵＴＲを有するオープンリーディングフレームを、アデノウイルス５型のＤＮＡからの増幅により調製して（Ｅ１Ｂ５５ｋの順方向プライマー＝５’−ＡＴＧＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣ−３’、および、Ｅ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲの逆方向プライマー＝５’−ＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＣ−３’）、末端を平滑化したＮｈｅｌ制限部位 （それはＴ末端（ＴＡクローニング）を有しており、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドへクローニングされている）に導入した。したがって、トランス遺伝子は、５’末端にｈＣＭＶ−プロモーターおよび３’末端にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを所持していた。しかしながら、さらに、Dobbelstein (Dobbelstein, M. et al., EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997) から得たプラスミドｐＣＧＮＥ１ＢからＢａｍ ＨＩにより得たＥ１Ｂ５５ｋを用いて、末端を平滑化し、ＴＡクローニングを行うことは本発明の範囲内である。クローニングしたＥ１Ｂ５５ｋ−３’ＵＴＲについては、特に図２３と２４により詳細に記述する。

【0247】

ベクターＥ４ＯＲＦ６−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３.１（＋）のクローニング
アデノウイルス５型ＤＮＡを鋳型として用いる（Ｅ４ｏｒｆ６の順方向プライマー：５’−ＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧ−３’、および、Ｅ４ｏｒｆ６の逆方向プライマー：５’−ＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＡＡＴＣＧＴ−３’）、およびＢａｍ ＨＩにより切断されたプラスミドｐＣＭＶＥ４−３４ｋＤ (Dobbelstein et al., EMBO, 16, 4276-4284, 1997)からの、増幅物Ｅ４ｏｒｆ６、および鋳型としてＮｏｖａｇｅｎ社のｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）を有するＩＲＥＳエレメント（ＩＲＥＳの順方向プライマー＝５’−ＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣ−３’およびＩＲＥＳの逆方向プライマー＝５’−ＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ−３’）を、続いてｐｃＤＮＡ３.１（＋）ベクターのマルチクローニング部位へクローンニングした。そのような目的のために、Ｅ４ｏｒｆ６トランス遺伝子に対して、オープンリーディングフレームの５’末端にＢａｍＨＩ切断部位を、および３’末端にＥｃｏＲＩ切断部位を生成するプライマーを用いた。増幅物をそれぞれの制限酵素で消化し、またその末端を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲｌを用いて開かれたベクター中への指向されたクローニングに適合するようにした。次に、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）中のプラスミドＥ４ｏｒｆ６をＥｃｏＲＶにより直線状にして、Ｔ末端を加え、増幅物をＩＲＥＳエレメント中へクローニングした。ＩＲＥＳエレメントの正確な方向をチェックした後に、ベクターをさらなるクローニングに用いた。

【0248】

両方のトランス遺伝子のＩＲＥＳエレメントとの連結は、ＮｏｔＩにより直線状にし、末端を平滑化し、続いてＸｂａｌにより切断した、以前に生成されたプラスミドＣＭＶ−ＥｌＢ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）中への、Ｅ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳカセットのクローニングの結果であった。ｐｃＤＮＡ３.１（＋）中のＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳをＮｏｔＩにより直線状にし、末端を平滑末端にして、さらにＮｈｅＩにより消化した。Ｅ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳインサートをＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）とライゲーションさせることによって、ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）中でＸＶＩＲ−３’ＵＴＲを生成した。

【0249】

使用するアデノウイルスのシャトルベクターの生成
現在 Microbix社のアデノウイルス生成システムに用いられているシャトルベクターｐΔＥ１ｓｐ１Ａは、ＣＭＶプロモーターも、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをｐΔＥ１ｓｐ１Ａへクローニングした。その目的のために、ＣｌａＩでｐΔＥ１ｓｐ１Ａを直線化し、末端を平滑化し、またＥｃｏＲＩによって切断した。エレメントＣＭＶ−ＭＣＳ（マルチクローニング部位）−ｐｏｌｙＡをＭｆｅＩでｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から直線化し、末端を平滑末端化し、さらにＥｃｏＲｌにより切断した。続いて、カセット（Clontech から得たＸｖｉｒ−３’ＵＴＲ ｐＳｈｕｔｔｌｅ）を、さらにＰｍｅＩで切断されていて続いて脱リン酸化されたＣＭＶ−ＭＣＳ−ポリＡ ｐΔＥ１ｓｐ１Ａベクター中へ、ＰｍｅＩによりクローニングした。クローニング生成物Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐΔＥ１ｓｐ１Ａをウイルス生成に用いた。

【0250】

ウイルスの生成
Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐΔＥ１ｓｐ１ＡおよびｐＢＨＧＥ３（Microbix から得た、野生型アデノウイルス５型に対応するＥ３領域を含む）をＨＥＫ２９３細胞へ共トランスフェクションした。それにより両方のベクターの相同配列の組換えによりウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲＥ３が生成された。

【0251】

ＡｄＥＡＳＹシステム（Qbiogene 社）を用いるアデノウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ３’ＵＴＲ−ＡｄＥＡＳＹ Ｅ３の生成

【0252】

使用するアデノウイルスのシャトルベクターの生成
ここで用いるシステムのためには、ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹは、ＣＭＶプロモーターもウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹへクローニングした。その目的のために、プラスミドをＥｃｏＲＩによって消化し、Ｔ４ポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓで末端を満たすことによって平滑化し、骨格を脱リン酸化し、また生成された両方の消化生成物を再びライゲーションした。そうすることによって、ＥｃｏＲＩの制限認識部位を除去した。このようにして得られたプラスミドをｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ)−ＡｄＥＡＳＹと呼んだ。

【0253】

次に、Clontech のｐＳｈｕｔｔｌｅから得たカセットＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡをＭｆｅＩおよびＥｃｏＲＩにより切断し、末端を平滑末端化し、そしてベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲ１)−ＡｄＥＡＳＹ中へクローニングした。これはそのような目的のために、ＸｂａＩで直線化し、平滑末端化し、また脱リン酸化しておいたものである。このようにして、プラスミドＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹが生成された。カセットＥ４Ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ−３’ＵＴＲをこのプラスミドへ、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、クローニングした。そうすることによって、ｐＳｈｕｔｔｌｅ ＡｄＥＡＳＹ中のプラスミドＸｖｉｒ３’ＵＴＲが生成された。これをＢｓｔ１１０７ＩおよびＭｒｏＩで直線化し、エレクトロポレーションによって救済プラスミドｐＡｄＥＡＳＹと共にＢＪ５１８３（ＥＣ）バクテリアへ導入した。相同組換えによって、アデノウイルスのプラスミドＡｄ−Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐＡｄＥＡＳＹが生成され、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションされた後にウイルス産生をもたらした。

【0254】

野生型Ｅ３領域のｐＡｄＥＡＳＹへの導入
プラスミドｐＡｄＥＡＳＹでは実質的にＥ３領域が欠失しているので、Ｅ３領域をプラスミドｐＡｄＥＡＳＹからＳｐｅＩおよびＰａｃＩによってプラスミドＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡ ｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＡｄＥＡＳＹ）中へ再構成のためにクローニングして、プラスミドＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹが生成された。

【0255】

ＮｄｅＩによる制限切断、および再ライゲ−ションにより２つのＮｄｅＩ制限部位のうちの１つの制限部位を欠失させ、したがって、プラスミドからマルチクローニングサイトを除いた。この手順により、プラスミドＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹが生成された。

【0256】

続いて、４００７ｂｐの野生型Ｅ３領域断片を野生型アデノウイルス５型からＳｐｅＩおよびＮｄｅＩにより切り出し、ＳｐｅＩとＮｄｅＩによって開かれたＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹへクローンニングした。このようにして生成されたベクターをｗｔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｎｄｅｌ）−ＡｄＥＡＳＹと呼んだ。

【0257】

次に、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−Ｎｄｅｌ）−ＡｄＥＡＳＹから野生型Ｅ３Ｅ４領域をＳｐｅＩおよびＰａｃＩによって切断して、ｐＡｄＥＡＳＹへクローニングし、またＳｐｅＩとＰａｃＩで切断した。それによってプラスミドｐＡｄＥＡＳＹ中で、Ｅ３領域が再建された（ｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３）。ＢＪ５１８３（ＥＣ）バクテリアをプラスミドＸｖｉｒ−３’ＵＴＲによって形質転換する際の相同組換えにより、ｐＳｈｕｔｔｌｅ ＡｄＥＡＳＹおよびｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３中に、ＸＶｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３が生成された。

【0258】

言及したシステムすべてのためのＥ４の操作
治療用トランス遺伝子のためのスペースを提供するために、および望ましくない相同組換えを回避するために、プラスミドＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ中のＥ４領域を特別に欠失させることができる。その目的のためにＥ４ｏｒｆ６領域を、約０.６ kB、好ましくは６２９または６３４ｂｐ、ＰｓｔＩによる切断および再ライゲ−ションによって短縮する。これは図１７に記述されているように、Ｘｖｉｒ０３／０１に関連して遂行することができる。それぞれの欠失は、組換えアデノウイルスを生成するための種々のシステムにおいて、当業者によって実現可能である。

【0259】

特にＡｄ−Ｘｖｉｒ ３’ＵＴＲ−ＡｄＥＡＳＹ Ｅ３中へのＲＧＤモチーフのクローニング（他のシステムにも適用可能）
感染力を増大させるために、ファイバーノブ領域のＨＩループを Dmitriev et al. 1998 （An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus and Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism）に従って修飾する：それぞれの領域をプライマーＲＧＤ−Ｈｐａ順方向（５’−ＧＡＧｇｔｔａａｃＣＴＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧ−３’）、ＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ逆方向（５’−ＣＡＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧ−３’）、および ＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ順方向（５’−ＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ−３’）およびＲＧＤ−Ｂｆｒ逆方向（５’−ＣＡＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡｃｔｔａａｇＴＧＡＧＣＴＧＣ−３’）を用いて増幅し、これにより、ＥｃｏＲＶ制限部位が生成された。この制限部位に、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）−ペプチドをコードする対のオリゴヌクレオチド：ＲＧＤ−ｏｌｉｇｏ １（５’−ＣＡＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣ−３’）およびＲＧＤ−ｏｌｉｇｏ ２（５’−ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧ ＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＡＧＴＣＡＣＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＧ−３’）をクローニングした。これにより、ＲＧＤモチーフがファイバーノブ領域のＨＩループ中に存在する。

【0260】

上記ベクターは原理的には本発明での使用に関して、本明細書に記載したその他ウイルスと同様に好適である。具体的には、上記ベクターはＹＢ−１核陽性細胞およびＹＢ−１が調節解除状態にある細胞、即ちＹＢ−１が正常細胞および非腫瘍細胞に比べ過剰発現している細胞での複製および溶解始動について好適である。このベクターの使用は、特に本発明に従い用いられるものとして本明細書に記載されているその他アデノウイルス、ならびに本明細書に開示されている本発明のその他アデノウイルスに関連し開示されている疾患、患者群または患者集団を適用とする。

【実施例12】

【0261】

アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３／０１の構造デザイン
図１７から分かるように、Ｘｖｉｒ０３／０１はＸｖｉｒ０３を更に発展させたものである。例えばここに記した遺伝子の様な治療目的の遺伝子やトランス遺伝子をＥ３領域内にクローニングできる。さらに、Ｅ４領域内に欠失を導入してＸｖｉｒ０３の発現カセットに由来するＥ４ｏｒｆ６との間で相同的組換えが起こるのを回避した。これによってより大型のトランス遺伝子をこの構築体内にクローニングすることが可能になった。欠失型のＥ３領域にはカセット導入に適したＳａｃＩ、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩ制限部位があり、ここに例えば治療用トランス遺伝子をクローニングすることができる。しかし、Ｅ３領域はまたインタクトのままに留まってもよい。また、治療用遺伝子はＥ４領域中への連続体でありうる。これにより、特に、アデノウイルス細胞死タンパク質ＡＤＰの発現が保証される。

【0262】

Ｅ３領域内への治療用遺伝子クローニングおよびＥ４領域内への欠失作製を目的としたプラスミドの調製：
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製ｐＡｄｅｎｏＸ−Ｐｌａｓｍｉｄには３’ＩＴＲ領域の後に野生型アデノウイルスには無いＳｆｕＩ向けの制限部位がある。Ｅ３〜Ｅ４領域をＳｐｅＩ（位置２３６４４）およびＳｆｕＩを使ってｐＡｄｅｎｏＸ（Clontech）から取り出し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）内にトランスフェクションした＝ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５−Ｅ４。Ｅ４ＯＲＦ６の大部分、即ち３３２４１〜３３８７５をＰｓｔＩを用いて取り出した＝ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５。Ｘｖｉｒ０３を更に発展させるために、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５由来の欠失Ｅ３／Ｅ４領域をＳｆｕＩおよびＳｐｅＩを使ってプラスミドｐＡｄｅｎｏＸ内にクローニングした＝ｐＡｄｎｏＸＥ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５。

【0263】

次にＸｖｉｒ０３について記載した発現カセットを、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩを使ってＥ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅより、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）−ポリＡと共にｐＡｄｅｎｏＸＥ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５内にクローニングし、ＡｄｃｍｖＥ１Ｂ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６−ΔＥ４と命名した。次にアデノウイルスをメーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の指示書に従い作製した。

【0264】

QBIOGENE社および Nicrobix社のシステムなどの他のシステムを、本発明に従うアデノウイルス、特に組換えアデノウイルスの製造に用いることができるということは、本発明の範囲内であり、また本明細書の開示に照らして当業者にとって実施可能である。

【0265】

上記ベクターは原理的にはここに記載した本発明に従い使用される他ウイルスと同様に有用である。特に上記ベクターはＹＢ−１核陽性細胞ならびにＹＢ−１が脱制御状態にある、即ちＹＢ−１が正常細胞および非腫瘍細胞に比べ過剰発現している細胞での複製、およびその限りにおいて溶解の誘導に好適である。このベクターは、本発明に従い用いられる本明細書記載の他アデノウイルス、および本明細書のアデノウイルスに関し開示されている疾患、患者群および患者集団にも使用できる。

【実施例13】

【0266】

２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ細胞でのＸｖｉｒ０３のガン溶解作用
１００、０００個の細胞（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）を６個のウエルを持つプレート（６ウエルプレート）の各ウエルに接種した。翌日細胞に、図１８に示すようにＡｄ３１２（２０pfu/ml）およびＸｖｉｒ０３（５pfu/ml）を感染させた。感染は無血清ＤＭＥＭ培地５００μl中で、３７℃、１時間実施した。次に感染培地を取り除き、完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）２mlと交換した。５日後にクリスタルバイオレット染色による分析を行った。結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。

【0267】

図１８Ａおよび１８Ｂから明らかな様に、核内にＹＢ−１を持つ多剤耐性細胞では、Ａｄ３１２およびＸｖｉｒ０３を感染させた場合、細胞のクリスタルバイオレット染色より示されるようにＸｖｉｒ０３感染例のみ崩壊を示した。この場合まず培地を取り除いた。続いて細胞をクリスタルバイオレット液（５０％ＥＴＯＨ、３％ホルムアルデヒド、５％酢酸、１％クリスタルバイオレット）で覆い、室温で５〜１０分間インキュベーションした。次に６ウエルプレートを水でよく濯いでから室温で乾かした。

【0268】

本発明者は、本発明の意味においてアデノウイルスをトランス活性化しないＥ１Ａ欠失ウイルス（例えばＡｄ３１２）がより高いＭＯＩでは極めて効率的に複製できるが（Nevins J.R.、Cell 26、213〜220、1981年）、しかしこれらは臨床的には応用できないことを承知していた。この現象は文献では「Ｅ１Ａ−様活性」と呼ばれている。ここで用いるアデノウイルスＡｄ３１２はＥ１Ａ欠失ウイルスである。使用した力価（２０pfu/ml）はまだ臨床応用には高すぎるが、この力価ではＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６といった初期アデノウイルス遺伝子は発現しないか、または極少量しか発現しない（Nevins J.R.、Cell 26、213〜220、1981年）。本明細書に既に記した様に、これら遺伝子およびタンパク質はウイルス複製において重要な役割をはたしており、それぞれアデノウイルスＸｖｉｒ０３により発現される（図１６）図１８Ａおよび１８Ｂから分かるように、遺伝子Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６の発現は、必要とする感染力価（pfu/mlで表される）の低下を伴いながら効率的にウイルス複製および細胞溶解を起こすだろう。このことから、本発明の基礎となる発見、即ちＹＢ−１の核内局在と組み合わさったＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ−５５Ｋの発現（且つＥ１Ａが存在しない）は、極めて効率的なアデノウイルスの複製を誘導できることが確認される。これに必要な力価は僅かに１〜５pfu/mlに過ぎず、臨床的応用が可能である。

【0269】

このことから、本発明の基礎となる発見、即ち本発明に従い用いられるウイルスを用いて感染細胞を溶解させるには、核内にＹＢ−１が存在すること、特に細胞周期と無関係に存在することが必要であることが確認される。

【実施例14】

【0270】

イリノテカン添加後の細胞中のアデノウイルス複製
アデノウイルスの複製に対するイリノテカンの影響を決定するために、１０⁶個のＵ３７３腫瘍細胞を１０ cm² のペトリ皿にプレートした。最初の反応では、５μM イリノテカンを２４時間後に加えた。さらに２４時間の後、細胞に１０ pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させた。イリノテカンなしで３日間インキュベーション後に、実施例１０に記述した手順に従ってＤＮＡを単離した。

【0271】

平行した反応においては、このように準備したＵ３７３細胞を予めイリノテカンでインキュベーションしなかった。イリノテカンなしで４８時間細胞を培養した後に、それらに１０pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させ、さらに３日の間イリノテカンなしで続いてインキュベーションした。上述したようにＤＮＡを単離した。

【0272】

続いて２μg ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、サザンブロット解析を行なった。ＰＣＲによって生成されたアデノウイルスゲノムの一部（位置：２２７３４−２４２３５）をプローブとして用いた。

【0273】

結果を図１９に示す。図１９は、イリノテカンとのインキュベーション後に、イリノテカンとインキュベーションを行なわない無処理の対照（レーン１）と比較して、イリノテカン処理後に（レーン２）Ｕ３７３細胞中でアデノウイルスの複製が著しく増加することを示す。これは、イリノテカンの影響下でアデノウイルスの複製が増大することを意味する。

【実施例15】

【0274】

トリコスタチンＡ投与後の細胞中のアデノウイルスの複製
アデノウイルスの複製に対するトリコスタチンＡの影響をテストするために、１０⁶個のＵ３７３腫瘍細胞を１０ cm² のペトリ皿にプレートした。２４時間後に０、０.２５、０.５、および０.７５μM のトリコスタチンＡを加えた。さらに２４時間後、細胞に１０ pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させた。

【0275】

３日間トリコスタチンのない培地でインキュベーションした後、ＤＮＡを単離した。次に２μg ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、サザンブロット解析を行なった。ＰＣＲによって生成されたアデノウイルスのゲノムの一部（位置：２２７３４〜２４２３５）をプローブとして用いた。

【0276】

結果を図２０に示す。図２０は、トリコスタチンＡ濃度を増加させてインキュベーションした後（レーン２、３および４）では、Ｕ３７３細胞中のアデノウイルス複製が、トリコスタチンＡとインキュベーションしなかった未処理の対照（レーン１）と比較して、著しく増大することを示す。これは、ウイルスの複製がトリコスタチンＡの影響下で増大することを意味する。

【実施例16】

【0277】

トリコスタチンＡの添加に応答して、Ｕ３７３細胞のコクサッキーウイルス−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現に影響を及ぼす
２００,０００個のＵ３７３細胞を６ウエルプレートにプレートした。２４時間後、細胞を１μM トリコスタチンと共に２４時間培養した。さらに２４時間後、細胞を単離した。次にＣＡＲ発現の解析を、Ｆａｃｓ解析および Upstate社から得た一次抗体、抗−ＣＡＲクローンＲｍｃＢ、および二次抗体としてウサギ−抗−マウスＦＩＴＣ（DAKO社）を用いる標準プロトコルにより実施した。

【0278】

結果を図２１に示す。トリコスタチン処理をしない場合、細胞の１１.３％がＣＡＲ陽性であったが、細胞を１μＭトリコスタチンとインキュベーションした後は、細胞の５６.２％がＣＡＲ陽性であった。図はテストに用いた全細胞のパーセンテージである。

【0279】

図２１から、ヒストンデアシラーゼインヒビタートリコスタチンＡの影響下で、アデノウイルスの結合の重要な因子であるＣＡＲがより高いレベルで発現され、またより利用可能性が高く、CARはこのように処理した細胞のトランスフェクションの効率を増大させることが分かる。

【実施例17】

【0280】

イリノテカンおよびトリコスタチンＡによる細胞の併用処理後のアデノウイルスによるＵ３７３細胞の腫瘍崩壊。
２００,０００個のＵ３７３細胞を６ウエルプレートにプレートした。２４時間後に、２μM イリノテカンまたは１μM トリコスタチンＡのみ、あるいは１μM イリノテカン ＋ ０.５μM トリコスタチンを培地に加えた。２４時間のインキュベーションの後、細胞に１０、２０、および３０ pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させた。３〜５日後に、クリスタルバイオレット染色を用いて、解析を行なった。解析を二重に行なった。

【0281】

結果を図２２に示す。パネル１中に表した６つのプレートは、クリスタルバイオレット染色によって示される、イリノテカンおよびトリコスタチンＡの組合せとのインキュベーションに影響されなかった完全な細胞層を示す。パネル１の次の２つのウエルは、１０および２０ pfu/細胞のｄｌ５２０による感染後の細胞層をそれぞれ示す。そのような条件下でも、ｄｌ５２０の複製がないため、細胞崩壊がない。したがって、１０または２０ pfu/細胞のｄｌ５２０も、１μM イリノテカン＋０.５μM トリコスタチンＡのみも、細胞溶解を引き起こすことは出来ないことを示す。

【0282】

本明細書でパネル２、３および４とも呼ぶ、図２２中に示したさらなる６ウエルプレート２、３および４を、基本的に次のスキームに従って処理した。個々のウエルに、前に記述したようにＵ３７３細胞を接種し、細胞をその中で培養した。正副２つのウエルに、１０、２０、または３０ pfu/細胞のｄｌ５２０を接種した。３枚の６ウエルプレート間には、用いた細胞増殖抑制薬の種類に差異が存在した。パネル２では２μM イリノテカン、パネル３では１μM トリコスタチンＡ、ならびにパネル４では１μM イリノテカンおよび０.５μM トリコスタチンＡを、個々のプレートに加えた。

【0283】

２μM イリノテカンを加えた６ウエルプレート２（パネル２）では、３０ pfu/細胞のｄｌ５２０により細胞が溶解された。１μM トリコスタチンＡを加えた６ウエルプレート３（パネル３）では、２０および３０ pfu/細胞のｄｌ５２０により細胞が溶解された。１μM イリノテカン＋０.５μM トリコスタチンＡを加えた６ウエルプレート４（パネル４）ではそれらと対照的に、すでに１０ pfu/細胞のｄｌ５２０により細胞が溶解された。

【0284】

図１９〜２３に結果が表されているテストは、イリノテカン＋トリコスタチンＡ＋ｄｌ５２０から成る組合せが、化合物単独のいずれよりも有効な腫瘍細胞の細胞溶解を引き起こすことを示す。これは一方では、ＣＡＲ発現を増大させ、従って細胞の感染可能性を著しく改善するトリコスタチンＡに起因する。他方では、イリノテカンがＹＢ−１を細胞核に移行させ、従ってアデノウイルス複製の増進を引き起こす。さらに、細胞のＹＢ−１はｄｌ５２０による感染の後にアデノウイルスの複製を支援しており、もはやＤＮＡ修復プロセスに利用できない。見方によって、これは、一方でｄｌ５２０の効率の改善をもたらし、また他方では細胞増殖抑制薬の効率の増大をもたらす。

【0285】

前記明細書に開示した発明の特徴、特許請求の範囲ならびに図面は、個々およびいずれかの組み合わせの両方に於いて、その発明の各種実施態様での実現にとって極めて重要であろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]