特許 5873900 ウイルス感染を治療するための医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5873900

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】ウイルス感染を治療するための医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/341 20060101AFI20160216BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20160216BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/341

   A61P31/12

   A61P31/14

   A61P43/00 121

   A61K37/66 G

【請求項の数】11

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2014-136125(P2014-136125)

(22)【出願日】2014年7月1日

(65)【公開番号】特開2015-129108(P2015-129108A)

(43)【公開日】2015年7月16日

【審査請求日】2014年7月1日

(31)【優先権主張番号】103100064

(32)【優先日】2014年1月2日

(33)【優先権主張国】TW

(73)【特許権者】

【識別番号】509075457

【氏名又は名称】中國醫藥大學

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100109449

【弁理士】

【氏名又は名称】毛受 隆典

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】林 振文

(72)【発明者】

【氏名】▲黄▼ 安正

(72)【発明者】

【氏名】連 金城

(72)【発明者】

【氏名】平 家鳳

(72)【発明者】

【氏名】李 詩▲ウェン▼

(72)【発明者】

【氏名】陳 奕潔

【審査官】 井上 明子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０７５５９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１８０１４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５３６６２２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００−３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）の化合物、前記式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩およびこれらの組み合わせから構成される群から選択される、有効量のアニリン誘導体を含み、

【化1】

Ｒ_１はＣ１からＣ６のアルキル基であり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_３、Ｒ_５およびＲ_７は、それぞれ独立して、Ｈまたはハロゲンであり、Ｒ_４およびＲ_６は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１からＣ４のアルキル基である、
ウイルス感染を治療するための医薬組成物。

【請求項2】

前記アニリン誘導体は、エチル２−（３’，５’−ジメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレートである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

ウイルスに抑制されたヤヌスキナーゼシグナル伝達兼転写活性化因子（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路の活性化、ウイルスに抑制されたプロテインキナーゼＡｋＴ−哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ＡｋＴ−ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路の活性化、ウイルスに抑制された細胞外シグナル制御キナーゼｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＥＲＫ−ＣＲＥＢ）シグナル伝達経路の活性化、ウイルス感染細胞におけるインターフェロンの発現の促進、ウイルス感染細胞におけるインターフェロン受容体の発現の促進、ウイルス感染細胞におけるインターフェロン制御因子の発現の促進、ウイルス感染細胞におけるプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の発現の促進、および、ウイルス感染細胞におけるオリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）の発現の促進のうちの、少なくとも１つのためのものである、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ウイルス感染細胞におけるインターフェロンの発現の促進、ウイルス感染細胞におけるインターフェロン受容体の発現の促進、および、ウイルス感染細胞におけるインターフェロン制御因子の発現の促進のうちの、少なくとも１つのためのものであり、
前記インターフェロンはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）の少なくとも１つであり、前記インターフェロン受容体はインターフェロン−α受容体−１（ＩＦＮＡＲ１）であり、前記インターフェロン制御因子はインターフェロン制御因子−３（ＩＲＦ−３）およびインターフェロン制御因子−７（ＩＲＦ−７）の少なくとも１つである、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

ウイルス誘発性アポトーシスの阻害、ウイルス誘発性細胞変性効果の阻害、および、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害のうちの、少なくとも１つのためのものである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ウイルスは、フラビウイルス属ウイルスおよびエンテロウイルス属ウイルスの少なくとも１つである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ウイルスは、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ）およびエンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）の少なくとも１つである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記デングウイルスは、デングウイルス２型（ＤＥＮ２）である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

有効量のインターフェロンをさらに含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

エンテロウイルス感染を治療するためのものであり、
前記インターフェロンは、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）の少なくとも１つである、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

エンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）感染を治療するためのものであり、
前記インターフェロンは、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）である、請求項９に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アニリン誘導体を含む、ウイルス感染を治療するための医薬組成物に関する。特に、本発明は、ウイルス誘発性アポトーシスを阻害し、ウイルス誘発性細胞変性効果を阻害し、および／または、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害するための医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、ウイルス感染の治療における相乗効果を提供するために、インターフェロンをさらに含むか、またはインターフェロンと組み合わせて使用されてもよい。

【背景技術】

【0002】

ウイルスは細胞ではなく、遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびタンパク膜から構成されている（いくつかのウイルスは、宿主細胞の表面に到達した場合には、タンパク膜を取り囲む脂質のエンベロープを形成することができる）。ウイルスは保護コートによって被覆された、ＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントである。ウイルスは、その単純な構成のために自身により複製することはできない。ウイルス複製は、感染メカニズムを通した宿主細胞のシステムを利用することによって、種々のウイルスのタンパク質およびウイルスの核酸を合成し、構築するように行われる。ウイルス感染細胞を通したウイルスの複製周期は、次の約６段階に分類することができる。付着、侵入、脱殻、合成、構築および放出である。

【0003】

同属におけるウイルスの遺伝子構造および複製周期は非常に類似していることが知られている。例えば、フラビウイルス属ウイルスのゲノムは、プラス一本鎖ＲＮＡである。全ゲノムは約１１キロ塩基（ｋｂ）長である。ゲノムにおける遺伝子配列は、高い保存性を有する。例えば、ゲノムＲＮＡの５’末端にＩ型キャップを有し、ゲノムＲＮＡの３’末端はポリＡ端部を欠いており、ゲノムＲＮＡの５’末端および３’末端のそれぞれは非翻訳領域（ＵＴＲ）を有している。これらは、高く保存された二次構造を形成することができる。２つのＵＴＲ間には、大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。当該ＯＲＦは、順次、３つの構造タンパク質（すなわち、コアタンパク質、プレ膜タンパク質、エンベロープタンパク質）、ならびに７つの非構造タンパク質、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５を生成するポリペプチドへと翻訳され得る。フラビウイルス属ウイルスのウイルス粒子は、受容体媒介エンドサイトーシスを通って宿主細胞へと入るために、そのエンベロープタンパク質により宿主細胞上の受容体へと結合することができる。その後、当該ウイルス粒子は、宿主細胞のエンドソームと膜融合を行うために、エンドソームの酸性化によりエンベロープタンパク質の構造を変化させる。それによって、宿主細胞のサイトゾルの中へウイルスＲＮＡゲノムが放出される。そして、ウイルスゲノムのタンパク質翻訳は、宿主細胞内において直接的に行われ、小胞体（ＥＲ）におけるシグナルペプチターゼおよびウイルスＮＳ２ＢＮＳ３プロテアーゼによって分断される長鎖ポリタンパク質を生成する。その結果、前述した３つの構造タンパク質および７つの非構造タンパク質が生じる。ウイルス粒子を形成するように、ウイルスゲノムは複製され、ＥＲにおいて集まってきたウイルスタンパク質で構築される。その後、ウイルス粒子はゴルジ体へと輸送され、エキソサイトーシスを通してウイルス感染細胞から放出される。

【0004】

エンテロウイルス属ウイルスは、プラス一本鎖ＲＮＡである。全ゲノム長は、約７．４ｋｂである。ゲノムにおける遺伝子配列は、高い保存性を有する。例えば、ＶＰｇ−５’−ＮＣＲ、ＶＰ０（ＶＰ４、ＶＰ２）、ＶＰ３、ＶＰ１、ＶＰ２Ａ、ＶＰ２Ｂ、ＶＰ２Ｃ、ＶＰ３Ａ、ＶＰ３Ｂ、ＶＰ３Ｃ、ＶＰ３Ｄおよび３’末端へ連結されているポリＡ端部は、ゲノムＲＮＡの５’末端から３’末端へと、順次、存在している。ＶＰ０は、分離前におけるＶＰ４およびＶＰ２の前駆体である。ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４はエンテロウイルスの構造タンパク質であり、宿主細胞におけるウイルス感染の特性に関するものである。これらの構造タンパク質のうち、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３はウイルスのカプシドを構成するための最初のタンパク質であり、ＶＰ１は細胞受容体の結合にも関連するものである。エンテロウイルス属ウイルスのウイルス粒子が、宿主細胞の表面上の受容体に結合した場合、ウイルスタンパク質ＶＰ１のＮ末端が構造的に変化する。ＶＰ１はウイルス粒子の内側から外側へと移動し、宿主細胞の受容体とチャネルを形成する。それによって、ウイルスのゲノムＲＮＡを導き、宿主細胞の中へと入るようにする。そして、ウイルスゲノムＲＮＡは多タンパク質中において翻訳され、ＶＰ２Ａ、ＶＰ３ＣおよびＶＰ３ＣＤのようなウイルスタンパク質に分断されて、ウイルス外皮タンパク質およびＲＮＡポリメラーゼを生成し、ウイルスゲノムＲＮＡの複製を達成して感染能を有する新たなウイルス粒子を形成する。

【0005】

ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）およびデングウイルス（ＤＥＮ）のような、フラビウイルス属におけるいくつかのウイルスは、人体において深刻な病気を引き起こすことが知られている。日本脳炎ウイルスまたはデングウイルスによって引き起こされる病気は、最も深刻である。日本脳炎ウイルスは、蚊に刺されることによって感染する。そして、日本脳炎ウイルス感染は、重篤な脳の髄膜炎（“日本脳炎”とも示される）を引き起こし、脳、脊髄および髄膜の損傷へと導く。日本脳炎ウイルスの感染は、通常、夏において発生し、シベリア、インド、中国、台湾、日本、韓国、フィリピンおよびタイを含む、東南アジアにおいて流行するものである。毎年、約３０，０００から５０，０００の確認例が報告されている。台湾における日本脳炎ウイルスの感染は、毎年５月と１０月との間に起こり、通常７月においてピークとなる。また、特に、無菌性髄膜炎および呼吸不全のような重篤な状態まで達した場合には、死亡率は、３０から７０％までの範囲となる。死亡率は、特に、６歳未満の子供と６５歳以上の弱い免疫系を有する人との間において、かなり高くなっている。本格的なワクチン接種は、台湾、日本、韓国、タイおよびシンガポールにおいてのみ利用できる。現在までに、治療のために使用できる特定の薬剤はない。補助療法に加えて、クリニックにおいて使用されている唯一の治療は、抗ウイルス剤、リバビリンおよびインターフェロンを組み合わせているものである。しかし、予後は良くなく、そのような治療は通常深刻な後遺症をもたらす。

【0006】

デングウイルスは、抗原性において４つの異なる血清型に分類される。１型、２型、３型および４型である。デングウイルスに感染した患者は、高熱（≧３８℃）、頭痛、眼窩後部痛、筋肉痛、関節痛および発疹の突然の徴候のような症状を示し、これは“典型的なデング熱”として呼ばれる。さらに、デングウイルスの異なる型に感染した場合には、“出血性デング熱”となる可能性が、より高くなる。前述した典型的なデング熱の症状に加え、出血性デング熱は出血を引き起こす可能性がある。発症率は、特に、１５歳未満の子供の間において高い。もし、すぐに治療しなかった場合には、重篤な出血によって引き起こされる過剰な血漿漏出が、損傷または死に至らせる可能性もある。死亡率は、最大で５０％となり得る。デング熱は通常暖かいシーズンにおいて起こり（すなわち、５月から１０月）、６１か国を含む亜熱帯気候での世界全領域（すなわち、北緯２５度と南緯２５度との間の領域）において流行するものである。約１５億人が、デング熱感染の危険の中において居住している。１９７０年と１９８０年との間では、毎年、約２５０，０００の出血性デング熱の感染があった。デング熱は１９８０年代から世界的に広がっていった。現在までにワクチンは使用されておらず、特定の薬剤はなく、唯一の治療は補助療法である。

【0007】

エンテロウイルス属ウイルスは、コクサッキーウイルスＡ群（ＣＶＡ）の２３の型、コクサッキーウイルスＢ群（ＣＶＢ）の６つの型、ポリオウイルスの３つの型、エコーウイルスの３０の型、およびエンテロウイルス６８型から７１型（ＥＶ６８からＥＶ７１）を含む。エンテロウイルスは主に３歳未満の子供に感染し、通常夏および秋において感染する。エンテロウイルス感染者は、手足口病およびヘルパンギーナのような、通常の風邪のような目立たない症状を有し得る。時には、エンテロウイルス感染は、無菌性髄膜炎、ウイルス性脳炎、心筋炎、麻痺症候群および急性出血性結膜炎のような、特別な臨床症状へとつながり得る可能性もある。１９９０年から、台湾、香港、中国、日本、マレーシア、シンガポールおよびマカオにおいて、感染例が挙がっている。台湾では、エンテロウイルス感染例が１年中通して見られる。ピークシーズンは、４月と９月との間である。１９９８年には、ＥＶ７１およびコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡＶ１６）によって引き起こされた、手足口病およびヘルパンギーナの１３０，０００症例があり、最大の流行となった。ほとんどの症例は５月と７月との間、および９月と１１月との間において報告され、４００の重篤症例と７８の死亡例とを含んでいた。エンテロウイルス感染、特にＥＶ７１感染を治療するための特定の薬剤はない。唯一、補助療法が症状に応じて使用されている。台湾において開発されている１つのワクチンが存在するが、まだ臨床試験のＩＩ期における状態であり、これは臨床用から少なくとも４から５年かかってしまう。さらに、エンテロウイルスは１００以上の型が存在するため、単一のワクチンの使用で、いくつもの種類のエンテロウイルスを治療することが可能かどうかは不明である。さらに、いくつかの製薬会社は、現在、エンテロウイルスを阻害することができる薬剤の調査を行っている工程にある。しかし、これらの薬剤の全てがまだ臨床試験中であり、子供における安全性が十分に評価されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

効果的にウイルス感染を治療するためには、補助療法では不十分なので、薬剤の開発の必要性および緊急性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、本発明の式（Ｉ）の化合物が、効果的に、ウイルス誘発性アポトーシスを阻害し、ウイルス誘発性細胞変性効果を阻害し、およびウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害することができるということ見出した。さらに、式（Ｉ）の化合物は、ウイルス感染の治療における相乗効果を生み出すために、インターフェロンと組み合わせて同時または順次に使用することができる。特に、本発明の式（Ｉ）の化合物は、フラビウイルス属ウイルスおよびエンテロウイルス属ウイルスにおいて、とりわけ日本脳炎ウイルス、デングウイルスおよび／またはエンテロウイルス７１型において、前述した効果を生ずる。

【0010】

本発明の目的は、ウイルス感染を治療するための薬剤の製造において、アニリン誘導体の使用を提供することである。当該アニリン誘導体は、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される。

【0011】

【化1】

【0012】

Ｒ_１はＣ１からＣ１０のアルキル基であり、Ｒ_２はＨまたはＣ１からＣ４のアルキル基であり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１からＣ１０のアルキル基、Ｃ１からＣ１０のアルコキシル基または（Ｃ１からＣ１０のアルキレン基）−Ｏ−Ｏ−（Ｃ１からＣ１０のアルキル基）である。好ましくは、Ｒ_１はＣ１からＣ６のアルキル基であり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１からＣ４のアルキル基、Ｃ１からＣ４のアルコキシル基または（Ｃ１からＣ４のアルキレン基）−Ｏ−Ｏ−（Ｃ１からＣ６のアルキル基）である。さらに好ましくは、Ｒ_１はＣ１からＣ６のアルキル基であり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１からＣ４のアルキル基である。

【0013】

本発明の別の目的は、対象におけるウイルス感染を治療するための方法を提供することである。当該方法は、必要において対象に有効量の前述のアニリン誘導体を投与することを含む。

【0014】

本発明のさらに別の目的は、ウイルス感染を治療するための医薬組成物を提供することである。当該医薬組成物は、前述のアニリン誘導体を含む。

【0015】

詳細な技術および本発明のために実施された好ましい実施の形態は、この技術分野における当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように、添付された図面と共に後の段落において記載される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】実施例１における、化合物１により処置されたＢＨＫ−２１細胞の生存率を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は細胞生存率を表し、横軸は化合物１の濃度を表す。

【図1B】実施例１における、化合物１により処置されたＴＥ６７１細胞の生存率を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は細胞生存率を表し、横軸は化合物１の濃度を表す。

【図1C】実施例１における、化合物１により処置されたＲＤ細胞の生存率を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は細胞生存率を表し、横軸は化合物１の濃度を表す。

【図2A】化合物１が、ＢＨＫ−２１細胞のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染誘発性細胞変性効果を阻害していることを示す撮影図である。

【図2B】化合物１が、ＴＥ６７１細胞のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染誘発性細胞変性効果を阻害していることを示す撮影図である。

【図3A】初期アポトーシスへと入るＢＨＫ−２１細胞の割合を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は細胞数の割合を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図3B】後期アポトーシスへと入るＢＨＫ−２１細胞の割合を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は細胞数の割合を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図4A】初期アポトーシスへと入るＴＥ６７１細胞の割合を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は細胞数の割合を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図4B】後期アポトーシスへと入るＴＥ６７１細胞の割合を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は細胞数の割合を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図5A】４８時間においてＪＥＶ Ｔ１Ｐ１を感染させたＢＨＫ−２１細胞中のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の複製を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸はウイルス力価を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図5B】７２時間においてＪＥＶ Ｔ１Ｐ１を感染させたＢＨＫ−２１細胞中のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の複製を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸はウイルス力価を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図6A】３６時間においてＪＥＶ Ｔ１Ｐ１を感染させたＴＥ６７１細胞中のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の複製を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸はウイルス力価を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図6B】４８時間においてＪＥＶ Ｔ１Ｐ１を感染させたＴＥ６７１細胞中のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の複製を示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸はウイルス力価を表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図7】ヤヌスキナーゼシグナル伝達兼転写活性化因子（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路関連タンパク質、プロテインキナーゼＡｋＴ−哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ＡｋＴ−ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路関連タンパク質、および、細胞外シグナル制御キナーゼｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＥＲＫ−ＣＲＥＢ）シグナル伝達経路関連タンパク質における、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染によって抑制されたリン酸化が、化合物１によって活性化することを示しているウェスタンブロッティングの図である（ＪＡＫ１はヤヌスキナーゼ１を表し、ＪＡＫ２はヤヌスキナーゼ２を表し、Ｔｙｋ２はチロシンキナーゼ２を表し、ＳＴＡＴ１はシグナル伝達兼転写活性化因子１を表し、ｍＴＯＲは哺乳類ラパマイシン標的タンパク質を表し、ＥＲＫ１／２は細胞外シグナル制御キナーゼ１／２を表し、ＣＲＥＢはｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質を表し、Ｔｙｒはチロシンを表し、Ｓｅｒはセリンを表し、Ｔｈｒはスレオニンを表す）。

【図8A】化合物１がＴＥ６７１細胞における抗ウイルス遺伝子（ＰＫＲ）の相対発現レベルを活性化させることを示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は抗ウイルス遺伝子の相対発現レベルを表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図8B】化合物１がＴＥ６７１細胞における抗ウイルス遺伝子（ＯＡＳ）の相対発現レベルを活性化させることを示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は抗ウイルス遺伝子の相対発現レベルを表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図8C】化合物１がＴＥ６７１細胞における抗ウイルス遺伝子（ＩＦＮ−α）の相対発現レベルを活性化させることを示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は抗ウイルス遺伝子の相対発現レベルを表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図8D】化合物１がＴＥ６７１細胞における抗ウイルス遺伝子（ＩＦＮ−β）の相対発現レベルを活性化させることを示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は抗ウイルス遺伝子の相対発現レベルを表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図8E】化合物１がＴＥ６７１細胞における抗ウイルス遺伝子（ＩＦＮＡＲ１）の相対発現レベルを活性化させることを示す統計的棒グラフの図である（^＊ｐ＜０．００５：推計的有意性、^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は抗ウイルス遺伝子の相対発現レベルを表し、横軸の上段はＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図9】化合物１がＤＥＮ２感染誘発性細胞変性効果を阻害することを示す撮影図である。

【図10】化合物１がＨｙｈ７細胞におけるＤＥＮ２複製を阻害することを示す曲線図であり、縦軸はＤＥＮ２ ＮＳ１タンパク質発現レベルを表し、横軸は化合物１の濃度を表す。

【図11】化合物１がエンテロウイルス感染誘発性細胞変性効果を阻害することを示す撮影図である。

【図12A】化合物１により処置されたＲＤ細胞におけるエンテロウイルス複製を示す統計的棒グラフの図である（^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸はウイルス力価を表し、横軸の上段はＥＶ７１感染＋（プラス）を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図12B】化合物１により処置されたＲＤ細胞におけるエンテロウイルス複製を示す統計的棒グラフの図である（^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸は阻害率を表し、横軸の上段はＥＶ７１感染＋（プラス）を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図13】エンテロウイルス感染誘発性細胞変性効果を阻害する、化合物１とインターフェロンとの組み合わせを示す撮影図である。横軸の上段はＥＶ７１感染＋（プラス）または−（マイナス）かを表し、横軸の中段はインターフェロン−βの濃度を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【図14】エンテロウイルス複製が化合物１とインターフェロンとの組み合わせにより阻害されることを示す統計的棒グラフの図である（^＊＊ｐ＜０．００１：推計的有意性）。縦軸はウイルス力価を表し、横軸の上段はＥＶ７１感染＋（プラス）を表し、横軸の中段はインターフェロン−βの濃度を表し、横軸の下段は化合物１の濃度を表す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下に、詳細における本発明のいくつかの実施の形態について記載する。しかし、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は種々の実施の形態において具体化され得るし、本明細書に記載される実施の形態に限定されるべきではない。さらに、本明細書において他に言及のない限り、本明細書において（特に、特許請求の範囲において）用いられる“１”、“当該”および同様の用語は、単数形式および複数形式の両方を包含するように理解されるべきである。さらに、本明細書において使用されている“有効量”または“治療のための有効量”という用語は、必要において対象に投与される場合、被疑対象における治療されている状態を少なくとも部分的に緩和することができる化合物の量を示している。本明細書において使用されている“対象”という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む、哺乳動物を示している。

【0018】

他に言及しない限り、本明細書において使用されている“式（Ｉ）のアニリン誘導体”という用語は、式（Ｉ）のアニリン誘導体、式（Ｉ）のアニリン誘導体の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）のアニリン誘導体の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせを含む。

【0019】

一般的に、ウイルスに感染した後には、ウイルス感染細胞は、免疫系に関連するシグナル伝達経路を活性化するために、通常インターフェロンを、特にＩ型インターフェロンを分泌する。当該シグナル伝達経路は、ヤヌスキナーゼシグナル伝達兼転写活性化因子（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路、プロテインキナーゼＡｋＴ−哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ＡｋＴ−ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路、および、細胞外シグナル制御キナーゼｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＥＲＫ−ＣＲＥＢ）シグナル伝達経路を含む。これにより、ウイルス感染細胞に、抗ウイルスタンパク質の生成と、ウイルス侵入から守るための免疫応答の誘導とを促進させる。しかし、ウイルスは、ウイルス感染細胞の遺伝物質を制御するように、自身をウイルス感染細胞のゲノム中に融合させることができ、ウイルス感染細胞の物質および酵素を使用することにより複製のために必要とされる種々のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を合成することができる。これは、免疫系シグナル伝達経路の活性化を阻害するようになされており、この結果、ウイルス感染細胞における免疫系による排除を逃れている。

【0020】

本発明者らは、下記の式（Ｉ）のアニリン誘導体が、ウイルス誘発性アポトーシスを阻害し、ウイルス誘発性細胞変性効果を阻害し、および／または、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害する機能を有し、ウイルス感染の治療における相乗効果を生み出すために、インターフェロンと組み合わせて同時または順次に使用することができることを見出した。

【0021】

【化2】

【0022】

Ｒ_１はＣ１からＣ１０のアルキル基であり、Ｒ_２はＨまたはＣ１からＣ４のアルキル基であり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１からＣ１０のアルキル基、Ｃ１からＣ１０のアルコキシル基または（Ｃ１からＣ１０のアルキレン基）−Ｏ−Ｏ−（Ｃ１からＣ１０のアルキル基）である。

【0023】

従って、本発明はアニリン誘導体の適用を提供する。これには、ウイルス感染を治療するための薬剤の製造におけるアニリン誘導体の使用、ウイルス感染を治療するためにアニリン誘導体を必要とする対象に投与すること、および、アニリン誘導体を含む医薬組成物を提供することが含まれる。当該アニリン誘導体は、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される。

【0024】

【化3】

【0025】

Ｒ_１はＣ１からＣ１０のアルキル基であり、Ｒ_２はＨまたはＣ１からＣ４のアルキル基であり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１からＣ１０のアルキル基、Ｃ１からＣ１０のアルコキシル基または（Ｃ１からＣ１０のアルキレン基）−Ｏ−Ｏ−（Ｃ１からＣ１０のアルキル基）である。

【0026】

本発明において使用される式（Ｉ）のアニリン誘導体は、対応するアニリンの反応から調製することができる。例えば、Ｒ_２がＨである場合、式（Ｉ）の化合物は以下の反応を通して提供され得る。

【0027】

【化4】

【0028】

上述の合成スキームにより示されているように、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中における水素化ナトリウム（ＮａＨ）の懸濁液を調製し、所望するアニリン誘導体に対応する置換基Ｒ_１を有する化合物（Ａ）を当該懸濁液に添加し（例えば、所望するアニリン誘導体におけるＲ_１がエチル基である場合、化合物（Ａ）はマロン酸ジエチルである）、その後、環化反応を行って中間化合物（Ｂ）を生成させるために、塩化クロロアセチル（ＣｌＣＨ_２ＣＯＣｌ）を加える（例えば、所望するアニリン誘導体におけるＲ_１がエチル基である場合、環化反応の生成物である化合物（Ｂ）は、エチル２−エトキシ−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレートである）。次いで、対応しており、所望する式（Ｉ）のアニリン誘導体を提供する縮合反応を行うために、任意に置換されたアニリンを加える。

【0029】

好ましくは、本発明において使用されるアニリン誘導体は、式（Ｉ）の化合物において、Ｒ_１はＣ１からＣ６のアルキル基であり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１からＣ４のアルキル基、Ｃ１からＣ４のアルコキシル基または（Ｃ１からＣ４のアルキレン基）−Ｏ−Ｏ−（Ｃ１からＣ６のアルキル基）である。さらに好ましくは、式（Ｉ）において、Ｒ_１はＣ１からＣ６のアルキル基であり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１からＣ４のアルキル基である。

【0030】

本発明において使用される式（Ｉ）のアニリン誘導体の実施の形態は、限定はされないが、次の化合物を含む。
（１）エチル２−（３’，５’−ジメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（２）エチル２−（３’−メトキシアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（３）エチル２−（２’−メチル−４’−クロロ−アニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（４）エチル２−（２’−エトキシカルボニルメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（５）エチル２−（３’，４’，５’−トリメトキシアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（６）エチル２−（３’−ヒドロキシアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（７）エチル２−（３’−クロロアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（８）エチル２−（３’，５’−ジメトキシアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；
（９）エチル２−アニリノ−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート；および
（１０）エチル２−（３’，４’−ジメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート。

【0031】

本発明のいくつかの実施の形態では、エチル２−（３’，５’−ジメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレートが、式（Ｉ）のアニリン誘導体として使用されている。

【0032】

本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体が、効果的に、ウイルス誘発性アポトーシスを阻害し、ウイルス誘発性細胞変性効果を阻害し、および／または、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害することができるということが見出された。

【0033】

特に、本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体は、ウイルス感染細胞における、ウイルス抑制シグナル伝達経路を効果的に活性化することができる。当該シグナル伝達経路の活性化は、限定はされないが、ウイルス感染細胞におけるウイルス抑制ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化、ウイルス感染細胞におけるウイルス抑制ＡｋＴ−ｍＴＯＲシグナル伝達経路の活性化、およびウイルス感染細胞におけるウイルス抑制ＥＲＫ−ＣＲＥＢシグナル伝達経路の活性化のようなものを含む。

【0034】

さらに、本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体は、ウイルス感染細胞における、抗ウイルス遺伝子の発現を効果的に促進することもできる。抗ウイルス遺伝子の例としては、インターフェロン、インターフェロン受容体、インターフェロン制御因子、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）およびオリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）が挙げられる。インターフェロンの例には、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）が含まれる。インターフェロン受容体の例には、インターフェロン−α受容体−１（ＩＦＮＡＲ１）が含まれる。インターフェロン制御因子の例には、インターフェロン調節因子−３（ＩＲＦ−３）およびインターフェロン調節因子−７（ＩＲＦ−７）が含まれる。

【0035】

本発明のいくつかの実施の形態では、式（Ｉ）のアニリン誘導体は、フラビウイルス属ウイルスによって引き起こされた病気の治療のために使用される。フラビウイルス属におけるウイルスのうち、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）およびデングウイルス（ＤＥＮ）のようなウイルスは、今まで人体に重篤な疾患を引き起こしてきた。本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体は、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルス（特に、デングウイルス２型）によって引き起こされた感染の治療において、とりわけ効果的である。

【0036】

本発明のいくつかの他の実施の形態では、式（Ｉ）のアニリン誘導体は、エンテロウイルス属ウイルスによって引き起こされた病気の治療のために使用される。エンテロウイルス属ウイルスは、コクサッキーウイルスＡ群（ＣＶＡ）の２３の型、コクサッキーウイルスＢ群（ＣＶＢ）の６つの型、ポリオウイルスの３つの型、エコーウイルスの３０の型、およびエンテロウイルス６８型から７１型（ＥＶ６８からＥＶ７１）を含む。本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体は、特に、エンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）の治療に効果的である。

【0037】

ウイルス感染を治療するために、本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体は、相乗効果を生み出すように、インターフェロンと組み合わせて同時または順次に使用されてもよい。インターフェロンの例としては、限定されないが、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを含む。本発明の１つの実施の形態では、式（Ｉ）のアニリン誘導体は、ＩＦＮ−βと組み合わせて同時に使用される。前述した相乗作用は、エンテロウイルス感染の治療において、特にＥＶ７１感染の治療において、顕著に効果的である。

【0038】

本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体は、ウイルス感染を治療するための医薬組成物を提供するために、または、ウイルス感染を治療するための薬剤を製造するために、使用され得る。特に、医薬組成物または薬剤は、前述したウイルスの感染を治療するためのものである。医薬組成物または薬剤は、任意の形態において製造することが可能であり、任意の適切な形態において投与され得る。例えば、薬剤は、経口、皮下、鼻腔内または静脈により必要とする対象に投与することができるが、これらに限定されない。形態および目的に応じて、医薬組成物および薬剤は、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含むこともできる。

【0039】

経口投与の場合、本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体を使用することにより提供される医薬組成物、または製造される薬剤は、式（Ｉ）のアニリン誘導体の所望される活性に悪影響を与えないと考えられる、薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。キャリアは、溶媒、油性溶媒、希釈剤、安定化剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、酸化防止剤、結合剤、潤滑剤および水分吸収剤等のようなものを含む。医薬組成物または薬剤は、タブレット、カプセル、顆粒、粉末、流体抽出液、溶液、シロップ、懸濁液、乳剤およびチンキ剤等のような、経口投与のための任意の形態において提供され得る。

【0040】

皮下または静脈投与の場合、本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体を使用することにより提供される医薬組成物、または製造される薬剤は、等張液、生理食塩緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液）、可溶化剤、乳化剤および他のキャリア等のような、１または複数の組成物を含んでもよい。これは、静脈注射剤、エマルジョン静脈注射剤、粉末注射剤、懸濁液注射剤および粉末懸濁液注射剤等のような、医薬組成物または薬剤を提供するためである。

【0041】

任意において、本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体を使用することにより提供される医薬組成物、または製造される薬剤は、結果物としての医薬組成物または薬剤の味および外観を向上させるために、香味剤、トナーおよび着色剤等のような他の添加物を含んでもよい。また、医薬組成物または薬剤の保存性を改善するために、適切な量の防腐剤、保存剤、消毒剤および抗菌剤等も添加してもよい。さらに、医薬組成物または薬剤は、当該医薬組成物または薬剤の効能を増大させるため、もしくは当該医薬組成物または薬剤の適応柔軟性および順応性を増加させるために、１または複数の他の活性成分を含んでもよく、または、１または複数の他の活性成分を含む薬剤と組み合わせて使用されてもよい。しかし、これは、当該他の活性成分が、式（Ｉ）のアニリン誘導体の所望される効果に悪影響を及ぼさない場合に限る。例えば、当該活性成分は、インターフェロン（例えばＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β）、酸化防止剤（例えばビタミンＥ）または免疫調節因子等が挙げられる。本発明の１つの実施の形態では、エンテロウイルス感染を治療するための医薬組成物または薬剤において、さらに、インターフェロンが含まれる。例えば、ＥＶ７１感染の治療のための医薬組成物または薬剤において、さらに、ＩＦＮ−βが含まれる。

【0042】

本発明の式（Ｉ）のアニリン誘導体を使用することにより提供される医薬組成物、または製造される薬剤は、対象の必要性に応じて、１日に１回、１日に数回または数日に１回のような、様々な投与頻度において適用することができる。例えば、日本脳炎ウイルス感染を治療するために人体に適用される場合、医薬組成物または薬剤の投薬量は、１日に、約１５ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重から、約３５ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重である。好ましくは、１日に、約２０ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重から、約２５ｍｇ（式（Ｉ）の化合物として）／ｋｇ−体重である。ここで、“ｍｇ／ｋｇ−体重”という用語は、治療される対象のｋｇ体重毎において必要とされる量を意味する。しかし、重篤な状態を有する患者には、実践的な要求に応じて、投薬量を数倍または数十倍に増加させることができる。例えば、ウイルス感染治療の薬剤を製造するための、エチル２−（３’，５’−ジメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレートの使用において、薬剤の投薬量は、約２５ｍｇ（エチル２−（３’，５’−ジメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレートとして）／ｋｇ−体重となり得る。

【0043】

本発明は、必要としている対象におけるウイルス感染を治療するための方法をも提供する。当該方法は、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能なエステルおよびこれらの組み合わせから構成される群から選択される有効量のアニリン誘導体を、対象へ投与することを含む。アニリン誘導体、ならびにそれらを投与する際の形態および量の選択については、上記に沿った内容と同様である。

【0044】

本発明は、さらに、以下の特定の実施例の詳細において説明される。しかし、以下の実施例は、本発明を説明するためのみに提供されるものにすぎず、それにより本発明の範囲は限定されない。

【実施例】

【0045】

（実施例１）式（Ｉ）の化合物の調製
（Ａ）２−（３’，５’−ジメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート（化合物１）の合成
乾燥ＴＨＦ（４０ｍｌ）中においてＮａＨの懸濁液（６０％、８．０ｇ、０．２モル）を調製し、マロン酸ジエチル（３２．０ｇ、０．２モル）およびＴＨＦ（５０ｍｌ）を混合したものを当該懸濁液中において滴下して加えて、混合溶液を準備した。その後、当該混合溶液を１０から１２℃へと冷却した。次いで、ＴＨＦ（１００ｍｌ）中のＣｌＣＨ_２ＣＯＣｌ（１１．３ｇ、０．１モル）の溶液を、当該混合溶液に滴下して加えた。その後、混合溶液を、１０から１２℃の低温度下において１時間保ち、次いで、温水（４０から４５℃）によって１時間温め、そして１０から１２℃に冷却した。その後、ＴＨＦ（５０ｍｌ）中の３，５−ジメチルアニリン（１２．１ｇ、０．１モル）の溶液を、上述した混合溶液に滴下して加え、室温下において１時間攪拌し、水浴上において数時間加熱した。得られた反応溶液の反応が完了しているかどうかの確認は、ＴＬＣによって調べた。その後、おおよそのＴＨＦを取り除くように反応溶液を減圧濃縮し、残留物を得た。当該残留物は、黄色の粘性物質である。次いで、黄色の粘性物質をフラスコ内に入れて、冷水（６００ｍｌ）およびｎ−ヘキサン（３００ｍｌ）をその中に注いだ。フラスコを激しく振とうさせると、沈殿物が観察された。当該沈殿物を、ブフナー漏斗により濾過および回収し、ｎ−ヘキサン（１００ｍｌ）および少量のエタノールのそれぞれにより一度洗浄した。その後、得られた残留物を加熱し、１２５ｍｌのエタノール中において溶解させた。そして、溶解していない不純物を取り除くために、まだ熱いうちに、当該溶液を濾過した。当該濾過では、結晶化が起こるまで、そのまま放置しておいた。その後、結晶を回収し、エタノールによって再結晶化させた。２１．７４ｇの結晶ブロックが得られた。生産率は７９％であり、結晶の融点は１４４から１４７℃の範囲であった。光学スペクトルのデータは次の通りであった。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７５（Ｍ^＋），ＩＲ（ＫＢｒ ｄｉｓｃ）ｃｍ^−１：３２５１．５（−ＮＨ−），１７０８．６（Ｃ_４＝Ｏ），１６６２．８（Ｃ_３−ＣＯ−ＯＥｔ）；ＵＶλ_ｍａｘｎｍ（ＣＨＣｌ_３）（ｌｏｇε）：２８３（４．４５）；^１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：１．２４０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．２５６（６Ｈ，ｓ，Ｃ_３’−ＣＨ_３，Ｃ_５’−ＣＨ_３），４．２０２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−１’’），４．６７（２Ｈ，ｓ，Ｈ−５），６．８８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４’），７．０５（２Ｈ，ｓ，Ｈ−２’，Ｈ−６’），１０．１２７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１４．６２（Ｃ−２’’），２１．０４（３’−ＣＨ_３，５’−ＣＨ_３），５９．４１（Ｃ−１’’），７５．４１（Ｃ−５），８６．８５（Ｃ−３），１２０．５８（Ｃ−２’，Ｃ−６’），１２７．７３（Ｃ−４’），１３５．０３（Ｃ−１’），１３５．０３（Ｃ−３’，Ｃ−５’），１６４．３２（Ｃ−２），１７７．２５（Ｃ−３’’），１８８．６５（Ｃ−４）。

【0046】

（Ｂ）エチル２−（３’−メトキシアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート（化合物２）の合成
化合物１の調製手順において、３’，５’−ジメチルアニリンを、３’−メトキシアニリン（１０．７１ｇ、０．１モル）に置き換えて調製した。２１．６ｇの白色針状結晶が得られた。生産率は７８％であり、結晶の融点は１４０．７℃であった。光学スペクトルのデータは次の通りであった。ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：２７８（Ｍ^＋＋１，９．１２），２７７（Ｍ^＋，５３．０４），２３１（Ｍ^＋−４６，１００）；ＩＲ（ＫＢｒ ｄｉｓｃ）ｃｍ^−１：３２８２（−ＮＨ−），１７０３．１４（Ｃ_４＝Ｏ），１６６２．４７（Ｃ_３−ＣＯ−ＯＥｔ）；ＵＶλ_ｍａｘｎｍ（ＭｅＯＨ）（ｌｏｇε）：２８３．０（４．２１８）；^１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｈ−２’’），３．７５（３Ｈ，ｓ，３’−ＯＣＨ_３），４．３０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｈ−１’’），４．６１（２Ｈ，ｓ，Ｈ−５），６．７〜７．２５（４Ｈ，ｍ，Ｈ−２’，Ｈ−４’，Ｈ−５’，Ｈ−６’），１０．２（１Ｈ，ｓ，−ＮＨ−）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：１４．２２（Ｃ−２’’），５５．１５（３’−ＯＣＨ_３），６０．２８（Ｃ−１’’），７５．２１（Ｃ−５），８７．３９（Ｃ−３），１０７．１５（Ｃ−２’），１１１．０８（Ｃ−４’），１１３．２４（Ｃ−６’），１２９．９６（Ｃ−５’），１３５．６２（Ｃ−１’），１６０．０５（Ｃ−３’），１６５．２６（Ｃ−２），１７７．３４（Ｃ−３’’），１８８．１２（Ｃ−４）。

【0047】

（Ｃ）エチル２−（２’−メチル−４’−クロロ−アニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート（化合物３）の合成
化合物１の調製手順において、３’，５’−ジメチルアニリンを、２’−メチル−４’−クロロ−アニリン（１０．７１ｇ、０．１モル）に置き換えて調製した。１８．５５ｇの白色結晶が得られた。結晶の融点は１１８から１１９℃の範囲であった。光学スペクトルのデータは次の通りであった。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６２（Ｍ^＋＋１，８．８１），２６１（Ｍ^＋，４０．９５）；ＩＲ（ＫＢｒ ｄｉｓｃ）ｃｍ^−１：３１６９．３５（−ＮＨ−），１７０３．６２（Ｃ_４＝Ｏ），１６５１．９６（Ｃ_３−ＣＯ−ＯＥｔ）；ＵＶλ_ｍａｘｎｍ（ＭｅＯＨ）（ｌｏｇε）：２９４．５（４．１７１７）；^１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１．２４５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．２９（３Ｈ，ｓ，２’−ＣＨ_３），４．０３５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−１’’），４．６２（２Ｈ，ｓ，Ｈ−２），７．２０８〜７．４４７（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’，Ｈ−５’，Ｈ−６’），１０．１５（１Ｈ，ｓ，−ＮＨ−）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１４．６９（Ｃ−２’’），１７．６５（２’−ＣＨ_３），５９．３２（Ｃ−１’’），７５．２４（Ｃ−５），８６．６７（Ｃ−３），１２５．４６（Ｃ−６’），１２６．７７（Ｃ−４’），１２７．２７（Ｃ−５’），１３０．６８（Ｃ−３’），１３２．６８（Ｃ−２’），１３３．９２（Ｃ−１’），１６４．２８（Ｃ−２），１７７．６０（Ｃ−３’’），１８８．８１（Ｃ−４）。

【0048】

（Ｄ）エチル２−（２’−エトキシカルボニルメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート（化合物４）の合成

【0049】

（ａ）エチル２−（２’−アミノフェニル）アセテートの調製
２−（２’−ニトロフェニル）酢酸（１８．１ｇ、０．１モル）を９５％エタノール溶液（２００ｍｌ）中に溶解し、８℃の低温度下を保ち、混合溶液を調製するように９８％ＨＣｌ（２０ｍｌ）をゆっくりとその中へ滴下して加えた。当該混合溶液を１時間攪拌し、加熱し、水浴上で４時間還流し、その後室温下において１から２日間攪拌した。得られた反応溶液の反応が完了しているかどうかの確認は、ＴＬＣによって調べた。その後、エタノール溶液を取り除くように、反応溶液を減圧濃縮した。残留物にゆっくりと冷水を加え、ＣＨＣｌ_３によって、何回かにわたって抽出した。得られた抽出物を、乾燥ＭｇＳＯ_４を添加することにより乾燥させ、ＣＨＣｌ_３を取り除くために減圧濃縮し、大きい黄色の凝塊を得た。これは、２−（２’−ニトロフェニル）アセテート（１６．９ｇ、生産率８１％）である。

【0050】

２−（２’−ニトロフェニル）アセテートを、５０ｍｌのエタノールおよび触媒としての１０％パラジウム／炭素混合物（１．０ｇ）と共に、強化ガラスフラスコ内に注いだ。さらに、当該反応溶液を、水素添加のための水添器内に配置した。得られた反応溶液の反応が完了しているかどうかの確認は、ＴＬＣによって調べた。反応完了後、パラジウム／炭素混合物を取り除くために、反応溶液を濾過し、エタノールが取り除かれるように減圧濃縮を行った。そして、黄褐色の粘性の液体である、エチル２−（２’−アミノフェニル）アセテートを得た。

【0051】

（ｂ）エチル２−（２’−エトキシカルボニルメチルアニリノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレートの調製
乾燥ＴＨＦ（４０ｍｌ）中においてＮａＨの懸濁液（６０％、８．０ｇ、０．２モル）を調製し、マロン酸ジエチル（３２．０ｇ、０．２モル）およびＴＨＦ（５０ｍｌ）を混合したものを当該懸濁液中においてゆっくりと加えて、混合溶液を準備した。その後、混合溶液を１０から１２℃へと冷却し、ＴＨＦ（１００ｍｌ）中のＣｌＣＨ_２ＣＯＣｌ（１１．３ｇ、０．１モル）の溶液を、当該混合溶液に滴下して加えた。そして、混合溶液を１０から１２℃の低温度下において１時間保ち、温水（４０から４５℃）によって約１時間温め、次いで１０から１２℃に冷却した。その後、ＴＨＦ（５０ｍｌ）中における、ステップ（ａ）において調製されたエチル２−（２’−アミノフェニル）アセテート（０．１モル）の溶液を、前述の反応溶液に滴下して加え、室温下において１時間攪拌し、水浴上において数時間熱した。得られた反応溶液の反応が完了しているかどうかの確認は、ＴＬＣによって調べた。その後、おおよそのＴＨＦを取り除くように、反応溶液を減圧濃縮した。減圧濃縮フラスコ内には、冷水（６００ｍｌ）を注いだ。そして、減圧濃縮フラスコ内における反応溶液を、ＣＨＣｌ_３によって何回かにわたって抽出した。得られた抽出物を、水によって洗浄し、乾燥ＭｇＳＯ_４により乾燥させ、ＣＨＣｌ_３を取り除くために減圧濃縮を行った。濃縮された溶液は、室温下において結晶化していた。そして、エタノールによって当該結晶を回収および再結晶化させ、１３．６６ｇの白色針状結晶を得た。生産率は４１％であり、結晶の融点は９１．２℃であった。光学スペクトルのデータは次の通りであった。ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：３３２．８（Ｍ^＋，３５．８５），３３３．８（Ｍ^＋＋１，７．７３）；ＩＲ（ＫＢｒ ｄｉｓｃ）ｃｍ^−１：３１２１．８６（−ＮＨ−），１７３７．２８（Ｃ８’＝Ｏ），１６９８．３（Ｃ_４＝Ｏ），１６６４．１９（Ｃ_３−ＣＯ−ＯＥｔ）；ＵＶλ_ｍａｘｎｍ（ＭｅＯＨ）（ｌｏｇε）：２９１．０（３．８２５）；^１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１．１７６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−１０’），１．２３（３Ｈ，ｔ，１６６Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−２’’），３．７６３（２Ｈ，ｓ，Ｈ−７’），４．０４９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−９’），４．１９２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−２’’），４．５７３（２Ｈ，ｓ，Ｈ−５），７．３２１〜７．４５３（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−４’，Ｈ−５’，Ｈ−６’），１０．１１５（１Ｈ，ｓ，−ＮＨ−）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１４．０９（Ｃ−１０’），１４．６５（Ｃ−２’’），３７．２９（Ｃ−７’），５６．３０（Ｃ−１’’），６０．９６（Ｃ−９’），７５．１７（Ｃ−５’），８６．９３（Ｃ−３），１２６．７９（Ｃ−６’），１２７．６４（Ｃ−４’），１２８．１７（Ｃ−２’），１３０．３３（Ｃ−３’），１３１．４４（Ｃ−５’），１３４．０３（Ｃ−１’），１６４．０９（Ｃ−２），１７０．８８（Ｃ−８’），１７７．９０（Ｃ−３’’），１８８．９８（Ｃ−４）。

【0052】

（Ｅ）他のアニリン誘導体（化合物５から１０）の合成
化合物１の調製手順において、３’，５’−ジメチルアニリンを、種々の任意のアニリン置換体（０．１モル）に置き換えて繰り返すと、対応する式（Ｉ）の化合物（すなわち、表１において示される化合物５から１０）が得られた。

【0053】

【化5】

【0054】

【表1】

【0055】

（実施例２）細胞生存率の実施例（ＭＴＴアッセイ）
この実施例では、異なる濃度に調製された化合物１において処置された場合、ＢＨＫ−２１細胞、ＴＥ６７１細胞およびＲＤ細胞の生存率に影響を与えるか否かを、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を使用して調べた。ＢＨＫ−２１細胞、ＴＥ６７１細胞およびＲＤ細胞における化合物１の５０％細胞毒性（ＣＣ５０）濃度も算出した。

【0056】

ＭＴＴは可溶性のテトラゾリウム塩であり、生細胞中のミトコンドリアの呼吸鎖に影響を与え得る。コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）およびシトクロムｃ（ｃｙｔ ｃ）の反応下では、ＭＴＴの構造におけるテトラゾリウムブロミドは代謝還元をおこし、不溶性の紫色の結晶ホルマザンを形成する。従って、（ＳＤＨは死細胞からは消え、死細胞ではＭＴＴを還元させることができないため）生成される結晶の量は、直接的に、生細胞の数に正比例する。さらに、ミトコンドリアは環境に対し最も敏感な細胞小器官であり、ＭＴＴアッセイは薬剤処置後における細胞生存を分析するためのマーカーとして利用することができる。

【0057】

ＢＨＫ−２１細胞、ＴＥ６７１細胞およびＲＤ細胞を、それぞれ、ウェル当たり３×１０^３の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１００μｌのＭＥＭ培地において、９６ウェル培養プレートを用いて培養した。培養プレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れ、一晩インキュベートした。その後、細胞がプレートに付着した後に、培地を取り除いた。次いで、培養プレートのそれぞれのウェルの中に、新たな培地と化合物１を加えた。化合物１の最終濃度は、それぞれ、約０、２．５、２５、１２５、２５０および５００μＭであった。さらに、培養プレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れ、４８時間インキュベートした。インキュベート後、培地を取り除き、培養プレートのそれぞれのウェルの中にＭＴＴ試薬１を１０μｌ加えて、暗所において４時間静置した。その後、培地を取り除き、培養プレートのそれぞれのウェルの中にＭＴＴ試薬２を１００μｌ加えて、暗所において１時間静置した。ＥＬＩＳＡによって、５７０／６３０ｎｍの波長における、サンプルの吸光度を測定した。結果を図１Ａから図１Ｃに示す。

【0058】

図１Ａから図１Ｃにおいて示されるように、ＢＨＫ−２１細胞における化合物１の５０％細胞毒性濃度は、５００μＭよりも大きかった。さらに、ＴＥ６７１細胞およびＲＤ細胞における化合物１の５０％細胞毒性濃度は、それぞれ、１８９μＭおよび２２２μＭであった。これらの結果は、ＢＨＫ−２１細胞、ＴＥ６７１細胞およびＲＤ細胞における化合物１の細胞毒性が、かなり低いということを示している。化合物１は、細胞生存率に悪影響を与えないと考えられる。

【0059】

（実施例３）日本脳炎ウイルス感染誘発性細胞変性効果および誘発性アポトーシスの阻害
（１）ＢＨＫ−２１細胞およびＴＥ６７１細胞のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染
ＢＨＫ−２１細胞および／またはＴＥ６７１細胞を、ウェル当たり３×１０^４の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１ｍｌのＭＥＭ培地において、別々に、２４ウェル培養プレートを用いて培養した。細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れ一晩インキュベートし、細胞がプレートに付着するのを待って、培地を取り除いた。次いで、培養プレートのそれぞれのウェルの中に、２％のＦＢＳを含む新しいＭＥＭ培地を同時に加えた。その後、当該細胞を、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１ウイルス株に感染させた。なお、ＢＨＫ−２１細胞を感染させるために使用されたＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の量は、感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）＝０．１であり、ＴＥ６７１細胞を感染させるために使用されたＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の量は、Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．０５であった。その後、それぞれ異なるウェルの中において、異なる濃度の化合物１（最終濃度は、それぞれ、０、２．５、２５および１２５μＭである）を加え、培養プレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内に入れておいた。

【0060】

（２）細胞変性効果試験
上述の実験（１）において示したように、ＢＨＫ−２１細胞をＪＥＶ Ｔ１Ｐ１ウイルス株に４８時間および７２時間において感染させ、細胞変性効果を撮影によって観察した。また、ＴＥ６７１細胞をＪＥＶ Ｔ１Ｐ１ウイルス株に３６時間および４８時間において感染させ、細胞変性効果を撮影によって観察した。結果を図２Ａおよび図２Ｂにおいて示す。さらに、両方の細胞のウイルス培養液２００μｌを、それぞれの時点（すなわち、４８時間および７２時間）において回収し、それらを、実施例４におけるウイルスプラーク試験に利用するために回収しておいた。

【0061】

図２Ａにおいて観察されたＢＨＫ−２１細胞の撮影図によってわかるように、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１に４８時間において感染させた場合、ＢＨＫ−２１細胞は、明らかに細胞変性効果を示していた。この細胞変性効果は、化合物１（２５μＭ）によって同時に処置していた場合には、有意に減少していた。さらに、感染時間を７２時間まで延長させた場合、ＢＨＫ−２１細胞は著しい細胞変性効果を示していた（または死滅さえもしていた）。一方、この細胞変性効果は、化合物１（１２５μＭ）によって同時に処置していた場合には、まだ効果的に阻害されていた。

【0062】

図２Ｂにおいて観察されたＴＥ６７１細胞の撮影図によってわかるように、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１に３６時間において感染させた場合、ＴＥ６７１細胞は、明らかに細胞変性効果を示していた。一方、この細胞変性効果は、化合物１（２５μＭ）によって同時に処置していた場合には阻害されていた。さらに、たとえＴＥ６７１細胞のＪＥＶ Ｔ１Ｐ１ウイルス株感染時間を４８時間に延長した場合でも、細胞を化合物１（２５μＭ）によって処置していた場合には、細胞変性効果を未だ阻害することができていた。

【0063】

（３）アポトーシス試験
ＢＨＫ−２１細胞およびＴＥ６７１細胞を、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１ウイルス株を用いて上述の実験（１）の方法で３６時間において感染させた後、ＰＢＳで洗浄した。その後、ＰＢＳを取り除き、それぞれのウェルの中にトリプシン−ＥＤＴＡ（１５０μｌ）を加えた。そして、細胞を３７℃のインキュベーターにおいて、３分間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡを中和するために、それぞれのウェルの中に１ｍｌのＭＥＭ培地を加えた。当該細胞を１５ｍｌチューブの中において回収し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分間）によって沈殿させた。上清を取り除き、チューブ毎に１ｍｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、その後遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分間）によって沈殿させた。そして、上清を取り除き、異なるチューブにおける細胞を、種々のＦＡＣＳチューブに移し、染色した。非染色グループには、５００μｌの結合バッファーのみを添加した。アネキシンＶのみの染色グループでは、１０μｌのアネキシンおよび４９０μｌの結合バッファーを添加した。ＰＩのみの染色グループでは、１０μｌのＰＩおよび４９０μｌの結合バッファーを添加した。当該細胞を、暗所において５から１０分間静置し、フローサイトメトリーにより分析した。結果を、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａおよび図４Ｂにおいて示す。

【0064】

図３Ａおよび図３Ｂにおいて示すように、５９．０５％のＢＨＫ−２１細胞が、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１に３６時間において感染させた後に、後期アポトーシスに入っている。後期アポトーシスに入るＢＨＫ−２１細胞の割合は、濃度依存的に化合物１によって減少している。この結果は、化合物１が、ＢＨＫ−２１細胞の日本脳炎ウイルス感染誘発性細胞変性効果を阻害する機能を有することを示している。

【0065】

さらに、図４Ａおよび図４Ｂにおいて示すように、２０．１％のＴＥ６７１細胞がＪＥＶ Ｔ１Ｐ１に３６時間において感染させた後に、後期アポトーシスに入っており、１２５μｌの化合物１を用いて処置することによって、後期アポトーシスに入るＴＥ６７１細胞の割合を４．７％にまで減少させていた。この結果は、化合物１が、ＴＥ６７１細胞の日本脳炎ウイルス感染誘発性細胞変性効果を阻害する機能を有することを示している。

【0066】

（実施例４）日本脳炎ウイルス複製の阻害（ウイルスプラーク試験）
ＢＨＫ−２１細胞を、ウェル当たり３×１０^５の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む２ｍｌのＭＥＭ培地において、６ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れ一晩インキュベートし、細胞がプレートに付着するのを待って培地を取り除いた。その後、上述した実施例３の実験（２）において回収しておいて１０^４倍に希釈した上清（４８および７２時間）２００μｌを、それぞれのウェルの中に添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）においてインキュベートし、全ての細胞が上清によって覆われるように、１５分毎に培養プレートを穏やかに軽くたたいておいた。１時間のインキュベート後、培地を取り除いた。その後、２％のＦＢＳを含む新しいＭＥＭ培地（３ｍｌ）をそれぞれのウェルの中に加えて、細胞を３日間インキュベートし、その後培地を取り除いた。次いで、それぞれのウェルの中に、ナフトールブルーブラック染料を加えて、室温下において一晩細胞を染色した。その後、細胞を浄水を用いて洗浄し、ウイルス力価を算出するために、ウイルスプラークをカウントした。結果を図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａおよび図６Ｂにおいて示す。

【0067】

図５Ａおよび図５Ｂにおいて示すように、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１に感染させたＢＨＫ−２１細胞を、４８時間または７２時間において化合物１を用いて処置した後には、ＢＨＫ−２１細胞におけるＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の複製は顕著に減少していた。さらに、図６Ａおよび図６Ｂにおいて示すように、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１に感染させたＴＥ６７１細胞を、３６時間または４８時間において化合物１を用いて処置した後にも、ＴＥ６７１細胞におけるＪＥＶ Ｔ１Ｐ１の複製は顕著に減少していた。これらの結果は、化合物１が日本脳炎ウイルス複製を阻害する機能を有しているということを示している。

【0068】

（実施例５）抗ウイルスメカニズム分析
ＴＥ６７１細胞を、ウェル当たり３×１０^５の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む２ｍｌのＭＥＭ培地において、６ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートし、細胞がプレートに付着するのを待って培地を取り除いた。その後、２％のＦＢＳを含む新しい１ｍｌのＭＥＭ培地を、同時にそれぞれのウェルの中に加えた。当該細胞を、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１ウイルス株を用いて感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．０５）、それぞれの異なるウェルの中に、異なる濃度の化合物１を加えた（最終濃度は、それぞれ、０、２．５、２５、１２５および２５０μＭであった）。次いで、細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において３６時間インキュベートし、上清を取り除き、ＴＥ６７１細胞をＰＢＳを用いて洗浄した。その後、ＰＢＳを取り除き、それぞれのウェルの中に１５０μｌのトリプシン−ＥＤＴＡを加え、３７℃のインキュベーターにおいて３分間インキュベートした。そして、ＥＤＴＡを中和するために、それぞれのウェルの中に１ｍｌのＭＥＭ培地を加え、当該細胞を、１５ｍｌチューブ内に分けて回収し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分間）によって沈殿させ、上清を取り除いた。次いで、チューブ毎に１ｍｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、それぞれ１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分間）によって沈殿させた。その後、上清を取り除き、１００μｌの放射性免疫沈降バッファー（ＲＩＰＡバッファー）をそれぞれのウェルの中に添加した。当該細胞を１５から３０分間４℃において静置して、超音波処理器によって破砕した（レベル３；ＯＮ／ＯＦＦ：２秒／２秒；破砕時間：１０秒）。破砕した細胞を遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分間）によって沈殿させ、新しいマイクロチューブ内に、上清タンパク質をそれぞれ別々に回収した。次いで、２Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルローディングバッファー（１００μｌ）を、それぞれのマイクロチューブ内に加えた。そして、当該マイクロチューブを１００℃の乾燥浴インキュベーターにおいて５分間熱し、素早く氷上に置き、最後に−２０℃において保存しておいた。

【0069】

上記のタンパク質サンプルを、タンパク質電気泳動によって分析した。まず、ガラスプレートおよびゲルアセンブリラックを作製した。所望のゲル濃度に従って調製された分離ゲルをその中へ注ぎ、７５％エタノールを使用することにより平坦にプレスした。分離ゲルがポリマー化した後に、エタノールを注ぎ出し、予め調製しておいた４％スタッキングゲルを、その中へと注いだ。その後、サンプルウェルコームを差し込んだ。スタッキングゲルがポリマー化した後、サンプルウェルコームを取り外した。そして、電気泳動装置において、ゲルラックを配置し、１Ｘランニングバッファーを電気泳動装置内に注いだ。ウェルの中にマーカー（３．５μｌ）を注入し、他のウェルの中にはそれぞれのタンパク質サンプル１０μｌを注入し、電気泳動を開始した（電圧：６０ボルト（Ｖ）；時間：３０分間）。青色色素が分離ゲルに入り、マーカーが分離するまでは、電圧は１２０Ｖとしておいた。電気泳動は、１．５時間続けた。青色色素がゲルの一番下に移動するのを待って、スタッキングゲルを切り出した。次いで、タンパク質転写を行った。

【0070】

予め準備しておいた発泡ゴム、ニトロセルロース膜、３Ｍろ紙および上記の電気泳動ゲルを、転写バッファー内に浸漬した。その後、１つの発泡ゴム、２つの３Ｍろ紙、１つのニトロセルロース膜、電気泳動ゲル、２つの３Ｍろ紙および１つの発泡ゴムを、陽極から陰極へと順に配置した。圧縮することによって、それぞれの層の間における気泡を慎重に取り除いた。電気プレートを密閉し、ウェット転写タンク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を入れ、タンパク質の転写を行った（４℃、９０Ｖ、４００ｍＡ、９０分間）。最終的に、ニトロセルロース膜へタンパク質が転写された後には、ウェスタンブロッティングを行った。当該ニトロセルロース膜を１％のＢＳＡを含むブロックバッファー中に浸漬し、室温下において１から１．５時間振とうした。次いで、一次抗体（抗体の説明書により推奨されている濃度となるように、１％のＢＳＡを含み希釈したもの）を膜上において添加し、反応させるために４℃において一晩振とうした。その後、一次抗体を回収した。当該膜を、シェーカー（振とう器）において３回、それぞれの回において２０分間、１Ｘ ＴＢＳＴを用いて洗浄した。そして、二次抗体を膜上において添加し、反応させるために室温下において２時間振とうした。その後、膜をシェーカーにおいて３回、それぞれの回において２０分間、１Ｘ ＴＢＳＴを用いて洗浄した。ＥＣＬの呈色剤（試薬１：試薬２＝１：１）を混合し、膜上において添加した。膜をすぐにカゼイン酸塩に入れて、タンパク質シグナルを暗室においてＸ線フィルムにより現させた。結果を図７において示す。

【0071】

図７において示すように、ＴＥ６７１細胞がＪＥＶ Ｔ１Ｐ１に感染した後には、ＴＥ６７１細胞における、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路関連タンパク質、ＡｋＴ−ｍＴＯＲシグナル伝達経路関連タンパク質、およびＥＲＫ−ＣＲＥＢシグナル伝達経路関連タンパク質のリン酸化レベルが、顕著に減少していた。ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染誘発性のシグナル伝達経路リン酸化レベルは、化合物１の同時処置によって、濃度依存的に増加していた。この結果は、化合物１は抗ウイルスメカニズムを活性化する機能を有するということを示している。

【0072】

（実施例６）抗ウイルス遺伝子発現の分析
ＴＥ６７１細胞を、当該実験条件に従って、６ウェル培養プレートにおいて培養した。翌日、ＴＥ６７１細胞をＪＥＶ Ｔ１Ｐ１ウイルス株に感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝１）、様々な濃度の化合物１（化合物１の最終濃度は、それぞれ、約０または１２５μＭである）を、同時に異なるウェルの中において添加した。そして、細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れて８時間インキュベートし、回収した。当該細胞を、ＰＢＳを用いて再懸濁し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）によって沈殿させ、ＲＮＡを得るために、Ｐｕｒｅ Ｌｉｎｋ（商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔによって抽出した。ここで、得られたＲＮＡについて、−２０℃での保存を所望する場合、ＲＮＡを、後記の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）ステップを利用してｃＤＮＡへと逆転写しておかなければならない。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）ステップ：ｉ）１１μｌのＲＮＡをマイクロチューブに注入し、５５℃のＰＣＲ装置内へと配置し、１５分間保つ；ｉｉ）１μｌのｄＮＴＰおよびオリゴｄＴを添加し、６５℃において１０分間保つ；ｉｉｉ）２μｌのＤＴＴおよび４μｌの５Ｘ ファーストストランド（第１鎖）バッファーを添加し、４２℃において１分間保つ；ｉｖ）１μｌのスーパースクリプトＩＶトランスクリプターゼ（転写酵素）を添加し、４２℃において６２分間保つ；ｖ）反応を停止させるために（すなわち、スーパースクリプトＩＶトランスクリプターゼの活性を失わせるために）、７２℃において１５分間保っておく。このステップから得たｃＤＮＡは、−２０℃において保存され得る。

【0073】

抗ウイルス遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって分析した。ｃＤＮＡ混合物を、次のような量において８流路のマイクロＰＣＲチューブの中に分注した。ＳＹＢＲグリーン（１２．５μｌ）、フォワードプライマー（１μｌ）、リバースプライマー（１μｌ）、ＭｇＣｌ_２（１μｌ）、ｄｄＨ_２Ｏ（４．５μｌ）およびｃＤＮＡ（５μｌ）。そして、このｃＤＮＡ混合物を、ＲＴ−ＰＣＲ装置内に設置した。反応条件は、次の通りに設定した。ｉ）９５℃、１５分間；ｉｉ）９５℃において１５秒間、および６０℃において１分間。この条件下で、４０サイクル行った。そして、各サイクルの蛍光量を、ＡＢＩプリズム７５００ソフトウェアによって決定した。コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）グループと比較したそれぞれの遺伝子の相対差は、Ｃｔを使用して、ΔＣｔおよびΔΔＣｔを計算した（すなわち、ΔＣｔ＝Ｃｔ．ｅｘｐ−Ｃｔ．ｃｏｎｔｒｏｌ、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ．ｅｘｐ−ΔＣｔ．ｍｏｃｋ）。それによって、２^{−ΔΔＣｔ}を計算することができる。結果を、図８Ａから図８Ｅにおいて示す。

【0074】

図８Ａから図８Ｅにおいて示すように、化合物１の処置によって、ＪＥＶ Ｔ１Ｐ１感染ＴＥ６７１細胞における、ＰＫＲ、ＯＡＳ、ＩＦＮ−αおよびインターフェロン受容体の相対遺伝子発現レベルを増加させることができる。この結果は、化合物１がウイルス感染細胞について抗ウイルス遺伝子の発現を促進させる機能を有していることを示している。

【0075】

（実施例７）デングウイルス感染誘発性細胞変性効果の阻害
ＢＨＫ−２１細胞を、ウェル当たり３×１０^４の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１ｍｌのＭＥＭ培地において、２４ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートし、細胞がプレートに付着するのを待って、培地を取り除いた。その後、培養プレートのそれぞれのウェルの中に、２％のＦＢＳを含む新しい１ｍｌのＭＥＭ培地を同時に加えた。そして、当該細胞をＤＥＮ２ウイルス株に感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．１）、異なるウェルの中に、異なる濃度の化合物１（最終濃度は、それぞれ、０、２．５および２５μＭである）を加えた。その後、ＢＨＫ−２１細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において７２時間インキュベートし、それらの形態を撮影によって観察した。

【0076】

図９において示すように、７２時間においてＤＥＮ２を感染させた全てのＢＨＫ−２１細胞は、細胞変性効果が見られた。しかし、化合物１（２５μＭ）の同時処置によって、細胞変性効果は効果的に阻害されていた。

【0077】

（実施例８）デングウイルス複製の阻害
Ｈｕｈ７細胞を、ウェル当たり３×１０^４の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１ｍｌのＭＥＭ培地において、２４ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートし、細胞がプレートに付着するのを待って、培地を取り除いた。その後、培養プレートのそれぞれのウェルの中に、２％のＦＢＳを含む新しい１ｍｌのＭＥＭ培地を同時に加えた。そして、当該細胞をＤＥＮ２ウイルス株に感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．５）、異なるウェルの中に、異なる濃度の化合物１（最終濃度は、それぞれ、０、１０、５０、１００および１５０μＭである）を加えた。その後、培養プレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内に入れ、そのまま４８時間保った。そして、ウイルス培養液の上清を回収した。

【0078】

上記において得られた上清を、ウイルス培養液におけるＤＥＮ２ ＮＳ１タンパク質レベルを定量するために、抗原補足酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。まず、９６ウェルマイクロ反応プレートのそれぞれのウェルの中にＮＳ１抗体を添加し、４℃において一晩反応させた（２００μｌ／ウェル）。その後、それぞれのウェルをＰＢＳＴを用いて３回洗浄した（２００μｌ／回）。１％のＢＳＡを含むブロッキングバッファー（３００μｌ）をそれぞれのウェルの中に添加し、室温下において１時間反応させ、その後ブロッキングバッファーを取り除いた。順次希釈した組み換えＮＳ１タンパク質（ｒＮＳ１）、および９５℃において３分間変性させた上清２００μｌを、それぞれのウェルの中へ添加した。反応は、室温下において１時間行い、全ての液体を取り除いた。次いで、ビオチンを結合させた抗ＮＳ１ウサギポリクローナル抗体をそれぞれのウェルの中に添加し、室温下において１時間反応させた。その後、それぞれのウェルを、２００μｌのＰＢＳＴを用いて３回洗浄した。次いで、ストレプトアビシン−ＨＲＰをそれぞれのウェルの中へ添加し（２００μｌ／ウェル）、室温下において２０分間反応させた。その後、それぞれのウェルをＰＢＳＴを用いて３回洗浄した（２００μｌ／回）。最後に、ＴＭＢ（２００μｌ／ウェル）を加え、呈色反応のために室温下において１０分間静置し、その後反応を停止させるため、Ｈ_２ＳＯ_４（２Ｎ、１００μｌ／ウェル）を加えた。ＤＥＮ２複製を評価するために、それぞれの上清中におけるＤＥＮ ＮＳ１タンパク質量の読取値を、４５０ｎｍの波長の吸光度を調べることによって測定した。結果を、図１０において示す。

【0079】

図１０において示すように、１０μｌの化合物１で処置することによって、ＤＥＮ２ ＮＳ１タンパク質レベルは減少している。この結果は、化合物１がウイルス感染細胞におけるデングウイルス複製を効果的に減少させることができるということを示している。

【0080】

（実施例９）エンテロウイルス感染誘発性細胞変性効果の阻害
ＲＤ細胞を、ウェル当たり３×１０^４の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１ｍｌのＭＥＭ培地において、２４ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートした。培地を取り除き、その後、それぞれのウェルの中に、２％のＦＢＳを含む新しい１ｍｌのＭＥＭ培地を同時に加えた。ＲＤ細胞をＥＶ７１ウイルス株に感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．１）、異なるウェルの中に、異なる濃度の化合物１（最終濃度は、それぞれ、０、２．５、２５および１２５μＭである）を加えた。その後、当該ＲＤ細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内において３６時間インキュベートし、それらの形態を撮影によって観察した。

【0081】

図１１において示すように、３６時間にわたってＥＶ７１を感染させた全てのＲＤ細胞において、細胞変性効果が見られた。しかし、化合物１（１２５μＭ）の同時処置によって、細胞変性効果は効果的に阻害されていた。

【0082】

（実施例１０）エンテロウイルス複製の阻害
ＲＤ細胞を、ウェル当たり３×１０^４の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１ｍｌのＭＥＭ培地において、２４ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートした。培地を取り除き、その後、それぞれのウェルの中に、２％のＦＢＳを含む新しい１ｍｌのＭＥＭ培地を同時に加えた。ＲＤ細胞をＥＶ７１ウイルス株に感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．１）、異なるウェルの中に、異なる濃度の化合物１（最終濃度は、０、２．５、２５および１２５μＭである）を加えた。その後、当該ＲＤ細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内において３６時間インキュベートし、続くプラーク試験のためにウイルス培養液を回収しておいた。

【0083】

ＲＤ細胞を、６ウェル培養プレートを用いて培養し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートした。培地を取り除き、その後、上記において回収したものを１０^４倍に希釈したウイルス培養液２００μｌを、それぞれのウェルの中に添加した。そして、細胞を１時間において感染させた。それぞれのウェルの中に、３％のアガロースの被覆溶液３ｍｌを加え、細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において３日間インキュベートし、その後被覆溶液を取り除いた。それぞれのウェルの中にメチルブルーを加え、プレートを室温下において一晩置き、その後、浄水を用いて洗浄し乾燥させた。ウイルス力価および阻害率を算出するために、プラークの数をカウントした。結果を、図１２Ａおよび図１２Ｂにおいて示す。

【0084】

図１２Ａおよび図１２Ｂにおいて示すように、２．５、２５および１２５μＭの化合物１において処置したＲＤ細胞におけるＥＶ７１複製の阻害率は、それぞれ、４．６％、２３％および２４．６％であった。この結果は、化合物１が宿主細胞におけるエンテロウイルスの複製を大いに減少させることができるということを示している。

【0085】

（実施例１１）インターフェロンの同時使用による、エンテロウイルス感染誘発性細胞変性効果の阻害
ＲＤ細胞を、ウェル当たり３×１０^４の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１ｍｌのＭＥＭ培地において、２４ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートした。その後、細胞がプレートに付着するのを待って、培地を取り除いた。それぞれのウェルの中に、２％のＦＢＳを含む新しい１ｍｌのＭＥＭ培地を同時に加えた。ＲＤ細胞をＥＶ７１ウイルス株に感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．１）、異なるウェルの中に、異なる濃度の化合物１（最終濃度は、０、２．５、２５および１２５μＭである）、および／または、ＩＦＮ−β（最終濃度は、０および１００ユニット／ｍｌである）を、別々に加えた。当該ＲＤ細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内において３６時間インキュベートし、その後、それらの形態を撮影によって観察した。結果を、図１３および表２において示す。さらに、それぞれのウェルから２００μｌのウイルス培養液を回収し、実施例１２のウイルスプラーク試験を行うために、−８０℃において保存しておいた。

【0086】

図１３および表２において示すように、３６時間においてＥＶ７１を感染させた全てのＲＤ細胞は、細胞変性効果が見られ、細胞生存率はわずか５．０１％となる。しかし、化合物１および１００ユニット／ｍｌのＩＦＮ−βの組み合わせの処置によって、細胞変性効果は効果的に阻害され得る。さらに、細胞生存率は、化合物１の量の増加に伴って増加していた。例えば、細胞を１２５μＭの化合物１において処置した場合、８３．３％の細胞生存率を提供することができる。この結果は、化合物１およびインターフェロンの組み合わせが、エンテロウイルス感染誘発性細胞変性効果の阻害において、相乗効果を生じ得るということを示している。

【0087】

【表2】

【0088】

（実施例１２）インターフェロンを同時に使用することによる、エンテロウイルス複製の阻害
ＲＤ細胞を、ウェル当たり３×１０^４の初期細胞密度、ウェル当たり２％のＦＢＳを含む１ｍｌのＭＥＭ培地において、２４ウェル培養プレートを用いて培養した。当該細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において一晩インキュベートした。培地を取り除き、その後、上記において回収したものを１０^４倍に希釈したウイルス培養液２００μｌを、それぞれのウェルの中に添加した。そして、細胞を１時間において感染させた。それぞれのウェルの中に、３％のアガロースの被覆溶液３ｍｌを加え、細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）において３日間インキュベートし、その後被覆溶液を取り除いた。それぞれのウェルの中にメチルブルーを加え、プレートを室温下において一晩置き、その後、浄水を用いて洗浄し、乾燥させた。ウイルス力価および阻害率を算出するために、プラークの数をカウントした。結果を、図１４において示す。

【0089】

図１４において示すように、化合物１（１２５μＭ）およびＩＦＮ−β（１００ユニット／ｍｌ）の組み合わせにより引き起こされた、ＲＤ細胞におけるＥＶ７１複製の阻害率は、７８％であった（すなわち、１００％×（１０^９．１−１０^８．４５）／１０^９．１＝７８％）。この結果は、化合物１とインターフェロンとの組み合わせは、宿主細胞におけるエンテロウイルスの複製の減少において、相乗効果を生じ得るということを示している。

【0090】

上述の実施例は、本発明の原理および有効性を説明するために使用されるものにすぎず、本発明を限定するようには使用されない。本技術分野における当業者であれば、記載されている本発明の開示および示唆に基づいて、技術的原理およびその精神から逸脱することなく、種々の変形および代替を用いて実施し得るだろう。そのため、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲において規定されているものである。

【0091】

（関連する出願）
本出願は、台湾特許出願１０３１０００６４（出願日２０１４年１月２日）に基づく優先権を主張しており、その内容は本明細書に参照として取り込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図10】

【図12A】

【図12B】

【図14】

【図2A】

【図2B】

【図7】

【図9】

【図11】

【図13】