知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5874163
(24)【登録日】2016年1月29日
(45)【発行日】2016年3月2日
(54)【発明の名称】免疫誘導剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20160218BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20160218BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20160218BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20160218BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20160218BHJP
C12N 5/0781 20100101ALI20160218BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20160218BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20160218BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20160218BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20160218BHJP
C12Q 1/68 20060101ALI20160218BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20160218BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
A61K37/02
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
C12N5/0781
C12N5/0783
C12N5/0784
C07K7/08
C07K7/06
C12Q1/68 A
G01N33/68
【請求項の数】7
【全頁数】35
(21)【出願番号】特願2010-539646(P2010-539646)
(86)(22)【出願日】2010年9月2日
(86)【国際出願番号】JP2010064993
(87)【国際公開番号】WO2011027807
(87)【国際公開日】20110310
【審査請求日】2013年8月23日
(31)【優先権主張番号】特願2009-203489(P2009-203489)
(32)【優先日】2009年9月3日
(33)【優先権主張国】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】栗原 祥
(72)【発明者】
【氏名】岡野 文義
【審査官】
大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第０２／０８１６４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００８−５３４００８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Gene，２００４年，Vol.328，pp.187-196
【文献】
J. Cancer Res. Clin. Oncol.，２００８年，Vol.134，pp.453-462
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ａ６１Ｋ ３８／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列表の配列番号２７〜３５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチドを有効成分として含有する、癌の予防用及び／又は治療用である免疫誘導剤。
【請求項2】
前記癌がＰＤＳ５Ａを発現する癌である、請求項１に記載の免疫誘導剤。
【請求項3】
前記癌が乳癌、脳腫瘍、食道癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、肛門周囲腺癌、神経芽腫又白血病である、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
【請求項4】
免疫誘導剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫誘導剤。
【請求項5】
配列表の配列番号２７〜３５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
【請求項6】
配列表の配列番号２７〜３５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２である免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
【請求項7】
配列表の配列番号２７〜３５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２である免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。【背景技術】
【0002】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている。【0003】
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。１９９１年、ベルギーＬｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献１）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（特許文献１、非特許文献２）、この方法により、いくつかの癌抗原が単離されている。さらに、その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。【0004】
一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺腫瘍、扁平上皮癌など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬及び診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬及び予防薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。【0005】
ＰＤＳ５Ａ（ＰＤＳ５，ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｏｈｅｓｉｏｎ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，ｈｏｍｏｌｏｇ Ａ）は別名ＳＳＣ−１１２とも呼ばれるタンパク質で、染色体の分配時に関与する細胞周期制御因子として同定され、正常組織と比べて上咽頭癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌細胞の１種で発現が高いことが報告されている（特許文献２、非特許文献３〜５）。そして、ＰＤＳ５Ａ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ又はＰＤＳ５Ａタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて癌細胞中のＰＤＳ５Ａの発現を抑制することによって癌細胞の増殖を抑制でき、また、ＰＤＳ５Ａ全長タンパク質又はＰＤＳ５Ａタンパク質の部分ペプチドを投与することで、癌細胞にアポトーシスを誘導できることが報告されている（特許文献３）。また、特許文献３では癌細胞においてＰＤＳ５Ａタンパク質のｍＲＮＡ量の増加が確認されている。しかし、ＰＤＳ５Ａタンパク質及び該タンパク質の部分ペプチドが癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質及び該タンパク質の部分ペプチドが癌の治療や予防に有用であるという報告はなく、ＰＤＳ５Ａタンパク質が癌の診断に利用可能なマーカーとしての機能を有するかどうかについては確認されていない。【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許第５６９８３９６号
【特許文献2】ＷＯ２００６／１０９９４３
【特許文献3】ＷＯ２００２／０８１６４１
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７（１９９１）
【非特許文献2】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）
【非特許文献3】Ｇｅｎｅ．１７；３２８：１８７−９６（２００４）
【非特許文献4】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１５；１１８（Ｐｔ １０）：２１３３−４１（２００５）
【非特許文献5】Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．：１３４（４）：４５３−６２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤、あるいは癌の検出に有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤又は癌の検出への使用を提供することである。【課題を解決するための手段】
【0009】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ乳癌由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するイヌＰＤＳ５，ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｏｈｅｓｉｏｎ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，ｈｏｍｏｌｏｇ Ａ（以下、ＰＤＳ５Ａと記載する）タンパクを作製した。また、取得した遺伝子のヒト及びマウス相同性遺伝子を基にして、配列番号４又は４４で示されるアミノ酸を有するヒトＰＤＳ５Ａ（なお、配列番号４は配列番号４４の部分配列に相当する。）、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するマウスＰＤＳ５Ａを作製した。そしてこれらＰＤＳ５Ａが乳癌、脳腫瘍、食道癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、肛門周囲腺癌、神経芽腫及び白血病の組織又は細胞に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらＰＤＳ５Ａを生体に投与することによって、生体内にＰＤＳ５Ａに対する免疫細胞を誘導することができること、及びＰＤＳ５Ａを発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、ＰＤＳ５Ａの全長タンパク質又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な組換えベクターが、ＰＤＳ５Ａを発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。【0010】
さらにまた、ＰＤＳ５Ａの部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。【0011】
従って、本発明は、以下の特徴を有する。【0012】
(1)以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。(a)配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【0013】
(2)前記(b)のポリペプチドが、前記(a)のポリペプチドと９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、(1)に記載の免疫誘導剤。【0014】
(3)前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド、あるいは配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、(1)に記載の免疫誘導剤。【0015】
(4)前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、(3)に記載の免疫誘導剤。【0016】
(5)前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中のａａ１１１〜１４０、ａａ２１１〜２４０、ａａ２４８〜２７８、ａａ３２７〜３５７、ａａ４５９〜５２２、ａａ９０９〜９７２、ａａ９５９〜１０２２、ａａ９９４〜１０５７又はａａ１０１８〜１０８０の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド、あるいは配列表の配列番号２、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中のａａ１１１〜１４０、ａａ２１１〜２４０、ａａ２４８〜２７８、ａａ３２７〜３５７、ａａ４５９〜５２２、ａａ９０９〜９７２、ａａ９５９〜１０２２、ａａ９９４〜１０５７又はａａ１０１８〜１０８０の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、(3)に記載の免疫誘導剤。【0017】
(6)前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２７〜３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチド、あるいは配列表の配列番号２７〜３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチドである、(5)記載の免疫誘導剤。【0018】
(7)動物の癌の予防用である、(1)〜(6)のいずれかに記載の免疫誘導剤。【0019】
(8)動物の癌の治療用である、(5)又は(6)に記載の免疫誘導剤。【0020】
(9)前記癌がＰＤＳ５Ａを発現する癌である、(7)又は(8)に記載の免疫誘導剤。【0021】
(10)前記癌が乳癌、脳腫瘍、食道癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、肛門周囲腺癌、神経芽腫又は白血病である、(7)〜(9)のいずれかに記載の免疫誘導剤。【0022】
(11)免疫増強剤をさらに含む、(1)〜(10)のいずれかに記載の免疫誘導剤。【0023】
(12)前記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。【0024】
(13)前記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。【0025】
(14)配列表の配列番号２７〜３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチド、あるいは配列表の配列番号２７〜３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するポリペプチド。【0026】
(15)生体から分離された試料において、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド又は該ポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドの発現を測定することを含む、癌の検出方法。【0027】
(16)以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを個体に投与することを含む、免疫誘導方法。(a)配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【発明の効果】
【0028】
本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを生体に投与すると、生体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチドは癌の治療や予防に有用である。【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】同定したＰＤＳ５Ａ遺伝子の、イヌ正常組織及び腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；イヌＰＤＳ５Ａ遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号２；イヌＧＡＰＤＨ遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン。
【図2】同定したＰＤＳ５Ａ遺伝子の、ヒト正常組織及び腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号３；ヒトＰＤＳ５Ａ遺伝子のヒトの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号４；ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のヒトの各組織及び細胞株での発現パターン。
【図3】同定したＰＤＳ５Ａ遺伝子の、マウス正常組織及び腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号５；マウスＰＤＳ５Ａ遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号６；マウスＧＡＰＤＨ遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターンを示す。
【図4】ＰＤＳ５Ａ投与により、抗腫瘍効果（治療モデル−神経芽腫細胞株）が認められたことを示すグラフである。ベクターのみ、あるいはＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドを遺伝子銃を用いて免疫し、癌部の面積、生存マウスの割合で評価した。また、各群には１０匹のマウスを使用した。マウスは、１週間について２度の観察を行った。データは平均値±ＳＤで示した。参照番号７；ベクターのプラスミド投与群、参照番号８；ＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドの投与群を示す。
【図5】ＰＤＳ５Ａ投与により、抗腫瘍効果（予防モデル−神経芽腫細胞株）が認められたことを示すグラフである。ベクターのみ、あるいはＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドを遺伝子銃を用いて免疫し、癌部の面積、生存マウスの割合で評価した。また、各群には１０匹のマウスを使用した。マウスは、１週間について２度の観察を行った。データは平均値±ＳＤで示した。参照番号９；ベクターのプラスミド投与群、参照番号１０；ＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドの投与群を示す。
【図8】ＰＤＳ５Ａ投与により、抗腫瘍効果（治療モデル−大腸癌細胞株）が認められたことを示すグラフである。ベクターのみ、あるいはＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドを遺伝子銃を用いて免疫し、癌部の面積、生存マウスの割合で評価した。また、各群には１０匹のマウスを使用した。マウスは、１週間について２度の観察を行った。データは平均値±ＳＤで示した。参照番号１５；ベクターのプラスミド投与群、参照番号１６；ＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドの投与群を示す。
【図9】ＰＤＳ５Ａ投与により、抗腫瘍効果（予防モデル−大腸癌細胞株）が認められたことを示すグラフである。ベクターのみ、あるいはＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドを遺伝子銃を用いて免疫し、癌部の面積、生存マウスの割合で評価した。また、各群には１０匹のマウスを使用した。マウスは、１週間について２度の観察を行った。データは平均値±ＳＤで示した。参照番号１７；ベクターのプラスミド投与群、参照番号１８；ＰＤＳ５Ａをコードするプラスミドの投与群を示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる。なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示すアミノ酸配列を有するＰＤＳ５Ａの全長タンパク質も包含される。【0031】
(a)配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上のアミノ酸から成り、免疫誘導活性を有するポリペプチド(b)(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、７個以上のアミノ酸から成る、免疫誘導活性を有するポリペプチド
(c)(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
【0032】
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号２に示されるＭｅｔ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ・・(中略)・・Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇのアミノ酸配列を持つ、１３３７アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号２のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。この場合、「有する」という用語は、「からなる」という表現で置き換えてもよい。【0033】
ここで、「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。【0034】
上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポットアッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、例えば後述の実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのサイトカイン産生量を、特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。【0035】
また、後述の実施例に記載されるように、上記(a)〜(c)の組換えポリペプチドを担癌生体に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌生体に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。【0036】
あるいは、該ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。【0037】
本発明が開示する配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド及びそのヒト（配列番号４及び４４）、マウス（配列番号６）、ウシ（配列番号８）、ウマ（配列番号１０）及びニワトリ（配列番号１２）の相同因子として単離された、ＰＤＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列である（実施例１参照）。なお、イヌＰＤＳ５Ａのヒト相同因子であるヒトＰＤＳ５Ａでは、配列同一性が塩基配列９４％、アミノ酸配列９９％であり、マウス相同因子であるマウスＰＤＳ５Ａでは配列同一性は塩基配列９１％、アミノ酸配列９９％、ウシ相同因子であるウシＰＤＳ５Ａでは配列同一性は塩基配列９５％、アミノ酸配列９９％、ウマ相同因子であるウマＰＤＳ５Ａでは配列同一性は塩基配列９６％、アミノ酸配列９９％、ニワトリ相同因子であるニワトリＰＤＳ５Ａでは配列同一性は塩基配列８３％、アミノ酸配列９８％である。【0038】
上記(a)のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸から成るポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４で示されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。【0039】
また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７〜３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記(a)のポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４で示されるアミノ酸配列中の連続する７〜３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８〜３０もしくは９〜３０程度のアミノ酸から成るものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。【0040】
また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは２５０以上、さらに好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４の全長領域のポリペプチドとしてもよい。【0041】
さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＬＡの各型の結合モチーフを有する８〜１２個、好ましくは９〜１０個のアミノ酸からなるエピトープペプチドを検索しうる照合媒体、例えばBioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS)のHLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)によって照合し、エピトープペプチドとなりうるペプチドをスクリーニングすることができる。具体的には、配列番号２、６、８、１０、１２又は４４で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号ａａ１１１〜１４０、ａａ２１１〜２４０、ａａ２４８〜２７８、ａａ３２７〜３５７、ａａ４５９〜５２２、ａａ９０９〜９７２、ａａ９５９〜１０２２、ａａ９９４〜１０５７又はａａ１０１８〜１０８０の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチドが好ましく、さらに配列番号４又は４４のポリペプチドにおいては、配列番号２７〜３５で示されるポリペプチド、あるいは配列番号２７〜３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチドがより好ましい。【0042】
上記(b)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(b)のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記(b)のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４で示されるアミノ酸配列のうち、１個ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。本明細書中の「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、さらに好ましくは２〜４の整数を表す。【0043】
ここで、アミノ酸配列又は塩基配列の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。【0044】
なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなるため、好ましい。【0045】
なお、前述のエピトープペプチドとなる上記(b)のポリペプチドとしては、配列番号２、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中のａａ１１１〜１４０、ａａ２１１〜２４０、ａａ２４８〜２７８、ａａ３２７〜３５７、ａａ４５９〜５２２、ａａ９０９〜９７２、ａａ９５９〜１０２２、ａａ９９４〜１０５７又はａａ１０１８〜１０８０の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドが好ましく、さらに配列番号４又は４４のポリペプチドにおいては、あるいは配列番号２７〜３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチドがより好ましい。【0046】
上記(c)のポリペプチドは、上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、(a)又は(b)のポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。【0047】
なお、前述のエピトープペプチドとなる上記(c)のポリペプチドとしては、配列番号２、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列中のａａ１１１〜１４０、ａａ２１１〜２４０、ａａ２４８〜２７８、ａａ３２７〜３５７、ａａ４５９〜５２２、ａａ９０９〜９７２、ａａ９５９〜１０２２、ａａ９９４〜１０５７又はａａ１０１８〜１０８０の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドが好ましく、さらに配列番号４又は４４のポリペプチドにおいては、配列番号２７〜３５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜１２であるポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドがより好ましい。【0048】
上記したポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。【0049】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、イヌ染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。配列番号３又は４３の塩基配列を有するＤＮＡであれば、上記鋳型としてヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを使用することで同様に調製できる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１又は４３に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてイヌやヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークロニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記(a)のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した(b)又は(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。【0050】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。【0051】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。【0052】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。【0053】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。【0054】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。【0055】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記した(c)のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。【0056】
後述の実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを担癌生体に投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができる。また、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチド又はポリペプチドをコードする遺伝子を癌の発症前の生体に投与することで腫瘍の発生を予防することができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。また、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドは、免疫誘導による癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。【0057】
ここで、「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。【0058】
この場合、対象となる癌としては、ＰＤＳ５Ａを発現している癌であれば特に限定されないが、好ましくは乳癌、脳腫瘍、食道癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、肛門周囲腺癌、神経芽腫又は白血病である。【0059】
また、対象となる動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特に好ましくはヒト、イヌ又はネコである。【0060】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、後述の実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として０．０００１〜１０００μｇ、好ましくは０．００１〜１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。【0061】
本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。【0062】
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。【0063】
上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外又はマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ ５９５リポ多糖類の精製及び酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６/３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８及びＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）、外７名、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレン及び／又はトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、より好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Ｇｏｄｉｎｇ）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第２版、１９８６年を参照）。ポリペプチド及びアジュバントの混合物又はエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。【0064】
また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ及びＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。【0065】
また、上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した(a)ないし(c)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２０４、ＨＬＡ−Ａ０２０５、ＨＬＡ−Ａ０２０６、ＨＬＡ−Ａ０２０７、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ６８０１、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７０５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ−Ｃｗ０６０２などを挙げることができる。【0066】
ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とＩＬ−３（あるいはＩＬ−４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。【0067】
この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血又は骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日〜２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。【0068】
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５〜２０μｇ／ｍｌ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常１０３〜１０７細胞／ｍｌ程度、好ましくは５×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。【0069】
上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。【0070】
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞／ｍｌ程度、好ましくは１００００〜１００万細胞／ｍｌ程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７及びＩＬ−１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ−２及びＩＬ−７の濃度は、通常５〜２０Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ−６の濃度は通常５００〜２０００Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ−１２の濃度は通常５〜２０ｎｇ／ｍｌ程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。【0071】
上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。【0072】
後述の実施例に記載される通り、ＰＤＳ５Ａをコードする遺伝子は、それぞれ乳癌細胞、乳癌組織、脳腫瘍細胞、脳腫瘍組織、食道癌細胞、食道癌組織、肺癌細胞、肺癌組織、腎臓癌細胞、腎臓癌組織、大腸癌細胞、大腸癌組織、肛門周囲腺癌組織、肛門周囲腺癌細胞、神経芽腫細胞及び白血病細胞に特異的に発現している。従って、これらの癌種においては、ＰＤＳ５Ａが正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。癌細胞内に存在するＰＤＳ５Ａの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示され、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防剤として有用である。【0073】
上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。【0074】
抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個〜１０兆個、好ましくは１００万個〜１０億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。【0075】
また、上記(a)ないし(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記した(a)ないし(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。【0076】
遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。【0077】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で０．１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ程度である。【0078】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。【0079】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。【0080】
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ方法、及び対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、及びこれらの引用文献等）。ｉｎ ｖｉｖｏ方法がより好ましい。【0081】
ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。【0082】
なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。【0083】
また、本発明で用いられるポリペプチドは癌特異的に発現していることから、担癌生体中の血清とのみ特異的に反応するため、本発明のポリペプチドは、癌の検出にも用いられる。【0084】
上記、癌を検出する方法として、生体から分離された試料を用いて、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、あるいはその相同因子である該ポリペプチドと９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有するポリペプチドの発現を測定する。上記試料を用いてポリペプチドの発現を測定する方法としては、試料中に含まれる該ポリペプチドに対する抗体を免疫測定する方法（第１の方法）、試料中に含まれる該ポリペプチド自体を免疫測定する方法（第２の方法）、及び試料中に含まれる該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを測定する方法（第３の方法）が挙げられる。本発明の方法では、これらのいずれの方法でポリペプチドの発現を測定してもよい。なお、本発明において、「測定」という語には、検出、定量及び半定量のいずれもが包含される。【0085】
ここで、ＰＤＳ５Ａはイヌ乳癌由来ｃＤＮＡライブラリーと同一患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体（癌特異的抗体）と結合するポリペプチドとして同定されたものである（実施例１参照）。すなわち、担癌犬生体ではＰＤＳ５Ａに対する抗体が特異的に誘導されている。従って、担癌生体内のＰＤＳ５Ａに対する抗体を測定することで、ＰＤＳ５Ａを発現する癌を検出することもできる。また、上記第２の方法により抗原たるＰＤＳ５Ａを測定することでも、イヌの癌を検出できる。また、後述の実施例に記載される通り、該抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは癌細胞又は癌組織、特に乳癌細胞、乳癌組織、脳腫瘍細胞、脳腫瘍組織、食道癌細胞、食道癌組織、肺癌細胞、肺癌組織、腎臓癌細胞、腎臓癌組織、大腸癌細胞、大腸癌組織、肛門周囲腺癌細胞、肛門周囲腺癌組織、神経芽腫細胞及び白血病細胞において正常組織よりも有意に高発現しているため（実施例１参照）、該ｍＲＮＡを測定することによっても、イヌの癌を検出することができる。【0086】
上記第１の方法において、試料中に存在し得る上記癌特異的抗体の測定は、該抗体と抗原抗体反応する抗原物質を用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定法自体は下記に詳述するとおり周知の常法である。免疫測定の抗原物質として、上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いることができる。また、抗体には交叉反応性があり、実際に免疫原となった抗原物質以外の分子であっても、分子上に免疫原のエピトープと類似した構造が存在すれば、その分子は免疫原に対して誘導された抗体と抗原抗体反応により結合し得る。例えば、アミノ酸配列の配列同一性が高いポリペプチド同士では、エピトープの構造も類似している場合が多く、その場合には両者は同一の抗原性を示し得る。後述の実施例に具体的に記載される通り、配列番号４又は４４のヒト由来ポリペプチドは、担癌イヌ体内で誘導された上記抗体と抗原抗体反応する。従って、本発明の第１の方法では、免疫測定の抗原として、いずれの哺乳動物由来の相同因子を用いることもできる。【0087】
通常、タンパク質等のような、複雑な構造をとる分子量の大きい抗原物質の場合、分子上に構造の異なる複数の部位が存在している。従って、生体内では、そのような抗原物質に対し、複数の部位をそれぞれ認識して結合する複数種類の抗体が生産される。すなわち、生体内でタンパク質等の抗原物質に対して生産される抗体は、複数種類の抗体の混合物であるポリクローナル抗体である。なお、本発明において「ポリクローナル抗体」といった場合には、抗原物質を体内に含む生体由来の血清中に存在する抗体であって、該抗原物質に対して該生体内で誘導された抗体を指す。【0088】
試料中の抗体の測定は、上記したポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等がある。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、いずれの方法を用いても上記抗体の免疫測定を行うことができる。特に限定されないが、サンドイッチＥＬＩＳＡや凝集法は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないため、本発明の方法における上記抗体の免疫測定方法として好ましく適用することができる。抗体の標識として酵素を用いる場合、酵素としては、ターンオーバー数が大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たす物であれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫測定法に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてはアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトルフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては１２５Ｉや３Ｈ等の通常ラジオイムノアッセイで用いられている物を使用することができる。蛍光色素としては、フルオロレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられる物を使用することができる。【0089】
なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、抗原として用いる上記ポリペプチドを固相に不動化し、血清等の試料と反応させ、洗浄後、適当な二次抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した二次抗体を測定する。抗原ポリペプチドを固相に不動化することにより、未結合の二次抗体を容易に除去することができるため、本発明の癌の検出方法の態様として好ましい。二次抗体としては、例えば試料がイヌ由来であれば、抗イヌＩｇＧ抗体を用いることができる。二次抗体を上記に例示した標識物質で標識しておくことにより、固相に結合した二次抗体を測定することができる。こうして測定した二次抗体量が血清試料中の上記抗体量に相当する。標識物質として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって抗体量を測定できる。標識物質として放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定することができる。【0090】
本発明の第２の方法では、生体から得た試料中に含まれ得る、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４のポリペプチドあるいはその相同因子が測定される。上述した通り、癌患者においては、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４のポリペプチドあるいはその相同因子と抗原抗体反応する癌特異的抗体の量が有意に多いが、このことは、癌患者体内において、該癌特異的抗体の抗原たるこれらのポリペプチド又はその相同因子の産生量が有意に多いことを示している。従って、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４のポリペプチドあるいはその相同因子を測定することによっても、上記第１の方法と同様に、生体内の癌を検出することができる。【0091】
試料中のポリペプチドの測定は、周知の免疫測定法により容易に行なうことができる。具体的には、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるポリペプチドあるいはその相同因子と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中に存在し得る配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示される配列から成るポリペプチドあるいはその相同因子を測定することができる。免疫測定方法自体は、上述した通り周知の常法である。【0092】
ここで、「抗原結合性断片」とは、抗体分子中に含まれるＦａｂ断片やＦ(ａｂ’)２断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナルでもよいが、免疫測定等のためには、再現性が高いモノクローナル抗体が好ましい。ポリペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行うことが出来る。例えば、ポリペプチドをキーホールリンペットヘモシアン（ＫＬＨ）やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより、該ポリペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるポリペプチドあるいはその相同因子と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて、培養上清から上記タンパク質を対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることが出来る。なお、上記の方法は周知の常法である。【0093】
本発明の第３の方法では、生体から得た試料中に含まれ得る、ＰＤＳ５ＡをコードするｍＲＮＡが測定される。後述の実施例に具体的に示される通り、ＰＤＳ５ＡをコードするｍＲＮＡは、癌、乳癌、脳腫瘍、食道癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、肛門周囲腺癌、神経芽腫及び白血病の組織又は細胞において有意に高発現している。従って、試料中の該ｍＲＮＡを測定することによっても、生体内の癌を検出することができる。【0094】
本発明の検出方法では、上記のとおりに測定したポリペプチドの発現量に基づいて、対象生体が癌であるか否か等を判断する。癌の検出は、対象生体におけるポリペプチドの発現を測定するのみでも可能であるが、検出精度を高める観点からは、１ないし複数の健常者試料におけるポリペプチドの発現量（抗体量、ポリペプチド量又はｍＲＮＡ量）を調べて健常者基準値を取得し、対象生体の測定値を該健常者基準値と比較することが好ましい。さらに検出精度を高めたい場合には、癌を罹患していることがわかっている多数の患者から得た試料についてポリペプチド発現量を調べて癌患者基準値を取得し、対象生体の測定値を健常者基準値及び癌患者基準値の双方と比較してもよい。上記基準値は、例えば、各試料におけるポリペプチド発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、健常者基準値と癌患者基準値は、予め多数の健常者及び癌患者についてポリペプチド発現量を調べて定めておくことができる。そのため、本発明の方法で基準値との比較を行なう場合には、予め定めた基準値を用いてもよい。【0095】
本発明の検出方法では、他の癌抗原や癌マーカーによる検出を組み合わせて用いてもよい。これにより、癌の検出精度をさらに高めることができる。【0096】
本発明の検出方法によれば、生体内の癌を検出することができる。本発明の方法によれば眼に見えない小さいサイズの腫瘍や体内深部の腫瘍をも検出できるので、癌の早期発見に有用である。また、癌の治療後経過観察中の患者について本発明の検出方法を適用すれば、癌の再発があった場合にその癌を早期に検出することができる。【0097】
また、担癌生体において、本発明で測定対象となる上記所定のポリペプチドを発現する癌細胞の数が増加すればそれだけ、該生体内における該ポリペプチド及びそのｍＲＮＡの蓄積量が増大し、血清中に上記ポリペプチドに対する抗体が多く産生される。一方、癌細胞の数が減少すればそれだけ、生体内の該ポリペプチド及びそのｍＲＮＡの蓄積量が減少し、血清中の上記ポリペプチドに対する抗体が減少する。従って、上記所定のポリペプチドの発現量が多い場合には、腫瘍の増大や癌の転移が生じている、すなわち癌の進行度が進んでいると判断することができる。【0098】
また、後述の実施例に示される通り、同一種類の腫瘍において、悪性型では良性型よりも有意に上記抗体量が多い。そのため、上記所定のポリペプチドの発現量が多い場合には、癌の悪性度がより高いと判断することができる。すなわち、本発明の方法によれば、癌の悪性度を検出することもできる。【0099】
さらに、上記所定のポリペプチドの発現量の増減を指標として、癌の治療効果をモニタリングすることもできる。従って、癌の治療中や治療後の個体について、上記ポリペプチドの発現量を観察することで、抗癌剤の治療効果や、腫瘍摘出後の残存腫瘍有無、さらに経過観察でも転移・再発をいち早く知る手がかりが得られる。適切に治療できている場合には、ポリペプチドの発現量は治療前の担癌状態よりも低下するので、その生体に対し行なった（行なっている）治療の効果が良好であると判断することができる。ポリペプチド発現量が上昇又は維持されている場合、あるいは一旦低下した後さらに上昇が見られた場合には、治療効果が不十分と判断することができ、他の治療方法への変更や抗癌剤投与量の変更等、治療方法選択の有用な判断材料となる。【0100】
本発明の癌の検出方法の対象となる癌としては、ＰＤＳ５Ａを発現している癌であり、乳癌、脳腫瘍、食道癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、肛門周囲腺癌、神経芽腫又は白血病が好ましい例として挙げられる。また、本発明の方法の対象となる生体は哺乳動物であることが好ましく、ヒトやイヌ、ネコがより好ましい。【0101】
本発明の方法に供する試料としては、血液、血清、血漿、腹水、胸水などの体液、組織、細胞が挙げられる。特に、上記第１の方法及び第２の方法においては、血清、血漿、腹水及び胸水を好ましく用いることができ、また、ｍＲＮＡを測定する上記第３の方法においては、組織試料及び細胞試料が好ましい。【0102】
第１の方法で免疫測定の抗原として用いられる上記したポリペプチドは、癌検出試薬として提供することができる。該試薬は、上記ポリペプチドのみから成っていてもよく、また、該ポリペプチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該試薬は、プレートやメンブレン等の固相に固定化した状態で提供することもできる。【0103】
第２の方法で配列番号２、４、６、８、１０、１２又は４４に示されるポリペプチドあるいはその相同因子を免疫測定する際に用いられる、該ポリペプチド又はその相同因子と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片も、癌検出試薬として提供することができる。この場合の癌検出試薬も、上記抗体又は抗原結合性断片のみから成るものであってもよく、また、該抗体又は抗原結合性断片の安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該抗体又は抗原結合性断片は、マンガンや鉄等の金属を結合させたものであってもよい。そのような金属結合抗体又は抗原結合性断片を体内に投与すると、抗原タンパク質がより多く存在する部位に該抗体又は抗原結合性断片がより多く集積するので、ＭＲＩ等によって金属を測定すれば、抗原タンパク質を産生する癌細胞の存在を検出することができる。【0104】
さらにまた、第３の方法でｍＲＮＡの測定に用いられる上記した癌検出用ポリヌクレオチドも、癌検出試薬として提供することができる。この場合に癌検出用試薬も、該ポリヌクレオチドのみから成るものであってもよく、また、該ポリヌクレオチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。該試薬中に含まれる該癌検出用ポリヌクレオチドは、好ましくはプライマー又はプローブである。【実施例】
【0105】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。【0106】
実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
担癌犬の乳癌組織から酸−グアニジウム−フェノール−クロロフォルム法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ ＮＡを精製した。
【0107】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ｚａｐ−ｃＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。【0108】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング上記作製したｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ Ｅｘｔｒａ:ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。
【0109】
上記患犬血清としては、肛門近位腫瘍の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢＬｕｅ ＭＲＦ'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次で０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％ 脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【0110】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％ 脱脂粉乳を含ＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｄｏｇ ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ:ＢＥＴＨＹＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温1時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ ゼラチン（ｐＨ７．５））５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する３０９４０個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。【0111】
（３）単離抗原遺伝子の配列同一性検索上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１００μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
【0112】
精製したプラスミドは、配列番号１３に記載のＴ３プライマーと配列番号１４に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号１に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＰＤＳ５Ａ遺伝子であることが判明した。イヌＰＤＳ５Ａのヒト相同因子であるヒトＰＤＳ５Ａでは、配列同一性が塩基配列９４％、アミノ酸配列９９％であり、マウス相同因子であるマウスＰＤＳ５Ａでは、配列同一性が塩基配列９１％、アミノ酸配列９９％、ウシ相同因子であるウシＰＤＳ５Ａでは、配列同一性が塩基配列９５％、アミノ酸配列９９％、ウマ相同因子であるウマＰＤＳ５Ａでは、配列同一性が塩基配列９６％、アミノ酸配列９９％、ニワトリ相同因子であるニワトリＰＤＳ５Ａでは、配列同一性が塩基配列８３％、アミノ酸配列９８％であった。ヒトＰＤＳ５Ａの塩基配列を配列番号３及び４３、アミノ酸配列を配列番号４及び４４に、マウスＰＤＳ５Ａの塩基配列を配列番号５、アミノ酸配列を配列番号６に、ウシＰＤＳ５Ａの塩基配列を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８に、ウマＰＤＳ５Ａの塩基配列を配列番号９、アミノ酸配列を配列番号１０に、ニワトリＰＤＳ５Ａの塩基配列を配列番号１１、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。【0113】
（４）各組織での発現解析上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの正常組織及び各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテク社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１５及び１６、ヒトプライマーは配列番号１７及び１８、マウスプライマーは配列番号１９及び２０に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ(ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−１分のサイクルを３０回繰り返して行った。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（イヌ及びヒトＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２１及び２２、マウスＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２３及び２４に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、イヌＰＤＳ５Ａ遺伝子は、健常なイヌ組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方、イヌ腫瘍組織では強い発現が見られた。ヒト及びマウスＰＤＳ５Ａ遺伝子の発現も、イヌＰＤＳ５Ａ遺伝子と同様、ヒト及びマウス正常組織ではほとんど発現が確認できず、癌細胞では大部分の細胞株で発現が検出された（図２、３）。
【0114】
実施例２：ＰＤＳ５Ａの生体内での癌抗原性の解析及び薬効評価（１）生体内でＰＤＳ５Ａを発現する組換えベクターの作製
配列番号５の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でＰＤＳ５Ａを発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたマウス癌細胞株Ｎ２ａ（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２５及び２６に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号５のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％ アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約４０００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
【0115】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターＰＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でＰＤＳ５Ａタンパクが産生される。【0116】
上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｍ ＣａＣｌ２ １００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後金−ＤＮＡ粒子と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％エタノール（ＷＡＫＯ社製）によって３回洗浄した。金−ＤＮＡ粒子に１００％ エタノール ６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金−ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）に流し込み、壁面に沈殿させた。金−ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした。【0117】
（２）ＤＮＡワクチン法によるＰＤＳ５Ａの抗腫瘍効果１０匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）及びＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）の皮下にマウス神経芽腫細胞株Ｎ２ａ、大腸癌細胞株ＣＴ２６を各々１×１０６個移植後、上記で作製したチューブを遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与し（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）、抗腫瘍効果を評価した（治療モデル）。また、同様にして、１０匹のＡ／Ｊマウス及びＢａｌｂ／ｃマウスに、ＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回経皮投与した後にＮ２ａ細胞、ＣＴ２６細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、ＰＤＳ５Ａ遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを各モデルで１０匹ずつ投与した。
【0118】
抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。結果を図４〜１１に示す。本検討の結果、神経芽腫細胞株を用いた治療モデルにおいて、４１日後には、コントロール群及びＰＤＳ５Ａプラスミド投与群で、それぞれ５６９ｍｍ３、１０９ｍｍ３となり、ＰＤＳ５Ａプラスミド投与群で有意な腫瘍の縮小が観察された（図４）。同様に神経芽腫細胞株を用いた予防モデルにおいても、４３日後には、コントロール群及びＰＤＳ５Ａプラスミド投与群で、それぞれ、４７６ｍｍ３、０ｍｍ３となり、ＰＤＳ５Ａプラスミド投与群では腫瘍の完全な退縮が観察された（図５）。また、大腸癌細胞株を用いた治療モデルにおいて、４１日後には、コントロール群及びＰＤＳ５Ａプラスミド投与群で、それぞれ５８９ｍｍ３、１８９ｍｍ３となり、ＰＤＳ５Ａプラスミド投与群で有意な腫瘍の縮小が観察された（図８）。同様に大腸癌細胞株を用いた予防モデルにおいても、４３日後には、コントロール群及びＰＤＳ５Ａプラスミド投与群で、それぞれ、３９７ｍｍ３、４３ｍｍ３となり、ＰＤＳ５Ａプラスミド投与群で有意な腫瘍の縮小が観察された（図９）。また、神経芽腫細胞株を用いた両モデルにおける生存の経過を観察した結果、治療モデルにおいて、コントロール群では投与後８４日で全例死亡したのに対し、ＰＤＳ５Ａプラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた（図６）。また予防モデルにおいて、コントロール群では投与後９０日で全例死亡したのに対し、ＰＤＳ５Ａプラスミドを投与した群では、全てのマウスが生存していた（図７）。さらに、大腸癌細胞株を用いた両モデルにおける生存の経過を観察した結果、治療モデルにおいて、コントロール群では投与後８４日で全例死亡したのに対し、ＰＤＳ５Ａプラスミド投与群では、４０％のマウスが生存していた（図１０）。また予防モデルにおいて、コントロール群では投与後９０日で全例死亡したのに対し、ＰＤＳ５Ａプラスミドを投与した群では、８０％のマウスが生存していた（図１１）。【0119】
以上の結果から、ＰＤＳ５Ａプラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められ、このことから、ＰＤＳ５Ａが強い癌抗原性を有する癌抗原であり、癌の治療及び予防に有効であることが明らかになった。【0120】
実施例３：ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導ヒトＰＤＳ５Ａタンパク質のアミノ酸配列中のＨＬＡ−Ａ０２０１結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/）で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いて配列番号４及び４４のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスＩ分子に結合可能と予想される、配列番号２７〜３５のポリペプチドを選択した。
【0121】
ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性の健常人から末梢血を分離し、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（ＯｒｇａｎｏｎｐＴｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）に重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（又はそれ以上）洗浄し、ＰＢＭＣを得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｌｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中に３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。【0122】
一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。【0123】
調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、選択したポリペプチドそれぞれを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ポリペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ，Ｍｉａｍｉ,ＦＬ）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後に刺激されたＴ細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。【0124】
実施例４：ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するＰＤＳ５Ａ中の細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定上記で誘導した各穴のＴ細胞の内、配列番号２７〜３５の各ポリペプチドで刺激されたＴ細胞が増殖していることが顕微鏡下における細胞数計測により確認された。増殖が見られたＴ細胞それぞれについて、パルスに用いた各ポリペプチドに対する特異性を調べるために、ポリペプチドでパルスされた、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子を発現するＴ２細胞（Ｓａｌｔｅｒ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：２３５−２４６（１９８５）、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中に各ポリペプチドを添加し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ポリペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号２７〜３５の各ポリペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において、ＩＦＮ−γ産生が確認された（図１２）。従って、配列番号２７〜３５の各ポリペプチドは特異的にＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。一方、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する本発明の範囲外のポリペプチドを添加して上記処理を行った場合、ＩＦＮ−γの産生は確認されなかった（図１２）。
【0125】
次に、本発明で用いられるポリペプチドである配列番号２７〜３５の各ポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でＰＤＳ５Ａを発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであるか、また本ポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でＰＤＳ５Ａを発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。【0126】
ＰＤＳ５Ａの発現が確認された悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇ（Ｓｔｅｉｎ ＧＨ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９９：４３−５４ （１９７９）、ＡＴＣＣより購入）を１０５個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加し、さらにこれに後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁された１０５、５×１０４、２．５×１０４及び１．２５×１０４個の配列番号２７〜３５の各ポリペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、配列番号２７〜３５の各ポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。【0127】
その結果、配列番号２７〜３５の各ポリペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を有することが判明した（図１３）。従って、本発明で用いられるポリペプチドである配列番号２７〜３５の各ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でＰＤＳ５Ａを発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであり、さらにこれらポリペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。一方、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する本発明の範囲外のポリペプチドを添加して上記処理を行った場合、細胞障害活性は見られなかった（図１３）。【0128】
なお、細胞障害活性は、上記のように本発明で用いられる各ポリペプチドで刺激誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞１０５個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個の悪性脳腫瘍細胞株Ｔ９８Ｇとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したＣＤ８陽性Ｔ細胞のＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を示した結果である。【0129】
＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えた際のＴ９８Ｇからのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。【0130】
実施例５：組換えＰＤＳ５Ａタンパク質の作製、薬効評価及び癌の検出と癌診断（１）組換えＰＤＳ５Ａタンパク質の作製
実施例１で取得した配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを１μｌ、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３７及び３８に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％ アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約４０００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
【0131】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【0132】
また、配列番号４３の遺伝子を基に、以下の方法にてヒトＰＤＳ５Ａの組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３９及び４０に記載）を各０．４μＭ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号４４のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約４０００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【0133】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【0134】
また、配列番号５の遺伝子を基に、以下の方法にてマウスＰＤＳ５Ａの組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号４１及び４２に記載）を各０．４μＭ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号６のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％ アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約４０００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【0135】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【0136】
(２)組換えＰＤＳ５Ａタンパク質の精製上記で得られた、配列番号２、配列番号４４又は配列番号６を発現するそれぞれの組換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ アンピシリン含有ＬＢ培地にて６００ｎｍでの吸光度が０．７付近になるまで３７℃で培養後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、さらに３７℃で４時間培養した。その後４８００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに４８００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体の洗浄を行った。
【0137】
この菌体を５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。【0138】
不溶性画分を５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて懸濁し６０００ｒｐｍで１５分間遠心した。本操作を２回繰り返し、脱プロテアーゼ操作を行った。【0139】
この残渣を６Ｍ グアニジン塩酸塩、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム含有５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、４℃で２０時間静置しタンパク質を変性させた。この変性操作後、６０００ｒｐｍで３０分間遠心して得られた可溶性画分を、定法に従って調製したニッケルキレートカラム（担体：Ｃｈｅｌａｔｅｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社）、カラム容量５ｍＬ、平衡化緩衝液：６Ｍ グアニジン塩酸塩、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム含有５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に添加し、さらに４℃で一晩静置しニッケルキレート化した担体への吸着を行った。このカラム担体を１５００ｒｐｍで５分間遠心して上清を回収し、カラム担体についてはリン酸緩衝化生理食塩水で懸濁後、カラムに再充填した。【0140】
カラム未吸着画分をカラム容量の１０倍量の０．５Ｍ 塩化ナトリウム含有０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、０．５Ｍ 塩化ナトリウム含有０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行い精製画分とし、以降この精製画分を投与試験用の材料とした。なお、各溶出画分中の目的タンパク質は、定法に従って行ったクマシー染色によって確認した。【0141】
上記方法によって得られた精製標品を反応用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．０））に置換した後、ＦａｃｔｏｒＸａ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従ってＦａｃｔｏｒＸａプロテアーゼによるＨｉｓタグの切断及び目的タンパク質の精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品１２ｍｌを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを実験に用いた。【0142】
（３）組換えマウスＰＤＳ５Ａタンパク質の担癌マウスに対する抗腫瘍効果Ａ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）の皮下にマウス神経芽腫細胞株Ｎ２ａを１×１０６個移植し、腫瘍が平均５０〜１００ｍｍ３に達した時点（典型的には腫瘍接種後７日間）で、マウスを１群１０匹として無作為に群分けし、組換えマウスＰＤＳ５Ａタンパク質の抗腫瘍効果の評価を行った（治療モデル）。前述の通り精製した組換えマウスＰＤＳ５Ａタンパク質１００μｇ（０．５ｍｌ）に５０μｇのポリＩＣを混合して癌治療剤を調製し、これを担癌マウスに一週間毎に皮下に計３回投与を行った。その結果、癌治療剤投与から３１日後には腫瘍が完全に退縮した。一方、ＰＢＳ（−）投与陰性コントロール群及びポリＩＣ単独投与群（５０μｇ）では投与後３１日後には腫瘍がそれぞれ平均１６５７ｍｍ３、平均９３２ｍｍ３となった。
【0143】
また、Ａ／Ｊマウスに対して組換えマウスＰＤＳ５Ａタンパク質１００μｇ（０．５ｍｌ）と５０μｇのポリＩＣを混合した癌治療剤を調製し、これを一週間毎に皮下に計３回投与を行った後に、Ｎ２ａ細胞を１×１０６個移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、1群は１０匹とし、比較対照として、ＰＢＳ（−）投与陰性コントロール群及びポリＩＣ単独投与群（５０μｇ）を割り付けた。その結果、癌治療剤投与を投与した群では、癌治療剤を投与して４０日後においても腫瘍の発生は観察されなかった。一方、ＰＢＳ（−）投与陰性コントロール群及びポリＩＣ単独投与群（５０μｇ）では投与後４０日後にはそれぞれ平均１９８９ｍｍ３、平均１８４３ｍｍ３となった。【0144】
同様の実験を大腸癌モデルで行った。Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）の皮下に大腸癌細胞株ＣＴ２６を１×１０６個移植し、腫瘍が平均５０〜１００ｍｍ３に達した時点（典型的には腫瘍接種後７日間）で、マウスを１群１０匹として無作為に群分けし、組換えマウスＰＤＳ５Ａタンパク質の抗腫瘍効果の評価を行った（治療モデル）。前述の通り精製した組換えマウスＰＤＳ５Ａタンパク質１００μｇ（０．５ｍｌ）に５０μｇのポリＩＣを混合して癌治療剤を調製し、これを担癌マウスに一週間毎に皮下に計３回投与を行った。その結果、癌治療剤投与から２４日後には腫瘍が完全に退縮した。一方、ＰＢＳ（−）投与陰性コントロール群及びポリＩＣ単独投与群（５０μｇ）では投与後２４日後には腫瘍がそれぞれ平均１４４９ｍｍ３、平均８３５ｍｍ３となった。【0145】
また、Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して組換えマウスＰＤＳ５Ａタンパク質１００μｇ（０．５ｍｌ）と５０μｇのポリＩＣを混合した癌治療剤を調製し、これを一週間毎に皮下に計３回投与を行った後に、ＣＴ２６細胞を１×１０６個移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、1群は１０匹とし、比較対照として、ＰＢＳ（−）投与陰性コントロール群及びポリＩＣ単独投与群（５０μｇ）を割り付けた。その結果、癌治療剤投与を投与した群では、癌治療剤を投与して３１日後においても腫瘍の発生は観察されなかった。一方、ＰＢＳ（−）投与陰性コントロール群及びポリＩＣ単独投与群（５０μｇ）では投与後３１日後にはそれぞれ平均１７８１ｍｍ３、平均１６７５ｍｍ３となった。【0146】
以上の結果から組換えＰＤＳ５Ａタンパク質が癌の治療及び予防に有効であることが明らかになった。【0147】
（４）組換えＰＤＳ５Ａタンパク質の担癌患犬に対する抗腫瘍効果表皮に腫瘤を持つ担癌患犬３頭（乳腺腫瘍３頭）に対して、後述の実施例５に記載した組換えタンパク質の抗腫瘍効果の評価を行った。投与を行う前に、まず後述の実施例５（３）に記載した方法により、各患犬の血清中の組換えタンパク質に対する抗体価を測定したところ、健常犬と比較して高い抗体価が検出された。このことからこれら担癌患犬の生体中の腫瘍組織には、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が癌抗原として発現していることが示唆された。
【0148】
前述の通り精製した組換えＰＤＳ５Ａタンパク質（イヌ由来及びヒト由来）各々５００μｇ（２．５ｍｌ）に等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合して２種類の癌治療剤を調製し、これを一週間毎に腫瘍近傍の所属リンパ節に計３回投与を行った。その結果、癌治療剤投与時点で、それぞれ大きさが約５００ｍｍ３及び１０００ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤投与からそれぞれ１３日後及び２１日後には、完全に退縮した。一方、ＰＢＳ（−）投与陰性コントロール群ではＰＢＳ投与時点で約８００ｍｍ３であった腫瘤が、投与後２１日後には１６２５ｍｍ３となった。【0149】
また、肛門周囲に発生した腺癌及び表皮に発生した扁平上皮癌の患犬各１頭に対して、後述の実施例５の通り精製した組換えイヌＰＤＳ５Ａタンパク質５００μｇ（２．５ｍｌ）に等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合して癌治療剤とし、これを一週間毎に腫瘍近傍の皮下に計４回投与した。その結果、癌治療剤投与時点で、それぞれ癌の大きさが約３７０ｍｍ３及び２８０ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤投与からそれぞれ３５日後及び４２日後には、完全に退縮した。【0150】
（５）組換えＰＤＳ５Ａタンパク質を用いた癌の検出悪性腫瘍の確認された患犬１１２頭と健常犬３０頭の血液を採取し、血清を分離した。上記（２）で作製したイヌＰＤＳ５Ａタンパク質（配列番号２）を用いてＥＬＩＳＡ法にて該タンパク質に特異的に反応する血清中の抗体価を測定した。作製したタンパク質の固相化は、リン酸緩衝化生理食塩水にて５μｇ／ｍＬに希釈した組換えタンパク質溶液を９６穴イモビライザーアミノプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で一晩静置して行った。ブロッキングは、３％ ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ウシ血清アルブミン）、シグマアルドリッチジャパン社製）含有５０ｍＭ 重炭酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ８．４）（以下ブロッキング溶液）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうした。希釈にブロッキング溶液を用いた１０００倍希釈血清を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３時間振とうして反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）含有リン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液にて３０００倍希釈したＨＲＰ修飾抗イヌＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｄｏｇ ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＢＥＴＨＹＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間振とうして反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＲＰ基質 ＴＭＢ（１−Ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）、ＰＩＥＲＣＥ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３０分間酵素基質反応させた。その後、０．５Ｍ 硫酸溶液（シグマアルドリッチジャパン社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応停止後、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度測定を行った。コントロールとしては、作製した組換えタンパク質を固相化しないもの、担癌犬血清を反応させないものを上記と同様に行い比較した。
【0151】
上記癌診断に用いた全１１２検体は、摘出された腫瘍組織を用いた病理診断の結果、全て悪性と確定診断がされている。【0152】
具体的には、悪性黒色腫、悪性混合腫瘍、肝細胞癌、基底細胞癌、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大腸癌、気管支腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肺癌、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、扁平上皮癌、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫、褐色細胞腫などの癌診断を受けている検体である。【0153】
これら担癌犬生体由来の血清は、健常犬由来血清に比べて組換えタンパク質に対する高い抗体価を示した。本診断法による悪性判断を健常犬平均値の２倍以上とした場合、９４検体、８３．９％で悪性癌と診断できることがわかった。この９４検体の癌の種類は以下のとおりである。なお、検体によっては複数種類の癌を罹患しているものもあるが、以下に示す数値は癌の種類ごとの累計値である。【0154】
悪性黒色腫５例、リンパ腫１０例、顆粒膜細胞腫１例、肝細胞癌３例、悪性精巣腫瘍３例、口腔内腫瘤３例、肛門周囲腺癌５例、肉腫９例、乳腺癌３５例、肺癌１例、腺管癌４例、皮脂腺癌２例、肥満細胞腫５例、平滑筋肉腫１例、扁平上皮癌４例、悪性混合腫瘍２例、血管周皮腫１例。【0155】
また、上記（２）で作製したヒトＰＤＳ５Ａタンパク質（配列番号４４）を用いて、上記と同様にして癌診断を行ったところ、同様の結果が得られた。【0156】
以上のことから、ＰＤＳ５Ａタンパク質を用いて該タンパク質に特異的に反応する血清中の抗体価を測定することによって、癌の検出と診断ができることが判った。【産業上の利用可能性】
【0157】
本発明の各種癌に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防あるいは癌の検出に有用である。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]