特許 5875230 遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5875230

(24)【登録日】2016年1月29日

(45)【発行日】2016年3月2日

(54)【発明の名称】遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160218BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160218BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12Q1/68 A

【請求項の数】4

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2011-19698(P2011-19698)

(22)【出願日】2011年2月1日

(65)【公開番号】特開2012-157295(P2012-157295A)

(43)【公開日】2012年8月23日

【審査請求日】2013年10月29日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】506194173

【氏名又は名称】木下 健司

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】木下 健司

(72)【発明者】

【氏名】山下 邦彦

【審査官】 吉岡 沙織

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−１２４９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０３８１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−０９９６２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／０６４７３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−２８３１６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Genome Research，２００３年，Vol.13，P.1488-1495

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液、または、口腔内細胞を含む唾液である被検試料に含まれる特定遺伝子を検出する方法であって、
被検試料を担持した水解性担体を、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含む反応液に接触させ、水解性担体を反応液中で分解させることで、水解性担体に干渉されることなく水解性担体の分解後の反応液にＣＣＤ方式による光学的手段を用いて、反応液中に特定遺伝子が含まれるか否かを検出することを特徴とする、方法。

【請求項2】

水解性担体が水解性紙である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂおよびアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子の遺伝子多型の検出に用いられる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

被検試料を担持した水解性担体を接触後の前記反応液中で、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる反応を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法に関する。より詳細には、被検試料に含まれる遺伝子を増幅する方法、または、被検試料に特定遺伝子が含まれるか否かを特異的に検出する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生物の個体間では、野生型とは異なる塩基配列を有する遺伝子多型（ＳＮＰ）が存在する。この遺伝子多型は、個体の基礎代謝、性質、疾患などの差異を生じさせることが知られており、生物における遺伝子多型を検査することは将来生じうる疾患などを予測することに繋がることから、臨床的にも重要視されている。したがって、個体のＤＮＡの特定遺伝子において変異が生じているか否かを検査することについて様々な研究が進められており、生体試料、臨床試料などの被検試料に含まれる遺伝子の増幅ｖ法として汎用されているＰＣＲ法がＳＮＰ分析にも応用されている（たとえば特開２００５−２４５２７２号公報（特許文献１）を参照）。しかしながら、特許文献１に記載の方法は、ＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などの操作が煩雑であり、より簡便な方法が求められている。

【0003】

また生体から少量の血液などを採取し、その血液を直接利用して特定遺伝子を増幅して検出するための簡便なＰＣＲ法などが開発されている（たとえば特表２００８−５３１０３９号公報（特許文献２）を参照）。しかし、特許文献２に記載の方法においては、血液を採取する際に痛みが伴い、血液を輸送する際には低温に保持する必要があり、さらに、ＰＣＲ法などに使われなかった余った血液などの被検試料の保存および処分には細心の留意を払う必要がある。

【0004】

また、ＰＣＲ法などを利用した特開２００６−１８７２７０号公報（特許文献３）、特開２００６−３２２７３９号公報（特許文献４）およびＫｉｎｏｓｈｉｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３５：ｅ３ （２００７）（非特許文献１）には、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面にＤＮＡ鎖を固定化した不溶性担体に検出対象遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、該ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせ、溶液中の遺伝子断片の含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法が開示されている。しかしながら、特許文献３、４などに記載の方法においても、同様にＰＣＲ法に利用するためのＤＮＡの精製などの操作が煩雑であり、より簡便な方法が求められている。

【0005】

生体試料、臨床試料、食品などの被検試料中の特定微生物の有無を調べる場合には、従来、被検試料中の微生物を分離培養し、コロニーについて視覚的観察（コロニーの色素反応、コロニー形態など）、顕微鏡観察、グラム染色、生化学的性状の検査などを行なっていた。特定微生物の有無が判明するまでに少なくとも２日間を要する。したがって、この方法は、微生物が検出されたとしてもそれに対する対応が遅くなることから、食品メーカーによる食品出荷前の自主検査には採用し難い。そこで、食品衛生検査や臨床検査領域においては、微生物の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各微生物の特定遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各微生物の存在の有無を判別および定量する試みがなされている。

【0006】

また、ウイルス病の診断を確実に行なうこと、また、未知の流行病を新しいウイルス病として同定することは、当該ウイルス病の地域分布と流行時期を知り、当該疾患に対する予防と治療対策を立てる上で重要なことであることから、簡便に早急に診断することについて研究が進められている。したがって、被検試料から、生体に潜在しているウイルス核酸やｍＲＮＡの特定遺伝子としての存在を証明して診断する方法が開発されている。当該方法によると、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５））やＲＴ−ＰＣＲ法を利用することによって被検試料中に微量存在するウイルス遺伝子でも高感度に検出できる。しかし、この場合、検査結果の取得に１日以上要する。

【0007】

また、近年、臨床での応用が期待される薬物代謝関連酵素遺伝子のＳＮＰも多く見出されており、多くの薬物代謝に関与するチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）のファミリーや抗結核薬イソニアジドの代謝に関与するＮ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＮＡＴ−２）、経口抗凝固剤ワルファリンの効果の強さに大きく影響するＣＹＰ２Ｃ９とＶＫＯＲＣ１などがそれである。これらの遺伝子にその酵素活性を低下させるようなＳＮＰがあると、薬剤の血中濃度が長時間にわたって高く保たれた結果、効果が強く発現したり、有毒な中間代謝産物が蓄積されたりする副作用がある。また、代謝速度の高い遺伝子多型が見出されたならば、薬剤の血中濃度を維持するために投薬量を増やすなどの処置が必要となる。そこで、投薬前にこのような遺伝子のＳＮＰを検査し、その遺伝子の型から判断して適切な薬剤の投薬量を決定するなどして、副作用を回避し、効率的な治療効果を得ようとする医療、すなわち、「テーラーメイド医療」、「オーダメイド医療」、あるいは「個別化医療」と呼ばれている患者個々の体質に応じたより適切な医療の実現が可能となり、無用な副作用への対処や不適切な投薬を減らすことによって医療費削減への効果も期待できる。このように、ＳＮＰを利用した診断の実用化と普及が大いに期待されている。

【0008】

また、ヒトの大腸内には５００〜１０００種以上、糞便１ｇ当たり１０¹²個近い多種多様な細菌が棲息している。これらの細菌がヒトの栄養、薬効、生理機能、老化、発ガン、免疫、感染などに極めて大きな影響を及ぼすことが培養法により明らかにされてきた。しかしながら、大腸内の環境は複雑な栄養成分および嫌気性であるが故に分離、同定できる菌種に限りがあり、大腸内常在菌の約７０〜８０％が難分離、難培養性細菌で占められている。そのため、大腸内菌叢の全体像は明らかにされていなかった。１９９０年代になって分子生物学的手法より環境中の微生物菌叢の解析が行なわれるようになった。その結果、多数の難分離、難培養性細菌が存在することが系統学的に明らかにされ始めた。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ライブラリーによりヒト大腸内菌叢の解析を行ない、今までに検出されていない細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し、多くの難分離、難培養性細菌の存在を明らかにした。しかしながら、現在行なわれている遺伝子の分離・精製法では煩雑であり、大腸内常在菌の全体像を理解するには不十分である。さらにどの様な大腸内常在菌が難分離、難培養性であるのか不明瞭であるなどの課題が残されていた。

【0009】

また現在、核酸の増幅方法は、微量なＲＮＡの検出方法としても活発に利用されている。ＲＮＡの検出方法として通常使用されるＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写酵素を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後に、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する方法で、微量のＲＮＡでも定量的に解析できるため、今日最も検出感度の高い解析法の１つとして、ＲＮＡを遺伝子として保有しているウイルスの検出、ｍＲＮＡの定量的検出や塩基配列決定による発現遺伝子の解析、さらにはｃＤＮＡのクローニングによる発現産物の解析および生産などには欠かせないものになっている。

【0010】

ＲＴ−ＰＣＲ法をはじめとしたＲＮＡ増幅法は全て酵素反応をベースとしているため、被検試料中に存在する色素、タンパク質、糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が強く阻害されることが広く知られている。そこで、ＲＮＡ増幅に先立って、細胞、真菌、細菌、ウイルスなどのＲＮＡを包含する被検試料を分離後、当該被検試料からＲＮＡを抽出する過程が必要となる。その方法として、従来、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などにより生体試料を処理し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルムなどを用いて、ＲＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。最近ではＲＮＡ抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬などが使用されている。

【0011】

また、最近になり、被検試料からの簡便な遺伝子増幅手法として、血液から直接遺伝子増幅する方法、乾燥させたろ紙に担持させた被検試料などから直接遺伝子増幅する手法などが報告されている。しかしながら、血液を用いる場合には、上述したように採血時の痛み、事故、低温での輸送の必要性などの問題がある。

【0012】

また別の被検試料の採取法として、口腔粘膜の細胞を綿棒などで擦り取り利用する方法も報告されている。しかしこの場合、綿棒に保持された細胞から、ＤＮＡを抽出し、別途調整した増幅用反応液に抽出したＤＮＡ溶液を添加しなければならず、多数の被検試料を同時に処理した場合にサンプルの取り違えや、コンタミネーションが生じる恐れがあり、最善の方法とはいえない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】特開２００５−２４５２７２号公報

【特許文献2】特表２００８−５３１０３９号公報

【特許文献3】特開２００６−１８７２７０号公報

【特許文献4】特開２００６−３２２７３９号公報

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３５：ｅ３ （２００７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

上述のように、生体試料、臨床試料、食品などの被検試料に含まれる遺伝子の増幅、もしくは、生体試料、臨床試料、食品などの被検試料に特定遺伝子が含まれるかを特異的に検出できる特定遺伝子の検出において、様々な問題が未だ解決されていない。

【0016】

また、試料中の微量の核酸を増幅するためにはＰＣＲ法が広く普及している。しかしながら、ＰＣＲ法では試料中に含まれる夾雑物により遺伝子の増幅反応を阻害してしまう場合があるため、上述のように増幅反応の前に分離、精製などの煩雑な前処理を行なう必要がある。特に、ＲＮＡを増幅させる場合、試料中のＲＮＡの精製を行なっても、夾雑物の完全な除去は困難であり、かつ試料中のＲＮＡの回収量が一定しない場合も多く、このため引き続くＲＮＡ増幅が、とりわけ試料中の目的とするＲＮＡの含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、ＲＮＡの精製は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。さらに、ＲＮＡは全ての生体試料中に普遍的に存在するＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）による分解の危険性に常に曝されており、精製の際に迅速なＲＮａｓｅ不活性化の処理を行なうべきことはもちろんのこと、精製過程においても、精製後においても、ＲＮａｓｅが混入しないような厳重な操作や管理が要求される。

【0017】

したがって、本発明の目的は、生体試料、臨床試料、食品などの被検試料に含まれる核酸の分離および精製などの前処理を必要とせず、被検試料に含まれる遺伝子を増幅することができる方法、または、被検試料に含まれる特定遺伝子を高感度に検出できる方法を提供することである。

【0018】

また本発明は特定遺伝子がＲＮＡである場合、核酸合成に対する阻害物質の作用を抑制して、被検試料中のＲＮＡを効率よく増幅させ得る特定遺伝子の検出方法を提供することもその目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明は、被検試料に含まれる遺伝子を増幅する方法であって、被検試料を担持した水解性担体を、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含む反応液に接触させることを特徴とする方法に関する。

【0020】

また本発明は、被検試料に含まれる特定遺伝子を検出する方法であって、被検試料を担持した水解性担体を、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含む反応液に接触させ、光学的手段を用いて反応液中に特定遺伝子が含まれるか否かを検出することを含むことを特徴とする方法についても提供する。

【0021】

上述したいずれの本発明の方法においても、水解性担体は水解性紙であることが好ましい。

【0022】

上述したいずれの本発明の方法においても、被検試料は、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、精液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を水解性担体上で乾燥させたものであることが好ましい。

【0023】

上述したいずれの本発明の方法においても、被検試料を担持した水解性担体を接触後の前記反応液中で、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる反応を行なうことが好ましい。

【発明の効果】

【0024】

本発明によれば、水解性担体を用いていることにより、被検試料を担持させた水解性担体が反応液と接触することで水解性担体が反応液中で水解する。これによって、効率的で自動化しやすい遺伝子増幅が可能となるとともに、効率的で正確で高い感度での特定遺伝子の検出が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】本発明の方法を模式的に示す図である。

【図2】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂ遺伝子の判定結果を示す図である。

【図3】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２遺伝子の判定結果を示す図である。

【図4】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＶＫＯＲＣ１遺伝子の判定結果を示す図である。

【図5】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の判定結果を示す図である。

【図6】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＲＢ２遺伝子の判定結果を示す図である。

【図7】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＲＢ３遺伝子の判定結果を示す図である。

【図8】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＵＣＰ１遺伝子の判定結果を示す図である。

【図9】Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＣＴＮ３遺伝子の判定結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、被検試料に含まれる遺伝子を増幅する方法、または、被検試料に含まれる特定遺伝子を検出する方法に関する。ここで、図１は、このような本発明の方法を模式的に示す図である。本発明は、遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法のいずれの場合でも、図１に示すように、被検試料１を保持した水解性担体２を、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含む反応液３に接触させる工程を共通して含む。

【0027】

ここで、本発明における大きな特徴である「水解性担体」とは、水と接触することによって分解し、水に溶解または分散する性質を有する担体を指す。なお、水解性であるか否かは、たとえば１０μｌの水（反応液）に、０．０５〜０．１ｍｇの担体を接触させた後、その水（反応液）の６６０ｎｍにおける濁度をＢｉｏ−ＲＡＤ社製のＳｍａｒｔ Ｓｐｅｃ（商標）３０００を用いて測定した場合に０．４以下である場合に水解性を有するものとする。このような水解性担体として、具体的には、６０ＭＤＰ（日本製紙パピリア社製）、３０ＭＤＰ（日本製紙パピリア社製）、１２０ＭＤＰ（日本製紙パピリア社製）、３０ＭＤＰ−Ｓ（日本製紙パピリア社製）、６０ＭＤＰ−Ｓ（日本製紙パピリア社製）などのＭＤＰシリーズの製品、３０ＣＤ−２（日本製紙パピリア社製）、６０ＣＤ−２（日本製紙パピリア社製）、１２０ＣＤ−２（日本製紙パピリア社製）などのＣＤ−２シリーズなどの水解性紙、水解紙（特殊紙商事株式会社製）、アガロースゲルを乾燥し膜状にしたもの、ゼラチン、コラーゲンなどを加熱溶解後乾燥させて膜状にしたものなどが挙げられる。中でも、遺伝子増幅、あるいは、特定の遺伝子検出に用いる反応液中で、反応中に均一に分散し、さらに沈降し、物理的操作や工学的検出に干渉しにくい状態になることから、水解性担体として水解性紙を用いることが好ましい。

【0028】

本発明によれば、このような水解性担体を用いることにより、被験試料を担持させた水解性担体が反応液と接触することで、水解性担体が反応液中で水解する。これによって、従来のように、綿棒などの水解性を有しない担体に保持させた被験試料から、一旦熱処理などによりＤＮＡを抽出し、その後に増幅用反応液に抽出液の一部を移液して増幅反応を実施する場合に比較して、このような独立した抽出工程および増幅反応のための移液などの操作も必要としない。また、従来から、ろ紙上に保持させた血液や唾液などを、ろ紙に保持した状態で遺伝子増幅反応液に投入し、サンプル中の遺伝子を増幅できることも報告されている。この場合独立したＤＮＡの抽出工程や移液操作は省略され得るが、増幅反応時に、ろ紙が反応液中で反応液上部に浮遊した状態になる場合があることから、正確な反応結果を得るためには、たとえば遺伝子増幅反応で汎用される９６穴の反応容器を用いる場合、９６穴全てで、ろ紙が同様に反応液と接触していることを目視などにより確認する必要があった。また、遺伝子増幅が終了した反応液の一部を用いて電気泳動などを行う場合、水解性を有さないろ紙を用いて増幅反応を行った場合、増幅反応終了時にろ紙が、反応液上部に平面上に浮遊することがあるため、反応液のサンプリングに際し物理的な干渉があり、反応液を、遺伝子操作実験などで通常用いられる多連のピペットや自動分注器などを用いて取り扱う際に、操作性、定量性などの面で課題が残されていた。

【0029】

水解性担体を用いることにより、水解性担体が反応液中に溶解、あるいは分散することで吸着面に影響されない遺伝子増幅が可能になっただけでなく、増幅後の反応液の一部を移液する際にも、水解性担体が反応液中に溶解、分散、あるいは沈降することにより、サンプリングに使用したろ紙などに物理的に干渉されることがなくなり、操作性が大きく改善できる。遺伝情報を取り扱う分析・検査においてはＤＮＡの抽出液の取り違えや、移液に伴うコンタミネーションなどの可能性は可能な限り排除する必要があり、本発明によりこの可能性は大幅に低減され、効率的な遺伝子の増幅、効率的かつ正確に高い感度での遺伝子検出が可能となる。

【0030】

このように、水解性担体を用いることによって、本発明の遺伝子増幅方法においては、独立した遺伝子抽出工程の省略、自動分注器たとえばラボオートメーションＢｉｏｍｅｋシリーズ（ベックマンコールター社製）での移液に適した状態の反応液が得られるなど、全体として、効率化とヒューマンエラーなどのミスの可能性の低減、省力化を図ることができるという利点がある。

【0031】

また、水解性担体を用いることによって、生体試料、臨床試料、食品などの被検試料から特定遺伝子を検出する方法においては、水解性担体を水解させた後の反応液に直接光学的手段を用いた検出に供することができるという利点がある。

【0032】

また、ろ紙などの水解性を有しない担体に担持させた被検試料を直接反応液に投入して増幅反応を行なう技術も知られているが、この場合、担体が反応液中に存在することで、本発明のように水解性担体を用いた場合とは異なり、そのまま光学的手段を用いた特定遺伝子の検出に供することができない。反応液を特定遺伝子の検出に供しようとする場合、たとえば反応液から担体を引き上げる、または担体を残して反応液を他に移すことが考えられるが、いずれにしても反応液の量が少なくなってしまい、また、コンタミネーションが起こり易くなってしまうため正確な検出が困難となり、作業効率も下がってしまう。

【0033】

さらに、血液、唾液、汗などの生体より得られた液状物を被検試料とする場合、これを直接反応液に投入して増幅反応を行なう技術も知られているが、被検試料が液状物であるため、採取した直後に反応を行なうのであればともかく、採取から反応の間に期間があいた場合、被検試料の保存安定性が悪いという問題がある。これに対し、本発明では水解性担体に被検試料を担持し、乾燥させるため、保存安定性に優れる、という利点もある。

【0034】

本発明における被検試料としては、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液、血清、血漿、髄液、唾液、尿、汗、乳、精液、口腔ぬぐい液、歯間ぬぐい液、湿性耳垢、膣腔ぬぐい液、食品および細胞組織から選ばれる液状物を水解性担体上で乾燥させたものであることが好ましいが、水解性担体に担持させ得るものであれば、これら液状物に限定されるものではない。たとえば、水解性担体で机などの表面を擦り、机の表面から水解性担体に細菌などを付着させ、これを被検試料として検出に供するようにしてもよい。なお、被検試料が液状物である場合、その水分含有率は、被検試料を担持させた水解性担体の取り扱いができる程度であればよい。

【0035】

ここで、液状物を乾燥させる方法としては、上述した水解性担体に前記液状物をしみこませ、水分を蒸発させる方法や、自然乾燥または凍結乾燥など、公知の乾燥方法を選ぶことができる。ただし、糞便由来の被検試料を得るためには、糞便を水解性担体に塗布し、水解性担体を自然乾燥した後にシリカゲルとともに密閉し１時間以上保持することが好ましい。

【0036】

液状物を水解性担体上で乾燥させて被検試料とすることで、液状物にもともと含まれるプロテアーゼ、アミラーゼおよびヌクレアーゼなどの酵素活性を阻害することができ、生体組織細胞、微生物およびウイルスを完全に死滅させることなく生命活動を休止させることができる。したがって、被検試料の輸送、保存などは室温で行なうことができ、より簡便となる利点がある。

【0037】

本発明においては、上述した中でも、採取され得る細胞の数が一定しており、安定した量の鋳型を遺伝子型判定に供することができ、再現性に優れる観点から、被検試料が血液または唾液を水解性担体上で乾燥させたものであることが好ましい。なお、被検試料が血液を水解性担体上で乾燥させたものである場合、従来の遺伝子型の判定方法と比較すると、血液の採取量が少なくて済むという利点がある。

【0038】

本発明において増幅の対象となる遺伝子または検出の対象となる特定遺伝子は、被検試料の遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）に含まれる生物種に特異的配列またはその遺伝子多型（ＳＮＰ）、微生物のユニバーサル領域、またはウイルス由来遺伝子における特異的配列である。特異的配列は、たとえば生物種ごとに公開されている遺伝子配列データベースを検索することで被検試料ごとに決定することができる。

【0039】

増幅の対象となる遺伝子または検出の対象となる特定遺伝子の長さとしては、通常２０〜数十万塩基程度まで適用できるが、５０〜３０００塩基であることが好ましい。検出対象が微生物である場合には、具体的には、増幅の対象となる遺伝子または検出の対象となる特定遺伝子は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。これは、広汎な微生物に応用して使用することができるためである。また、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を応用して使用してもよい。

【0040】

本発明の方法において、被検試料は、細胞、真菌、細菌およびウイルスから選ばれるＲＮＡを包含する試料を含むものであり、増幅の対象となる遺伝子または検出の対象となる特定遺伝子がＲＮＡであってもよい。この場合、本発明においては、水解性担体に担持させた被検試料を反応液に直接添加してＲＮＡ増幅反応を行なうことにより、当該被検試料中に存在するＲＮＡを直に増幅させることができる。ここで、「直接添加」とは、ＲＮＡ増幅に先立って、このＲＮＡを包含する被検試料からＲＮＡを抽出する過程が不要という意味である。

【0041】

本発明においては、被検試料を担持した水解性担体を接触後の前記反応液中で、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification：ループ介在等温増幅）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＳＤＡ（Reverse Transcription Strand Displacement Amplification：逆転写鎖置換増幅）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification：逆転写ループ介在等温増幅）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification：核酸配列に基づいた増幅）法、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification：転写介在増幅）法、ＲＣＡ（Rolling Cycle Amplification：ローリングサイクル増幅）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：等温遺伝子増幅）法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction：リガーゼ連鎖反応）法、ＬＤＲ（Ligase Detection Reaction：リガーゼ検出反応）法、ＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法、ＳＭＡＰ２（Smart Amplification Process Version 2）法から選ばれる方法を施すことが好ましい。これらの遺伝子増幅方法は、それ自体公知の方法である。

【0042】

本発明に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼに代表される、プライマー付加による核酸を合成する耐熱性に優れたポリメラーゼであれば特に制限なく用いることができる。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、たとえばＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕあるいはＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは上述したＤＮＡポリメラーゼの少なくともいずれかの混合物などを挙げることができ、中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。なお、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよびＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ由来のＣ．ｔｈｅｒｍ ＤＮＡポリメラーゼはＲＴ活性も有しているため、後述するようにＲＴ−ＰＣＲをＯｎｅ ｔｕｂｅ−Ｏｎｅ ｓｔｅｐで行なうときに、１種類の酵素で賄うことができるという特徴を有している。

【0043】

バッファーは被検試料中に含まれるＰＣＲ反応を阻害する物質存在下でもＤＮＡ増幅可能なものであれば、特に制限されないが、ＥｚＷａｙ（商標）（ＫＯＭＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（（株）島津製作所製）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ ｋｉｔバッファー（Ｎｅｗ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）、ＫＯＤ ＦＸバッファー（東洋紡績（株）製）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）などを用いることが好ましく、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用に開発されたＫＯＤ ＦＸバッファー（東洋紡績（株）製）を用いることが特に好ましい。たとえば実施例で用いられたＰＣＲ酵素キットＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績（株）製）には、試料中のＰＣＲ阻害成分の反応阻害を除去する効果を有する、１〜２Ｍのベタインが含まれる。なお、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）には、ベタインが含まれていることが記載されており、ＫＯＤ ＦＸバッファーと同等の効果が期待できる。

【0044】

以下、増幅する対象となる遺伝子または検出する対象となる特定遺伝子がＲＮＡである場合に好適な遺伝子増幅方法として用いられるＲＴ−ＰＣＲ法を行なう場合を例に挙げて、具体的に説明する。

【0045】

逆転写（ＲＴ）反応に用いる反応液（ＲＴ反応液）は、通常、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ₂、ＫＣｌなどの塩類、ジチオスレトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅインヒビター、逆転写酵素を含むものである。また、前記塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。ＲＴ反応液はまた、通常、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク、界面活性剤を含む。

【0046】

本発明において、増幅する対象となる遺伝子または検出する対象となる特定遺伝子がＲＮＡである場合、バッファーとＤＮＡポリメラーゼとを含む反応液が、融解温度調整剤をさらに含むことが、より好ましい。融解温度調整剤は、ＤＮＡポリメラーゼ反応時のプライマーと鋳型ＤＮＡとの融解温度（Ｔｍ）を調整するためのものであり、このような融解温度調整剤としてベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、プロリン、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと省略する）、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩などが一般に利用される。融解温度調整剤を利用することで、オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。さらに、ベタインやトラアルキルアンモニウム塩を融解温度調整剤として用いた場合には、そのｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｚｅ作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。

【0047】

融解温度調整剤としてたとえばベタインを用いる場合、反応液中０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍの範囲内の添加によって、本発明による核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度などのその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を適宜設定することができる。

【0048】

ＲＴ反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写できる酵素を意味する。逆転写酵素としては、Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＲＡＶ）やＡｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）などのトリのレトロウイルス由来の逆転写酵素、Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）などのマウスのレトロウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼあるいはＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ由来のＣ．ｔｈｅｒｍ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0049】

ＲＴ−ＰＣＲはＲＴ反応の産物の一部をＰＣＲ反応液に添加して実行すること（Ｔｗｏ ｔｕｂｅ−Ｔｗｏ ｓｔｅｐ）、ＲＴ反応の産物にＰＣＲ反応液を添加して実行すること（Ｏｎｅ ｔｕｂｅ−Ｔｗｏ ｓｔｅｐ）、あるいは予めＲＴ−ＰＣＲに必要な全ての試薬を準備しておき、ＲＴ反応とＰＣＲを連続して実行すること（Ｏｎｅ ｔｕｂｅ−Ｏｎｅ ｓｔｅｐ）も可能である。

【0050】

ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＴ反応に引き続き行なわれるＰＣＲの反応液は、通常、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ₂、ＫＣｌなどの塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類を含むものである。また、前記塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク、ジメチルスルホキシド、界面活性剤、さらに上述した融解温度調整剤であるジメチルスルホキシド、ベタインなどが添加される場合がある。

【0051】

ＲＴ−ＰＣＲにおいて、添加剤として、たとえば、１ｍＬ中に２．７Ｍ ベタイン、６．７ｍＭ ＤＴＴ、６．７％ ＤＭＳＯ、５５μｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有する溶液を調整し、適宜、濃度調整して添加するようにしてもよい。また、上述した市販品であるＭａｓｔｅｒＡｍｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ（登録商標）（ｗｉｔｈ ｂｅｔａｉｎｅ）（ＭＥ８１２０１、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を添加しても同等の効果を得ることができる。

【0052】

本発明における反応液に用いられるプライマーは、増幅する対象となる遺伝子または検出する対象となる特定遺伝子を決定した時点で、適宜公知の方法で設計することができる。本発明における反応液に用いられるプライマーは、増幅する対象となる遺伝子または検出する対象となる特定遺伝子を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。

【0053】

本発明における被検試料に含まれる遺伝子の増幅または被検試料に含まれる特定遺伝子の検出は、プレート状またはチューブ状の不溶性担体上で行なうことが好ましい。このような不溶性担体としては、反応液に対して不溶なプラスチック、ガラスなどからなるチューブのほか、９６穴ウェルなどを挙げることができる。なお、チューブ状とは、中空状態のものをいい、底があるＰＣＲチューブや、エッペンドルフチューブのような形状であってもよい。

【0054】

具体的には、まず、プレート状またはチューブ状の不溶性担体に反応液を投入する。チューブ状の不溶性担体である場合には、その内部にバッファー、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含有する反応液を投入し、プレート状の不溶性担体である場合には、その表面に前記反応液を置く。そして前記反応液と被検試料および水解性担体が直接接触するように配置し、上述したＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＲＴ−ＳＤＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＲＣＡ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＬＤＲ法、ＳＭＡＰ法、ＳＭＡＰ２法から選ばれる方法を施す。なお、不溶性担体上に被検試料を担持した水解性担体を置き、その後に不溶性担体上に前記反応液を置いてもよい。図１には、チューブ状の不溶性担体の内部にバッファー、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含有する反応液３を投入し、さらに、不溶性担体に被検試料１を担持した水解性担体２を投入することで、被検試料１を反応液３と接触させた後、チューブ状の不溶性担体に蓋をして、遺伝子の増幅または特定遺伝子の検出を行なう例が示されている。なお、水解性担体２は、前記反応液３と接触することで分解し、前記反応液３に溶解または分散する。

【0055】

本発明において、ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理にのっとった特異的な増幅が起こる限り特に制限されず、適宜設定することができる。

【0056】

本発明の特定遺伝子の検出方法は、上述した被検試料を担持した水解性担体を、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含む反応液に接触させることに加え、光学的手段を用いて反応液中に特定遺伝子が含まれるか否かを検出することも含む。特定遺伝子の検出には、たとえばリアルタイムＰＣＲ法を利用することができ、その際に用いる光学的手段としては当分野において通常用いられるＴａｑ−Ｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）などを好適に用いることができる。

【0057】

リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。したがって、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲの特定遺伝子に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。

【0058】

なお、本発明の遺伝子の増幅方法で被検試料から増幅された遺伝子は、検出または定量に供されても勿論よく、この手段としては、ＤＮＡシーケンス法、ゲル電気泳動法、平板状のＤＮＡチップまたはビーズによるハイブリダイゼーション、プローブＤＮＡを利用した伸張反応またはハイブリダイゼーションによる遺伝子検出法などを挙げることができ、また、光学的手段を用いた検出に供しても勿論よい。

【0059】

本発明の遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法を用いることによって、ヒトの３０億塩基対あるゲノム遺伝子配列上の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することが可能であり、ＳＮＰタイピングによる遺伝子型の判定から遺伝的背景を調べることができる他、原因遺伝子のわかっている遺伝病については、将来的な危険率も診断することができる。たとえば、アルコール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２）およびアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２）をＳＮＰタイピングすることにより、アルコールに対する強さなどの遺伝的な要因を調べることができる。

【0060】

また、遺伝子型を判定する対象となる遺伝子の好適な例として、たとえば薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子を挙げることもできる。ここで、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９（Cytochtome P450, Family 2, Subfamily C, Polypeptide 9）は、下記式

【0061】

【化1】

【0062】

で表わされる化学構造を有するワルファリンを、投与された患者の体内において、下記式

【0063】

【化2】

【0064】

で表わされる、効能が消失した化学構造に代謝する働きを有する酵素である。ここで、日本人の約９６％は、このＣＹＰ２Ｃ９は正常な活性を有するが、約４％はこのＣＹＰ２Ｃ９の活性が低く、約１％に至っては酵素活性が１／１０に満たない。このＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子としては、たとえば、正常な酵素活性を有する遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９ ＊１と、約１／１０に低下した酵素活性を有する遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９ ＊３とが知られている。すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９が正常な活性を有する約９６％の日本人は対立遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９ ＊１／＊１を有し、ＣＹＰ２Ｃ９の活性が低い約４％の日本人は対立遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９ ＊１／＊３を有し、酵素活性が１／１０に満たない約１％の日本人は対立遺伝子ＣＹＰ２Ｃ９ ＊３／＊３を有することとなる。

【0065】

また、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１（Vitamin K Epoxide Reductase Complex Subunit 1）は、血液凝固に関連する酵素である。ここで、下記式

【0066】

【化3】

【0067】

で表わされる化学構造を有するビタミンＫは、下記式

【0068】

【化4】

【0069】

で表わされる化学構造を有する還元型ビタミンＫとなり、この還元型ビタミンＫが血液凝固因子に作用して、血液凝固因子が活性化される。血液凝固因子に作用した後の還元型ビタミンＫは、下記式

【0070】

【化5】

【0071】

で表わされるビタミンＫエポキシドとなり、これにＶＫＯＲＣ１が作用することで、ビタミンＫエポキシドが還元されてビタミンＫとなる。ワルファリンは、このようなビタミンＫサイクルにおける律速酵素であるＶＫＯＲＣ１の作用を阻害することで、ビタミンＫエポキシドからのビタミンＫの形成を妨げ、抗血液凝固作用を発揮する。このＶＫＯＲＣ１も、個人によって代謝が異なる。このＶＫＯＲＣ１遺伝子として、たとえば、遺伝子ＶＫＯＲＣ１ Ａ／Ａと、ワルファリンの維持用量が高い傾向にある遺伝子ＶＫＯＲＣ１ Ｇ／Ａとが知られている。

【0072】

また、遺伝子型を判定する対象となる遺伝子の好適なその他の例として、たとえば、β２アドレナリンレセプター（ＡＤＲＢ２：Adrenergic, beta-2, receptor, surface）遺伝子、β３アドレナリンレセプター（ＡＤＲＢ３：Adrenergic, beta-3, receptor, surface）遺伝子、脱共役たんぱく質１（ＵＣＰ１：Uncoupling Protein 1）遺伝子なども挙げられる。これらの遺伝子にもそれぞれ遺伝子多型が存在し、遺伝子型によって基礎代謝（安静時消費カロリー）が異なることが知られている。ここで、ＡＤＲＢ２は、主に心臓、気管支平滑筋、前立腺などに分布し、脂肪組織にも存在して脂肪分解にも関与する。ＡＤＲＢ３は、主に脂肪組織で見られ、脂肪分解と熱産生の調節に関与する。また、ＵＣＰ１は、褐色脂肪細胞に特異的に発現し、寒冷時や食事後の熱産生に関与する。

【0073】

さらに、速筋線維にのみ発現するタンパク質であって、その遺伝子型の違いが瞬発力、持久力を要する運動のいずれに適性を有する可能性があるかを判断する手がかりとなるいわゆる「スポーツ遺伝子」と注目されているＡＴＣＮ３（Alpha-Actinin-3）の遺伝子を遺伝子型の判定対象としてもよいし、遺伝子型の違いが耳垢の種類に現れることが知られているＡＢＣＣ１１（ATP-binding cassette transporter sub-family C member 11）の遺伝子、遺伝子型の違いが顔面形態の個人差、集団差に関与することが知られているＥＤＡＲ（Ectodysplasin A Receptor）の遺伝子を遺伝子型の判定対象としてもよい。

【0074】

また、本発明の遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法は、上述の人の体質を診断する一塩基多型（ＳＮＰ）以外に、血液・糞便など液状物の被検試料中の細菌・ウイルスなどの微生物検査などにも応用することができる。

【実施例】

【0075】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0076】

＜実施例１＞
以下の手順で、検査対象（被検者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）からそれぞれ採取した唾液（口腔内細胞を含む）について、アルコール脱水素酵素ＡＤＨ１Ｂの遺伝子およびアルデヒド脱水素酵素ＡＬＤＨ２の遺伝子の遺伝子多型の検出をリアルタイムＰＣＲ装置ＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）法により行なった。

【0077】

水解性担体として６０ＭＤＰ（日本製紙パピリア社製）を用い、これに被検試料である唾液を染み込ませ、自然乾燥させた。チューブ状の不溶性担体に、反応液（各組成については後述）を投入し、これに被検試料を担持させた乾燥後の水解性担体の直径１．２ｍｍのパンチ片を直接投入した。通常行なうＤＮＡの抽出・精製工程は省略し、直接増幅反応を行なった。

【0078】

ＴａｑＭａｎ法による遺伝子判定には、プローブおよびプライマーセットはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓキット、ＰＣＲ増幅はＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用して、それぞれ以下の試薬を含む１０μＬ反応液を調整した。遺伝子型判定は、本反応の結果、添付のプロトコールに従って、検出される２色の蛍光強度により判定した。

【0079】

（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ： ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １Ｂ（ｃｌａｓｓ Ｉ）， ｂｅｔａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ： Ｃ＿２６８８４６７＿２０。

【0080】

（ＡＤＨ１Ｂ遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：５μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿２６８８４６７＿２０：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：３．５μｌ。

【0081】

（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ：ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２ ｆａｍｉｌｙ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ：Ｃ＿１１７０３８９２＿１０。

【0082】

（ＡＬＤＨ２遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：５μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿１１７０３８９２＿１０：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：３．５μｌ。

【0083】

（増幅条件）
熱変性：５０℃、２分→９５℃、１０分、
９５℃、１５秒→６０℃、１分を４０サイクル。

【0084】

サンプルは以下のとおりであった。

【0085】

【表1】

【0086】

図２は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＨ１Ｂ遺伝子の判定結果を示す図であり、図３は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＬＤＨ２遺伝子の判定結果を示す図である。

【0087】

＜実施例２＞
３９人の被検者を検査対象とし、以下の試薬を含む反応液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ビタミンＫエポキシド還元酵素ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の遺伝子型を判定した。

【0088】

（ＶＫＯＲＣ１遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ：ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ， ｓｕｂｕｎｉｔ １； ｐｏｌｙｓｅｒａｓｅ ３、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ： Ｃ＿３０４０３２６１＿２０。

【0089】

（ＶＫＯＲＣ１遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：５μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿３０４０３２６１＿２０：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：３．５μｌ。

【0090】

図４は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＶＫＯＲＣ１遺伝子の判定結果を示す図である。

【0091】

＜実施例３＞
７人の被検者を検査対象とし、以下の試薬を含む反応液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子の遺伝子型を判定した。

【0092】

（ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ：ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０， ｆａｍｉｌｙ ２， ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ， ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ９、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ：Ｃ＿２７１０４８９２＿１０。

【0093】

（ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：５μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿２７１０４８９２＿１０：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：３．５μｌ。

【0094】

図５は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の判定結果を示す図である。

【0095】

＜実施例４＞
７人の被検者を検査対象とし、以下の試薬を含む反応液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、β２アドレナリンレセプター（ＡＤＲＢ２）の遺伝子の遺伝子型を判定した。

【0096】

（ＡＤＲＢ２遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ：ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ， ｂｅｔａ−２−， ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ｓｕｒｆａｃｅ、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ：Ｃ＿２０８４７６５＿２０。

【0097】

（ＡＤＲＢ２遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：５μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿２０８４７６５＿２０：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：３．５μｌ。

【0098】

図６は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＲＢ２遺伝子の判定結果を示す図である。

【0099】

＜実施例５＞
７人の被検者を検査対象とし、以下の試薬を含む反応液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、β３アドレナリンレセプター（ＡＤＲＢ３）の遺伝子の遺伝子型を判定した。

【0100】

（ＡＤＲＢ３遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ：ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ， ｂｅｔａ−３−， ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ｓｕｒｆａｃｅ、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ：Ｃ＿２２１５５４９＿２０。

【0101】

（ＡＤＲＢ３遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：５μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿２２１５５４９＿２０：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：３．５μｌ。

【0102】

図７は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＤＲＢ３遺伝子の判定結果を示す図である。

【0103】

＜実施例６＞
３人の被検者を検査対象とし、以下の試薬を含む反応液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、脱共役たんぱく質１（ＵＣＰ１）の遺伝子の遺伝子型を判定した。

【0104】

（ＵＣＰ１遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ：Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ：Ｃ＿８８６６３６８＿２０。

【0105】

（ＵＣＰ１遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：５μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿８８６６３６８＿２０：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：３．５μｌ。

【0106】

図８は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＵＣＰ１遺伝子の判定結果を示す図である。

【0107】

＜実施例７＞
３人の被検者を検査対象とし、以下の試薬を含む反応液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＡＣＴＮ３遺伝子の遺伝子型を判定した。

【0108】

（ＡＣＴＮ３遺伝子用ＴａｑＭａｎプローブ・プライマーセット）
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
・Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ：Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｆ， Ａｃｔｉｎｉｎ Ａｌｐｈａ ３、
・ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ ＩＤ：Ｃ＿５９００９３＿１。

【0109】

（ＡＣＴＮ３遺伝子用ＴａｑＭａｎ反応液）
・Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：１０μｌ、
・Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ Ｃ＿５９００９３＿１：０．５μｌ、
・ＫＯＤ ＦＸ Ｂｕｆｆｅｒ：２μｌ、
・ＤＷ（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）：７．５μｌ。

【0110】

図９は、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）製）を使用したＴａｑＭａｎ法によるＡＣＴＮ３遺伝子の判定結果を示す図である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】