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特許5876477増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼ

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5876477

(24)【登録日】2016年1月29日

(45)【発行日】2016年3月2日

(54)【発明の名称】増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼ

(51)【国際特許分類】

C12N 9/12 20060101AFI20160218BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20160218BHJP

C12Q 1/68 20060101ALI20160218BHJP

【ＦＩ】

C12N9/12

C12N15/00 AZNA

C12Q1/68 A

【請求項の数】8

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2013-514593(P2013-514593)

(86)(22)【出願日】2011年6月17日

(65)【公表番号】特表2013-534817(P2013-534817A)

(43)【公表日】2013年9月9日

(86)【国際出願番号】EP2011002999

(87)【国際公開番号】WO2011157434

(87)【国際公開日】20111222

【審査請求日】2014年6月16日

(31)【優先権主張番号】61/356,280

(32)【優先日】2010年6月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラロシュアーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡＲＯＣＨＥＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島勝

(74)【代理人】

【識別番号】100166028

【弁理士】

【氏名又は名称】北谷賢次

(72)【発明者】

【氏名】フレッドレイチャート

(72)【発明者】

【氏名】キースバウアー

(72)【発明者】

【氏名】トーマスダブリュ．マイアーズ

【審査官】松田芳子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００８／０４６６１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００１／００１２６１３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００７−５２０２２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３−５１００１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Biol. Chem.，２０００年，Vol.275, No.42，p.32728-35

【文献】 Nucleic Acids Res.，２００１年，vol.29, no.20，p.4206-14

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ
対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増大した３’末端ミスマッチ識別活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、以下の：
Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｐ：
［ここで、
Ｘ₂は、Ｓ又はＮであり；
Ｘ₃は、Ｃ又はＮであり；そして
Ｘ₄は、Ｖ又はＩである］（配列番号１１）
を含むポリメラーゼドメインのモチーフを含み、ここで配列番号１の５８０番目のアミノ酸がＧであり、そして当該対照ＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸Ｘ₃がＹであることを除き、当該ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項2】

配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項3】

前記ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸。

【請求項5】

プライマー伸長を行うための方法であって：
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼとプライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸とを、当該プライマーの伸長に適切な条件下で接触させ、伸長プライマーを生成することを含んでなる、方法。

【請求項6】

伸長プライマーを生成するキットであって：
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む少なくとも１つの容器を含んでなる、キット。

【請求項7】

（ａ）プライマー伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なプライマーを提供する容器；
（ｂ）ヌクレオシド三リン酸を提供する容器；
（ｃ）プライマー伸長に適切な緩衝液を提供する容器
からなる群から選択される１つ以上の追加の容器をさらに含んでなる、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも一つのプライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸を含んでなる反応混合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼ、ならびに核酸ポリヌクレオチドの伸長及び増幅を含む様々な用途におけるこれらの使用を提供する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡポリメラーゼはゲノムの複製や保持という、世代から世代へと遺伝情報を正確に伝達するための中心的な役割を担っている。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの合成を担う酵素として細胞内で機能しており、複製される鋳型ＤＮＡ又は鋳型ポリヌクレオチドに必要なオーダーのＭｇ²⁺のような金属活性化因子の存在下、デオキシリボヌクレオシド３リン酸を重合付加している。In vivoにおいて、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、組換え及び遺伝子増幅を含む一連のＤＮＡ合成過程に関与している。それぞれのＤＮＡ合成過程の間に、鋳型ＤＮＡは一度又は多くとも数回複製され、同一の複製物を生成する。これに対しin vitroでは、例えばポリメラーゼ連鎖反応の際のように、ＤＮＡ複製は何回も繰り返すことができる（例えば、米国特許第４,６８３,２０２号参照）。

【0003】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の初期の研究では、各サイクルのＤＮＡ複製開始時にＤＮＡポリメラーゼを加えていた（前述の米国特許第４,６８３,２０２号参照）。その後、高温で生育する細菌から熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが得られ、これらの酵素を一度だけ加えればよくなった（米国特許第４,８８９,８１８号及び米国特許第４,９６５,１８８号参照）。ＰＣＲ中に使用する高温下で、これらの酵素は不可逆的に不活性化されない。その結果、合成付加過程の開始時ごとに新しい酵素を加えることなく、ポリメラーゼ連鎖反応の反復的サイクルを行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性ポリメラーゼは、ＤＮＡ組換え研究や疾病の医療診断における数多くの技術にとって重要である。特に診断に用いられる場合、標的核酸配列は問題となるＤＮＡ又はＲＮＡのごく一部のみとなり得るため、増幅しないで標的核酸配列の存在を検出するのは難しい可能性がある。

【0004】

ＤＮＡポリメラーゼの折りたたみパターン全体はヒトの右手に似ており、パーム（手のひら）、フィンガー（指）、サム（親指）の３つの異なるサブドメインを含む(Beese et al., Science 260:352-355, 1993); Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995参照)。フィンガー及びサム・サブドメインの構造は、サイズ及び細胞内での機能が異なるポリメラーゼ間で大きく異なる一方、触媒作用を持つパーム・サブドメインは全て重ね合わせることができる。例えば、取り込むｄＮＴＰと相互作用して化学触媒作用中に遷移状態を安定化させるモチーフＡは、哺乳類のｐｏｌα及び原核生物のｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼファミリーの中で、約１Åの平均偏差で重ね合わせることができる（Wang et al., Cell 89: 1087-1099, 1997）。モチーフＡは構造的に、主に疎水性残基を含む逆平行β−ストランドで始まり、α−ヘリックスへと続く。ＤＮＡポリメラーゼ活性部位の一次アミノ酸配列は、非常によく保存されている。モチーフＡの場合、例えば、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲ（配列番号２８）は、例えばサーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及び大腸菌（Escherichia coli）を含む、何百万年もの間の進化により分化した生物のポリメラーゼの中に保持されている。

【0005】

よく保存されていることに加え、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位は比較的変異しやすく、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有意に低下させることなく特定のアミノ酸置換を有することができることも示されている（例えば、米国特許第６,６０２,６９５号参照）。このような変異ＤＮＡポリメラーゼは、例えば核酸合成反応を含んでなる診断及び研究用途において種々の選択的優位性を提供することができる。このように、変異しやすいアミノ酸位置を同定し、ポリメラーゼ活性を改良することが当業界で求められている。本発明は、本明細書に記載されるとおり、これらや他の必要性を満たす。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第４,６８３,２０２号

【特許文献2】米国特許第４,８８９,８１８号

【特許文献3】米国特許第４,９６５,１８８号

【特許文献4】米国特許第６,６０２,６９５号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Beese et al., Science 260:352-355, 1993

【非特許文献2】Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995

【非特許文献3】Wang et al., Cell 89: 1087-1099, 1997

【発明の概要】

【0008】

本発明は、対応する非改変対照ポリメラーゼと比較して増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼ、及びこのようなＤＮＡポリメラーゼを生成、使用する方法を提供する。態様によっては、当該ポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは熱活性(thermoactive)ＤＮＡポリメラーゼである。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはサーマス（Thermus）種に由来する。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはサーモトガ（Thermotoga）種に由来する。態様によっては、配列番号１の５４７番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＹ以外の任意のアミノ酸であり、そして、対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の５４７番目に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＹであることを除いては、前記ＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列を有する。例えば、態様によっては、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨから選択される。態様によっては、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸は、非極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、Ｆ、Ｃ、Ｖ又はＩ）又は極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、又はＴ）である。態様によっては、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸はＣ又はＮである。態様によっては、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸はＣである。態様によっては、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸はＮである。

【0009】

態様によっては、増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼは、
Ｋ−Ｌ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｘ₈：
［ここで、
Ｘ₁は、Ｋ、Ｒ又はＱであり；
Ｘ₂は、Ｎ、Ｓ又はＧであり；
Ｘ₃は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ₄は、Ｖ、Ｉ又はＬであり；
Ｘ₅は、Ｄ又はＥであり；
Ｘ₆は、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｓ又はＧであり；
Ｘ₇は、Ｌ又はＩであり；
Ｘ₈は、Ｐ又はＬである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる（配列番号８）。

【0010】

態様によっては、Ｘ₃は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｉ又はＨから選択される（配列番号４２）。

【0011】

態様によっては、増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼは、
Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｄ−Ｘ₆−Ｌ−Ｐ：
［ここで、
Ｘ₂は、Ｎ又はＳであり；
Ｘ₃は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ₄は、Ｖ又はＩであり；そして
Ｘ₆は、Ｐ又はＡである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる（配列番号９）。

【0012】

態様によっては、増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼは、
Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｐ：
［ここで、
Ｘ₂は、Ｎ又はＳであり；
Ｘ₃は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり；そして
Ｘ₄は、Ｖ又はＩである（配列番号１０）］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる。

【0013】

態様によっては、Ｘ₃は、非極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸（すなわち、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ又はＶ）又は極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸（Ｙ以外、すなわち、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、又はＴ）である。

【0014】

態様によっては、Ｘ₃はＣ又はＮである（配列番号１１）。

【0015】

態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＤ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＧである。

【0016】

様々なＤＮＡポリメラーゼが本発明による変異に従う。特に適切なものは、様々な種の好熱性細菌由来の野生型又は天然型の熱安定性ポリメラーゼを含む熱安定性ポリメラーゼ、ならびに、アミノ酸置換、挿入もしくは欠失、又は他の改変により、そのような野生型又は天然型の酵素から得た合成熱安定性ポリメラーゼである。非改変型ポリメラーゼの例としては、例えば、ＣＳ５（配列番号２９）、ＣＳ６（配列番号３０）もしくはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、又はこれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。他の非改変ポリメラーゼとしては、例えば、以下の好熱性細菌の種のいずれかに由来するＤＮＡポリメラーゼ（又は、そのようなポリメラーゼと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる：サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（配列番号３８）；サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（配列番号２）；サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（配列番号６）；サーマス・フラバス（Thermus flavus）（配列番号４）；サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）（配列番号３）；サーマス種Ｓｐｓ１７（Thermus sp. Sps17）（配列番号５）；サーマス種Ｚ０５（Thermus sp. Z05）（配列番号１）；サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neopolitana）（配列番号３９）；サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）（配列番号３７）；サーマス・カルドフィラス（Thermus caldophilus）（配列番号７）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）（配列番号３６）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（配列番号４０）又はバチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）（配列番号４１）。適切なポリメラーゼとしてはまた、逆転写酵素（reverse transcriptase）（ＲＴ）活性及び／又は、リボヌクレオチド若しくは他の２’改変ヌクレオチドのような特殊なヌクレオチドを取り込む能力、を有するものも挙げられる。

【0017】

効率的な３’末端ミスマッチ識別活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、特にＰＣＲを行うのに適切である一方、熱活性であるが、熱安定性ではないＤＮＡポリメラーゼであって、３’末端ミスマッチ識別活性を有するＤＮＡポリメラーゼもまた本発明による変異に従う。

【0018】

態様によっては、上記ＤＮＡポリメラーゼはサーマスＤＮＡポリメラーゼである。例えば、態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、
（ａ）サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）（配列番号１）；
（ｂ）サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（配列番号２）；
（ｃ）サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）（配列番号３）；
（ｄ）サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）（配列番号４）；
（ｅ）サーマス種Ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）（配列番号５）；
（ｆ）サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）（配列番号６）；及び
（ｇ）サーマス・カルドフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）（配列番号７）からなる群から選択されるポリメラーゼと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。

【0019】

態様によっては、上記ＤＮＡポリメラーゼはサーモトガＤＮＡポリメラーゼである。例えば、態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、
（ａ）サーモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）（配列番号３８）；
（ｂ）サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）（配列番号３９）；からなる群から選択されるポリメラーゼと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。

【0020】

特定の態様においては、上記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、５４７番目のアミノ酸が、Ｙ以外の任意のアミノ酸であることを除いては、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、配列番号１）である。例えば、態様によっては、５４７番目のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨから選択される。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５４７番目のアミノ酸は、Ｙ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５４７番目のアミノ酸はＣ又はＮである。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、５８０番目にさらに置換を含んでなるＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０番目のアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０番目のアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０番目のアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０番目のアミノ酸はＧである。

【0021】

変異又は改良ポリメラーゼは置換によらない他の改変を含むこともできる。そのような改変の一つは、酵素を不活性化する熱可逆的な共有結合修飾であり、通常ポリヌクレオチド伸長に用いられる温度などの高温でインキュベートすると、逆に酵素を活性化する。そのような熱可逆的な修飾のための試薬の例が、米国特許第５,７７３，２５８号及び第５,６７７,１５２号（Birch et al.）に記載されている。

【0022】

態様によっては、３’末端ミスマッチ活性を、配列番号３５の核酸配列（野生型ＢＲＡＦ＝配列番号３４）を有する変異ＢＲＡＦＶ６００Ｒ標的ポリヌクレオチドを用いて、変異配列と完全に一致し、野生型配列と比較して３’末端に一つのＡ：Ｃミスマッチを有するフォワードプライマーの存在下、所定のコピー数の野生型ＢＲＡＦＶ６００標的ポリヌクレオチドと、野生型標的のコピー数以下（例えば、１０,０００以下のコピー）の所定のコピー数の変異ＢＲＡＦＶ６００Ｒ標的ポリヌクレオチドを含む１つ以上の反応混合物において調べた。二つ以上の反応混合物には滴定したコピー数の変異ＢＲＡＦＶ６００Ｒ標的ポリヌクレオチドを入れておくことができる（例えば、１：５滴定(titrations)、１：１０滴定、例えば、数種類の反応混合物において、１０,０００コピー、１０００コピー、１００コピー、１０コピー、１コピー、０コピー）。本発明のポリメラーゼの３’末端ミスマッチ識別活性は、本明細書に記載されるように、事前に選択した時間単位にわたって、参照ポリメラーゼ（例えば、天然又は非改変ポリメラーゼ）の３’末端ミスマッチ識別能と比較することができる。天然又は非改変ポリメラーゼと比較して、３’末端ミスマッチ識別能が増大したポリメラーゼは、変異対立遺伝子と完全に一致するプライマーと接触した際、野生型配列を増幅しないか、又は変異対立遺伝子−特異的プライマー（すなわち、より高いＣｐ値を示す）を用いて野生型配列を増幅するのに、より多くのＰＣＲサイクル数を必要とする。

【0023】

様々な他の面においては、本発明は、本明細書に記載される変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸、前記組換え核酸を含んでなるベクター及び／又は前記ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。特定の態様においては、当該ベクターは発現ベクターである。そのような発現ベクターを含んでなる宿主細胞は、組換え核酸の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養することにより変異又は改良ポリメラーゼを生成するための本発明の方法に有用である。本発明のポリメラーゼは、反応混合物及び／又はキットに含まれていてもよい。組換え核酸、宿主細胞、ベクター、発現ベクター、反応混合物及びキットの態様は、上記及び本明細書に記載される通りである。

【0024】

さらに別の面においては、ポリヌクレオチド伸長を行う方法が提供される。本方法は通常、本明細書に記載される増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するＤＮＡポリメラーゼを、プライマーが伸長するのに適切な条件下で、プライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、伸長プライマーを生成する工程を含む。当該鋳型ポリヌクレオチドには、例えば、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡがなりうる。ヌクレオシド三リン酸は、例えば、リボヌクレオチド及び／又は標識されたヌクレオチドのような特殊なヌクレオチドを含むことができる。さらに、プライマー及び／又は鋳型は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含むことができる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長方法は、変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼを、ポリヌクレオチドの増幅に適切な条件下でプライマー対、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させる工程を含むポリヌクレオチド増幅方法である。ポリヌクレオチド伸長反応には、例えば、ＰＣＲ、等温伸長又はシークエンシング（例えば、４５４シークエンシング反応）がなりうる。

【0025】

態様によっては、プライマー伸長方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法である。

【0026】

本発明はまた、そのようなポリヌクレオチド伸長方法において有用なキットも提供する。通常キットは、本明細書に記載される変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼを提供する、少なくとも１つの容器を含む。特定の態様においては、キットはさらに、1つ以上の追加の試薬を提供する１つ以上の追加の容器を含む。例えば、特定の変形においては、１つ以上の追加の容器は、ヌクレオシド三リン酸；ポリヌクレオチド伸長に適切な緩衝液；及び／又は、ポリヌクレオチド伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なプライマーを提供する。

【0027】

さらに、本発明のポリメラーゼを含んでなる反応混合物が提供される。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１つ以上のポリヌクレオチドプライマー又はプローブ、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、特殊なヌクレオチドを含む）、緩衝液、塩類、標識（例えば、蛍光体）も含むことができる。

【0028】

本発明のさらなる態様が本明細書に記載される。

【0029】

定義
他に断りがない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本質的に本明細書に記載のものと同様の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、例示的な方法と材料のみを記載する。本発明の目的上、以下の用語は下記のとおり定義される。

【0030】

用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。

【0031】

「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中に組み込むことができる任意の単量体単位を指す。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、以下の２０個の天然の又は遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸を含む：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はF）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは「任意のアミノ酸」として定義する。これらの２０の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5^th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステイン及びピロリジンのような追加のアミノ酸もまた、遺伝的にコードされうる（Stadtman (1996) "selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100 and Ibba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolidine, " Curr Biol. 12(13):R464-R466）。「アミノ酸」という用語は、非天然アミノ酸、（例えば修飾された側鎖及び／又は骨格を有する）修飾アミノ酸及びアミノ酸アナログも含む。例えば、Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxy tryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Pes. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Pes. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315,Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural amino Acid Azatyrosine More Efficiently than tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, and Budisa et al. (2001) "Proteins with ｛beta｝-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7): 1281-1292を参照のこと。

【0032】

さらに例示すると、アミノ酸は典型的には、置換又は非置換のアミノ基、置換又は非置換のカルボキシ基、及び１つ以上の側鎖もしくは基、又はそれらの基のいずれかの類似体を含む有機酸である。側鎖の例としては、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン又はこれらの基の任意の組み合わせが挙げられる。他の代表的なアミノ酸としては、限定しないが、光励起性架橋剤を含んでなるアミノ酸、金属結合性アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージされた(photocaged）及び／又は光異性化可能アミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含んでなるアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含んでなるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的開裂可能な、及び／又は光開裂可能なアミノ酸、炭素結合した糖を含むアミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び１つ以上の有毒部位を含んでなるアミノ酸が挙げられる。

【0033】

「アプタマー」という用語は、米国特許第５,６９３,５０２号に記載されているように、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合し、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。

【0034】

「変異」という用語は、本発明のＤＮＡポリメラーゼに関しては、対応する天然又は非改変ＤＮＡポリメラーゼに対して、１つ以上のアミノ酸置換を含んでなるポリペプチド、典型的には組換え体を意味する。

【0035】

「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼに関しては、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼを定義づけるために本明細書で用いられる用語である：「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼを特徴づけるものとして特定された１つ以上のアミノ酸位置を除き、変異ポリメラーゼのアミノ酸配列を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼを指す。したがって、(ａ)その非改変型及び(ｂ)１つ以上の特定のアミノ酸置換という観点から変異ＤＮＡポリメラーゼのことを述べた場合、それは、変異ポリメラーゼが、特定のアミノ酸置換を除き、それ以外では特定のモチーフ中に非改変型と同一のアミノ酸配列を有することを意味する。「非改変ポリメラーゼ」（したがって増大した３’末端ミスマッチ識別能を有する改変型も）は所望の機能性、例えば、ジデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、色素標識ヌクレオチドの取り込みの改良、５’ヌクレアーゼ活性の調節、３’ヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング）活性の調節等を提供するために追加の変異を含んでもよい。したがって、本明細書に記載されるように本発明を実施する際には、ＤＮＡポリメラーゼの非改変型をあらかじめ決定する。ＤＮＡポリメラーゼの非改変型には、例えば、野生型及び／又は天然ＤＮＡポリメラーゼ又は既に意図的に改変されたＤＮＡポリメラーゼがなりうる。ポリメラーゼの非改変型は、好ましくは種々な好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに野生型又は天然型の熱安定性ポリメラーゼと実質的な配列同一性を有するその機能的変異体である。そのような変異体としては、例えば、米国特許第６,２２８,６２８号及び米国特許出願公開第２００４／０００５５９９号に記載されたキメラＤＮＡポリメラーゼのようなキメラＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。特定の態様においては、ポリメラーゼの非改変型は逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する。

【0036】

「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に安定で、耐熱性で、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間の間、高温にさらした際に、続くポリヌクレオチド伸長反応を行うために十分な活性を保持し、不可逆的に変性（不活性化）しない酵素を指す。核酸の変性に必要な加熱条件は、当業界で周知であり、例えば、米国特許第４,６８３,２０２号、第４,６８３,１９５号及び第４,９６５,１８８号に例示されている。本明細書で使用するとおり、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）のような温度サイクル反応での使用に適切である。本明細書での不可逆的変性とは、不変で完全な酵素活性の欠失を指す。熱安定性ポリメラーゼにとって酵素活性とは、鋳型核酸鎖と相補的なポリヌクレオチド伸長産物を生成するのに適切な方法でヌクレオチドの結合を触媒する作用を指す。好熱性細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリティマ、サーマス・アクアティカス、サーマス・サーモフィルス、サーマス・フラバス、サーマス・フィリホルミス、サーマス種Ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５、サーマス・カルドフィラス、バチルス・カルドテナクス、サーモトガ・ネアポリタナ及びサーモシフォ・アフリカヌス由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

【0037】

「熱活性」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＰＣＲ反応における逆転写又はアニーリング／伸長工程で通常用いられる温度（すなわち、４５〜８０℃）で触媒機能を維持する酵素を指す。熱安定性酵素とは、核酸の変性に必要な高温にさらした際に、不可逆的に不活性化又は変性しないものである。熱活性酵素は熱安定性であってもなくてもよい。熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、限定しないが、大腸菌、モロニーマウス白血病ウイルス及びトリ骨髄芽球症ウイルスを含む好熱性種又は中温性種由来のＤＮＡ又はＲＮＡ依存性であってよい。

【0038】

本明細書で使用する場合、「キメラ」タンパク質とは、そのアミノ酸配列が、少なくとも二つの異なるタンパク質由来のアミノ酸配列の部分配列の融合産物であるタンパク質を指す。キメラタンパク質は、典型的には、アミノ酸配列を直接操作することにより生成されるのではなく、むしろキメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。特定の態様においては、例えば、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼの非改変型は、サーマス種ＤＮＡポリメラーゼ由来のアミノ末端（Ｎ末端）領域とＴｍａＤＮＡポリメラーゼ由来のカルボキシ末端（Ｃ末端）領域からなるキメラタンパク質である。Ｎ末端領域は、Ｎ末端（１番目のアミノ酸）から内部アミノ酸までの領域をさす。同様に、Ｃ末端領域は、内部アミノ酸からＣ末端までの領域を指す。

【0039】

ＤＮＡポリメラーゼに関する文脈において、別の配列（例えば領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸位置等）との「対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号によるナンバリングをし、次いで配列同一性の割合を最大にするように配列をアラインメントする方法に基づく。得られた「対応領域」内の全ての位置が同一である必要はないため、対応領域内の一致しない位置が「対応位置」とみなされる場合もある。したがって、本明細書で、特定のＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置」といえば、他のＤＮＡポリメラーゼ、構造的類似体及びファミリーの中で、それらをアラインメントさせたものに基づいた同等の位置を指す。本発明の態様によっては、アミノ酸位置の「対応」を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３６、３７、３８、３９、４０又は４１の１つ以上のモチーフを含んでなるポリメラーゼの領域に対して決定する。ポリメラーゼのポリぺプチド配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７、３６、３７、３８、３９、４０又は４１と異なる場合には（例えば、アミノ酸の変化又はアミノ酸の付加又は欠失により）、本明細書で述べる改良された活性に関与する特定の変異は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３６、３７、３８、３９、４０又は４１のものと同じ位置番号にはないかもしれない。このことは、例えば、表１で示される。

【0040】

本明細書で使用する場合、「組換え体」とは、組換え法により意図的に改変されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列のことを指す。本明細書では、「組換え核酸」という用語は、一般的にはエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、天然には通常ない形で、元々はin vitroで生成された核酸を意味する。したがって、直鎖状の単離された変異ＤＮＡポリメラーゼ核酸、又は通常は結合しないＤＮＡ分子を結合させることによりin vitroで生成した発現ベクターは、どちらも本発明の目的の組換え体とみなす。一旦組換え核酸を生成し、宿主細胞中に再導入すれば、それは非組換え的に、すなわち、in vitroでの操作よりもむしろ宿主細胞のin vivoの細胞機構を使って複製するだろう；しかし、一旦組換えで生成されたそのような核酸は、その後は非組換え的に複製されるが、それでも本発明の目的の組換え体とみなされることが理解される。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を使って、すなわち、上述した組換え核酸の発現を通して、生成されたタンパク質である。

【0041】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結しており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作用可能に連結している。

【0042】

「宿主細胞」という用語は、細胞培養において増殖させる際の単細胞原核生物と真核生物の両方（例えば細菌、酵母及び放線菌類）、そしてより高等の植物又は動物由来の単細胞を指す。

【0043】

「ベクター」という用語は、典型的には二本鎖のＤＮＡ断片を指し、外来ＤＮＡ断片がその中に挿入されていてもよい。又は、ベクターは例えば、プラスミド由来でもよい。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に本来存在しないＤＮＡである異種ＤＮＡとして定義され、それは例えば、ベクター分子を複製し、選択可能又はスクリーニング可能なマーカーをコードするか、又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入れば、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立に又はそれと同時に複製することができ、ベクターとその挿入ＤＮＡの複数のコピーを生成することができる。その上、ベクターは挿入ＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、又は挿入ＤＮＡからＲＮＡの複数のコピーを複製する、必要な因子も含むことができる。発現ベクターの中には、発現したｍＲＮＡの半減期を長くし、かつ／又はｍＲＮＡからのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接した配列因子をさらに含むものもある。このように、挿入ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多数の分子を、迅速に合成することができる。

【0044】

「ヌクレオチド」という用語は、天然のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのモノマーを指すのに加え、本明細書中では、文脈から明らかにそうでないと示されていない限り、ヌクレオチドが用いられている個々の状況（例えば、相補的塩基へのハイブリダイゼーション）に関して機能的に同等である、誘導体及び類似体を含む、関連するその構造的変異体も指すことが理解されるべきある。

【0045】

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー又はその類似体に相当しうるポリマーを指すと本明細書で理解される。これは、ＲＮＡやＤＮＡのようなヌクレオチドのポリマー、ならびに合成型、その修飾（例えば化学的又は生化学的に修飾された）型、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含む）を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体での天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、無電荷結合のようなヌクレオチド間修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸等）が挙げられる。水素結合や他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。核酸の合成型は他の結合（例えばNielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載されるようなペプチド核酸）を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して結合する。核酸には、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーがなりえる。又は核酸はそれらを含むことができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。他に断りがない限り、特定の核酸配列は、明示された任意の配列に加え、相補的配列を含んでなるか、又はコードする。

【0046】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には約６〜約１７５の核酸モノマー単位、より典型的には約８〜約１００の核酸モノマー単位、さらにより典型的には約１０〜約５０の核酸モノマー単位（例えば約１５、約２０、約２５、約３０、約３５又はそれ以上の核酸モノマー単位）を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む多くの要因によって決まる。オリゴヌクレオチドは場合により、限定しないが、既存の又は天然の配列の単離、ＤＮＡ複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローニング及び制限消化、又はNarang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)のホスホトリエステル法；Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)のホスホジエステル法；Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981)のジエチルホスホルアミダイト法；Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)のトリエステル法；自動合成法；もしくは米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの方法による直接化学合成、又は当業者に公知の他の方法を含む任意の適切な方法により調整される。

【0047】

「プライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド伸長が開始する条件下（例えば適切な緩衝液中及び適切な温度又は温度サイクル（例えばポリメラーゼ連鎖反応でのような）で、必要なヌクレオシド三リン酸（コピーされる鋳型により決まる）の存在とポリメラーゼを含んでなる条件下）に置かれた時に、鋳型依存（template−directed）の核酸合成の開始点として作用しうるポリヌクレオチドのことを指す。さらに例示すると、プライマーは様々な他のオリゴヌクレオチド媒介合成方法において、例えばＲＮＡのde novo合成及びin vitro転写関連過程（例えば核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）等）の開始剤として、使用することもできる。プライマーは典型的には一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。プライマーの適切な長さは、プライマーの企図される用途により決まるが、典型的には６〜４０ヌクレオチド、より典型的には１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマーを伸長させるために、鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。特定の態様においては、「プライマー対」という用語は、増幅させる核酸配列の５’末端の相補体とハイブリダイズする５’センスプライマー（「フォワード」と呼ばれる場合もある）と、増幅させる配列の３’末端とハイブリダイズする３’アンチセンスプライマー（「リバース」と呼ばれる場合もある）とを含むプライマーのセットを意味する（例えば、標的配列がＲＮＡとして発現されるか、又はＲＮＡである場合）。プライマーは、必要であれば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手法により検出可能な標識を取り込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、³²Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡアッセイに汎用される）、ビオチン、又はそれに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテン及びタンパク質が挙げられる。

【0048】

「５’ヌクレアーゼプローブ」という用語は、少なくとも１つの発光標識部位を含んでなり、標的核酸の検出をする５’ヌクレアーゼ反応で用いられるオリゴヌクレオチドを指す。態様によっては、例えば、５’ヌクレアーゼプローブは、わずかに１つの発光部位（例えば、蛍光色素等）を含む。特定の態様においては、５’ヌクレアーゼプローブは、選択された条件下でプローブがヘアピン構造を形成することができるような自己相補的領域を含む。さらに例示すると、態様によっては、５’ヌクレアーゼプローブは少なくとも２つの標識部位を含んでなり、２つの標識のうち１つが開裂又はオリゴヌクレオチドから分離した後、発光強度が増す。特定の態様においては５’ヌクレアーゼプローブを、２つの異なる蛍光色素、例えば５’末端レポーター色素及び３’末端クエンチャー色素又は部位で標識する。態様によっては、５’ヌクレアーゼプローブを、末端部位以外の、又は末端位置に加えて１つ以上の部位で標識する。プローブがインタクトな状態であれば、典型的には、レポーター色素からの蛍光発光が少なくとも部分的には消光されるように、２つの蛍光色素分子間でエネルギー転移が起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程で、例えば、鋳型核酸に結合した５’ヌクレアーゼプローブは、例えばＴａｑポリメラーゼ又はこの活性を有する別のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により、レポーター色素の蛍光発光がこれ以上消光されないように開裂する。５’ヌクレアーゼプローブの例は、例えば、米国特許第５,２１０,０１５号；米国特許第５,９９４,０５６号；及び米国特許第６,１７１,７８５号にも記載されている。他の態様においては、５’ヌクレアーゼプローブは、２つ以上の異なるレポーター色素と３’末端クエンチャー色素又は部位で標識してもよい。

【0049】

「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー転移」又は「フェルスター共鳴エネルギー転移」という用語は、少なくとも二つの発色分子、ドナー発色分子及びアクセプター発色分子（クエンチャーと呼ぶ）間のエネルギー転移を指す。ドナーは通常、適切な波長の光放射により励起された時、アクセプターにエネルギーを転移する。アクセプターは通常、異なる波長での光放射の形で転移されたエネルギーを再放出する。アクセプターが「ダーク」クエンチャーの場合、転移されたエネルギーは光以外の形で放出される。特定の蛍光色素分子がドナー又はアクセプターとして作用するか否かは、ＦＲＥＴ対の他の要素の性質による。通常用いられるドナー−アクセプター対としては、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が挙げられる。通常用いられるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。通常用いられるダーククエンチャーとしては、ブラックホールクエンチャー（BlackHole Quencher）（登録商標）（ＢＨＱ）、（Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.）、アイオワブラック（Iowa Black）（登録商標）（Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa）、及びブラックベリー（登録商標）クエンチャー６５０（ＢＢＱ−６５０））（BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.）が挙げられる。

【0050】

核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸又はヌクレオチドについて述べる場合、「従来の」又は「天然の」という用語は、記載されたポリヌクレオチド中に本来存在するもの（すなわち、ＤＮＡの場合にはｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を指す。加えて、シークエンシングのような、in vitroでのＤＮＡ合成反応においては、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが頻繁に用いられ、ｄＡＴＰの代わりに７−デアザ−ｄＡＴＰを用いることができる。それらをまとめて、ｄＮＴＰと呼んでもよい。

【0051】

核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドについて述べる場合、「特殊な」又は「改変された」という用語は、特定のポリヌクレオチド中に本来存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの改変、誘導、類似体を含む。特定の特殊なヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰと比較してリボース糖の２’位で改変されている。したがって、ＲＮＡの場合は天然のヌクレオチドはリボヌクレオチド（すなわちＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、総称してｒＮＴＰ）だが、それらのヌクレオチドは、比較したらｄＮＴＰには存在しない、糖の２’位にヒドロキシル基を有するため、本明細書では、リボヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの基質としては特殊なヌクレオチドである。本明細書では、特殊なヌクレオチドとしては、限定しないが、核酸シークエンシングにターミネーター（terminator）として用いられる化合物が挙げられる。ターミネーター化合物の例としては、限定しないが、２’，３’ジデオキシ構造を有し、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる化合物が挙げられる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰは、まとめてｄｄＮＴＰと呼ばれる。ターミネーター化合物のその他の例としては、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ₄類似体（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７９９１号及び第２００５／００３７３９８号を参照）が挙げられる。他の特殊ヌクレオチドとしては、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［［α]−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−[α]−ボラノ−ｄＮＴＰ、[α]−メチルホスホネートｄＮＴＰ及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）が挙げられる。特殊な塩基は、³²Ｐ，³³Ｐ又は³⁵Ｓのような放射性同位体；蛍光標識；化学発光標識；生物発光標識；ビオチンのようなハプテン標識；又は、ストレプトアビジンもしくはアビジンのような酵素標識により標識してもよい。蛍光標識としては、フルオレセインファミリーの色素のような負に帯電した色素、又はローダミンファミリーの色素のような電荷が中性である色素、又はシアニンファミリーの色素のような正に帯電した色素を挙げることができる。フルオレセインファミリーの色素としては、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ及びＺＯＥが挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テキサスレッド及びＴＡＭＲＡにより標識した様々な色素又はヌクレオチドは、Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA)又はInvitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)より販売されている。シアニンファミリーの色素としてはＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７が挙げられ、それらはGE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)により販売されている。

【0052】

本明細書で使用する場合、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウを通して２つの最適にアラインメントさせた配列を比較することにより求められ、ここで比較ウィンドウ中の配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を調べて一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果を100倍して配列同一性の割合を求めることにより算出する。

【0053】

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「同一性」という用語は、同じである２つ以上の配列又は部分配列のことをいう。比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使ってもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、配列が同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を特定の割合で有する場合（例えば、特定の領域にわたって少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性）、配列は互いに「実質的に同一」である。それらの定義は、試験配列の相補体にも適用する。場合により、同一性は少なくとも長さ約５０ヌクレオチド、又はより典型的には長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチドの領域にわたって存在する。

【0054】

２つ以上のポリペプチド配列に関する文脈においける「類似性」又は「類似性の割合」という用語は、比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使ってもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、保存されたアミノ酸置換により定義されるものと同一か又は類似のアミノ酸残基を特定の割合（例えば、特定領域にわたって６０％の類似性、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の類似性）で有する、２つ以上の配列又は部分配列のことをいう。少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％又は少なくとも５５％が互いに類似している場合、配列は互いに「実質的に類似」している。場合により、この類似性は、少なくとも長さ約５０アミノ酸、より典型的には少なくとも長さ約１００〜５００又は１０００以上のアミノ酸の領域にわたって存在する。

【0055】

配列比較においては、通常１つの配列を参照配列とし、試験配列をその参照配列と比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータが通常用いられるが、代替えパラメータを指定することもできる。そしてプログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する試験配列の配列同一性又は類似性の割合を算出する。

【0056】

「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか一つのセグメントを指すことを含み、ここでは、２つの配列を最適にアラインメントした後で、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較してもよい。比較のための配列のアラインメント方法は当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Watermanのローカルホモロジーアルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482, 1970）、Needleman and Wunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）、Pearson and Lipmanの類似性検索法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）又は手動での配列及び目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)参照）により実施できる。

【0057】

配列同一性及び配列類似性の割合を求めるのに適切なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらはそれぞれ、Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)及びAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から市販されている。このアルゴリズムは、第1に、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた際に、いくつかの正の値の閾値Ｔと一致する又は満たす検索配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列ペア(ＨＳＰ)を同定する。Ｔを、近接(neighbourhood)文字列スコア閾値と呼ぶ（上述のAltschul el al.,)。これらの初期近接文字列のヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための初期検索の種（シード）として機能する。文字列のヒットは、各々の配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加し得る限り両方向に伸長する。ヌクレオチド配列についての累積スコアは、パラメータＭ（一致残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスは、累積スコアを計算するために使用される。各々の方向への文字列のヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最高値から量X減少した時、負のスコアの残基アラインメントの1つ以上の累積によって累積スコアがゼロ又はそれ以下になった時、又はいずれかの配列の末端に達した時に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは、（ヌクレオチド配列の場合）初期値として文字列の長さ（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合は、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として文字列の長さが３、期待値（Ｅ）が１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989参照)アラインメント(Ｂ)が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。

【0058】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の1つの基準は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。Ｐ（Ｎ）は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した最小和確率が約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると見なされる。

【0059】

「ミスマッチ識別能」という用語は、１つ以上のヌクレオチドを核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）に（例えば、共有結合的に）付加することにより鋳型依存的に核酸を伸長する際に、完全に相補的な配列をミスマッチ含有配列から識別する生体触媒（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ等のような酵素）の能力を指す。「３’末端ミスマッチ識別能」という用語は、伸長させる核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）が、核酸がハイブリダイズする鋳型と比較して、その核酸の３’末端にミスマッチを有する場合に、（ほぼ相補的な）ミスマッチ含有配列から完全に相補的な配列を識別する生体触媒の能力を指す。態様によっては、伸長させる核酸は、完全に相補的な配列に対して３’末端にミスマッチを含んでなる。態様によっては、伸長させる核酸は、完全に相補的な配列に対して３’末端から２番目（Ｎ−１）の位置及び／又はＮ−２の位置にミスマッチを含んでなる。

【0060】

「Ｃｐ値」又は「クロッシングポイント」値という用語は、標的核酸の投入量の定量ができる値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法（second−derivative maximum method）（Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction," BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287-293）により求めることができる。二次導関数最大値法において、Ｃｐは二次導関数曲線の第１のピークに相当する。このピークは指数増大期の開始に相当する。二次導関数法により、リアルタイムの蛍光強度曲線の二次導関数値が算出され、１つの値のみが得られる。オリジナルのＣｐ法は、ある区間で定義された強度値の微分可能な近似、例えば、多項式関数によるものに基づく。その後三次導関数を算出する。Ｃｐ値は、三次導関数の最小根である。Ｃｐはまたフィットポイント法（fit point method）を用いて求めることもでき、ここでは、Ｃｐは指数増大範囲における補助線（threshold line）との平行線の交点から求める（Van Luu-The, et al., BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February2005, pp. 287-293）。これらの計算は、当業者なら誰でも容易に行う。

【0061】

「ＰＣＲ効率」という用語は、完全に一致する鋳型プライマーを使用した場合の、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は式：ＰＣＲ効率（％）＝（１０^(-傾き)−１）×１００を用いて、それぞれの条件で算出する。ここで、傾きは、ｙ軸にプロットされたコピー数の対数とｘ軸にプロットされたＣｐを用いた直線回帰により算出した。

【0062】

「多重」という用語は、１セットより多いプライマーを用いた増幅、又は１回の反応における１つより多い多型性部位の増幅を指す。

【図面の簡単な説明】

【0063】

【図1】図１は、様々な細菌種由来の例示的なＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの領域のアミノ酸配列アラインメントを示す：サーマス種Ｚ０５（Ｚ０５）（配列番号１２）、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）（配列番号１３）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｆｉ）（配列番号１４）、サーマス・フラバス（Ｔｆｌ）（配列番号１５）、サーマス種Ｓｐｓ１７（Ｓｐｓ１７）（配列番号１６）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）（配列番号１７）、サーマス・カルドフィラス（Ｔｃａ）（配列番号１８）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）（配列番号１９）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）（配列番号２０）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔａｆ）（配列番号２１）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｒａ）（配列番号２３）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂｓｔ）（配列番号２４）及びバチルス・カルドテナクス（Ｂｃａ）（配列番号２５）。さらに、示したポリぺプチド領域は、アミノ酸モチーフＫ−Ｌ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｘ₈（配列番号２６）を含んでなり、その可変位置は本明細書でさらに定義される。このモチーフは、各ポリメラーゼ配列において太字で強調されている。本発明にしたがって変異を受け入れるアミノ酸位置を、アスタリスク（＊）で示す。

【図2】図２は、以下のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の配列同一性を示す：サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）；サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）；サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）；サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）；サーマス種Ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）；サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）；サーマス・カルドフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）；デイノコッカス・ラディオデュランスＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｒａ）；サーモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）；サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）；サーモシフォ・アフリカヌスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｆ）；バシラス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）；及びバチルス・カルドテナクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）。（Ａ）全ポリメラーゼＩ酵素にわたる配列同一性（Ｚ０５のアミノ酸１〜８３４に対応する）；及び（Ｂ）Ｚ０５のアミノ酸４２０〜８３４に対応するポリメラーゼサブドメインにわたる配列同一性。

【発明を実施するための形態】

【0064】

本発明は、ポリメラーゼドメイン内の１つ以上のアミノ酸が、１つ以上のポリメラーゼ活性又は特性を改良するものとして同定された改良ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、本明細書で述べるアミノ酸の差異を除いては同一なポリメラーゼの非改変型に対して、３’末端ミスマッチ識別活性が増大した活性酵素である（すなわち、本明細書に記載する本発明のポリメラーゼは、プライマーの３’末端で、又は３’末端近傍で鋳型と一致しないプライマーを伸長させる可能性が低い）。前記ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＤＮＡ組換え研究や疾病の医療診断における用途を含む、ポリヌクレオチド伸長又は鋳型ポリヌクレオチドの増幅が関わる様々な用途において有用である。

【0065】

本発明のポリメラーゼ
態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる：
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｔｈｒ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｘ₈（本明細書において、１文字コードで、Ｋ−Ｌ−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｘ₈とも呼ぶ）；
ここで、Ｘ₁は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり；
Ｘ₂は、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｎ（Ｎ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり；
Ｘ₃は、Ｔｙｒ（Ｙ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ₄は、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）又はＬｅｕ（Ｌ）であり；
Ｘ₅は、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）であり；
Ｘ₆は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり；
Ｘ₇は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＩｌｅ（Ｉ）であり；そして
Ｘ₈は、Ｐｒｏ（Ｐ）又はＬｅｕ（Ｌ）である（配列番号８）。

【0066】

態様によっては、Ｘ₃は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｉ又はＨから選択される（配列番号４２）。

【0067】

態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる（サーマス及びサーモトガに対応する）：
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｘ₂−Ｔｈｒ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ａｓｐ−Ｘ₆−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（本明細書において、１文字コードで、Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｄ−Ｘ₆−Ｌ−Ｐとも呼ぶ）；
ここで、Ｘ₂は、Ａｓｎ（Ｎ）又はＳｅｒ（Ｓ）であり；
Ｘ₃は、Ｔｙｒ（Ｙ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ₄は、Ｖａｌ（Ｖ）又はＩｌｅ（Ｉ）であり；
Ｘ₆は、Ｐｒｏ（Ｐ）又はＡｌａ（Ａ）である（配列番号９）。

【0068】

態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる：
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｘ₂−Ｔｈｒ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（本明細書において、１文字コードで、Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｐとも呼ぶ）；
ここで、Ｘ₂は、Ａｓｎ（Ｎ）又はＳｅｒ（Ｓ）であり；
Ｘ₃は、Ｔｙｒ（Ｙ）以外の任意のアミノ酸であり；そして
Ｘ₄は、Ｖａｌ（Ｖ）又はＩｌｅ（Ｉ）である（配列番号１０）。

【0069】

態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる：
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｘ₂−Ｔｈｒ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（本明細書において、１文字コードで、Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｘ₂−Ｔ−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｐとも呼ぶ）；
ここで、Ｘ₂は、Ａｓｎ（Ｎ）又はＳｅｒ（Ｓ）であり；
Ｘ₃は、Ｃｙｓ（Ｃ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり；そして
Ｘ₄は、Ｖａｌ（Ｖ）又はＩｌｅ（Ｉ）である（配列番号１１）。

【0070】

このモチーフは、多くのファミリーＡ型ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、特に好熱性菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの「フィンガー」ドメインの中に存在する。（Li et al., EMBO J. 17:7514-7525, 1998）。例えば、図１は、以下のいくつかの細菌種由来のＤＮＡポリメラーゼ中の、上記モチーフに対応する天然の配列を含んでなるアミノ酸配列アラインメントを示す：大腸菌、バチルス・カルドテナクス、バシラス・ステアロサーモフィラス、デイノコッカス・ラディオデュランス、サーモシフォ・アフリカヌス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーマス・アクアティカス、サーマス・カルドフィラス、サーマス・フィリホルミス、サーマス・フラバス、サーマス種Ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５及びサーマス・サーモフィルス。図示されるように、（Ｘ₃がＹであることを除いて）配列番号８のモチーフがこれらのポリメラーゼの各々に存在しており、ポリメラーゼのこの領域が保存された機能を有することが示唆される。図２は、これらのＤＮＡポリメラーゼの間の配列同一性を示す。

【0071】

したがって、態様によっては、本発明は、配列番号８、９、１０又は１１（例えば、その中で、Ｘ₃は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｉ又はＨから選択される。）を含んでなり、本明細書に記載するように活性及び／又は特性が改良されているポリメラーゼを提供し、ここで、ＤＮＡポリメラーゼは、それ以外は、例えば、上記の好熱性細菌の任意の種由来のポリメラーゼのような野生型又は天然型のＤＮＡポリメラーゼであるか、又はそのような野生型又は天然型のＤＮＡポリメラーゼと実質的に同一である。例えば、態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３６、３７、３８、３９、４０又は４１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。一つの変形においては、ポリメラーゼの非改変型は、サーマス属の種由来である。本発明の態様によっては、非改変ポリメラーゼはサーマス以外の好熱性種、例えば、サーモトガ由来である。非常に多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの全核酸及びアミノ酸配列が入手可能である。サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）（配列番号２）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）（配列番号６）、サーマス種Ｚ０５（配列番号１）、サーマス種Ｓｐｓ１７（配列番号５）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）（配列番号３８）及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔａｆ）（配列番号３７）のポリメラーゼの各配列が、国際公開第９２／０６２００号で公開されている。サーマス・フラバス（配列番号４）由来のＤＮＡポリメラーゼの配列は、Akhmetzjanov and Vakhitov (Nucleic Acids Research 20:5839, 1992) で公開されている。サーマス・カルドフィラス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号７）は、EMBL/GenBank Accession No. U62584で入手できる。サーマス・フィリホルミス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、表１で提供される配列情報とともに、例えば米国特許第４,８８９,８１８号で提供された方法を用いて、ＡＴＣＣ受託番号４２３８０から得ることができる。サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３９）は、GeneSeq Patent Data Base Accession No. R98144及び国際公開第９７／０９４５１号のものである。バチルス・カルドテナクス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号４１）は、例えば、Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993; Swiss-Prot database Accession No. Q04957 and GenBank Accession Nos. D12982 and BAA02361も参照）に記載されている。

【0072】

本明細書に記載されるように改変できるＤＮＡポリメラーゼの非改変型の例はまた、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号；第６,３４６,３７９号；第７,０３０,２２０号；第６,８８１,５５９号；第６,７９４,１７７号；第６,４６８,７７５号；及び米国特許出願公開第２００４０００５５９９号；第２００２００１２９７０；第２００６００７８９２８号；第２００４０１１５６３９号にも記載されている。代表的な全長ポリメラーゼ配列はまた、本配列表でも提供されている。

【0073】

態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなるポリメラーゼドメインを有するのと同時に、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｚ０５の１〜２９１番目に対応する）をも含んでなる。

【0074】

態様によっては、本発明のポリメラーゼはキメラポリメラーゼであり、すなわち、２つ以上の酵素由来のポリぺプチド領域を含んでなる。そのようなキメラＤＮＡポリメラーゼの例は、例えば、米国特許第６,２２８,６２８号に記載されている。特に適切なものは、キメラＣＳファミリーＤＮＡポリメラーゼであり、それにはＣＳ５（配列番号２９）、ＣＳ６（配列番号３０）ポリメラーゼ、及び配列番号２９又は配列番号３０と実質的な配列同一性又は類似性（典型的には少なくとも８０％の配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、最も典型的には少なくとも９５％の配列同一性）を有するその変異体が含まれ、したがって、それらは配列番号８を含むように改変することができる。ＣＳ５及びＣＳ６ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５及びサーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼに由来するキメラ酵素である。それらは、サーマス酵素のＮ末端５’ヌクレアーゼドメインとＴｍａ酵素のＣ末端３’−５’エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインを含んでなる。これらの酵素は効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長することができ、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰならびにフルオレセイン及びシアニン色素ファミリーで標識されたｄＮＴＰを利用することができる。ＣＳ５及びＣＳ６ポリメラーゼは効率的なＭｇ²⁺活性化ＰＣＲ酵素でもある。ＣＳ５及びＣＳ６キメラポリメラーゼは、さらに例えば、米国特許出願公開第２００４／０００５５９９号に記載されている。

【0075】

態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなり、さらに、天然のポリメラーゼと比較して１つ以上の追加のアミノ酸の変化（例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失による）を含んでなる。態様によっては、そのようなポリメラーゼは配列番号８のアミノ酸モチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）を保持し、さらに、以下のように配列番号２７のアミノ酸モチーフ（Ｚ０５（配列番号１）のＤ５８０Ｘ変異に対応する）を含んでなる：
Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘ₇−Ｘ₈−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ；
ここで、Ｘ₇は、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＴｈｒ（Ｔ）であり；
Ｘ₈ は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である（配列番号２７）。

【0076】

配列番号２７により特徴づけられる変異は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１号でより詳細に述べられている。態様によっては、そのような機能的変異ポリメラーゼは、典型的には野生型又は天然型のポリメラーゼ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３９、４０、４１、４２、４３又は４４）と実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも８０％の配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、最も典型的には少なくとも９５％の配列同一性を有するだろう。

【0077】

態様によっては、Ｘ₃の位置のアミノ酸は配列番号８、９、１０又は１１に示されるアミノ酸で置換され、Ｘ₈の位置のアミノ酸は配列番号２７に示されるアミノ酸で置換される。このように、態様によっては、Ｘ₃の位置のアミノ酸は、Ｔｙｒ（Ｙ）以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ₈の位置のアミノ酸は、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、アミノ酸置換には配列番号２７のＸ₈ の位置のロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、及びリジン（Ｋ）が含まれる。特定の態様においては、アミノ酸置換には、互いに独立してＸ₃の位置のシステイン（Ｃ）又はアスパラギン（Ｎ）、及びＸ₈の位置のグリシン（Ｇ）が含まれる。１つ以上の同定された部位での、他の適切なアミノ酸置換は、例えば、公知の部位特異的変異誘発法及びさらに本明細書に記載される、又は当業者に公知の他の分析法によるポリヌクレオチド伸長能の決定を用いて調べることができる。

【0078】

ＤＮＡポリメラーゼの正確な長さは変わるので、Ｘ₃及びＸ₈のそれぞれに対応する正確なアミノ酸位置は、使用する特定のポリメラーゼにより変化しうる。アミノ酸及び核酸配列アラインメントプログラムは容易に入手でき（例えば、上述のもの参照）、本明細書で同定された特定の得られたモチーフが、本発明にしたがった改変のための正確なアミノ酸（及び対応するコドン）を同定するのに役立つ。代表的なキメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及び例示的な好熱性種由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおける、Ｘ₃及びＸ₈のそれぞれに対応する位置を表１に示す。

【0079】

【表1】

【0080】

態様によっては、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼはサーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）由来又はその変異体（例えば、Ｄ５８０Ｇ変異等）である。上述したように、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼにおいては、Ｘ₃の位置は５４７番目のチロシン（Ｙ）に対応し、そしてＸ₈の位置は５８０番目のアスパラギン酸（Ｄ）に対応する。このように本発明の特定の変形において、変異ポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼに対し、Ｙ５４７及びＤ５８０において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。したがって、典型的には、Ｙ５４７の位置のアミノ酸はＹではない。態様によっては、５４７番目のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨから選択される。特定の態様においては、Ｙ５４７の位置のアミノ酸残基はＣ又はＮである。Ｄ５８０の位置のアミノ酸残基は、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択されうる。態様によっては、Ｄ５８０の位置のアミノ酸残基はＧである。

【0081】

態様によっては、Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼは追加のアミノ酸置換を更に含んで成る。例えば、態様によっては、配列番号１の４７５番目のアミノ酸はＥ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の４７５番目のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｒ又はＨから選択される。態様によっては、配列番号１の４７５番目のアミノ酸はＤである。態様によっては、配列番号１の６３２番目のアミノ酸はＲ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の６３２番目のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｅ又はＨから選択される。態様によっては、配列番号１の６３２番目のアミノ酸はＳである。

【0082】

サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体の例としては、アミノ酸置換Ｙ５４７Ｃ又はＹ５４７ＮをＥ４７５Ｄ、Ｒ６３２Ｓ、及び／又はＤ５８０Ｇと一緒に含んでなるものが挙げられる。態様によっては、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換Ｙ５４７Ｃ及びＤ５８０Ｇ；又はＹ５４７Ｎ及びＤ５８０Ｇを含んでなる。態様によっては、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換（ａ）Ｙ５４７Ｃ、Ｅ４７５Ｄ、及びＤ５８０Ｇ；又は（ｂ）Ｙ５４７Ｎ、Ｅ４７５Ｄ、及びＤ５８０Ｇを含んでなる。態様によっては、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換（ａ）Ｙ５４７Ｃ、Ｒ６３２Ｓ、及びＤ５８０Ｇ；又は（ｂ）Ｙ５４７Ｎ、Ｒ６３２Ｓ、及びＤ５８０Ｇを含んでなる。態様によっては、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換（ａ）Ｙ５４７Ｃ、Ｅ４７５Ｄ、及びＲ６３２Ｓ；又は（ｂ）Ｙ５４７Ｎ、Ｅ４７５Ｄ、及びＲ６３２Ｓを含んでなる。態様によっては、変異サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換（ａ）Ｙ５４７Ｃ、Ｅ４７５Ｄ、Ｒ６３２Ｓ、及びＤ５８０Ｇ；又は（ｂ）Ｙ５４７Ｎ、Ｅ４７５Ｄ、Ｒ６３２Ｓ、及びＤ５８０Ｇを含んでなる。

【0083】

態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の５４７番目に対応する位置に、中性ｐＨ（例えば、約ｐＨ７.４）において非極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、Ｆ、Ｃ、Ｖ、又はＩ）又は極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸（Ｙ以外、例えばＮ、Ｑ、Ｈ、Ｓ又はＴ）を含んでなる。態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種由来であり、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸は、中性ｐＨにおいて非極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、Ｐ、Ｆ、Ｃ、Ｖ又はＩ）である。態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼはサーマス種由来であり、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸は、中性ｐＨにおいて極性で非荷電性の側鎖を持つアミノ酸である（Ｙ以外、例えばＮ、Ｑ、Ｈ、Ｓ又はＴ）。態様によっては、非極性で非荷電性の側鎖を持つ、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸はＣである。態様によっては、極性で非荷電性の側鎖を持つ、配列番号１の５４７番目に対応する位置のアミノ酸はＳである。

【0084】

態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、置換によらない他の改変を含むことができる。そのような改変は、例えば当業界では公知の共有結合修飾を含むことができ、ポリヌクレオチド伸長を含んでなる用途に追加の利点を与える。例えば、特定の態様においては、変異ＤＮＡポリメラーゼはさらに、熱可逆的な共有結合修飾を含む。そのような熱可逆的修飾を含んでなるＤＮＡポリメラーゼは、例えば、様々なホットスタートＰＣＲ技術のような、ホットスタートでの使用に特に適切である。本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼに使用できる熱可逆的な修飾用試薬は、例えば、米国特許第５,７７３,２５８号Birch et al.に記載されている。

【0085】

例えば、熱可逆的な共有結合修飾を含んでなる特に適切なポリメラーゼは、アルカリｐＨで、約２５℃未満の温度で行われる、熱安定性酵素と以下の式Ｉ：

【0086】

【化1】

（ここで、Ｒ₁とＲ₂は、水素又は結合していてもよい有機基である）
に示される一般式を有する、又は以下の式ＩＩ：

【0087】

【化2】

（ここで、Ｒ₁とＲ₂は、結合していてもよい有機基であり、水素はシス配置である）
を有する、本質的に上述のBirch et al.に記載されるようなジカルボン酸無水物との混合物の反応により生成される。

【0088】

本発明のＤＮＡポリメラーゼは、対応する非改変ポリメラーゼ（例えば、野生型ポリメラーゼ又は本発明のポリメラーゼの由来となっている対応する変異体）をコードするＤＮＡ配列を、部位特異的変異誘発と一般に呼ばれる技術を用いて変異させることにより生成することができる。ポリメラーゼの非改変型をコードする核酸分子を、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により変異させることができる（例えば、PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) at Chapter 14; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990参照）。

【0089】

非限定的な例として、ポリメラーゼの非改変型をコードするポリヌクレオチドに部位特異的変異を導入するために、クロンテック（Clontech）の部位特異的変異導入キット（Transformer Site-Directed Mutagenesis kit）を用いた２プライマー法を採用してもよい。この方法で標的プラスミドを変性した後、２つのプライマーを同時にそのプラスミドにアニーリングさせる；これらのプラスミドのうちの一方は所望の部位特異的変異を含み、他方は制限部位を削除する、プラスミド中の別の箇所の変異を含む。その後第二鎖合成を行い、これらの二つの変異をしっかりと連結し、得られたプラスミドで大腸菌ｍｕｔＳ株を形質転換する。形質転換した菌からプラスミドＤＮＡを単離し、関連する制限酵素で切断し（これにより変異していないプラスミドを線状化する）、次いで大腸菌を再び形質転換する。この方法を用いれば、サブクローニング又は一本鎖ファージミドの生成を必要とせずに、発現プラスミドに直接変異を生成できる。２つの変異の強固な連結及びそれに続く変異していないプラスミドの線状化により高い変異効率が得られ、最小限のスクリーニングが可能になる。最初の制限部位プライマーを合成すれば、後はこの方法では変異部位当たりたった１つの新規プライマー型の使用が必要なだけである。それぞれの位置の変異体を個別に調製するよりも、定められた部位に所望の変異の全てを同時に導入するために、「設計された縮重」オリゴヌクレオチドプライマーセットを合成することができる。変異誘発された領域を含めてプラスミドＤＮＡの配列を決定し、変異体クローンを同定、選別することにより、形質転換体をスクリーニングすることができる。次いで各変異ＤＮＡを切断し、例えばMutation Detection Enhancement gel(Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ）での電気泳動により分析して、配列中に他の変更が起こらなかったことを確かめる（変異誘発しなかった対照とのバンドシフトの比較による）。又は、全ＤＮＡ領域の配列を決定して、標的領域の外側で追加の変異現象が起こらなかったことを確かめることができる。

【0090】

確認したｐＥＴ（又は他の）過剰発現ベクター内の変異二本鎖は、変異タンパク質の高効率生産と標準プロトコルによる精製用に、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株のような大腸菌を形質転換させるのに使用できる。ＦＡＢ−ＭＳマッピングの方法は、例えば、変異体発現のフィデリティーを迅速に調べるのに使用できる。この技術は、全タンパク質にわたってセグメントを配列決定し、配列割り当てにおいて必要な信頼度を提供する。このタイプのマッピング試験では、タンパク質をプロテアーゼで消化する（このセグメントが特に対象とされるものであり、残りのマップは変異誘発されないタンパク質のマップと同一であるはずなので、改変する特定領域によって選択する。）。切断断片のセットを、例えばマイクロボアＨＰＬＣ（microbore HPLC）（同じく改変する特定領域により、逆相又はイオン交換）により分画して、各画分中に数種のペプチドが入るようにし、そしてそのペプチドの分子量をＦＡＢ−ＭＳのような標準的な方法により調べる。次に、調べた各断片の質量を、推定配列の消化から予測されるペプチドの分子量と比較し、その配列の正確さを迅速に確認する。タンパク質改変にこの変異誘発アプローチが用いられるため、ＭＳデータが推定値と一致するならば、変更されたペプチドの配列決定は必要ないだろう。変化した残基を確認する必要があるなら、ＣＡＤ−ＭＳ／ＭＳを使用して当該混合物のペプチドを配列決定することができる。又は改変の位置によりエドマン分解又はカルボキシペプチダーゼＹ消化用に標的ペプチドを精製することができる。

【0091】

１つより多いアミノ酸が置換された変異ＤＮＡポリメラーゼは、様々な方法で生成することができる。ポリペプチド鎖中で互いに近接した位置にあるアミノ酸の場合、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時にそれらを変異させてもよい。しかし、アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて位置している（例えば、１０アミノ酸を超えて離れている）場合、所望の変化の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを生成するのはより困難である。その代わりに、２つの代替法の１つを使用してもよい。第一の方法では、置換する各アミノ酸のために、個別にオリゴヌクレオチドを生成する。次にそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングさせれば、鋳型から合成されるＤＮＡの第二鎖が、所望のアミノ酸置換の全てをコードすることになる。別の方法では、所望の変異体を生成する２ラウンド以上の変異誘発を行う。第一ラウンドは、１つの変異について記載された通りである：非改変ポリメラーゼをコードするＤＮＡを鋳型として使用し、第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングさせ、次にヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。変異誘発の第二ラウンドでは、変異誘発の第一ラウンドで生成した変異したＤＮＡを鋳型として使用する。このように、この鋳型はすでに１つ以上の変異を含む。次に、追加の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアリーリングすれば、得られたＤＮＡ鎖は、変異誘発の第一及び第二ラウンドの両方からの変異をコードすることとなる。この得られたＤＮＡは変異誘発の第三ラウンド等で鋳型として使用できる。あるいは、Seyfang & Jin（Anal. Biochem. 324:285-291, 2004）の多部位変異誘発法を使用してもよい。

【0092】

したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼのいずれか（例えば、配列番号８、９、１０又は１１のいずれかを含んでなるポリメラーゼ）をコードする組換え核酸もまた提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする本発明の核酸を用いて、様々なベクターを生成することができる。宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンと調節配列を含む任意のベクターを、本発明の実施に用いることができる。一般的に発現ベクターは、変異ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸と作用可能に連結された転写及び翻訳調節核酸領域を含む。「調節配列」という用語は、特定の宿主生物において、作用可能に連結されたコード配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な調節配列としては、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。さらに、ベクターは、転写されたｍＲＮＡの半減期を長くするPositive Rertoregulatory Element(ＰＲＥ)を含んでもよい（Gelfand et al.,米国特許第４，６６６，８４８号参照）。転写及び翻訳調節核酸領域は、ポリメラーゼを発現させるために用いる宿主細胞に一般的に適したものである。様々な宿主細胞のための、非常に多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当業界において公知である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられる。典型的な態様では、調節配列はプロモーターと転写開始及び終結配列とを含む。ベクターは通常、外来ＤＮＡの挿入のための複数の制限部位を含むポリリンカー領域を含む。特定の態様においては、精製及び、所望であれば、続けて行うＦＬＡＧタグ配列の除去を容易にするために「融合フラッグ」、例えば「Ｈｉｓタグ」が用いられる。しかしながら、一般的に、「加熱工程」を使用できる中温性宿主（例えば、大腸菌）から熱活性及び／又は熱安定性タンパク質を精製する際には、それらは不要である。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子及び対象となる変異ポリメラーゼをコードするＤＮＡを含む適切なベクターの生成は、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて行われる。当業界で周知のように（例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、NY、2nd ed. 1989)参照）、単離されたプラスミド、ウイルスベクター及びＤＮＡ断片を切断し、加工し、特定の順序で一緒に連結して所望のベクターを生成する。

【0093】

特定の態様においては、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界で周知であり、使用する宿主細胞により異なる。適切な選択遺伝子としては、例えば、アンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を挙げることができ、こうした耐性遺伝子により、それらのベクターで形質転換された細胞がそれらの抗生物質の存在下で増殖できるようになる。

【0094】

本発明の一つの面においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、単独で又はベクターと共に細胞内に導入される。本明細書で使用する場合、「に導入される」又はその文法的同等語は、核酸がその後の核酸の組み込み、増幅及び／又は発現に適切な方法で細胞内に入ることを意味する。導入の方法は、標的となる細胞の種類により大きく異なる。導入方法の例としては、ＣａＰＯ₄沈澱、リポソーム融合、LIPOFECTIN（登録商標）、エレクトロポレーション、ウイルス感染等が挙げられる。

【0095】

態様によっては、本発明の最初のクローニング工程の宿主として、原核生物が用いられる。それらは、大量のＤＮＡの迅速な生成、部位特異的変異誘発に用いる一本鎖鋳型ＤＮＡの生成、多数の変異体の同時スクリーニング、及び生成された変異体のＤＮＡ配列決定のために特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、大腸菌Ｋ１２株９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１，４４６）、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣＮｏ．２７，３２５）、大腸菌Ｋ１２株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣＮｏ．５３，６０６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１，５３７）及び大腸菌Ｂが挙げられる；しかし、他の多くのＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９のような大腸菌株、及び、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバチルス属、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）又はセラチア・マルセサンス（Serratia marcesans）のような他の腸内細菌、様々なシュードモナス（Pseudomonas）種を含む他の多くの原核生物の種及び属は、どれも宿主として使用することができる。原核宿主細胞又は堅い細胞壁を有する他の宿主細胞は、通常上述のsection 1.82 of Sambrook et al.に記載されている塩化カルシウム法を用いて形質転換される。あるいは、それらの細胞の形質転換にエレクトロポレーションを使用することができる。原核生物の形質転換技術は、例えばDower, in Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol, 204:63, 1991に記載されている。大腸菌の形質転換に通常用いられるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣＩ８、ｐＵＣＩ９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３が挙げられ、それらは全て上述のsections 1.12-1.20 of Sambrook et al.に記載されている。しかし、他の多くの適切なベクターも同様に利用可能である。

【0096】

態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導するか又は引き起こすのに適切な条件下で培養することにより生成する。形質転換された宿主細胞をタンパク質発現に適切な条件下で培養する方法は、当業界で周知である（例えば前述のSambrook et al.参照）。ラムダｐＬプロモーター含有プラスミドベクターからのポリメラーゼの生成に適切な宿主細胞としては、大腸菌株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣＮｏ．５３６０６）（米国特許第５，０７９，３５２号及びLawyer, F.C.et al.,PCR method and Applications 2:275-87, 1993参照）が挙げられる。発現後、ポリメラーゼを回収、単離することができる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの精製方法は、例えば前述のLawyer et al.に記載されている。

【0097】

一旦精製されれば、ＤＮＡポリメラーゼの３’末端ミスマッチ識別能を調べることができる。例えば、態様によっては、３’末端ミスマッチ識別活性は、プライマーと完全に一致する標的配列の増幅を、プライマーの３’末端に一つの塩基のミスマッチを有する標的の増幅と比較することにより求められる。増幅は例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いてリアルタイムで検出できる。２つの標的配列を識別するポリメラーゼの能力は、２つの反応のＣｐを比較することにより推測できる。場合により、各ウェルで第二の標的遺伝子の増幅を同時に行い、対照として第二の光チャンネルで検出することができる。「ΔＣｐ値」は、ミスマッチのある鋳型に関するＣｐ値から一致する標的のＣｐ値を引いた差異を指す（例えば、実施例）。態様によっては、配列番号８のＸ₃の位置に天然のアミノ酸（例えば、Ｙ）を有する、それ以外は同一の対照ポリメラーゼと比較して、本発明の改良ポリメラーゼは、少なくとも１、２、３、４、５又はそれ以上のΔＣｐ値を有する。態様によっては、この決定は実施例に記載する詳細な材料及び条件で行われる。

【0098】

本発明の方法
本発明の改良ＤＮＡポリメラーゼは、この種の酵素活性が必要又は所望である任意の目的に使用してよい。改良ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるように熱活性又は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでありうる。したがって、本発明の一つの面においては、本発明のポリメラーゼを用いたＰＣＲを含むポリヌクレオチド伸長方法が提供される。態様によっては、本発明は、鋳型核酸の増幅が不要な場合、例えば、標的核酸の存在を直ちに検出することが望まれる場合に、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡを伸長するのに有用な熱活性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。態様によっては、本発明は、標的核酸を伸長及び／又は増幅するのが望まれる場合に有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。ポリヌクレオチド伸長に適切な条件は、当業界で公知である（例えば、上述のSambrook et al.参照。Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology （4th ed.,John Wiley ＆ Sons 1999）も参照）。一般に、プライマーを標的核酸にアニーリングし、すなわちハイブリダイズさせて、プライマー−鋳型複合体を形成させる。プライマー−鋳型複合体を適切な環境下で変異ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、プライマーの３’末端に１つ以上のヌクレオチドを付加し、それにより標的核酸に相補的な伸長プライマーを生成する。プライマーとしては、例えば、１つ以上のヌクレオチド類似体を挙げることができる。さらに、ヌクレオシド三リン酸は、従来のヌクレオチド、特殊なヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又は標識されたヌクレオチド）又はその混合物でありうる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長反応は、標的核酸の増幅を含んでなる。ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対を用いた核酸増幅に適切な条件もまた、当業界で公知である（例えば、ＰＣＲ増幅法）。（例えば、上述のSambrook et al.,；上述のAusubel et al.,； PCR Applications： Protocols for Functional Genomics （Innis et al. eds., Academic Press 1999参照））。

【0099】

態様によっては、増大した３’末端ミスマッチ識別能を有する本ポリメラーゼの使用により、例えば、稀な対立遺伝子の検出が可能になる。例えば、特定のポリメラーゼの３’末端ミスマッチ識別能のフィデリティーは、その感度（異なっているが標的配列と関連のある、標的配列ではない配列が大量に存在するなかで、少量の標的配列を正確に検出する能力）を規定する。このように、３’末端ミスマッチ識別能を増大させることにより、稀な対立遺伝子の検出感度が上がる。稀な対立遺伝子の検出は、例えば、生検又は他の稀な遺伝子変化の試料、例えば、多くの正常細胞の中にあるがん対立遺伝子を持つ細胞のスクリーニングの際に有用である。

【0100】

態様によっては、改良ポリメラーゼは、対立遺伝子特異的ＰＣＲ又は一塩基多型（ＳＮＰ）検出に関わるポリヌクレオチド伸長で使用される。ＳＮＰ検出法の例はChen et al., "Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost and throughput" Pharmacogenomics J. 3(2):77-96 (2003); Kwok et al., "Detection of single nucleotide polymorphisms" Curr. Issues Mol. Biol. 5(2):43-60 (April 2003); Shi, "Technologies for individual genotyping: detection of genetic polymorphisms in drug targets and disease genes" Am. J. Pharmacogenomics 2(3): 197-205 (2002); and Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms" Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235-58 (2001)に記載されている。ハイスループットＳＮＰ検出（high−throughput SNP detection）技術の例は、Marnellos, "High-throughput SNP analysis for genetic association studies" Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6(3):317-21 (May 2003)に記載されている。一般的なＳＮＰ検出法としては、これらに限定するものではないが、ＴａｑＭａｎ分析、分子標識分析、核酸アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アレイプライマー伸長、ホモジニアスプライマー伸長分析（homogeneous primer extension assays）、質量分析による検出を伴うプライマー伸長、パイロシークエンシング、遺伝子アレイに基づき分類された多重プライマー伸長、ライゲーションローリングサークル（ligation with rolling circle）増幅、ホモジニアスライゲーション、ＯＬＡ（米国特許第４,９８８,１６７号）、遺伝子アレイに基づき分類された多重ライゲーション反応、制限断片長多型、一塩基伸長−タグアッセイ及びインベーダーアッセイ（Invader assay）が挙げられる。そのような方法は、例えば、発光又は化学発光検出、蛍光検出、時間分解蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏光、質量分析及び電気的検出のような検出機構と組み合わせて用いてもよい。

【0101】

異なる複対立遺伝子の検出は多重反応を用いて行うこともでき、多重反応を使えば、異なる複対立遺伝子を１回の反応で検出することができる。多重反応では、ＳＮＰ又は多塩基多型又は対立遺伝子を伸長、増幅するのに、２つ以上の対立遺伝子−特異的プライマーを用いる。一塩基多型又は多塩基多型の多重検出方法の例は、米国特許出願公開第２００６／０１７２３２４号に記載されている。

【0102】

本明細書に記載する改良ポリメラーゼを用いた、伸長産物又は増幅産物の他の検出方法としては、蛍光二本鎖ヌクレオチド結合色素又は蛍光二本鎖ヌクレオチドインターカレーション色素の使用が挙げられる。蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素の例としては、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（Molecular Probes）が挙げられる。蛍光二本鎖インターカレーション色素の例としては、臭化エチジウムが挙げられる。二本鎖ＤＮＡ結合色素は、プライマー伸長産物及び／又は増幅産物を測定する融解曲線分析と併せて使用できる。融解曲線分析は、ＡＢＩ５７００/７０００（９６ウェル型）又はＡＢＩ７９００（３８４ウェル型)装置のようなリアルタイムＰＣＲ装置と搭載ソフトウェア（ＳＤＳ２．１）を用いて行うことができる。もしくは、融解曲線分析はエンドポイント分析として行うこともできる。融解曲線分析の方法の例が米国特許出願公開第２００６／０１７２３２４号に記載されている。

【0103】

更に他の態様においては、ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡラべリング又はプライマー伸長産物のラべリングにおいて、本発明のポリメラーゼはプライマー伸長に用いられる。例えば、サンガーのジデオキシヌクレオチド法によるＤＮＡシークエンシング（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463, 1977）は、特殊な鎖停止ヌクレオチドを取り込むことができるポリメラーゼのために、本発明により改良される。基本的なサンガーらの方法が進展し、新規のベクター（Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-119, 1985）及び塩基類似体（Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2232-2235, 1979; and Barr et al., Biotechniques 4:428-432, 1986）が提供された。一般に、ＤＮＡシークエンシングには、鎖停止塩基類似体の存在下で鋳型依存的プライマー伸長が必要であり、それにより続いて大きさによって分離される部分断片の分布ができる。基本的なジデオキシシークエンシング法は（ｉ）場合により標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型にアニーリングさせ；（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、標識されていないｄＮＴＰと、場合により標識された１種のｄｄＮＴＰのような少量の鎖停止剤の混合物を各々含む、４回の別々の反応でプライマーを伸長し；（iii）４セットの反応産物を高解像変性ポリアクリルアミド／尿素ゲルで分析する工程を含む。使用した標識によって、反応産物はオートラジオグラフィー又は蛍光検出によりゲル中で検出することができ、そのイメージを調べてヌクレオチド配列を推測することができる。それらの方法では、大腸菌ＰｏｌＩのクレノウ断片のようなＤＮＡポリメラーゼ又は改変Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを使用する。

【0104】

ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼが利用できるようになり、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使ったシークエンシングの改良法（Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436, 1988参照）及び「サイクルシークエンシング」（Murray, Nuc Acids Res. 17:8889, 1989）と呼ばれるその改変がもたらされた。したがって、本発明の熱安定性ポリメラーゼは、そのような方法と併せて使用することができる。基本的なジデオキシシークエンシングに代わるものとして、サイクルシークエンシングは、鎖停止剤の存在下での鋳型配列に相補的な標的配列の直鎖状で非対称の増幅である。１回のサイクルで可能な全ての長さの伸長産物のファミリーが生成される。鋳型ＤＮＡからの伸長反応産物の変性に続き、プライマーアニーリングとプライマー伸長の複数サイクルがｄｄＮＴＰのような停止剤の存在下で起こる。サイクルシークエンシングは、従来の鎖停止シークエンシングよりも少ない鋳型ＤＮＡしか必要としない。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、サイクルシークエンシングにおいていくつかの利点を有する；それらは、核酸標的へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションに必要なストリンジェントなアニーリング温度に耐え、同時に各サイクルで起こる、例えば９０〜９５℃の高温変性の多数のサイクルに耐える。この理由で、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼとその誘導体及び派生物、例えばＡｍｐｌｉＴａｑＣＳＤＮＡポリメラーゼ及びＡｍｐｌｉＴａｑＦＳＤＮＡポリメラーゼが、Perkin-Elmer (Norwalk, CT)及びApplied Biosystems (Foster City, CA)のような会社により市販されているＴａｑサイクルシークエンシングキットに入っている。

【0105】

改良ポリメラーゼは、４５４シークエンシング（Roche）において用いることができる（Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380）。４５４シークエンシングには２つの工程が含まれる。第一の工程において、ＤＮＡは約３００〜８００塩基対の断片へと切断され、その断片は平滑末端を有する。次にオリゴヌクレオチドアダプターが断片の末端にライゲーションする。アダプターは、断片の増幅及びシークエンシングのためのプライマーとして機能する。例えば、５’ビオチンタグを含むアダプターＢを用いて、断片をＤＮＡ捕捉ビーズ、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに付着させることができる。ビーズに付着した断片を、油−水エマルジョンの液滴内でＰＣＲ増幅する。その結果、各ビーズ上にクローン増幅されたＤＮＡ断片の複数のコピーが得られる。第二の工程では、このビーズをウェル(ピコリットルサイズ)中に捕捉する。各ＤＮＡ断片上で同時にパイロシークエンシングを行う。１つ以上のヌクレオチドが付加すると光シグナルが生成され、そのシグナルはシークエンシング装置に搭載されたＣＣＤカメラにより記録される。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。

【0106】

パイロシークエンシングは、ヌクレオチドの付加時に放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）を利用している。ＰＰｉはアデノシン−５’−ホスホ硫酸の存在下、ＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換される。ルシフェラーゼはルシフェリンをオキシルシフェリンに変換するためにＡＴＰを使い、この反応が検出、分析される光を生成する。

【0107】

鎖停止シークエンシング方法の変形としては、色素プライマーシークエンシング及び色素停止剤シークエンシングが挙げられる。色素プライマーシークエンシングでは、ｄｄＮＴＰ停止剤は標識されておらず、標識されたプライマーを使って伸長産物を検出する（Smith et al., Nature 32:674-679, 1986）。色素停止剤ＤＮＡシークエンシングでは、ｄＮＴＰと蛍光標識ｄｄＮＴＰをＤＮＡプライマーの末端に取り込むのにＤＮＡポリメラーゼを用いる（Lee et al., Nuc. Acids. Res. 20:2471, 1992）。この方法には、色素標識プライマーを合成しなくてよいという利点がある。さらに、色素停止剤反応は、４つの反応全てを同一チューブ内で実施できるという点でより便利である。

【0108】

色素プライマー法と色素停止剤法は両方とも、Applied Biosystems (Foster City, CA)製の自動シークエンシング装置を用いて自動化してもよい（米国特許第５，１７１，５３４号）。この装置を使用する場合、反応を終えたシークエンシング反応混合物は、装置に搭載した変性ポリアクリルアミドゲル又はキャピラリー上で分画される。ゲル上でサイズにしたがって電気泳動されると、装置の底にあるレーザーが蛍光産物を検出する。

【0109】

色素停止剤シークエンシングで用いる停止剤を標識するために、通常２種類の蛍光色素が用いられる。負に帯電した蛍光色素と両性イオン性蛍光色素である。負に帯電した蛍光色素としては、フルオレセイン及びＢＯＤＩＰＹファミリーのものがあげられる。ＢＯＤＩＰＹ色素（４,４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）は、国際公開第９７／００９６７号に記載されている。両性イオン性蛍光色素としては、ローダミンファミリーのものが挙げられる。市販のサイクルシークエンシングキットは、ローダミン誘導体で標識された停止剤を使用している。しかし、ローダミン標識された停止剤はかなり高価である。また、それらはシークエンシング産物と共に移動するため、ゲルにロードする前に取り込まれなかった色素−ｄｄＮＴＰから産物を分離しなければならない。ローダミン色素ファミリー停止剤は、ＧＣリッチ領域においてヘアピン構造を安定化させるようであり、これにより産物が変則的に移動する。これには、二次構造を緩めるが停止剤の取り込み効率にも影響を及ぼすｄＩＴＰの使用を必要とする可能性がある。

【0110】

これに対し、フルオレセイン標識停止剤は、より大きな正味負電荷を有し、シークエンシング産物よりも速く移動するので、ゲルロード前の分離工程が不要となる。その上、フルオレセイン標識シークエンシング産物は、ローダミンで標識されたシークエンシング産物よりも良好に電気泳動で移動する。野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはフルオレセインファミリー色素で標識された停止剤を効率的に取り込まないが、これは、米国特許出願公開第２００２／０１４２３３３号に記載されているように、今や改変酵素の使用により効率的に達成することができる。したがって、米国特許出願第２００２/０１４２３３３号に記載のような改変は、プライマー伸長率が改良されたフルオレセインファミリー色素を取り込む熱安定性ポリメラーゼを生成するために、本発明に関して使用することができる。例えば、特定の態様において、本発明による非改変ＤＮＡポリメラーゼは、米国特許出願公開第２００２/０１４２３３３号に記載され、配列番号８に記載のモチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）、及び場合により配列番号２７のモチーフを有する改変熱安定性ポリメラーゼである。

【0111】

本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼが使用できる、他の核酸シークエンシング法の例としては、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ₄類似体を含むターミネーター化合物に関するものが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７９９１号及び第２００５／００３７３９８号、及び米国特許出願番号１２／１７４,４８８）。

【0112】

キット
本発明の別の面では、本明細書に記載するプライマー伸長方法に用いられるキットが提供される。態様によっては、キットは、使用の簡易性のために区分され、本発明にしたがって増大した３’末端ミスマッチ識別能を有する本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む。追加の試薬を提供する１つ以上の追加の容器を含むこともできる。そのような追加の容器は上述の方法にしたがったプライマー伸長法で用いる、当業者に認識された任意の試薬又は他の要素を含むことができ、それには、例えば、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング法又はＤＮＡラベリング法で用いる試薬が含まれる。例えば、特定の態様においては、キットはさらに、プライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、又は５’センスプライマーと対応する３’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を提供する容器を含む。態様によっては、キットは一塩基多型又は多塩基多型と完全に相補的な１つ以上のプライマーを含む１つ以上の容器を含み、ここでプライマーは、上述のように多重反応に有用である。他の相互排他的でない変形においては、キットはヌクレオシド三リン酸（従来の及び／又は特殊な）を提供する１つ以上の容器を含む。特定の態様では、キットはアルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ及び／又は、例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーｄＮＴＰのような標識されたｄＮＴＰを含む。さらに他の相互排他的でない態様においては、キットは、プライマー伸長反応に適切な緩衝液を提供する１つ以上の容器を含む。態様によっては、キットは１つ以上の標識された、又は標識されていないプローブを含む。プローブの例としては、二重標識されたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）プローブ及び分子標識プローブが挙げられる。別の態様においては、キットは、例えば、ホットスタートＰＣＲ分析用のアプタマーを含む。

【0113】

反応混合物
本発明の別の面においては、反応混合物は、本明細書に記載されるように、増大した３’末端ミスマッチ識別活性を有するポリメラーゼを含んで提供される。反応混合物は、例えば、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング法又はＤＮＡラベリング法で用いる試薬をさらに含むことができる。例えば、特定の態様においては、反応混合物はプライマー伸長反応に適切な緩衝液を含んでなる。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１つ以上のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、特殊なヌクレオチドを含む）、塩類（例えば、Ｍｎ²⁺、Ｍｇ²⁺）、及び標識（例えば、蛍光色素分子）を含むこともできる。態様によっては、反応混合物はさらに、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎのような二本鎖ＤＮＡ結合色素、又は臭化エチジウムのような二本鎖ＤＮＡインターカレーション色素を含んでなる。態様によっては、反応混合物はプライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、又は５’センスプライマーと対応する３’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を含む。特定の態様においては、反応混合物はさらに、増幅した鋳型核酸の検出のための蛍光ＦＲＥＴ加水分解プローブ、例えばＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含んでなる。態様によっては、反応混合物は、一塩基多型又は多塩基多型と完全に相補的な２つ以上のプライマーを含む。態様によっては、反応混合物は、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ及び／又は、例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーｄＮＴＰのような標識されたｄＮＴＰを含む。

【実施例】

【0114】

以下の実施例は本発明を例示するために提供されるが、何ら限定するものではない。

【0115】

実施例１：増大した３’末端ミスマッチ識別能を有する変異ＤＮＡポリメラーゼの同定
この実施例の対照ＤＮＡポリメラーゼは、５８０番目のアミノ酸がグリシンであることを除き、配列番号１のサーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼである（例えば、Ｄ５８０Ｇ置換）（以下Ｚ０５Ｄ５８０Ｇポリメラーゼ）。

【0116】

鋳型に対して３’末端ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する能力を減少させる、Ｚ０５Ｄ５８０Ｇポリメラーゼにおける変異を同定した。簡単に言えば、このスクリーニング過程における工程には、ライブラリー作成、変異酵素の発現及び部分精製、所望の性質をもつ酵素のスクリーニング、ＤＮＡシークエンシング、クローン精製、選択された変異体候補のさらなる特性評価が含まれた。これらの工程のそれぞれについて、以下にさらに説明する。

【0117】

クローンライブラリー作成：Ｚ０５Ｄ５８０ＧＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインをコードする核酸を、この核酸配列を含むプラスミドのＢｌｐＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位の間でエラープローン（変異誘発）ＰＣＲにかけた。増幅した配列を配列番号３３とした。これに用いたプライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー：５’−ＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号３１）；及び
リバースプライマー：５’−ＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＡ−３’（配列番号３２）。

【0118】

様々な変異率のライブラリーを作成するために、１．８〜３．６ｍＭのＭｇ²⁺濃度の範囲でＰＣＲを実施した。緩衝液条件は、５０ｍＭビシンｐＨ８．２、１１５ｍＭＫＯＡｃ、８％ｗ／ｖグリセロール、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰであった。ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＡｃｃｕＲＴホットスタートＰＣＲ酵素を０．１５Ｕ/μＬで使用した。反応容量５０μＬ当たり５×１０⁵コピーの線状化Ｚ０５Ｄ５８０ＧプラスミドＤＮＡで開始し、９４℃、６０秒で変性させ、続いて変性温度９４℃で１５秒、アニーリング温度６０℃で１５秒、伸長温度７２℃で１２０秒の条件で３０サイクルの増幅を行い、最後に７２℃で５分間最終伸長を行った。

【0119】

得られた増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Qiagen, Inc.,Valencia, CA, USA）で精製し、ＢｌｐＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで再び精製した。Ｚ０５Ｄ５８０Ｇベクタープラスミドは、同じ２つの制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼ、組換え体（RAS,cat＃03359123001）で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで精製することにより調整した。切断したベクターと変異した挿入断片を１：３の比で混合し、室温で５分間Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより処理した（ＮＥＢＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ（登録商標）キット）。ライゲーションしたものをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで精製し、エレクトロポレーションにより大腸菌宿主株を形質転換した。

【0120】

各形質転換における特徴的な形質転換体の数を調べるために、発現した培養物の一部をアンピシリン選択培地にまいた。形質転換体は、凍結保護物質としてのグリセロールの存在下−７０℃〜−８０℃で保存した。

【0121】

次に、各ライブラリーを大型のアンピシリン選択寒天培地にまいた。個々のコロニーを、自動コロニーピッカー（QPix2, Genetix Ltd）を用いて、アンピシリンと１０％ｗ／ｖグリセロールを含む２×Luriaブロスの入った３８４ウェルプレートに移した。それらのプレートを３０℃で一晩インキュベートして培養物を増殖させ、その後−７０℃〜−８０℃で保存した。２×Luriaブロスに添加したグリセロールは、培養物の増殖を可能にするのに十分なほど少量だったが、凍結保護のためには十分多い量だった。後に使用するために、この方法により複数の変異誘発（Ｍｇ²⁺）レベルで数千個のコロニーを調製した。

【0122】

抽出物ライブラリー調製１−発酵：上述のクローンライブラリーから、スクリーニング用に適切な、部分精製された抽出物の対応するライブラリーを調製した。この過程の第一工程は、各クローンの小規模の発現培養物を生成することであった。それらの培養物を９６ウェルフォーマットで増殖させた；したがって、３８４ウェルライブラリープレート毎に４枚の発現培養物プレートとなった。０．５μＬをクローンライブラリープレートの各ウェルから、１５０μＬの培地Ａ（下記表３を参照）を含む９６ウェルの種プレートのウェルへと移した。この種プレートを、ｉＥＭＳプレートインキュベーター／シェーカー（ThemoElectron）中で、１１５０ｒｐｍ、３０℃で一晩振盪培養した。次に、それらの種培養物を同じ培地に接種するのに用い、今度は大型の９６ウェルプレート（Nunc #267334）の２５０μＬの培地Ａ中に２０μＬを接種した。それらのプレートを３７℃で一晩振盪しながらインキュベートした。発現プラスミドは、３７℃で発現するが３０℃では発現しない転写調節因子を含んでいた。一晩インキュベートした後、培養物は典型的には全細胞タンパク質の１〜１０％でクローンタンパク質を発現した。それらの培養物から細胞を遠心分離により回収した。それらの細胞を凍結するか（−２０℃）又は後述するようにすぐに処理した。

【0123】

【表2】

【0124】

抽出物ライブラリー調製２−抽出：発酵工程で得た細胞ペレットを２５μＬの溶解緩衝液（下記表３)中に再懸濁し、３８４ウェルのサーモサイクラープレートに移して密閉した。なお、緩衝液は細胞溶解を補助するためにリゾチームを含み、抽出物からＤＮＡを除去するためにデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を含む。細胞を溶解させるために、プレートを３７℃で１５分間インキュベートし、−２０℃で一晩凍結し、３７℃で１５分間再びインキュベートした。硫酸アンモニウムを添加し（２Ｍ溶液を１．５μＬ）、外来的に添加されたヌクレアーゼを含む汚染タンパク質を沈澱、不活性化させるために、プレートを７５℃で１５分間インキュベートした。プレートを３０００×ｇで１５分間、４℃で遠心し、上清を新しい３８４ウェルサーモサイクラープレートに移した。それらの抽出物プレートを後にスクリーニングで使用するために−２０℃で凍結した。各ウェルには約０．５〜３μＭの変異ライブラリーポリメラーゼ酵素が含まれていた。

【0125】

【表3】

【0126】

３’プライマーミスマッチ伸長率が減じた抽出物ライブラリーのスクリーニング：抽出物ライブラリーは、鋳型オリゴヌクレオチドと完全に一致するプライマーの伸長率と３’末端Ｇ：Ｔミスマッチを有するプライマーの伸長率を比較することによりスクリーニングした。

【0127】

プライマー伸長反応のために、３８４ウェルサーモサイクラープレートで、２.５μＬの抽出物を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭＫＣｌ、０.１ｍＭＥＤＴＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２２.５μＬの緩衝液と混合することにより上記の酵素抽出物を１０倍に希釈し、カバーして、９０℃で１０分間加熱した。完全一致プライマーを用いた対照反応では、３８４ウェルＰＣＲプレートで、０.５μＬの希釈抽出物を１５μＬのマスター混合物と混合した。プライマー処理された鋳型の伸長は、ＣＣＤカメラ（上述のWatson参照）を用いて改良型キネティックサーマルサイクラーで１０秒毎にモニタリングした。マスター混合物には５０ｎＭのプライマー処理された鋳型プライマー、２５ｍＭトリシン、ｐＨ８.３、１００ｍＭＫＯＡｃ、０.６ＸＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、２００μΜの各ｄＮＴＰ、１００ｎＭアプタマー、２.５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれていた。伸長由来の蛍光をバックグラウンドの蛍光から区別するために、マスター混合物からヌクレオチドを除くことによりプライマー鎖伸長を阻害した実験を並行したウェルで行った。３’末端にミスマッチのあるプライマーを用いた反応は、１.５ｕＬの希釈抽出物を各反応に添加し、酢酸マグネシウムの代わりに１.５ｍＭ酢酸マンガンを使用したこと以外は上記と同じように行った。抽出物の量を３倍に増やし、マンガンを金属活性化因子として用いると、どちらでもミスマッチ伸長がより起こりやすくなり、したがって３’末端ミスマッチ伸長を識別する能力が最も強いそれらの酵素のためのスクリーニングの選択性が向上する。

【0128】

上記のプロトコールを用いて約５０００の変異抽出物をスクリーニングした。任意のカットオフを上回る完全一致プライマーの伸長値及び完全一致伸長の割合に対して低いミスマッチに基づき、オリジナルのプールの約７％が再スクリーニングのために選択された。最も良い抽出物に相当する培養ウェルは新しい増殖培地に採取し、再培養して、最良の変異体を含む新しい培養プレートならびに比較のために用いる多数の親培養物を生成した。これらの培養プレートを次に、元のスクリーニングの表現型を確認するために再スクリーニングされる、新しい抽出物を生成するのに用いた。完全に３’末端が一致するプライマーと３’末端にミスマッチがあるプライマーを用いた反応のプライマー伸長率は、時間経過に伴う蛍光の上昇についての曲線の直線部分の勾配として算出した。完全一致の伸長の勾配でミスマッチのある伸長の勾配を割った比を、最良の候補をランク付けし選択するために用いた。再スクリーニングで選択されたクローンと、さらに比較のために親クローンＺ０５Ｄ５８０Ｇのそれぞれの遺伝子型及び表現型を以下の表に示す。

【0129】

【表4】

【0130】

実施例２：野生型ＢＲＡＦのヒトゲノム鋳型をバックグラウンドとした変異ＢＲＡＦプラスミド鋳型の増幅
この実施例の対照ＤＮＡポリメラーゼは、５８０番目のアミノ酸がグリシンであることを除き（例えば、Ｄ５８０Ｇ置換）、配列番号１のサーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼである（以下Ｚ０５Ｄ５８０Ｇポリメラーゼ）。

【0131】

野生型ＢＲＡＦのヒトゲノムＤＮＡをバックグラウンドとした場合の変異ＢＲＡＦＶ６００Ｒ標的の識別能を改善するためにＴａｑＭａｎＰＣＲにおいて精製したＺ０５Ｄ５８０ＧＹ５４７Ｃ及びＺ０５Ｄ５８０ＧＥ４７５ＤＹ５４７ＮＲ６３２Ｓを親酵素Ｚ０５Ｄ５８０Ｇと比較した。

【0132】

ヒトＢＲＡＦ遺伝子の領域を増幅する、標的がＢＲＡＦのコドン６００に変異、Ｖ６００Ｋを持つ場合に、前記標的と完全に一致するプライマーを使用した。ヒトゲノムＤＮＡに存在する標的野生型ＢＲＡＦに対し、対立遺伝子選択プライマーは３’末端に１つのＡ：Ｃミスマッチをもたらす。コモンプライマーはＢＲＡＦ遺伝子と完全に一致しており、これがプローブ配列で、リアルタイム、ＴａｑＭａｎで増幅を検出することができる。各反応では、最終容量１６μＬ中に、１０,０００コピー（３３ｎｇ）の野生型ヒトゲノム細胞株ＤＮＡ、又は１０,０００もしくは１００コピーのＢＲＡＦＶ６００Ｒ変異配列を含む線状化プラスミドが含まれていた。酵素により異なる塩の最適条件を考慮して、増幅は２５〜１３０ｍＭのＫＣｌ濃度の範囲で行った。緩衝液条件は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０、２.５ｍＭＭｇＣｌ₂、０.２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０.０２Ｕ／μＬＵＮＧ、２００ｎＭアプタマーであった。フォワード及びリバースプライマーは１００ｎＭ、プローブは２５ｎＭだった。ＤＮＡポリメラーゼは全て２０ｎＭで分析し、２％（ｖ／ｖ）酵素保存緩衝液（５０％ｖ／ｖグリセロール、１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８.０、０.１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０.５％Ｔｗｅｅｎ２０）を反応に加えた。反応は、Roche LightCycler４８０サーマルサイクラーで行い、９５℃、６０秒で変性させ、続いて変性温度９２℃で１０秒、アニーリング温度６２℃で３０秒の条件で９９サイクルの増幅を行った。

【0133】

反応は２回行い、クロッシングポイント（「Ｃｐ」）はAbs Quant/２^nd derivative Max法を用いて算出し、Ｃｐの平均値を求めた。Ｃｐ平均値を、算出したＰＣＲ効率、各酵素が最も早く高コピー数の変異を得たＣｐのＫＣｌ濃度における差別因子の値と共に以下の表に示す。高コピーΔＣｐは、１０,０００コピーの３’末端にミスマッチがある野生型標的ゲノムをバックグラウンドとして、１０,０００コピーの３’末端にミスマッチがある野生型標的ゲノムを用いた反応のＣｐ平均値と、１０,０００コピーの完全一致標的プラスミドを用いた反応のＣｐ平均値の差異に等しい。全ての反応は、バックグラウンドとして１０,０００コピーの野生型標的ＢＲＡＦを含んでおり、したがって変異プラスミドを含まない反応のＣｐは、試験した条件下でのミスマッチがある鋳型プライマーの増幅のブレークスルー及び酵素の識別能の限界を示す。Ｚ０５Ｄ５８０ＧＹ５４７Ｃ及びＺ０５Ｄ５８０ＧＥ４７５ＤＹ５４７ＮＲ６３２Ｓは、親Ｚ０５Ｄ５８０Ｇより良好な識別能を示した。

【0134】

表５．ＢＲＡＦＶ６００Ｋ変異プラスミドとヒトゲノムＤＮＡの増幅のＣｐ

【表5】