特許 5876637 ニックまたはギャップの入った核酸分子およびそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5876637

(24)【登録日】2016年1月29日

(45)【発行日】2016年3月2日

(54)【発明の名称】ニックまたはギャップの入った核酸分子およびそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160218BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20160218BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160218BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20160218BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20160218BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20160218BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20160218BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20160218BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N15/00 G

   A61K48/00

   A61K9/127

   A61K9/51

   A61K9/16

   A61K47/40

   A61K31/713

【請求項の数】29

【全頁数】69

(21)【出願番号】特願2009-533539(P2009-533539)

(86)(22)【出願日】2007年10月18日

(65)【公表番号】特表2010-506598(P2010-506598A)

(43)【公表日】2010年3月4日

(86)【国際出願番号】US2007081836

(87)【国際公開番号】WO2008049078

(87)【国際公開日】20080424

【審査請求日】2010年10月18日

(31)【優先権主張番号】60/862,027

(32)【優先日】2006年10月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/910,393

(32)【優先日】2007年4月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/955,317

(32)【優先日】2007年8月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/969,136

(32)【優先日】2007年8月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507328184

【氏名又は名称】マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】クウェイ，スティーブン，シー．

(72)【発明者】

【氏名】マクスヴィッゲン，ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァイシュ，ナレンドラ，ケイ．

(72)【発明者】

【氏名】アーマディアン，モハマド

【審査官】 白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５０３１４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１１２０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０４４１３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０４４１３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０４４１３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−１９２５５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／０８０５６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−１７４８２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０５６１５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５３０３１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１４８７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 EMBO reports，２００６年 １月，vol.7 no.3，pp.314-320

【文献】 Nucleic Acids Research，２００５年，vol.33 no.1，pp.439-447

【文献】 Nucleic Acids Research，２００７年，vol.35 no.17，pp.5886-5897

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１５〜３０ヌクレオチドの長さを有し標的ＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖であるＡ鎖と、５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ１鎖と、５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ２鎖と、を含むリボ核酸であって、ここで：
（ａ）前記Ｓ１鎖と前記Ａ鎖がアニールして、長さ５〜１３塩基対の第一の二本鎖領域を形成し；
（ｂ）前記Ｓ２鎖と前記Ａ鎖がアニールして、長さ６〜２５塩基対の第二の二本鎖領域を形成し；
（ｃ）前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の長さの合計が１９〜３０塩基対であり；
（ｄ）前記第一の二本鎖領域がギャップによって前記第二の二本鎖領域と分離されて、前記ギャップは前記Ａ鎖の１〜１０の不対ヌクレオチドであり、前記ギャップは前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間に存在する；そして
（ｅ）前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜５ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。

【請求項2】

（ａ）前記Ａ鎖が、１８〜２５ヌクレオチドの長さを有し；そして
（ｂ）前記Ｓ１鎖およびＳ２鎖のそれぞれが、独立して、５〜１５ヌクレオチドの長さを有し；
（ｃ）前記Ｓ１鎖と前記Ｓ２鎖の長さの合計が、１８〜２５ヌクレオチドであり；
（ｄ）前記Ａ鎖、Ｓ１鎖、およびＳ２鎖が、第一の二本鎖領域と第二の二本鎖領域とを形成し；
（ｅ）前記第一の二本鎖領域が、ギャップによって前記第二の二本鎖領域と分離されて、前記ギャップは前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間の前記Ａ鎖の単鎖領域であり、ここで、前記ギャップは１〜１０ヌクレオチドの長さであり；そして
（ｆ）前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜４ヌクレオチドの長さである；
請求項１に記載のリボ核酸。

【請求項3】

前記Ａ鎖が、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のリボ核酸。

【請求項4】

１５〜３０ヌクレオチドの長さを有し標的ＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖であるＡ鎖と、６〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ１鎖と、６〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ２鎖と、を含むリボ核酸であって、ここで：
（ａ）前記Ｓ１鎖と前記Ａ鎖がアニールして、長さ５〜１３塩基対の第一の二本鎖領域を形成し；
（ｂ）前記Ｓ２鎖と前記Ａ鎖がアニールして、第二の二本鎖領域を形成し、ここで前記第一および第二の二本鎖領域が合わせて２５〜４０塩基対の総計長を有し；そして、
（ｃ）前記リボ核酸が、前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間にギャップを有し、前記ギャップは前記Ａ鎖の１〜１０の不対ヌクレオチドであり；そして
（ｄ）前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜５ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。

【請求項5】

（ａ）前記Ｓ１鎖が６〜１６ヌクレオチドの長さを有し；そして、
（ｂ）前記Ｓ２鎖が６〜１６ヌクレオチドの長さを有する；
請求項４に記載のリボ核酸。

【請求項6】

リボ核酸が１〜５ヌクレオチドの長さの３´オーバーハングを含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項7】

前記３´オーバーハングが１、２、３または４ヌクレオチドの長さである請求項６に記載のリボ核酸。

【請求項8】

前記ギャップが１〜６不対ヌクレオチドの長さを有する請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項9】

前記ギャップが１不対ヌクレオチドの長さを有する請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項10】

前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の長さの合計が２５〜３０塩基対である請求項１乃至９のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項11】

請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のリボ核酸および薬学的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項12】

リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性のナノカプセル、生体接着性のマイクロスフェア、またはタンパク質性のベクター、をさらに含む請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

標的遺伝子のｍＲＮＡを発現する細胞中において、前記標的遺伝子の発現を低減させるインビトロの方法であって、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のリボ核酸を細胞に投与することを含む、方法。

【請求項14】

１つ以上のヌクレオチドが修飾された糖を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項15】

１つ以上のヌクレオチドが２’糖架橋を有する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項16】

１つ以上のヌクレオチドが修飾されたヌクレオシド間結合を有する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項17】

１つ以上のヌクレオチドがロック核酸ヌクレオチドを有する請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項18】

１つ以上のヌクレオチドがロック核酸ヌクレオチドである、あるいは１つ以上のヌクレオチドが２’糖架橋を有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドがＧ形クランプを有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドが修飾されたヌクレオシド間結合を有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドが末端キャップ置換基を有する、１つ以上のヌクレオチドが２’−メトキシもしくはフルオロ修飾を有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、またはこれらの任意の組み合わせである請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項19】

前記リボ核酸のピリミジンの１つ以上が、式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドを含む：

【化1】

式中、
Ｒ^１とＲ^２は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ハロゲン、置換もしくは非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換もしくは非置換−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３、置換もしくは非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり，
Ｒ^３とＲ^４は、それぞれ独立して、水酸基、保護水酸基、リン酸、またはヌクレオシド間結合基であり、および
Ｒ^５とＲ^８は、独立して、ＯまたはＳである、
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリボ核酸。

【請求項20】

１つ以上のヌクレオシドが、Ｒ^１がメチルでＲ^２が−ＯＨである式Ｉに記載の請求項１９に記載のリボ核酸。

【請求項21】

１つ以上のヌクレオシドが、Ｒ^２が−ＯＣＨ_３またはフルオロである式Ｉに記載の請求項１９に記載のリボ核酸。

【請求項22】

請求項１〜１０及び１４〜２１のいずれか一項に記載のリボ核酸および薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、緩衝剤、安定剤、または保存剤を含む医薬組成物。

【請求項23】

リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性のナノカプセル、生体接着性のマイクロスフェア、またはタンパク質性のベクター、をさらに含む請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

請求項１〜１０及び１４〜２１のいずれか一項に記載のリボ核酸を含む、標的遺伝子のｍＲＮＡを発現する細胞における前記標的遺伝子の発現の低減用の薬剤。

【請求項25】

前記細胞がヒト細胞である請求項２４に記載の薬剤。

【請求項26】

請求項１〜１０及び１４〜２１のいずれか一項に記載のリボ核酸を含む、ヒト対象における標的ＲＮＡの発現を低減させることによる過増殖性疾病または炎症性疾病の治療用の薬剤。

【請求項27】

ヒト対象に感染している微生物の標的遺伝子の発現を低減させる感染症の治療用の薬剤の製造のための、請求項１〜１０及び１４〜２１のいずれか一項に記載のリボ核酸の使用。

【請求項28】

請求項１〜１０及び１４〜２１のいずれか一項に記載のリボ核酸を含む、ヒト対象中での過増殖性疾病、炎症性疾病、または感染症の治療用の薬剤。

【請求項29】

過増殖性疾病、炎症性疾病、または感染症のヒト対象の治療における使用のための薬剤の製造における請求項１〜１０及び１４〜２１のいずれか一項に記載のリボ核酸の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、遺伝子サイレンシングが可能な二本鎖核酸分子を提供し、より具体的には、例えば、ＲＮＡ干渉および標的遺伝子の発現もしくは標的遺伝子に影響される遺伝子に関連する疾患の治療または予防のためのそのような二本鎖ＲＮＡの使用により、標的遺伝子の発現を減少させる鎖を少なくとも３本含むニックの入った二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはギャップの入った二本鎖ＲＮＡを提供する。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的メッセンジャーＲＮＡの一部に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等の阻害核酸小分子によって仲介される、動物における配列特異性の転写後の遺伝子サイレンシングの細胞プロセスに関する（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６，１９９８；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−９５１，１９９９）。ＲＮＡｉは、哺乳類を含む種々の生物で観察されている（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６，１９９８；Ｂａｈｒａｍｉａｎ ａｎｄ Ｚａｒｂｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２７４−２８３，１９９９；Ｗｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：７０，１９９９）。ＲＮＡｉは、培養哺乳類細胞に、外因性で２１ヌクレオチドの合成ＲＮＡ二重鎖を導入することにより誘導できる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４，２００１ａ）。

【0003】

ｄｓＲＮＡが標的遺伝子サイレンシングを仲介するメカニズムは、２つの段階を含むものとして記述できる。第１段階は、２１〜２３ヌクレオチドを有し約１９の塩基対の二本鎖域を含む短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）への、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ型様の酵素による、長いｄｓＲＮＡの分解を含む（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８，２００１ｂ；ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２）：２２２，２００５）。ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングの第２段階は、ｓｉＲＮＡからの鎖（ガイド鎖またはアンチセンス鎖）を１本およびアルゴノートタンパク質を有する多成分ヌクレアーゼを活性化し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）を形成することを含む（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８，２００１）。Ａｒｇｏｎａｕｔｅはまず二本鎖ｓｉＲＮＡと結合し、次いで非導入鎖（ｎｏｎ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ鎖）（パッセンジャー鎖またはセンス鎖）をヌクレオチド鎖切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｃｌｅａｖｅ）し、その遊離を、結果として生じる、切断した二重鎖の熱力学的不安定性によって促進する（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ７：３１４，２００６）。活性化ＲＩＳＣ中のガイド鎖は、相補的な標的ｍＲＮＡに結合し、そのｍＲＮＡを切断して遺伝子サイレンシングを促進する。標的ＲＮＡの切断は、ガイド鎖に相補的な標的領域の中央で生じる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ）。

【0004】

標的特有の遺伝子サイレンシングは、外因的にｓｉＲＮＡを付加することで達成できるが、非標的遺伝子の非特異的サイレンシング（オフターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）と称される）は難題となり得る（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６３５，２００３；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：１６７１，２００５ 参照）。したがって、遺伝子サイレンシングを仲介する代替のｄｓＲＮＡ分子および方法に対する当分野における需要が、依然存在する。本開示はそのような需要を満たし、さらにその他の関連する利点も提供するものである。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、本明細書においてＡ、Ｓ１、およびＳ２（Ａ：Ｓ１Ｓ２）と指定する鎖を少なくとも３本含むｄｓＲＮＡ分子を提供し、ここでＳ１とＳ２は、Ａの非重複領域に対して相補的であり、Ａの非重複領域と塩基対（ｂｐ）を形成する。したがって、本明細書で記載のｓｉＲＮＡ分子については、Ｓ１とＡのアニーリングにより形成された二本鎖領域は、Ｓ２とＡのアニーリングにより形成された二本鎖領域とは異なる。Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖の間に位置し、Ａ鎖、Ｓ１鎖、および／もしくはＳ２鎖のいずれかまたは両鎖の３’−末端での、任意の１つ以上の不対ヌクレオチドとは異なるＡ鎖中の、少なくとも１つの不対ヌクレオチドに起因する「ギャップ」によって、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖が分離されている場合がある。代わりに、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖の間に位置するＡ鎖中に不対ヌクレオチドが存在しないような、もしくは、もしある場合、不対ヌクレオチドが１つだけ、Ａ鎖、Ｓ１鎖、および／もしくはＳ２鎖のいずれかまたは両鎖の３’−末端に存在するような「ニック」によって、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖が分離されてもよい。

【0006】

ある局面においては、本開示は、標的ＲＮＡに相補的な第１の鎖ならびにそれぞれが第１の鎖の非重複領域に相補的な第２および第３の鎖を含むメロデュープレックス（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）であり、ここで前記第２および第３の鎖が、前記第１の鎖とアニールして１０ヌクレオチド以下のギャップにより分離されている少なくとも２つの二本鎖領域を形成可能であり、ここで（ａ）少なくとも１つの二本鎖領域が約５〜１３塩基対、または（ｂ）二本鎖領域の合計が約１５〜約４０塩基対でありｍｄＲＮＡ分子が平滑末端を有する、メロデュープレックスＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）を提供する。特定の態様においては、第１の鎖は約１５〜約４０ヌクレオチドの長さであり、第２および第３の鎖はそれぞれ独立に、約５〜約２０ヌクレオチドであり、ここで第２と第３の鎖の合計の長さは、約１５〜約４０ヌクレオチドである。別の態様においては、ｍｄＲＮＡはＲＩＳＣアクチベータ（例えば、第１の鎖は約１５〜約２５ヌクレオチドを有する）またはダイサー基質（例えば、第１の鎖は約２６〜約４０ヌクレオチドを有する）である。いくつかの態様においては、ギャップは、第２と第３の鎖が第１の鎖にアニールされた際に形成する二本鎖領域間に位置する第１の鎖中に、少なくとも１〜１０の不対ヌクレオチドを含み、またはギャップは、ニックを含む。特定の態様においては、ニックまたはギャップは、第１の（アンチセンス）鎖の５’−末端から１０ヌクレオチドまたはアルゴノート切断部位に位置する。別の態様においては、異なる位置にニックまたはギャップを有するようなメロデュープレックスの熱安定性と比較して、第１と第２の鎖の二重鎖および第１と第３の鎖の二重鎖において熱安定性が最大限になるように、メロデュープレックスのニックまたはギャップが位置する。

【0007】

別の局面においては、本開示は、標的ＲＮＡに相補的な第１の鎖ならびにそれぞれが第１の鎖の非重複領域に相補的な第２および第３の鎖を含むｍｄＲＮＡ分子であり、ならびにそれぞれが第１の鎖の非重複領域に相補的な第２および第３の鎖を含むｍｄＲＮＡであり、ここで前記第２および第３の鎖が、前記第１の鎖とアニールして１０ヌクレオチド以下のギャップにより分離されている少なくとも２つの二本鎖領域を形成可能であり、ここで（ａ）少なくとも１つの二本鎖領域が約５〜１３塩基対、または（ｂ）二本鎖領域の合計が約１５〜約４０塩基対でありｍｄＲＮＡ分子が平滑末端を有し、ｍｄＲＮＡのピリミジンの少なくとも１つが式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドを含む、ｍｄＲＮＡを提供する：

【0008】

（式中、Ｒ^１とＲ^２はそれぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１０の置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシルアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１０の置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３、Ｃ_２−Ｃ_１０の置換もしくは非置換アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり；Ｒ^３とＲ^４はそれぞれ独立して、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、リン酸、またはヌクレオシド間結合基であり；Ｒ^５とＲ^８は独立してＯまたはＳである）。特定の態様においては、少なくとも１つのヌクレオシドが、Ｒ^１がメチルでＲ^２が−ＯＨである式Ｉのヌクレオシドである。特定の関連する態様においては、ｄｓＲＮＡ分子のウリジンの少なくとも１つが、Ｒ^１がメチルでＲ^２が−ＯＨ、またはＲ_１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨ、そしてＲ^８がＳである式Ｉのヌクレオシドで置換される。いくつかの態様においては、少なくとも１つのＲ^１は、メチル等のＣ_１−Ｃ_５のアルキルである。いくつかの態様においては、少なくとも１つのＲ^２は、２’−Ｏ−（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’−Ｏ−アリル、またはフルオロから選択される。いくつかの態様においては、ｍｄＲＮＡ分子のピリミジンの少なくとも１つが、二環式の糖の形態のロックされた核酸（ＬＮＡ）であり、ここでＲ^２が酸素であり、２’−Ｏと４’−Ｃがオキシメチレン架橋を同一のリボース環上（例えば、５−メチルウリジンＬＮＡ）に形成するか、Ｇ形クランプである。別の態様においては、１つまたは複数のヌクレオシドは、Ｒ^１がメチルであり、Ｒ^２が２’−Ｏ−メチル等の２’−Ｏ−（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキルである、式Ｉに記載のものである。いくつかの態様においては、ギャップは、第２と第３の鎖が第１の鎖にアニールされた際に形成する二本鎖領域間に位置する第１の鎖中に、不対ヌクレオチドを少なくとも１つ含み、またはギャップは、ニックを含む。特定の態様においては、ニックまたはギャップは、第１の鎖の５’−末端から１０ヌクレオチドまたはアルゴノート切断部位に位置する。別の態様においては、異なる位置にニックまたはギャップを有するようなメロデュープレックスの熱安定性と比較して、第１と第２の鎖の二重鎖および第１と第３の鎖の二重鎖において熱安定性が最大限になるように、メロデュープレックスのニックまたはギャップが位置する。

【0009】

本明細書において開示する組成物および方法は、標的遺伝子または標的遺伝子ファミリーの一部である１つもしくは複数の遺伝子の、細胞中での発現の低減において、または過増殖性疾患（例えば、癌）、炎症性の状態（例えば、関節炎）、呼吸器系疾病、肺疾病、循環器系疾病、自己免疫疾病、アレルギー性疾患、神経系疾病、感染症（例えば、インフルエンザ等のウイルス感染）、腎臓疾病、移植拒絶、標的遺伝子もしくは遺伝子ファミリーの調節に応答するいずれの他の疾病や状態等の、１つ以上の標的遺伝子ファミリーメンバーの発現と関連する疾病や疾患の治療もしくは予防において、有用である。

【0010】

特定の態様においては、本開示のｄｓＲＮＡは、要約すると、約１５塩基対〜約４０塩基対；または約１８〜約３５塩基対；または約２０〜３０塩基対；または２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、もしくは２９塩基対、を含む。特定の態様の範囲内では、ｓｉＲＮＡは、１ヌクレオチド〜５ヌクレオチドの一本鎖３’−オーバーハングを含んでもよい。特定の態様においては、そのような一本鎖３’−オーバーハングは、１、２、３、または４ヌクレオチドである。

【0011】

別の局面においては、本開示のｄｓＲＮＡは、Ａセンス鎖またはＡアンチセンス鎖のいずれかを含み、ここで、前記Ａ鎖の長さは約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド；または前記Ａ鎖の長さは約１８ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド；または前記Ａ鎖の長さは約２０ヌクレオチド〜約３２ヌクレオチド；または前記Ａ鎖の長さは２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１ヌクレオチド、である。

【0012】

別の局面においては、本開示のｓｉＲＮＡはさらに、本明細書において例えばＳ１およびＳ２と指定するＳ鎖を２本以上含み、ここで、Ｓ鎖はそれぞれ、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ａ鎖の非重複領域に相補的であり、ここで、１つのニックまたは１つもしくは複数のヌクレオチドギャップによって、第１のＳ鎖（Ｓ１）と第２のＳ鎖（Ｓ２）は分離されている。前記同族Ａ鎖がセンス鎖であるかアンチセンス鎖であるかに応じて、各々のＳ鎖はアンチセンス鎖またはセンス鎖にそれぞれなるであろう。本明細書に記載のＳ鎖（Ｓ１、Ｓ２など）は、それぞれ独立して、約１ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さ；より典型的には約４ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの長さ；さらにより典型的には約５ヌクレオチド〜約１６ヌクレオチドの長さ；最も典型的には６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの長さである。

【0013】

意図する詳細な用途によっては、第１のＳ鎖（Ｓ１）は、ニックまたはギャップによって、第２のＳ鎖（Ｓ２）と分離されている場合がある。Ｓ１とＳ２がギャップによって分離されているこれらの態様においては、該ギャップは、約１ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド；または約１ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド；または約１ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド；または該ギャップは、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド、である。Ｓ鎖は、それぞれ独立して、５’ヒドロキシル（例えば、５’−ＯＨ）を末端としてよく、または５’リン酸基（例えば、５’−ＰＯ_４）を末端としてよい。

【0014】

本明細書のいずれの局面においても、第１、第２、もしくは第３の鎖上の少なくとも１つのウリジンの代わりに、または第１、第２、もしくは第３の鎖上のあらゆる全てのウリジンの代わりに、５−メチルウリジン（リボチミジン）または２−チオリボチミジンを有するｍｄＲＮＡを提供する。さらなる態様においては、ｍｄＲＮＡは、５−メチルウリジン（リボチミジン）、２−チオリボチミジン、デオキシウリジン、ロックされた核酸（ＬＮＡ）分子、２’−Ｏメチルで修飾された糖、もしくはＧ形クランプのいずれか１つ、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。特定の態様においては、ｍｄＲＮＡ分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、２’−Ｏ−アリル、またはハロゲン（例えば、２’−フルオロ）等の、２’−糖置換を含む。特定の態様においては、ｍｄＲＮＡ分子は、第１、第２、もしくは第３の鎖の片末端または両末端上に、独立して、アルキル、無塩基デオキシ（ａｂａｓｉｃ ｄｅｏｘｙｌ）、無塩基グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、逆位デオキシヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）部分等の、少なくとも１つの末端キャップ置換基（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃａｐ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）を、さらに含む。別の態様においては、ｍｄＲＮＡ分子は、独立して、ホスホロチオエート、キラル（ｃｈｉｒａｌ）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸、アルキルホスホン酸、３’−アルキレンホスホン酸、５’−アルキレンホスホン酸、キラルホスホン酸、ホスホノアセテート、チオホスホノアセテート、ホスフィン酸塩、ホスホラミデート、３’−アミノホスホラミデート、アミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホン酸、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸、ボラノ（ｂｏｒａｎｏ）リン酸結合等の、修飾されたヌクレオシド間結合を、少なくとも１つさらに含む。

【0015】

本開示のいずれの局面においても、いくつかの態様においては、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、２デオキシリボヌクレオチド（例えば、チミジン）等の、ギャップの一部ではない３’末端の少なくとも１つに１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを含むｍｄＲＮＡ、を提供する。いくつかの態様においては、二本鎖領域内の第２の鎖の少なくとも１または２の５’−末端リボヌクレオチドが、２’−糖置換を含む。関連する態様においては、二本鎖領域内の第１の鎖の少なくとも１または２の５’−末端リボヌクレオチドが、２’−糖置換を含む。別の関連する態様においては、二本鎖領域内の、第２の鎖の少なくとも１または２の５’−末端リボヌクレオチドおよび第１の鎖の少なくとも１または２の５’−末端リボヌクレオチドが、独立の２’−糖置換を含む。別の態様においては、ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも３つの５−メチルウリジンを少なくとも１つの二本鎖領域内に含む。いくつかの態様においては、ｍｄＲＮＡ分子は、片末端または両末端上に平滑末端を有する。別の態様においては、第３の鎖の５’−末端はヒドロキシルまたはリン酸である。

【0016】

本開示の方法においては、ギャップの入ったｄｓＲＮＡまたはニックの入ったｄｓＲＮＡの標的となる、全ての可能な遺伝子変異形のヌクレオチド配列の事前知識が、要求されないことが理解されるであろう。はじめに、ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、標的遺伝子の保存領域から選択されてよい。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ＲＩＳＣアクチベータ ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡ（２１ヌクレオチドセンス鎖／２１ヌクレオチドアンチセンス鎖；２１／２１）、ダイサー基質 ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡ（２５ヌクレオチドセンス鎖／２７ヌクレオチドアンチセンス鎖；２５／２７）、および、２７ヌクレオチドアンチセンス鎖にアニールされた際に、１ヌクレオチドのギャップが１３ヌクレオチドセンス鎖と１１ヌクレオチドセンス鎖の間に残されるように、センス鎖に１ヌクレオチドが不足している、メロデュープレックス ＬａｃＺ ｍｄＲＮＡ（１３ヌクレオチドセンス鎖と１１ヌクレオチドセンス鎖／２７ヌクレオチドアンチセンス鎖；１３、１１／２７へのノックダウン活性を示す。ノックダウン活性は、ＱｎｅｇコントロールｄｓＲＮＡに標準化され、Ｑｎｅｇの標準化値として示される（例えば、Ｑｎｅｇは、１００％または「標準」遺伝子発現レベルを示す）。より小さな値がより大きなノックダウン効果を表す。

【図2】図２は、１００ｎＭでのＲＩＳＣアクチベータインフルエンザｄｓＲＮＡ Ｇ１４９８（２１／２１）およびニックの入ったｄｓＲＮＡ（１０、１１／２１）のノックダウン活性を示す。「野生型」という指定は、非置換ＲＮＡ分子を表し；「ｒＴ」は、各ウリジンがリボチミジンで置換されているＲＮＡを表し；そして、「ｐ」はその鎖の５’−ヌクレオチドがリン酸化されていることを表す。Ｇ１４９８の２１ヌクレオチドセンス鎖およびアンチセンス鎖は、５’−末端から測定してヌクレオチド１０と１１の間で個別にニックされ、それぞれ１１、１０／２１および２１／１０、１１と称される。コントロールとして、Ｇ１４９８一本鎖２１ヌクレオチドアンチセンス鎖が単独で（ＡＳ−のみ、と指定）使用された。

【図3】図３は、８〜１４の位置のそれぞれの１つにニックを有し、センス鎖の（５’−末端から数えて）１３の位置に１ヌクレオチドのギャップを有する、ＬａｃＺダイサー基質（２５／２７）のノックダウン活性を示す。ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）は、ニックの入ったセンス配列またはギャップの入ったセンス配列の最も３’側の５’−末端で、１３の位置で導入された。

【図4】図４は、センス鎖の８〜１４の位置のそれぞれの１つでニックされた配列の、ダイサー基質インフルエンザｄｓＲＮＡ Ｇ１４９８ＤＳ（２５／２７）を示し、リン酸化もされているか、ロックされた核酸置換を有する、これらのニックの入った分子の活性を示す。

【図5】図５は、センス鎖の１３の位置でニックされた配列の、ダイサー基質インフルエンザｄｓＲＮＡ Ｇ１４９８ＤＳ（２５／２７）の用量依存性のノックダウン活性を示す。

【図6】図６は、センス鎖の８〜１２の位置のいずれか１つの位置で始まる、１〜６ヌクレオチドのニックまたはギャップを有する、ダイサー基質インフルエンザｄｓＲＮＡ Ｇ１４９８ＤＳのノックダウン活性を示す。

【図7】図７は、センス鎖の８〜１４の位置のいずれか１つの位置で始まる、１〜６ヌクレオチドのニックまたはギャップを有する、ＬａｃＺ ＲＩＳＣ ｄｓＲＮＡの活性を示す。

【図8】図８は、センス鎖の８〜１４の位置のいずれか１つの位置で始まるニックを有し、センス鎖１本につき１または２つのロックされた核酸をさらに有する、インフルエンザＲＩＳＣ ｄｓＲＮＡのノックダウン活性を示す。

【図9】図９は、ロックされた核酸置換を有する同様のニックの入ったダイサー基質と比較して、センス鎖の８〜１４の位置のいずれか１つの位置でニックを有する、ＬａｃＺダイサー基質ｄｓＲＮＡのノックダウン活性を示す。

【図10】図１０は、インフルエンザ特異性のｍｄＲＮＡ使用し、ＴＣＩＤ_５０（５０％培養細胞感染量）で測定した、ＷＳＮインフルエンザウイルス力価における用量依存的な低下を示す。

【図11】図１１は、インフルエンザＷＳＮ株に特異的なｍｄＲＮＡを使用して、インフルエンザウィルス力価におけるノックダウン％率を示す。

【図12】図１２は、インフルエンザ特異性のｍｄＲＮＡ使用し、ＴＣＩＤ_５０（５０％培養細胞感染量）で測定した、ＰＲ８インフルエンザウイルス力価におけるインビボでの低下を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本開示は、ダイサーの基質として、またはＲＩＳＣとの結合に適している鎖を少なくとも３本含み、それゆえ、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介する遺伝子サイレンシングに有利に利用できる、ギャップの入った二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供する。すなわち、本明細書に記載の部分的に二重鎖のｄｓＲＮＡ分子（少なくとも１本の鎖中にニックもしくはギャップを有するメロマー（ｍｅｒｏｍｅｒｓ）またはメロデュープレックスとも称される）は、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または関連の標的ｍＲＮＡファミリーの発現を修飾（例えば、低減）するＲＮＡｉカスケードの惹起が可能である。そのような構造の遺伝子サイレンシングの機能性は、（インタクトのｄｓＲＮＡと比較して）熱力学的に安定性が低いニックの入ったｄｓＲＮＡパッセンジャー鎖またはギャップの入ったｄｓＲＮＡパッセンジャー鎖が、いずれかの遺伝子サイレンシングが生じる前に崩壊すると想定されるだろうことから、予測不可能である（例えば、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ７：３１４，２００６；Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：５８８６，２００７参照）。

【0019】

本明細書に記載のメロデュープレックスリボ核酸（ｍｄＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡに相補的な第１の（アンチセンス）鎖を、それぞれが第１の鎖の非重複領域に相補的な第２および第３の鎖（ともにギャップの入ったセンス鎖を形成）と一緒に含み、ここで、第２および第３の鎖は、第１の鎖とアニールしギャップで分離される二本鎖領域を少なくとも２つ形成することが可能であり、ここで、少なくとも１つの二本鎖領域が約５塩基対〜１５塩基対であるか、または二本鎖領域を合わせた合計が約１５塩基対〜約４０塩基対でありｍｄＲＮＡは平滑末端を有する。

【0020】

ギャップは、０ヌクレオチド（すなわち、２つのヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合のみが、ポリヌクレオチド分子中で切断されているニック）〜約１０ヌクレオチド以下（すなわち、第１の鎖が非末端不対ヌクレオチドを少なくとも有するであろう）であり得る。特定の態様においては、ニックまたはギャップは、第１の（アンチセンス）鎖の５’−末端から約１０ヌクレオチドまたはアルゴノート切断部位に位置する。別の態様においては、異なる位置にニックまたはギャップを有するようなメロデュープレックスの熱安定性と比較して、第１と第２の鎖の二重鎖および第１と第３の鎖の二重鎖において熱安定性が最大限になるように、メロデュープレックスのニックまたはギャップが位置する。

【0021】

本明細書においてはまた、上記のようなｄｓＲＮＡを使用して、標的遺伝子または標的遺伝子ファミリーの一部である１つもしくは複数の遺伝子の、細胞中での発現を低減する方法、または過増殖性疾患（例えば、癌）、炎症性の状態（例えば、関節炎）、呼吸器系疾病、肺疾病、循環器系疾病、自己免疫疾病、アレルギー性疾患、神経系疾病、感染症（例えば、インフルエンザ等のウイルス感染）、腎臓疾病、移植拒絶、標的遺伝子もしくは遺伝子ファミリーの調節に応答するいずれの他の疾病や状態等の、１つ以上の標的遺伝子ファミリーメンバーの発現と関連する疾病や疾患を治療もしくは予防する方法も開示する。

【0022】

本開示にさらなる詳細を挿入するのに先がけ、その正しい認識にとって、本明細書で使用する特定の用語の定義を提供することが有益であろう。

【0023】

本記載においては、特に断りのない限り、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲、または整数範囲が、詳述の範囲内の任意の整数値、そして適切な場合にはそれらの分数（ある整数の１０分の１、１００分の１等）を含むことが、理解されるべきである。加えて、ポリマーのサブユニット数、大きさ、厚さ等の、物理的特徴に関連する本明細書に詳述の任意の数範囲が、特に断りのない限り、詳述の範囲内の任意の整数を含むことが、理解されるべきである。本明細書で使用の通り、「約」または「本質的に成る」とは、他に断わりのない限り、表示の範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用の通り、「有する」および「含む」という表現は、特に制限がなく同義的に使用されるものである。本明細書で使用の「ａ」および「ａｎ」という表現は、列挙の成分の「１つ以上」に関することが理解されるべきである。選択語の使用（たとえば、「または／もしくは」）は、どちらか一方、両方、またはそれら選択語の任意の組み合わせ、を意味することが理解されるべきである。

【0024】

本明細書で使用の通り、「相補的な」とは、従来のワトソン・クリック型塩基対または相補的なヌクレオシドもしくはヌクレオチド間での他の特殊なタイプの対形成（例えば、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合）のいずれかによって、他の核酸分子またはそれ自身と水素結合を形成可能な核酸に関する。本開示の核酸分子に関すると、核酸分子とその相補的配列の結合自由エネルギーは、ＲＮＡｉ活性等の核酸分子の関連機能を進行させるのに十分であり、特異的結合が要求される条件下において、すなわち、インビボアッセイもしくは治療上処置の場合における生理学的条件下、またはインビトロアッセイ（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ）の場合においてアッセイが行われる条件下において、非標的配列への核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）の非特異的結合を回避するのに十分な相補度が存在する。当該分野において、核酸分子における結合自由エネルギーの決定は既知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ：１２３，１９８７；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：９３７３，１９８６；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３，１９８７参照）。したがって、「相補的な」または「特異的にハイブリダイズ可能」または「特異的に結合」とは、安定かつ特異的な結合が、核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）とＤＮＡもしくはＲＮＡ標的の間で生じるような、十分な相補度または正確な対形成を表す表現である。当該分野においては、特異的にハイブリダイズ可能または特異的に結合するのに、核酸分子が標的核酸配列に１００％相補的でなくてもよいことが、理解されている。すなわち、２つ以上の核酸分子は、十分に満たない相補的であってよく、第２の核酸分子と水素結合を形成可能な核酸分子中の近接残基（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｒｅｓｉｄｕｅ）の百分率で表わされる。

【0025】

例えば、第１の核酸分子が１０ヌクレオチドを有してよく、第２の核酸分子が１０ヌクレオチドを有していよく、その場合、第１と第２の核酸分子間の塩基対は５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドであり、これは近接二本鎖領域を形成してもしなくてもよく、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相性を示す。特定の態様においては、相補的核酸分子が誤った塩基対を有する場合があり、これはすなわち、塩基が従来のワトソン・クリック型塩基対または他の特殊なタイプの対（すなわち、「ミスマッチ」塩基対）を形成できないということである。例えば、十分に相補的な核酸分子は、０〜約１、約２、約３、約４、または約５等の、特定の「ミスマッチ」数を有しているものとして同定されてよい。

【0026】

「完全に」または「十分に」相補的な核酸分子とは、第１の核酸分子の特定数のヌクレオチドが、第２の核酸分子中の同じ数の基と水素結合（アニール）し、近接二本鎖領域を形成する核酸、を意味する。例えば、２本以上の十分に相補的な核酸分子鎖は、同数のヌクレオチド（すなわち、同じ長さを有し、オーバーハング有りもしくは無しの二本鎖領域を１つ形成する）または異なる数のヌクレオチド（例えば、一本の鎖は第２の鎖より短く第２の鎖内に完全に含まれてよく、もしくは一本の鎖は第２の鎖上にオーバーハングしてもよい）を有し得る。

【0027】

本明細書で使用の通り、「リボ核酸」または「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド分子を含む核酸分子を意味する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’−位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関することが、理解されるべきである。ＲＮＡという用語には、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（例えば、精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えによって作成されたＲＮＡ）、（１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換もしくは改変により、天然のＲＮＡとは異なる）変化した（ａｌｔｅｒｅｄ）ＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせ、が含まれる。例えば、そのような改変ＲＮＡは、ＲＮＡ分子の片末端もしくは両末端に、ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおいて内部的に、またはこれらの任意の組み合わせ等で、非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。本開示のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、化学的に修飾されたヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、アナログまたは標準ヌクレオチド（すなわち、本明細書で使用の通り、標準ヌクレオチドはアデニン、シチジン、グアニジン、チミジン、およびウリジンであると考えられる）のアナログと称されてよい。

【0028】

「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用の通り、「ｍｄＲＮＡ」と可換であり、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む任意の核酸分子に関し、例えば、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）または遺伝子サイレンシングを配列に特異的な様式で促進することにより、遺伝子発現を阻害またはダウンレギュレーション可能である。本開示のｄｓＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）は、ＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシングを仲介するダイサーまたはＲＩＳＣとの対合用の適宜の基体であってもよい。ｄｓＲＮＡの１本の鎖または両方の鎖は、５’−リン酸もしくは５’，３’−二リン酸等の末端リン酸基を、さらに含み得る。本明細書で使用の通り、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのリボヌクレオチドに加えて、置換、化学的に修飾されたヌクレオチド、および非ヌクレオチドを、さらに含み得る。特定の態様においては、ｄｓＲＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約１００％までリボヌクレオチドを含む。

【0029】

加えて、本明細書で使用の通り、ｄｓＲＮＡという用語は、例えば、メロデュープレックスＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ），ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ），ギャップの入ったｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ），短（ｓｈｏｒｔ）干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉置換オリゴヌクレオチド、短干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学的に修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後の遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）等、配列に特異的なＲＮＡｉを仲介可能な核酸分子を記述するのに使用される他の用語に相当することが意図される。「長二本鎖（ｌａｒｇｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）（ｄｓ）ＲＮＡ」という用語は、約４０塩基対（ｂｐ）〜約１００ｂｐまたはそれを超えるものより長い、具体的には約３００ｂｐ〜約５００ｂｐ以下の、任意の二本鎖ＲＮＡに関する。長ｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡの断片またはｍＲＮＡの全体を表してよい。二本鎖構造は、自己相補的な核酸分子（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または２本以上の異なる相補的な核酸分子鎖のアニーリングによって形成されてよい。

【0030】

ある局面においては、ｄｓＲＮＡは、２つの別々のオリゴヌクレオチドを含み、第１の鎖（アンチセンス）および第２の鎖（センス）を含み、ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的であり（すなわち、それぞれの鎖はもう一方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、これら別々の２本の鎖は二重鎖または二本鎖構造を形成し、例えばここで、二本鎖領域は約１５〜約２４もしくは２５塩基対、もしくは約２５もしくは２６〜約４０塩基対である）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み；そしてセンス鎖は、標的核酸配列に相当する（すなわち、相同の）ヌクレオチド配列またはその一部を含む（例えば、約１５〜約２５ヌクレオチドもしくは約２６〜約４０ヌクレオチドのセンス鎖が、標的核酸またはその一部に相当する）。

【0031】

別の局面においては、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの自己相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖が、核酸系リンカー（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ）または非核酸系リンカー（ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ）によって共に連結されることで、単独のオリゴヌクレオチドから構築される。特定の態様においては、ｄｓＲＮＡ分子の第１の（アンチセンス）鎖および第２の（センス）鎖は、本明細書に記載の通り、そして当該分野で既知の通り、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーによって、共有結合的に連結される。別の態様においては、第１のｄｓＲＮＡ分子は、当該分野で既知のヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーによって、少なくとも１つの第２のｄｓＲＮＡ分子に共有結合的に連結され、ここで、第１のｄｓＲＮＡ分子は、同じでも異なってもよい他の複数のｄｓＲＮＡ分子またはそれらの任意の組み合わせに、連結され得る。別の態様においては、連結されたｄｓＲＮＡは、該連結されたｄｓＲＮＡとメロデュープレックスを形成する第３の鎖を含んでいる場合がある。

【0032】

さらに別の局面においては、本明細に記載のｄｓＲＮＡ分子は、例えば「Ａ」（第１の、またはアンチセンス）鎖、「Ｓ１」（第２の）鎖、および「Ｓ２」（第３の）鎖等の、３本以上の鎖を有するメロデュープレックスＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）を形成し、「Ｓ１」鎖と「Ｓ２」鎖は、「Ａ」鎖の非重複領域に相補的であり塩基対（ｂｐ）を形成する（例えばｍｄＲＮＡは、Ａ：Ｓ１Ｓ２の形態を有し得る）。Ｓ１、Ｓ２、またはさらなる鎖は共に、「Ａ」鎖に対するセンス鎖を本質的に含む。「Ｓ１」鎖と「Ａ」鎖のアニーリングによって形成される二本鎖領域は、「Ｓ２」鎖と「Ａ」鎖のアニーリングで形成される二本鎖領域とは異なり、非重複である。ｍｄＲＮＡ分子は「ギャップ」分子であり、０ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチド以下の範囲の「ギャップ」を意味する。ある態様においては、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖の間に位置し、「Ａ」、「Ｓ１」または「Ｓ２」鎖の１本以上の３’−末端における任意の１つ以上の不対ヌクレオチドとは異なる、「Ａ」鎖中の１つ以上の不対ヌクレオチド（約１０不対ヌクレオチド以下）に起因するギャップによって、Ａ：Ｓ２二重鎖と分離される。別の態様においては、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖間の０ヌクレオチドのギャップ（すなわち、２つのヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合のみが、ポリヌクレオチド分子中で切断されている、または欠失しているニック）によってＡ：Ｓ２二重鎖と分離され、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）とも称され得る。例えば、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、合わせた合計が約１４塩基対〜約４０塩基対の少なくとも２つの二本鎖領域を有し、二本鎖領域は約０〜約１０ヌクレオチドのギャップにより分離されていて、平滑末端を有していてもよいｄｓＲＮＡから構成されてよく、または、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、１０以下のヌクレオチドのギャップで分離されている少なくとも２つの二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡを含んでよく、ここで、二本鎖領域の少なくとも１つは、約５塩基対〜１３塩基対を含む。

【0033】

ｄｓＲＮＡまたは長ｄｓＲＮＡは、リン酸骨格結合（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｂｏｎｄ）、糖、塩基、もしくはヌクレオシド中にあってよい置換または修飾を含む場合がある。そのようなヌクレオシド置換は、天然の非標準ヌクレオシド（例えば、５−メチルウリジンまたは５−メチルシチジンまたは２−チオリボチミジン）を含み得、そのような骨格、糖、またはヌクレオシド修飾は、メチル、アルコキシアルキル、ハロゲン、窒素もしくは硫黄等のアルキルもしくはヘテロ原子の置換または付加、あるいは当該分野で既知の他の修飾を含み得る。

【0034】

特定の態様においては、ｄｓＲＮＡまたはｍｄＲＮＡは単離されるであろう。本明細書で使用の通り、「単離された」という用語は、自然環境中（例えば、自然環境は細胞であってよい）で共存している物質の一部または全てから分離されているように、言及の分子がその本来の環境から取り除かれることを意味する。

【0035】

本明細書で使用の通り、「ＲＮＡｉ」という用語は、転写後の遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、または遺伝子の後成的発現（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）等の、配列に特異的なＲＮＡ干渉を記述するのに使用される他の用語に相当することが意図される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、転写後の段階または転写前の段階またはそれらの任意の組み合わせで、後成的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）に遺伝子をサイレンシングするのに使用可能である。

【0036】

本明細書で使用の通り、「標的核酸」とは、その発現または活性が改変される任意の核酸配列に関する。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのアナログであり得て、一本鎖、二本鎖、および複数鎖の形態を含む。「標的部位」または「標的配列」とは、ＲＮＡｉによる切断における「標的」であり、標的部位または標的配列に相補的なアンチセンス鎖内の配列を含む本開示のｄｓＲＮＡ構築物に仲介される、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）内の配列を意味する。

【0037】

本明細書で使用の通り、「オフターゲット効果」または「オフターゲットプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）」とは、ｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡによる遺伝子サイレンシングにおける、直接的にまたは非直接的に標的とされていない細胞中または他の生体試料中の、１つ以上の遺伝子の観察される改変された発現パターンに関する。例えば、ＤＮＡマイクロアレイを使用して、候補ｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡまたは１つ以上のｍＲＮＡ等の標的配列に特異的なこれらのアナログの存在下で、約２倍かそれを超える発現レベルの改変を有する非標的遺伝子数を決定し、オフターゲット効果を定量化することが可能である。「最小限のオフターゲット効果」とは、約２５％〜約１％の試験した非標的遺伝子の約２倍かそれを超えて、ｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが発現に作用することを意味し、または、置換もしくは修飾されたｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ（例えば、５−メチルウリジンか２−チオリボチミジンで置換されたウリジンを少なくとも１つ有し、２’−位置で修飾されたヌクレオチドを少なくとも１つ有していてもよい）が、非置換もしくは非修飾のｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの非標的遺伝子への作用と比較して、少なくとも約１％〜約８０％、またはそれ以上低減されることを意味する。

【0038】

「センス領域」または「センス鎖」とは、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域の１つ以上に相補性を有する、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域は、標的配列に対して相同性または同一性を有する核酸配列を含む。「アンチセンス領域」または「アンチセンス鎖」とは、標的核酸配列に相補性を有する、ｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖の１本以上に相補性を有する、核酸配列領域を含み得る。

【0039】

「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」は、本明細書で使用の通り、親化合物（例えば、核酸分子）と構造的に同様だが、組成が僅かに異なる（例えば、１つの原子または官能基が、異なるか、付加しているか、除去されている）化合物に関する。アナログは、元の化合物と異なる化学的特性または物理的特性を有していてもいなくてもよく、改善された生物活性または化学的活性を有していてもいなくてもよい。例えば、アナログはより親水性でよく、または親化合物と比較して改変された活性を有していてもよい。アナログは、親化合物の化学的活性もしくは生物活性を模倣してもよく、または、場合によっては、増加した活性もしくは減少した活性を有する場合がある。アナログは、元の化合物の天然のまたは非天然の（例えば、化学的に修飾されたもしくは組み換えの）変異体であってよい。ＲＮＡアナログの１つの例は、特定の望ましい特性（例えば、改善された安定性、バイオアベイラビリティ、最小限のオフターゲット効果またはインターフェロン応答）を付与する場合のある、５−メチルウリジンまたは５−メチルシチジンまたは２−チオリボチミジン等の非標準ヌクレオチドを有するＲＮＡ分子である。

【0040】

「ピリミジン」という用語は、本明細書で使用の通り、標準のピリミジン塩基であるウラシルおよびシトシンを含む、従来のピリミジン塩基に関する。さらに、ピリミジンという用語は、例えば、５−メチルウラシル、２−チオ−５−メチルウラシル、４−チオウラシル、擬ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、ジヒドロウラシル、オロト酸塩、５−メチルシトシン等の天然の非標準ピリミジン塩基または酸、ならびに、本開示の核酸分子内で標準ピリミジンを置換するのに使用可能な、化学的に修飾された塩基または「万能塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅｓ）」を包括的に含むことが意図される。

【0041】

「プリン」という用語は、本明細書で使用の通り、標準のプリン塩基であるアデニンおよびグアニンを含む、従来のプリン塩基に関する。さらに、プリンという用語は、例えば、Ｎ２−メチルグアニン、イノシン等の天然の非標準プリン塩基または酸、ならびに、本開示の核酸分子内で標準プリンを置換するのに使用可能な、化学的に修飾された塩基または「万能塩基」を包括的に含むことが意図される。

【0042】

本明細書で使用の通り、「万能塩基」という用語は、標準ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と、それらの区別無く塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識される、ヌクレオチド塩基アナログに関する（例えば、Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７０：４２６−４３５，１９９７参照）。万能塩基の限定されない例には、当該分野で既知の通り、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよびその他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドール等のニトロアゾール誘導体が含まれる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：２４３７−２４４７，２００１参照）。

【0043】

「遺伝子」という用語は、本明細書で使用の通り、特にＲＮＡｉにおける「標的遺伝子」または「遺伝子標的」との関連において、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ポリペプチドをコードする構造遺伝子とも称される）、そのような遺伝子のｍＲＮＡスプライスバリアント、機能遺伝子（ｆＲＮＡ）、もしくは、小時間性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ），リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ），トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびそれらの前駆体ＲＮＡ等の非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含む、ＲＮＡまたはそのような遺伝子の転写産物をコードする核酸、を意味する。そのような非コーディングＲＮＡは、機能的細胞プロセス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓ）もしくは調節細胞プロセス（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓ）に関与するｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性を改変する、ｄｓＲＮＡに仲介されるＲＮＡｉのための、標的核酸分子として機能することが可能である。標的遺伝子は、内在性遺伝子、導入遺伝子、または、その感染後に細胞中に存在する病原体（例えば、ウイルス遺伝子）からの遺伝子を含む外因性遺伝子等の、細胞由来の遺伝子であり得る。標的遺伝子を含む細胞は、植物、動物、原生生物、ウイルス、細菌、もしくは菌類等の、任意の生物に由来し得るか、または含まれ得る。

【0044】

さらに、１つ以上のｄｓＲＮＡを、標的ｍＲＮＡまたは関連のｍＲＮＡスプライスバリアントの発現のノックダウンに使用してもよい。この際、標的遺伝子が２つ以上のｍＲＮＡスプライスバリアントに転写されてもよいことが、注目される。特定の態様においては、１つの標的ｍＲＮＡスプライスバリアントが、１つ以上の他の標的ｍＲＮＡスプライスバリアントに影響せずにノックダウンされることが望ましい場合があり、逆もまた同様である。あるいは、１つ以上の標的ファミリー遺伝子の全ての転写産物のノックダウンが、本明細書において意図される。

【0045】

本明細書で使用の通り、「遺伝子サイレンシング」とは、細胞中の遺伝子発現の標的阻害を介する、部分的または完全な機能喪失に関し、ＲＮＡｉ「ノックダウン」、「阻害」、「ダウンレギュレーション」または標的遺伝子の発現の「低減」とも称される。検討されるべき状況および生物学的問題によっては、遺伝子発現を部分的に低減するのが好ましい場合がある。あるいは、可能な限り遺伝子発現を低減するのが望ましい場合があるかもしれない。サイレンシングの程度は、本明細書に記載の方法によって決定されてよく、当該分野で既知の場合もあり、そのいくつかは国際特許公開第９９／３２６１９号で要約されている。アッセイによっては、遺伝子発現の定量化によって、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルもしくは活性に関して、例えば、基準（すなわち、標準）または、特定の疾病状態もしくは治療のための他の状態と関連する場合のある増加した発現レベル等の他のコントロールレベルの、１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、９５％、もしくは９９％に等しいかそれを超える標的遺伝子の発現のノックダウンが可能になるであろう予防方法および治療方法を含む、本開示の特定の態様において望ましい場合のある、種々の阻害量の検出が可能になる。

【0046】

「被験体」とは、移植細胞（ｅｘｐｌａｎｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）もしくは細胞自身のドナーまたはレシピエントである生物を意味する。「被験体」とは、本開示の核酸分子を投与する生物にも関する。ある態様においては、被験体は哺乳動物または哺乳類細胞である。別の態様においては、被験体はヒトまたはヒト細胞である。

【0047】

本明細書で使用の通り、「治療上有効量」という用語は、投与する被験体において（例えば、哺乳類またはヒト）、病徴の重症度の減少、病徴が無い時期の頻度もしくは期間の増加、または疾病が原因の機能障害もしくは身体障害の予防に、結果としてつながるのに十分な量のｄｓＲＮＡ意味する。例えば、標的ｍＲＮＡに向けられる治療上有効量のｄｓＲＮＡは、効果的に標的をコードするｍＲＮＡをダウンレギュレーションし、それによって、感染、炎症、代謝障害、自己免疫状態、癌等の標的に関連する疾患の１つ以上を低減または予防する。当業者であれば、被験体の大きさ、症状の重症度、および選択する投与の特定の組成または経路といった要素に基づき、そのような治療上有効な量を決定することができるであろう。例えば、化合物の治療上有効量は、被験体において、腫瘍の大きさを減少させることができ、またはさもなければ、特定の疾患に関連する症状を寛解することができる。本開示のｄｓＲＮＡ分子は、個別にもしくは組み合わせで、または他の薬物との組み合わせで、治療に適した条件下で被験体に投与または特定の細胞に投与することにより、本明細書で考察する疾病または病状の治療に使用できる。

【0048】

加えて、本明細書で記載の構造および置換基の種々の組み合わせに由来の、個々の化合物または化合物の群は、まるで各々の化合物または化合物の群が個別に説明されるかのような程度と同程度に、本出願によって開示される。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。本明細書に記載の通り、全ての数値範囲は、表示する範囲に渡って包括的である。したがって、Ｃ_１−Ｃ_４の範囲は、１、２、３、および４という値を含み、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３およびＣ_４を含むことがことが理解されるであろう。

【0049】

「アルキル」という用語は、本明細書で使用の通り、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜８、そして最も好ましくは炭素数１〜４の飽和の直鎖または分岐鎖の脂肪族基に関する。この定義は同様に、アルコキシ、アルカノイル、およびアラルキル基のアルキル部分にも適用する。アルキル基は、置換されていても非置換でもよい。特定の態様においては、アルキルは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルまたはメチルである。

【0050】

「シクロアルキル」という用語は、本発明で使用の通り、任意に置換されてもよい炭素数３〜１２の飽和環式炭化水素環系（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に関する。態様の例には、以下に限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが含まれる。特定の態様においては、シクロアルキル基はシクロプロピルである。別の態様においては、（シクロアルキル）アルキル基は、環部分中に３〜１２の炭素を含み、アルキル部分中に１〜６の炭素を含む。特定の態様においては、（シクロアルキル）アルキル基はシクロプロピルメチルである。アルキル基は、ハロゲン、ヒドロキシ、およびアミノから成る群から選択される、１〜３の置換基で置換されてもよい。

【0051】

「アルカノイル」および「アルカノイルオキシ（ａｌｋａｎｏｙｌｏｘｙ）」という用語は、本明細書で使用の通り、それぞれ、−Ｃ（Ｏ）−アルキル基および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル基に関し、それぞれは２〜１０の炭素を含んでいてよい。アルカノイル基およびアルカノイルオキシ基の具体的な態様は、それぞれ、アセチルとアセトキシである。

【0052】

「アルケニル」という用語は、炭素数２〜１５を有し、親アルケンの１個の炭素から水素１個が除去されることに由来の炭素−炭素二重結合を少なくとも１つ有する、非飽和の分岐鎖、直鎖、または環式のアルキル基、に関する。この基は、二重結合についてシスまたはトランスのコンホメーションのいずれかでよい。特定の態様には、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチルエテニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、１，３−オクタジエニル、２−ノネニル、１，３−ノナジエニル、２−デセニルなど等が含まれる。アルケニル基は置換されていても非置換でもよい。

【0053】

「アルキニル」という用語は、本明細書で使用の通り、炭素数２〜１０を有し、親アルキンの１個の炭素から水素１個が除去されることに由来の炭素−炭素三重結合を少なくとも１つ有する、非飽和の分岐鎖、直鎖、または環式のアルキル基、に関する。アルキニルの例には、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、４−ペンチニル、１−オクチニル、６−メチル−１−ヘプチニル、２−デシニル等が含まれる。アルキニル基は置換されていても非置換でもよい。

【0054】

「ヒドロキシアルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせで、既に定義の通り１つもしくは数個の水素が、好ましくは一つの水素がヒドロキシ基ですでに置換されている、アルキル基に関する。例として、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、および２−ヒドロキシエチルが含まれる。

【0055】

「アミノアルキル」という用語は、本明細書で使用の通り、ＲとＲ’が独立して水素または（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルでよい、−ＮＲＲ’基に関する。

【0056】

「アルキルアミノアルキル」という用語は、アルキル基（すなわち、−アルキル−ＮＨ−アルキルまたは−アルキル−Ｎ（アルキル）（アルキル）の一般構造を有する基）を介して連結される、アルキルアミノ基に関する。そのような基には、以下に限定されないが、各アルキルが同じでも異なってもよい、モノ−およびジ−（Ｃ_１−Ｃ_８アルキル）アミノＣ_１−Ｃ_８アルキルが含まれる。

【0057】

「ジアルキルアミノアルキル」という用語は、アルキル基に付属のアルキルアミノ基に関する。例として、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル等が含まれる。ジアルキルアミノアルキルという用語にはまた、架橋アルキル部分（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ａｌｋｙｌ ｍｏｉｅｔｙ）が置換されていてもよい基も含まれる。

【0058】

「ハロアルキル」という用語は、例えば、クロロメチル、２−ブロモエチル、３−イオドプロピル、トリフルオロメチル、ペルフルオロプロピル、８−クロロノニル等の、１つ以上のハロ基で置換されたアルキル基に関する。

【0059】

「カルボキシアルキル」という用語は、本発明で使用の通り、Ｒ^１０がアルキレンである−Ｒ^Ｚ−ＣＯＯＨ置換基に関し、炭素アルコキシアルキル（ｃａｒｂａｌｋｏｘｙａｌｋｙｌ）とは、Ｒ^１０とＲ^１１がそれぞれ、アルキレンとアルキルである−Ｒ^１０−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^１１に関する。特定の態様においては、アルキルとは、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルペンチル、ｎ−ヘキシルなどの、飽和の直鎖または分岐鎖の炭素数１〜６のヒドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）ラジカル（ｒａｄｉｃａｌ）に関する。アルキレンは、二価であること以外は、アルキルと同じである。

【0060】

「アルコキシ」という用語には、酸素原子に共有結合的に結合した、置換および非置換アルキル、アルケニル、ならびにアルキニル基が含まれる。ある態様においては、アルコキシ基は、１〜１０個の炭素原子を含む。アルコキシ基の態様には、以下に限定されないが、メトキシ、エトキシ、イソプロピロキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が含まれる。置換アルコキシ基の態様には、ハロゲン化アルコキシ基が含まれる。さらなる態様においては、アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニロキシ、アリールカルボニロキシ、アルコキシカルボニロキシ、アリールオキシカルボニロキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホナート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｏ）、ホスフィナート（ｐｈｏｓｐｈｉｎａｔｏ）、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナート（ｓｕｌｆｏｎａｔｏ）、スルファモイル（ｓｕｌｆａｍｏｙｌ）、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素環式芳香族部分等の基で、置換され得る。典型的なハロゲンで置換されたアルコキシ基には、以下に限定されないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシが含まれる。

【0061】

「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキレン基に関する。例えば、メトキシエチル（ＣＨ_３ＯＣＨ_２ＣＨ_２−）およびエトキシメチル（ＣＨ_３ＣＨ_２ＯＣＨ_２−）は共に、炭素数３のアルコキシアルキル基である。

【0062】

「アリール」という用語は、本明細書で使用の通り、例えば、アルキル；上記で定義の置換アルキル、ハロゲン、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、カルバモイル、およびアリールオキシ等の１〜４個の置換基でそれぞれ置換されてもよい、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニルならびにジフェニルといった、環部分中に炭素原子を６〜１２有する、単環式または二環式の芳香族炭化水素基に関する。本開示に記載のアリール基の具体的な態様には、フェニル、置換フェニル、ナフチル、ビフェニル、およびジフェニルが含まれる。

【0063】

本明細書で単独または組み合わせで使用される「アロイル」という用語は、任意に置換されている安息香酸またはナフトエ酸等の芳香族カルボン酸に由来の、アリールのラジカルに関する。

【0064】

「アラルキル」という用語は、本明細書で使用の通り、好ましくは１〜１０の炭素原子を含むアルキル基を介して、２−ピリジニル環または４−ピリジニル環に結合しているアリール基、に関する。好ましいアラルキル基はベンジルである。

【0065】

「カルボキシ」という用語は、本明細書で使用の通り、式、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ⁻の基を表す。

【0066】

「カルボニル」という用語は、本明細書で使用の通り、酸素が炭素に二重結合している基（−Ｃ＝Ｏ）に関する。

【0067】

「トリフルオロメチル」という用語は、本明細書で使用の通り、−ＣＦ_３に関する。

【0068】

「トリフルオロメトキシ」という用語は、本明細書で使用の通り、−ＯＣＦ_３に関する。

【0069】

「ヒドロキシル」という用語は、本明細書で使用の通り、−ＯＨまたは−Ｏ⁻に関する。

【0070】

「ニトリル」または「シアノ」という用語は、本明細書で使用の通り、−ＣＮ基に関する。

【0071】

「ニトロ」という用語は、本明細書で使用の通り、単独または組み合わせで使用されるように、−ＮＯ_２基に関する。

【0072】

「アミノ」という用語は、本明細書で使用の通り、Ｒ^９が独立して水素、アルキル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリールでよい、−ＮＲ^９Ｒ^９基に関する。「アミノアルキル」という用語は、本明細書で使用の通り、「アミノ」と比較してより詳細な選択を表し、Ｒ’が独立して水素または（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルであってよい、−ＮＲ’Ｒ’基に関する。「ジアルキルアミノ」という用語は、同一または異なってもよいアルキル基を２個有するアミノ基に関する。

【0073】

「アルカノイルアミノ」という用語は、例えばアセチルアミノ、プロパノイルアミノ、およびブタノイルアミノ等、−Ｎ（Ｈ）−が続く−Ｃ（＝Ｏ）−基を含むアルキル、アルケニル、またはアルキニル基に関する。

【0074】

「カルボニルアミノ」という用語は、Ｒ’が独立して、水素または（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルから選択される、−ＮＲ’−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｒ’基に関する。

【0075】

「カルバモイル」という用語は、本明細書で使用の通り、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２に関する。

【0076】

「カルバミル」という用語は、本明細書で使用の通り、すなわち、Ｒ’が独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロ、もしくはヘテロアリールであってよい−ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’のように、窒素原子がカルボニルに直接結合している官能基に関する。

【0077】

「アルキルスルホニルアミノ」という用語は、Ｒ^１２がアルキルである、−ＮＨＳ（Ｏ）_２Ｒ^１２基に関する。

【0078】

「ハロゲン」という用語は、本明細書で使用の通り、臭素、塩素、フッ素、またはヨウ素に関する。ある態様においては、ハロゲンはフッ素である。別の態様においては、ハロゲンは塩素である。

【0079】

「ヘテロシクロ」という用語は、炭素原子を含む少なくとも１つの環中に少なくとも１個のヘテロ原子を有する、４〜７員環の単環式の、または７〜１１員環の二環式の環系である、置換、非置換、部分飽和、もしくは完全飽和であってよい、芳香族基または非芳香族環基、に関する。ヘテロシクロ環上の置換基は、アリール基に関して上で記載の置換基から選択されてよい。ヘテロ原子を含むヘテロシクロ基の各環は、窒素、酸素もしくは硫黄から選択される１、２、または３個のヘテロ原子を有してよい。任意のヘテロシクロ環中の複数のヘテロ原子は、同一でも異なってもよい。

【0080】

典型的な単環式ヘテロシクロ基には、ピロリジニル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、ピぺリジニル、ピペラジニル、アゼピニル（ａｚｅｐｉｎｙｌ）、ピリミジニル（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、ピリダジニル（ｐｙｒｉｄａｚｉｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、ジオキサニル、トリアジニルおよびトリアゾリル、が含まれる。好ましい二環式ヘテロシクロ基には、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル（ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）、テトラヒドロイソキノリニル、ベンジミダゾリル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）、ベンゾフリル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、ベンジソチアゾリル（ｂｅｎｚｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、イソインドリニルおよびテトラヒドロキノリニル、が含まれる。より詳細な態様においては、ヘテロシクロ基は、インドリル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｙｌ）、ピリジルおよびピリミジル、を含んでよい。

【0081】

「置換された」とは、１個以上の水素原子が、それぞれ独立して、同一のまたは異なる置換基で置換されている基、に関する。代表的な置換基には、−Ｘ、−Ｒ^６、−Ｏ−、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ^６、−Ｓ−、＝Ｓ、−ＮＲ^６Ｒ^６、＝ＮＲ^６、−ＣＸ_３、−ＣＦ_３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ_２、＝Ｎ_２、−Ｎ_３、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）_２ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^６、−ＯＳ（Ｏ）_２Ｏ−、−ＯＳ（＝Ｏ）_２ＯＨ、−ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^６、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ⁻）_２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ⁻）、−ＯＰ（＝Ｏ）_２（Ｏ⁻）、−Ｃ（−Ｏ）Ｒ^６、−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ^６、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^６、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ⁻、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ^６、−ＮＲ^６−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ^６）_２、−ＮＲ^６−Ｃ（＝Ｓ）−Ｎ（Ｒ^６）_２、および−Ｃ（＝ＮＲ^６）ＮＲ^６Ｒ^６が含まれ、ここで、各Ｘは独立してハロゲンであり；そして各Ｒ^６は独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アリール、アリールアルキル、アリールアリール、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ＮＲ^７Ｒ^７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^７、および−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^７であり；そして各Ｒ^７は独立して、水素、アルキル、アルカニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールヘテロアルキル、アリールアリール、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキルである。アリールを含む置換基は、１つ以上の置換基を有するか有しないかに関わらず、パラ（ｐ−）、メタ（ｍ−）もしくはオルト（ｏ−）コンホメーション、またはこれらの任意の組み合わせで、付属されてよい。

【0082】

ギャップまたはニックの入ったｄｓＲＮＡ分子
本開示は、小核酸分子を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現または活性を改変することにおいて有用な、化合物、組成物、および方法を提供する。より詳細な態様においては、本開示は、ニックまたはギャップを少なくとも１つ有し、標的遺伝子または遺伝子のファミリーの発現を改変し、被験体（例えば、ヒト）における疾病もしくは疾患の症状を予防、治療、または軽減する、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ニックの入った二本鎖ＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップの入った二本鎖ＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、またはこれらの組み合わせ等の小核酸分子を提供する。これらおよび関連する治療用組成物ならびに方法内において、ニックまたはギャップの入ったｄｓＲＮＡ（すでに置換されているか修飾されていてもよい）の使用はしばしば、天然のｄｓＲＮＡ分子の特性と比較して、ｄｓＲＮＡ分子の特性を改善し、これにより低減したオフターゲット効果、低減したインターフェロン応答、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、改善した細胞摂取、増加した作用強度（ｐｏｔｅｎｃｙ）、またはこれらの任意の組み合わせが得られるであろう。

【0083】

特定の態様においては、本開示のギャップの入ったｄｓＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）分子を、単独で、または補助的治療との組み合わせで、標的遺伝子に特異的なＲＮＡｉを活性化するのに十分な量で投与することにより、細胞中もしくは組織中の標的核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルに関係するか応答する等の遺伝子発現に関連する疾病、疾患、もしくは状態の治療または予防の方法が提供される。ある態様においては、標的遺伝子に特異的なＲＮＡｉが可能なｄｓＲＮＡ分子を投与することにより、疾病もしくは疾患を治療または予防する方法が提供され、このｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の置換または修飾を少なくとも１つ有し、低減したまたは最低限のオフターゲット効果を有する。

【0084】

２つ以上の核酸配列間での「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、ギャップ数および２つ以上の配列のアライメントを最適化するために導入される必要のある各ギャップの長さを考慮し、それら配列に共通の同一な位置の数（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置の合計数 ｘ １００）の関数である。配列の比較および２つ以上の配列間のパーセント同一性の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラム等の数学的アルゴリズムを初期設定パラメータにて使用することで、達成可能である（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３、１９９０；ＢＬＡＳＴＮ ａｔ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴも参照）。

【0085】

ある局面においては、本開示は、標的ｍＲＮＡに相補的な第１の鎖、および第１の鎖の非重複領域にそれぞれ相補的な第２と第３の鎖を含むメロデュープレックスリボ核酸（ｍｄＲＮＡ）分子を提供し、ここで、前記第２の鎖と第３の鎖は、前記第１の鎖とアニールして１０ヌクレオチド以下のギャップで分離されている二本鎖領域を少なくとも２つ形成することができ、ここで、（ａ）少なくとも１つの二本鎖領域が約５塩基対〜１３塩基対を含み、または（ｂ）ここで、前記の二本鎖領域の合計が約１５〜約４０塩基対であり、ｍｄＲＮＡ分子は平滑末端を含み；ここで、前記ｍｄＲＮＡのピリミジンの少なくとも１つが、式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドで置換されている。

【0086】

（式中、Ｒ^１とＲ^２は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ハロゲン、置換もしくは非置換のＣ_１−Ｃ_１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは非置換のＣ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換もしくは非置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３、置換もしくは非置換のＣ_２−Ｃ_１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−Ｃ≡、またはヘテロシクロ基であり；Ｒ^３とＲ^４は、それぞれ独立して、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、リン酸、またはヌクレオシド間結合基であり；Ｒ^５とＲ^８は独立して、ＯまたはＳである。特定の態様においては、少なくとも１つのヌクレオシドが式Ｉに記載で、Ｒ^１がメチルでＲ^２が−ＯＨ、あるいはＲ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨでＲ^８がＳである。

【0087】

別の態様においては、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０ヌクレオシドで共有結合的に連結する。いくつかの態様においては、ギャップは、第２と第３の鎖が第１の鎖にアニールされた際に形成する二本鎖領域間に位置する第１の鎖中に、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み、またはギャップは、ニックを含む。特定の態様においては、ニックまたはギャップは、第１の鎖の５’−末端から１０ヌクレオチドまたはアルゴノート切断部位に位置する。別の態様においては、異なる位置にニックまたはギャップを有するようなメロデュープレックスの熱安定性と比較して、第１と第２の鎖の二重鎖および第１と第３の鎖の二重鎖において熱安定性が最大限になるように、メロデュープレックスのニックまたはギャップが位置する。すなわち、２本以上のニックの入った鎖またはギャップの入った鎖のそれぞれが、第１の鎖にアニールされた際に最高融解温度を有する（すなわち、ニックの入った鎖またはギャップの入った鎖の１つの５０％が第１の鎖にアニールされるＴ_ｍもしくは温度）位置に位置する。

【0088】

本明細書で提供の通り、本明細書で開示のいかなる局面または態様も、過増殖性疾病（例えば、子宮頚癌、卵巣癌）、脈管形成疾患（例えば、腫瘍脈管形成）、または炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、関節リウマチ、慢性の閉塞性腸疾病、アステローム性動脈硬化症）、呼吸器系疾病、肺疾病、循環器系疾病、自己免疫疾病、アレルギー性疾患、神経系疾病、感染症（例えば、インフルエンザ等のウイルス感染）、腎臓疾病、移植拒絶、標的遺伝子もしくは遺伝子ファミリーの調節に応答するいずれの他の疾病や状態等の、標的遺伝子と関連する疾病や疾患の治療において、有用であろう。本開示の特定の態様においては、単独のｄｓＲＮＡが、１つもしくは複数の遺伝子ファミリーメンバーのｍＲＮＡ発現をノックダウンするのに使用され得る。

【0089】

いくつかの態様においては、ｄｓＲＮＡは、第１の鎖が約５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドを含み、そして第２と第３の鎖が、それぞれ別々に、約５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドを含む、少なくとも３本の鎖を含み、ここで、第２と第３の鎖の合計の長さは、約１５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドである。別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、第１の鎖が約１５ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチドもしくは約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドを含む、少なくとも２本または３本の鎖を含む。さらなる態様においては、第１の鎖は、第２の鎖に、または第２と第３の鎖に、または複数の鎖に相補的であろう。さらなる実施例においては、第１の鎖とその相補体は、少なくとも１つの標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な第１の鎖の約１９〜約２５ヌクレオチドと共に、本開示のｄｓＲＮＡまたはｍｄＲＮＡを形成することが可能であろう。

【0090】

例えば、ダイサー基質ｄｓＲＮＡは、約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドを有し得、アンチセンス（第１の）鎖の１９ヌクレオチドのみが、標的遺伝子ファミリーのｍＲＮＡの少なくとも１つに相補的である。さらなる態様においては、第１の鎖は、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドにおいて標的遺伝子ファミリーのｍＲＮＡと相補性を有し得、標的遺伝子ファミリーのｍＲＮＡもしくはそれらの任意の組み合わせと１、２もしくは３つのミスマッチ、またはそれらの任意の組み合わせを有し得、または、（例えば、ＲＩＳＣ中への添加（ｌｏａｄｉｎｇ ｉｎｔｏ）もしくはＲＩＳＣとの結合を活性化する、または可能な）約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの第１の鎖は、標的遺伝子ファミリーのｍＲＮＡの少なくとも１つ、またはそれらの任意の組み合わせ中にある、相当するヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有し得る。

【0091】

置換および修飾されたニックまたはギャップの入ったｄｓＲＮＡ分子
本開示のｍｄＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ分子への置換および修飾ヌクレオチドの導入は、外因的に送達される天然のＲＮＡ分子に固有な、インビボでの安定性とバイオアベイラビリティの潜在的な制限を克服するための手段を提供する。特定の態様においては、ｄｓＲＮＡ分子が、被験体中もしくは生物試料中（例えば、血清）で増加した融解温度もしくは半減期を有するように設計されてもよいことから、本開示の置換および修飾されたｄｓＲＮＡ分子は、任意の治療効果のための特定の核酸分子の投与量を少なくさせることが可能である。さらに、特定の置換または修飾は、特定の細胞もしくは組織を標的とすること、またはｄｓＲＮＡの細胞摂取を改善することにでｄｓＲＮＡのバイオアベイラビリティを改善するために使用され得る。したがって、天然のＲＮＡ分子と比較して、本開示のｄｓＲＮＡ分子の活性がたとえ低減したとしても、分子の改善した安定性または送達によって、置換または修飾されたｄｓＲＮＡ分子の全般的な活性は、天然のＲＮＡ分子のそれよりも大きくなり得る。ｍｄＲＮＡ構造は、低減したインターフェロン応答につながる場合があり、そして置換および修飾されたｄｓＲＮＡは、例えばヒトにおいて、インターフェロン応答の活性化の可能性を最小限にすることもできる。

【0092】

特定の態様においては、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、５−メチルウリジンもしくは２−チオリボチミジンで置換もしくは置き換えられたｄｓＲＮＡの第１の（アンチセンス）鎖の、少なくとも１つのウリジン、少なくとも３つのウリジン、またはありとあらゆるウリジン（すなわち、全てのウリジン）を有する。関連する態様においては、本開示のｄｓＲＮＡ分子もしくはそのアナログは、５−メチルウリジンもしくは２−チオリボチミジンで置換もしくは置き換えられたｄｓＲＮＡの第２の（センス）鎖の、少なくとも１つのウリジン、少なくとも３つのウリジン、またはありとあらゆるウリジンを有する。さらなる別の態様においては、本開示のｄｓＲＮＡ分子もしくはそのアナログは、５−メチルウリジンもしくは２−チオリボチミジンで置換もしくは置き換えられたｄｓＲＮＡの第１（アンチセンス）と第２（センス）の両鎖の、少なくとも１つのウリジン、少なくとも３つのウリジン、またはありとあらゆるウリジンを有する。いくつかの態様においては、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域は、少なくとも３つの５−メチルウリジンまたは２−チオリボチミジンを有する。特定の態様においては、ｄｓＲＮＡ分子は、１本の鎖、両鎖、またはそれらの任意の組み合わせにおけるヌクレオチド位置の約５％〜約９５％で、リボヌクレオチドを含む。

【0093】

さらなる態様においては、本開示に記載のＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させるｄｓＲＮＡ分子は、１つ以上の天然または合成の非標準ヌクレオシドをさらに含む。関連する態様においては、非標準ヌクレオシドは、１つ以上のデオキシウリジン、Ｌ−もしくはＤ−ロックされた核酸（ＬＮＡ）分子（例えば、５−メチルウリジンＬＮＡ）もしくは置換ＬＮＡ（例えば、ピレンを有する）、または万能結合性（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ）ヌクレオチド、またはＧ形クランプ、またはこれらの任意の組み合わせである。特定の態様においては、万能結合性ヌクレオチドは、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル、イノシン、アゾールカルボキサミド、１−β−Ｄ−リボフラノシル−４−ニトロインドール、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、１−β−Ｄ−リボフラノシル−６−ニトロインドール、または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールであり得る。

【0094】

ｄｓＲＮＡ分子中に存在する、好ましくはアンチセンス鎖中に存在する、しかしながらまたセンス鎖中もしくはアンチセンス鎖とセンス鎖の両鎖中に存在してもよい置換または修飾ヌクレオチドは、本開示に記載の修飾されたまたは置換されたヌクレオチドを含み、天然もしくは標準リボヌクレオチドと同様の特性または特徴を有する。例えば、本開示は、ノーザンコンホメーション（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（例えば、ノーザン擬回転サイクル、例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４参照）を有するヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を特筆している。それ自体、本開示のｄｓＲＮＡ分子中に存在する、好ましくはアンチセンス鎖中に存在する、しかしながらまたセンス鎖中もしくはアンチセンス鎖とセンス鎖の両鎖中に存在してもよい置換または修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に耐性である一方で同時に、ＲＮＡｉを仲介する能力を維持している。ノーザン構造（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有するヌクレオチドの例には、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’メチル−チオ−エチル、２’デオキシ−２’フルオロヌクレオチド、２’デオキシ−２’クロロヌクレオチド、２’アジドヌクレオチド、５−メチルウリジン、または２’Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。特定の態様においては、ＬＮＡは、５−メチルウリジンＬＮＡまたは２−チオリボチミジンＬＮＡである。これらのいずれの態様においても、１つ以上の置換または修飾ヌクレオチドが、Ｇ形クランプであり得る（例えば、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン等のグアニンにさらなる水素結合を結合するシトシンアナログ；例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｅｕｃｃｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：８５３１，１９９８参照）。

【0095】

本明細書に記載の通り、本開示が提供するｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログの、第１の鎖および１本以上の第２の鎖は、共にアニールまたはハイブリダイズして（すなわち、鎖間の相補性により）、約４〜約１０塩基対、約５〜約１３塩基対、または約１５〜約４０塩基対の長さを有する二本鎖領域を少なくとも１つ形成することができる。いくつかの態様においては、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２４塩基対または約１９〜約２３塩基対の長さ範囲の二本鎖領域を、少なくとも１つ有する。別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約２６〜約４０塩基対または約２７〜約３０塩基対または約３０〜約３５塩基対の長さ範囲の二本鎖領域を、少なくとも１つ有する。別の態様においては、本開示のｄｓＲＮＡ分子の２本以上の鎖は、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子よって、共有結合的に連結されてよい。

【0096】

特定の態様においては、ｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、１つのデオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えば、チミジン、アデニン）を含むオーバーハング等の、１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを、ｄｓＲＮＡの３’−末端の片末端もしくは両末端上に含む。特定の態様においては、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む３’−末端は、ｍｄＲＮＡ分子中にあり、ギャップ中、ギャップ外、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかにある。特定の態様においては、ｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、ｄｓＲＮＡの片末端または両末端に、平滑末端を有する。特定の態様においては、第１の鎖または第２の鎖の５’−末端がリン酸化されている。本明細書で記載のｄｓＲＮＡ分子のいずれの態様においても、３’−末端ヌクレオチドのオーバーハングは、核酸の糖、塩基、もしくは骨格で化学的に修飾されている、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載のｄｓＲＮＡ分子のいずれの態様においても、３’−末端ヌクレオチドのオーバーハングは、万能塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）リボヌクレオチドを１つ以上含み得る。本明細書に記載のｄｓＲＮＡ分子のいずれの態様においても、３’−末端ヌクレオチドのオーバーハングは、非環式ヌクレオチドを１つ以上含み得る。本明細書に記載のｄｓＲＮＡ分子のいずれの態様においても、ｄｓＲＮＡはさらに、５’リン酸（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１０：５６３，２００２；および Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：５３７，２００２を参照のこと）または５’３’二リン酸等の末端リン酸基を含み得る。

【0097】

本明細書で説明の通り、１つ以上の標的遺伝子の発現を、例えばＲＮＡｉによって減少させる、本開示のｄｓＲＮＡの末端構造は、平滑末端または１つ以上のオーバーハングのいずれかを有してよい。特定の態様においては、オーバーハングは、３’末端または５’末端にあってよい。オーバーハングを有するｄｓＲＮＡの合計の長さは、対形成した二本鎖部分の長さとオーバーハングしているヌクレオチドとの合計として表わされる。例えば、１９塩基対のｄｓＲＮＡが両末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを有する場合、全長は２１−ｍｅｒと表わされる。さらに、オーバーハング配列は標的遺伝子の１つ以上に対して低い特異性を有する場合があるため、標的遺伝子配列に相補的（アンチセンス）または同一（センス）である必要はない。さらなる態様においては、ＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させる、本開示のｄｓＲＮＡはさらに、例えばｄｓＲＮＡのオーバーハング部分の１つ以上において、低分子量の構造（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡ等の天然ＲＮＡ分子、または人工ＲＮＡ分子）を含んでよい。

【0098】

さらなる態様においては、本開示に記載のＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させるｄｓＲＮＡ分子は、例えば２’−デオキシ、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、ハロゲン、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アリル等、またはこれらの任意の組み合わせといった、２’−糖置換を含む。なおさらなる態様においては、本開示に記載のＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させるｄｓＲＮＡ分子は、第１の鎖の片末端もしくは両末端、または第２の鎖の片末端もしくは両末端上に、アルキル、無塩基デオキシ、無塩基グリセリル、ジヌクレオチド非環式ヌクレオチド、逆位デオキシヌクレオチド部分もしくはそれらの任意の組み合わせ等の、末端キャップ置換基をさらに含む。特定の態様においては、二本鎖領域内のセンス鎖の少なくとも１つまたは２つの５’−末端リボヌクレオチドが、２’−糖置換を有する。特定の別の態様においては、二本鎖領域内のアンチセンス鎖の少なくとも１つまたは２つの５’−末端リボヌクレオチドが、２’−糖置換を有する。特定の態様においては、二本鎖領域内のセンス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも１つまたは２つの５’−末端リボヌクレオチドが、２’−糖置換を有する。

【0099】

別の態様においては、本開示に記載のＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させるｄｓＲＮＡ分子は、リボシル、２’−デオキシリボシル、テトロフラノシル（例えば、Ｌ−α−トレオフラノシル）、ヘキソピラノシル（例えば、β−アロピラノシル、β−アルトロピラノシル、およびβ−グルコピラノシル）、ペントピラノシル（例えば、β−リボピラノシル、α−リキソピラノシル、β−キシロピラノシル、およびα−アラビノピラノシル）、炭素環式の（炭素のみの環）アナログ、ピラノース、フラノース、モルフォリノ、またはそれらのアナログもしくは誘導体の、任意の組み合わせを含む、糖骨格中に、１つ以上の置換を含む。

【0100】

さらなる別の態様においては、本開示に記載のＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させるｄｓＲＮＡ分子は、独立して、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸、アルキルホスホン酸、３’−アルキレンホスホン酸、５’−アルキレンホスホン酸、キラルホスホン酸、ホスホノアセテート、チオホスホノアセテート、ホスフィン酸塩、ホスホラミデート、３’−アミノホスホラミデート、アミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホン酸、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸、ボラノリン酸結合、またはそれらの任意の組み合わせ等の、修飾されたヌクレオシド間結合を少なくとも１つ含む。

【0101】

修飾されたヌクレオチド間結合は、本明細書で記載の通り、例えば、センス鎖中、アンチセンス鎖中、両鎖中、または複数の鎖中（例えば、ｍｄＲＮＡ中）といった、本開示のｄｓＲＮＡ分子の１本以上の鎖中に存在し得る。本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の、もしくはアンチセンス鎖の、もしくは両鎖の、３’−末端、５’−末端、もしくは３’−と５’−の両末端に、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合を含み得る。ある態様においては、ＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させることが可能なｄｓＲＮＡ分子は、３’−末端に、ホスホロチオエート結合等のヌクレオチド間結合を１つ有する。例えば、本開示は、１本のｄｓＲＮＡ鎖中に約１〜約８またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、ＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させることが可能なｄｓＲＮＡ分子を提供する。さらに別の態様においては、本開示は、両方のｄｓＲＮＡ鎖中に約１〜約８またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、ＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させることが可能なｄｓＲＮＡ分子を提供する。別の態様においては、本開示の典型的なｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、両鎖、もしくは複数の鎖の５’−末端に、約１〜約５またはそれ以上の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。別の実施例においては、本開示の典型的なｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖中、アンチセンス鎖中、２本の鎖中、または複数の鎖中に、１つ以上のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。さらに別の実施例においては、本開示の典型的なｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖中、アンチセンス鎖中、２本の鎖中、または複数の鎖中に、１つ以上のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。

【0102】

本開示のｄｓＲＮＡにおいて有用な、多くの典型的な修飾されたヌクレオチド塩基またはそれらのアナログは、５−メチルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの、６−メチル、２−プロピル、もしくはその他のアルキル誘導体；８−置換アデニンおよびグアニン（例えば、８−アザ、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル等）；７−メチル、７−デアザ、および３−デアザアデニンならびにグアニン；２−チオウラシル；２−チオチミン；２−チオシトシン；５−メチル、５−プロピニル、５−ハロ（例えば、５−ブロモもしくは５−フルオロ）、５−トリフルオロメチル、またはその他の５−置換ウラシルおよびシトシン；ならびに、６−アゾウラシルを含む。さらなる有用なヌクレオチド塩基は、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８，２００３；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２９７，２０００；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０；米国特許第３，６８７，８０８号、および同様の参考文献に見出すことができる。

【0103】

特定のヌクレオチド塩基部分は、本開示のｄｓＲＮＡ分子の、相補的なする標的に対する結合親和性の増加において、特に有用である。これら塩基部分には、５−置換ピリミジン；６−アゾピリミジン；ならびにＮ−２、Ｎ−６、またはＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン等）が含まれる。さらに、例えば、５−メチルウリジンおよび５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を増加させることが知られており、修飾もしくは置換ｄｓＲＮＡに対して所望のヌクレアーゼ耐性を提供する、２’−糖置換（例えば、２’−メトキシもしくは２’−メトキシエチル）またはヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わされ得る。

【0104】

本開示の別の局面においては、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な第１の鎖、またはそれらの任意の組み合わせ、および第１の鎖に相補的な第２の鎖を含む、１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させるｄｓＲＮＡが提供され、ここで、第１と第２の鎖は、約１５〜約４０塩基対の二本鎖領域を形成し、ここで、ｄｓＲＮＡのピリミジンの少なくとも１つが、式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドで置換される。

【0105】

式中、Ｒ^１とＲ^２は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ハロゲン、置換もしくは非置換のＣ_１−Ｃ_１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル，アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは非置換のＣ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換もしくは非置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３、置換もしくは非置換のＣ_２−Ｃ_１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−Ｃ≡、またはヘテロシクロ基であり；Ｒ^３とＲ^４は、それぞれ独立して、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、またはヌクレオシド間結合基であり；Ｒ^５とＲ^８は独立して、ＯまたはＳである。特定の態様においては、少なくとも１つのヌクレオシドが式Ｉに記載で、Ｒ^１がメチルでＲ^２が−ＯＨ、あるいはＲ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨでＲ^８がＳである。別の態様においては、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０ヌクレオシドで共有結合的に連結する。

【0106】

特定の態様においては、ＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させ、かつ式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドで置換されているピリミジンを少なくとも１つ有する、ｄｓＲＮＡの第１の鎖および１本以上の第２の鎖は、共にアニールまたはハイブリダイズして（すなわち、鎖間の相補性により）、１つの長さもしくは合計の長さが約１５〜約４０塩基対を有する二本鎖領域を少なくとも１つ形成することができる。いくつかの態様においては、ｄｓＲＮＡは、約４〜約１０塩基対または約５〜約１３塩基対または約１５〜約２５塩基対または約１９〜約２３塩基対の長さ範囲の二本鎖領域を、少なくとも１つ有する。別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約２６〜約４０塩基対または約２７〜約３０塩基対または約３０〜約３５塩基対の長さ範囲の二本鎖領域を、少なくとも１つ有する。特定の態様においては、ｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、１つのデオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えば、チミジン）を含むオーバーハング等の、１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを、３’−末端の片末端もしくは両末端上に含む。いくつかの態様においては、ｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、ｄｓＲＮＡの片末端または両末端に平滑末端を有する。特定の態様においては、第１の鎖のまたは第２の鎖の５’−末端は、リン酸化されている。

【0107】

特定の態様においては、Ｒ^１の少なくとも一つが、メチルまたはエチル等のＣ_１−Ｃ_５アルキルである。本開示の別の典型的な態様の範囲内においては、式Ｉの化合物は５−アルキルウリジン（すなわち、Ｒ^１はアルキル、Ｒ^２は−ＯＨ、そしてＲ^３、Ｒ^４、ならびにＲ^５は本明細書で定義の通り）であり、あるいは、式ＩＩの化合物は５−アルキルシチジン（すなわち、Ｒ^１はアルキル、Ｒ^２は−ＯＨ、そしてＲ^３、Ｒ^４、ならびにＲ^５は本明細書で定義の通り）である。関連する態様においては、５−アルキルウリジンは５−メチルウリジン（リボチミジンまたは「ｔ」もしくは「Ｔ」とも称される。すなわち、Ｒ^１はメチルでＲ^２は−ＯＨである）であり、５−アルキルシチジンは５−メチルシチジンである。別の態様においては、ｄｓＲＮＡの第１の鎖のウリジンの、少なくとも１つ、少なくとも３つ、もしくは全てが、５−メチルウリジンで置換され、または、ｄｓＲＮＡの第２の鎖のウリジンの、少なくとも１つ、少なくとも３つ、または全てが、５−メチルウリジン、で置換され、あるいはこれらの任意の組み合わせ（たとえば、そのような変更が両鎖において行われる）である。特定の態様においては、式Ｉまたは式ＩＩのピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つが、ＳであるＲ^５またはＳであるＲ^８を有する。

【0108】

さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡのピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つは、二環式の糖の形態でロックされた核酸（ＬＮＡ）であり、ここで、Ｒ^２は酸素で、２’Ｏと４’Ｃは同じリボース環上に、１つのオキシメチレン架橋を形成する。ある関連する態様においては、ＬＮＡは、５−メチルウリジンＬＮＡまたは２−チオ−５−メチルウリジン等の、塩基置換を含む。別の態様においては、ｄｓＲＮＡの第１の鎖のウリジンの、少なくとも１つ、少なくとも３つ、もしくは全てが、５−メチルウリジンもしくは２−チオリボチミジンもしくは５−メチルウリジンＬＮＡまたは２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡで置換され、または、ｄｓＲＮＡの第２の鎖のウリジンの、少なくとも１つ、少なくとも３つ、もしくは全てが、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、５−メチルウリジンＬＮＡ、２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせで置換される（例えば、そのような変更が両鎖において行われる、または、いくつかの置換が、５−メチルウリジンのみ、２−チオリボチミジンのみ、５−メチルウリジンＬＮＡのみ、２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡのみ、または１つ以上の５−メチルウリジンもしくは２−チオリボチミジンと１つ以上の５−メチルウリジンＬＮＡもしくは２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡを含む）。

【0109】

さらなる態様においては、ピリミジンヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合のリボースは、任意に修飾され得る。例えば、式Ｉまたは式ＩＩの化合物が提供され、ここで、Ｒ^２は２’Ｏ−メチル置換等（例えば、それぞれ、５−アルキルウリジンまたは５−アルキルシチジンに追加され得る）のアルコキシである。特定の態様においては、Ｒ^２は、２’Ｏ−（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル、２’Ｏ−メチル、２’ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、２’ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’Ｏ−アリル、または２’−フルオロから選択される。さらなる態様においては、１つ以上のピリミジンヌクレオシドは式Ｉに記載で、Ｒ^１はメチルでＲ^２は２’Ｏ−（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル（例えば、２’Ｏ−メチル）であり、あるいは、Ｒ^１はメチル、Ｒ^２は２’Ｏ−（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル（例えば、２’Ｏ−メチル）、そしてＲ^５もしくはＲ^８はＳ、またはそれらの任意の組み合わせ、である。別の態様においては、式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドの１つ以上もしくは少なくとも２つが、−Ｈまたは−ＯＨでないＲ^２を有し、３’−末端または５’−末端で導入されて、これはｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域内の１本以上の鎖のギャップ内ではない。

【0110】

さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、Ｒ_２が−Ｈもしくは−ＯＨでない式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドおよびオーバーハングを含み、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域内の１本の鎖または２本の鎖の、３’−末端もしくは５’−末端もしくは両末端のいずれかで導入されるピリミジンヌクレオシドを少なくとも２つ、さらに含む。ある関連する態様においては、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖の二本鎖領域内の３’−末端または５’−末端に位置し、ここで、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つは最初に、ｄｓＲＮＡ分子の１本の鎖内に位置する。なおさらなる態様においては、オーバーハングを有するｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖の二本鎖領域内の５’−末端に導入される、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでない２つ以上のピリミジンヌクレオシドの第１のピリミジンヌクレオシド、およびｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の二本鎖領域内の５’−末端に導入される、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでない２つ以上のピリミジンヌクレオシドの第２のピリミジンヌクレオシド、を有する。これらのいずれの態様においても、置換または修飾ヌクレオチドの１つ以上は、Ｇ形クランプであり得る（例えば、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン等のグアニンにさらなる水素結合を形成する、シトシンアナログ；例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｅｕｃｃｉ，１９９８参照）。これらのいずれの態様においても、提供される１つ以上のピリミジンヌクレオシドはギャップ内にない。

【0111】

さらに別の態様においては、本開示に記載の式Ｉまたは式ＩＩの、オーバーハングを有するｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシドまたはＲ_２が−Ｈもしくは−ＯＨでない４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシドを含み、ここで、（ａ）第１のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス（第２の）鎖の二本鎖領域内の３’−末端に導入され、（ｂ）第２のピリミジンヌクレオシドは、センス（第２の）鎖の二本鎖領域内の５’−末端に導入され、（ｃ）第３のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の３’−末端に導入され、そして（ｄ）第４のピリミジンヌクレオシドは、アンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の５’−末端に導入される。これらのいずれの態様においても、提供される１つ以上のピリミジンヌクレオシドはギャップ内にない。

【0112】

さらなる態様においては、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでなく平滑末端である、式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドを含むｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、ｄｓＲＮＡ分子の１本の鎖または２本の鎖の、３’−末端もしくは５’−末端もしくは両末端のいずれかで導入されるピリミジンヌクレオシドを少なくとも２つ、さらに含む。ある関連する態様においては、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ分子の１本以上の鎖の二本鎖領域内の３’−末端または５’−末端に位置し、ここで、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つは最初に、ｄｓＲＮＡ分子の１本の鎖内に位置する。なおさらなる態様においては、平滑末端であるｄｓＲＮＡ分子またはそのアナログは、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端で導入される、Ｒ^２が−Ｈもしくは−ＯＨでない少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドの第１のピリミジンヌクレオシド、およびｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’−末端で導入される、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドの第２のピリミジンヌクレオシド、を有する。これらのいずれの態様においても、提供される１つ以上のピリミジンヌクレオシドはギャップ内にない。

【0113】

さらに別の態様においては、式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドを含み、平滑末端であるｄｓＲＮＡ分子は、４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシドまたはＲ_２が−Ｈもしくは−ＯＨでない４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシドを含み、ここで、（ａ）第１のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス（第２の）鎖の二本鎖領域内の３’−末端に導入され、（ｂ）第２のピリミジンヌクレオシドは、センス（第２の）鎖の二本鎖領域内の５’−末端に導入され、（ｃ）第３のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の３’−末端に導入され、そして（ｄ）第４のピリミジンヌクレオシドは、アンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の５’−末端に導入される。これらのいずれの態様においても、提供される１つ以上のピリミジンヌクレオシドはギャップ内にない。

【0114】

なおさらなる態様においては、本開示に記載の式Ｉまたは式ＩＩのｄｓＲＮＡもしくはそのアナログは、第１の鎖または第２の鎖の片末端もしくは両末端に、アルキル、無塩基デオキシ、無塩基グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、逆位デオキシヌクレオチド部分、またはそれらの任意の組み合わせ等の末端キャップ置換基を、さらに含む。さらなる態様においては、少なくとも１つのヌクレオシド間結合が任意に修飾され得る。例えば、本開示に記載の式ＩまたはＩＩのｄｓＲＮＡ分子もしくはそのアナログ、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸、アルキルホスホン酸、３’−アルキレンホスホン酸、５’−アルキレンホスホン酸、キラルホスホン酸、ホスホノアセテート、チオホスホノアセテート、ホスフィン酸塩、ホスホラミデート、３’−アミノホスホラミデート、アミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホン酸、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸、ボラノリン酸結合、またはそれらの任意の組み合わせ、に修飾される。

【0115】

さらなる別の態様においては、ＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させる、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な第１の鎖、またはそれの任意の組み合わせ、および第１の鎖に相補的な２本以上の第２の鎖を含む、ニックまたはギャップの入ったｄｓＲＮＡ分子（それぞれ、ｎｄｓＲＮＡまたはｇｄｓＲＮＡ）が提供され、ここで、第１の鎖と少なくとも１本の第２の鎖は、約５〜約１３塩基対の非重複二本鎖領域を形成する。前述の置換または修飾のいずれも、同様に、本態様の範囲内であると意図される。

【0116】

本開示の別の典型例においては、少なくとも２つの置換ピリミジンヌクレオシドを含むｄｓＲＮＡは、それぞれ独立して選択され得て、ここでＲ^１は、アルキル（例えば、メチル）、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アルカノイロキシ、アリール、アロイル、アラルキル、二トリル、ジアルキルアミノ、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボニル、アルカノイルアミノ、カルバモイル、カルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、またはヘテロシクロ基等の、本明細書で意図する任意の化学修飾または置換を含む。２つ以上の修飾リボヌクレオチドが存在する場合、修飾リボヌクレオチドはそれぞれ独立して、Ｒ^１もしくはＲ^２において、同一のもしくは異なる修飾または置換を有するように修飾され得る。

【0117】

別の詳細な態様においては、式Ｉまたは式ＩＩに記載の１つ以上のピリミジンヌクレオシドは、本開示のｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれかまたは両鎖上で、上記の１つもしくは複数の末端位置または複数の非末端（「内部的」）位置のいずれかもしくは組み合わせを含む、任意のヌクレオチド位置またはリボヌクレオチド位置の任意の組み合わせにおいて、位置し得る。これに関して、センス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれは、約１〜約６またはそれ以上の置換ヌクレオチドを導入し得る。

【0118】

特定の態様においては，２つ以上の置換ミリミジンヌクレオシドが本開示のｄｓＲＮＡ内に導入される場合、該置換ピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つは、片鎖もしくは両鎖の３’−末端または５’−末端で存在し、特定の態様においては、該置換ピリミジンヌクレオシドの少なくとも１つは、片鎖もしくは両鎖の５’−末端で存在するであろう。別の態様においては、置換ピリミジンヌクレオシドは、本明細書に記載の通り、同族ｍＲＮＡを標的とするための相同配列として構築される修飾されていないｄｓＲＮＡ中のピリミジンの位置に相当する位置にある。

【0119】

加えて、本開示のｄｓＲＮＡの末端構造は、ｄｓＲＮＡ分子の片側の末端がリンカー核酸（例えば、リンカーＲＮＡ）で接続されるステム−ループ構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有してもよい。二本鎖領域（ステム−ループ部位）の長さは、例えば、約１５〜約４９塩基対（ｂｐ）、約１５〜約３５ｂｐ、または約２１〜約３０ｂｐの長さであり得る。代わりに、標的細胞中で発現されるｄｓＲＮＡの最終転写産物である二本鎖領域の長さは、例えば、およそ約１５〜約４９ｂｐ、約１５〜約３５ｂｐ、または約２１〜約３０ｂｐの長さであり得る。リンカー断片が用いられる場合、ステム−ループ構造のステム部位における対形成を妨げない限り、リンカーの長さに具体的な限定はない。例えば、ステム部位の安定した対形成およびこの部をコードするＤＮＡ間の組み換えの抑制のためには、リンカー部位はクローバー型のｔＲＮＡ構造を有してもよい。仮にリンカーがステム部位の対形成を妨げるであろう長さを有する場合でも、例えば、前駆体ＲＮＡから成熟ＲＮＡへのプロセス中にイントロンが切除され、これによりｓｔｅｍ部位の対形成が可能となるように、イントロンを含むリンカー部位を構築することが可能である。ステム−ループ型ｄｓＲＮＡ場合、ループ構造を持たないＲＮＡのいずれかの末端（ヘッド（ｈｅａｄ）またはテール（ｔａｉｌ））は、低分子量ＲＮＡを有してよい。上に記載の通り、これらの低分子量ＲＮＡは、ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡもしくはＲＮＡ等の天然のＲＮＡ分子または人工のＲＮＡ分子を含んでよい。

【0120】

ｄｓＲＮＡ分子は、１つの環状核酸分子で構成されてよく、ここでｄｓＲＮＡは、約１８〜約２３塩基対（例えば、約１９〜約２１）を有する、長さ約３８〜約７０ヌクレオチドであり、ここで環状オリゴヌクレオチドは、約１９塩基対と２つのループを有するダンベル型構造（ｄｕｍｂｂｅｌｌ ｓｈａｐｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成する。特定の態様においては、環状ｄｓＲＮＡ分子は２つのループモチーフを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子の一方のまたは両方のループ部位は、生分解性である。たとえば、本開示のある環状ｄｓＲＮＡ分子は、インビボでのｄｓＲＮＡ分子のループ部位の分解が、約１〜約４の（不対）ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハング等の３’末端オーバーハングを備える二本鎖ｄｓＲＮＡ分子を生成できるように設計されている。

【0121】

本開示に記載のｄｓＲＮＡへ置換するピリミジンヌクレオシドは、例えば、５’エキソ核酸分解または３’エキソ核酸分解等のエキソ核酸分解（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の、酵素的分解に対する耐性を増加させるように選択可能である。本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、それ自体として、標準ヌクレオチドを有する相当するｄｓＲＮＡと比較して、酵素的分解に対して有意な耐性を示し、それによって、生理的環境（例えば、真核標的細胞に導入された場合）において、より優れた安定性、増加した半減期、およびより優れたバイオアベイラビリティを保有するであろう。エキソ核酸分解に対する置換または修飾ｄｓＲＮＡの増加した耐性に加えて、式Ｉまたは式ＩＩに記載の１つ以上のピリミジンヌクレオシドの組み入れは、これらの分子を、他の置換もしくは修飾を含まない同一のｄｓＲＮＡよりもより安定でバイオアベイラブル（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ）にさせるｄｓＲＮＡを提供するであろう。本開示の関連する局面においては、本明細書に記載のｄｓＲＮＡの置換または修飾は、修飾ｄｓＲＮＡを生物試料と、例えば哺乳類細胞、細胞内区画、血清もしくはその他の細胞外液、組織、あるいは他のインビトロもしくはインビボの生理的区画または環境と接触させる、研究、診断および治療方法内で使用する修飾ｄｓＲＮＡの安定性を、改善させるように選択される。ひとつの態様においては、診断は単離された生物試料に行われる。別の態様においては、診断方法はインビトロで行われる。さらなる態様においては、診断方法は人体または動物体で（直接的に）行われない。

【0122】

置換または修飾ｄｓＲＮＡの安定性の増加に加えて、遺伝子サイレンシング用に設計されたｄｓＲＮＡ中での式Ｉまたは式ＩＩに記載の１つ以上のピリミジンヌクレオシドの組み入れは、相当する非修飾のｄｓＲＮＡに比較して、置換または修飾ｄｓＲＮＡの融点の上昇を含む、さらなる所望の機能的結果をもたらすために使用可能である。ｄｓＲＮＡのかように上昇した融点により、対象の置換または修飾はしばしば、（通常起こるであろう、そしてｄｓＲＮＡを特定のエキソヌクレアーゼによる分解に対してより脆弱にさせるであろう）置換または修飾ｄｓＲＮＡの部分的デハイブリダイゼーション（ｄｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の発生もしくは程度を、遮断または低減し、それにより、置換または修飾ｄｓＲＮＡの安定性を増加させるであろう。

【0123】

本開示の別の局面においては、ｍｄＲＮＡ構造は、ｍｄＲＮＡを生物試料と接触させる際（例えば、潜在的な特異的および非特異的標的として存在する、特異的および非特異的ｍＲＮＡ種を有する標的真核細胞に導入する際）、本明細書に記載の置換または修飾で改善可能な、オフターゲット効果を低減するのために使用可能である。同様に、ｍｄＲＮＡ構造は、ｍｄＲＮＡを生物試料と接触させる際、例えば真核細胞に導入する際、本明細書に記載の置換または修飾で改善可能な、インターフェロン活性を低減するために使用可能である。したがって、本開示に記載の置換または修飾ｄｓＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）は、遺伝子サイレンシングの方法で用いられ、ここでは、置換または修飾ｄｓＲＮＡが、ニックもしくはギャップもしくは修飾が欠如している相当するｄｓＲＮＡと比較して、低減されたもしくは検出不可能なオフターゲット効果、または低減されたインターフェロン応答を示す。

【0124】

さらなる態様においては、本開示のｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の配列に相同もしくは相当するセンス（第２の）鎖を１本以上と、標的遺伝子のセンス鎖および配列に相補的はアンチセンス（第１の）鎖とを含み得る。典型的な態様においては、ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖は、式Ｉまたは式ＩＩに記載の置換された１つ以上ピリミジン組み入れる（例えば、ここでピリミジンは、１つ以上の５−メチルウリジンまたは２−チオリボチミジンで置換され、リボースは修飾されて２’−Ｏ−メチル置換を１つ以上組み入れ、もしくはそれら任意の組み合わせ）。式Ｉまたは式ＩＩに記載の、これらおよびその他の複数の置換または修飾は、ｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ活性を保持する限り、ｄｓＲＮＡの片鎖もしくは両鎖に存在する、１つ以上のピリミジンまたはそれら任意の組み合わせおよび全てのピリミジンにも、導入可能である。

【0125】

本明細書で記載のいずれの態様においても、ｄｓＲＮＡは複数の修飾を含んでよい。例えば、少なくとも１つのリボチミジンまたは２−チオリボチミジンを有するｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのＬＮＡ、２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−デオキシ、ホスホロチオエート結合、逆位塩基末端キャップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃａｐ）、またはこれらの任意の組み合わせ、をさらに含んでよい。特定の態様においては、ｄｓＲＮＡは、ウリジンの１つ〜全てがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下のＬＮＡ置換を有するであろう。別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、ウリジンの１つ〜全てがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下の２’−メトキシ置換を（そしてアルゴノート切断部位においてではなく）有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、ウリジンの１つ〜全てがリボチミジンで置換されていて、約１００％以下の２’−フルオロ置換を有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、ウリジンの１つ〜全てがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下のＬＮＡ置換を有し、約７５％以下の２’−メトキシ置換を有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下のＬＮＡ置換を有し、約１００％以下の２’−フルオロ置換を有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下のＬＮＡ置換を有し、約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下の２’−メトキシ置換を有し、約１００％以下の２’−フルオロ置換を有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下の２’−メトキシ置換を有し、約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。さらに別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約１００％以下の２’−フルオロ置換を有し、約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。

【0126】

さらなる複数の修飾の態様においては、ｄｓＲＮＡは、１つ〜全てのウリジンがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下のＬＮＡ置換および７５％以下の２’−メトキシ置換を有するであろう。なおさらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、１つ〜全てのウリジンがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下のＬＮＡ置換および約１００％以下の２’−フルオロ置換を有するであろう。さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、１つ〜全てのウリジンがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下のＬＮＡ置換および約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、１つ〜全てのウリジンがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下の２’−メトキシ置換および約７５％以下の２’−フルオロ置換を有するであろう。さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、１つ〜全てのウリジンがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下の２’−メトキシ置換および約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、１つ〜全てのウリジンがリボチミジンで置換されていて、約１００％以下の２’−フルオロ置換および約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。なおさらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、１つ〜全てのウリジンがリボチミジンで置換されていて、約７５％以下のＬＮＡ置換、約７５％以下の２’−メトキシ、約１００％以下の２’−フルオロ、および約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。別の態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下のＬＮＡ置換、約７５％以下の２’−メトキシ置換、および約１００％以下の２’−フルオロ置換を有するであろう。さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下のＬＮＡ置換、約７５％以下の２’−メトキシ置換、および約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。さらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下のＬＮＡ置換、約１００％以下の２’−フルオロ置換、および約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。なおさらなる態様においては、ｄｓＲＮＡは、約７５％以下の２’−メトキシ、約１００％以下の２’−フルオロ、および約７５％以下の２’−デオキシ置換を有するであろう。

【0127】

これら複数の修飾の態様のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、１００％以下のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合、１〜１０もしくはそれ以上の逆位塩基末端キャップ、またはそれらの任意の組み合わせ、をさらに含んでよい。加えて、これら複数の修飾の態様のいずれも、１本の鎖、２本の鎖、３本の鎖、複数の鎖、または全ての鎖上に、これら複数の修飾を有してよい。最後に、これら複数の修飾ｄｓＲＮＡのいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは遺伝子サイレンシングの活性を保持しなければならない。

【0128】

特定の局面の範囲内では、本開示は、ＲＮＡｉによって１つ以上の標的遺伝子の発現を減少させるｄｓＲＮＡ、およびｄｓＲＮＡを１つ以上含む組成物を提供し、ここで、少なくとも１つのｄｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖のアンチコドン中の第１の、第２の、もしくは第３の位置において、１つ以上の万能結合ヌクレオチドを含み、さらにここで、ｄｓＲＮＡは、標的細胞よって発現されるＲＮＡ等の１つ以上の標的配列に特異的に結合することができる。ここで標的ＲＮＡの配列が１つ以上の単独のヌクレオチド置換を含む場合、万能結合ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合する能力を保持し、それによって遺伝子サイレンシングを仲介し、結果として、ｄｓＲＮＡに仲介される遺伝子サイレンシングからの標的の逸脱を克服する。本明細書で開示される組成物および方法において好適に用いられてもよい万能結合ヌクレオチドの限定されない例には、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、および１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが含まれる。本開示の目的のためには、万能結合ヌクレオチドは、１種類以上のヌクレオチドと水素結合されたヌクレオチド対を形成できるヌクレオチドである。

【0129】

上記の組成物の限定されない例として、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖のアンチコドン内において、チロシン（ＡＵＡ）もしくはフェニルアラニン（ＡＡＡかＧＡＡ）、システイン（ＡＣＡかＧＣＡ）、ヒスチジン（ＡＵＧかＧＵＧ）、アスパラギン（ＡＵＵかＧＵＵ）、イソロイシン（ＵＡＵ）およびアスパラギン酸（ＡＵＣかＧＵＣ）のためのアンチコドンを修飾することが含まれる。

【0130】

例えば、特定の態様の範囲内において、ＡＵＡが同族コドンであるイソロイシンのアンチコドンＵＡＵは、第３位置のウリジン（Ｕ）ヌクレオチドが万能結合ヌクレオチドであるイノシンＩで置換されてアンチコドンＵＡＩを作成するように、修飾されてよい。イノシンは、アデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、およびシチジン（Ｃ）ヌクレオチドと対形成できるが、グアノシン（Ｇ）とは対形成しない、典型的な万能結合ヌクレオチドである。この修飾されたアンチコドンＵＡＩは、ｄｓＲＮＡ分子の特異的結合能力を増加させ、したがって、コードする鎖の相当する位置にＡＵＡ、ＵＵＡ、およびＣＵＡのいずれか１つを有するｍＲＮＡとｄｓＲＮＡの対形成を可能にし、それによってｄｓＲＮＡが特異的に結合してもよい、有用なＲＮＡ分解標的の数を増大させる。

【0131】

代わりに、アンチコドンＡＵＡはまたもしくは選択的に、ＵＡＩ（第３の位置の置換）またはＵＩＵ（第２の位置の置換）で表わされるアンチコドンが、ＡＵＡ、ＣＵＡおよびＵＵＡ、ならびに、ＡＡＡ、ＡＣＡおよびＡＵＡに特異的結合が可能なｄｓＲＮＡを生成するように、アンチコドンの第３もしくは第２の位置で、万能結合ヌクレオチドの置換によって修飾されてもよい。

【0132】

特定の局面においては、本明細書で開示のｄｓＲＮＡは、約１個の万能結合ヌクレオチド〜約１０個の万能結合ヌクレオチドを含み得る。特定の局面の範囲内においては、本開示のｄｓＲＮＡは、他の相補的なｄｓＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖の、１以上のヌクレオチドが、１つ以上の万能結合ヌクレオチドで置換されるという条件で、少なくとも１つの標的遺伝子の１つの配列に相同なセンス鎖およびセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖を含んでよい。

【0133】

背景技術として、サイレンシング複合体内において、ｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡと相互作用または結合できるように位置する。ＲＩＳＣは、あらゆる任意の時点において典型的な細胞中にある何千もの異なるＲＮＡと遭遇するであろう。しかしながら、ＲＩＳＣ中に装填されたｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖と近い相補性を有する標的ＲＮＡと、特異的にアニールするだろう。したがって、ウイルス感染に対するインターフェロン応答とは異なり、サイレンシング複合体は、標的ＲＮＡの同定において非常に選択的である。ＲＩＳＣは、捕えた標的ＲＮＡ鎖を切断し、ＲＮＡの２つの断片をリリースし（この時点でタンパク質合成へ方向付けることがが不可能になる）、次へと進む。ＲＩＳＣそれ自身は無傷のままで、さらなる標的ＲＮＡ分子を見つけて切断することが可能である。

【0134】

１つ以上の万能結合ヌクレオチドが置換される位置に関わらず、ｄｓＲＮＡ分子は標的遺伝子およびその１つ以上の変異体に結合が可能であり、それによって、ダイサーまたはＲＩＳＣを介して標的遺伝子もしくはその変異体の分解を促進できることが、理化されるであろう。したがって、本開示のｄｓＲＮＡは、細胞に導入し、１つ以上の標的遺伝子またはそれらの変異体の、標的とされる転写後の遺伝子サイレンシングを仲介するのに好適である。ｄｓＲＮＡが細胞に挿入される際、ｄｓＲＮＡ二重鎖はその後巻き戻され、アンチセンス鎖はｍＲＮＡとアニールしてダイサー基質を形成し、あるいは、アンチセンス鎖はタンパク質の集合へと装填されてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。

【0135】

ギャップまたはニックの入ったｄｓＲＮＡ分子の合成
本開示の代表的な分子は、組み換え技術によって生成される、化学的に合成される、またはこれらの組み合わせである。オリゴヌクレオチド（例えば、特定の修飾されたオリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠いているオリゴヌクレオチドの一部）は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３，１９９２，Ｔｈｏｍｐｓｏｎらによる国際特許公開第９９／５４４５９号、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７，１９９５、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．６１：３３−４５，１９９８およびＢｒｅｎｎａｎによる米国特許第６，００１，３１１号に記載されているように、当該技術分野において既知であるプロトコルを用いて合成される。本開示の特定のｄｓＲＮＡ分子およびそのアナログを含むＲＮＡの合成は、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５，１９８７、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３，１９９０、およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７に記載されているような手順を用いて行うことができる。

【0136】

特定の態様では、本開示の核酸分子は、別々に合成し、例えばライゲーション（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：９９２３，１９９２、Ｄｒａｐｅｒらによる国際特許公開第９３／２３５６９号、Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４２４７，１９９１、Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６：９５１，１９９７、Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８：２０４，１９９７）または合成若しくは脱保護後のハイブリダイゼーションにより、合成後結合させることができる。

【0137】

更なる態様では、ＲＮＡｉにより１または２個以上の標的ファミリー遺伝子の発現を低下させる本開示のｄｓＲＮＡは、１または２種以上のｄｓＲＮＡをコードし、宿主細胞内にそれらの発現を方向づけるポリヌクレオチドベクターにより発現する、単一または複数の転写産物として作製することができる。これらの態様では、標的細胞内で発現すべきｄｓＲＮＡの最終転写産物の二本鎖部分は、例えば、約５〜約４０ｂｐ、約１５〜約２４ｂｐ、または約２５〜４０ｂｐの長さであり得る。代表的な態様では、２または３本以上の鎖が対をなしているｄｓＲＮＡの二本鎖部分は、完全に対をなすヌクレオチド断片に限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的ではない）、バルジ（１本の鎖上に、対応する相補的なヌクレオチドが欠損している）、オーバーハング等による非対部分を含有してよい。ｄｓＲＮＡ形成および機能を妨げない程度であれば、非対部分が含有されていてよい。特定の態様では、「バルジ」は、１〜２個の非対ヌクレオチドを含んでよく、２本の鎖が対をなしているｄｓＲＮＡの二本鎖部分は約１〜７または約１〜５箇所のバルジを含有してよい。更に、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分に含有された「ミスマッチ」部分は、約１〜７または約１〜５箇所のミスマッチを含んでよい。他の態様では、本開示のｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、およそ本明細書で特定する数値範囲のバルジおよびミスマッチ部分を含有してよい。

【0138】

本開示のｄｓＲＮＡまたはそのアナログは、更に、ヌクレオチド、非ヌクレオチドまたはｄｓＲＮＡのセンス領域をｄｓＲＮＡのアンチセンス領域に結合させる混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含んでよい。ひとつの態様では、ヌクレオチドリンカーは、長さ約２ヌクレオチド超、約１０ヌクレオチド以下のリンカーであり得る。別の態様では、ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであり得る。本明細書で使用するとき、「アプタマー」または「核酸アプタマー」とは、核酸分子が、自然環境で標的分子に認識される配列を含む配列を有する、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味する。あるいは、アプタマーは、自然には核酸に結合しない標的分子に結合する核酸分子である場合がある。標的分子は、いかなる対象分子であってもよい。例えば、アプタマーを用いて、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合させ、それによりタンパク質と天然リガンドとの相互作用を防ぐことができる。これは非限定的な例であり、当業者は、当該技術分野において周知である技術（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３，１９９５、Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５，２０００、Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１００，２０００、Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７，２０００、Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０，２０００およびＪａｙａｓｅｎａ，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ．４５：１６２８，１９９９参照）を用いて他の態様を容易に作りだせることを理解するであろう。

【0139】

非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）または他の高分子化合物（例えば、２〜１００個のエチレングリコールユニットを有するもののようなポリエチレングリコール類）を含んでよい。具体例としては、Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０、Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１１３，１９８７、Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４，１９９１、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５１０９，１９９１、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２５８５，１９９３、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１７５１，１９９３、Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：６３５３， １９９０、ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １０：２８７， １９９１、Ｊａｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：３０１，１９９３、Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９９１４，１９９１、Ａｒｎｏｌｄらによる国際特許公開第８９／０２４３９号、Ｕｓｍａｎらによる国際特許公開第９５／０６７３１号、Ｄｕｄｙｃｚらによる国際特許公開第９５／１１９１０号およびＦｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４０００，１９９１に記載されているものが挙げられる。更に修飾されていてもよい、本開示のｄｓＲＮＡ分子の合成は、（ａ）ｄｓＲＮＡ分子の２本の相補鎖を合成する工程と、（ｂ）ｄｓＲＮＡ分子を得るのに好適な条件下で２本の相補鎖をアニーリングする工程を含む。別の態様では、ｄｓＲＮＡ分子の２本の相補鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。更に別の態様では、ｄｓＲＮＡ分子の２本の相補鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成による。

【0140】

置換または修飾（塩基、糖、リン酸またはこれらの任意の組み合わせ）を有する核酸分子を化学合成すると、血清リボヌクレアーゼによる核酸分子の分解を妨げることができ、これは効力を高める可能性がある。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎらによる国際特許公開第９２／０７０６５号、Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５，１９９０、Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４，１９９１、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４，１９９２、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３，１９９４、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２，１９９５、Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０，１９９６、Ｂｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９−２０１０，１９９７、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：１１３１，１９９８、Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５，１９９８、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０：２９７，２０００、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８，２００３、Ｄｏｒｓｅｔｔ ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３：３１８，２００４、Ｒｏｓｓｉらによる国際特許公開第９１／０３１６２号、Ｕｓｍａｎらによる国際特許公開第９３／１５１８７号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによる国際特許公開第９７／２６２７０号、Ｗｏｏｌｆらによる国際特許公開第９８／１３５２６号、Ｓｐｒｏａｔによる米国特許第５，３３４，７１１号、Ｕｓｍａｎらによる米国特許第５，６２７，０５３号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによる米国特許第５，７１６，８２４号、Ｏｔｖｏｓらによる米国特許第５，７６７，２６４号、Ｇｏｌｄらによる米国特許第６，３００，０７４号を参照のこと。上記参考文献はそれぞれ、核酸分子の塩基、リン酸または糖部分への様々な置換および化学修飾について開示しており、これらは本明細書に記載のｄｓＲＮＡで用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチドの糖部分を修飾し、ヌクレアーゼ耐性を上昇させることにより、安定性を強化するまたは生物活性を延長することができる。このような糖修飾の代表例としては、２’アミノ、２’Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリルまたは２’−デオキシが挙げられる。したがって、本開示のｄｓＲＮＡ分子を修飾し、修飾していないｄｓＲＮＡと比較したとき、実質的に強化されたＲＮＡｉ活性を保持しながらまたは有しながら、ヌクレアーゼ耐性または二重鎖安定性を上昇させることができる。

【0141】

ヌクレアーゼ安定性および有効性の著しく強化された核酸分子に導入することができる糖、塩基およびリン酸修飾について記載している、当該技術分野における例が幾つか存在する。例えば、オリゴヌクレオチドを修飾し、例えば２’アミノ、２’Ｃ−アリル、２’フルオロ、２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾等の、ヌクレアーゼ耐性基で修飾することにより安定性または生物活性を強化する。Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴＩＢＳ １７：３４，１９９２、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１： １６３，１９９４、Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０，１９９６を参照のこと。核酸分子の糖修飾については、当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎらによる国際特許公開第９２／０７０６５号、Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５−５６８，１９９０、Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７，１９９１、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４−３３９，１９９２、Ｕｓｍａｎらによる国際特許公開第９３／１５１８７号、Ｓｐｒｏａｔによる米国特許第５，３３４，７１１号およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２，１９９５、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによる国際特許公開第９７／２６２７０号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによる米国特許第５，７１６，８２４号、Ｕｓｍａｎらによる米国特許第５，６２７，０５３号、Ｗｏｏｌｆらによる国際特許公開第９８／１３５２６号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：１１３１，１９９８、Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５，１９９８、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８並びにＢｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９−２０１０，１９９７を参照のこと）。このような刊行物には、触媒を調節することなく、核酸分子に糖、塩基またはリン酸修飾等を導入する位置を決定するための一般的な方法およびストラテジーが記載されている。このような教示を考慮して、ｄｓＲＮＡ分子の細胞内におけるＲＮＡｉを促進する能力が著しく阻害されない限り、本開示のｄｓＲＮＡ分子を修飾するために、本明細書に記載されているような同様の修飾を使用することができる。

【0142】

ひとつの態様では、本開示は、１または２個以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、モルホリノ、カルバミン酸アミデート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタル、チオホルムアセタル、またはアルキルシリルを含むリン酸骨格修飾、置換のような、置換または修飾されたｄｓＲＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾については、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，１９９５およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ，２４−３９，１９９４参照。

【0143】

別の態様では、コンジュゲート分子は、所望により、ＲＮＡｉにより１または２個以上の標的遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡまたはそのアナログに結合することができる。例えば、このようなコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、または、例えば細胞取り込みを仲介することができる細胞受容体のリガンドであってよい。本開示のｄｓＲＮＡまたはそのアナログに結合することができる、本開示により検討されるコンジュゲート分子の具体例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅらによる米国特許出願公開第２００３／０１３０１８６号（２００３年７月１０日公開）および米国特許出願公開第２００４／０１１０２９６号（２００４年６月１０日公開）に記載されている。別の態様では、コンジュゲート分子は、生分解性リンカーを介してＲＮＡｉにより１または２個以上の標的遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡまたはそのアナログに共有結合する。特定の態様では、コンジュゲート分子は、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖のいずれかの３’末端に結合することができる。別の態様では、コンジュゲート分子は、ｄｓＲＮＡまたはそのアナログのセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖のいずれかの５’末端に結合することができる。更に別の態様では、コンジュゲート分子は、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖若しくは両方の鎖のいずれかの３’末端および５’末端の両方に結合する、またはこれらの任意の組み合わせである。更なる態様では、本開示のコンジュゲート分子は、ｄｓＲＮＡまたはそのアナログの、細胞のような生物学的システムへの送達を促進する分子を含む。当業者は、様々なコンジュゲートを有する本開示のｄｓＲＮＡをスクリーニングし、ｄｓＲＮＡ−コンジュゲート複合体が、例えば本明細書で記載するまたは当該技術分野において周知であるような動物モデルにおいてＲＮＡｉを仲介する能力を維持しながら、改善された特性（例えば、薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、安定性）を有するかどうかを決定することができる。

【0144】

標的配列に特異的なｄｓＲＮＡ分子を選択する方法
上記のように、本開示はまた、１または２個以上の標的遺伝子に特異的に結合することができるが、一方非標的遺伝子には特異的に結合しないまたは最低限しか結合しないｄｓＲＮＡまたはそのアナログを選択する方法も提供する。本明細書で開示される選択プロセスは、例えば、１または２個以上の非標的遺伝子への非特異的な結合とその後の分解に起因して細胞毒性であるｄｓＲＮＡアナログを排除するのに有用である。

【0145】

本開示の方法は、ｄｓＲＮＡまたはそのアナログにより標的化される、可能な全ての遺伝子変異体の塩基配列に関する先験的知識を必要としない。ひとつの態様では、ｄｓＲＮＡの塩基配列は、１または２個以上の標的遺伝子の保存領域または共通配列から選択される。別の態様では、ｄｓＲＮＡの塩基配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡスプライス変異体内に含有される特定の配列を、選択的にまたは優先的に標的とすることができる。

【0146】

特定の態様では、ＲＮＡｉにより１または２個以上の標的遺伝子の発現を低下させる１または２個以上のｄｓＲＮＡを選択する方法であって、ｄｓＲＮＡ分子が、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはその任意の組み合わせに相補的である第１鎖と、第１鎖に相補的である第２鎖とを含み、第１および第２鎖が約１５〜約４０ｂｐの二本鎖領域を形成し、ｄｓＲＮＡ分子のウリジンの少なくとも１個が５−メチルウリジンまたは２−チオリボチミジンに置換されている方法が提供され、この方法は、本明細書で提供される１または２個以上のｄｓＲＮＡをインビボまたはインビトロのいずれかで細胞と接触させる「オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）」プロファイリングを使用し、非標的遺伝子（例えば、インターフェロン）を含む既知の遺伝子のパネルから、１または２個以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイのプロービングにおいて使用するために、全ての標的ｍＲＮＡが収集される。本明細書で提供されるｄｓＲＮＡの「オフターゲット」プロファイルは、候補ｄｓＲＮＡの存在下で発現レベルが低下した非標的遺伝子の数を測定することにより定量化される。「オフターゲット」結合の存在は、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡが、１または２個以上の非標的遺伝子メッセージに特異的に結合することができることを示す。特定の態様では、治療用途に適用できる、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡは、優れた安定性、最低限のインターフェロン応答性を示し、かつ、僅かな「オフターゲット」結合しか示さないまたは全く「オフターゲット」結合を示さない。

【0147】

更なる態様では、本明細書で提供されるような、１または２個以上の標的配列を含有するｄｓＲＮＡ（長さが約１５ｂｐ〜約４０ｂｐまたは約５ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド、または約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドであるもののような）に次々インフレームで操作可能に融合する、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）またはβ−ガラクトシダーゼのような１または２種以上のレポーター遺伝子に操作可能に融合し、その発現を変化させることができる、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータのような恒常的なプロモータを含む１または２種以上のレポーター遺伝子コンストラクトを使用することにより、より効果的なｄｓＲＮＡを選択する方法を提供する。

【0148】

個々のレポーター遺伝子発現コンストラクトは、１または２個以上のｄｓＲＮＡまたはそのアナログとコトランスフェクションすることができる。所与のｄｓＲＮＡの、標的遺伝子の発現レベルを低下させる能力は、対象ｄｓＲＮＡ分子をトランスフェクションしたまたはしていない細胞内で測定されたレポーター遺伝子活性を比較することにより決定することができる。

【0149】

本明細書で開示される特定の態様は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性を予測する段階を使用する、１または２個以上の修飾されたｄｓＲＮＡ分子を選択する方法を提供する。ある態様では、このような予測は理論上の融解曲線を使用することにより達成され、より高い理論上の融解曲線は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性の上昇およびそれと同時に起こる細胞毒性効果の低下を示す。あるいは、ｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性は、例えばポリヌクレオチドアレイ内における、本明細書に記載するＲＮＡアナログ一本鎖と、相補的な標的遺伝子とのハイブリダイゼーションを測定することにより実験的に測定することができる。それぞれの修飾ＲＮＡとそれに相補的な、アレイ上に固定されたＲＮＡの融解温度（即ち、Ｔ_ｍ値）を測定することができ、このＴ_ｍ値から、相補的なＲＮＡ分子と対をなしている置換または修飾されたＲＮＡの相対安定性を測定することができる。

【0150】

例えば、万能結合性ヌクレオチドに関して、Ｋａｗａｓｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：７７２７，１９８６）は、様々な位置にＤｉ（イノシン）を有するオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の、アレイとして作製されたＯＤＮの相補的なセットへのハイブリダイゼーションを測定することにより達成することができる、ＤｉとＡ、Ｃ、ＧおよびＴとのヌクレオチド対形成特性の分析について記載している。ヌクレオチド対の相対強さは、

である。一般に、Ｄｉを含有する二重鎖は、対応するＷＣヌクレオチド対に比べて低いＴ_ｍ値を示した。対形成によるＤｉの安定化は、Ｄｃ＞Ｄａ＞Ｄｇ＞Ｄｔ＞Ｄｕの順であった。２種類の状態モデルに従いファントホッフプロットを使用して算出した熱力学的値から、Ｋａｗａｓｅらは、ヌクレオチドスタッキングに起因して、二重鎖形成ではプリン−ピリミジンの配列が好まれると結論づける。例えば、ＸＹ＝ＡＴの二重鎖形成は、ＸＹ＝ＣＧおよびＴＡより好まれる組成である。当業者は理解するように、安定性（即ち、Ｔ_ｍ値）を決定する例として本明細書では万能結合性ヌクレオチドが使用されるが、他のヌクレオチド置換（例えば、ウリジンを５−メチルウリジンに）または更なる修飾（例えば、２’−位におけるリボース修飾）もまたこれらのまたは同様の方法により評価することができる。

【0151】

特定の態様では、本明細書で開示する方法は、（ａ）１または２個以上の標的遺伝子のＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングに好適なｄｓＲＮＡを設計または合成する工程であって、ｄｓＲＮＡが少なくとも３本の鎖と、所望により少なくとも１箇所の修飾または置換（５−メチルウリジン、ＬＮＡ、２’−メトキシ、２’−フルオロ、ホスホロチオエートまたはこれらの任意の組み合わせのような）とを含む工程と、（ｂ）１または２個以上の標的タンパク質を発現している細胞を、ｄｓＲＮＡと接触させる工程であって、ｄｓＲＮＡが１または２個以上の標的ｍＲＮＡまたは遺伝子に特異的に結合し、それにより１または２個以上の標的メンバーの発現を低下させることができる工程と、を含む。

【0152】

また、これらの対象ｄｓＲＮＡを同定する方法のいずれかを用いて、標的ｍＲＮＡに相補的である第１鎖またはこれらの任意の組み合わせと、第１鎖に非オーバーラップ相補性を有する第２および第３鎖を含む、ＲＮＡ干渉により１または２個以上の標的遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡを評価することもでき、ここで第１鎖と第２または第３鎖のうち少なくとも１本は約５〜約１３ｂｐの二本鎖領域を形成し、ｄｓＲＮＡのピリミジンの少なくとも１個は、式ＩまたはＩＩ：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ハロゲン、置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換または非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換または非置換−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３、置換または非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルキニル、カーバモイル、カーバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−Ｃ≡Ｎまたはヘテロシクロ基であり、Ｒ^３およびＲ^４はそれぞれ独立に、ヒドロキシル、保護ヒドロキシルまたはヌクレオシド間結合基であり、Ｒ^５およびＲ^８は独立にＯまたはＳである）のピリミジンヌクレオシドを含む。特定の態様では、少なくとも１個のヌクレオシドが、Ｒ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨである、または、Ｒ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨ、Ｒ^８がＳである式Ｉのヌクレオシドである。他の態様では、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０ヌクレオシドに共有結合する。

【0153】

組成物および使用方法
上記のように、本開示のｄｓＲＮＡは、高いレベルで発現しているまたは発現すべきでないときも発現し続け、かつ、例えば過剰増殖性、血管新生または炎症性疾患の状態または悪条件に関連する原因因子または要因である１または２個以上の標的遺伝子（その１または２種以上のｍＲＮＡスプライス変異体を含む）を標的とするよう設計される。これに関連して、本開示のｄｓＲＮＡまたはそのアナログは、１または２個以上の標的遺伝子の発現を、１または２種以上の関連する病徴の重症度または再発を防ぐ、軽減するまたは低減するレベルに、効果的にダウンレギュレートするであろう。あるいは、疾病または他の悪条件の結果または帰結として１または２個以上の標的遺伝子の発現が必ずしも上昇しない様々な特徴的な疾病モデルでも、１または２個以上の標的遺伝子のダウンレギュレーションは、遺伝子発現を低下させることにより、治療結果をもたらすであろう。更に、本開示のｄｓＲＮＡは、１または２個以上の標的遺伝子の発現を低下させることを標的とすることができ、これはその発現が１または２個以上の標的タンパク質により直接または間接的に負に調節される「ダウンストリーム」遺伝子のアップレギュレーションをもたらす可能性がある。本開示のｄｓＲＮＡ分子は、有用な試薬を含み、治療的、診断的な標的バリデーション、ゲノミックディスカバリー、遺伝子工学および薬理ゲノミクス用途の様々な方法のために使用することができる。

【0154】

特定の態様では、水性懸濁液は、懸濁剤または分散若しくは湿潤剤のような好適な賦形剤との混合物中の本開示のｄｓＲＮＡを含有する。代表的な懸濁剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムが挙げられる。代表的な分散または湿潤剤としては、天然ホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。特定の態様では、水性懸濁液は、所望により、１若しくは２種以上の防腐剤（例えば、エチルまたはｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、１若しくは２種以上の着色剤、１若しくは２種以上の着香剤、または１若しくは２種以上の甘味剤（例えば、スクロース、サッカリン）を含有してよい。更なる態様では、水の添加により水性懸濁液を調製するのに好適な分散性粉末および顆粒は、分散または湿潤剤、懸濁剤および所望により１または２種以上の防腐剤、着色剤、着香剤または甘味剤との混合物中の本開示のｄｓＲＮＡを提供する。

【0155】

本開示は、薬剤的に許容可能な担体または希釈剤中に薬剤的に有効な量の所望の化合物を含む、保存または投与用に調製されたｄｓＲＮＡ組成物を含む。治療用に許容可能な担体または希釈剤は、薬学分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５に記載されている。特定の態様では、本開示の薬剤組成物は、所望により、防腐剤、抗酸化剤、安定剤、染料、着香剤またはこれらの任意の組み合わせを含んでよい。代表的な防腐剤としては、安息香酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸およびソルビン酸が挙げられる。

【0156】

本開示のｄｓＲＮＡ組成物は、薬剤的に許容可能な製剤として有効に使用することができる。薬剤的に許容可能な製剤は、被験体の病状または他の悪条件の発生を防ぐ若しくは重症度を変化させる、または治療する（１または２種以上の症状を検出可能なまたは測定可能な程度に軽減する）。薬剤的に許容可能な製剤としては、上記化合物の塩、例えば塩酸、臭化水素酸、酢酸またはベンゼンスルホン酸の塩のような酸付加塩が挙げられる。薬剤組成物または製剤とは、細胞またはヒトのような被験体に投与する（例えば、全身投与）のに好適な形態である組成物または製剤を指す。標的遺伝子の発現に関連する疾患を治療するまたは予防するのに十分な量のｄｓＲＮＡを有する本開示の製剤は、例えば、局所（例えば、クリーム、軟膏、貼付剤、点眼剤、点耳剤）適用または投与に好適である。投与の別の経路としては、経口、非経口、舌下、膀胱洗浄、経膣、経直腸、経腸、座剤、経鼻および吸入が挙げられる。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、腹内、腹腔内、関節内、眼球内または眼球後、耳内、くも膜下腔内、腔内、体腔内、髄腔内、肺内または経肺、滑液包内および尿道内注射または注入技術を含む。本開示の薬剤組成物は、その中に含有されているｄｓＲＮＡが、被験体への投与時に生物学的に利用可能になるように配合される。

【0157】

更なる態様では、本開示のｄｓＲＮＡは、例えば植物油（例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはココヤシ油）または鉱物油（例えば、流動パラフィン）にｄｓＲＮＡを懸濁させることにより、油性懸濁液またはエマルション（例えば、水中油型）として配合することができる。好適な乳化剤は、天然ゴム（例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム）、天然リン脂質（例えば、大豆、レシチン、脂肪酸およびヘキシトール由来のエステルまたは部分エステル）、無水物（例えば、ソルビタンモノオレエート）、または部分エステルとエチレンオキシド（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）との縮合生成物であってよい。特定の態様では、油性懸濁液またはエマルションは、所望により、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールのような増粘剤を含有してよい。関連する態様では、甘味剤および着香剤を所望により添加し、口当たりのよい経口剤を提供することができる。更に他の態様では、これらの組成物は、所望によりアスコルビン酸のような抗酸化剤を添加することにより保存することができる。

【0158】

更なる態様では、本開示のｄｓＲＮＡは、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロース）を含むシロップおよびエリキシル剤として配合することができる。このような製剤はまた、粘滑剤、防腐剤、着香剤、着色剤、またはこれらの任意の組み合わせを含有してもよい。他の態様では、本開示のｄｓＲＮＡを含む薬剤組成物は、無菌で、注射可能な、水性または油性懸濁液の形態であってよい。無菌で、注射可能な調製品はまた、非毒性であり、非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤中の、無菌で、注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液のような）であってよい。本開示の組成物で有用な、代表的な許容可能な溶媒および溶剤は、水、リンガー溶液、または生理食塩液である。更に、無菌固定油を、本開示のｄｓＲＮＡの溶剤または懸濁媒として使用することができる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の銘柄の固定油を使用することができる。更に、オレイン酸のような脂肪酸は、非経口製剤の調製における利用法が見出されている。

【0159】

本開示の特定の態様では、ポリペプチドと混合される、複合体を形成する、またはコンジュゲートし、所望により、希釈剤、安定剤、バッファ等のような薬剤的に許容可能な担体とともに配合される、本開示の１または２個以上のｄｓＲＮＡまたはそのアナログの存在または投与を特徴づける、薬剤組成物および方法が提供される。本開示の負の電荷を帯びたｄｓＲＮＡ分子は、安定剤、バッファ等の有り無しで、治療に好適な組成物を形成する任意の標準的な手段により患者に投与することができる。リポソーム送達機構を使用することが望ましいときは、リポソームの形成のための標準的なプロトコルに従ってよい。当該技術分野において既知である他の化合物を用いてまたは用いずに、本開示の組成物を配合し、経口投与用の錠剤、カプセルまたはエリキシル剤、直腸投与用の座剤、無菌溶液、または注射投与用の懸濁液として使用することもできる。したがって、本開示のｄｓＲＮＡは、鼻内に、経皮的に、非経口的に、または局所注射によるような、任意の形態で投与することができる。

【0160】

本明細書の開示に従って、ｄｓＲＮＡ分子（所望により、置換または修飾またはコンジュゲートされている）、その組成物、および細胞または生物中の１または２個以上の標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。特定の態様では、本開示は、疾病を有する、または、１若しくは２個以上の標的遺伝子の発現により引き起こされる若しくはそれに関連する疾病が発生する危険のある、ヒト細胞、組織または個体を含む被験体を治療するための方法およびｄｓＲＮＡ組成物を提供する。ひとつの態様では、この方法は、標的遺伝子の発現が抑えられるように、細胞または哺乳類のような生物に、本開示のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含有する薬剤組成物を投与することを含む。本開示のｄｓＲＮＡ分子（所望により、置換または修飾またはコンジュゲートされている）、その組成物、および方法を使用する治療を受け入れられる被験体（例えば、哺乳類、ヒト）としては、１若しくは２個以上の標的遺伝子の過剰発現または不適切な発現により、少なくとも部分的に、仲介された１若しくは２種以上の疾病または状態に苦しんでいるもの、または、過剰増殖性（例えば、癌）、血管新生、代謝または炎症性（例えば、関節炎）疾病若しくは疾患若しくは状態を含む、１若しくは２個以上の標的タンパク質の発現を低下させることによる治療を受け入れられるものが挙げられる。

【0161】

本明細書で開示する組成物および方法は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、コロナウイルス、並びに、呼吸器系ウイルス（ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルスを含む）のような、レトロウイルスを含む、広範な標的ウイルスの治療に有用である。

【0162】

他の例では、本開示の組成物および方法は、１または２個以上の標的遺伝子の発現を調節し、例えば、過剰増殖性疾患等の症状を治療するまたは予防する、治療ツールとして有用である。代表的な過剰増殖性疾患としては、新生物、癌腫、肉腫、 腫瘍、または癌が挙げられる。より代表的な過剰増殖性疾患としては、口腔癌、咽喉癌、喉頭癌、食道癌、咽頭癌、上咽頭癌、口腔咽頭癌、消化管癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小腸癌、結腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、膵癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、外陰癌、膣癌、尿道癌、膀胱癌、腎臓癌、副腎皮質癌、島細胞癌、胆嚢癌、胃癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、絨毛性腫瘍、精巣癌、陰茎癌、骨癌、骨肉腫、肝臓癌、肝外胆管癌、皮膚癌、基底細胞癌（ＢＣＣ）、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳腫瘍、メラノーマ、カポジ肉腫、眼癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、胸腺腫（ｔｙｍｏｍａ）、胸腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、ヒッペルリンダウ症候群、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性胸膜中皮腫、バレット腺癌、ウィルムス腫瘍等が挙げられる。

【0163】

他の例では、本開示の組成物および方法は、１または２個以上の標的遺伝子の発現を調節し、例えば炎症性疾患の症状を治療するまたは予防する治療ツールとして有用である。代表的な炎症性疾患としては、真性糖尿病、関節リウマチ、炎症骨膜壁のパンヌス成長、コラーゲン誘導関節炎、脊椎関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、脳脊髄炎、炎症性腸疾患、クローン病（Ｃｈｒｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾癬または乾癬性関節炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、移植片対宿主病、アテローム性動脈硬化およびアレルギーが挙げられる。

【0164】

本開示のｄｓＲＮＡで治療することができる他の代表的な疾患としては、代謝障害、心臓病、肺疾患、新血管新生、虚血性疾患、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、糖尿病、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、リンパ脈管新生およびアテローム性動脈硬化が挙げられる。

【0165】

本明細書で開示する任意の方法では、本明細書で記載する１若しくは２個以上のｄｓＲＮＡまたは置換若しくは修飾ｄｓＲＮＡであって、標的ｍＲＮＡに相補的であり、かつ、少なくとも１種の他のヒト標的ファミリーｍＲＮＡに対して、３箇所以下のミスマッチを含んで、完全に相補的であり、逆もまた同様である第１鎖と、それぞれ第１鎖の非オーバーラップ領域に相補的である第２鎖および第３鎖とを含み、第２鎖および第３鎖は第１鎖とアニールして、１０ヌクレオチド以下のギャップにより分離されている少なくとも２箇所の二本鎖領域を形成することができ、少なくとも１箇所の二本鎖領域が約５ｂｐ〜約１３ｂｐであるｄｓＲＮＡを使用することができる。他の態様では、被験体は、少なくとも１個の他の標的ファミリーｍＲＮＡに対して、３箇所以下のミスマッチを含んで、完全に相補的であり、逆もまた同様である第１鎖と、それぞれ第１鎖の非オーバーラップ領域に相補的である第２鎖および第３鎖とを有し、第２鎖および第３鎖は第１鎖とアニールして、１０ヌクレオチド以下のギャップにより分離されている少なくとも２箇所の二本鎖領域を形成することができ、少なくとも１箇所の二本鎖領域が約５ｂｐ〜約１３ｂｐであり、ｍＲＮＡの少なくとも１個のピリミジンが式ＩまたはＩＩ：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ハロゲン、置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換または非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換または非置換−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３、置換または非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルキニル、カーバモイル、カーバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−Ｃ≡Ｎまたはヘテロシクロ基であり、Ｒ^３およびＲ^４はそれぞれ独立に、ヒドロキシル、保護ヒドロキシルまたはヌクレオシド間結合基であり、Ｒ^５およびＲ^８は独立にＯまたはＳである）のピリミジンヌクレオシドで置換されている、有効量の１または２個以上のｄｓＲＮＡを投与することにより、予防的または治療的に、有効に治療することができる。特定の態様では、少なくとも１個のヌクレオシドは、Ｒ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨである、または、Ｒ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨ、Ｒ^８がＳである式Ｉのものである。他の態様では、ヌクレオシド間結合基は約５〜約４０ヌクレオシドに共有結合する。

【0166】

更なる態様では、被験体は、標的ｍＲＮＡに相補的であり、かつ、少なくとも１種の他の標的遺伝子のｍＲＮＡに対して、３箇所以下のミスマッチを含んで、完全に相補的であり、逆もまた同様である第１鎖と、それぞれ第１鎖の非オーバーラップ領域に相補的である第２鎖および第３鎖とを有し、第２鎖および第３鎖は第１鎖とアニールして、１０ヌクレオチド以下のギャップにより分離されている少なくとも２箇所の二本鎖領域を形成することができ、組み合わせた二本鎖領域の合計が約１５ｂｐ〜約４０ｂｐであり、ｍｄＲＮＡ分子が平滑末端を含む、本明細書に記載する有効量の１または２個以上のｄｓＲＮＡまたは置換若しくは修飾ｄｓＲＮＡを投与することにより、予防的または治療的に、有効に治療することができる。更なる態様では、本明細書で開示する方法では、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、少なくとも１種の他の標的ファミリーのｍＲＮＡに対して、３箇所以下のミスマッチを含んで、完全に相補的であり、逆もまた同様である第１鎖と、それぞれ第１鎖の非オーバーラップ領域に相補的である第２鎖および第３鎖とを含み、第２鎖および第３鎖は第１鎖とアニールして、１０ヌクレオチド以下のギャップにより分離されている少なくとも２箇所の二本鎖領域を形成することができ、少なくとも１箇所の二本鎖領域が約５ｂｐ〜約１３ｂｐであり、ｍｄＲＮＡ分子が平滑末端を含み、ｍｄＲＮＡの少なくとも１個のピリミジンが式ＩまたはＩＩ：

式中、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立に−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ハロゲン、置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換または非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換または非置換−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３、置換または非置換Ｃ_２−Ｃ_１０アルキニル、カーバモイル、カーバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−Ｃ≡Ｎまたはヘテロシクロ基であり、Ｒ^３およびＲ^４はそれぞれ独立に、ヒドロキシル、保護ヒドロキシルまたはヌクレオシド間結合基であり、Ｒ^５およびＲ^８は独立にＯまたはＳである。特定の態様では、少なくとも１個のヌクレオシドは、Ｒ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨである、または、Ｒ^１がメチル、Ｒ^２が−ＯＨ、Ｒ^８がＳである式Ｉのヌクレオシドである。他の態様では、ヌクレオシド間結合基は約５〜約４０ヌクレオシドに共有結合する。

【0167】

本開示の更なる局面では、本開示のｄｓＲＮＡとともに配合されまたはそれとともに協調的に投与されて、本明細書で記載したような１または２個以上の標的遺伝子関連疾病または状態を制御する、１または２種以上の第２または補助活性剤と併用される、有効量の本開示の１または２個以上のｄｓＲＮＡを含む複合製剤および方法が提供される。これらの複合製剤および協調治療法で有用な補助治療剤としては、例えば、酵素的核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイまたはアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体のような抗体、小分子並びに金属、塩およびイオンを含む他の有機若しくは無機化合物、並びに、癌、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）等を治療するために用いられる化学療法剤を含む、１または２個以上の標的遺伝子関連疾病または状態の治療に必要とされる他の薬剤および活性剤が挙げられる。

【0168】

代表的な化学療法剤としては、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ブスルファン、ニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、ウラムスチン、テモゾロマイド）、代謝拮抗剤（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、シタラビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン（ｉｄａｒｕｉｃｉｎ）、ミトキサントロン、バルルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシン、ヒドロキシ尿素、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド）、モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ロイコボリン、オキサリプラチンが挙げられる。

【0169】

本開示の協調的投与法を実施するために、ｄｓＲＮＡは、本明細書で記載したまたは当該技術分野において既知である１または２種以上の第２または補助治療剤とともに、協調的な治療プロトコルで同時にまたは経時的に投与される。協調的投与は、いずれの順番で行ってもよく、１種のみまたは両方（または全て）の活性治療剤が、個別にまたは共同で、その生物活性を発揮する間、期間が存在する場合がある。全てのこのような協調的治療法の特徴的な局面は、組成物中に存在するｄｓＲＮＡが幾つかの有益な臨床反応を誘発することであり、これは第２治療剤によりもたらされる第２臨床反応と併せて起こる場合もあり、そうでない場合もある。例えば、ｄｓＲＮＡと本明細書で意図した第２治療剤との協調的投与により、精製されたｄｓＲＮＡまたは第２治療剤のいずれかのみまたは両方により誘発される治療反応を超える、強化された（例えば、相乗的）治療反応を得ることができる。

【0170】

別の態様では、本開示のｄｓＲＮＡは、１または２個以上のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ（例えば、末端）上にコンジュゲートメンバーを含んでよい。コンジュゲートメンバーは、例えば、リポフィル（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、テルペン、タンパク質結合剤、ビタミン、炭水化物またはペプチドであってよい。例えば、コンジュゲートメンバーは、ナプロキセン、ニトロインドール（またはスタッキング相互作用に寄与する別のコンジュゲート）、葉酸、イブプロフェン、またはＣ５ピリミジンリンカーであってよい。他の態様では、コンジュゲートメンバーは、グリセリド脂質コンジュゲート（例えば、ジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥコンジュゲートまたはチオコレステロールである。更なるコンジュゲートメンバーとしては、本開示の修飾ｄｓＲＮＡにコンジュゲートすると、標的細胞へのｄｓＲＮＡの送達を促進する、または逆に、生体試料と接触すると、ｄｓＲＮＡの送達、安定性若しくは活性を強化する機能を有するペプチドが挙げられる。本開示のこれらの局面内で使用するための代表的なペプチドコンジュゲートメンバーとしては、例えば、その全文が参照することにより本明細書に組み込まれたものとする、米国特許出願公開第２００６／００４０８８２号および同第２００６／００１４２８９号、並びに、米国仮特許出願番号第６０／９３９，５７８号に記載されているペプチドＰＮ２７、ＰＮ２８、ＰＮ２９、ＰＮ５８、ＰＮ６１、ＰＮ７３、ＰＮ１５８、ＰＮ１５９、ＰＮ１７３、ＰＮ１８２、ＰＮ２０２、ＰＮ２０４、ＰＮ２５０、ＰＮ３６１、ＰＮ３６５、ＰＮ４０４、ＰＮ４５３およびＰＮ５０９が挙げられる。特定の態様では、ペプチドコンジュゲートパートナーを用いて本開示のｄｓＲＮＡまたはそのアナログの送達を強化すると、得られるｄｓＲＮＡ製剤および方法は、脂質送達溶媒（例えば、リポフェクタミン（登録商標））のような、代替送達溶媒と併用して送達されるｄｓＲＮＡと比較したとき、標的細胞内におけるインターフェロン応答がさらに低下していることが多い。

【0171】

更に別の態様では、本開示のｄｓＲＮＡまたはそのアナログを、ポリペプチドとコンジュゲートさせ、１または２種以上の非カチオン性脂質または非カチオン性脂質とカチオン性脂質との組み合わせと混合し、標的細胞を裸のｄｓＲＮＡと接触させて得られる送達と比較して、ｄｓＲＮＡの細胞内送達を強化する組成物を形成することができる。本開示のさらに詳細な局面では、ｄｓＲＮＡおよびポリペプチドを含む混合物、複合体またはコンジュゲートは、所望により、リポフェクチン（登録商標）のようなカチオン性脂質と併用する（例えば、混合するまたは複合体化する）ことができる。ポリペプチド、ｄｓＲＮＡおよびカチオン性脂質を含むこれらの組成物を生成するために、まずｄｓＲＮＡとペプチドとを細胞培養培地のような好適な培地内で混合し、その後カチオン性脂質を混合物に添加し、ｄｓＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成する。所望により、細胞培養培地のような好適な培地内で、まずペプチドとカチオン性脂質とを混合し、続いてｄｓＲＮＡを添加し、ｄｓＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成することができる。

【0172】

本開示は、また、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾または長循環性（ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）リポソームまたはステルスリポソーム）を含有する表面修飾リポソームを含むｄｓＲＮＡ組成物の使用と特徴とする。これらの製剤は、標的組織内での薬物の蓄積を増加させる方法を提供する（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２６０１，１９９５、Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４３：１００５，１９９５）。このようなリポソームは、恐らく新血管新生した標的組織内での管外遊出および捕捉により、腫瘍内で選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２７５，１９９５、Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２３８：８６，１９９５）。長循環性リポソームは、単核性食細胞系（ＭＰＳ）の組織内に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較したとき、核酸分子の薬物動態および薬力を強化する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ４２：２４８６４， １９９５、Ｃｈｏｉらによる国際特許公開第９６／１０３９１号、Ａｎｓｅｌｌらによる国際特許公開第９６／１０３９０号、Ｈｏｌｌａｎｄらによる国際特許公開第９６／１０３９２号）。長循環性リポソームはまた、肝臓および脾臓のような代謝的に攻撃的であるＭＰＳ組織への蓄積を避けることにより、理論上のカチオン性リポソームに比較して、ヌクレアーゼ分解からさらに保護することもできる。

【0173】

ひとつの態様では、本開示は、肝細胞のような特定の細胞型に、本開示のｄｓＲＮＡ分子を投与するのに好適な組成物を提供する。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９，１９８７）は、肝細胞に特有であり、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）のような分岐ガラクトース末端糖タンパク質に結合する。このような糖タンパク質または合成複合糖質の受容体への結合は、オリゴ糖鎖の分岐の程度に強く依存する親和性を有するように起こる、例えば、三分岐（ｔｒｉａｔｅｎｎａｒｙ）構造は二分岐または一分岐鎖より強い親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，Ｃｅｌｌ ２２：６１１，１９８０、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：９３９，１９８２）。Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ （Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．４：３１７，１９８７） は、炭水化物成分として、ガラクトースに比べて受容体により高い親和性を有する、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを使用することを通して、この高い特異性を得た。この「クラスタリング効果」はまた、マンノシル末端糖タンパク質または複合糖質の結合および取り込みについても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：１３８８，１９８１）。細胞膜を通して外因性化合物を輸送するためのガラクトースおよびガラクトサミン系コンジュゲートの使用は、肝臓病の治療に標的化された送達手法を提供することができる。バイオコンジュゲートの使用もまた、治療に必要な治療化合物の必要投与量を低減することができる。更に、治療バイオアベイラビリティ、薬力学および薬物動態パラメータは、本開示のｄｓＲＮＡバイオコンジュゲートの使用を通して調節することができる。

【0174】

本開示はまた、ｄｓＲＮＡナノ粒子の調製方法も特徴とする。メラミン誘導体を含有する第１溶液を、ＨＣｌのような酸を加えているジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドのような有機溶媒に溶解する。ＨＣｌの濃度はメラミン誘導体１モルあたりＨＣｌ約３．３モルであった。次いで、第１溶液を、極性または親水性溶剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）またはこれらの組み合わせを含有する水性緩衝溶液）に溶解または懸濁した核酸を含む第２溶液と混合する。混合物は第１エマルションを形成する。混合は、例えば、超音波処理、ボルテックスまたはマイクロフリューダイザーのような任意の標準的な技術を使用して行うことができる。これは、核酸と三量体核酸複合体を形成するメラミン誘導体との複合体化を引き起こす。理論または機構に縛られるものではないが、３個の核酸は約１個のメラミン誘導体部分と環状に複合体化し、多くのメラミン誘導体部分が、核酸が有するヌクレオチドの数の多少に応じて３個の核酸分子と複合体化することができると考えられる。濃度は、約２０ヌクレオチド対を有する二本鎖核酸１モルあたり約１〜約７モルのメラミン誘導体であるべきであり、二本鎖核酸が長ければさらに多くなる。得られる核酸粒子を精製し、ゲルろ過クロマトグラフィー若しくは透析またはその両方を使用して有機溶剤を除去することができる。

【0175】

次いで、複合体化核酸ナノ粒子を、水溶液中にポリアルギニン若しくはグルタミン−アスパラギンポリマーまたはその両方を含有する水溶液と混合することができる。それぞれのポリマーの好ましい分子量は、約５０００〜約１５，０００ダルトンである。これは、メラミン誘導体並びにポリアルギニンおよびグルタミン−アスパラギンポリマーと複合体化した核酸のナノ粒子を含有する溶液を形成する。混合工程は、平均して直径が約２００ｎｍより小さいナノ粒子を生成しながら、核酸の剪断を最低限に抑える方式で実行する。理論に縛られるものではないが、ポリアルギニンは核酸の副溝内にあるリン酸基の負電荷と複合体を形成し、ポリアルギニンが三量体核酸複合体に巻き付くと考えられる。ポリアルギニンのいずれかの末端で、ＴＡＴポリペプチドのような他の部分、マンノースまたはガラクトースは、ポリマーに共有結合し、ガラクトースを使用するとき、核酸複合体の肝臓のような特定の組織への結合を導くことができる。理論に縛られるものではないが、グルタミン−アスパラギンポリマーは、核酸の塩基との水素結合を通じて、核酸の主溝内で核酸複合体と複合体化すると考えられる。ポリアルギニンおよびグルタミン−アスパラギンポリマーは、２０ｂｐの核酸１モルあたり２モルの濃度で存在すべきである。濃度は、２０ｂｐ超の核酸に比例して増加すべきである。例えば、核酸が２５ｂｐである場合、ポリマーの濃度は二本鎖核酸１モルあたり２．５〜３モルであるべきである。例は、ＨＩＶ ＴＡＴからＮ−末端タンパク質トランスダクションドメインに操作可能に結合しているポリペプチドである。このようなタンパク質で用いるためのＨＩＶ ＴＡＴコンストラクトは、Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：２３，１９９９に詳細に記載されている。米国特許出願公開第２００４／０１３２１６１号（２００４年７月８日公開）も参照のこと。得られるナノ粒子は、サイズ排除クロマトグラフィー後の透析のような標準的な手段により精製することができる。次いで、精製された複合体化ナノ粒子は、当該技術分野において周知である技術を用いて凍結乾燥することができる。

【0176】

本開示のひとつの態様は、ＲＮＡｉにより１または２個以上の標的遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡを含む１００ナノメートル（ｎｍ）未満のナノ粒子を提供する。より具体的には、ｄｓＲＮＡの長さは約３０ｂｐ未満、または約２０〜約２５ｂｐである。

【0177】

薬剤的に有効な投与量は、疾病状態を予防する、発生を抑制する、または治療する（症状、好ましくは全ての症状をある程度軽減する）のに必要な投与量である。薬剤的に有効な投与量は、疾病の種類、使用される組成物、投与経路、治療する被験体の種類、治療を検討中の特定の被験体の物理的特性、同時投薬、および当業者が認める他の要因に依存する。例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／体重（ｋｇ）／日の量の活性成分を、本開示のｄｓＲＮＡの効力に応じて投与することができる。

【0178】

約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ／体重（ｋｇ）／日程度の投与量レベルが、上記状態の治療に有用であり得る（約０．５ｍｇ〜約７ｇ／患者／日）。担体材料と組み合わせて単一剤形を生産することができる活性成分の量は、治療する宿主および具体的な投与モードに応じて変動する。投与単位形は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。

【0179】

任意の具体的な患者に対する特定の投与量は、使用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全体的健康、性別、食習慣、投与時刻、投与経路、および排出速度、複合薬および治療中の具体的な疾病の重症度を含む種々の要因に依存すると理解される。本開示の配合および方法に従ったｄｓＲＮＡの投与後に、被験体は、プラセボ治療したまたは他の好適な対照被験体に比べて、治療される疾病または疾患に関連する１または２種以上の症状が約１０％〜約９９％低減する。

【0180】

核酸分子およびポリペプチドは、ｄｓＲＮＡおよびポリペプチドのみを含む、または、薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、乳化剤、バッファ、安定剤、防腐剤等のような１または２種以上の追加成分を更に含む製剤での投与が挙げられる、当業者に既知である種々の方法により、細胞に投与することができる。特定の態様では、ｄｓＲＮＡまたはポリペプチドは、リポソームに封入する、イオントフォレシスにより投与する、または、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性微粒子若しくはタンパク質性ベクターのような他の媒体に導入することができる（例えば、国際特許公開第００／５３７２２号を参照のこと）。あるいは、核酸／ペプチド／媒体の組み合わせは、直接注射または薬物注入ポンプの使用により局所的に送達することができる。本開示の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内または皮内のいずれであろうと、標準的な針と注射器の方法論を使用して、または、Ｃｏｎｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：２３３０，１９９９および国際特許公開第９９／３１２６２号に記載されているもののような針を使わない技術によって行うことができる。

【0181】

ｄｓＲＮＡはまた、例えば、薬物を直腸投与するための座剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、薬物と、常温で固体であるが直腸温度で液体である好適な非刺激性賦形剤とを混合することにより調製でき、従って直腸内で融解し薬物を放出する。このような材料としては、カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。

【0182】

非ヒト動物への投与については、組成物を飼料または飲料水に添加してもよい。動物が食料とともに治療的に適切な量の組成物を取り込むように、飼料および飲料水組成物を配合することが好都合な場合がある。飼料または飲料水に添加するためのプレミックスとして組成物を与えることが好都合な場合もある。

【0183】

本開示のｄｓＲＮＡのような、核酸分子を送達するための更なる方法は、例えば、Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１３０８，１９９８、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２１：２８０，１９９９、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：５５９２，１９９５、Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１５：７３，１９９５、Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４９１０，１９９８、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７０５３，１９９９、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２：１３９，１９９２、“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９，１９９９、Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５，１９９９およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４，２０００に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎらによる国際特許公開第９４／０２５９５号は、更に、酵素的核酸分子を送達するための一般的な方法について記載しており、この方法を用いて、本開示で検討したｄｓＲＮＡを補充または補完送達することができる。

【0184】

インビボ遺伝子阻害に加えて、当業者は、本開示のｄｓＲＮＡが、科学的および商業的調査（例えば、生理学的経路の解明、薬物の発見および開発）並びに医学的および獣医学的診断のような、広範なインビトロ用途で有用であることを認めるであろう。一般に、方法は、既知の技術（例えば、細胞プロセスを通じた吸収、または、助剤若しくはエレクトロポレーションのようなデバイス、リポフェクションにより、またはペプチドコンジュゲートの使用を通じて）を使用して細胞にｄｓＲＮＡ剤を導入し、次いで１または２個以上の標的ｍＲＮＡを分解するのに十分な時間細胞を維持することを含む。

【0185】

本明細書で参照した米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許刊行物、図およびウェブサイトは全て、その全文が参照することにより明確に本明細書に組み込まれるものとする。

【実施例1】

【0186】

ギャップの入ったｄｓＲＮＡダイサー基質によるβ−ガラクトシダーゼ活性のノックダウン
ＬａｃＺ ｍＲＮＡのサイレンシングにおける、二本鎖構造にギャップを含有するダイサー基質ｄｓＲＮＡの活性を、正常ダイサー基質ｄｓＲＮＡ（即ち、ギャップを有しない）と比較して、評価した。

【0187】

ＬａｃＺ ｍＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡおよびｍｄＲＮＡの塩基配列
１または２本以上のセンス鎖並びにｄｓＲＮＡおよびギャップの入ったｄｓＲＮＡ（本明細書ではメロデュープレックスまたはｍｄＲＮＡとも呼ばれる）の核酸配列を以下に示し、標準的な技術を用いて合成した。ＲＩＳＣアクチベータＬａｃＺ ｄｓＲＮＡは、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、これらはアニールして、それぞれの鎖上に２個のデオキシチミジン突出を有する１９ｂｐの二本鎖領域を形成することができる（２１／２１ｄｓＲＮＡと呼ぶ）。
ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡ（２１／２１）−ＲＩＳＣアクチベータ
センス ５’−ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＣＧＡＵＵＵｄＴｄＴ−３’（配列番号１）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＡＡ−５’（配列番号２）

【0188】

ダイサー基質ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡは、２５ヌクレオチドのセンス鎖および２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、これらはアニールして、一方に平滑末端、他方にシチジンおよびウリジン突出を有する２５ｂｐの二本鎖領域を形成することができる（２５／２７ｄｓＲＮＡと呼ぶ）。
ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡ（２５／２７）−ダイサー基質
センス ５’−ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＣＧＡＵＵＵＣＣＡＵｄＧｄＴ−３’（配列番号３）
アンチセンス ３’−ＣＵＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＡＡＧＧＵＡ ＣＡ−５’（配列番号４）

【0189】

ＬａｃＺ ｍｄＲＮＡは、１３ヌクレオチド（５’−部分）および１１ヌクレオチド（３’−部分）のセンス鎖２本および２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、これら３本の鎖はアニールして、１箇所のヌクレオチドギャップにより分離されている１３および１１ｂｐの２箇所の二本鎖領域を形成することができる（１３，１１／２７ｍｄＲＮＡと呼ぶ）。１１ヌクレオチドのセンス鎖断片の５’−末端を、所望によりリン酸化してもよい。「＊」はギャップ、この場合、１箇所のヌクレオチドギャップ（即ち、シチジンが欠失している）を指す。
ＬａｃＺ ｍｄＲＮＡ（１３，１１／２７）−ダイサー基質
センス ５’−ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧ＊ＧＡＵＵＵＣＣＡＵｄＧｄＴ−３’（配列番号５、６）
アンチセンス ３’−ＣＵＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＡＡＧＧＵＡ ＣＡ−５’（配列番号４）
ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡまたはｍｄＲＮＡのそれぞれを用いて９ｌａｃＺ／Ｒ細胞をトランスフェクションした。

【0190】

トランスフェクション
６ウェルのコラーゲンコーティングしたプレートに、ウェルあたり２ｍＬの容積で、５×１０^５ ９ｌａｃＺ／Ｒ細胞／ウェルを播種し、ＤＭＥＭ／高グルコース培地中にて、３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。
トランスフェクションの準備：２５０μＬの血清を含まないＯＰＴＩＭＥＭ培地を、５μＬの２０ｐｍｏｌ／μＬ ｄｓＲＮＡと混合し、５μＬのＨＩＰＥＲＦＥＣＴトランスフェクション溶液（Ｑｉａｇｅｎ）を、２５０μＬの別のＯＰＴＩＭＥＭ培地と混合した。両方の混合物を５分間平衡化させた後、ＲＮＡとトランスフェクション溶液とをまとめ、室温で２０分間放置し、トランスフェクション複合体を形成した。ＨＩＰＥＲＦＥＣＴの最終濃度は５０μＭであり、ｄｓＲＮＡは０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭおよび１０ｎＭで試験し、一方ｍｄＲＮＡは０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭおよび５０ｎＭで試験した。完全培地を除去し、細胞を不完全ＯＰＴＩＭＥＭで洗浄し、次いで５００μＬのトランスフェクション混合物を細胞に適用し、これを３７℃で４時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。トランスフェクション後、トランスフェクション培地を除去し、完全ＤＭＥＭ／高グルコース培地で１度洗浄し、新鮮培地を添加し、次いで細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。

【0191】

β−ガラクトシダーゼアッセイ
トランスフェクションした細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで０．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡで剥離した。剥離した細胞を１ｍＬの完全ＤＭＥＭ／高グルコースに懸濁し、清潔な試験管に移動した。細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離することにより収集し、次いで４℃で５０μＬの１×溶解バッファに再懸濁した。溶解細胞をドライアイスおよび３７℃の水浴で２度凍結融解サイクルに供した。溶解試料を４℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。試料それぞれについて、１．５μＬおよび１０μＬの溶解液を清潔な試験管に移動し、最終容量３０μＬまで滅菌水を添加し、続いて７０μＬのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノース（ＯＮＰＧ）および２００μＬのβ−メルカプトエタノールを含む１×切断バッファを添加した。試料を短時間混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで５００μＬの停止バッファを添加した（最終容量８００μＬ）。各試料のβ−ガラクトシダーゼ活性を、使い捨てキュベット内で４２０ｎｍにて測定した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）法で測定した。本実施例の目的のために、測定したＬａｃＺ活性のレベルは、９Ｌ／ＬａｃＺ細胞内のＬａｃＺ転写産物の量に相関していた。したがって、細胞生存能力に負の影響のない、ｄｓＲＮＡトランスフェクション後のβ−ガラクトシダーゼ活性の低下は、ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡの介在する標的化された分解が原因である、ＬａｃＺ転写産物の量の低下に起因していた。

【0192】

結果
トランスフェクションした細胞およびトランスフェクションしていない細胞のノックダウン活性をＱｎｅｇ対照ｄｓＲＮＡに対して正規化し、Ｑｎｅｇ対照の正規化値（即ち、１００％または「正常」遺伝子発現レベルを表すＱｎｅｇ）として提示した。ＬａｃＺ ＲＩＳＣアクチベータおよびダイサー基質ｄｓＲＮＡ分子は両方、０．１ｎＭ程度の濃度でβ−ガラクトシダーゼの良好なノックダウンを示し（図１）、一方ダイサー基質アンチセンス鎖（一本鎖２７ｍｅｒ）のみではサイレンシング効果を示さなかった。驚くべきことに、ギャップのあるｍｄＲＮＡは良好なノックダウンを示したが、インタクトなＲＩＳＣアクチベータおよびダイサー基質ｄｓＲＮＡよりも若干効果が低かった（図１）。様々な濃度（０．１μＭ〜５０μＭ）でのギャップマーシチジン（即ち、欠失ヌクレオチド）の存在は、ｍｄＲＮＡの活性に影響はなかった（データ不掲載）。ｄｓＲＮＡまたはｍｄＲＮＡ溶液はいずれも、トランスフェクションした９Ｌ／ＬａｃＺ細胞内で検出可能な毒性を全く示さなかった。ＬａｃＺ ｍｄＲＮＡのＩＣ_５０は３．７４ｎＭと算出され、これは予め測定したＬａｃＺ ｄｓＲＮＡ２１／２１よりも約１０倍低い（データ不掲載）。これらの結果は、メロデュープレックス（ギャップの入ったｄｓＲＮＡ）が遺伝子サイレンシングを誘発できることを示す。

【実施例2】

【0193】

ニックの入ったｄｓＲＮＡによるインフルエンザ遺伝子発現のノックダウン
インフルエンザ遺伝子発現のサイレンシングにおける、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（２１／２１）の活性、正常ｄｓＲＮＡ（即ち、ニックを有しない）と比較して、を評価した。

【0194】

インフルエンザｍＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡおよびｍｄＲＮＡの塩基配列
ｄｓＲＮＡおよびニックの入ったｄｓＲＮＡ（メロデュープレックスの別の形態、本明細書ではｎｄｓＲＮＡと呼ぶ）を以下に示し、標準的な技術を使用して合成した。ＲＩＳＣアクチベータインフルエンザＧ１４９８ｄｓＲＮＡは、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、これらはアニールして、各鎖に２個のデオキシチミジン突出を有する１９ｂｐの二本鎖領域を形成することができる。
Ｇ１４９８−ｗｔ ｄｓＲＮＡ（２１／２１）
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号７）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣ−５’（配列番号８）

【0195】

ＲＩＳＣアクチベータインフルエンザＧ１４９８ｄｓＲＮＡは、ヌクレオチド１１の後にセンス鎖上にニックが入り、１１ヌクレオチド（５’−部分、イタリック体）および１０ヌクレオチド（３’−部分）の２本のセンス鎖と２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有するｎｄｓＲＮＡを生成し、これら３本の鎖はアニールして、１箇所のヌクレオチドギャップ（Ｇ１４９８ １１，１０／２１ｎｄｓＲＮＡ−ｗｔと呼ぶことができる）により分離されている１１（イタリック体で示す）および１０ｂｐの２箇所の二本鎖領域を形成することができる。１０ヌクレオチドのセンス鎖断片の５’−末端は、所望により、ヌクレオチドの前の「ｐ」で記述するように（例えば、ｐＣ）リン酸化してもよい。

【0196】

Ｇ１４９８ ｎｄｓＲＮＡ−ｗｔ（１１，１０／２１）
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号９，１０）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣ−５’ （配列番号８）

【0197】

Ｇ１４９８ ｎｄｓＲＮＡ−ｗｔ（１１，１０／２１）
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号９，１０）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣ−５’（配列番号８）

【0198】

更に、各Ｕを５−メチルウリジン（リボチミジン）で置換したこれらのＧ１４９８ｄｓＲＮＡをそれぞれ作製し、これをＧ１４９８ｄｓＲＮＡ−ｒＴと呼ぶ。５−メチルウリジン置換の有り無しで、Ｇ１４９８ｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡ（メロデュープレックス）をそれぞれ用いて、ルシフェラーゼ遺伝子に関連するインフルエンザ標的配列を有するＨｅＬａＳ３細胞をトランスフェクションした。また、Ｇ１４９８アンチセンス鎖のみ、または、１１ヌクレオチドのセンス鎖部分にアニールしたアンチセンス鎖のみ、または１０ヌクレオチドのセンス鎖部分のみの活性を評価した。

【0199】

トランスフェクションおよびデュアルルシフェラーゼアッセイ
恒常的にホタルｌｕｃ２（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、シーパンジーとしても知られる）ルシフェラーゼの両方を発現しする、レポータープラスミドｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、Ｒｅｎｉｌｌａ−インフルエンザＮＰフュージョンｍＲＮＡをもたらすウミシイタケの翻訳停止コドンの下流のインフルエンザＮＰ遺伝子の一部をクローニングした。ｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２ベクター中のホタルルシフェラーゼを用いて、ウミシイタケルシフェラーゼ発現を正規化し、トランスフェクション効率の対照とする。

【0200】

マルチウェルプレートに、１００μＬのハムズＦ１２培地および１０％ウシ胎児血清中でＨｅＬａＳ３細胞／ウェルを播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。実施例１に記載したものと本質的に同じトランスフェクション手順を用いて、ＨｅＬａＳ３細胞に、リポフェクタミン（登録商標）２０００およびＯＰＴＩＭＥＭ低減血清培地に配合されたｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−インフルエンザプラスミド（７５ｎｇ）およびＧ１４９８ｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡ（最終濃度１０ｎＭまたは１００ｎＭ）をトランスフェクションした。トランスフェクション混合物を、ＨｅＬａＳ３細胞とともに、穏やかに振盪しながら３７℃で約１８〜２０時間インキュベートした。

【0201】

トランスフェクション後、まずＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を１０分間振盪しながら添加し、次いでＶＩＣＴＯＲ^３（登録商標）１４２０マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して蛍光シグナルを定量化することにより、ホタルルシフェラーゼレポーター活性を測定した。ホタル蛍光を測定した後、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を１０分間振盪しながら添加し、同時にホタルの反応を消光させ、ウミシイタケルシフェラーゼの反応を開始させ、次いでウミシイタケルシフェラーゼの蛍光シグナルをＶＩＣＴＯＲ^３（登録商標）１４２０マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して定量化した。

【0202】

結果
トランスフェクションした細胞およびトランスフェクションしていない細胞のノックダウン活性をＱｎｅｇ対照ｄｓＲＮＡに対して正規化し、Ｑｎｅｇ対照の正規化値（即ち、Ｑｎｅｇは１００％または「正常」遺伝子発現レベルを表す）として提示した。したがって、より小さな値は、より大きなノックダウン効果を示す。Ｇ１４９８ｄｓＲＮＡ−ｗｔおよびｄｓＲＮＡ−ｒＴは、１００ｎＭの濃度で同様の良好なノックダウン効果を示した（図２）。驚くべきことに、リン酸化されていようといまいと、Ｇ１４９８ｎｄｓＲＮＡ−ｒＴは良好なノックダウン効果を示したが、Ｇ１４９８ｄｓＲＮＡ−ｗｔより若干効果が低かった（図２）。１０ｎＭの濃度におけるｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡでも同様の結果が得られた（データ不掲載）。Ｇ１４９８ｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡ溶液はいずれも、１０ｎＭまたは１００ｎＭのいずれにおいてもＨｅＬａＳ３細胞中で検出可能な毒性を全く示さなかった。Ｇ１４９８アンチセンス鎖と、ニックの入ったセンス鎖の半分のみ（１１ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチドの鎖のみ）しか存在しない場合でさえ、幾らかの検出可能な活性を示した。これらの結果は、ニックを入れたメロデュープレックスｄｓＲＮＡ分子は、予想外に、遺伝子サイレンシングを促進することができることを示す。

【実施例3】

【0203】

様々な位置にニックを有するｍｄＲＮＡのノックダウン活性
本実施例では、様々な位置にニックを有するセンス鎖を有する実施例１のダイサー基質ＬａｃＺ ｄｓＲＮＡの活性を評価した。更に、ジデオキシヌクレオチド（即ち、ｄｄＧ）を、ニックまたは単一ヌクレオチドギャップを有するセンス鎖の最も３’側の鎖の５’末端に組み込み、ニックの入ったセンス鎖のインビボでのライゲーションが「救出（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）」活性を有するかどうかを決定した。ｄｄＧはライゲーションの基質ではない。また、８〜１４の位置のうち１箇所にニックの入ったセンス鎖を有する実施例６のインフルエンザダイサー基質ｄｓＲＮＡも評価した。「ｐ」記号は、ニックの入ったセンスインフルエンザ配列の最も３’側の鎖の５’末端がリン酸化されていることを示す。「Ｌ」記号は、ニックの入ったセンスインフルエンザ配列の最も５’側の鎖の２の位置のＧが、ロックされた核酸Ｇに置換されていることを示す。ＱｎｅｇはネガティブコントロールｄｓＲＮＡである。

【0204】

実施例２のデュアルルシフェラーゼアッセイを用いて、５ｎＭのＬａｃＺ配列および０．５ｎＭのインフルエンザ配列のノックダウン活性を測定した。ｌａｃｚダイサー基質（２５／２７，ＬａｃＺ−ＤＳ）およびｌａｃＺ ＲＩＳＣアクチベータ（２１／２１，ＬａｃＺ）は等しく活性があり、ＬａｃＺ−ＤＳは、８〜１４のいずれかの位置にニックが入っていても活性に影響はない（図３）。さらに、ニック（ＬａｃＺ：ＤＳＮｋｄ１３−３’ｄｄ）または１箇所のヌクレオチドギャップ（ＬａｃＺ：ＤＳＮｋｄ１３Ｄ１−３’ｄｄ）を有する最も３’側のＬａｃＺセンス配列の５’−末端上にｄｄＧを含んでも、非置換配列と本質的に同じ活性であった（図３）。８〜１４のいずれか１箇所にニックの入ったインフルエンザダイサー基質（Ｇ１４９８ＤＳ）もまた高い活性を示した（図４）。ニックの入ったセンスインフルエンザ配列の最も３’側の鎖の５’−末端のリン酸化は、本質的に活性に影響を及ぼさなかったが、ロックされた核酸の添加により活性が高まるようである。

【実施例4】

【0205】

ｍｄＲＮＡの平均阻害濃度
本実施例では、用量反応アッセイを実施し、ロックされた核酸を含むまたは含まない、１２、１３または１４の位置にニックの入ったセンス鎖を有する実施例７のインフルエンザダイサー基質ｄｓＲＮＡの平均阻害濃度（ＩＣ_５０）を測定した。実施例２のデュアルルシフェラーゼアッセイを用いた。インフルエンザダイサー基質ｄｓＲＮＡ（Ｇ１４９８ＤＳ）を、０．０００４ｎＭ、０．００２ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．０１９ｎＭ、０．０６７ｎＭ、０．２３３ｎＭ、０．８１６ｎＭ、２．８ｎＭおよび１０ｎＭで試験し、一方１３の位置にニックの入ったｍｄＲＮＡ（Ｇ１４９８ＤＳ：Ｎｋｄ１３）を、０．００１ｎＭ、０．０４８ｎＭ、０．１６７ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、７ｎＭおよび２５ｎＭで試験した（図５を参照のこと）。また、様々な位置にニックの入ったまたは入っていないＲＩＳＣアクチベータ分子（２１／２１）についても試験し、Ｇ１４９８ＤＳ：Ｎｋｄ１２およびＧ１４９８ＤＳ：Ｎｋｄ１４は、上記のようなロックされた核酸を有するそれぞれのニックの入ったバージョンである（データ不掲載）。ＱｎｅｇはネガティブコントロールｄｓＲＮＡである。

【0206】

ＲＩＳＣアクチベータＧ１４９８のＩＣ_５０は約２２ｐＭであると算出され、一方、ダイサー基質Ｇ１４９８ＤＳのＩＣ_５０は約６ｐＭであると算出された。ＲＩＳＣおよびダイサーｍｄＲＮＡのＩＣ_５０は、約２００ｐＭ〜約１５ｎＭの範囲である。単一のロックされた核酸を含むと、ダイサーｍｄＲＮＡのＩＣ_５０は４倍低下した（データ不掲載）。これらの結果は、いずれかの位置にニックまたはギャップを有するメロデュープレックスｄｓＲＮＡが、遺伝子サイレンシングを誘発できることを示す。

【実施例5】

【0207】

様々な大きさおよび位置のギャップを有するｍｄＲＮＡのノックダウン活性
様々な大きさおよび位置のギャップを有するセンス鎖を有するインフルエンザダイサー基質ｄｓＲＮＡの活性を評価した。８の位置に０〜６ヌクレオチドのギャップ、９の位置に４ヌクレオチドのギャップ、１０の位置に３ヌクレオチドのギャップ、１１の位置に２ヌクレオチドのギャップ、および１２の位置に１ヌクレオチドのギャップを有するセンス鎖を有する実施例７のインフルエンザダイサー基質ｄｓＲＮＡを作製した（表３を参照のこと）。ＱｎｅｇはネガティブコントロールｄｓＲＮＡである。それぞれのｍｄＲＮＡを、５ｎＭ（データ不掲載）および１０ｎＭの濃度で試験した。ｍｄＲＮＡは、表３に示すように、以下のアンチセンス鎖５’−ＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＵＵ（配列番号１１）と、ニックまたはギャップの入ったセンス鎖とを有する。

【0208】

【表3】

【0209】

実施例２のデュアル蛍光アッセイを用いてノックダウン活性を測定した。濃度５ｎＭおよび１０ｎＭの両方で同様の結果が得られた。これらのデータは、６ヌクレオチド以下のギャップを有するｍｄＲＮＡは依然として活性を有するが、４以下の欠失ヌクレオチドを有するｍｄＲＮＡが最も高い活性を有することを示す（図６も参照のこと）。したがって、様々な異なる位置に様々な大きさのギャップを有するｍｄＲＮＡがノックダウン活性を有する。

【0210】

様々な大きさおよび位置のギャップを有するセンス鎖を有する配列の一般的適用性を評価するために、様々なｄｓＲＮＡ配列を試験した。８の位置に０〜６ヌクレオチドのギャップ、９の位置に５ヌクレオチドのギャップ、１０の位置に４ヌクレオチドのギャップ、１１の位置に３ヌクレオチドのギャップ、１２の位置に２ヌクレオチドのギャップ、１２の位置に１ヌクレオチドのギャップおよび１４の位置にニック（ギャップ０）を有するセンス鎖を有する、実施例１のｌａｃＺ ＲＩＳＣ ｄｓＲＮＡを作製した（表４を参照のこと）。ＱｎｅｇはネガティブコントロールｄｓＲＮＡである。それぞれのｍｄＲＮＡを、５ｎＭ（データ不掲載）および２５ｎＭの濃度で試験した。ｌａｃＺ ｍｄＲＮＡは、以下のアンチセンス鎖５’−ＡＡＡＵＣＧＣＵＧＡＵＵＵＧＵＧＵＡＧｄＴｄＴＵＡＡＡ（配列番号２）および表４に示すような、ニックまたはギャップの入ったセンス鎖を有する。

【0211】

【表4】

【0212】

実施例２のデュアル蛍光アッセイを用いてノックダウン活性を測定した。図７は、６ヌクレオチド以下のギャップを有するｍｄＲＮＡは実質的な活性を有し、ギャップの位置はノックダウンの効力に影響を及ぼす可能性がある。したがって、様々な異なる位置および異なるｍｄＲＮＡ配列に様々な大きさのギャップを有するｍｄＲＮＡがノックダウン活性を有する。

【実施例6】

【0213】

置換ｍｄＲＮＡのノックダウン活性
ニックの入ったセンス鎖およびロックされた核酸置換を有するセンス鎖を有するインフルエンザｄｓＲＮＡ ＲＩＳＣ配列の活性を評価した。５’−末端から数えて８〜１４の位置にニックを有するセンス鎖を有する実施例２のインフルエンザＲＩＳＣ配列Ｇ１４９８を作製した。それぞれのセンス鎖を、表５に示すように、１または２個のロックされた核酸で置換した。Ｑｎｅｇおよびプラスミドはネガティブコントロールである。それぞれのｍｄＲＮＡを５ｎＭの濃度で試験した。用いたアンチセンス鎖は、５’−ＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣｄＴｄＴ（配列番号８）であった。

【0214】

【表5】

【0215】

実施例２のデュアル蛍光アッセイを用いてノックダウン活性を測定した。これらのデータは、ロックされた核酸置換の数が増加すると、多くの位置のうちいずれかにニックを有するｍｄＲＮＡの活性が上昇する傾向があることを示す。センス鎖あたりのロックされた核酸が１個の場合、ニックの位置が１１である時に最も高い活性を示した（図８を参照のこと）。しかし、各センス鎖のロックされた核酸が複数の場合、いずれかの位置にニックを有するｍｄＲＮＡは、単一置換の最適なニック位置（即ち、位置１１）と同じくらいの活性になる（図８）。したがって、二重鎖安定化修飾を有するｍｄＲＮＡは、ニック位置にかかわらず、ｍｄＲＮＡの活性を本質的に等しくする。

【0216】

ロックされた核酸置換を実施例１のＬａｃＺダイサー基質ｍｄＲＮＡ（配列番号３および４）内に作製したとき、同様の結果が観察された。ｌａｃＺダイサーは８〜１４の位置にニックが入っており、５’センス鎖の位置３（５’−末端から）におけるＡがロックされた核酸Ａ（ＬＮＡ−Ａ）で置換されていることを除き、ニックの入ったＬａｃＺダイサー分子の複製セットが作製された。図１１から明らかであるように、ＬＮＡ−Ａを含有するニックの入ったｌａｃＺダイサー分子の大部分は、非置換ｌａｃＺダイサーと同程度のノックダウン活性効力であった（図９を参照のこと）。

【実施例7】

【0217】

インフルエンザウイルス力価のｍｄＲＮＡノックダウン
インフルエンザウイルス力価の低下における、ダイサー基質のニックの入ったｄｓＲＮＡの活性を、野性型ｄｓＲＮＡ（即ち、ニックを有しない）と比較して、評価した。インフルエンザダイサー基質配列（２５／２７）は以下の通りである。
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡＡｄＴｄＧ （配列番号６２）
アンチセンス ５’−ＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＵＵ（配列番号１１）
これらのｍｄＲＮＡ配列は、それぞれ５’−末端から数えて１２、１３および１４後の位置にニックが入っており、各センス鎖はまた２の位置がロックされた核酸Ｇで置換されたＧを有する。

【0218】

ウイルス感染力アッセイのために、ウェルあたり５００μＬの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地中でトランスフェクションする１日前に、ベロ細胞を、６．５×１０^４細胞／ウェル播種した。各ｄｓＲＮＡの１００、１０、１、０．１および０．０１ｎＭストックの試料を、１．０μＬ（１ｍｇ／ｍＬストック）のリポフェクタミン（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）と複合体化し、１５０μＬのＯＰＴＩＭＥＭ（合計容量）（Ｇｉｂｃｏ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中にて室温で２０分間インキュベートした。ベロ細胞をＯＰＴＩＭＥＭで洗浄し、次いでＯＰＴＩＭＥＭ中のトランスフェクション複合体１５０μＬを、１５０μＬのＯＰＴＩＭＥＭ培地を収容している各ウェルに添加した。各条件について三つ組のウェルで試験した。トランスフェクション条件を備えない追加の対照ウェルを準備した。トランスフェクションの３時間後、培地を除去した。各ウェルを、０．３％のＢＳＡおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＰＳを含有するＰＢＳ２００μＬで１度洗浄した。各ウェル内の細胞に、０．３％のＢＳＡ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＰＳおよび４μｇ／ｍＬのトリプシンを含有する、２００μＬの感染培地中にて、感染多重度（ＭＯＩ）０．０１でインフルエンザウイルスのＷＳＮ株を感染させた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。吸着されていないウイルスを２００μＬの感染培地で洗い流し、廃棄し、次いで、０．３％のＢＳＡ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＰＳおよび４μｇ／ｍＬのトリプシンを含有する４００μＬのＤＭＥＭを各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートし、次いで各ウェルの上清５０μＬを、ＭＤＣＫ細胞内でＴＣＩＤ_５０アッセイ（組織培養感染量５０、ＷＨＯプロトコル）により二つ組で試験し、力価をＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ式を用いて推定した。

【0219】

結果は、Ｇ１４９８のニックの入ったｍｄＲＮＡは全て、インフルエンザウイルス力価を１０倍低下させることを示す（図１０）。つまり、これらのｍｄＲＮＡは、１０ｐＭ程度の低濃度でさえ、約５０％〜６０％のウイルス価ノックダウンを示す（図１１）。

【0220】

また、インビボインフルエンザマウスモデルを用いて、インフルエンザウイルス力価の低下における、ダイサー基質のニックの入ったｄｓＲＮＡの活性を、野性型ｄｓＲＮＡ（即ち、ニックを有しない）と比較して、評価した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５〜１０匹の、８〜１０週齢のマウス）に対し、インフルエンザ株ＰＲ８の鼻腔内投与（２０ＰＦＵ／マウス）前に、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のｄｓＲＮＡ（３０：１：２０：４９の比で配合された、Ｃ１２−ｎｏｒＡｒｇ（ＮＨ_３＋Ｃｌ−）− Ｃ１２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＤＳＰＣ／コレステロール）を鼻腔内に３日間連続で投与した。感染の２日後、各マウスから肺全体を回収し、抗生物質を含むＰＢＳ／０．３％ＢＳＡ溶液中に定置し、ホモジナイズし、ウイルス価（ＴＣＩＤ_５０）を測定する。投与量は、マウスの耐容性がよく、いずれの投与群においても２％未満の体重低下を示した。試験したｍｄＲＮＡは、僅かに大きいとしても、非修飾およびニックの入っていないＧ１４９８ダイサー基質と比較し、インビボで同様のウイルス減少を示した（図１２）。したがって、ｍｄＲＮＡはインビボで活性を有する。

【実施例8】

【0221】

サイトカイン誘発に対するｍｄＲＮＡの効果
インビボでのサイトカイン誘発に対するｍｄＲＮＡ構造の効果を評価した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜９週齢）に、約５０μＭのｄｓＲＮＡ（３０：１：２０：４９の比で配合されたＣ１２−ｎｏｒＡｒｇ（ＮＨ_３＋Ｃｌ−）−Ｃ１２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＤＳＰＣ／コレステロール）または６０５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の裸のｄｓＲＮＡを、３日間連続で鼻腔内に投与した。最終投与の約４時間後、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収し、サイトカイン応答の評価のために回収した血液を血清に加工した。０．５ｍＬの、生理食塩水中の氷冷０．３％ＢＳＡで２度（計１ｍＬ）気管支洗浄を行った。ＢＡＬＦを回転させ、上清を回収し、サイトカイン分析まで冷凍した。安楽死直後に大静脈から血液を回収し、血清分離チューブ内に入れ、室温で少なくとも２０分間凝固させた。試料を血清に加工し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ０．２２μｍろ過管に分注し、１２，０００ｒｐｍで回転させ、ドライアイス上で冷凍し、次いで分析まで−７０℃で保管した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）アレイリーダー上で、Ｐｒｏｃａｒｔａ（登録商標）マウス１０−Ｐｌｅｘサイトカインアッセイキット（Ｐａｎｏｍｉｃｓ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）を用いて、ＢＡＬＦおよび血漿のサイトカイン分析を実施した。０日目の最初の投与前、更に３日目、安楽死直前の体重を含む、毒性パラメータも測定した。脾臓を回収し、計量し、重量を最終体重に対して正規化した。結果を表６に示す。

【0222】

【表6】

【0223】

ｍｄＲＮＡ（ＲＩＳＣまたはダイサーの大きさの）はインタクトな（即ち、ニックの入っていない）親分子程ではないにせよ、サイトカインを誘発した。サイトカイン誘発の減少は、一貫して１０サイトカイン多発性アッセイの誘発の最高レベルを有するサイトカインである、ＩＬ−１２（ｐ４０）が最も大きかった。ｍｄＲＮＡでは、ＩＬ−１２（ｐ４０）の減少は２５〜５６倍の範囲であり、一方ＩＬ−６またはＴＮＦαの誘発の低下はいずれも、より僅かであった（これら２種のサイトカインの低下は２〜１０倍）。したがって、ｍｄＲＮＡ構造は、非修飾ｄｓＲＮＡと比較して、サイトカイン誘発が最低限に抑えられる点で、インビボにおいて利点をもたらすと思われる。

【0224】

配合されたｍｄＲＮＡでも同様の結果が得られたが、誘発の低下は顕著ではなかった。更に、ロックされた核酸の存在または非存在は、サイトカイン誘発に影響を及ぼさない。これらの結果を表７に示す。

【0225】

【表7】

【0226】

特許、特許出願および学術論文を含む、本明細書で引用した全ての参考文献の教示は、その全文が参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。上記開示は理解の明確性のために、実施例を通して詳細に記載されているが、当業者は、限定ではなく例示のために提示される、添付の特許請求の範囲の範囲内で特定の変更および修正が実施できることを理解するであろう。この文脈では、様々な刊行物および他の参考文献は、説明を簡潔にするために上記開示内で引用されている。しかしながら、本明細書で論じられている様々な刊行物は、本出願の出願日前に開示されたもののみ組み込まれ、発明者らは先行発明によってこのような開示を回避する権利を保有することに留意すべきである。
以下は国際出願時の特許請求の範囲に記載された発明である。
[１] １５〜３０ヌクレオチドの長さを有し標的ＲＮＡに相補的なＡ鎖と、５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ１鎖と、５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ２鎖と、を含むリボ核酸であって、ここで：
（ａ）前記Ｓ１鎖と前記Ａ鎖がアニールして、長さ５〜１３塩基対の第一の二本鎖領域を形成し；
（ｂ）前記Ｓ２鎖と前記Ａ鎖がアニールして、第二の二本鎖領域を形成し；
（ｃ）前記第一の二本鎖領域がギャップによって前記第二の二本鎖領域と分離されて、前記ギャップは前記Ａ鎖の１〜１０の不対ヌクレオチドであり、前記ギャップは前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間に存在し；そして、
（ｄ）前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜５ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。
[２] Ａ鎖と、Ｓ１鎖と、Ｓ２鎖とを含むリボ核酸であって、ここで：
前記Ａ鎖が、１８〜２５ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖であり；
前記Ｓ１鎖が、５〜１５ヌクレオチドの長さを有し；
前記Ｓ２鎖が、３〜１３ヌクレオチドの長さを有し；
前記Ｓ１鎖と前記Ｓ２鎖の長さの合計が、１８〜２５ヌクレオチドで；
前記Ａ鎖、Ｓ１鎖、およびＳ２鎖が、第一の二本鎖領域と第二の二本鎖領域とを形成し；
前記第一の二本鎖領域が、ギャップによって前記第二の二本鎖領域と分離されて、前記ギャップは前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間の前記Ａ鎖の単鎖領域であり、ここで、前記ギャップは１〜１０ヌクレオチドの長さであり；そして、
前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜４ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。
[３] １６〜３０ヌクレオチドの長さを有し標的ＲＮＡに相補的なＡ鎖と、５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ１鎖と、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ２鎖と、を含むリボ核酸であって、ここで：
（ａ）前記Ｓ１鎖と前記Ａ鎖がアニールして、第一の二本鎖領域を形成し；
（ｂ）前記Ｓ２鎖と前記Ａ鎖がアニールして、第二の二本鎖領域を形成し；
（ｃ）１つ以上の二本鎖領域が、５塩基対〜１３塩基対の長さであり；
（ｄ）前記第一の二本鎖領域が、ギャップによって前記第二の二本鎖領域と分離されて、前記ギャップは前記Ａ鎖の１〜１０ヌクレオチドであり、前記ギャップは前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間にあり；そして、
（ｅ）前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜５ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。
[４] １５〜３０ヌクレオチドの長さを有し標的ＲＮＡに相補的なＡ鎖と、６〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ１鎖と、６〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ２鎖と、を含むリボ核酸であって、ここで：
（ａ）前記Ｓ１鎖と前記Ａ鎖がアニールして、長さ５〜１３塩基対の第一の二本鎖領域を形成し；
（ｂ）前記Ｓ２鎖と前記Ａ鎖がアニールして、第二の二本鎖領域を形成し；
（ｃ）前記リボ核酸が、前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間にニックを有し；そして、
（ｄ）前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜５ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。
[５] Ａ鎖と、Ｓ１鎖と、Ｓ２鎖とを含むリボ核酸であって、ここで：
前記Ａ鎖が、１８〜２５ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖であり；
前記Ｓ１鎖が、５〜１５ヌクレオチドの長さを有し；
前記Ｓ２鎖が、３〜１３ヌクレオチドまたはそれ未満の長さを有し；
前記Ｓ１鎖と前記Ｓ２鎖の長さの合計が、１８〜２５ヌクレオチドであり；
前記Ａ鎖、Ｓ１鎖、およびＳ２鎖が、第一の二本鎖領域と第二の二本鎖領域とを形成し；
前記リボ核酸が、前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間にニックを有し；そして、
前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜４ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。
[６] １６〜３０ヌクレオチドの長さを有し標的ＲＮＡに相補的なＡ鎖と、５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ１鎖と、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＳ２鎖と、を含むリボ核酸であって、ここで：
（ａ）前記Ｓ１鎖と前記Ａ鎖がアニールして、第一の二本鎖領域を形成し；
（ｂ）前記Ｓ２鎖と前記Ａ鎖がアニールして、第二の二本鎖領域を形成し；
（ｃ）１つ以上の二本鎖領域が、５塩基対〜１３塩基対の長さで；
（ｄ）前記リボ核酸が、前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の間にニックを有し；そして、
（ｅ）前記リボ核酸が、０、１、または２つのオーバーハングを有し、ここで、前記オーバーハングは前記ギャップ中になく、それぞれが独立して、１〜５ヌクレオチドの長さである；
リボ核酸。
[７] 前記ギャップが１〜６不対ヌクレオチドの長さを有する請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[８] 前記ギャップが１不対ヌクレオチドの長さを有する請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[９] 前記オーバーハングが３’オーバーハングであり、各オーバーハングが１〜４ヌクレオチドの長さを有する請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１０] 前記リボ核酸の前記ギャップの一部ではない３’−末端が平滑末端である請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１１] 前記Ａ鎖が１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１２] 前記Ａ鎖が２５〜３０ヌクレオチドの長さを有する請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１３] 前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の長さの合計が１９〜２５塩基対である請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１４] 前記第一の二本鎖領域と前記第二の二本鎖領域の長さの合計が２５〜３０塩基対である請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１５] １つ以上のヌクレオチドが修飾された糖を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１６] １つ以上のヌクレオチドが２’糖架橋を有する請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１７] １つ以上のヌクレオチドが修飾されたヌクレオシド間結合を有する請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１８] １つ以上のヌクレオチドがロック核酸ヌクレオチドを有する請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[１９] １つ以上のヌクレオチドがロック核酸ヌクレオチドである、あるいは１つ以上のヌクレオチドが２’糖架橋を有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドがＧ形クランプを有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドが修飾されたヌクレオシド間結合を有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドが末端キャップ置換基を有する、１つ以上のヌクレオチドが２’−メトキシもしくはフルオロ修飾を有する、あるいは１つ以上のヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、またはこれらの任意の組み合わせである請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[２０] 前記リボ核酸のピリミジンの１つ以上が、式Ｉまたは式ＩＩに記載のピリミジンヌクレオシドを含む：

【化2】

式中、
Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは非置換−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり，
Ｒ３とＲ４は、それぞれ独立して、水酸基、保護水酸基、リン酸、またはヌクレオシド間結合基であり、および
Ｒ５とＲ８は、独立して、ＯまたはＳである、
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリボ核酸。
[２１] １つ以上のヌクレオシドが、Ｒ１がメチルでＲ２が−ＯＨである式Ｉに記載の請求項２０に記載のリボ核酸。
[２２] １つ以上のヌクレオシドが、Ｒ２が−ＯＣＨ３またはフルオロである式Ｉに記載の請求項２０に記載のリボ核酸。
[２３] 請求項１乃至２２のいずれか一項に記載のリボ核酸および薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、緩衝剤、安定剤、または保存剤を含む医薬組成物。
[２４] リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性のナノカプセル、生体接着性のマイクロスフェア、またはタンパク質性のベクター、をさらに含む請求項２３に記載の医薬組成物。
[２５] 標的遺伝子のｍＲＮＡを発現する細胞中において、前記標的遺伝子の発現を低減させる方法であって、請求項１乃至２２のいずれか一項に記載のリボ核酸を細胞に投与することを含む方法。
[２６] 前記細胞がヒト細胞である請求項２５に記載の方法。
[２７] 標的ＲＮＡの発現を低減させることによる、過増殖性疾病または炎症性疾病の治療方法であって、請求項１乃至２２のいずれか一項に記載のリボ核酸を、前記標的ＲＮＡを発現しているヒト対象に投与することを含む治療方法。
[２８] 請求項１乃至２２のいずれか一項に記載のリボ核酸を、感染したヒト対象に投与することを含み、ここで前記リボ核酸が、前記ヒト対象に感染している微生物の標的遺伝子の発現を低減させる感染症の治療方法。
[２９] ヒト対象中での、過増殖性疾病、炎症性疾病、または感染症の治療における薬剤としての請求項１乃至２２のいずれか一項に記載のリボ核酸の使用。
[３０] 過増殖性疾病、炎症性疾病、または感染症のヒト対象の治療における使用のための薬剤の製造における請求項１乃至２２のいずれか一項に記載のリボ核酸の使用。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】