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特許5877893融合ポリペプチドのアミノ酸配列およびその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5877893

(24)【登録日】2016年2月5日

(45)【発行日】2016年3月8日

(54)【発明の名称】融合ポリペプチドのアミノ酸配列およびその使用

(51)【国際特許分類】

C07K 19/00 20060101AFI20160223BHJP

C07K 14/195 20060101ALI20160223BHJP

C12N 9/90 20060101ALI20160223BHJP

C12P 21/08 20060101ALI20160223BHJP

C12N 15/09 20060101ALN20160223BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00ZNA

C07K14/195

C12N9/90

C12P21/08

!C12N15/00 A

【請求項の数】22

【全頁数】80

(21)【出願番号】特願2014-508814(P2014-508814)

(86)(22)【出願日】2012年5月4日

(65)【公表番号】特表2014-520073(P2014-520073A)

(43)【公表日】2014年8月21日

(86)【国際出願番号】EP2012058207

(87)【国際公開番号】WO2012150320

(87)【国際公開日】20121108

【審査請求日】2013年12月19日

(31)【優先権主張番号】11164957.0

(32)【優先日】2011年5月5日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】12155742.5

(32)【優先日】2012年2月16日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラロシュアーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡＲＯＣＨＥＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本和弥

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアスハーバート

(72)【発明者】

【氏名】カサゴラバルリベーラダビド

(72)【発明者】

【氏名】ドゥエフェルハルトムート

(72)【発明者】

【氏名】ゲルグミハエル

(72)【発明者】

【氏名】ショルツクリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】シュレームルミハエル

【審査官】戸来幸男

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９−５２１９３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４−５３５１９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７−１１７０９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Mol. Biol.，２０１０年，vol.398, no.3，pp.375-390

【文献】 FKBP-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (slyD) [Thermococcus gammatolerans EJ3]，２０１０年１１月２９日，Accession no. ACS32696，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/239909805?sat=14&satkey=10484338

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ１９／００

Ｃ０７Ｋ１４／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Iのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
NH₂-S₂-X₁-S₁-COOH （式I）
式中、
X₁は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかを含み、
S₂およびS₁は、第2ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であり、
-はペプチド結合を表し、
ここで、該第2ポリペプチドは、ペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するポリペプチドであるかまたはFKBPフォールドドメインファミリー由来であり、かつ
X₁は、第2ポリペプチドのインサート・イン・フラップ（insert-in-flap）ドメイン（IFドメイン）の位置に挿入されている、
前記融合ポリペプチド。

【請求項2】

融合ポリペプチドが式IIのポリペプチドを含むことを特徴とし、
NH₂-S₄-X₂-S₃-S₂-X₁-S₁-S₀-COOH （式II）
式中、
X₁は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかを含み、
S₂およびS₁は、どちらも第2ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であり、
S₃およびS₀は、存在しないかまたは第3ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であるかのいずれかであり、
S₄は、存在しないかまたは第4ポリペプチド由来のアミノ酸配列であるかのいずれかであり、
X₂は、存在しないかまたはペプチド性リンカー配列であるかのいずれかであり、
ここで、該第2ポリペプチドおよび該第3ポリペプチドおよび該第4ポリペプチドは、互いに異なっており、かつペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するポリペプチドであるおよび／またはFKBPフォールドドメインファミリー由来であり、かつ
X₁は、該第2ポリペプチドのインサート・イン・フラップドメイン（IFドメイン）の位置に挿入されている、
請求項1記載の融合ポリペプチド。

【請求項3】

前記第2ポリペプチドが、SlyDであることを特徴とする、請求項1または2記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記第2ポリペプチドが、好熱菌由来のポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

好熱菌が、好熱性細菌または好熱性古細菌であることを特徴とする、請求項4記載の融合ポリペプチド。

【請求項6】

好熱菌が、サーマス（Thermaceae）科由来であることを特徴とする、請求項4または5記載の融合ポリペプチド。

【請求項7】

好熱菌が、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）であることを特徴とする、請求項4〜6のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

好熱性古細菌が、超好熱性古細菌であることを特徴とする、請求項5記載の融合ポリペプチド。

【請求項9】

好熱菌が、サーモコッカス（Thermococci）綱由来であることを特徴とする、請求項4〜5および8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項10】

好熱菌が、サーモコッカス・ガンマトレランス（Thermococcus gammatolerans）であることを特徴とする、請求項4〜5および8〜9のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項11】

X₁が、隠れたエピトープに対応するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項12】

前記第2ポリペプチドおよび前記第3ポリペプチドおよび前記第4ポリペプチドが、異なる種由来であることを特徴とする、請求項2〜11のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項13】

前記第2および／または第3ポリペプチドが、少なくとも60℃の最適成長温度を有する好熱菌由来のポリペプチドであることを特徴とする、請求項2〜12のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項14】

好熱菌が、サーマス・サーモフィルスまたはサーモコッカス・ガンマトレランスであることを特徴とする、請求項13記載の融合ポリペプチド。

【請求項15】

X₁が、式IIIのポリペプチドであることを特徴とし、
X_aX_bX_cX_d-X₀-X_eX_fX_gX_h （式III）
式中、X₀は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかであり、
X_a〜X_hの各々はアミノ酸残基を表し、かつX_a〜hのいずれも個々に存在しても存在しなくてもよい、
請求項1〜14のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項16】

X₁が、
GS-X₀-GSS （式VI）、
AGS-X₀-GSS （式V）、
CG-X₀-GC （式VI)、
C-X₀-GC （式VII)、
G-X₀-G （式VIII）、
S-X₀-GSS （式IX）、
GG-X₀-GG （式X）、
G-X₀-TGG （式XI）、
GGGS-X₀-GGGS （式XII）、
GGNP-X₀-GPT （式XIII）、
からなる群より選択されるポリペプチドであり、式中、X₀は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかであることを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。

【請求項17】

実験動物においてX₁に対する免疫応答を惹起するための、請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチドの使用。

【請求項18】

実験動物において、あるポリペプチドに対する免疫応答を惹起する方法であって、実験動物に対して、X₁が該ポリペプチドのアミノ酸配列である請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを少なくとも1回投与する工程を含む、前記方法。

【請求項19】

以下の工程を含む、標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する方法：
a）実験動物に対して、X₁のアミノ酸配列が該標的抗原のアミノ酸配列を含む請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを少なくとも1回投与する工程、
b）最後のポリペプチド投与の3〜10日後の実験動物から、該標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を回収する工程、および
c）該標的抗原に特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する工程。

【請求項20】

以下の工程を含む、標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する方法：
a）請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチドの投与後の実験動物から、X₁のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を回収する工程、および
b）X₁のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する工程。

【請求項21】

X₁のアミノ酸配列がエピトープを含む請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチドの、エピトープマッピングのための使用。

【請求項22】

以下の工程を含む、標的抗原に特異的に結合する抗体を選択する方法：
a）請求項1〜16のいずれか一項記載の融合ポリペプチドのX₁のアミノ酸配列が該標的抗原のアミノ酸配列を含む、固定化された標的抗原に対する複数の抗体の結合親和性を決定する工程、
b）予め規定された閾値レベルを超える見かけの複合体安定性を有する抗体を選択する工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、1つまたは複数のペプチジル-プロリルシス／トランスイソメラーゼまたはFKBPファミリーメンバーの1つまたは複数のフラグメントを含む融合ポリペプチド、および抗体のスクリーニング／選択、エピトープマッピング方法におけるその使用、および当該融合ポリペプチドによって表される免疫原性ペプチドまたは2次構造に特異的に結合する抗体の製造のための免疫原としてのその使用を報告する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
近年、治療抗体の製造は着実に増加しており、近い将来、治療抗体は様々な疾患の処置に利用可能な最大の治療剤グループになる可能性がある。治療抗体の効果は、それらの特異性、例えば特異的な標的認識結合機能からくるものである。

【0003】

抗体は、免疫原で免疫処置した実験動物から得ることができる。免疫原は、ほとんどの場合、ポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントである。免疫原を十分な量および純度で提供するため、組み換え生産された免疫原を使用することができる。

【0004】

一般に、ポリペプチドの組み換え生産に、原核生物細胞および真核生物細胞を使用することができる。組み換えポリペプチドは、可溶性の形態でまたは沈殿物（封入体）としてのいずれかで得ることができる。クロマトグラフィー精製の前に、封入体に含まれる不溶性のポリペプチドは可溶化する必要がある。

【0005】

一般に、免疫原は、合成性の、またはペプチド性の、または組み換え生産された、または融合、またはキメラ、または支持体結合されたポリペプチドである。免疫処置のために、免疫原は、単独またはアジュバント、例えばフロイントアジュバントと組み合わせてのいずれかで投与することができる。

【0006】

Knappe, T.A.ら（J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468）（非特許文献1）は、FKBP12のフラップ（Flap）領域を、構造的に関連する大腸菌（E.coli）シャペロンであるSlyDのIFドメインで置換できることを報告した。このキメラFKBP12-SlyD融合ポリペプチドは、単離されたポリペプチドと比較して、200倍高いペプチジル-プロリル-シス／トランスイソメラーゼ活性を有する。

【0007】

大腸菌SlyDおよびFKBP12（野生型ならびにC23AおよびC23S変異体）は、大腸菌において、可溶性形態で高収率で組み換え生産することができる（Standaert, R.F., et al., Nature 346（1990） 671-674（非特許文献2））。

【0008】

好熱性生物由来のFKBPおよび大腸菌SlyDは、大腸菌における融合ポリペプチドの組み換え発現におけるシャペロンとして使用することができる（Ideno, A., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 99-105（非特許文献3））。大腸菌SlyDおよびFKBP12ポリペプチドは、可逆的にフォールディングするポリペプチドである（Scholz, C., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703-12707（非特許文献4））。

【0009】

FKBP12ポリペプチドのアミノ酸配列は、60位に単一のトリプトファン残基を含んでいる。したがってFKBP12変異体は、単にトリプトファン蛍光を分析することによって構造完全性について分析することができる（DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180（非特許文献5））。FKBP12変異体の残存触媒活性の試験は、残存するロタマーゼ活性を決定することにより行うことができる（Brecht, S., et al., Neuroscience 120 (2003) 1037-1048（非特許文献6）; Schories, B., et al., J. Pept. Sci. 13 (2007) 475-480（非特許文献7）; Timerman, A.P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2451-2459（非特許文献8））。FK506またはラパマイシン結合を決定することによってFKBP12変異体の構造完全性を決定することも可能である（DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180（非特許文献9））。

【0010】

McNamara, A.ら（J. Org. Chem. 66 (2001) 4585-4594）（非特許文献10）は、2つのC(アルファ)部位間の脂肪族結合により拘束されたペプチド：i,(i+4)結合ペプチドのデザイン、合成、および予想外の立体配座特性を報告している。

【0011】

Suzukiら（Suzuki, R., et al., J. Mol. Biol. 328 (2003) 1149-1160（非特許文献11））は、ペプチジル-プロリル-シス-トランスイソメラーゼおよびシャペロン様活性の2機能を有する古細菌FKBPの3次元溶液構造を報告している。発現ベクター、宿主、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドの製造プロセスおよびタンパク質の製造プロセスは、EP 1 516 928で報告されている。Knappe, T.A.らは、シャペロンドメインの挿入によりFKBP12が強力なタンパク質フォールディングの触媒に変化することを報告している（J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468（非特許文献1））。優れたシャペロンおよびフォールディング活性を有するキメラ融合ポリペプチドは、WO 2007/077008（特許文献1）で報告されている。WO 03/000878（特許文献2）では、発現ツールとしてのFKBPシャペロンの使用が報告されている。EP 1 621 555（特許文献3）では、免疫原、免疫学的利用のための組成物およびこれを用いて抗体を製造する方法が報告されている。Rebuzzini, G.（University of Milano-Bicocca (Italy)におけるPhD研究（2009））は、C型肝炎ウイルスNS3ヘリカーゼドメインの化学発光免疫アッセイへの応用に関する研究を報告している。

【0012】

WO 2007/077008（特許文献1）では、優れたシャペロンおよびフォールディング活性を有するキメラ融合タンパク質が報告されている。シャペロンドメインの挿入による強力なタンパク質フォールディング触媒へのFKBP12の変換は、Knappeら（Knappe, T.A., et al., J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468（非特許文献1））によって報告されている

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】WO 2007/077008

【特許文献2】WO 03/000878

【特許文献3】EP 1 621 555

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Knappe, T.A.ら（J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468）

【非特許文献2】Standaert, R.F., et al., Nature 346（1990） 671-674

【非特許文献3】Ideno, A., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 99-105

【非特許文献4】Scholz, C., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703-12707

【非特許文献5】DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180

【非特許文献6】Brecht, S., et al., Neuroscience 120 (2003) 1037-1048

【非特許文献7】Schories, B., et al., J. Pept. Sci. 13 (2007) 475-480

【非特許文献8】Timerman, A.P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2451-2459

【非特許文献9】DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180

【非特許文献10】McNamara, A.ら（J. Org. Chem. 66 (2001) 4585-4594）

【非特許文献11】Suzuki, R., et al., J. Mol. Biol. 328 (2003) 1149-1160

【発明の概要】

【0015】

本明細書で報告される融合ポリペプチドは、(i）PPIase活性を有するまたはFKBPファミリーに属する1つの、すなわち同一の、または異なるポリペプチド由来の1つまたは複数の部分、および(ii）その間に挿入された免疫原性ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。

【0016】

本明細書で報告される融合ポリペプチドは、PPIase活性を有するまたはFKBPファミリーに属する1つまたは複数のポリペプチド由来の1つまたは複数の部分に挿入された免疫原性ポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製するための、動物の免疫処置に使用することができる。

【0017】

本明細書で報告される1つの局面は、式Iの融合ポリペプチドであって、
NH₂-S₂-X₁-S₁-COOH （式I）
式中、
X₁は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかを含み、
S₂およびS₁は、第2ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であり、
-はペプチド結合を表し、
ここで、該第2ポリペプチドは、ペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するポリペプチドであるかまたはFKBPドメインファミリー由来である、
前記融合ポリペプチドである。

【0018】

本明細書で報告される融合ポリペプチドにより、（天然に存在する）アミノ酸配列の内部（いわゆる隠れたまたは埋もれた）エピトープに特異的に結合する抗体を得ることができることが見出された。内部エピトープは、例えばその抗原性ポリペプチド（例えば、受容体）の活性化および同時に起こる立体配座変化の際にしかアクセスできないため、古典的な免疫処置プロトコルではアクセスすることができない。さらに、別の方法では十分な量または質で提供するのが困難な構造に由来する免疫原性ポリペプチドに特異的に結合する抗体を得ることができる。

【0019】

本明細書で報告される融合ポリペプチドは、例えば抗体のスクリーニング／選択またはエピトープマッピング方法におけるペプチドの2次および3次構造のディスプレイのためにならびに提示された抗原性アミノ酸配列または2次構造に特異的に結合する抗体の製造のための免疫原として使用することができる、キメラ組み換えポリペプチドである。本明細書で報告されるポリペプチドは、組み換え生産することができ、熱力学的に安定であり、モノマーであり、かつ水溶液に溶解する。

【0020】

本明細書で報告される1つの局面は、式IIの融合ポリペプチドであって、
NH₂-S₄-X₂-S₃-S₂-X₁-S₁-S₀-COOH （式II）
式中、
X₁は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかを含み、
S₂およびS₁は、第2ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であり、
S₃およびS₀は、存在しないかまたは第3ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であるかのいずれかであり、
S₄は、存在しないかまたは第4ポリペプチド由来のアミノ酸配列であるかのいずれかであり、
X₂は、存在しないかまたはペプチド性リンカー配列であるかのいずれかであり、
-はペプチド結合を表し、
ここで、該第2ポリペプチドおよび該第3ポリペプチドおよび該第4ポリペプチドは、互いに異なっており、かつペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するポリペプチドであるかまたはFKBPドメインファミリー由来である、
前記融合ポリペプチドである。

【0021】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、ペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性を有するかまたはFKBPドメインファミリー由来である第2ポリペプチドは、SlyDである。

【0022】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドは、好熱菌由来のポリペプチドである。

【0023】

1つの態様において、好熱菌は、好熱性細菌である。1つの態様において、該好熱性細菌は、サーマス（Thermaceae）科由来である。1つの態様において、好熱菌は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）である。

【0024】

1つの態様において、好熱菌は、好熱性古細菌である。1つの態様において、該好熱性古細菌は、超好熱性古細菌である。1つの態様において、好熱菌は、サーモコッカス（Thermococci）綱由来である。1つの態様において、好熱菌は、サーモコッカス・ガンマトレランス（Thermococcus gammatolerans）である。

【0025】

1つの態様において、好熱菌は、少なくとも60℃の最適成長温度を有する。

【0026】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、免疫原性配列は、X₁アミノ酸配列に含まれる。1つの態様において、X₁アミノ酸配列は、免疫原性配列およびペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するさらなるポリペプチド由来またはFKBPフォールドドメインファミリーのさらなるポリペプチド由来の1つまたは複数の部分を含み、このさらなるポリペプチドは、第2ポリペプチドと異なるものである。

【0027】

X₁のアミノ酸配列は、第2ポリペプチドのインサート・イン・フラップ（insert-in-flap）ドメイン（IFドメイン）の位置に挿入される。したがって、X₁がIFドメインと同一である、すなわちIFドメインのアミノ酸配列を有する場合、融合ポリペプチドS₂-X₁-S₁は、天然に存在する第2ポリペプチドの対応する部分と同一である。

【0028】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチド由来のS₂およびS₁アミノ酸配列は、野生型（天然に存在する）第2ポリペプチドのIFドメインによって相互に（直接）接続される。

【0029】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁は、第2ポリペプチドのインサート・イン・フラップドメイン（IFドメイン）の位置に挿入される。

【0030】

本明細書で報告される1つの局面は、X₁を除いて決定した場合は式Iの、またはX₁、X₂および非存在の配列を除いて決定した場合は式IIのポリペプチドに対して少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。1つの態様において、ポリペプチドは、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。1つの態様において、ポリペプチドは、少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。1つの態様において、ポリペプチドは、少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。1つの態様において、ポリペプチドは、少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有する。

【0031】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁は、隠れたエピトープに対応するアミノ酸配列を含む。

【0032】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁は、4〜約500アミノ酸残基のアミノ酸配列長を有する。1つの態様において、X₁は、5〜約100アミノ酸残基のアミノ酸配列長を有する。1つの態様において、X₁は、約7〜約60アミノ酸残基のアミノ酸配列長を有する。

【0033】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁の少なくとも1つのアミノ酸残基は、翻訳後修飾を含む。1つの態様において、X₁の1つ、または2つ、または3つ、または4つ、または5つ、または6つ、または7つ、または8つ、または9つ、または10のアミノ酸残基が、翻訳後修飾を含む。

【0034】

1つの態様において、融合ポリペプチドは、以下の式にしたがうものであり、
NH₂-S₃-S₂-X₁-S₁-S₀-COOH
式中、
X₁は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかを含み、
S₂およびS₁は、第2ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であり、
S₃およびS₀は、存在しないかまたは第3ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であるかのいずれかであり、
-はペプチド結合を表し、
ここで、第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドは、互いに異なっており、かつペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するかまたはFKBPドメインファミリー由来のポリペプチドである。

【0035】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドおよび第4ポリペプチドは、異なる種由来である。

【0036】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたは植物ポリペプチドまたは細菌ポリペプチドまたは古細菌ポリペプチドである。

【0037】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第3ポリペプチドは、ヒトポリペプチドまたは細菌ポリペプチドまたは古細菌ポリペプチドである。

【0038】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第4ポリペプチドは、細菌ポリペプチドまたは古細菌ポリペプチドである。

【0039】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第4ポリペプチドは、細菌ポリペプチドである。1つの態様において、該細菌ポリペプチドは、好熱性細菌由来のポリペプチドである。1つの態様において、好熱菌は、サーマス科由来である。1つの態様において、好熱菌は、サーマス・サーモフィルスである。

【0040】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第4ポリペプチドは、古細菌ポリペプチドである。1つの態様において、該古細菌ポリペプチドは、超好熱性古細菌由来のポリペプチドである。1つの態様において、好熱菌は、サーモコッカス綱由来である。1つの態様において、古細菌生物は、サーモコッカス・ガンマトレランスである。

【0041】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、好熱菌は、少なくとも60℃の最適成長温度を有する。

【0042】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第1ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。

【0043】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁は、ジペプチドGSがN末端に付加されかつトリペプチドGSSがC末端に付加された、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかである。

【0044】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁は、式IIIのポリペプチドであり、
X_aX_bX_cX_d-X₀-X_eX_fX_gX_h （式III）
式中、X₀は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかであり、
X_a〜X_hの各々は（天然に存在する）アミノ酸残基を表し、X_a〜hのいずれも個々に存在しても存在しなくてもよい。

【0045】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁は、式IV〜式XIII、
GS-X₀-GSS （式IV）、
AGS-X₀-GSS （式V）、
CG-X₀-GC （式VI)、
C-X₀-GC （式VII)、
G-X₀-G （式VIII）、
S-X₀-GSS （式IX）、
GG-X₀-GG （式X）、
G-X₀-TGG （式XI）、
GGGS-X₀-GGGS （式XII）、
GGNP-X₀-GPT （式XIII）、
からなる群より選択されるポリペプチドであり、式中、X₀は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかである。

【0046】

1つの態様において、X₀は、そのN末端およびC末端で、個別の（単一の）システイン残基に隣接している。

【0047】

1つの態様において、X₁は、N末端アミノ酸残基内にシステイン残基、およびC末端アミノ酸残基内にシステイン残基を含む。1つの態様において、NまたはC末端アミノ酸残基は、8つの末端残基である。1つの態様において、X₁は、そのN末端に1つのシステイン残基、およびそのC末端に1つのシステイン残基を含む。

【0048】

1つの態様において、X₁は、環状に拘束されたポリペプチドである。

【0049】

1つの態様において、X₁は、環状ポリペプチドである。

【0050】

1つの態様において、X₁のシステイン残基は、4.3オングストローム〜6.5オングストロームのアルファ炭素原子間距離を有する。1つの態様において、X₁のシステイン残基は、4.5オングストロームのアルファ炭素間距離を有する。1つの態様において、X₁のシステイン残基は、5.6オングストロームの平均アルファ炭素原子間距離を有する。

【0051】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁またはX₀は、4〜約500アミノ酸残基の長さを有する。

【0052】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₂は、約10〜約30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である。

【0053】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）FKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₄、X₂、S₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、かつS₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、かつS₄、X₂、S₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:04を有し、かつS₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:05を有し、S₄、X₂、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式IVのポリペプチド（GS-X₀-GSS）である。

【0054】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはヒトFKBP12（SEQ ID NO:06）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₄、X₂、S₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:07を有し、かつS₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:08（LVFDVELLKLE）を有し、かつS₄、X₂、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式III（GS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0055】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはサーマス・サーモフィルスSlyD（SEQ ID NO:09）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₄、X₂、S₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:10を有し、かつS₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:11を有し、かつS₄、X₂、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式V（AGS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0056】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第3ポリペプチドはヒトFKBP12（SEQ ID NO:06）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₄およびX₂は存在しない。1つの態様において、S₃はSEQ ID NO:07のアミノ酸配列を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、S₀はアミノ酸配列SEQ ID NO:08（LVFDVELLKLE）を有し、S₄およびX₂は存在せず、かつX₁は式IV（GS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0057】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第3ポリペプチドはサーマス・サーモフィルスSlyD（SEQ ID NO:09）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₄およびX₂は存在しない。1つの態様において、S₃はSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、S₀はアミノ酸配列SEQ ID NO:11（LVFDVELLKLE）を有し、S₄およびX₂は存在せず、かつX₁は式IV（GS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0058】

【0059】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、第3ポリペプチドはヒトFKBP12（SEQ ID NO:06）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドは大腸菌SlyD（SEQ ID NO:12）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。1つの態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:12を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₃はSEQ ID NO:07のアミノ酸配列を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、S₀はアミノ酸配列SEQ ID NO:08（LVFDVELLKLE）を有し、かつX₁は式IV（GS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0060】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、第3ポリペプチドはサーマス・サーモフィルスSlyD（SEQ ID NO:09）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドは大腸菌SlyD（SEQ ID NO:12）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。1つの態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:12を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₃はSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、S₀はアミノ酸配列SEQ ID NO:11（LVFDVELLKLE）を有し、かつX₁は式IV（GS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0061】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはサーマス・サーモフィルスSlyD（SEQ ID NO:09）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドは大腸菌SlyD（SEQ ID NO:12）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:12を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:10を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:11を有し、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式V（AGS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0062】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドは大腸菌SlyD（SEQ ID NO:12）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:12を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:04を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:05を有し、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式IV（GS-X₀-GSS）または式VI（(P)CG-X₀-GC）のポリペプチドである。

【0063】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD（SEQ ID NO:106）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₄、X₂、S₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:107を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:108を有し、S₄、X₂、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式IV〜式XIIIから選択されるポリペプチドである。

【0064】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第3ポリペプチドはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD（SEQ ID NO:106）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₄およびX₂は存在しない。1つの態様において、S₃はSEQ ID NO:107のアミノ酸配列を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、S₀はアミノ酸配列SEQ ID NO:108を有し、S₄およびX₂は存在せず、かつX₁は式IV〜式XIIIから選択されるポリペプチドである。

【0065】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、第3ポリペプチドはヒトFKBP12（SEQ ID NO:06）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD（SEQ ID NO:106）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。1つの態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:106を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₃はSEQ ID NO:07のアミノ酸配列を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、S₀はアミノ酸配列SEQ ID NO:08（LVFDVELLKLE）を有し、かつX₁は式IV〜式XIIIから選択されるポリペプチドである。

【0066】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、第3ポリペプチドはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD（SEQ ID NO:106）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドは大腸菌SlyD（SEQ ID NO:12）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。特定の態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:12を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₃はSEQ ID NO:107のアミノ酸配列を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:02（DRGAGC）を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:03（CLIPPASV）を有し、S₀はアミノ酸配列SEQ ID NO:108を有し、かつX₁は式IV〜式XIIIから選択されるポリペプチドである。

【0067】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD（SEQ ID NO:106）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドは大腸菌SlyD（SEQ ID NO:12）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:12を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:107を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:108を有し、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式IV〜式XIIIから選択されるポリペプチドである。

【0068】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、第2ポリペプチドはシロイヌナズナFKBP13（SEQ ID NO:01）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつ第4ポリペプチドはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD（SEQ ID NO:106）であるか、または少なくとも70%もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり、かつS₃およびS₀は存在しない。1つの態様において、S₄はアミノ酸配列SEQ ID NO:107を有し、X₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:13を有し、S₂はアミノ酸配列SEQ ID NO:04を有し、S₁はアミノ酸配列SEQ ID NO:05を有し、S₃およびS₀は存在せず、かつX₁は式IV〜式XIIIから選択されるポリペプチドである。

【0069】

本明細書で報告される局面の融合ポリペプチドは、例えば大腸菌において良好な収率で組み換え生産できるので、多くの用途を有する。例えば、融合ポリペプチドは、免疫処置、抗体作製、抗体スクリーニング、抗体エピトープマッピングまたは免疫組織化学スクリーニングにおいてアミノ酸配列を表すために使用することができる。

【0070】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₂は、アミノ酸配列

を有する。

【0071】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₁は、アミノ酸配列

を有し、ここで、X₀は4〜85アミノ酸残基のアミノ酸配列である。

【0072】

1つの態様において、大腸菌SlyDおよびヒトFKBP12のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが、不安定な立体配座のポリペプチドの提示のために使用される。

【0073】

1つの態様において、ヒトFKBP12およびシロイヌナズナFKBP13、またはサーマス・サーモフィルスSlyD単独、またはサーマス・サーモフィルスSlyDおよびシロイヌナズナFKBP13、またはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD単独、またはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyDおよびシロイヌナズナFKBP13のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが、安定な2次構造の提示のために使用される。

【0074】

本明細書で報告される1つの局面は、動物においてX₁またはX₀に対する免疫応答を惹起するための本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0075】

本明細書で報告される1つの局面は、動物においてポリペプチドに対する免疫応答を惹起する方法であって、X₀が免疫原性アミノ酸配列である本明細書で報告される融合ポリペプチドを動物に少なくとも1回投与する工程を含む前記方法である。

【0076】

本明細書で報告される1つの局面は、標的抗原に特異的に結合する抗体をコードする核酸を得る方法であって、以下の工程：
a）X₁のアミノ酸配列が該標的抗原のアミノ酸配列を含む、本明細書で報告される融合ポリペプチドを動物に少なくとも1回投与する工程、
b）最後のポリペプチド投与の3〜10日後に、該標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を動物から回収する工程、および
c）標的抗原に特異的に結合する抗体をコードする核酸をB細胞から得る工程、
を含む前記方法である。

【0077】

本明細書で報告される1つの局面は、標的抗原に特異的に結合する抗体の製造方法であって、以下の工程：
a）X₁のアミノ酸配列が該標的抗原のアミノ酸配列を含む、本明細書で報告される融合ポリペプチドを動物に少なくとも1回投与する工程、
b）最後のポリペプチド投与の3〜10日後に、該標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を動物から回収する工程、
c）場合により、該標的抗原に特異的に結合する抗体をコードする核酸をB細胞から得る工程、および
d）該標的抗原に特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する、工程、
を含む前記方法である。

【0078】

本明細書で報告される1つの局面は、標的抗原に特異的に結合する抗体の製造方法であって、以下の工程：
a）本明細書で報告される融合ポリペプチドの投与後の実験動物から、X₀のアミノ酸配列を有する、該標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を回収する工程、および
b）X₀のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、該抗体を細胞または培養培地から回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する工程、
を含む前記方法である。

【0079】

本明細書で報告される1つの局面は、X₁のアミノ酸配列がエピトープを含む本明細書で報告される融合ポリペプチドの、エピトープマッピングにおける使用である。

【0080】

本明細書で報告される1つの局面は、標的抗原に特異的に結合する抗体を選択する方法であって、以下の工程：
a）本明細書で報告される融合ポリペプチドのX₁のアミノ酸配列が該標的抗原のアミノ酸配列を含む、標的抗原に対する複数の抗体の結合親和性を決定する工程、
b）予め規定された閾値レベルを超える見かけの複合体安定性を有する抗体を選択する工程、
を含む前記方法である。

【0081】

本明細書で報告される1つの局面は、標的ポリペプチドの免疫組織化学分析に適した抗体を選択する方法であって、以下の工程：
a）複数の抗体の結合キネティクスを決定する工程、
c）予め規定された閾値レベルを超える見かけの複合体安定性を有する抗体を選択する工程、
を含む前記方法である。

【0082】

本明細書で報告される1つの局面は、標的アミノ酸配列に対する抗体の結合部位をマッピングする方法であって、以下の工程：
a）X₁のアミノ酸配列が該標的アミノ酸配列を含む、本明細書で報告される融合ポリペプチドが固定化された固相支持体を抗体と接触させる工程、
b）本明細書で報告される融合ポリペプチドとの抗体のキネティクス特性を決定する工程、
c）予め規定された閾値レベルを超える見かけの複合体安定性を有する抗体を選択する工程、
を含む前記方法である。

【0083】

本明細書で報告される1つの局面は、X₁のアミノ酸配列が、構造-機能の関係を決定したいポリペプチドを含む、構造-機能の関係を決定するための、本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0084】

本明細書で報告される1つの局面は、X₁のアミノ酸配列がポリペプチドを含む、ポリペプチドをその正確な2次および／または3次構造で提示するための、本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0085】

本明細書で報告される1つの局面は、スクリーニング方法における、本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0086】

1つの態様において、スクリーニング方法は、X₁に特異的に結合する分子を同定または選択するためのスクリーニング方法である。1つの態様において、分子は、低分子またはポリペプチドである。1つの態様において、ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントまたは抗体融合ポリペプチドである。

【0087】

本明細書で報告される1つの局面は、リボソームディスプレイにおける、本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0088】

本明細書で報告される1つの局面は、ファージディスプレイにおける、本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0089】

本明細書で報告される1つの局面は、細胞表面ディスプレイにおける、本明細書で報告されるポリペプチドの使用である。1つの態様において、細胞は、原核生物細胞である。1つの態様において、該原核生物細胞は、細菌細胞である。1つの態様において、細胞は、真核生物細胞である。1つの態様において、該真核生物細胞は、CHO細胞、またはHEK細胞、またはBHK細胞、またはSp2/0細胞、またはNS0細胞、または酵母細胞である。

【0090】

本明細書で報告される1つの局面は、本明細書で報告される方法によって製造される抗体である。

【0091】

本明細書で報告される1つの局面は、本明細書で報告される融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的調合物である。

【0092】

本明細書で報告される1つの局面は、検出可能な標識に結合された本明細書で報告される融合ポリペプチドを含む診断用調合物である。

【0093】

本明細書で報告される1つの局面は、医薬の製造における本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0094】

本明細書で報告される1つの局面は、疾患の処置のための、本明細書で報告される融合ポリペプチドの使用である。

【0095】

本明細書で報告される1つの局面は、個体を処置する方法であって、有効量の本明細書で報告される融合ポリペプチドを個体に投与する工程を含む、前記方法である。
[本発明1001]
式Iのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
NH₂-S₂-X₁-S₁-COOH （式I）
式中、
X₁は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかを含み、
S₂およびS₁は、第2ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であり、
-はペプチド結合を表し、
ここで、該第2ポリペプチドは、ペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するポリペプチドであるかまたはFKBPフォールドドメインファミリー由来であり、かつ
X₁は、第2ポリペプチドのインサート・イン・フラップ（insert-in-flap）ドメイン（IFドメイン）の位置に挿入されている、
前記融合ポリペプチド。
[本発明1002]
融合ポリペプチドが式IIのポリペプチドを含むことを特徴とし、
NH₂-S₄-X₂-S₃-S₂-X₁-S₁-S₀-COOH （式II）
式中、
X₁は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかを含み、
S₂およびS₁は、どちらも第2ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であり、
S₃およびS₀は、存在しないかまたは第3ポリペプチド由来の重複しないアミノ酸配列であるかのいずれかであり、
S₄は、存在しないかまたは第4ポリペプチド由来のアミノ酸配列であるかのいずれかであり、
X₂は、存在しないかまたはペプチド性リンカー配列であるかのいずれかであり、
ここで、該第2ポリペプチドおよび該第3ポリペプチドおよび該第4ポリペプチドは、互いに異なっており、かつペプチジル-プロリルシス／トランス-イソメラーゼ活性（PPIase活性）を有するポリペプチドであるおよび／またはFKBPフォールドドメインファミリー由来であり、かつ
X₁は、該第2ポリペプチドのインサート・イン・フラップドメイン（IFドメイン）の位置に挿入されている、
本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1003]
X₁がIFドメインの場合、S₂-X₁-S₁ポリペプチドが、天然に存在するポリペプチドのフラグメントまたは天然に存在するポリペプチドの全長であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1004]
前記第2ポリペプチドが、SlyDであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1005]
前記第2ポリペプチドが、好熱菌由来のポリペプチドであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1006]
好熱菌が、好熱性細菌または好熱性古細菌であることを特徴とする、本発明1005の融合ポリペプチド。
[本発明1007]
好熱菌が、サーマス（Thermaceae）科由来であることを特徴とする、本発明1005〜1006のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1008]
好熱菌が、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）であることを特徴とする、本発明1005〜1007のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1009]
好熱性古細菌が、超好熱性古細菌であることを特徴とする、本発明1005〜1006のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1010]
好熱菌が、サーモコッカス（Thermococci）綱由来であることを特徴とする、本発明1005〜1006および1009のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1011]
好熱菌が、サーモコッカス・ガンマトレランス（Thermococcus gammatolerans）であることを特徴とする、本発明1005〜1006および1009〜1010のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1012]
X₁が、隠れたエピトープに対応するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1013]
前記第2ポリペプチドおよび前記第3ポリペプチドおよび前記第4ポリペプチドが、異なる種由来であることを特徴とする、本発明1002〜1012のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1014]
前記第2および／または第3ポリペプチドが、少なくとも60℃の最適成長温度を有する好熱菌由来のポリペプチドであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1015]
好熱菌が、サーマス・サーモフィルスまたはサーモコッカス・ガンマトレランスであることを特徴とする、本発明1014の融合ポリペプチド。
[本発明1016]
X₁が、式IIIのポリペプチドであることを特徴とし、
X_aX_bX_cX_d-X₀-X_eX_fX_gX_h （式III）
式中、X₀は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかであり、
X_a〜X_hの各々はアミノ酸残基を表し、かつX_a〜hのいずれも個々に存在しても存在しなくてもよい、
前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1017]
X₁が、
GS-X₀-GSS （式VI）、
AGS-X₀-GSS （式V）、
CG-X₀-GC （式VI)、
C-X₀-GC （式VII)、
G-X₀-G （式VIII）、
S-X₀-GSS （式IX）、
GG-X₀-GG （式X）、
G-X₀-TGG （式XI）、
GGGS-X₀-GGGS （式XII）、
GGNP-X₀-GPT （式XIII）、
からなる群より選択されるポリペプチドであり、式中、X₀は、ランダムなアミノ酸配列または第1ポリペプチド由来のアミノ酸配列のいずれかであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1018]
実験動物においてX₁に対する免疫応答を惹起するための、本発明1001〜1017のいずれかの融合ポリペプチドの使用。
[本発明1019]
実験動物において、あるポリペプチドに対する免疫応答を惹起する方法であって、実験動物に対して、X₁が該ポリペプチドのアミノ酸配列である本発明1001〜1017のいずれかの融合ポリペプチドを少なくとも1回投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1020]
以下の工程を含む、標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する方法：
a）実験動物に対して、X₁のアミノ酸配列が該標的抗原のアミノ酸配列を含む本発明1001〜1017のいずれかの融合ポリペプチドを少なくとも1回投与する工程、
b）最後のポリペプチド投与の3〜10日後の実験動物から、該標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を回収する工程、および
c）該標的抗原に特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する工程。
[本発明1021]
以下の工程を含む、標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する方法：
a）本発明1001〜1017のいずれかの融合ポリペプチドの投与後の実験動物から、X₁のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を回収する工程、および
b）X₁のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を製造する工程。
[本発明1022]
X₁のアミノ酸配列がエピトープを含む本発明1001〜1017のいずれかの融合ポリペプチドの、エピトープマッピングのための使用。
[本発明1023]
以下の工程を含む、標的抗原に特異的に結合する抗体を選択する方法：
a）本発明1001〜1017のいずれかの融合ポリペプチドのX₁のアミノ酸配列が該標的抗原のアミノ酸配列を含む、固定化された標的抗原に対する複数の抗体の結合親和性を決定する工程、
b）予め規定された閾値レベルを超える見かけの複合体安定性を有する抗体を選択する工程。
[本発明1024]
標的抗原に特異的に結合する抗体を選択する方法であって、抗体を生成するための動物の免疫処置が、サーマス・サーモフィルス（Thermo thermophilus）SlyD-インサートを含む融合ポリペプチドおよびサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD-インサートを含む融合ポリペプチドを抗体の選択に用いて行われる、前記方法。
[本発明1025]
標的抗原に特異的に結合する抗体を選択する方法であって、抗原に特異的に結合する抗体の選択が、サーマス・サーモフィルスSlyD-インサートを含む融合ポリペプチドおよびサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD-インサートを含む融合ポリペプチドを抗体の生成（免疫処置）に用いて行われる、前記方法。
[本発明1026]
本発明1019〜1021および1023〜1025のいずれかの方法により得られる抗体。

【図面の簡単な説明】

【0096】

【図1】SlyD/FKBP12対照ポリペプチドのSDS PAGE（クマシー染色）およびウェスタンブロット（抗オクタhisタグ抗体との10秒間のインキュベーション）。

【図2】A：ERCC1（PDB 1Z00）：円で囲まれている部分はヘリックスターンヘリックスモチーブ（IAASREDLALSPGLGPQKARRLFD, C274S）である；B：FKBP12 C22A：円で囲まれた配列が置換された；FKBP12キメラはC末端で大腸菌SlyDに融合された。

【図3】SlyD/FKBP12-ERCC1ポリペプチドのSDS PAGE（クマシー染色）および抗hisタグウェスタンブロット（10秒間暴露）。M - Novex Sharp標準；1〜2.5μg SlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチド；2〜5.0μg SlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチド；3〜10μg SlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチド；M^* - Magic Mark。

【図4】300nm〜600nmの波長スキャンを600nm/分で行い、25℃、35℃、45℃、55℃、85℃でのSlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチドの蛍光発光強度を記録した。

【図5】FK-506に対するSlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチドの結合を決定するためのBIAcoreアッセイのスキーム。

【図6】溶液中分析物としての300nM SlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチドおよび300nM 野生型FKBP12 対センサー表面に提示されたビオチニル化リガンドbi-FK506。

【図7】SlyD/FKBP12-対照融合ポリペプチドの分析用HPLCのクロマトグラム。Ni-NTA精製の後、SlyD/FKBP12-対照がモノマーピークとして溶出している。

【図8】SlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチドの分析用HPLCのクロマトグラム。Ni-NTA精製の後、SlyD/FKBP12-ERCC1がモノマーピークとして溶出している。

【図9】溶液中分析物としてSlyD/FKBP12-ERCC1融合ポリペプチドおよび300nM SlyD/FKBP12-対照を用いるBIAcore結合アッセイキネティクススクリーニングのスキーム。CM5センサー、Capture RAMFCy：ウサギ抗マウスFcガンマ捕捉抗体。

【図10】溶液中分析物としてSlyD/FKBP12-ERCC1を用いたキネティクススクリーニングにより決定された、抗ERCC1抗体のキネティクス特性を示す最終安定（Stability Late）／最終結合（Binding Late）プロット。すべてのクローンが最終結合値＞40RUで10^-5 l/sの傾向線上に存在しており、このことは並外れた抗原複合体安定性を示している。SlyD/FKBP12-対照に対する結合は検出できない。

【図11】キネティクススクリーニングにより決定された抗ERCC1抗体の特性。最終結合／抗体捕捉レベルプロットは、傾向線による結合価のコリドー（corridor）を示している。すべての5.00X.35姉妹クローン（円で囲まれたもの）は、この結合価のコリドー上のモル比=0.5からモル比=1の間に存在し、これらをさらなる処理のために選択した。

【図12A】キネティクススクリーニングによって決定された抗ERCC1抗体のキネティクス特性の表。BL:最終結合、SlyD/FKBP12-ERCC1の結合フェーズの終点におけるシグナルの振幅の高さを相対反応単位で表したもの。SL：最終安定、SlyD/FKBP12-ERCC1の解離フェーズの終点のシグナルの振幅の高さを相対反応単位で表したもの。kd：解離フェーズのラングミュアフィットにしたがう解離速度定数（l/s）。t1/2 diss：t1/2 diss = ln(2)/(60^*kd)の式にしたがい算出される、抗体-SlyD/FKBP12-ERCC1複合体の半減期を分で表したもの。

【図12B】キネティクススクリーニングによって決定された抗ERCC1抗体のキネティクス特性の表。BL:最終結合、SlyD/FKBP12-ERCC1の結合フェーズの終点におけるシグナルの振幅の高さを相対反応単位で表したもの。SL：最終安定、SlyD/FKBP12-ERCC1の解離フェーズの終点のシグナルの振幅の高さを相対反応単位で表したもの。kd：解離フェーズのラングミュアフィットにしたがう解離速度定数（l/s）。t1/2 diss：t1/2 diss = ln(2)/(60^*kd)の式にしたがい算出される、抗体-SlyD/FKBP12-ERCC1複合体の半減期を分で表したもの。

【図13】溶液中分析物としてSlyD/FKBP12-ERCC1を用いた、クローン<ERCC1>M-5.3.35の例示的な抗ERCC1抗体単一濃度キネティクス。

【図14】クローン<ERCC1>M-5.1.35を用いたウェスタンブロット。5μgのOVCAR-3およびHEK293細胞溶解産物をNuPAGE SDSゲル（Invitrogen）の各レーンに充填した。37kDaの特異的なERCC1バンドを検出した。

【図15】SCLC癌サンプルのFFPE包埋ヒト癌組織におけるERCC1の免疫組織化学検出。白色の矢印は、より暗色に見える、上昇したERCC1レベルを有する細胞を示している。

【図16】IGF-1（PDB:1PMX）およびIGF-2（PDB:1IGL）PyMOL1.4を重ねたもの。IGF-1およびIGF-2の配列アラインメント（clustalW）。黒枠は、IGF-1（74-90）およびIGF-2（53-65）のヘアピン配列を表している。

【図17】サーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドのSDS PAGE（クマシー染色）および抗hisタグウェスタンブロット（10秒間暴露）。M - Novex Sharp標準；1〜2.5μgサーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチド；2〜5.0μgサーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチド；3〜10μgサーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチド；M^* - Magic Mark。

【図18】サーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドの分析用HPLCのクロマトグラム。

【図19】SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)を用いたNMRIマウスの12週免疫処置後にELISAにより決定された血清力価。mE：ミリ吸光度、IGF-1：ネイティブヒトIGF-1（Peprotech）。

【図20】Balb/CおよびNMRIマウスの12週免疫処置後にELISAにより決定された血清力価。mE：ミリ吸光度、IGF-1：ネイティブヒトIGF-1（Peprotech）。

【図21】IGF-1、サーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドおよびサーマス・サーモフィルスSlyD野生型ポリペプチドに対する結合シグナルによる初代培養物のELISAスクリーニング。mE：ミリ吸光度、IGF-1：ネイティブヒトIGF-1（Peprotech）。

【図22】IGF-1、IGF-2、サーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドおよびサーマス・サーモフィルスSlyD野生型ポリペプチドに対する初代培養物<IGF-1>M-11.0.15の例示的なBIAcoreキネティクススクリーニング。

【図23】IGF-1、サーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドおよびサーマス・サーモフィルスSlyD野生型ポリペプチドに対するクローン培養物上清のELISAスクリーニング。IGF-1およびサーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドに対して上昇した結合吸収シグナルが検出できた。

【図24】IGF-1、IGF-2、サーマス・サーモフィルスSlyD-IGF-1(74-90)融合ポリペプチド、サーマス・サーモフィルスSlyD野生型ポリペプチド、サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD野生型ポリペプチド、サーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチド、サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD-IGF-2(53-65)融合ポリペプチドに対する、スキャホールドにより構築された<IGF-1>M-11.11.17-IgGのBIAcore測定。

【図25】融合ポリペプチドにより構築された抗IGF-1抗体の結合キネティクスの表。mAb：モノクローナル抗体；RU：センサー上に捕捉されたモノクローナル抗体の相対反応単位；Antigen：溶液中の抗原：kDa：溶液中分析物として注入された抗原の分子量；ka：結合速度定数；kd：解離速度定数；t1/2 diss：t1/2 diss = ln(2)/60^*kdの式にしたがい算出された抗体・抗原複合体の半減期；KD：解離定数；R_MAX：90nM分析物注入の結合フェーズの終点における結合シグナル；MR：モル比；Chi²：測定失敗；n.d.：検出できず。

【図26】DSC測定、10℃〜95℃の温度勾配でSlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドを融解させる2回の実施を重ねてプロットしたもの。SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドは、可逆的にフォールディングする。

【図27】サーマス・サーモフィルスSlyD野生型ポリペプチド、サーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチド（FKBP）およびサーマス・サーモフィルスSlyD-抗原融合ポリペプチドの近UV CDスペクトル。20℃ですべてのポリペプチドがそれらのネイティブ構造にフォールディングする。

【図28】サーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチドの温度依存的なCDスペクトル。加熱冷却の繰り返しは、サーマス・サーモフィルスSlyDのFKBPドメインが可逆的にフォールディングすることを示す。サーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチドは、65℃まで安定であり、85℃でアンフォールディングする。

【図29】サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD-抗原融合ポリペプチドの温度依存的なCDスペクトル。100℃では低シグナル側のプラトーに達せず、このことは、この融合ポリペプチドがなおも完全にアンフォールディングしていないことを示している。この融合ポリペプチドは80℃まで安定でありフォールディングしている。

【図30】モノマー性のサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD-抗原融合ポリペプチドを含む画分を、凍結解凍サイクルの繰り返しおよび温度ストレス試験の後に再クロマトグラフィーした。100μlの50mM K₂HPO₄/KH₂PO₄、pH 7.0、100mM KCl、0.5mM EDTA中のサーモコッカス・ガンマトレランスSlyD-抗原融合ポリペプチドの0.75ml/分でのNi-NTA溶出画分300μgの280nm SUX 200プロフィール。

【図31】サーマス・サーモフィルスSlyD野生型ポリペプチドのSDS PAGE（クマシー染色）およびウェスタンブロット（抗オクタhisタグ抗体との10秒間のインキュベーション）。

【図32A】このキネティクススクリーニングアプローチの抗IGF-1抗体に関する定量。空白のセルは、それぞれの値が検出できなかった／決定できなかったことを表す。

【図32B】このキネティクススクリーニングアプローチの抗IGF-1抗体に関する定量。空白のセルは、それぞれの値が検出できなかった／決定できなかったことを表す。

【図33】IGF-1の結合に関する12個のクローン培養物上清のキネティクス。

【図34】大腸菌で発現させたFKBP12/13融合ポリペプチドのSDS PAGE（クマシー染色）。

【図35】FKBP12/13融合ポリペプチド：Ni-NTA精製物のHPLC SEC溶出プロフィール。FKBP12/13融合ポリペプチドは大部分がモノマーである。

【図36】SlyD/FKBP12-IGF-1(74-90)融合ポリペプチドの分析用HPLCのクロマトグラム。

【図37】クマシー染色したネイティブNovex（登録商標）8-16% Tris-Glycine Mini Gel（Invitrogen） BM：BenchMark（商標）Pre-Stained Protein Ladder（Invitrogen）。F4〜f10：サイズ排除クロマトグラフィーの溶出画分。画分8および画分9は、37kDaの単一の明確なタンパク質バンドを示している。

【図38】異なる温度におけるSlyD-FKBP12/13-CSF1Rの蛍光発光。

【図39】サーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチドのSDS PAGE（クマシー染色）および抗hisタグウェスタンブロット（10秒間暴露）。タンパク質バンドは黒色の矢印で示されている。M - Novex Sharp標準；1〜2.5μgサーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチド；2〜5.0μgサーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチド；3〜10μgサーマス・サーモフィルスSlyD-ΔIF融合ポリペプチド；M^* - Magic Mark。

【図40】Ni-NTAクロマトグラフィー精製されたSlyD-FKBP12-CD81のSDSページ（左）およびウェスタンブロット（右）。M：Novex Sharp標準、1：SlyD/FKBP12-CD81；2.5μg MW：36kD、2：SlyD/FKBP12-CD81；5.0μg、3：SlyD/FKBP12-CD81；10μg M^*：Magic Mark。

【発明を実施するための形態】

【0097】

発明の詳細な説明
概して、例えばX₁のアミノ酸配列中に含まれる、抗原または抗原性もしくは免疫原性アミノ酸配列は、本明細書で報告される融合ポリペプチドの第2ポリペプチドのSlyD部分のインサート・イン・フラップドメイン（IFドメイン）の位置に挿入される。

【0098】

本明細書で報告されるすべての局面のうちの1つの態様において、X₀は、天然に存在するポリペプチドのフラグメントから選択されるかまたはランダムなアミノ酸配列である。1つの態様において、天然に存在するポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。

【0099】

X₁アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドは、一方では抗体生成のための動物の免疫処置に、他方ではランダム化によりまたは免疫処置後に得られる抗体ライブラリのスクリーニングに、使用することができる。任意のスクリーニングおよびディスプレイ技術、例えば、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、ウイルスディスプレイおよび本明細書で報告される融合ポリペプチドベースのディスプレイを用いることで、特異的結合因子を同定することもできる。

【0100】

サーマス・サーモフィルスSlyDおよびサーモコッカス・ガンマトレランス（Thermococcus gammadurans）SlyDは、それらのフラップドメインが外来アミノ酸挿入物X1で置き換えられた場合でさえも可逆的にフォールディングする能力を有する高安定性タンパク質である。これらの分子は、基本的にMattheakis, L. C., et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (1994) 9022-9026)の方法にしたがい、リボソームディスプレイにおいて、サーマス・サーモフィルスSlyDまたはサーモコッカス・ガンマトレランスSlyDのフレーム内でポリペプチド配列X1をディスプレイするために使用することができる。いわゆる三元複合体は、（3）リボソーム提示される融合ポリペプチドの遺伝子情報をコードする（2）mRNAに付加された（1）リボソームサブユニットからなる。

【0101】

三元複合体は、X1アミノ酸配列を特異的に認識する抗体または抗体フラグメントに対するパンニング手順において使用することができる。

【0102】

本明細書で報告される融合ポリペプチドは、本明細書で報告される融合ポリペプチドを用いた動物の免疫処置により得られる抗体のスクリーニング／選択に使用することができ、ここで動物の免疫処置に使用される融合ポリペプチドおよび得られる抗体のスクリーニングに使用される融合ポリペプチドは同一のX₁アミノ酸配列を有し、そして残りのアミノ酸配列は異なっている。これにより、スキャホールドに特異的に結合し免疫原性ペプチドX₁には特異的に結合しない抗体を除外することができる。

【0103】

1つの態様において、免疫処置に使用される融合ポリペプチドとスクリーニングに使用される融合ポリペプチドは、20%未満の配列同一性を有する。1つの態様において、配列同一性は、10%未満である。

【0104】

本明細書は、1つの局面として、そのN末端にサーマス・サーモフィルスSlyDポリペプチドのN末端フラグメント（SEQ ID NO:10）、すなわちサーマス・サーモフィルスSlyDポリペプチドの残基2〜64を含む融合ポリペプチドを報告する（番号付けは、SEQ ID NO:09のMを残基1として開始したものである）。その後に、X₁に含まれる免疫原性配列が挿入される。融合ポリペプチドのC末端は、サーマス・サーモフィルスSlyDポリペプチドのアミノ酸残基123〜149（SEQ ID NO:11）およびアミノ酸配列

を有する任意の精製タグによって形成される。

【0105】

本明細書は、1つの局面として、そのN末端にサーモコッカス・ガンマトレランスSlyDポリペプチドのN末端フラグメント（SEQ ID NO:106）、すなわちサーモコッカス・ガンマトレランスSlyDポリペプチドの残基2〜85を含む融合ポリペプチドを報告する（番号付けは、SEQ ID NO:107のMを残基1として開始したものである）。その後に、X₁に含まれる免疫原性配列が挿入される。融合ポリペプチドのC末端は、サーモコッカス・ガンマトレランスSlyDポリペプチドのアミノ酸残基137〜156（SEQ ID NO:108）およびアミノ酸配列

を有する任意の精製タグによって形成される。

【0106】

本明細書は、1つの局面として、そのN末端に大腸菌SlyDポリペプチドのN末端フラグメント、すなわち大腸菌SlyDポリペプチドの残基1〜165を含むポリペプチドを報告する（番号付けは、Mを残基1として開始したものである）。その後に、大腸菌SlyDフラグメントのC末端とヒトFKBP12ポリペプチドのN末端のフラグメント、すなわちヒトFKBP12ポリペプチドの残基2〜84、を接続するリンカーが挿入される（番号付けは、Mを残基1として開始したものである）。その後に、5〜500個のアミノ酸残基のアミノ酸配列が挿入され得る。ポリペプチドのC末端は、ヒトFKBP12ポリペプチドのアミノ酸残基97〜108およびアミノ酸配列

を有する精製タグによって形成される。

【0107】

本明細書で報告される1つの局面は、本明細書で報告される融合ポリペプチドの変種体であって、親ポリペプチドに対して少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ親ポリペプチドと比較して高い融点を有する変種体である。1つの態様において、融点は、少なくとも55℃である。1つの態様において、融点は、少なくとも60℃である。1つの態様において、融点は、少なくとも65℃である。

【0108】

「ポリペプチドに由来する」という用語は、それぞれのポリペプチドの全長アミノ酸配列のフラグメントであって、全長ポリペプチド内のそれぞれの配列に対して少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するものが示されていることを表す。

【0109】

X₁およびX₀アミノ酸配列は、それぞれ、それが少なくとも5アミノ酸残基長である限り、自由に選択できる。例えば、挿入される配列は、白血球マーカー、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、b、c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27およびそのリガンド、CD28およびそのリガンドB7.1、B7.2、B7.3、CD29およびそのリガンド、CD30およびそのリガンド、CD40およびそのリガンドgp39、CD44、CD45およびそのアイソフォーム、CDw52（キャンパス抗原）、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1およびTCR；組織適合抗原、MHCクラスIまたはII、ルイスY抗原、SLex、SLey、SLeaおよびSLeb；インテグリン、VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、αVβ3およびLFA-1、Mac-1およびp150,95、αVβ1、gpIIbIIIa、αRβ3、α6β4、αVβ5、αVβ6およびαV 62 7；セレクチン、L-セレクチン、P-セレクチンおよびE-セレクチンならびにそれらの対抗受容体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2およびLFA-3；インターロイキン、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14およびIL-15； IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、Il-14RおよびIL-15Rからなる群より選択されるインターロイキン受容体；PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、GroβおよびIL-8からなる群より選択されるケモカイン；TNFアルファ、TGFベータ、TSH、VEGF/VPF、VEGFA、VEGFB、VEGF111、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、PTHrP、EGFファミリー、FGF、PDGFファミリー、エンドセリン、フィブロシン（FSF-1）、ヒトラミニンおよびガストリン放出ペプチド（GRP）、PLGF、HGH、HGHRからなる群より選択される成長因子；TNFアルファR、RGFベータR、TSHR、VEGFR/VPFR、FGFR、EGFR、PTHrPR、PDGFRファミリー、EPO-R、GCSF-Rおよび他の造血受容体からなる群より選択される成長因子受容体；IFNCαR、IFNβRおよびIFNλRからなる群より選択されるインターフェロン受容体；IgE、FcγRIおよびFcγRIIからなる群より選択されるIgおよびその受容体；her2-neu、ムチン、CEAおよびエンドシアリンからなる群より選択される腫瘍抗原；チリダニ抗原、lol p1（草）抗原およびウルシオールからなる群より選択されるアレルゲン；CMV糖タンパク質B、HおよびgCIII、HIV-1エンベロープ糖タンパク質、RSVエンベロープ糖タンパク質、HSVエンベロープ糖タンパク質、HPVエンベロープ糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原からなる群より選択されるウイルスポリペプチド；緑膿菌内毒素およびオステオポンチン／ウロポンチン、ヘビ毒、クモ毒およびハチ毒コノトキシンからなる群より選択される毒素；補体C3b、補体C4a、補体C4b-9、Rh因子、フィブリノゲン、フィブリンおよびミエリン関連成長阻害因子からなる群より選択される血液因子；ならびにコレステロールエステル転移ポリペプチド、膜結合マトリクスメタロプロテアーゼおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）からなる群より選択される酵素、由来であり得る、すなわち、それらのフラグメントを含み得る。

【0110】

「ペプチド性リンカー配列」という用語は、天然および／または合成起源のペプチドリンカーを表す。これらは、20個の天然に存在するアミノ酸がモノマー基本単位となる直線状のアミノ酸鎖からなる。この鎖は10〜50アミノ酸、特に10〜30アミノ酸の長さを有する。リンカーは、反復するアミノ酸配列または天然に存在するポリペプチド、例えば、ヒンジ機能を有するポリペプチド、の配列を含み得る。1つの態様において、ペプチド性リンカーアミノ酸配列は、グリシン、グルタミンおよび／またはセリン残基が豊富なように設計された「合成性リンカーアミノ酸配列」である。これらの残基は、例えば、最大5アミノ酸の小さな反復単位、例えば、

として配置される。この小さな反復単位は、マルチマー単位を形成するよう、2〜6回繰り返され得る。マルチマー単位のアミノおよび／またはカルボキシ末端には、最大6つの追加、任意の、天然に存在するアミノ酸が付加され得る。他の合成性ペプチド性リンカーは、10〜20回繰り返されかつそのアミノおよび／またはカルボキシ末端に最大6つの追加、任意の、天然に存在するアミノ酸を含み得る単一のアミノ酸、例えば、リンカー

においてはセリンから構成される。特定のリンカーアミノ酸配列が、以下の表に示されている。1つの態様において、リンカーアミノ酸配列は、

から選択される。すべてのペプチド性リンカーは、核酸分子によってコードされ得、したがって組み換え発現させることができる。

【0111】

（表）

【0112】

参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列のアラインメントを行いそして必要な場合に最大のパーセント配列同一性を達成するようギャップを導入した後の、かつあらゆる保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば公開されているコンピュータソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にまたがって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントに適したパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的上、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.の著作物であり、そのソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559にユーザー文書と共に提出され、U.S. Copyright Registration第TXU510087号の下で登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公開されたものを利用可能である、またはそのソースコードからコンパイルされ得る。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムで利用されるようコンパイルされるはずである。すべての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定されており、それは異ならない。

【0113】

アミノ酸配列の比較にALIGN-2が利用される場合、所定のアミノ酸配列Bに対する所定のアミノ酸配列Aの％アミノ酸配列同一性（あるいは、所定のアミノ酸配列Bに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所定のアミノ酸配列Aということもできる）は、以下の通りに計算され：
分数X/Yの100倍
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2により、AとBのプログラムによるアラインメントにおいて一致と記録されたアミノ酸残基の数であり、ここで、Yは、Bのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの％アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの％アミノ酸配列同一性と等しくならないことが理解されるであろう。それ以外のことが具体的に示されていない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性の値は、直前の段落に記載されたようにALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られたものである。

【0114】

「動物」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ハムスター、カニクイザルおよびチンパンジーからなる群より選択される動物を表す。特に、動物は、マウスまたはウサギまたはハムスターまたはラットである。1つの態様において、動物は、非ヒト動物である。

【0115】

1つの態様において、「回収（する）」という用語は、（a）（i）標的抗原で免疫処置された動物由来のB細胞を不死化すること、および（ii）得られた不死化細胞を、標的抗原に特異的に結合する抗体の分泌についてスクリーニングすること、または（b）（i）フィーダー細胞の存在下で単細胞捕集されたB細胞を共培養すること、および（ii）その培養上清を、標的抗原に特異的に結合する抗体の存在についてスクリーニングすること、を含む。

【0116】

「標的抗原に特異的に結合する」という用語は、抗体が標的抗原に対して、少なくとも10^-8 mol/lの解離定数（= K_解離）、特に少なくとも10^-10 mol/lのK_解離で結合することを表す。同時に、標的抗原に特異的に結合しないという特性は、10^-7 mol/lまたはそれより悪い、例えば10^-5 mol/lのK_解離により担保される。

【0117】

「薬学的調合物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にすることができる形態にあり、かつその調合物を投与される対象に対して許容されない毒性を示す追加の成分を含まない調製物を表す。

【0118】

「薬学的に許容される担体」は、薬学的調合物中の、活性成分以外の、対象に対して非毒性の成分を表す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤または保存剤が含まれるがこれらに限定されない。

【0119】

「大腸菌SlyD」という用語は、以下のアミノ酸配列：

を有するポリペプチドを表す。

【0120】

「以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す」という用語は、与えられたアミノ酸配列のポリペプチドを表し、またX₁に関してそのポリペプチドと同じ特性を有するその変種体も包含する。1つの態様において、この用語は、少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを表す。1つの態様において、この用語は、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを表す。1つの態様において、この用語は、少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを表す。1つの態様において、この用語は、少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを表す。1つの態様において、この用語は、少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを表す。

【0121】

ポリペプチドが大腸菌内で生産されるまたは大腸菌由来である場合、そのアミノ末端メチオニン残基は通常、プロテアーゼによって効果的に切断されず、したがってそのアミノ末端メチオニン残基が生産されるポリペプチドに部分的に存在している。これをふまえて、すべての配列は、開始メチオニン残基を含めて示されている。

【0122】

「サーマス・サーモフィルスSlyD」という用語は、以下のアミノ酸配列：

を有するポリペプチドを表す。

【0123】

「サーモコッカス・ガンマトレランスSlyD」という用語は、以下のアミノ酸配列：

を有するポリペプチドを表す。

【0124】

「ヒトFKBP12」という用語は、以下のアミノ酸配列：

を有するポリペプチドを表す。

【0125】

「シロイヌナズナFKBP13」という用語は、以下のアミノ酸配列：

を有するポリペプチドを表す。

【0126】

「FKBP12融合ポリペプチド」という用語は、以下のアミノ酸配列：