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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5881711
(24)【登録日】2016年2月12日
(45)【発行日】2016年3月9日
(54)【発明の名称】無細胞血管製品
(51)【国際特許分類】
A61L 27/00 20060101AFI20160225BHJP
【ＦＩ】
A61L27/00 Q
【請求項の数】15
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2013-529715(P2013-529715)
(86)(22)【出願日】2011年9月26日
(65)【公表番号】特表2013-537828(P2013-537828A)
(43)【公表日】2013年10月7日
(86)【国際出願番号】GB2011051817
(87)【国際公開番号】WO2012042250
(87)【国際公開日】20120405
【審査請求日】2013年8月15日
(31)【優先権主張番号】1020846.0
(32)【優先日】2010年12月9日
(33)【優先権主張国】GB
(31)【優先権主張番号】1016150.3
(32)【優先日】2010年9月27日
(33)【優先権主張国】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】515201431
【氏名又は名称】ティシュー レジニックス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】100167623
【弁理士】
【氏名又は名称】塚中 哲雄
(72)【発明者】
【氏名】アイリーン インガム
(72)【発明者】
【氏名】ステーシー ポール ウィルショー
(72)【発明者】
【氏名】ジョン フィッシャー
【審査官】
井上 明子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００７−５２９２７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００９／００９６２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
英国特許出願公開第０２３７５７７１（ＧＢ，Ａ）
【文献】
米国特許第０４７７６８５３（ＵＳ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２００８／０３０６６１０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特表２００５−５３１３５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１０−５０９９６５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｌ１５／００−３３／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体外で、適切なドナー血管に下記工程（ｉ）〜（ｖｉ）の処理を施すことにより、天然型無細胞異種血管組織を調製する方法：
（ｉ）２００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を用いた前処理のインキュベーション、（ｉｉ）第１の殺菌洗浄、
（ｉｉｉ）少なくとも２サイクルの低張緩衝液および陰イオン洗浄剤を用いたインキュベーション、
（ｉｖ）ヌクレアーゼ処理、
（ｖ）高張液洗浄、および
（ｖｉ）最終殺菌処理工程。
（ｉ）２００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を用いた前処理のインキュベーション、（ｉｉ）第１の殺菌洗浄、
（ｉｉｉ）少なくとも２サイクルの低張緩衝液および陰イオン洗浄剤を用いたインキュベーション、
（ｉｖ）ヌクレアーゼ処理、
（ｖ）高張液洗浄、および
（ｖｉ）最終殺菌処理工程。
【請求項2】
ＥＤＴＡを用いた前記インキュベーション工程が高張緩衝溶液内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記陰イオン洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記最終殺菌処理によりウイルスを排除し、生物汚染度を低減する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記天然型無細胞異種血管組織の内面および外面のいずれか一方または両方を、抗凝固剤、合成五糖阻害剤、直接トロンビン阻害剤、ビタミンＫ拮抗薬、第Ｘａ因子阻害薬、銀、コラーゲンＩＶ、エラスチン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、および合成または天然のペプチドからなる群、またはこれらの混合物からから選択される材料で覆う工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記天然型無細胞異種血管組織に、上皮細胞、平滑筋細胞、多能性・多分化能の幹細胞、および線維芽細胞からなる群から選択された単一細胞集団または混合細胞集団を播種する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により得られる血管組織マトリックスの未処理対照と比較し、ＤＮＡ含有量が少なくとも８０％低減された天然型無細胞異種血管組織マトリックスを含み、前もって形成されたヒト抗体と反応しうるエピトープを内腔表面上に含まず、補体を活性化する能力をもたない製品。
【請求項8】
α−ｇａｌエピトープを内腔表面上に含まない、請求項７に記載の製品。
【請求項9】
（ｉ）ブタ外腸骨動脈（ＥＩＡ）およびブタ内頸動脈（ＩＣＡ）のいずれか一方であるか；
（ｉｉ）ウシ由来の製品であって、頸動脈、内乳動脈、内胸動脈、腸間膜静脈、および頸静脈からなる群から選択される、請求項７または８に記載の製品。
（ｉｉ）ウシ由来の製品であって、頸動脈、内乳動脈、内胸動脈、腸間膜静脈、および頸静脈からなる群から選択される、請求項７または８に記載の製品。
【請求項10】
前記ブタドナー血管の長さが最長３０ｃｍであり、前記ウシドナー血管の長さが最長８０ｃｍである、請求項７〜９のいずれかに記載の製品。
【請求項11】
生細胞の、または未処理の組織と比較して、コラーゲン含有量、グリコサミノグリカン含有量、エラスチン含有量、破裂圧力、縫合保持強度、最大抗張力、および低ひずみ速度破壊靭性値からなる群から選択される生化学的または生物力学的特性が同等または有意に異ならない、請求項７〜１０のいずれかに記載の製品。
【請求項12】
被膜をさらに含み、該被膜が適切な材料で内面（内腔）および外面のいずれか一方または両方を覆って設けられ、前記被膜の材料が抗凝固剤、合成五糖阻害剤、直接トロンビン阻害剤、ビタミンＫ拮抗薬、第Ｘａ因子阻害薬、銀、コラーゲンＩＶ、エラスチン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、および合成または天然のペプチドからなる群から選択されるか、またはこれらの混合物である、請求項７〜１１のいずれか一に記載の製品。
【請求項13】
上または中に単一細胞集団または混合細胞集団が播種され、前記細胞集団が移植箇所に応じて選択され、上皮細胞、平滑筋細胞、多能性・多分化能の幹細胞、および線維芽細胞からなる群から選択された、請求項７〜１２のいずれかに記載の製品。
【請求項14】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により得られる天然型無細胞異種血管組織マトリックス組織製品を、移植組織として用いる製品。
【請求項15】
バイパス手術または血管アクセスに用いられる請求項１４に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は無細胞異種マトリックスに関し、特に、生体適合性をもつとともに非免疫原性である無細胞の動脈などの小・中径の血管製品に関する。本発明はとりわけ、特に血管バイパス手術における無細胞製品の使用法および無細胞血管マトリックスを形成する方法を含む。
【背景技術】
【0002】
補体活性化は、実質臓器移植における炎症および拒絶反応の有用なメディエーターおよび診断指標である。機構的に、補体経路における一連のエフェクター分子は、顆粒球および単球などの自然免疫系細胞の走化性および活性化の主な要因となりうる炎症促進作用をもたらす。同時に、これら上記の補体メディエーターの多くは被移植部と移植部の間の内皮細胞界面を活性化させ破壊し、さらに補体は獲得免疫系のＢおよびＴリンパ球を刺激しうる。補体はアポトーシス細胞の非炎症性の損傷にも関与する。このため、補体経路は複数の作用機序により活性化され、多様な補体成分により移植片に対する反応を様々に調整することができる。
【0003】
これまでのところ、異種移植実験では、被移植体の免疫系の反応により生じる多くの障害のため、完全に成功したものはない。この反応は一般的に同種移植における反応より激しく、最終的に異種移植片を拒絶してしまう。移植片拒絶反応にはいくつかの種類があり、体液性免疫系の反応による超急性拒絶および急性血管性拒絶ならびに細胞性免疫による細胞性拒絶および慢性拒絶が挙げられる。
【0004】
超急性拒絶反応は移植片の内皮に異種反応性自然抗体（ＸＮＡｓ）が結合してヒト補体系を活性化させることにより起こる。主要なエピトープＸＮＡｓのターゲットは、α−ｇａｌエピトープ（ｇａｌα１−３ｇａｌβ１−（３）４ｇｌｃｎａｃ−ｒ）であり、これは酵素α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３ｇｔ）によるグリコシル化に起因して、非霊長類哺乳動物および広鼻猿（新世界猿）の糖脂質および糖タンパク質に多く存在する。ヒト、類人猿、および狭鼻猿（旧世界猿）には、このエピトープは存在しないが、これは祖先の旧世界霊長類でα１，３ｇｔ遺伝子が不活性化されたためである。その代わり、ヒト、類人猿、および狭鼻猿は、特にα−ｇａｌエピトープと相互作用し、かつ血中免疫グロブリンの約１％を構成する抗ｇａｌ抗体を生成する。α−ｇａｌエピトープによる免疫反応は、異種間の臓器/組織移植の重大な阻害要因となっている。ヒトへの異種移植を成功させるためには、異種移植片における自然抗ｇａｌ抗体とα−ｇａｌエピトープとの相互作用を解消することが不可欠である。抗ｇａｌ抗体はブタの細胞上に発現するα−ｇａｌエピトープに結合するため、ブタの臓器のヒトへの移植を妨げ、免疫学的障壁となってきた。従来技術として、ブタα−ｇａｌエピトープが欠如し、α１，３ｇｔ遺伝子が欠損したα１，３ｇｔノックアウトブタをつくることにより、この免疫学的障壁が部分的に解消され、これにより超急性拒絶反応が一部克服されることが知られているが、移植用のブタの生産にはコストと時間がかかる。さらに、少ないとはいえ潜在的には相当量のｇａｌα（１，３）ｇａｌがα１，３ｇｔノックアウト動物の組織で発現しており、これは、このエピトープの合成には別のグリコシルトランスフェラーゼも関与していることを示している（Milland et al Immunol. Cell Biol 2005, 83, 687-693）。また、従来技術として、コーヒー生豆のα−ガラクトシダーゼおよび組み換えヒトα−ガラクトシダーゼにより、ブタの大動脈弁や心膜組織などの組織の細胞表面からα−ｇａｌエピトープを除去することができることも知られている。しかし、酵素処理には費用対効果の面で限界があるだけでなく、組織の構築に悪影響を及ぼし、望ましくない酵素の残基が残存しうるという問題がある。超急性拒絶反応を克服するために、（Ｃ３を枯渇させる）コブラ毒因子、可溶性補体受容体タイプ１、抗Ｃ５抗体、またはＣ１インヒビター（Ｃ１−ＩＮＨ）を用いて被移植体の補体経路を阻害することも知られている。この手法には、コブラ毒因子の毒性に加え、最も重要な点としてこれらの処理が個体の機能補体系を奪ってしまうといった欠点がある。急性血管性拒絶に関していえば、この種の拒絶反応は、超急性拒絶が防止されても、不適合異種移植片において２〜３日以内に発生する。このプロセスは超急性拒絶反応よりも格段に複雑であり、現在完全には理解されていないが、超急性拒絶反応および急性血管性拒絶を防止すれば、血中にＸＮＡｓが存在していても異種移植片が生着し、免疫学的に順応させることが可能となる。補体経路が阻害されるか、血中抗体が除去されるかもしくは機能が変更されるか、または移植片の表面抗原の発現に変化があった場合、液性拒絶により移植片が破断される。これにより異種移植片の受容体の発現が増加し、ひいては保護遺伝子の発現が可能となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、補体を活性化しない無細胞異種血管マトリックスが望まれる。また、抗体による炎症反応を緩和するために、無細胞異種血管マトリックスは、抗原成分、特にα−ｇａｌエピトープを含まないことが望ましい。さらに、血管バイパス手術用の小・中径血管製品を作成する、費用効率がより高い別の方法を提供することが望ましい。α−ガラクトシダーゼ酵素の残基が残存しない、移植用の無細胞異種血管マトリックスを提供することも望まれる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の第１の態様によると、血管組織マトリックスの未処理対照と比較し、ＤＮＡ含有量が少なくとも８０％低減された天然型無細胞異種血管組織マトリックスを含み、前もって形成されたヒト抗体と反応しうるエピトープを実質的に含まず、補体を実質的に活性化する能力をもたない製品が提供される。
【0007】
本明細書において、「実質的に補体を活性化する能力をもたない」とは、本発明の製品が補体活性化試験においてヒトの生細胞の大腿動脈と同程度の補体活性能をもつことを示す。
【0008】
無細胞異種血管組織はα−ｇａｌを実質的に含まないことが好ましい。
【0009】
本明細書において、「前もって形成されたヒト抗体と反応しうるエピトープを実質的に含まない」とは、本発明の製品が生細胞のまたは無細胞のヒトの大腿動脈と同程度のα−ｇａｌエピトープをもつことを示す。
【0010】
好ましくは、無細胞異種血管組織マトリックスは、血管組織マトリックスの未処理対照または自然対照と比較し、ＤＮＡ含有量の減少率が少なくとも８０％以上であってもよく、すなわち８０％を超える最大１００％の任意の整数の減少率であってもよい。
【0011】
血管組織は、ブタ由来またはウシ由来であることが好ましい。好ましくはブタ由来の血管組織は小・中径血管であり、より好ましくはブタの外腸骨動脈（ＥＩＡ：ｅｘｔｅｒｎａｌ ｉｌｉａｃ ａｒｔｅｒｙ）およびブタの内頸動脈（ＩＣＡ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）のいずれかである。
【0012】
血管組織は特に限定されるものではないが、羊やラマなどの他の哺乳動物種、大型鳥類（例えばダチョウ）、および大型有袋類（例えばカンガルー）に由来するものであってもよいことを理解されたい。
【0013】
血管組織が大径の血管、例えばブタまたはウシの大動脈であってもよいことを理解されたい。
【0014】
本明細書において、「小径の」血管は内法が６ｍｍ未満の血管を指す語として当該技術分野で受け入れられており、「中径」は内法が６〜１５ｍｍの血管を指し、「大径」は内法が２５ｍｍ程度の血管を指す。
【0015】
無細胞異種血管組織マトリックスがウシ由来である、本発明の実施形態において、血管組織は頸動脈、内乳動脈、内胸動脈、腸間膜静脈、および頸静脈からなる群から選択される。
【0016】
無細胞異種血管組織は、生細胞の、または未処理の組織と比較し、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびエラスチンの含有量が同等または実質的に異ならないことが好ましい。
【0017】
生細胞または未処理のＩＣＡ組織のコラーゲン含有量は一般的に４００〜１０００μｇ／ｍｇの範囲内であり、より好ましくは６００〜８００μｇ／ｍｇの範囲内である。一方、ＥＩＡのコラーゲン含有量は２００〜１０００μｇ／ｍｇの範囲内であり、より好ましくは４５０〜６５０μｇ／ｍｇの範囲内である。一般的に、生細胞または未処理のＩＣＡおよびＥＩＡ組織のグリコサミノグリカン含有量は２５〜２００μｇ／ｍｇの範囲内であり、より好ましくは５０〜１００μｇ／ｍｇの範囲内である。
【0018】
無細胞異種血管組織は、生細胞のまたは未処理の組織と比較し、破裂圧力、縫合保持強度、最大抗張力、膨張、および低ひずみ速度破壊靭性の値が同等または著しく異ならないことが好ましい。
【0019】
生細胞の、または未処理のＩＣＡおよびＥＩＡ組織の破裂圧力平均値は一般的に３０００ｍｍＨｇより高く、生細胞の、または未処理のＩＣＡおよびＥＩＡ組織の標準的な縫合保持強度は１〜５Ｎの範囲内である。生細胞の、または未処理のＩＣＡおよびＥＩＡの軸方向における低ひずみ速度破壊靭性値は一般的に２．５〜６．５ＭＰａの範囲内であり、より好ましくは３．５〜５．５ＭＰａの範囲内である。一方、生細胞の、または未処理のＩＣＡおよびＥＩＡの組織の周方向における低ひずみ速度破壊靭性値は１〜６ＭＰａの範囲内であり、より好ましくは２〜５ＭＰａの範囲内である。典型的に、生細胞の、または未処理のＩＣＡおよびＥＩＡ組織の最大抗張力の平均値は３〜５ＭＰａの範囲内である。
【0020】
典型的に、ブタ由来の無細胞異種血管組織の長さは最長３０ｃｍ程度であって、ウシ由来の組織の長さは最長８０ｃｍ程度であることが好ましい。
【0021】
本発明の無細胞異種血管組織は天然のスキャフォールドであり、すなわち、遺伝子変異を受けず、α−ガラクトシダーゼ酵素の残基を実質的に含まない。さらに、この組織は生細胞の、または未処理の組織とほぼ同等の生物化学的・機械的特性をもつ点において有利であり、このため、抗原的に不活性である効果をもつとともに生細胞の、または未処理の組織として機能する。したがって、この組織は、移植およびバイパス交換手術用の理想的な製品候補となる。
【0022】
無細胞異種血管組織は被膜をさらに含み、被膜は適切な材料で内面（内腔）および外面の一方または両方を覆って設けることが好ましい。本発明の本実施形態は、血管移植片に特有の有用性についての実施形態である。
【0023】
血管の開通性を改善し、あるいは血管内腔または血管内腔の内面の内膜のいずれかを補助／修復する被膜材料を選択することが好ましい。
【0024】
皮膜は管腔皮膜であり、被膜の材料はヘパリンなどの抗凝固剤、合成五糖阻害剤、直接トロンビン阻害剤、ビタミンＫ拮抗薬、第Ｘａ因子阻害薬、銀、コラーゲンＩＶ、エラスチン、ラミニンやフィブロネクチンなどの糖タンパク質、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカン、および合成または天然のペプチドからなる群から選択されるか、またはこれらの混合物であることが好ましい。
【0025】
無細胞異種血管組織の上または中に単一または混合細胞集団を播種してもよく、細胞集団は移植箇所に応じて選択し、内皮・中皮・平滑筋細胞などの上皮細胞、線維芽細胞、自家および同種成体幹細胞などの多能性・多分化能の幹細胞、造血・間葉・ニューロン・内皮・胚・幹細胞からなる群から選択することが好ましい。
【0026】
本発明の別の態様によれば、適切な交換用血管を得て、（ｉ）ＥＤＴＡでのインキュベーション、
（ｉｉ）第１の殺菌洗浄、
（ｉｉｉ）少なくとも２サイクルの、低張緩衝液および陰イオン洗浄剤を用いたインキュベーション、
（ｉｖ）ヌクレアーゼ処理、
（ｖ）高張液洗浄、および
（ｖｉ）最終殺菌処理
の方法工程を交換用血管に施すことにより天然型無細胞異種血管組織を調製する方法が提供される。
【0027】
好ましくは、工程（ｉ）および（ｉｉ）は逆順で行ってもよく、本発明の工程は、この順序に制限されず、またこの順序は本発明の範囲を限定するものでもない。
【0028】
ＥＤＴＡを用いたインキュベーションは例えば５０ｍＭ ＴＲＩＳ・１．５Ｍ ＮａＣｌなどの高張緩衝溶液内で行うことが好ましく、典型的なプロトコルでは、このような２００ｍＭ ＥＤＴＡを含む高張緩衝液内で最低２４時間、４℃程度でインキュベーションを行う。高張溶液は微弱アルカリ性の生理的ｐＨ付近でおよそ７．２〜７．４の間のｐＨをもつ。
【0029】
工程（ｉｉ）における前記第１の殺菌洗浄はバンコマイシン、ゲンタマイシン、およびポリミキシンを含む低張緩衝溶液内での洗浄を含み、３０分前後の適切な洗浄時間、３７℃前後の温度で行うことが好ましい。
【0030】
工程（ｉｉｉ）の低張インキュベーション工程は、典型的に１０ｍＭ ＴＲＩＳを含む低張緩衝液に続いて２．７ｍＭ ＥＤＴＡ・１０ＫＩＵ／ｍＬアプロチニンをさらに含む低張緩衝液を用いた最初のインキュベーションを含むことが好ましい。インキュベーション条件は、典型的には４６〜５６時間、４℃前後で行う。次のインキュベーションでは、低張緩衝液が濃度０．１％（ｗ／ｖ）前後のＳＤＳなどの陰イオン洗浄剤をさらに含み、このインキュベーション中の温度は３７℃程度である。インキュベーション工程のこのサイクルは１回以上繰り返してもよい。
【0031】
その後、この組織は、工程（ｉｖ）のヌクレアーゼ処理を行う前にダルベッコリン酸緩衝生理食塩水でくり返し洗浄することが好ましい。ヌクレアーゼ処理では典型的に、５０ｍＭ ＴＲＩＳ， ５０Ｕ／ｍＬＤＮＡａｓｅ， １Ｕ／ｍＬ ＲＮＡａｓｅを含むヌクレアーゼ溶液内において３７℃でおよそ３時間のインキュベーションを行う。続いて、工程（ｖ）の前に組織をくり返し洗浄する。
【0032】
工程（ｖ）の高張インキュベーションでは、５０ｍＭ ＴＲＩＳ・１．５Ｍ ＮａＣｌ内において３７℃でおよそ２４時間のインキュベーションを行うことが好ましい。その後、工程（ｖｉ）の前に組織をくり返し洗浄する。
【0033】
好ましくは、無細胞異種血管組織を保管またはレシピエントへ移植する前に、最終殺菌処理によってウイルスを排除し、生物汚染度を低減する。
【0034】
最終殺菌工程は抗生物質・ディフェンシン・Ａｇ２＋のような金属などの抗菌剤の導入または抗菌剤による皮膜形成、グルタルアルデヒドなどの架橋剤による処理、過酢酸・エチレンオキシド・酸化プロピレン・水酸化ナトリウムなどの殺菌剤による処理、例えばγ線や電子線の照射、および超臨界二酸化炭素による処理のうち１つ以上の処理によって行うのが理想的である。
【0035】
この殺菌工程は、例えば濃度約０．１％（ｖ／ｖ）の過酢酸を用いた３７℃で約４時間のインキュベーションを含む第２の殺菌洗浄であってもよい。続いて、さらに組織をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水などの適切な最終洗浄液で洗浄する。
【0036】
濃度およびインキュベーションの条件は、本出願の範囲を限定することを意図したものではなく、単に典型的な方法的条件を提示するものである。
【0037】
この方法は、天然型無細胞異種血管組織の内面および／または外面を、前述のとおり定義したコーティング剤で覆う工程をさらに含むことが好ましい。
【0038】
この方法は、天然型無細胞異種血管組織に前述のとおり定義した単一または混合細胞集団を播種する工程をさらに含むことが好ましい。
【0039】
動脈などの血管組織は管状であるため、動脈内腔の内壁面に対し、前もって形成されたヒト抗体と反応しうるエピトープおよび補体を活性化しうるエピトープを除去する処理を確実に十分に行うことが非常に難しい。本発明の一実施形態において、血管組織には、継続的に流れる流体媒体を灌流してもよい。さらに、またはこれに代えて、血管組織の形成およびインキュベーション工程の間、血管組織の壁を薄くして種々の流体が流れやすくなるよう、膨張させてもよい。発明者らは、本発明の方法により内壁面への処理であっても成功させることができることを実証した。
【0040】
本発明のさらに別の態様によると、本発明の方法により得られる天然型無細胞異種血管組織マトリックス組織製品を移植組織として用いる製品が提供される。
【0041】
好ましくは、移植組織製品はバイパス手術、特に心臓および四肢のバイパス手術に用いられ、血管アクセス、例えば動静脈アクセスにも用いられる。
【0042】
ウシ由来の血管組織を用いる本発明の実施形態は、血管材料の長さの範囲が最長８０ｃｍであるため、四肢のバイパス手術において、また血管アクセス手段として特に有用である。
【0043】
また、本発明の別の態様によると、損傷した、または閉塞した血管を本発明の第１の態様の製品または本発明の方法により作成された天然型無細胞異種血管組織マトリックス組織製品に交換する血管バイパス手術の方法が提供される。
【0044】
以下、本発明の実施形態を、添付の図面を参照してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】無細胞組織を産生するための無細胞化プロトコルのフローチャートを示す。
【図2】２サイクルの低張緩衝液およびＳＤＳ溶液（１ｍｇ・ｍＬ−１）の処理を行い、その後ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した、ブタの内頸動脈（ＩＣＡ）を（Ａ）〜（Ｈ）に、外腸骨動脈（ＥＩＡ）を（Ｉ）〜（Ｌ）に示す。
【図3】２サイクルの低張緩衝液およびＳＤＳ溶液（１ｍｇ・ｍＬ−１）を用いて処理し、ＤＡＰＩにより染色したブタＩＣＡ（Ｃ〜Ｄ）およびＥＩＡ（Ｅ〜Ｆ）を示す。生細胞のブタＩＣＡ（Ａ）およびＥＩＡ（Ｂ）を陽性対照として用いた。
【図4】２サイクルの低張緩衝液およびＳＤＳ溶液（１ｍｇ・ｍＬ−１）を用いて処理した無細胞のブタＥＩＡを示し、（Ｃ）は生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡを示し、（Ｄ）および（Ｅ）はα−ｇａｌエピトープに対するモノクローナル抗体を用いて標識され、（Ｆ）はアイソタイプ対照を示す。生細胞のブタの皮膚を陽性対照として用いた（Ａ、Ｂ）。
【図5】４℃の２００ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｅ〜）および３７℃の高張緩衝液の処理を１サイクル実施し、α−ｇａｌエピトープに対するモノクローナル抗体を用いて標識した無細胞ＩＣＡを示す。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）、および（Ｆ）は未精製抗体により、（Ｃ）および（Ｇ）は０．３９・ｍＬ−１の精製抗体により、また（Ｄ）および（Ｈ）は０．１６ｍｇ・ｍＬ−１の純粋な抗体により標識した。
【図6】図１のプロトコルにしたがって無細胞ＥＩＡを調製し、（Ａ）精製済みのα−ｇａｌエピトープに対するモノクローナル抗体、（Ｂ）ＢＳＡに吸着した同抗体、（Ｃ）α−ｇａｌ−ＢＳＡに吸着した同抗体、（Ｄ）ＩｇＭアイソタイプ対照を用いて標識したものを示す。
【図7】（Ａ）精製済みのα−ｇａｌエピトープに対するモノクローナル抗体、（Ｂ）ＢＳＡに吸着した同抗体、（Ｃ）α−ｇａｌ−ＢＳＡに吸着した同抗体、（Ｄ）ＩｇＭアイソタイプを用いて標識した無細胞ＩＣＡを示す。
【図8】生細胞のおよび無細胞のブタまたはヒト同種血管が吸着後の、α−ｇａｌエピトープに対する抗体を検出するＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：酵素免疫吸着測定法）を示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。「*」は一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）および事後比較Ｔ検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｔ ｔｅｓｔ）により求められた有意差を示す。同様に、ＩＣＡ：生細胞のブタＩＣＡ、ＡＩＣＡ：無細胞ブタＩＣＡ、ＣＦＡ：生細胞のヒト総大腿動脈、ＡＣＦＡ：無細胞のヒト総大腿動脈、ＥＩＡ：生細胞のブタ外腸骨動脈、ＡＥＩＡ：無細胞のブタ外腸骨動脈、ＮＴＣ：非組織対照を示す。
【図9】生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡ（Ａ）およびＩＣＡ（Ｂ）のコラーゲン、変性コラーゲン、および硫酸化プロテオグリカンの含有量を示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。
【図10】シアノアクリレートコンタクト型接着剤（Ａ）、コラーゲンゲル（Ｂ、Ｅ）、または無細胞のブタのＥＩＡ（Ｃ、Ｆ）およびＩＣＡ（Ｄ、Ｇ）とともに４８時間培養し、ギムザ染色により染色して位相差顕微鏡法で観察した仔ハムスターの腎臓細胞を示す。
【図11】シアノアクリレートコンタクト型接着剤（Ａ）、コラーゲンゲル（Ｂ、Ｅ）、または無細胞のブタＥＩＡ（Ｃ、Ｆ）およびブタＩＣＡ（Ｄ、Ｇ）とともに４８時間培養し、ギムザ染色により染色して位相差顕微鏡法で観察したマウスの３Ｔ３細胞を示す。
【図12】生細胞のおよび無細胞のブタのＥＩＡ（Ｂ）およびＩＣＡ（Ａ）の抽出試料でインキュベーションされたマウスの３Ｔ３細胞または生細胞のおよび無細胞のブタのＥＩＡ（Ｄ）およびＩＣＡ（Ｃ）の抽出試料でインキュベーションされた仔ハムスターの腎臓細胞のＡＴＰの相対含有量を示す。４０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯでインキュベーションした試料を細胞毒性に関する陽性対照として、ＤＭＥＭでインキュベーションした試料を細胞毒性に関する陰性対照として用いた。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。記号「*」は一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定により求められた、ＤＭＥＭ対照に対する有意差を示す。
【図13】生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡ、生細胞のおよび無細胞のヒト総大腿動脈（ＣＦＡ）、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ、Ｐｅｒｍａｃｏｌ、およびＣｏｌｌａＭｅｎｄから抽出したＤＮＡを２６０ｎｍの吸光度を用いて定量化したものを示す。データは平均値（ｎ＝３）、信頼限界±９５％で表した。
【図14】生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの縫合保持強度試験を示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。
【図15】生細胞のおよび無細胞のブタＩＣＡ（Ａ、Ｂ）およびＥＩＡ（Ｃ、Ｄ）の拡張反応試験を示し、データは谷径の変化率を内圧の増加に対する関数として表す。Ｘ軸（Ａ、Ｃ）またはＹ軸（Ｃ、Ｄ）。データは平均値（ｎ＝３）、信頼限界±９５％で表し、データは統計的分析を行うために逆正弦変換した。
【図16】生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡ（Ａ）およびＩＣＡ（Ｂ）の周方向および軸方向の最大抗張力を示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。
【図17】生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡ（Ａ）およびＩＣＡ（Ｂ）の周方向および軸方向のコラーゲン相配向（ｐｈａｓｅ ｓｌｏｐｅ）を示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。
【図18】生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡ（Ａ）およびＩＣＡ（Ｂ）の周方向および軸方向のエラスチン相配向を示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。
【図19】正常ヒト血清と組織培養用プラスチック、ＰＢＳ、ＢＳＡ、α−ｇａｌ ＢＳＡまたはザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）との反応後の（ａ）Ｃ３ａまたは（ｂ）Ｃ５ａを検出するためのＥＬＩＳＡを示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。「*」は一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定により求められた有意差（ポリスチレンとの比較における）を示す。
【図20】正常ヒト血清と、組織培養用プラスチック、ＰＢＳ、ＢＳＡ、α−ｇａｌ ＢＳＡ、ザイモサン、または様々な市販の無細胞の生物学的スキャフォールド（Ｓｕｒｇｉｓ、Ｃｏｌｌａｍｅｎｄ、Ｐｅｒｍａｃｏｌ）との反応後の（ａ）Ｃ３ａまたは（ｂ）Ｃ５ａを検出するためのＥＬＩＳＡを示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±95％で表した。「*」は一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定により求められた有意差（ポリスチレンとの比較における）を示す。心膜：生細胞のブタ心膜、尿管：生細胞のブタ尿管、ＩＣＡ：生細胞のブタＩＣＡ、ＥＩＡ：生細胞のブタ外腸骨動脈、ＡＩＣＡ：無細胞のブタＩＣＡ、ＣＦＡ：生細胞のヒト総大腿動脈、ＡＰ：無細胞のブタ心膜、ＡＵ：無細胞のブタ尿管、ＡＩＣＡ：無細胞ブタ内頸動脈、ＡＥＩＡ：無細胞のブタ外腸骨動脈、およびＡＣＦＡ：無細胞のヒト総大腿動脈を示す。
【発明を実施するための形態】
【0046】
本明細書の記載および特許請求の範囲にわたり、用語「含む」および「含有する」およびこれらの用語の変形は、「含むがそれらに限定されない」ことを意味し、他の部分、付加物、成分、数値または工程を排除することを意図しない（排除しない）。本明細書の記載および特許請求の範囲にわたり、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形は複数形を含む。文脈上異なる解釈を要する場合を除き、特に不定冠詞を用いた場合、本明細書は単数のみならず複数をも意図していることを理解されたい。
【0047】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載された特徴、数値、性質、化合物、化学的部分または化学基は、矛盾しない限りにおいて、本明細書に記載の他のいかなる態様や、実施形態または実施例に対しても適用可能であることを理解されたい。本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）に開示されたすべての特徴および／または同様に開示されたあらゆる方法または処理のすべての工程は、このような特徴および／または工程の少なくともいくつかが相互に排他的であるような組み合わせを除き、いかなる組み合わせにて組み合わせてもよい。本発明は、前述のいずれの実施形態の詳細にも制限されない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）に開示された新規な特徴、もしくはそのような特徴の新規な組み合わせ、または同様に開示された方法または処理の新規な工程や、それらの工程の新規な組み合わせにまで適用範囲が及ぶ。
【0048】
本願に関連して本明細書と同時または事前に提出され、本明細書とともに公衆の縦覧に供されるすべての書類および文献が一読されるものとし、このようなすべての書類および文献の内容は、参照により本明細書に組み組み込まれるものとする。
【0049】
本発明は無細胞製品およびその産生方法を提供する。ブタの外腸骨動脈および内頸動脈を２本の特に適切な血管として特定し、全細胞および８０％を超えるＤＮＡをこれらの血管から除去することが可能なプロトコルが初期の研究により確立された。これは４℃の低張緩衝液および３７℃、１ｍｇ・ｍＬ−１のＳＤＳ溶液をそれぞれ用いた２サイクルを基本とする。単一サイクルの低張緩衝液およびＳＤＳ溶液を用いて脱細胞化された血管は、ヘマトキシリンおよびエオシンおよびＤＡＰＩで染色したところ、残留細胞および遺残細胞の存在が示された。したがって、確実に無細胞血管を産生するために、２サイクルの低張緩衝液およびＳＤＳによる処理を最適な脱細胞化処理として選択した。
【0050】
α−ｇａｌエピトープに対するモノクローナル抗体を用いた抗体標識により、無細胞の外腸骨動脈および内頸動脈内にα−ｇａｌエピトープが存在することが実証された。抗体標識は、低温包埋組織試料、亜鉛固定パラフィンワックス包埋試料およびホルマリン固定パラフィンワックス包埋試料を用いて行った。市販品では、単一源からの単一の抗体クローンしかなく、未精製品として提供されている。未精製品は、ＩｇＭ陰性対照抗体と比較して一貫して高いバックグラウンド染色を示した。抗体は、ＩｇＭ結合カラムを用いて精製した。続いて、遠心式ろ過機を用いて抗体を透析し、濃縮した。精製抗体を用いた標識は、粗精製物と比較して大幅に低いレベルのバックグラウンドを示した。低温包埋試料は最も高感度の標識を示し、ホルマリン固定試料が最も弱い標識を示した。このため、亜鉛固定パラフィン包埋試料は、低温包埋試料と比較し優れた組織構造を示し、ホルマリン固定試料よりも感度が高いため、標準的な技術として利用された。マトリックス全体のα−ｇａｌレベルは生細胞の対照組織と比較し、大幅に低かったが、エピトープは検出可能であった。α−ｇａｌエピトープを低張緩衝液およびＳＤＳ溶液のサイクルを増加することによって除去しようと試みた。モノクローナル抗体標識により、単一サイクルに比べ、２サイクルを用いた場合でもα−ｇａｌレベルに大幅な低下はないことが示された。
【0051】
この２サイクルの低張緩衝液およびＳＤＳ溶液では、無細胞マトリックスからα−ｇａｌを除去することができなかった。血管内腔の表面から内皮細胞を取り除く最初の過程によって、無細胞マトリックス内のα−ｇａｌの量が低下しうると仮定した。このため、脱細胞化処理の前にバーセン液および様々な濃度のＥＤＴＡを用い、血管の内腔からの内皮細胞の放出を促進するよう、金属イオンをキレート化した。２００ｍＭのＥＤＴＡを用いた２５時間４℃での前処理により無細胞血管のα−ｇａｌのレベルを低下させることに成功したことが確認された。これは本発明の脱細胞化処理に組み込まれる。
【0052】
脱細胞化に続く高張緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）処理は、無細胞心血管組織内に存在するα−ｇａｌのレベルをさらに下げるために脱細胞化処理中に行われた。さらに、抗体標識により、２００ｍＭのＥＤＴＡを用いた４℃２４時間の前処理と組み合わせて撹拌した３７℃２４時間の高張緩衝液の単一サイクルで無細胞血管のα−ｇａｌのレベルを低減することに成功したことが示された。さらに、サイクルを増やしても（最大３サイクル）、３７℃の高張緩衝液処理におけるα−ｇａｌの低減には顕著な改善が見られないことが示された。
【0053】
無細胞マトリックス内におけるα−ｇａｌ残基の有無を判定するためには、抗体の特異性を特定することが基本であった。これは、α−ｇａｌ ＢＳＡを用いた精製抗体の吸着により行うことができる。ＢＳＡも、対照として使用した。吸着の後、α−ｇａｌ抗体はα−ｇａｌ ＢＳＡに結合する可能性があり、それにより標識した組織内のα−ｇａｌエピトープに結合する作用が減弱する。したがって、これを用いた染色はバックグラウンドとみなされる可能性がある。ＢＳＡのみを用いた吸着では、タンパク複合体は抗体のα−ｇａｌエピトープを検出する作用に悪影響を及ぼさない可能性があることが明らかになった。ＢＳＡに吸着した抗体およびα−ｇａｌ ＢＳＡに吸着した抗体を用いて、無細胞組織およびα−ガラクトシダーゼで処理した無細胞組織から得たデータの比較により、無細胞のＥＩＡが、酵素の使用によりさらに減少されうるα−ｇａｌ残基をもつとみられることが示唆された。この染色はマトリックスにおけるものであって、内膜表面におけるものではない。無細胞ＩＣＡには非常に弱い染色を示す部分があり、該当部分はα−ガラクトシダーゼの使用によっては除去することができない。総合すると、これらのデータは、無細胞血管中に最小限のα−ｇａｌが存在するということを示した。
【0054】
抗体吸着測定法においても、同じモノクローナル抗体を使用した。この測定法の利点は、非常に薄い切片に限定される免疫細胞化学法と比較し、より大量の材料を測定することができることにある。さらに、抗体吸着測定法により、異なる組織試料内に存在するα−ｇａｌのレベルを半定量的に評価することが可能となった。生細胞の血管試料は最高レベルのα−ｇａｌ発現を示した。生細胞のブタのＥＩＡおよびα−ガラクトシダーゼで処理したＩＣＡにはα−ｇａｌがなく（非組織対照との差異がない）、測定が成功したことを示した。無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡ試料は、非組織対照と同様、生細胞のおよび無細胞のヒト総大腿動脈とさほど変わりないα−ｇａｌレベルを示した。
【0055】
組織学的測定により、無細胞試料のマトリックス構造および構成が生細胞の対照と類似することが確認された。無細胞マトリックスは、生細胞のブタ血管と比較すると、より余裕のある開放構造を示した。生細胞の血管と比較し、無細胞のＥＩＡまたはＩＣＡのＧＡＧ、コラーゲン、またはエラスチンの含有量に定性的差異はないようであった。ヒドロキシプロリン、変性コラーゲン、およびグリコサミノグリカンの測定結果から、脱細胞化処理によって組織からコラーゲンまたはグリコサミノグリカンが失われなかったことが分かった。定量的な生化学的分析は、無細胞マトリックスのコラーゲンおよびグリコサミノグリカン含有率に関する情報を提供する一方、成分の構造的完全性を評価することができないという点において制限されている。したがって、α−キモトリプシン処理の後に変性コラーゲンのレベルを測定した。α−キモトリプシン処理は、天然コラーゲンに影響を与えることなく分解コラーゲンを消化することが可能である（Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。消化後、組織の上澄み液（分解コラーゲンを含む）について、ヒドロキシプロリンの有無を調べた。その結果、生細胞の血管と比較し、無細胞のＥＩＡまたはＩＣＡ内に存在する変性コラーゲンの総量に顕著な増加は見られないことがわかった。
【0056】
残留ＳＤＳの存在に関する問題については、無細胞のＥＩＡまたはＩＣＡの産生に用いる脱細胞化溶液のそれぞれのＳＤＳ濃度を定量することにより対処した。放射性標識したＳＤＳ（１４Ｃ）の使用により、脱細胞化処理で用いられる最終洗浄溶液内に、極度に低いレベルのＳＤＳが存在することが明らかになった。
【0057】
無細胞マトリックスの生体適合性は、抽出法および接触法による接触細胞毒性試験を用いて確かめられた。試験はいずれも仔ハムスターの腎臓細胞、およびマウスの３Ｔ３細胞の２つの異なる細胞株を用いた。先のデータはＳＤＳで処理したマトリックスの生体内における生体適合性を示し、無細胞のＥＩＡまたはＩＣＡを用いてこれを繰り返す必要はない。
【0058】
多数の様々な試験を用いたＤＮＡ定量により、脱細胞化後、ＤＮＡ量に９０％を超える減少が見られ、この値はＳｕｒｇｉｓｉｓから単離したＤＮＡの量よりも非常に低いものである。無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡから単離したＤＮＡの量はＰｅｒｍａｃｏｌおよびＣｏｌｌａＭｅｎｄの場合と同程度であった。無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡはそれぞれ０．０１４μｇ・ｍｇ−１、０．０１９μｇ・ｍｇ−１のＤＮＡを含んでいた。Ｓｕｒｇｉｓｉｓは０．１１９μｇ・ｍｇ−１、Ｐｅｒｍａｃｏｌは０．０２８μｇ・ｍｇ−１、ＣｏｌｌａＭｅｎｄは０．０１７μｇ・ｍｇ−１のＤＮＡを含んでいた。ＰＣＲ法により、残留ＤＮＡは、増幅できないＤＮＡの小断片または非コードの、いわゆるジャンクＤＮＡであることが確認された。ブタ内在性レトロウイルスの存在は、ブタ由来の異種移植片にとって問題となる。ところが、こうしたウイルスのヒトに対する影響、感染の可能性や最低安全基準に関する情報はほとんど存在しない。ＰＥＲＶのコピー数をＴａｑＭａｎプローブを用いた定量ＰＣＲによって測定した。データは、無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡだけでなくヒト真皮線維芽細胞も含めたすべての試料にＰＥＲＶ ＤＮＡが存在することを示した。生細胞の組織と比較し、無細胞ＣＦＡではコピー数が６ｌｏｇ減少し、無細胞ＩＣＡでは７ｌｏｇ減少した。ブタ内在性レトロウイルスの最低安全基準は確立されていないため、無細胞のＩＣＡおよびＥＩＡ内に存在するコピー数は市販されているいずれの製品よりも大幅に少なくなった。この試験は、完全なＰＥＲＶゲノムが存在するか、または転写活性をもつかを判別するものではない。無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの生体力学特性およびコンプライアンスを破裂圧力試験、縫合保持強度試験、拡張反応試験、および低ひずみ速度破壊試験によって評価した。移植片材料は、交換対象となる動脈と同様の生体力学的特徴をもつことが不可欠である。生細胞のブタ組織と比較して無細胞ブタ血管には大きな性質の変化はない。無細胞ＥＩＡまたはＩＣＡの破裂圧力には、生細胞の血管と比較し、留意すべき顕著な相違はなかった。破裂圧力値は、動脈内における１２０ｍｍＨｇ程度の通常の生理的圧力よりも大幅に高かった。無細胞動脈に関して得られた結果は、ヒト動脈（２０３１ｍｍＨｇ〜４２２５ｍｍＨｇ）の最大破裂圧力およびヒト伏在静脈（１６８０ｍｍＨｇ〜２２７３ｍｍＨｇ、Ｌ’Ｈｅｕｒｅｕｘ，Ｎ． ｅｔ ａｌ．，２００６）と同程度であった。
【0059】
補体活性化およびＣ３ａまたはＣ５ａの検出（図２０）については、本発明の方法により産生した無細胞血管は、市販の製品と比較し、ごくわずかな活性化を示し、また興味深いことに、同方法で調製したブタ尿管と比較してもごくわずかな活性化を示した。これは２つの無細胞血管組織から抗原性のエピトープを除去することに成功したことを示唆している。
【0060】
これまでに収集されたデータによれば、新規の脱細胞化プロトコルを用いて２つの無菌無細胞血管を確実に産生することが可能であり、これらは９０％（ｗ／ｗ）を超えるＤＮＡ減少、最低α−ｇａｌレベルを示し、生化学的または生体力学的に生細胞の血管と差異のない生体適合性血管である。また、データによると、無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡのＰＥＲＶ含有量は、患者への使用により実証済みの臨床記録が存在する市販製品よりも大幅に低かった。
【0061】
（ブタの外腸骨動脈（ＥＩＡ）および内頸動脈（ＩＣＡ）の脱細胞化）長さ最大２００ｍｍの凍結保存したＥＩＡおよびＩＣＡ血管を、２００ｍＬの各溶液を用いて図１に示すとおり調製した。各溶液は、使用前に適切な温度に予め温めておく。血管は個別に無菌の２５０ｍＬ容器に入れ、８０ｒｐｍで行うヌクレアーゼ工程を除き、すべてのインキュベーションを２４０ｒｐｍの攪拌とともに行う。最初の工程として、ＥＩＡおよびＩＣＡが凍結されている場合、組織を３７℃で２０分間解凍し、その後バンコマイシン、硫酸ゲンタマイシン、およびポリミキシンＢを含む殺菌溶液を用いて３７℃で３０分間洗浄する。インキュベーションの第１の工程は、２００ｍＭのＥＤＴＡを用いた２４時間４℃の洗浄であり、続いて低張緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ， ２．７ｍＭＥＤＴＡ， １０ＫＩＵ／ｍ アプロチニン）を用いた２４時間４℃の洗浄と、低張緩衝液内の０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを用いた２４時間３７℃の洗浄を行う。低張緩衝液を用いた２４時間４℃での洗浄をさらに行った後、アプロチニンを含むＤＰＢＳａ ＥＤＴＡを用いた４℃４８〜５６時間の洗浄、および０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの低張緩衝液を用いた２４時間３７℃での洗浄を行う。その後、組織に対しそれぞれＤＰＢＳａを用いた３０分間３７℃の洗浄を３回行い、ヌクレアーゼ溶液（５ｍＭ ＴＲＩＳ， ５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ， ５０Ｕ／ｍＬ ＤＮＡｓｅ， １Ｕ／ｍＬ ＲＮＡｓｅ）を用いた３時間３７℃での洗浄を行う。次に、組織に対し、それぞれアプロチニンを含むＤＰＢＳａ ＥＤＴＡを用いた３０分間３７℃での洗浄を３回行い、さらに高張溶液を用いた２４時間３７℃でのインキュベーション洗浄およびそれぞれアプロチニンを含むＤＰＢＳａ ＥＤＴＡを用いた３０分間３７℃での洗浄をさらに３回行う。続いて、組織を０．１％（ｖ／ｖ）の過酢酸溶液を用いて４時間２７℃で殺菌する。続いて、（ｉ）それぞれアプロチニンを含むＤＰＢＳａ ＥＤＴＡを用いた３０分間３７℃の洗浄を３回および（ｉｉ）ＤＰＢＳａを用いた２４時間４℃での洗浄の２工程をクラスＩＩの安全キャビネット内で無菌状態にて行う。その後組織は必要となるまでＤＰＢＳ内に４℃で保存しておく。
【0062】
（組織／組織構造の調製）組織試験片を１０％（ｖ／ｖ）の中性緩衝ホルマリン内に固定した後、乾燥してパラフィンワックスに包埋した。連続切片を採取し、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）（Ｂｉｏｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．， Ｓｋｅｌｍｅｒｓｄａｌｅ， ＵＫ）染色を用いて組織の組織構造を評価し、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のエラスチン染色によりエラスチン含有量を評価した。核酸をＤＡＰＩ染色（シグマ−アルドリッチ）およびヘキスト３３２５８（シグマ−アルドリッチ）を用いて染色した。α−ｇａｌエピトープに対するＩｇＭモノクローナル抗体をＡｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国サンディエゴ）から入手し、使用前に精製した。
【0063】
（α−ｇａｌの抗体吸着試験）ＥＬＩＳＡを用いて組織試料のインキュベーション後の非結合α−ｇａｌ抗体レベルを定量した。試料は、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む５００μＬのＤＰＢＳで一晩４℃でインキュベーションし、その後ＢＳＡを処分してそれぞれの管に対し５００μＬのＤＰＢＳを用いて２分間の洗浄を３回行った。厳密に１００ｍｇの組織を計量し、よく膨潤させ、抗α−ｇａｌモノクローナル抗体希釈液（０．３７ｍｇ・ｍＬ−１）１ｍＬを、ブロッキングされたマイクロチューブに入れ、スピナーにセットして４℃で一晩放置した。組織を入れたマイクロチューブを６００×ｇ、１５分間遠心分離（または１３０００ｒｐｍでマイクロ遠心分離）し、７５０μＬの上澄みを取り除いてブロッキングされたマイクロチューブをリフレッシュし、そこにさらに７５０μＬのＴＢＳアジドＢＳＡを加えた。その後撹拌し、６００×ｇ、１５分間遠心分離した。さらに７５０μＬの上澄み液を取り出し、この上澄み液のα−ｇａｌに対する抗体を、Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレートのウェルに１０μｇ／ｍＬ−１のα−ｇａｌ ＢＳＡを含む５０μＬのＤＰＢＳを添加し、４℃で一晩反応させるＥＬＩＳＡ法で分析した。これらに対し、３００μＬのＤＰＢＳ Ｔｗｅｅｎを用いて振とうしながら１０分間の洗浄を３回行い、コーティングされたＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレートの各ウェルを、２５０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＤＰＢＳにより４℃で一晩ブロッキングした。次に、各ウェルに対し３００μＬのＤＰＢＳ Ｔｗｅｅｎを用いて、振とうしながら３０分間の洗浄を３回行い、１００μＬの試料を、コーティング及びブロックされた、マイクロタイタープレートの対応するウェルに継代した。その後、これを常温で３時間インキュベーションし、洗浄した後、５０μＬのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス二次抗体（１：１０００希釈）を添加した。これを常温で１時間インキュベーションした後、洗浄し、１００μＬのＯＰＤ溶液を添加し、暗所で１０分間常温でインキュベーションした。５０μＬの３Ｍ硫酸を各ウェルに添加し、マイクロプレート分光光度計を用いて６３０ｎｍのリファレンスフィルタで４９２ｎｍにおける光学密度を測定した。各試料の値を平均値、信頼限界±９５％でプロットしたが、有意差は見られなかった。
【0064】
（ヒドロキシプロリン測定）ヒドロキシプロリン測定の実行に先立ち、試料を前もって恒量となるまで凍結乾燥し、６Ｍ塩酸（ＨＣｌ）を用いた４時間１２０℃のインキュベーションにより加水分解し、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて中和した。採用した一連の手順は、ＥｄｗａｒｄｓおよびＯ’Ｂｒｉｅｎ ［２９］により説明された方法に基づいている。ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シグマ）を用いて標準的な標準物質溶液を調製した。１００μＬの酸化性溶液（クロラミンＴ・水和物、シグマ）を添加した平底の９６ウェルプレートのウェルに試験溶液（５０μＬ）を加え、緩やかに振とうしながら５分間放置した。その後、エールリッヒ試薬（１００μＬ）を各ウェルに添加した。続いて、このプレートに覆いをかけ、５７０ｎｍにおける吸光度を測定する前に、水槽内で４５分間６０℃でインキュベーションした。ヒドロキシプロリンの標準曲線から補間することによりヒドロキシプロリンの濃度を求めた。
【0065】
（グリコサミノグリカン測定）硫酸化糖（ＧＡＧｓ）の量をジメチルメチレンブルー結合により測定した（Enobakhare et al, Anal.Biochem. 243, 189, 1996、Farndale et al, Biochim. Biophys. Acta., 883, 173, 1986）。簡潔に述べると、試液をジメチルメチレンブルー溶液でインキュベーションし、５２５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＧＡＧｓの量は、ある濃度範囲にわたるコンドロイチン硫酸およびリン酸塩分析緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム ０．１Ｍ， オルトリン酸水素二ナトリウム ０．１Ｍ， ｐＨ６．８）を用いて得られた標準曲線から補間することにより求めた。
【実施例1】
【0066】
ホルマリン固定処理したブタのＩＣＡおよびＥＩＡから５μｍの薄片を得て、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した（図２）。２サイクルの低張緩衝液およびＳＤＳを用いた場合、残留細胞または遺残細胞が存在するという証拠は得られなかった（図２）。また、処理後もマトリックス組織構造は損なわれないままであった。ホルマリン固定処理したブタＩＣＡおよびＥＩＡの切片は、二本鎖ＤＮＡの存在を確認するためにＤＡＰＩを用いて染色され、生細胞のブタＩＣＡおよびＥＩＡを陽性対照として用いた（図３）。この染色により、生細胞の対照組織と比較して、マトリックス内の二本鎖ＤＮＡおよび細胞が不足していることが明らかになった（図３）。露光時間を１０倍としたところ、二本鎖ＤＮＡすなわち細胞が存在することによる蛍光は見られなかった。
【実施例2】
【0067】
抗体による炎症反応を軽減するため、臨床的に用いる場合、無細胞異種マトリックスにはα−ｇａｌエピトープがないことが望ましい。したがって、無細胞血管内のα−ｇａｌエピトープの存在を確実に検出する方法を開発することが必要である。生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡ（２サイクルＳＤＳ）の試料をパラフィンワックス内にホルマリン固定包埋し、５μｍの薄片を得た。生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡの薄片は、ＩｇＭモノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｓ ＡＬＸ−８０１−０９０、クローンＭ８６、希釈率１：１０）を用いてα−ｇａｌエピトープの存在を標識した。ダコＥｎｖｉｓｉｏｎキットを用いて一次抗体を可視化した（図４）。その結果、脱細胞化後のα−ｇａｌエピトープの存在が明らかになった。高レベルのバックグラウンド染色も見られたが、これはＩｇＭアイソタイプ対照抗体を試料の標識に用いた場合には見られなかった。さらなる実験によると、生細胞の組織はＩｇＭモノクローナル抗体に対し高い陽性標識を示し（データは示さず）、粗精製抗体と比較し、精製抗体に、より特異的な標識が生ずる（データは示さず）ことが分かった。この標識により、２００ｍＭのＥＤＴＡを用いて２４時間４℃で行われた洗浄に高張緩衝液を用いた場合においてα−ｇａｌ量が減少を示した（図５）。高張緩衝液のサイクルを増して用いてもα−ｇａｌ量のレベルに差は見られなかった。したがって、２００ｍＭのＥＤＴＡによる２４時間４℃で行われた最初の洗浄とともに、α−ｇａｌエピトープを無細胞マトリックスから除去するために２４時間３７℃での高張緩衝液における一回のインキュベーションを採用した。これに続く組織脱細胞化には図１のプロトコルを採用した。
【実施例3】
【0068】
無細胞血管内のα−ｇａｌ残基の有無を判定するためには、抗体標識の特異性を判断することが重要であった。生細胞のおよび無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡと、生細胞のおよび無細胞のα−ガラクトシダーゼで処理したＥＩＡおよびＩＣＡの試料について、α−ｇａｌエピトープの存在をＩｇＭモノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｓ ＡＬＸ−８０１−０９０）クローンＭ８６を用いて標識し、ダコＥｎｖｉｓｉｏｎキットを用いて可視化した。（ｉ）精製抗体（１：４希釈、０．３９ｍｇ・ｍＬ−１）、（ｉｉ）ＢＳＡを用いて吸着させた精製抗体、および（ｉｉｉ）α−ｇａｌ ＢＳＡを用いて吸着させた精製抗体の３つの異なる調製の抗体を用いた。図６（Ａ）では、精製済みのα−ｇａｌエピトープに対するモノクローナル抗体、（Ｂ）ではＢＳＡに吸着した同抗体、（Ｃ）ではα−ｇａｌ ＢＳＡに吸着した同抗体、（Ｄ）ではＩｇＭアイソタイプ対照を用いて標識した無細胞ＥＩＡを、原寸の１００倍で示す。図７は無細胞ＩＣＡについて同様に示す。
【0069】
生細胞の組織の抗体標識では、マトリックス全体にわたり非常に明確な陽性標識が見られたが、これはα−ガラクトシダーゼ処理後に大幅に減少しうる。この結果から、精製抗体がＢＳＡ吸着により「浄化」されることが分かった。このＢＳＡにより吸着処理された「精製」抗体は、α−ｇａｌ ＢＳＡによる吸着処理によって生細胞の組織に対する結合が完全に切断されるため、α−ｇａｌに対し特異的である。またさらに、無細胞のＩＣＡおよびＥＩＡ内には最小限のα−ｇａｌしか存在しないため、内腔表面は清浄な状態となった。顕微鏡による薄片の詳細な観察から、ＢＳＡにより吸着処理された抗体を用いた場合のバックグラウンド標識はごくわずかであることが明らかになった。この試験はさらに、バックグラウンド標識がα−ガラクトシダーゼを用いた処理によっては取り除くことができないことを示した。
【実施例4】
【0070】
半定量的抗体吸着分析を用いてブタ組織にするα−ｇａｌの量を推定した。膨潤した組織試料をインキュベーションした後に、存在する非結合の抗α−ｇａｌ抗体をＥＬＩＳＡを用いて定量した。用いた陰性対照は非組織対照であり、データは非組織対照、無細胞血管、およびヒトの皮膚では有意差があることを示した。生細胞のおよび無細胞の同種総大腿動脈を、この分析の対照として用いた（図８）。この分析により、生細胞のおよび無細胞の総大腿動脈にはα−ｇａｌエピトープが含まれないことが分かった。非組織対照または生細胞のおよび無細胞の同種総大腿動脈と比較し、無細胞のブタＥＩＡまたはＩＣＡに結合するα−ｇａｌ抗体に有意差はみられなかった（図８）。しかし、無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡと生細胞のＥＩＡおよびＩＣＡとでは結合する抗体に有意差があった（図８、一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定）。
【実施例5】
【0071】
マトリックスに対する脱細胞化プロトコルの影響を完全に評価するために、生細胞のおよび無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡの試料（ｎ＝６）の主成分を特定するための分析を行った。コラーゲンを定量すべく、酸加水分解組織試料について、ＥｄｗａｒｓとＯ’Ｂｉｒａｎ（１９８０）による方法にしたがって、ヒドロキシプロリン含有率を分析した。この分析によりｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを用いて得られた標準曲線と５７０ｎｍでの吸光度の間に線形関係が生じた。分析値はμｇ・ｍｇ−１に変換し、ヒドロキシプロリン値に７．４６をかけてコラーゲン量に換算した。生細胞のおよび無細胞のＩＣＡのコラーゲン含有量はそれぞれ７９５．２μｇ・ｍｇ−１および７００．６μｇ・ｍｇ−１であった。生細胞のおよび無細胞のＥＩＡのコラーゲン含有量はそれぞれ５７２．３μｇ・ｍｇ−１および５４７．３μｇ・ｍｇ−１であった。これらの値に大きな相違はなかった（一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定）。
【0072】
ＧＡＧ含有量を定量すべく、酸加水分解組織試料について、ジメチレンブルー色素を用いて硫酸化カルボキシル化糖含有量を分析した（Ｆａｒｎｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。この分析により、コンドロイチン硫酸Ｂを用いて得られた標準曲線と５２５ｎｍでの吸光度の間に直線関係が生じた。この分析値を試料質量に対して正規化し、μｇ・ｍｇ−１で表した。生細胞のＩＣＡの硫酸化ＧＡＧ含有量は、６３．８μｇ・ｍｇ−１であったのに対し、無細胞ＩＣＡでは５７．０μｇ・ｍｇ−１であった。生細胞のおよび無細胞のＥＩＡのＧＡＧ含有量はそれぞれ６４．５μｇ・ｍｇ−１および５４．７μｇ・ｍｇ−１であった。これらの値に大きな相違はなかった（一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定、図９Ａおよび図９Ｂ）。
【0073】
変性または損傷したコラーゲンの量は、α−キモトリプシンを用いた組織の酵素消化と、その後の加水分解により分析した。ヒドロキシプロリン量を測定し、コラーゲン量に換算した。分析により、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを用いて得られた標準曲線と、５７０ｎｍでの吸光度との間に線形関係が生じた。生細胞のおよび無細胞のＩＣＡの変性コラーゲン含有量はそれぞれ３０．８μｇ・ｍｇ−１および２６．６μｇ・ｍｇ−１であった。生細胞のおよび無細胞のＥＩＡの変性コラーゲン含有量はそれぞれ３０．８μｇ・ｍｇ−１および２１．５μｇ・ｍｇ−１であった。これらの値に大きな相違はなかった（一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定、図９Ａおよび図９Ｂ）。
【実施例6】
【0074】
接触細胞毒性試験を用いて無細胞マトリックスの細胞増殖に対する影響を調べ、これを生体適合性の初期評価として用いた。無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの小標本（ｎ＝３）の切片を無菌で得て、コラーゲンゲルを用いて組織培養プレートのウェルの中央に付着させ、マイコプラズマ陰性のマウス３Ｔ３細胞または仔ハムスターの腎臓細胞のいずれかの懸濁液を各ウェルに添加して４８時間培養した。ホルマリン固定およびギムザ染色の後に、各ウェルを位相差顕微鏡法を用いて観察した。接触細胞毒性試験のプレートの顕微鏡観察において、マウスの３Ｔ３線維芽細胞（図１１）および仔ハムスター腎臓細胞（図１０）が成長し、無細胞材料に接触したことが示された。細胞形態または細胞溶解に顕著な変化は見られなかった。シアノアクリレート接着剤（陽性対照）は細胞溶解を引き起こすことが確認された。コラーゲンのみ（陰性対照）では細胞毒性の兆候は見られなかった。
【実施例7】
【0075】
生細胞のおよび無細胞化されたブタＥＩＡおよびＩＣＡの試料を膨潤し、可溶性成分を抽出するために、濃度１００ｍｇ・ｍＬ−１のＤＭＥＭ内で７２時間３７℃で撹拌しながらインキュベーションした。この抽出物をマイコプラズマ陰性のマウス３Ｔ３細胞および仔ハムスター腎臓細胞の単分子層とともに４８時間インキュベーションし、その後、市販のＡＴＰＬｉｔｅ−Ｍアッセイシステム（パーキンエルマー）を用いてＡＴＰ量を測定した。マウス３Ｔ３細胞の線維芽細胞株および仔ハムスター腎臓細胞の上皮細胞株の２つの異なる細胞株を用いた。その結果によると、ＤＭＥＭでインキュベーションしたマウス３Ｔ３細胞および抽出された無細胞のブタＩＣＡの試料の、相対ＡＴＰ量とそれによる生存率との間には有意差は見られなかった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。マウス３Ｔ３細胞を無細胞のブタＥＩＡの抽出物でインキュベーションした場合、細胞生存率に大幅な増加が見られた（図１２Ｂ）。生細胞の組織抽出物と比較し、ＤＭＥＭまたは無細胞の抽出物で培養した各３Ｔ３細胞のＡＴＰ量には有意差が見られた（図１２Ａ）。４０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの存在下で培養された３Ｔ３細胞内に存在するＡＴＰの量は他の試験サンプルよりも大幅に低かった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ＤＭＥＭと比較し、無細胞のブタＥＩＡまたはＩＣＡの抽出物で培養された仔ハムスター腎臓細胞のＡＴＰ量には大幅な増加が見られた（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。生細胞の組織抽出物と比較し、ＤＭＥＭまたは無細胞の抽出物で培養された各仔ハムスター腎臓細胞のＡＴＰ量には有意差が見られなかった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。４０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの存在下で培養された仔ハムスター腎臓細胞内に存在するＡＴＰの量は他の試験サンプルよりも大幅に低かった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。
【実施例8】
【0076】
市販のキット（キアゲン）を用いて生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの試料（ｎ＝３）からＤＮＡを単離し、２６０ｎｍでの吸光度を用いて定量した。分析には、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ、Ｐｅｒｍａｃｏｌ、およびＣｏｌｌａＭｅｎｄと、多くの市販製品を使用した。データによると、脱細胞化後にＤＮＡ量に９０％を超える減少が見られた。無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡはＤＮＡをそれぞれ０．０１４μｇ・ｍｇ−１および０．０１９μｇ・ｍｇ−１含んでいた（図１３）。ＳＵｒｇｉｓｉｓは０．１１９μｇ・ｍｇ−１のＤＮＡを含み、Ｐｅｒｍａｃｏｌは０．０２８μｇ・ｍｇ−１のＤＮＡを含み、ＣｏｌｌａＭｅｎｄは０．０１７μｇ・ｍｇ−１のＤＮＡを含んでいた（図１３）。無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡのＤＮＡ含有量はＳｕｒｇｉｓｉｓよりも大幅に少なかった（図１３）。
【実施例9】
【0077】
抽出したＤＮＡおよびｔｏｔａｌＲＮＡを用いてＰＣＲおよびＲＴ＾ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨおよびＴＮＦαに対するプライマーを用いて生細胞のおよび無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡから抽出されたＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ生成物を検出するために蛍光色素のサイバーグリーンを用いた。ＰＣＲ反応では、無細胞のＥＩＡまたはＩＣＡから抽出したＤＮＡの試料においてＧＡＰＤＨまたはＴＮＦαの生成物を検出することはできなかった（表１）。したがって、存在するＤＮＡはすべて断片かつ非コードであると見え、すなわち「ハウスキーピング」活動のみのための非機能性ＤＮＡであった。
【0078】
表１は、ＧＡＰＤＨおよびＴＮＦαに対するプライマーを、サイバーグリーンＰＣＲ中で単離ＤＮＡに対して用いた場合 にＰＣＲ生成物が検出されるサイクル数を示している。
【0079】
【表1】
【0080】
ＧＡＰＤＨ（表２）およびＴＮＦα（表３）の検出を、生細胞のおよび無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡから抽出したｔｏｔａｌＲＮＡの２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて行った。ＰＣＲ生成物を検出するために蛍光色素のサイバーグリーンを用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応では、生細胞の試料と比較し、無細胞のＥＩＡおよびＩＣＡから抽出したｔｏｔａｌＲＮＡの試料においてＧＡＰＤＨまたはＴＮＦα生成物を検出することはできなかった。
【0081】
表２は、ＧＡＰＤＨに対するプライマーを２ステップＲＴ−ＰＣＲで単離RNAに対して用いた場合にＰＣＲ生成物が検出されるサイクル数を示している。
【0082】
【表2】
【0083】
表３は、ＴＮＦαに対するプライマーを２ステップＲＴ−ＰＣＲで単離ＲＮＡに対して用いた場合にＰＣＲ生成物が検出されるサイクル数を示している。
【0084】
【表3】
【実施例10】
【0085】
ブタ内在性レトロウイルスの検出および定量を、ＴａｑＭａｎプローブを用いた定量リアルタイムＰＣＲにより行った。市販のキット（キアゲン）を用いて生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの試料（ｎ＝３）からＤＮＡを単離し、２６０ｎｍでの吸光度を用いて定量した。分析には、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ、Ｐｅｒｍａｃｏｌ、およびＣｏｌｌａｍｅｎｄと、多くの市販製品が使われた。市販の供給源から入手した初代ヒト真皮線維芽細胞からもＤＮＡを単離した。
【0086】
表４はブタのＥＩＡ、ＩＣＡ、Ｐｅｒｍａｃｏｌ、ＣｏｌｌａＭｅｎｄ、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ、および初代ヒト線維芽細胞に存在するＰＥＲＶゲノムのコピー数を示す。データは平均値（ｎ＝３）を示す。
【0087】
【表4】
【0088】
データは、検査したすべての試料内にＰＥＲＶ ＤＮＡが存在することを示した（表４）。生細胞の組織と比較し、無細胞ＣＦＡではコピー数が６ｌｏｇ減少し、無細胞ＩＣＡでは７ｌｏｇ減少した。無細胞のＩＣＡおよびＥＩＡ内に存在するコピー数は市販されているいずれの製品よりも大幅に少なかった（一元配置分散分析および事後比較Ｔ検定）。この検査は、完全なＰＥＲＶゲノムが存在するか、または転写活性をもつかを判定するものではない。
【実施例11】
【0089】
生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの試料（長さ１５ｃｍ）に対し、特別に設計された破裂圧力リグを用いた圧力上昇に耐えうるかを試験した。内圧は各管において最高３７５０ｍｍＨｇまで上昇させた。０．１％（ｖ／ｖ）の過酢酸で３〜４時間処理した無細胞のブタＥＩＡに対して試験を行い、この工程がマトリックスの生体力学的に悪影響を及ぼすか否かを判定した。その結果によると、生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡまたはＩＣＡが耐えうる最大圧力に有意差は見られなかった（データは示さず）。生細胞の試料のうち２つでは縫合による結紮部分で破裂が起こったが、無細胞の試料ではセットアップによる、または結紮すなわち連結部分で破裂は起こらなかった。無細胞ＩＣＡの破裂圧力平均値は３６２４ｍｍＨｇであるのに対し、無細胞ＥＩＡでは３７５０ｍｍＨｇであった。０．１％（ｖ／ｖ）の過酢酸で３〜４時間処理した無細胞ＥＩＡに有意差は見られなかった。
【実施例12】
【0090】
無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡに対し縫合保持強度試験を行い、データを生細胞の試料と比較した。４−０ Ｐｒｏｌｅｎｅを用いて一本の縫合糸を組織試料内に通し、三重結びで固定した。この試験はＩｎｓｔｒｏｎの５８６０シリーズテーブルモデル試験機を用いて１０ｍｍ・ｍｉｎ−１の速度で行った。データは、縫合糸が取り除かれるまでに各組織が耐えうる最大の力をニュートンで表した。無細胞の試料と比較し、生細胞のＥＩＡまたはＩＣＡでは最大縫合保持強度に有意差は見られなかった（図１４）。
【実施例13】
【0091】
この研究の目的は、生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡ（ｎ＝３）の周方向および軸方向への膨張を定量することである。拡張反応試験で得られたデータは漸次加圧の間隔（ｎ＝３）における生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの静画を含んでいた。すべての画像をＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ Ｖ５．４１のソフトウェアによって分析した。ＸおよびＹの両軸方向への膨張が確認された。その結果は、谷径の変化率を内圧の増加に対する関数として表した（図１５Ａ〜１５Ｄ）。データは統計的に有意な２つの結果を示した。Ｘ軸方向における無細胞のＩＣＡの膨張（図１５Ａ）は生細胞のＩＣＡの膨張よりも大幅に大きかった。また、Ｙ軸方向における無細胞のブタＩＣＡの膨張は生細胞のＩＣＡよりも大幅に大きかった（図１５Ｂ）。他の膨張グラフはいずれも類似しており、生細胞の組織と無細胞組織に有意差は見られなかった（図１５Ａ−Ｄ）。
【実施例14】
【0092】
生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの試料を、Ｉｎｓｔｒｏｎの５８６０シリーズテーブルモデル試験システムを用いて１０ｍｍ・ｍｉｎ−１の速度で試験した。低ひずみ速度破壊試験中、各試験の間、ｍｍの単位でクロスヘッドのストローク、荷重変換器の応答時間およびｍｓの単位で時間を記録した。各組織サンプルの寸法は統一し、厚みは、試験リグに載置する前に厚さゲージで記録した。各試験は、軸方向および周方向の両方について行った（ｎ＝６）。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析し、各試料に対する応力ひずみ線を生成した。そのデータおよび応力ひずみ線を用いて、最大抗張力（Ｎ）ならびにコラーゲン弾性率および弾性率（ＭＰａ）のパラメータを定めた（図１６、１７、および１８）。
【0093】
データによると、生細胞の組織を比較した場合、無細胞のＥＩＡまたはＩＣＡの機械的特性に有意差はなかった。生細胞のＩＣＡの平均最大抗張力は軸方向および周方向に、それぞれ３．９０±０．６４ＭＰａ、４．１３±１．００ＭＰａであった。無細胞ＩＣＡの対応する値は３．９２±０．８７ＭＰａおよび４．８２±０．８７ＭＰａであった。残る生体力学的なパラメータの平均値は表５に示した。生体力学的データにより、脱細胞化処理は組織に大きな変化をもたらさなかったことが示された。
【0094】
表５は、生細胞のおよび無細胞のブタＥＩＡおよびＩＣＡの低ひずみ速度破壊試験による生体力学的なパラメータを示す。データは平均値（ｎ＝６）、信頼限界±９５％で表した。
【0095】
【表5】
【実施例15】
【0096】
広範な調査により、免疫細胞化学法および半定量ＥＬＩＳＡによって示されたように、本発明において開発されたプロセスが、α−ｇａｌを除去することが分かったため、無細胞のブタ動脈移植片がヒト血清において補体を活性化するか否かを判定すべく、組織に対しさらなる機能試験を実施することにした。脱細胞化処理により生成された動脈移植片を、市販の競合製品と比較した。各生体材料の試料を、正常ヒト血清の存在下において３７℃で1時間インキュベーションした。血清を採取し、ＥＬＩＳＡを実施してＣ３ａまたはＣ５ａの有無を判定した。初期成果は、ＰＢＳ陰性対照と比較し、ザイモサン（陽性対照）が正常ヒト血清の補体活性化を起こしたことを示した（図２０）。この結果により、ＢＳＡコンジュゲートα−ｇａｌが正常ヒト血清の補体活性化を引き起こす能力をもつことが明らかになった（図１９）。
【0097】
ＥＬＩＳＡの結果は、生細胞のブタ組織に反応して正常ヒト血清内にＣ３ａおよびＣ５ａが生成されることを示した（図２０）。これは、無細胞ブタ組織、無細胞ヒト組織、または生細胞のヒト組織と反応した血清では観察されなかった。ヒト血清をＳｕｒｇｉｓｉｓと反応させると、Ｃ３ａおよびＣ５ａが生成された。ヒト血清をＰｅｒｍａｃｏｌまたはＣｏｌｌａＭｅｎｄと反応させた場合、Ｃ３ａまたはＣ５ａに増加は見られなかった（図２１）。これらの研究は、無細胞のブタ由来スキャフォールドが、前もって形成されたヒト抗体と反応可能かつ補体を活性化可能なエピトープを含まないことの強力な証拠を提示する。