特許 5882330 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出および／または同定するための、β−グルコシダーゼ活性化剤の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5882330

(24)【登録日】2016年2月12日

(45)【発行日】2016年3月9日

(54)【発明の名称】Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出および／または同定するための、β−グルコシダーゼ活性化剤の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20160225BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20160225BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   C12Q1/02

【請求項の数】14

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2013-526532(P2013-526532)

(86)(22)【出願日】2011年8月30日

(65)【公表番号】特表2013-536680(P2013-536680A)

(43)【公表日】2013年9月26日

(86)【国際出願番号】FR2011051982

(87)【国際公開番号】WO2012028816

(87)【国際公開日】20120308

【審査請求日】2014年7月24日

(31)【優先権主張番号】1056928

(32)【優先日】2010年9月1日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】304043936

【氏名又は名称】ビオメリュー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ

(74)【代理人】

【識別番号】100109726

【弁理士】

【氏名又は名称】園田 吉隆

(74)【代理人】

【識別番号】100101199

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 義教

(72)【発明者】

【氏名】セリエ， マリー

(72)【発明者】

【氏名】アリミ， ディアン

(72)【発明者】

【氏名】オレンガ， シルヴァン

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０９２９８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０００−５１２５０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−１６８３８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−２９５９９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０３４０２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００２／０２６９７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１０４６７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Hildebrand DC, Schroth MN.，beta-Glucosidase Activity in Phytopathogenic Bacteria. ，Appl Microbiol.，１９６４年１１月，12(6)，p.487-91

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−２８

Ｃ１２Ｑ １／００−７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ基質と、式Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド（式中、Ａｒ−は、芳香族化合物を表す）を有するβ−グルコシダーゼ活性化剤とを含む反応培地であって、
前記活性化剤は前記基質と異なるものであり、ヒドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド（アルブチン）、４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、４−アミノフェニル−β−グルコシド、および２−（ヒドロキシメチル）フェニル−β−Ｄ−グルコシド（サリシン）からなる群から選択され、
前記活性化剤は培地中に５ｇ／Ｌ未満の濃度で存在する、反応培地。

【請求項2】

化合物Ａｒ−β−Ｄ−グルコシドが、０．３〜１．５ｇ／Ｌの間の濃度である、請求項１に記載の反応培地。

【請求項3】

化合物Ａｒ−β−Ｄ−グルコシドが、アルブチンである、請求項１または２に記載の反応培地。

【請求項4】

β−グルコシダーゼ基質が、アリザリン−β−グルコシド、マゼンタ−β−グルコシド（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシド）、ＤＨＦ−β−グルコシド、３ＨＦ−β−グルコシド、およびＣＨＥ−β−グルコシド（３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド）、ならびに、ＡＬＤＯＬ（商標）β−グルコシドからなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の反応培地。

【請求項5】

β−グルコシダーゼ基質が、２５〜１０００ｍｇ／Ｌの間の濃度である、請求項１から４の何れか一項に記載の反応培地。

【請求項6】

β−グルコシダーゼ基質が、５０〜４００ｍｇ／Ｌの間の濃度である、請求項１から５の何れか一項に記載の反応培地。

【請求項7】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞発芽活性剤をさらに含む、請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地。

【請求項8】

前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞発芽活性剤が、タウロコール酸ナトリウムである、請求項７に記載の反応培地。

【請求項9】

タウロコール酸ナトリウムが、０．１〜１０ｇ／Ｌの間の濃度である、請求項８に記載の反応培地。

【請求項10】

タウロコール酸ナトリウムが、１〜５ｇ／Ｌの間の濃度である、請求項８または９に記載の反応培地。

【請求項11】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出および／または同定する方法であって、
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含有している可能性の高い試料を、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ基質および式Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド（式中、Ａｒ−は、芳香族化合物を表す）を有するβ−グルコシダーゼ活性化剤とを含む反応培地に、接触させて置くステップであって、
前記β−グルコシダーゼ活性化剤は前記基質と異なるものであり、ヒドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド（アルブチン）、４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、４−アミノフェニル−β−グルコシド、および２−（ヒドロキシメチル）フェニル−β−Ｄ−グルコシド（サリシン）からなる群から選択される、ステップ、
ｂ）インキュベートするステップ、および
ｃ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの存在を示す、β−グルコシダーゼ基質の加水分解を検出するステップ
を含む方法。

【請求項12】

ステップａ）に用いられる培地が、請求項１から１０の何れか一項に記載の培地である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ステップｂ）に用いられるインキュベーションが、嫌気状態で行われる、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ検出および／または同定培地における、β−グルコシダーゼ活性化剤としてのアルブチンの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）を検出および／または同定する方法に関する。本発明はまた、β−グルコシダーゼ活性化剤を含む、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに特異的な反応培地に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、偏性嫌気性および芽胞形成性である、グラム陽性桿菌である。それは、様々な重症度の腸病変、すなわち、敗血症の原因になり得る中程度もしくは激しい下痢、偽膜性大腸炎、または中毒性巨大結腸症の原因である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、胃の酸性度に耐性を示し、腸内で発芽する、芽胞を経口摂取することによって感染する。結腸の共生細菌叢のアンバランスにより、大腸炎の原因である毒素を産生するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖が可能になる。多くの場合、共生細菌叢のアンバランスは、抗生物質を服用した結果である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、ある種の条件下で日和見病原体になる、無害な環境微生物であるとみなすことができる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの無症候性の消化管保有率（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｃａｒｒｉａｇｅ）は、成人人口において、３％と推定されるが、それは、抗生物質治療、または流行性の高いユニットでの滞在の後の対象の１５〜２５％に達し得る。入院患者における２０〜４０％から、幼児における５０〜７０％までの高い保有率レベルが、一般に観察される。早期かつ迅速な診断の可能性は、重い合併症の防止、および効果的な臨床ケアの重要な要素である。

【0003】

診断は、毒素検査、および培養に基づく。

【0004】

直接的に糞便から毒素を単離することは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素産生菌の存在の優れたマーカーである。参照法は、細胞培養を用いて、細胞変性効果（英語の細胞毒性活性の略であるＣＴＡ）を検査することにある。この方法は、非常に高感度であるが、標準化されておらず、専門の技術者、および数日の応答時間を必要とする。毒素Ａのみ、または毒素ＡおよびＢを検出する、ＥＬＩＳＡ型の免疫酵素試験も開発されてきた。結果を得るための時間は、短縮される。しかし、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株を単離するために、毒素を検出するのに使用される免疫学的技法を、細菌培養と組み合わせることが推奨されている。この培養は、本出願人により販売されているＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ寒天培地で用いることができ、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅコロニーは、ＡＰＩ（登録商標）２０Ａギャラリー、またはラピッドＩＤ３２Ａギャラリーなどの生化学的方法によって同定される。しかし、ギャラリーによる同定は、十分な生物量（３〜４マクファーランド）を得るために、同定しようとする細菌を、適切な増殖培地上で純粋培養することが必要とされ、それは、せいぜい４８時間を要する（推定検出するにすぎない、試料抽出からの２４〜７２時間の単離培養、次いで、十分な生物量を生じさせるための２４〜７２時間の培養）。次いで、ギャラリーの読み取りが、ラピッドＩＤ３２Ａについては、４時間の、および、２０Ａギャラリーについては、２４〜４８時間のインキュベーション後に行われる。

【発明の概要】

【0005】

最後に、診断は、分子生物学技術を使用して行うことができる。しかし、これらの技術は、現在、日常的に使用されていない。

【0006】

細菌培養におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの直接的な同定の向上を目指したその研究により、本出願人は、β−グルコシダーゼ酵素基質（複数可）の使用が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを容易に、かつ素早く同定することを可能にすることを実証した。β−グルコシダーゼ基質の前記使用は、出願ＷＯ２００９／０９２９８２に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの同定結果を得るための時間を短縮するものとして記載されている。

【0007】

試料中に潜在的に存在するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの早期かつ迅速な同定は、依然として、主要な目的であり、本出願人は、酵素活性の発見を早めることをより詳細に追求することによって、その研究を続行した。このようにして、本出願人は、β−グルコシダーゼ基質と、一般式Ａｒ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式中、Ａｒ−は、芳香族環、または、数個の隣接した芳香族環に相当する）のβ−グルコシダーゼ活性化剤とを含む反応培地により、試料において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが、迅速に同定されること、言い換えれば、そのような培地により、少なくともいくつかのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の酵素活性が、より早期に検出されることを予想外にも実証した。Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド化合物の使用により、β−グルコシダーゼが活性化され、観察しようとするＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅコロニーの著しく濃い呈色が可能になる。有利なことに、Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド化合物は、セロビオース（４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコース）またはメチル−β−Ｄ−グルコースなどの他のβ−Ｄ−グルコシド誘導体のものよりもはるかに優れた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ β−グルコシダーゼ活性化力を有する。

【0008】

一般式Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド（式中、Ａｒ−は、少なくとも１つの単素環式または複素環式芳香族環を表す）の化合物は、β−グルコシダーゼ基質として使用できることが知られている。この使用は、出願ＷＯ２００９／０９２９８２に報告されている（上記参照）。さらに、ＨｉｌｄｅｂｒａｎｄおよびＳｃｈｒｏｔｈは、アルブチン、すなわち、ヒドロキノンβ−Ｄ−グルコピラノシドを、反応培地において、グルコースと組み合わせて、０．５重量／体積％、言い換えれば、５ｇ／ｌの濃度で、炭素源として使用することを報告している。クロマトグラフ法により測定される、ヒドロキノンのアルブチンの加水分解は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅのβ−グルコシダーゼ活性のマーカーである（ＨｉｌｄｅｂｒａｎｄおよびＳｃｈｒｏｔｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９６４；１２（６）：４８７〜４９１）。これによって、当業者は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出または同定するために、反応培地において、Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド化合物を、β−グルコシダーゼ活性化剤として使用することを思いとどまる。なぜなら、それ自体が、標的微生物の酵素活性を明らかにすることが意図された基質と競合すると思われるからである。

【0009】

最後に、先行技術は、経口投与されたアルブチンは、尿中に、排出および代謝され、したがって、利尿特性および抗菌特性のために使用することができる（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒら、２００２；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．；４２（８）：９２０〜９２７；Ｓｉｅｇｅｒｓら、２００３、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ；１０（付録４）：５８〜６０）。そのような使用も、細菌を検出するために、反応培地において、アルブチンを使用することを阻む。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の詳細な説明の前に、本発明をよりよく理解できるように、以下の定義を示す。それらの定義は、決して限定するものではない。

【0011】

反応培地とは、代謝の発現、および／または微生物の増殖に必要な要素のすべてを含む培地であると理解する。反応培地は、固体、半固体、または液体であってもよい。固体培地とは、ゲル状培地であると理解する。寒天は、微生物を培養するための、微生物学における従来のゲル化剤であるが、ゼラチン、アガロース、または他の天然もしくは人工のゲル化剤を使用することが可能である。例えば、コロンビア寒天培地、トリプケースソイ寒天培地、マッコンキー寒天培地、サブロー寒天培地、または、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているものなどの、多くの調製物が市販されている。本発明による反応培地は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を可能にしなければならない。

【0012】

反応培地は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、ミネラル、ビタミンなどの１つまたは複数の要素を組み合わせて含むことができる。培地はまた、着色剤も含むことができる。例示として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、ヒツジの血液、ウマの血液、酸化チタンなどの乳白剤、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン、１種または複数の代謝指示薬、１種または複数の代謝調節剤などを、着色剤として挙げることができる。

【0013】

反応培地は、検出培地（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）、または培養および検出培地であってもよい。前者の場合、微生物の培養は、接種前に行われ、後者の場合、検出および／または同定培地も、培養培地を構成する。

【0014】

当業者はまた、バイプレートを使用することができ、バイプレートにより、同一の生物学的試料が置かれた異なる基質、または異なる選択的混合物を含む、２つの培地を容易に比較することが可能になる。

【0015】

反応培地は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の１種または複数の増殖活性剤を含むことができる。増殖活性剤とは、微生物の増殖を刺激する、化合物または一群の化合物であると理解する。特に、血液、血清、および卵黄を挙げることができる。限定されないが、０．１〜１０％の間の濃度が、本発明に特に適している。

【0016】

反応培地は、１種または複数の還元剤を含むことができる。還元剤とは、培地に存在する溶解した酸素を中和することにより、嫌気性菌の増殖を容易にする、化合物または一群の化合物であると理解する。特に、システイン、ピルビン酸塩、オキシラーゼ、亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸塩、ヒスチジン、および硫化第一鉄を挙げることができる。限定されないが、０．０５〜５０ｇ／ｌの間、好ましくは０．１〜２ｇ／ｌの間の濃度が、本発明に特に適している。

【0017】

反応培地は、１種または複数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞発芽誘導剤を含むことができる。芽胞発芽誘導剤とは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの芽胞状態から成長状態への変化を促進する、化合物または一群の化合物であると理解する。特に、タウロコール酸ナトリウムを挙げることができる。

【0018】

限定されないが、０．１〜１０ｇ／ｌの間、好ましくは１〜５ｇ／ｌの間の濃度が、本発明に特に適している。

【0019】

反応培地は、１種または複数の選択剤を含むことができる。選択剤とは、標的微生物を除く微生物の増殖を妨げるか、遅らせる任意の化合物であると理解する。限定されないが、５ｍｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの間の濃度が、本発明に特に適している。

【0020】

抗生物質および抗真菌剤を、選択剤として挙げることができる。抗生物質とは、細菌の増殖を妨げるか、遅らせることができる任意の化合物として理解すべきである。特に、それらは、抗生物質はセファロスポリン、アミノグリコシド、ポリペプチド、スルファミドおよびキノロンの群に属する。例示として、特に、抗生物質のセフォタキシム、セフタジジム、セフォキシチン、セフトリアキソン、セフポドキシム、アズトレオナム、ゲンタマイシン、トリメトプリム、トブラマイシン、モキサラクタム、ホスホマイシン、Ｄ−サイクロセリン、ポリミキシン、コリスチン、および、ナリジクス酸などのキノロンを挙げることが可能である。

【0021】

抗真菌剤とは、酵母菌またはカビの増殖を妨げるか、遅らせることができる任意の化合物であると理解すべきである。例示として、特に、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、およびシクロヘキシミドを挙げることが可能である。

【0022】

一般に、反応培地は、直接的または間接的に検出できるシグナルにより、標的微生物の酵素活性または代謝活性を検出することを可能にする基質を、さらに含有することができる。直接的な検出の場合、この基質は、蛍光性または発色性マーカーとして作用する部分と結合させることができる。間接的な検出の場合、本発明による反応培地は、基質の消費から生じ、かつ、標的微生物の増殖を明らかにするｐＨ変動に敏感なｐＨ指示薬を、さらに含むことができる。前記ｐＨ指示薬は、発色団、または発蛍光団であり得る。ニュートラルレッド、アニリンブルー、およびブロモクレゾールブルーを、発色団の例として挙げることができる。発蛍光団は、例えば、４−メチルウンベリフェロン、ヒドロキシクマリン誘導体、またはレゾルフィン誘導体を含む。

【0023】

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを同定できるβ−グルコシダーゼ基質とは、適切な増殖条件下で、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの呈色をもたらす基質であると理解する。特に、２−ヒドロキシフェニル−β−グルコシド（カテコール−β−グルコシド）；マゼンタ−β−グルコシド（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシド）；ＤＨＦ−β−グルコシド（ジヒドロキシフラボン−β−グルコシド）；エスクリン（エスクレチン−β−グルコシド）；ＣＨＥ−β−グルコシド（３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド）；８−ヒドロキシキノリン−β−グルコシド；Ｘ−β−グルコシド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシド）；ローズ（ｒｏｓｅ）−β−グルコシド（６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシド；６−ブロモ−３−インドキシル−β−グルコシド；ブルー−β−グルコシド（５−ブロモ−３−インドキシル−β−グルコシド）；６−フルオロ−３−インドキシル−β−グルコシド；アリザリン−β−グルコシド；（Ｐ）−ニトロフェニル−β−グルコシド；４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、ナフトールベンゼイン−β−グルコシド、インドキシル−Ｎ−メチル−β−グルコシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−メチル−β−グルコシド、ナフチル−β−グルコシド；アミノフェニル−β−グルコシド；ジクロロアミノフェニル−β−グルコシド、Ａｌｄｏｌ（商標）−β−グルコシド（ＢＩＯＳＹＮＴＨ、Ｌｕｋａｓ Ｍ．Ｗｉｃｋ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｂａｙｅｒ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ Ｗｅｙｍｕｔｈ、Ｇｕｎｔｅｒ Ｓｃｈａｂｅｒｔ、Ｖａｎｅｓｓａ Ｐｆｉｓｔｅｒ、Ａｙｓｅｌ Ａｓｌａｎ、Ｕｒｓ Ｐ．Ｓｐｉｔｚ、「Ｎｏｖｅｌ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」、ＡＳＭ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、２００９、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｉ−０９１／２８５）を挙げることができる。

【0024】

反応培地は、酵素活性化剤をさらに含むことができる。酵素活性化剤とは、酵素消化プロセスを活性化するために、言い換えれば、酵素活性を明らかにするためのインキュベーションの時間を短縮するために、および／または前記酵素活性を高めるために作用する化合物であると理解する。

【0025】

本発明によるβ−グルコシダーゼ活性化剤は、一般式として、Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド（式中、Ａｒ−は、芳香族環を表す）を有する。本発明者らは、「芳香族環」で、不飽和化合物、すなわち、二重結合を有し、また、１つまたは複数の隣接したホモ原子環またはヘテロ原子環（各環が５〜７個の頂点を有する）を含むものを指して述べている。非限定的に、アルブチン（ヒドロキノン−β−Ｄ−グルコシド）、４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、４−アミノフェニル−β−グルコシド、サリシン（２−（ヒドロキシメチル）−フェニル−β−Ｄ−グルコシド）、およびエスクリン（６，７−ジヒドロキシ−クマリン−β−グルコシド）を挙げることができる。これらの化合物のいくつかは、β−グルコシダーゼ基質である。本発明に観点から、それらを、活性化剤とみなす。なぜなら、それらは、基質として使用される化合物の加水分解の検出に必要な、インキュベーションの時間を短縮することを可能にし、あるいはこの加水分解を高めることを可能にするからである。したがって、驚くべきことに、酵素基質と本発明による活性化剤との組み合わせにより、これらの化合物を別々に使用した場合よりも、酵素活性を早期に、および／または強力に検出することが可能になる。

【0026】

活性化剤の基質を、組み合わせにおける、基質のモル濃度と活性化剤のモル濃度との合計に少なくとも等しいモル濃度で使用するだけの場合よりも、前記化合物と基質との組み合わせの方が、早期の、および／または強力な検出を可能にするならば、化合物の活性化力は、遅い、および／または弱いβ−グルコシダーゼ活性を有する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのある種の菌株について、顕著に示される可能性がある。

【0027】

生物学的試料とは、分析のために、物から単離された、小さな部分または少ない量のものを意味することを意図する。これは、生体液標本から得られた臨床試料、または、任意の種類の食物から得られた食物試料であり得る。したがって、この試料は、液体または固体であってもよい。非限定的に、全血、血清、血漿、尿もしくは糞便試料、鼻、喉、皮膚、外傷、または濃脊髄液の臨床試料、水、牛乳や果汁などの飲料、ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズ、チーズ、魚などからの食物試料、特に、骨粉から得られた試料などの、動物飼料から得られた食物試料を挙げることができる。この標本は、そのまま使用することもできるし、分析前に、当業者に既知の方法に従って、富化、抽出、濃縮、または精製タイプの調製を受けることもできる。

【0028】

試料を接触させた後、反応培地は、一般に２０〜５０℃の間、好ましくは３０℃〜４０℃の間の適切な温度でインキュベートされる。好ましくは、インキュベーションは、当業者に既知の技術に従って、嫌気状態、言い換えれば、酸素の非存在下で行われる。

【0029】

したがって、本発明は、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ基質と、前記基質と異なる、５ｇ／ｌ未満の濃度の、一般式Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド（式中、Ａｒ−は、芳香族化合物を表す）の化合物とを含む反応培地に関する。

【0030】

化合物Ａｒ−β−Ｄ−グルコシドは、好ましくは、０．３〜１．５ｇ／ｌの間の濃度である。

【0031】

式Ａｒ−β−Ｄ−グルコシドの化合物は、好ましくは、アルブチン、すなわち、ヒドロキノン−β−グルコシド、４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、４−アミノフェニル−グルコシド、サリシン、すなわち、２−（ヒドロキシメチル）フェニル−β−Ｄ−グルコシド、エスクリン、すなわち、６，７−ジヒドロキシ−クマリン−β−グルコシドの中から選択される。

【0032】

化合物Ａｒ−β−Ｄ−グルコシドは、好ましくは、アルブチンである。

【0033】

本発明の好ましい実施形態によれば、β−グルコシダーゼ基質は、アリザリン−β−グルコシド、マゼンタ−β−グルコシド（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシド）、ＤＨＦ−β−グルコシド、３ＨＦ−β−グルコシド、およびＣＨＥ−β−グルコシド（３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド）、ならびに、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社によるＡＬＤＯＬ（商標）β−グルコシド（Ｗｉｃｋら、２００９、ＡＳＭ Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ−Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ、ＵＳＡ））の中から選択される。前記β−グルコシダーゼ基質は、２５〜１，０００ｍｇ／ｌの間、好ましくは５０〜４００ｍｇ／ｌの間の濃度である。

【0034】

本発明によれば、酵素活性化剤は、加水分解生成物が、酵素基質の加水分解生成物と異なる酵素基質である。

【0035】

本発明の好ましい実施形態によれば、酵素活性化剤は、生成物が、肉眼で、反応培地において検出できないが、酵素基質の加水分解生成物が検出できる酵素基質である。

【0036】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、反応培地は、０．１〜１０．０ｇ／ｌの間、好ましくは１．０〜５．０ｇ／ｌの間の濃度のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞発芽活性剤、好ましくは、タウロコール酸ナトリウムをさらに含む。

【0037】

本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出および／または同定する方法であって、
ａ）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含有している可能性の高い試料を、少なくとも１種のβ−グルコシダーゼ基質と、前記基質と異なる、一般式Ａｒ−β−Ｄ−グルコシド（式中、Ａｒ−は、芳香族化合物を表す）の化合物とを含む反応培地と接触させるステップと、
ｂ）インキュベートするステップと、
ｃ）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの存在を示す、β−グルコシダーゼ基質の加水分解を検出するステップと
を含む方法に関する。

【0038】

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明による方法は、ステップａ）において、上で定義したような培地を用いる。

【0039】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、本発明による方法のステップｂ）において用いられるインキュベーションは、嫌気状態で行われる。

【0040】

本発明は、反応培地における、β−グルコシダーゼ活性化剤としての一般式Ａｒ−β−Ｄ−グルコシドの化合物の使用に関する。

【0041】

好ましくは、前記化合物は、５ｇ／ｌ未満、好ましくは０．３〜１．５ｇ／ｌの間の濃度である。

【0042】

好ましくは、前記化合物は、アルブチン、すなわち、ヒドロキノン−β−グルコシド、４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、４−アミノフェニル−β−グルコシド、サリシン、すなわち、２−（ヒドロキシメチル）フェニル−β−Ｄ−グルコシド、エスクリン、すなわち、６，７−ジヒドロキシ−クマリン−β−グルコシドから選択される。より好ましくは、前記化合物は、アルブチンである。

【0043】

好ましくは、前記培地は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出および／または同定するための培地である。

【0044】

以下に実施例は、説明として示すものであり、決して限定するものではない。それらによって、本発明をよりよく理解することが可能になるであろう。

【実施例1】

【0045】

β−グルコシダーゼ基質でのアルブチンの活性化効果の実証。
１．培地および微生物
本出願人の収集物からのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの８つの菌株を、ＣＨＥ−β−グルコシドが存在するまたは存在しない、異なる濃度のアルブチンを含む培地で試験した。次いで、２４時間で、ディッシュの読み取りを行う。培地は、以下の通りに構成される。

【0046】

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＣｈｒｏｍＩＤ（登録商標）ベースは、すべての培地に共通する。

【0047】

【表1】

【0048】

次いで、培地に応じて、アルブチンおよび／またはＣＨＥ−β−グルコシドを添加する。

【0049】

【表2】

【0050】

試験した菌株の整理番号および各リボタイプを、以下の表に示す。

【0051】

【表3】

【0052】

２．試験
培地を、ペトリ皿に分配する。

【0053】

嫌気状態における、３７℃での、４８時間の前培養から、接種を行う。

【0054】

生理食塩水中での、０．５ＭｃＦの懸濁を行い、次いで、菌株を、１０μｌの定量白金耳（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ｌｏｏｐ）で接種する。

【0055】

嫌気状態における、３７℃での２４時間のインキュベーション後に、読み取りを行う。

【0056】

３．結果
酵素活性／呈色の読み取り尺度
・０＝活性なし
・０．５＝非常に薄い呈色
・１＝明瞭な低強度の呈色
・２＝明確な中強度の呈色
・３＝濃い呈色の存在
・４＝非常に濃い呈色の存在。

【0057】

この基質で得られた呈色は、強度１までで灰色であり、その他の値について、黒色である。

【0058】

【表4】

【0059】

２４時間のインキュベーション後、本発明者らは、異なる培地で、黒色に着色された菌株の数について以下のものを得た。

【0060】

【表5】

【0061】

４．解釈
基質の非存在下では、呈色が観察されない。

【0062】

アルブチンだけでも、コロニーの呈色を得ることはできない。

【0063】

逆に言えば、ＣＨＥ−β−グルコシドの存在下で、アルブチンを添加すると、β−グルコシダーゼの活性化が示され、それは、呈色の強まり（灰色から黒色）により表される。

【0064】

５．結論
アルブチンは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株で、β−グルコシダーゼ活性化剤として作用する。

【実施例2】

【0065】

異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株でのアルブチンの最適濃度の試験。
１．培地および微生物
本出願人の収集物からのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの２４個の菌株を、それぞれ異なるアルブチン濃度である、５つの培地で試験した。次いで、２４時間で、ディッシュの読み取りを行う。使用する培地を、上記の実施例１に示したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＣｈｒｏｍＩＤ（登録商標）培地に基づいて調製し、それに、０．０１６ｇ／ｌのセフォタキシム、０．００５ｇ／ｌのファンギゾン、および０．２５ｇ／ｌ（最終濃度）のＤ−サイクロセリン、ならびに、以下の表に従って、アルブチンを加える。

【0066】

【表6】

【0067】

試験した菌株の整理番号および各リボタイプを、以下の表に示す。

【0068】

【表7】

【0069】

２．試験
培地を、ペトリ皿に分配する。

【0070】

嫌気状態における、３７℃での、４８時間の前培養から、接種を行う。

【0071】

生理食塩水中での、０．５ＭｃＦの懸濁を行い、次いで、菌株を、１０μｌの定量白金耳で接種する。

【0072】

嫌気状態における、２４時間のインキュベーション後に、読み取りを行う。

【0073】

３．結果
酵素活性／呈色の読み取り尺度
・０＝活性なし
・０．５＝非常に薄い呈色
・１＝明瞭な低強度の呈色
・２＝明確な中強度の呈色
・３＝濃い呈色の存在
・４＝非常に濃い呈色の存在。

【0074】

この基質で得られた呈色は、強度１までで灰色であり、その他の値について、黒色である。

【0075】

ここに示す、異なる培地での結果は、嫌気状態における、３７℃での２４時間のインキュベーション後に得られた。

【0076】

【表8】

【0077】

２４時間のインキュベーション後、本発明者らは、異なる培地で、黒色に着色された菌株の数について以下のものを得た。

【0078】

【表9】

【0079】

４．解釈
培地にアルブチンを加えると、呈色が、明らかに強まる。２４時間で、アルブチンを含まない培地では、２４個のうちの１２個の菌株しか、１以上の呈色を有しなかったが、７５０ｍｇ／Ｌのアルブチンの存在下で、２４個のうちの２４個の菌株が、最低限度の強度１で着色される。

【0080】

対照で、強い呈色をすでに有する菌株は、１ｇ／Ｌを超えない限り、アルブチンの存在により、ほとんど、または全く影響を受けないように思われる。その他、ある菌株について、呈色強度のわずかな低下が示される。

【0081】

５．結論
式中、アルブチンは、確実に、β−グルコシダーゼ活性化剤として作用し、また、その作用は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの早期検出、特に、リボタイプ０２７について重要であると思われる。

【実施例3】

【0082】

異なるβ−グルコシダーゼ基質でのアルブチンの活性化効果についての試験。
１．培地および微生物
実施例１で試験したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの８個の菌株を、ＤＨＦ−β−グルコシド（培地Ａ）、アリザリン−β−グルコシド（培地Ｂ）、または３ＨＦ−β−グルコシド（培地Ｃ）を含み、かつ、アルブチン濃度が高くなっていく培地で試験した。

【0083】

次いで、２４時間および４８時間で、ディッシュの読み込みを行う。

【0084】

使用する培地を、上記の実施例１に示したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＣｈｒｏｍＩＤ（登録商標）培地に基づいて調製し、それに、以下の表に従って、アルブチンを加える。

【0085】

【表10】

【0086】

したがって、基質に応じて、培地は、以下の通りとなる：
・４００ｍｇ／ＬのＤＨＦ−β−グルコシド（培地ＴＡ、１Ａ、２Ａおよび３Ａ）
・５０ｍｇ／Ｌのアリザリン−β−グルコシド（培地ＴＢ、１Ｂ、２Ｂおよび３Ｂ）
・３００ｍｇ／Ｌの３ＨＦ−β−グルコシド（培地ＴＣ、１Ｃ、２Ｃおよび３Ｃ）

【0087】

２．試験
培地を、ペトリ皿に分配する。

【0088】

嫌気状態における、３７℃での、４８時間の前培養から、接種を行う。

【0089】

生理食塩水中での、０．５ＭｃＦの懸濁を行い、次いで、菌株を、１０μｌの定量白金耳で接種する。

【0090】

嫌気状態における、３７℃での２４時間および４８時間のインキュベーション後に、読み取りを行う。

【0091】

３．結果
酵素活性／呈色の読み取り尺度
・０＝活性なし
・０．５＝非常に薄い呈色
・１＝明瞭な低強度の呈色
・２＝明確な中強度の呈色
・３＝濃い呈色の存在
・４＝非常に濃い呈色の存在。

【0092】

コロニーの色：
培地Ａ：茶色
培地Ｂ：藤色
培地Ｃ：茶色

【0093】

【表11】

【0094】

４．解釈
アルブチンの存在下では、使用する基質に関係なく、呈色強度の向上が示される。この向上は、２４時間以降、主に１ｇ／ｌのアルブチンの存在下で、ＤＨＦ−β−グルコシドを使用する間でとりわけ明白である。アリザリン−β−グルコシドの場合、向上は、２４時間では、明確ではないが、４８時間では、アルブチンを含有するすべての培地で、より明瞭である。最後に、３ＨＦ−β−グルコシドの場合、この化合物の効果は、４８時間で明白であるにすぎないが、使用した濃度に関係なく、また、菌株が何であるかに関係なく、β−グルコシダーゼ活性の実際の活性化が示される。

【0095】

しかし、理想の濃度は、使用する基質に応じて異なり、ＤＨＦ−β−グルコシドおよび３ＨＦ−β−グルコシドならば、約１ｇ／ｌ、アリザリン−β−グルコシドならば、５００ｍｇ／ｌであろう。

【0096】

５．結論
この試験は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの菌株におけるβ−グルコシダーゼ活性の活性化に対する、アルブチンの重要性を実証している。

【実施例4】

【0097】

β−グルコシダーゼ活性へのＡｒ−β−グルコシド化合物の活性化効果についての試験。
１．培地および微生物
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの６個の菌株を、これらの菌株において、β−グルコシダーゼ活性化剤として作用し得る化合物を含む培地で試験した。これらの菌株のリボタイプを、上記の表に示している。整理番号０８０１０９１を有する菌株のリボタイプは、０５６である。β−グルコシダーゼ活性化剤として試験した化合物は、以下の通りである：
・アルブチン、
・Ｏ−メチル−β−グルコシド、
・セロビオース、
・サリシン、
・４−アミノフェニル−β−グルコシド、
・４−メチル−ウンベリフェロン−β−グルコシド、
・エスクリン。

【0098】

それらを、各化合物について同じモル濃度を有することが可能になる濃度で試験した。

【0099】

使用する培地を、上記の実施例１に示したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＣｈｒｏｍＩＤ（登録商標）培地に基づいて調製し、それに、０．３ｇ／ｌのＣＨＥ−β−グルコシド基質、および、以下の表に従って、化合物の１つをそれぞれを加える。

【0100】

【表12】

【0101】

２．試験
培地を、ペトリ皿に分配する。

【0102】

嫌気状態における、３７℃での、４８時間の前培養から、接種を行う。

【0103】

生理食塩水中での、０．５ＭｃＦの懸濁を行い、次いで、菌株を、１０μｌの定量白金耳で接種する。

【0104】

嫌気状態における、３７℃での２４時間のインキュベーション後に、読み取りを行う。

【0105】

３．結果
酵素活性／呈色の読み取り尺度
・０＝活性なし
・０．５＝非常に薄い呈色
・１＝明瞭な低強度の呈色
・２＝明確な中強度の呈色
・３＝濃い呈色の存在
・４＝非常に濃い呈色の存在。

【0106】

この基質で得られた呈色は、強度１までで灰色であり、その他の値について、黒色である。

【0107】

【表13】

【0108】

４．解釈
Ｏ−メチル−β−グルコシドおよびセロビオースは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのβ−グルコシダーゼに活性化効果を与えない。それどころか、対照で呈色を示している菌株で、呈色の低下が示される。

【0109】

逆に、アルブチンに関しては、β−グルコシダーゼの活性化が観察され、ひいては、サリシン、４−アミノフェニル−β−グルコシド、４−メチル−ウンベリフェロン、またはエスクリンの存在下でコロニーの呈色が強まる。これらのうちの１つの化合物の存在下で、不均一な菌株について、呈色の均一化も示される。エスクリンを含有する培地について、寒天において、黒色呈色の強い拡散が示され、それにより、培地を読み取ることが困難になることもある。

【0110】

５．結論
この試験は、アルブチン、サリシン、４−アミノフェニル−β−グルコシド、４−メチル−ウンベリフェロン、またはエスクリンなどの、少なくとも１つの芳香族環を有する化合物による、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのβ−グルコシダーゼの活性化効果を実証している。

【実施例5】

【0111】

ＡＬＤＯＬ（商標）［ＡＬＤＯＬ（商標）４５５−β−グルコシド、およびＡＬＤＯＬ（商標）４８４−β−グルコシド（ＢＩＯＳＹＮＴＨ）］に基づく、β−グルコシダーゼの２つの基質の試験。
１．培地および微生物
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの８個の菌株を、４つの異なる培地、すなわち、対照の増殖培地（Ｔ）、７５ｍｇ／ＬのＡＬＤＯＬ（商標）４５５−β−グルコシドを含有する培地（１）、７５ｍｇ／ＬのＡＬＤＯＬ（商標）４８４−β−グルコシドを含有する培地（２）、および、３００ｍｇ／ＬのレベルのＣＨＥ−β−グルコシドと、クエン酸鉄アンモニウム（３００ｍｇ／Ｌ）とを含有する培地（３）それぞれで試験した。

【0112】

すべての培地に共通した栄養ベースの組成を以下に示す。それは、クエン酸鉄アンモニウムを含まないが、１ｇ／Ｌのアルブチンを補給したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｃｈｒｏｍＩＤ（登録商標）ベースである。

【0113】

【表14】

【0114】

寒天が溶けた後、このベースを、４×８０ｍＬに分け、フラスコＴ、１、２、および３に分配する。３００ｍｇ／ＬのＣＨＥ−β−グルコシド、および３００ｍｇ／Ｌのクエン酸鉄アンモニウムを、前もって、秤量してフラスコ３に入れていたであろう。オートクレーブサイクルにより、培地が滅菌される。培地を過冷却に戻した後、ＡＬＤＯＬ（商標）に基づく基質を、濃縮ストック溶液から、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの溶媒に可溶化した添加物として加える。

【0115】

２．試験
培地を、ペトリ皿に分配する。

【0116】

嫌気状態における、３７℃での、４８時間の前培養から、接種を行う。

【0117】

生理食塩水中での、０．５ＭｃＦの懸濁を行い、次いで、菌株を、１０μｌの定量白金耳で接種する。

【0118】

嫌気状態における、３７℃での２４時間のインキュベーション後に、読み取りを行う。結果を以下に列挙する。

【0119】

３．結果
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの菌株による、異なる基質の酵素加水分解の後、培地１、２および３で得られた単離コロニーの呈色は、それぞれ、黄色、オレンジ色、および茶色である。

【0120】

酵素活性の発現の読み取り尺度（呈色強度）
・０＝活性なし
・０．５＝非常に薄い呈色
・１＝明瞭な低強度の呈色
・２＝明確な中強度の呈色
・３＝濃い呈色の存在
・４＝非常に濃い呈色の存在。

【0121】

【表15】

【0122】

４．解釈
ＡＬＤＯＬ（商標）４５５−β−グルコシド、およびＡＬＤＯＬ（商標）４８４−β−グルコシド（ＢＩＯＳＹＮＴＨ）の基質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの優れた検出を可能にする。２４時間のインキュベーションからの得られた呈色強度（それぞれ、黄色およびオレンジ色）は高い。これら２つの基質により得られた成果は、ＣＨＥ−β−グルコシドにより得られた成果と実質的に同一である。