特許 5883381 親油性ポリヌクレオチド接合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5883381

(24)【登録日】2016年2月12日

(45)【発行日】2016年3月15日

(54)【発明の名称】親油性ポリヌクレオチド接合体

(51)【国際特許分類】

   C07J 51/00 20060101AFI20160301BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20160301BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20160301BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20160301BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20160301BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20160301BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20160301BHJP

【ＦＩ】

   C07J51/00ZNA

   A61K31/7088

   A61K47/48

   A61K47/28

   A61P9/00

   A61P9/04

   A61P9/10 103

【請求項の数】29

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2012-509948(P2012-509948)

(86)(22)【出願日】2010年5月5日

(65)【公表番号】特表2012-526132(P2012-526132A)

(43)【公表日】2012年10月25日

(86)【国際出願番号】US2010033729

(87)【国際公開番号】WO2010129672

(87)【国際公開日】20101111

【審査請求日】2013年4月5日

(31)【優先権主張番号】61/175,690

(32)【優先日】2009年5月5日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511268694

【氏名又は名称】ミラゲン セラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】マーシャル，ウィリアム エス．

(72)【発明者】

【氏名】ヴェイグル，カート

【審査官】 深谷 良範

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０３１４６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５３０２１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Bioorganic & Medicinal Chemistry，２００１年，Vol.9，p.1827-1835

【文献】 Journal of Medicinal Chemistry，２００８年，Vol.51，p.4374-4376

【文献】 Chemistry Letters，２００８年，Vol.37, No.3，p.340-341

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｊ，Ｃ０７Ｈ，Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

構造（ＩＶ）〜（ＶＩ）及び（Ｘ）〜（ＸＩＩＩ）：

【化1】

【化2】

【化3】

から選択される構造を有する（構造（ＩＶ）〜（ＶＩ）については、ＲおよびＲ¹は、それぞれ、水素またはポリヌクレオチドリン酸エステルであり、
構造（Ｘ）〜（ＸＩＩＩ）については、Ｒはポリヌクレオチド鎖である）、親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項2】

前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡをベースとする、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項3】

前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡをベースとする、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項4】

前記ポリヌクレオチドは、修飾されたポリヌクレオチド骨格を有する、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項5】

前記ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート修飾を含む、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項6】

前記ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド単位を有する、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項7】

前記ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の一本鎖領域および１つまたは複数の二本鎖領域を有する、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項8】

前記ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはリボザイムである、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項9】

前記ポリヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒである、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項10】

前記ポリヌクレオチドの長さが、約５〜約５０ヌクレオチドである、請求項８または９に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項11】

前記ポリヌクレオチドの長さが、約１８〜約３０ヌクレオチドである、請求項８または９に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項12】

前記ポリヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡに少なくとも約７５％相補的な配列を含む、請求項８または９に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項13】

前記ポリヌクレオチドは、表１に列記した成熟ｍｉＲＮＡに少なくとも約７５％相補的な配列を含む、請求項８または９に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項14】

前記ポリヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡに１００％相補的な配列を含む、請求項８または９に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項15】

前記ポリヌクレオチドは、表１に列記した成熟ｍｉＲＮＡに１００％相補的な配列を含む、請求項８または９に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項16】

前記ポリヌクレオチドは、細胞ｍｉＲＮＡを模倣するように設計された配列を有する、請求項８に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項17】

前記ポリヌクレオチドは、表１に列記したｍｉＲＮＡを模倣するように設計された配列を有する、請求項８に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項18】

前記ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸、ペプチド核酸骨格、および／または糖修飾を２’位または４’位に含む、請求項１に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体。

【請求項19】

患者への送達用に製剤化された請求項１〜１８のいずれか１項に記載の親油性ポリヌクレオチド接合体を含む医薬組成物。

【請求項20】

前記親油性ポリヌクレオチド接合体は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビード、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームとして製剤化される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記親油性部分により、前記ポリヌクレオチド接合体がリポソームに固着される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

皮内送達、皮下送達、筋内送達、腹腔内送達、または静脈内送達用に製剤化される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項23】

心臓カテーテル系による投与用に製剤化される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項24】

ポリヌクレオチドを請求項１〜１８のいずれか１項に記載の接合体として投与することを含む、iｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達する方法。

【請求項25】

ポリヌクレオチドを請求項１〜１８のいずれか１項に記載の接合体として投与することを含む、iｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチドを哺乳動物患者に送達する方法。

【請求項26】

前記ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤である、請求項２４または２５に記載の方法。

【請求項27】

前記患者は、ｍｉＲＮＡ発現に関係する病状を有している、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記病状は、心臓肥大、心筋梗塞、心不全、血管傷害、および病的心臓線維症の１つまたは複数である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

親油性ポリヌクレオチド接合体であって、構造（Ｉ）〜（ＸＩＩＩ）：

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

から選択される構造を有する（構造（Ｉ）〜（ＩＩＩ）については、ｎは１または２であり、Ｒはヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり；
構造（ＩＶ）〜（ＶＩ）については、ＲおよびＲ¹は、それぞれ、水素またはポリヌクレオチドリン酸エステルであり；
構造（ＶＩＩ）〜（ＩＸ）については、ＲおよびＲ¹は、それぞれ、水素、またはＯＨ、またはポリヌクレオチドリン酸エステルであり；
構造（Ｘ）〜（ＸＩＩＩ）については、Ｒはポリヌクレオチド鎖である）、親油性ポリヌクレオチド接合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連発明の相互参照）
［００１］本出願は、２００９年５月５日に出願された米国仮出願第６１／１７５，６９０号（その全体について参照により本明細書に援用する）の優先権の利益を請求する。

【0002】

（電子出願テキストファイルの詳細）
［００２］本明細書とともに電子出願されたテキストファイルの内容物は、その全体について参照により本明細書に援用する：配列リストのコンピューター読み取り可能なフォーマットコピー（ファイル名：ＭＩＲＧ＿０１４＿００ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１０年５月４日に記録したデータ、ファイルサイズ１０キロ）。

【0003】

（発明の分野）
［００３］本発明は、治療、研究および／または診断目的のためにポリヌクレオチドを細胞送達するための親油性核酸接合体（conjugates）に関する。本発明は、ある種の実施態様において、内在性ｍｉｃｒｏＲＮＡ機能を標的とするポリヌクレオチドの送達に関する。

【背景技術】

【0004】

［００４］オリゴヌクレオチド治療戦略は、細胞膜を構成する疎水性リン脂質二重層を横断することにより、親水性、高電荷、かつ陰イオン性の核酸分子を細胞質に送達することに依る。オリゴヌクレオチドの疎水性接合体は、その細胞取り込みを促進する能力について調べられている。例えば、コレステロール接合体は、リポタンパク質、より具体的には、ＩＤＬ粒子およびＬＤＬ粒子に結合することが可能であり得る。該粒子は、ＡｐｏＥおよびＡｐｏＢ−１００リポタンパク質を含み、これらは、ＬＤＬ細胞表面受容体を標的にし、リポタンパク質仲介エンドサイトーシスにより内在化することができる。これらの受容体は、主に肝臓に見出されるが、脂肪組織、心臓、および骨格筋にも見出される。さらに、親油性ペンダント基は、リン脂質二重膜に介在して（intercalate)、それよってオリゴヌクレオチドの受動的な内在化を助けることにより、接合体を細胞膜に「固着すること（anchoring）」を助け得る。

【0005】

［００５］そのような親油性分子または置換基は、所望の治療活性のためのポリヌクレオチド機能および構造を維持するようにポリヌクレオチドとともに製剤化するかまたはポリヌクレオチドに結合される必要がある。例えば、治療用のポリヌクレオチドは、大きいおよび／または複雑なリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体との相互作用によって機能させ、および／またはこれらの複合体のＲＮＡ成分を標的にしてもよい。したがって、親油性修飾により、細胞因子および分子標的と相互作用するためのポリヌクレオチドの近づきやすさは妨げられない。

【0006】

［００６］ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ）は、特に、発生時期の調節、アポトーシス、脂肪代謝、および造血細胞の分化を含む多くの生物学的プロセスに関与し、比較的新しいクラスの治療標的を代表するものである。ｍｉＲは、約１８〜約２５ヌクレオチド長の小さな、タンパク質をコードしない（non-ptotein coding）ＲＮＡであり、配列が完全に相補的である場合には分解を促進することにより、あるいは、配列がミスマッチを含む場合には翻訳を阻害することにより、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして働く。成熟ｍｉＲＮＡ鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に導入され、塩基対の相補性によって標的ＲＮＡと会合する。

【0007】

［００７］分子標的との相互作用を実質的にまたは有意に害することなく、ｍｉＲおよびｍｉＲ阻害剤を含む治療用ポリヌクレオチドを細胞に効率的に送達するための組成物および方法が求められている。

【発明の概要】

【0008】

［００８］本発明は、親油性ポリヌクレオチド接合体、および治療が必要な哺乳動物細胞または哺乳動物患者に治療用ポリヌクレオチドを送達する方法を提供する。本発明は、親油性ポリヌクレオチド接合体の合成方法をさらに提供する。本発明によれば、接合体には、細胞ｍｉＲＮＡを模倣するまたは標的にするように設計されたコレステロールとポリヌクレオチドとの接合体が含まれる。コレステロールまたはコレステロール誘導体などの親油性部分は、炭化水素基によってポリヌクレオチドから隔てられている。親油性部分の近くに非常に極性な基（significantly polar groups）および／または交換可能なプロトンが存在しないため、本発明は、親油性部分と細胞膜との間の相互作用を促進して、効率的に細胞に進入する。接合体は、治療効果を送達するポリヌクレオチドの能力を実質的にまたは有意に害しない。

【0009】

［００９］一態様において、本発明は、親油性ポリヌクレオチド接合体ならびにこれを含む医薬組成物および医薬製剤を提供する。この態様によれば、親油性部分は、コレステロールもしくは本明細書に記載される類似の親油性構造、または膜リン脂質に会合するその他の基であってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡをベースとすることができ、および／または１つまたは複数の核酸修飾、例えば、修飾ポリヌクレオチド骨格または１つまたは複数の修飾ヌクレオシド単位を包含してもよい。例えば、修飾骨格は、全体または一部がホスホロチオエート修飾された骨格であってもよい。ポリヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡを模倣するか、あるいはアンチセンス阻害などによりｍｉＲＮＡを標的にするように設計してもよい。ポリヌクレオチドおよび親油性部分は、実質的に直鎖状の炭化水素部分（例えばリンカー）によって隔てられ、これを介して接合している。炭化水素リンカーは、ポリヌクレオチドの５’および／または３’末端などに接合させることができる。

【0010】

［０１０］本発明の接合体は、親油性部分付近に、交換可能なプロトンを有する基などの非常に極性な基を有していない。例えば、炭化水素は、エーテル結合またはチオエーテル結合などの比較的非極性の基を介して親油性部分（例えばコレステロール）に接合させることができ、疎水性リンカーは、約３〜約１５個の炭素原子を含んでもよい。例えば交換可能なプロトンを有する非常に極性な基が親油性部分の付近に存在しないことにより、当該部分は、細胞または患者に送達されたときに膜リン脂質とより良好に介在することが可能となる。

【0011】

［０１１］第２の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達する方法、および哺乳動物患者での病状の進行を治療または予防する方法を提供する。この態様において、本発明は、コレステロールまたは本明細書に記載の他の親油性部分との接合体として、ポリヌクレオチド投与することを含む。ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤（例えば、ｍｉＲＮＡの発現または活性を阻害するように設計されたヌクレオチド配列を有する）であってもよい。そのような実施態様において、患者は、ｍｉＲＮＡ発現などのＲＮＡ発現に関連する病状を有する。そのような状態には、特に、心臓肥大、心筋梗塞、心不全（例えば、鬱血性心不全）、血管傷害、再狭窄、および／または病的心臓線維症（pathologic cardiac fibrosis）などが含まれる。

【0012】

［０１２］第３の態様において、本発明は、ポリヌクレオチド接合体の合成方法を提供する。本発明は、炭化水素部分またはリンカーを介して５’および／または３’末端でまたはポリヌクレオチド骨格に沿って接合された親油性部分を有するポリヌクレオチドの合成方法を提供する。親油性部分がステロールなどのアルコールである、ある種の実施態様において、当該親油性部分は、好適な末端官能基を有する炭化水素でエーテル化される。このエーテル結合中間体は、固相核酸合成に適合する好適な試薬を調製するようにさらに反応させてもよい。例えば、エーテル結合中間体を、（例えばポリヌクレオチド合成に際してヌクレオチド５’ヒドロキシルに結合する）リン酸エステルに変換するための、（例えばエーテル結合を介する）末端ホスホロアミダイトを調製するようにさらに反応させてもよい。あるいは、またはさらに、エーテル結合中間体を、核酸合成用の好適な支持体に（例えばアミド化により）結合するための好適な末端基を調製するようにさらに反応させてもよい。

【0013】

［０１３］あるいは、本発明は、ポリヌクレオチド合成の完了後、カルボニル付加−脱離／還元アミノ化、アミド化、マレイミド−チオールカップリング、水性ディールス・アルダー、および「クリック（Click）」ケミストリーなどを用いて、ポリヌクレオチドとのコレステロール接合体を合成する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】［０１４］従来の接合体と比較した本発明の例示的な親油性（コレステロール）接合体を図示している。本発明によれば、交換可能なプロトンを有する極性基などの極性基はコレステン環構造付近から除かれる。

【図2】［０１５］ヌクレオチドと５’位で結合するためのホスホロアミダイト中間体（６）および固体支持体への結合のためのコハク酸エステル中間体（７）の調製を含む、本発明による例示的な接合体の合成を図示している。

【図3】［０１６］固体支持体に固着されるコレステロール結合中間体を有する例示的な３’−コレステロール接合体（１−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ））−１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−３−オール官能化ＣＰＧ）の合成を図示している。

【図4】［０１７］オリゴヌクレオチドが相補的な官能基で官能化される場合、コレスト−５−エン−３−オキシアルカノール（Ａ）を修飾して、アミド化（Ｂ）、ディールス・アルダーバイオコンジュゲーション（Ｃ）、および「クリック」バイオコンジュゲーション（Ｄ）などの典型的なバイオコンジュゲーション技法を容易に行うための官能基を得ることができることを図示している。

【図5】［０１８］表２に示した化学物質の静脈注入に対するｍｉＲ−２０８のノーザン分析である。

【図6】［０１９］示した化学物質の静脈注入に対するｍｉＲ−２０８ノックダウンのリアルタイム定量化を、生理食塩水を注入した動物と比較して示している。

【発明を実施するための形態】

【0015】

（発明の詳細な説明）
［０２０］能動および／または受動細胞輸送メカニズムは、ペンダント親油性基（リン脂質二重層にネイティブであるもの、および該二重層に効率的に収容する（pack）必要があるものを含む）の恩恵を浴することができる。したがって、本発明は、リン脂質二重層に効率的に収容することによって細胞膜または送達運搬体として働き得るリポソームもしくはミセルに対するポリヌクレオチド接合体の親和性を高めるための十分に疎水性のリンカーを含む接合体を提供する。オリゴヌクレオチド−コレステロール型の接合体では、一般に、ステロイド環構造に非常に近接した交換可能なプロトンを含む極性基となるコレステリルカルバメート結合が用いられる。これらの接合体では親油性特性が最適化されてなく、極性結合点は効率的なリン脂質二重層の収容を妨げ得る。

【0016】

［０２１］本発明は、親油性ポリヌクレオチド接合体、および治療が必要な哺乳動物細胞または哺乳動物患者を治療するためのポリヌクレオチドの送達方法を提供する。本発明は、親油性ポリヌクレオチド接合体の合成方法をさらに提供する。本発明によれば、ｍｉＲＮＡを含む細胞ＲＮＡを標的にするように接合体を設計してもよい。例えば、アンチセンス阻害によって細胞ｍｉＲＮＡを標的にするかまたはｍｉＲＮＡを模倣するように接合体を設計してもよい。親油性部分、例えば、コレステロールまたは他の親油性基は、炭化水素リンカーによってポリヌクレオチドから隔てられている。親油性部分の付近に非常に極性な基および／または交換可能なプロトンが存在しないため、本発明は、親油性部分と膜リン脂質との相互作用を促進し、それによって細胞に効率的に進入することとなる。接合体は、治療効果をもたらすためのポリヌクレオチドの能力を実質的にまたは有意に害さない。

【0017】

親油性部分および炭化水素スペーサー
［０２２］親油性部分は、細胞膜などのリン脂質二重層または本明細書に記載されるリポソームもしくはミセルなどの送達運搬体に介在可能な脂肪可溶性部分である。親油性部分は、エーテル結合またはチオエーテル結合を介して炭化水素スペーサー（下記）に接合体することができる。例示的な親油性部分は、コレステロールおよびコレステロール誘導体（コレステン、コレスタン、およびコレスタジエンを含む）、胆汁酸（コール酸、デオキシコール酸、およびデヒドロコール酸など）、ステロール、ステロイド、または他の脂肪可溶性アルコールまたはチオールを含む。ある種の実施態様において、親油性部分は、本明細書に参照により援用する米国特許第７，２０２，２２７号に記載されるようなコレステロールもしくはコレステロール誘導体またはコール酸もしくはコール酸誘導体である。そのような誘導体は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（例えばメチル）で置換されたコレステロールまたはコール酸構造を含む。

【0018】

［０２３］例えば、ある種の実施態様において、コレステロールまたは誘導体は以下の構造を有することができる。

【化1】

【0019】

そのような構造において、Ｒ^１乃至Ｒ^８の各々は、実質的に非極性基である。例えば、Ｒ^１乃至Ｒ^８の各々は、水素、アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、置換アルキル、置換されていてもよいアルコキシ（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、および置換されていてもよいアルコキシアルキルから独立して選択してもよい。ある種の実施態様において、親油性部分は次式を有する（式中、Ｒはアルキル（例えばＣ１〜Ｃ１０アルキル）である）：

【化2】

【0020】

［０２４］炭化水素部分またはスペーサーは、親油性部分（上記）を極性基などの非親油性から引き離し、患者に送達したときまたは哺乳動物細胞と接触したときに、親油性部分が、特に膜リン脂質とより良好に作用することが可能となる。したがって、接合体は、一般に、親油性部分付近に交換可能なプロトンまたは他の極性基（例えばヒドロキシルまたはアミド）を有しない。一般に、親油性部分から約３〜約１５原子以内に非常に極性な基および交換可能なプロトンは無い。ある種の実施態様において、第１の非常に極性な基または交換可能なプロトンは親油性部分から少なくとも６原子、７原子、８原子または９原子離れている。

【0021】

［０２５］炭化水素スペーサーは、エーテル結合またはチオエーテル結合などの比較的非極性の結合を介して親油性部分に接合してもよい。例えば、親油性部分がコレステロールまたは他のステロールである場合、炭化水素スペーサーはステロールヒドロキシル基とエーテル結合することができる。

【0022】

［０２６］ある種の実施態様において、炭化水素スペーサーは、Ｃ２〜Ｃ１５飽和または不飽和炭化水素鎖（例えばアルキレンまたはアルケニレン）を含み、比較的非極性の置換基で置換されてもよい。一般に、そのような置換基は、上記のように親油性部分の付近に交換可能なプロトンまたは極性基を含まない。例えば、置換基は、アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アルコキシ（例えばＣ１〜Ｃ６アルコキシ）、およびアルコキシアルキルから独立して選択することができる。極性置換基が存在する場合、それらは、親油性部分から少なくとも約６原子、７原子、８原子、または９原子隔てられている。不飽和の場合、炭化水素スペーサーは、１個、２個、または３個の二重結合を含んでもよい。ある種の実施態様において、炭化水素スペーサーは、Ｃ２〜Ｃ１０またはＣ４〜Ｃ８飽和炭化水素鎖を含む。例えば、炭化水素スペーサーは、Ｃ４またはＣ６飽和炭化水素を含んでもよい。

【0023】

［０２７］ある種の実施態様において、炭化水素鎖は、１つまたは複数の複素原子（例えば１〜５個）、例えばＯ、Ｓ、および／またはＮから独立して選択される複素原子を含む。所望するいくつかの実施態様またはポリヌクレオチドがエーテル結合またはチオエーテル結合によって末端に結合することに起因するいくつかの実施態様を除く、ある種の他の実施態様において、炭化水素鎖はいかなる複素原子も有しない。

【0024】

［０２８］炭化水素スペーサーは、例えばヌクレオチド５’位または３’位を介してあるいはポリヌクレオチド骨格に沿った他の位置において、親油性部分と反対の末端でポリヌクレオチドに接合している。炭化水素スペーサーは、ホスホジエステル、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、またはアミドを含む任意の好適な官能基を介して、ポリヌクレオチドに、例えばヌクレオチド５’ 位または３’位などに接合することができる
［０２９］本発明の例示的な接合体は、以下の構造（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）からそれぞれ選択される構造を有する。

【化3】

【0025】

式中、ｎは、１または２であり、Ｒは、連結基を介して結合してもよい３’位または５’位を介して結合しているヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。

【0026】

［０３０］さらなる例示的な接合体には、構造（ＩＶ）−（ＶＩ）（式中、ＲおよびＲ’は、それぞれ、Ｈまたはポリヌクレオチドリン酸エステル（phosphate polynucleotide）である）、および構造ＶＩＩ−ＩＸ（式中、ＲおよびＲ’は、それぞれ、Ｈ、ＯＨ、またはポリヌクレオチドリン酸エステルである）が含まれる。

【化4】

【0027】

［０３１］ある種の実施態様において、接合体は、下記構造の１つを有する５’接合体である（式中、Ｒは、ポリヌクレオチド鎖である)。

【化5】

【0028】

［０３２］ある種の実施態様において、接合体は、下記構造の１つを有する３’接合体である（式中、Ｒは、ポリヌクレオチド鎖である）。

【化6】

【0029】

ポリヌクレオチド
［０３３］本発明の化合物、組成物、および方法は、種々のポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）およびその誘導体を用いることができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡをベースとしてもよく、および／または１つまたは複数の核酸修飾、例えば修飾ポリヌクレオチド骨格または１つまたは複数の修飾ヌクレオシド単位を含んでもよい。ポリヌクレオチドまたは誘導体は、１つまたは複数の一本鎖領域および／または１つまたは複数の二本鎖領域を有してもよい。ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはリボザイムであってもよい。

【0030】

［０３４］ある種の実施態様において、本化合物、本組成物、または本方法は、接合されたｍｉＲＮＡ阻害剤（例えばアンチセンス阻害剤）を用いる。そのような阻害剤は、例えば、国際公開第国際公開第２００８／０１６９２４号、国際公開第２００９／０６２１６９号、国際公開第２００９／０５８８１８号、国際公開第２００９／０１８４９２号、国際公開第２００９／０１８４９３号、国際公開第２００９／０１２４６８号、および国際公開第２００７／０７０４８３号に記載されており、これらをその全体について参照により本明細書に援用する。

【0031】

［０３５］したがって、ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。ある種の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１の化学修飾（例えば糖または骨格修飾）を含む。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチル−糖修飾）を含んでもよい。ある種の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドのみを含む。ある種の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含み、一部または全体がホスホロチオエート骨格となる。ｍｉＲＮＡを阻害するのに好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約５０ヌクレオチド長、例えば約１０〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜約２５ヌクレオチド長であってもよい。ある種の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８〜約１８ヌクレオチド長であり、他の実施態様において、約１２〜約１６ヌクレオチド長である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列を含んでもよい（以下の表１を参照）。他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的な配列を含む。本明細書で用いる「相補的な」または「塩基対」は、古典的なワトソン−クリックヌクレオチド塩基対を包含し、あるいはこの塩基対のみをいう。一実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒ（antagomir）である。「アンタゴｍｉｒ」は、ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的な、化学修飾されていてもよい一本鎖リボヌクレオチドである。

【0032】

［０３６］ある種の実施態様において、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、例えば表１に列記した細胞ｍｉＲＮＡを模倣するように設計された配列を有する。これらの実施態様におけるポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチル−糖修飾）および１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含んでもよい。ｍｉＲＮＡを模倣するのに好適なポリヌクレオチドは、約１５〜約５０ヌクレオチド長であってもよく、例えば約１８〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜約２５ヌクレオチド長であってもよい。合成ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同性である配列を含んでもよい（以下の表１を参照のこと）。他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相同性である配列を含む。

【0033】

［０３７］ポリヌクレオチドは、主にリボヌクレオチド単位から構成されてもよく、または主にデオキシリボヌクレオチド単位から構成されてもよく、１つまたは複数の化学修飾を有してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の「コンホメーションが束縛された（confomationally constrained）」または二環式糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）からなってもよく、これは、ＢＳＮを含むオリゴヌクレオチドとその相補的なｍｉｃｒｏＲＮＡ標的鎖との間に形成される複合体に高い熱的安定性を与える。ある種の実施態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、約１〜１０個のロックド核酸（locked nucleic acids）を含む。「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシドを含み、リボース糖部分は、「ロックド（locked）」コンホメーションである。あるいは、またはさらに、ポリヌクレオチドは、糖−ホスフェート骨格ではなく、ペプチドをベースとした骨格を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。これらの実施態様または他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の糖修飾および／または１つまたは複数の骨格修飾を含む。例示的な糖修飾は、２’および４’修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなど）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾を含む。例示的な骨格修飾は、ホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボキシレート結合を含む（例えば、米国特許第６，６９３，１８７号および第７，０６７，６４１号を参照のこと。これらを全体について参照により本明細書に援用する。）。

【0034】

［０３８］ある種の実施態様において、ポリヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（gapmer）である。「ギャップマー」は、５’末端および３’末端の両方において２’−Ｏ−メトキシエチル修飾されたリボヌクレオチドを含み、中心に少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを有する。この「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ非依存性分解メカニズムを引き起こすことができる。

【0035】

［０３９］安定性を高めおよび／またはアンチセンス効率を良くするなどの他のポリヌクレオチド修飾は公知であり、本発明に関して用いることができる。例示的な修飾は、米国特許第６，８３８，２８３号に記載されている（これを全体として参照として本明細書に援用する）。

【0036】

［０４０］ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、例えば、以下の表１に列記したｍｉＲＮＡを模倣するまたは標的にするように設計されたヌクレオチド配列を有してもよい。ある種の実施態様において、ｍｉＲＮＡを阻害するように設計されたポリヌクレオチドは、完全に相補的なｍｉＲＮＡ配列に対して１〜５つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のミスマッチを含む配列を有してもよい（以下の表１を参照のこと）。他の実施態様において、ｍｉＲＮＡを模倣するように設計されたポリヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１〜５つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のヌクレオチド置換を含む配列を有してもよい（以下の表１を参照のこと）。そのようなアンチセンスおよびセンス配列は、ｓｈＲＮＡ、またはステムおよびループ部分などを含む他のＲＮＡ構造に導入されてもよい。そのような配列は、特に、心臓肥大、心筋梗塞、心不全（例えば、鬱血性心不全）、血管傷害、および／または病的心臓線維症の治療または治癒用にｍｉＲＮＡ機能を模倣するまたは標的化するのに特に有用である。例示的なｍｉＲＮＡ治療の有用性は、以下の表１に列記した米国特許および国際公開公報の参照文献に開示され、その各々をその全体について参照により本明細書に援用する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0037】

［０４１］ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のように接合体された親油性基を１〜５個有してもよい。親油性基は、ポリヌクレオチドの５’位または３’位を介して接合してもよいし、および／または、リン酸エステルなどの形成によりポリヌクレオチド骨格に接合してもよい。ある種の実施態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のように接合体された１個または２個の親油性基を５’および／または３’末端において有してもよい。

【0038】

医薬組成物および送達
［０４２］本発明の接合体は、種々の医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、意図する用途に適切な形態で調製されるであろう。一般に、これは、発熱原およびヒトまたは動物に有害となり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを包含する。例示的な送達／製剤系は、コロイド分散系、高分子（macromolecule）複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビード、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質をベースとした系を含む。本発明の核酸を心臓および骨格筋組織に送達するのに好適な市販の脂肪エマルジョンには、Ｉｎｔｒａ脂質（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏでの送達運搬体としての使用に好ましいコロイド状系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は、当業界において周知である。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号；米国特許第６，２１７，９００号；米国特許第６，３８３，５１２号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第７，２０２，２２７号；米国特許第６，３７９，９６５号；米国特許第６，１２７，１７０号；米国特許第５，８３７，５３号３；米国特許第６，７４７，０１４号；および国際公開第０３／０９３４４９号に開示され、これらを全体として参照により本明細書に援用する。

【0039】

［０４３］医薬組成物および製剤は、送達運搬体を安定にし、標的細胞による取り込みを可能とするための適切な塩および緩衝剤を用いてもよい。本発明の水性組成物は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散された、阻害剤としてのポリヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（例えばリポソームまたは他の複合体）を含む送達運搬体を有効量含む。「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」とは、動物またはヒトに投与したときに副作用、アレルギー、または他の有害な反応を生じない分子部分および組成物をいう。本明細書に用いられる「薬学的に許容可能な担体」には、医薬、例えばヒトへの投与に好適な医薬の製剤化での使用に許容される１つまたは複数の溶剤、緩衝剤、液剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれてもよい。医薬活性物質のためのこのような媒体および剤の使用は、当業界において公知である。補充活性成分も組成物に含ませることができる。

【0040】

［０４４］本発明の医薬組成物の投与または送達は、その経路によって標的組織が利用可能である限り、任意の経路とすることができる。例えば、投与は、皮内、皮下、筋内、腹腔内または静脈内注入であってもよいし、または標的組織（例えば心臓組織）への直接注入によるものであってもよい。ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡ配列を含む発現構築物を含む医薬組成物は、カテーテル系または治療剤を心臓へ送達するための冠循環を同定する系によって投与することもできる。心臓および冠血管系に治療剤を送達するための種々のカテーテル系は、当業界で公知である。カテーテルをベースとした送達方法または本発明での使用に好適な冠状同定（coronary isolation）法のいくつのかの非限定的な例は、米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６，９５３，４６６号、国際公開第２００５／０８２４４０号、国際公開第２００６／０８９３４０号、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、および米国特許公開第２００７／００６０９０７号に記載され、これらを全体について参照により本明細書に援用する。

【0041】

［０４５］本組成物または製剤は、非経口投与してもよいし、または腹腔内投与してもよい。例示のため、遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての接合体の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合される水で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製してもよい。通常の貯蔵および使用状態下では、これらの調製は、微生物の成長を妨げるための防腐剤を一般に含む。

【0042】

［０４６］注入可能な使用またはカテーテル送達に好適な医薬形態には、例えば、無菌の水溶液または分散液、および注入可能な無菌の溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が含まれる。一般に、これらの調製は、注入が容易になる程度まで無菌かつ流動的とする。製剤は、製造および貯蔵状態下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して予防される必要がある。適切な溶剤または分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含んでもよい。適切な流動性は、例えば、レクチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必要な粒子サイズの保持により、および界面活性剤の使用により、保持することができる。微生物の働きは、種々の抗菌剤、抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって予防される。多くの場合、糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注入可能な組成物の吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物中で使用することによって延ばすことができる。

【0043】

［０４７］注入可能な無菌溶液は、所望する場合には任意の他の成分（例えば、上記で列挙したもの）とともに接合体を適切な量で溶媒中に入れることによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の無菌化活性成分を、塩基性分散媒体および所望の他の成分（例えば上記のもの）を含む無菌運搬体に入れることによって調製する。注入可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、その好ましい調製方法には真空乾燥技術および凍結乾燥技術が含まれ、これは、予め無菌ろ過した溶液由来の活性成分および所望する任意の追加成分の粉末を生成する。

【0044】

［０４８］製剤化に際し、溶液は、投与製剤（dosage formulation）に適合するように、かつ、治療に有効な量で投与することが好ましい。製剤は、種々の剤形、例えば、注入可能な溶液、薬物放出カプセルなどで容易に投与することができる。例えば、水溶液での経口投与のため、溶剤は一般に好適に緩衝化し、液体希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースなどでまず等張化する。そのような水性溶剤は、静脈内、筋内、皮下、および腹腔内投与などに用いることができる。無菌水性媒体は、当業者に知られているようにして使用すること、特に本開示に照らして使用することが好ましい。例示として、単一用量をＮａＣＩ等張溶液１ｍｌに溶解し、皮下注入液１０００ｍｌに添加するか、または予定の注入部位で注入してもよい（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第１０３５〜１０３８頁および第１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。治療対象の状態に応じて用量を変えることは必然的に必要となるであろう。いずれにしても、投与責任者が個々の対象に適切な用量を決定するであろう。さらにヒト投与のためには、製剤は無菌性、発熱原性、ＦＤＡ部局生物学基準によって要求される一般的な安全性基準および純度基準を満たす必要がある。

【0045】

治療方法
［０４９］本発明は、ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達する方法、および哺乳動物患者の病状の進行を治療、改善、または予防する方法を提供する。本方法は、一般に、本明細書に記載のとおり、ポリヌクレオチドをコレステロールまたは他の親油性部分との接合体として投与することを含む。ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ阻害剤（例えば、ｍｉＲＮＡ発現または活性を阻害するように設計されたヌクレオチド配列を有するもの）であってもよい。したがって、患者は、ｍｉＲＮＡ発現などのＲＮＡ発現に関係する病状を有してもよい。そのような病状には、例えば、心臓肥大、心筋梗塞、心不全（例えば鬱血性心不全）、血管傷害、再狭窄、または病的心臓線維症が含まれる。

【0046】

［０５０］心臓肥大、心筋梗塞、心不全（例えば鬱血性心不全）、血管傷害、再狭窄、および／または病的心臓線維症などの病状に関与するｍｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ機能を標的化する配列は、国際公開第２００８／０１６９２４号、国際公開第２００９／０６２１６９号、国際公開第２００９／０５８８１８号、国際公開第２００９／０１８４９２、国際公開第２００９／０１８４９３号、国際公開第２００９／０１２４６８号、および国際公開第２００７／０７０４８３号に記載され、これらを全体について参照により本明細書に援用する。そのようなｍｉＲＮＡおよび配列は、さらに表１に列記され、かつ本明細書に記載されている。

【0047】

［０５１］親油性ポリヌクレオチド接合体は、本明細書でも記載する医薬組成物または医薬製剤として患者に送達することができる。

【0048】

［０５２］ある種の実施態様において、患者は、長期に続く制御不能な高血圧、不修正（uncorrected）心臓弁膜症、慢性狭心症、亜急性心筋梗塞、心疾患の先天性素因、および病的肥大などを含む１つまたは複数のリスク要因を有する。あるいは、またはさらに、患者は、心臓肥大などの遺伝的素因を有すると診断されていてもよいし、または心臓肥大などの家族歴を有していてもよい。

【0049】

［０５３］この態様において、本発明は、心不全または心臓肥大を患う患者において、運動耐性の向上、少ない入院、より高い生活の質、羅患率の低下、および／または死亡率の低下をもたらすことができる。

【0050】

接合体の合成方法
［０５４］本発明は、さらに、炭化水素リンカーを介して５’および／または３’末端で接合体されたまたはポリヌクレオチド骨格に接合された親油性部分を有するポリヌクレオチドを合成する方法を提供する。この態様において、本発明は、親油性部分を末端官能基を有する直鎖状または環状炭化水素と結合し、第１の中間体を調製すること、および固相ポリヌクレオチド合成に際してポリヌクレオチド鎖に導入するのに好適な官能基を有する第２の中間体を調製することを伴う。あるいは、本方法は、ポリヌクレオチドの合成完了後に、カルボニル付加−脱離／還元アミノ化、アミド化、マレイミド−チオールカップリング、水性ディールス・アルダー、および「クリック」ケミストリーなどを用いて、ポリヌクレオチドとのコレステロール接合体を合成することを伴う。

【0051】

［０５５］親油性部分がステロールなどのアルコールである、ある種の実施態様において、本方法は、末端官能基を有する炭化水素に親油性部分（本明細書に記載）を接合することを含む。この工程では、第１の中間体、好ましくは、エーテル結合中間体を調製する。例えば、ある種の実施態様において、ステロールを（ステロールヒドロキシルを介して）Ｃ３〜Ｃ１５炭化水素にエーテル化する。炭化水素は、ある種の実施態様において、置換されていてもよく、かつ、Ｏ、Ｎ、および／またはＳから独立して選択される１個、２個、または３個の複素原子を骨格中に有してもよい、実質的に直鎖状のＣ４〜Ｃ８（例えば、Ｃ４またはＣ６）炭化水素である。あるいは、炭化水素は、シクロヘキサンなどのＣ５〜Ｃ８環状炭化水素、または１個または２個の複素原子を有する５〜８員の環状基を含む。

【0052】

［０５６］第１の中間体またはエーテル結合中間体は、固相核酸合成と適合する好適な第２の中間体を調製するためにさらに反応させる。例えば、エーテル結合中間体は、ポリヌクレオチド合成に際してリン酸エステルに変換するためのホスホロアミダイト中間体（例えばエーテル結合を介する）を調製するように１つまたは複数の工程を介してさらに反応させてもよい。あるいは、またはさらに、エーテル結合中間体は、好適な支持体に（アミド化などにより）結合させてポリヌクレオチド鎖の３’末端を形成するための好適な末端基を調製するように１つまたは複数の工程を介してさらに反応させてもよい。

【0053】

５’および３’接合体を調製するための例示的な反応を図２に示す。

【0054】

［０５７］ホスホロアミダイト中間体（図２の６として示される）の調製を伴うある種の実施態様において、エーテル結合中間体（２）の末端アルコールを、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトなどのホスファイト化剤との反応によってホスホロアミダイトを調製するようにさらに反応させる。これらの実施態様は、特に、トリチルでのモニタリングまたは追加のアミダイト結合が必要ない場合に用いることができる。

【0055】

［０５８］あるいは、ホスホロアミダイトを調製するための好適なヒドロキシルを有する他の中間体は、（２）から合成することができる。例えば、化合物（２）を、少なくとも１個の炭素、好ましくは２個以上の炭素によって隔てられている２個の異なるヒドロキシル基を形成するように反応させてもよい。化合物（２）を異なるヒドロキシルを有する化合物（５）に変換するための例示的な一連の反応を図２に示す。コレステロールを塩化トシルと反応することによって形成されるコレステロールトシレート（１）が、還流１，４−ジオキサン中での１，６−ヘキサンジオールとのＳｎ１反応を受ける。５位でのアルケンによる隣接基の関与によって、３β異性体のみが得られる。得られた（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキサン−６−オール（２）をメシレート（３）に変換し、続けて、これを用いて、ソルケタル（solketal）をアルキル化する。湿ＴＨＦ中でトリフルオロ酢酸処理することによって、粗製のソルケタル誘導体を脱保護して、３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−１，２−ジオール（４）が得られる。標準的な方法を用いて、ジオールの第１級アルコールを４，４’−ジメトキシトリチルエーテル（５）として選択的に保護する。残りの第２級アルコールを２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトなどのホスファイト化剤と反応させることによってホスホロアミダイト（６）に変換し、続いて、オリゴヌクレオチド合成サイクルにおいて標準のアミダイトモノマーとして使用することができる。あるいは、第２級アルコールは、ＴＥＡ存在下で無水コハク酸処理することにより、コハク酸エステル（７）に変換することができる。次いで、得られたカルボキシレートを、ＨＢＴＵにより、過剰のアミンで官能化された制御多孔質ガラス（ＣＰＧ（controlled pore glass））に結合する。ＣＰＧの過剰のアミンおよび任意の遊離表面水酸化物は、酢酸無水物で「キャッピング（capping）」することによって非反応性となる。コレステロール官能化ＣＰＧは、３’−コレステロールで修飾されたオリゴヌクレオチド合成に好適である。ＣＰＧは、任意の標準ヌクレオシド充填ＣＰＧが自動オリゴヌクレオチド合成で用いられるようにして使用することができる。

【0056】

［０５９］したがって、これらの実施態様において、第２の中間体は、少なくとも１個の２級アルコールおよび少なくとも１個の第１級アルコールを有する化合物から調製される。これらの実施態様によれば、ポリヌクレオチド合成に際して、１個のヒドロキシル基が、鎖の５’末端でヌクレオチドとホスホジエステル結合を形成する。５’接合体の場合、２個のヒドロキシル基により、自動合成装置上での反応についておよび／または所望する場合にはさらにコレステロール接合体を通過する鎖伸長についてのトリチルによるモニタリングが可能となる。

【0057】

［０６０］固体支持体に結合するための第２の中間体（図２の７として示される）の調製を伴うある種の実施態様において、エーテル結合中間体（２）のアルコールをいくつかの工程で反応させて、コハク酸エステル中間体（または固体支持体から開裂可能な他の中間体）を調製する。３’接合体を調製するための中間体は、上記の通り、好ましくは異なる、２個のヒドロキシル基を有することが好ましい。例えば、固体支持体に結合するための中間体は、少なくとも１個の第２級ヒドロキシルおよび少なくとも１個の第１級ヒドロキシルを有する化合物から調製することができる。化合物２を異なるヒドロキシルを有する化合物（５）に変換するための例示的な一連の反応は、図２に示されている。これらの実施態様において、ポリヌクレオチド合成に際して、ヌクレオチド鎖は、ＤＭＴｒで保護された第１級アルコールを伸長除去し、接合体部分は、第２級ヒドロキシル基（例えばコハク酸エステル）上のある種の開裂可能な結合を介して固体支持体に固着される。

【0058】

［０６１］本発明の代替の実施態様は、オリゴヌクレオチド合成の完了後、エーテル結合中間体（２）の誘導体を付加することを含む。図４を参照のこと。これは、カルボニル付加−脱離／還元アミノ化、アミド化、マレイミド−チオールカップリング、水性ディールス・アルダー、および「クリック」ケミストリーなどの反応により達成することができる。これらの方法により、コレステロールアミダイトを合成する必要なしに、同等のコレステロールエーテル構築物が提供される。例えば、化合物（２）などのコレスト−５−エン−３β−オキシアルカノールは、当業者によって容易に修飾され、末端アルデヒド、カルボキシレート、アミン、マレイミド、チオール、ジエン、アジド、アルキン、または他の反応性部分を得ることができる。これらの化合物は、末端官能化されたコレスト−５−エン−３β−オキシアルカンの反応性部分と共有結合を形成する相補的な官能基で好適に修飾されたオリゴヌクレオチドとさらに反応させることができる。生成物は、比較的非極性かつ実質的に直鎖状の、コレステロール部分とのアルキルオキシ結合を保持し、かつ、親油性部分および交換可能なプロトンまたは他の実質的に極性の官能基を含む任意の基の間で３原子以上の距離を維持する、コレステロール接合体である。これらのいわゆる「合成後バイオコンジュゲーション」は、保護された合成オリゴヌクレオチド鎖が固相にまだ結合している間に、または合成オリゴヌクレオチドが溶液中にある場合には脱保護後に実施することができる。

【0059】

［０６２］バイオコンジュゲーション技法は周知であり、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ＧＴ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００８年４月１日）などに記載されている。

【実施例】

【0060】

［０６３］核酸（ＮＡ）−Ｃｈｏｌ接合体が、アミンと容易に入手可能なコレステロールクロロホルメートとを反応させてコレステン環構造の３β位でカルバメート結合を得ることにより得られている。この系では、交換可能な水素を有する極性基が親油性環構造に非常に近くに位置している。このことは、接合体の親油性、および任意の脂質二重層に十分に介在するまたは他の親油性部分と結合する接合体の能力を制限することになり得る。図１を参照のこと。本明細書に記載の接合体では、交換可能なプロトンを有する極性基がコレステン環構造に隣接して位置するリンカー基の使用が避けられている（図１）。

【0061】

実施例１：例示的な接合体の合成
［０６４］Ｃｈｏｌ−Ｏ−ＨＥＸ−ＯＨ（図２の２に示される）などのエーテル結合コレステロールを用いて、ＮＡ接合体を作製することができる。図２は、リンカーアミダイト６、およびコハク酸エステル７（本明細書では「Ｃ６−Ｃｈｏｌ」と称する）の合成を示している。それらは、それぞれ、通常入手可能な合成試薬を用いて作られた一般的な化学合成オリゴヌクレオチドの５’修飾（化合物６）として、およびオリゴヌクレオチド合成に用いられる任意の市販のアミノ支持体にアミド化によって接合体される場合には３’修飾（化合物７）として用いることができる。あるいは、例えばトリチルによるモニタリングまたは追加のアミダイト結合の必要がない場合、５’末端で接合されるオリゴヌクレオチドのため、２などのアルコールからアミダイトを調製することができる。

【0062】

［０６５］一般に、炭化水素スペーサーは、リン酸エステルを形成するためにヒドロキシル基を末端にまたは末端近くに含む。少なくとも１個の炭素、好ましくは２個以上の炭素によって隔てられた２個のヒドロキシル基があることが好ましい。例えば、一方が第２級アルコールであり、他方が第１級アルコールである場合、ヒドロキシルは異なっていてもよい。少なくとも１個のヒドロキシル基が、鎖の５’末端でヌクレオチドとのホスホジエステル結合を形成する必要がある。５’−コレステロール接合体の場合、２個のヒドロキシル基があることにより、自動合成装置上での反応についておよび／またはコレステロール接合体を過ぎたさらなる鎖の伸長についてトリチルによるモニタリングが可能となる。４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）は、例えば、１個のヒドロキシルおよびホスホロアミダイト（すなわちホスホジエステル前駆体）上に位置するか、あるいはより効率的なホスホロアミダイト結合を提供するであろう残りのヒドロキシル上にある。

【0063】

［０６６］３’−コレステロール接合体は、異なることが好ましい（すなわち一方が第２級であり、一方が第１級である）２個のヒドロキシル基を必要とし、ここで、ヌクレオチド鎖は、ＤＭＴｒで保護された第１級アルコールを伸長除去し（grow off）、接合体部分は、第２級ヒドロキシル基上のある種の開裂可能な結合を介して固体支持体に固着されるであろう。５’−接合体は、第２級の位置にホスフェートを有するであろう。

【0064】

［０６７］固相ポリヌクレオチド合成での接合のためのＣｈｏｌ−Ｏ−Ｈｅｘ中間体の例示的な合成を以下に記載する。

【0065】

コレスト−５−エン−３β−トシレート
［０６８］コレステロール（２５．Ｏｇ，６４．７ｍｍｏｌ）を定量して５００ｍＬ丸底フラスコに入れ、ピリジン（２００ｍＬ）に溶解して、無色の溶液を得て、これを０℃に冷却する。塩化トシル（２４．６５ｇ，１２９ｍｍｏｌ）を定量して１００ｍＬ丸底フラスコに入れ、ピリジン（４０ｍＬ）に溶解し、淡黄色の溶液を得る。次いで、塩化トシル溶液を攪拌したコレステロール溶液に一度に添加し、得られた反応混合物を一晩攪拌し、その間に室温となる。反応混合物を回転エバポレーターで濃縮し、白色の固体を得て、これを最小量のクロロホルム（４０ｍｌ）に溶解し、メタノール（５００ｍＬ）を添加することによって沈殿させる。得られた白色の固体をろ過し、メタノール（５００ｍＬ）およびアセトニトリル（２００ｍＬ）で洗浄する。固体を１Ｌ丸底フラスコに移し、高真空下で一晩乾燥し、白色粉末３４．２ｇ（９８％）を得る。^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ３）：δ０．６７（３Ｈ，ｓ）；０．８０−１．７５（３３Ｈ，ｍ）；１．７６−２．０３（５Ｈ，ｍ）；２．２０−２．３０（１Ｈ，ｍ）；２．４４（４Ｈ，ｍ）；４．２５−４．３５（１Ｈ，ｍ）；５．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ）；７．３２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）；７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）。

【0066】

コレスト−５−エン−３β−オキシヘキサン−６−オール
［０６９］コレスト−５−エン−３β−トシレート（１５．Ｏｇ，２７．７ｍｍｏｌ）および１，６−ヘキサンジオール（６５．５ｇ，５５５ｍｍｏｌ）を定量して５００ｍＬ丸底フラスコに入れ、１，４−ジオキサン（３００ｍＬ）に溶解し、無色の懸濁液を得る。フラスコに効率的な還流コンデンサーを取り付け、反応混合物を１１０℃油浴中で１７時間加熱還流する。反応混合物を真空で濃縮し、残渣を脱イオン水（５００ｍＬ）に懸濁する。水相をＥｔＯＡｃ（２ｘ１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を水（２ｘ３００ｍＬ）および食塩水（１ｘ１５０ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮し、高真空下で一晩乾燥し、淡黄色のワックス１２．８５ｇ（９５％）を得る。^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）：δ０．６７（３Ｈ，ｓ）；０．８０−１．６５（４２Ｈ，ｍ）；１．７５−２．０５（５Ｈ，ｍ）；２．１２−２．２５（１Ｈ，ｍ）；２．３０−２．４０（１Ｈ，ｍ）；３．０５−３．１７（１Ｈ_１ｍ）；３．４５（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．５，１．６Ｈｚ）；３．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）。

【0067】

コレスト−５−エン−３β−オキシヘキサン−６−メシレート
［０７０］コレスト−５−エン−３β−オキシヘキサン−６−オール（１２．８４ｇ，２６．４ｍｍｏｌ）を定量して、５００ｍＬ丸底フラスコに入れる。フラスコにジクロロメタン（１００ｍＬ）およびトリエチルアミン（７．３５ｍＬ，５２．７ｍｍｏｌ）を充填し、アルゴンでフラッシングし、０℃に冷却する。塩化メシル（２．５５ｍＬ，３２．９６ｍｍｏｌ）を攪拌溶液に５分間にわたって滴下して添加し、混合物をさらに１時間０℃で攪拌する。飽和重炭酸ナトリウム溶液（１５０ｍＬ）を混合物に添加し、次いで、これを分液漏斗に移す。水性相を捨て、有機相をフレッシュな飽和重炭酸ナトリウム溶液（１ｘ１５０ｍＬ）および食塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮乾燥し、黄色のワックス１４．８ｇ（９９％）を得る。^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）：δ０．６７（３Ｈ，ｓ）；０．８０−１．６５（４１Ｈ，ｍ）；１．７０−２．０５（５Ｈ，ｍ）；２．１２−２．２３（１Ｈ，ｍ）；２．３０−２．３７（１Ｈ，ｍ）；３．００（３Ｈ，ｓ）；３．０５−３．１７（１Ｈ，ｍ）；３．４５（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．５，１．４Ｈｚ）；４．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）。

【0068】

３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−１，２−ジオール
［０７１］ソルケタル（２．９２ｇ，２７．５ｍｍｏｌ）を定量し、２００ｍＬ丸底フラスコに入れた。アルゴンでフラッシングし、トルエン（４０ｍＬ）を充填した。水素化ナトリウム（油中６０％分散液）（３．１４ｇ，１３１ｍｍｏｌ）を攪拌溶液に一度に添加し、混合物を室温で３０分間攪拌した。コレスト−５−エン−３β−オキシヘキサン−６−メシレート（１４．８ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）をトルエン（４０ｍＬ）に溶解し、溶液をアルコキシド溶液にゆっくりと添加した。フラスコを還流コンデンサーに取り付け、器具をアルゴンでフラッシングした。反応混合物を加熱還流し、１７時間攪拌した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル中のエタノール溶液でクエンチし、１５分間にわたって激しく攪拌した反応混合物に滴下して添加した。反応混合物をさらに酢酸エチルで希釈し、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。

【0069】

［０７２］残渣を比率が４：４：１のテトラヒドロフラン：トリフルオロ酢酸：水（１８ｍＬ）に再び溶解し、次いで、２時間室温で攪するように設定した。反応混合物のＴＬＣ（１５％アセトン／ヘキサン）によって、粗製混合物中の所望の化合物の脱保護が完了したことが示された。反応混合物を蒸発乾燥し、１００ｇのＢｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰ シリカカラムに適用し、酢酸エチル／ヘキサン勾配（０〜３５％、２Ｌ、約５０ｍＬ／分）で溶出し、無色のワックス４．９０ｇ（２工程で３３％）を得た。

【0070】

．^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）：δ０．６７（３Ｈ，ｓ）；０．８０−１．６５（４１Ｈ，ｍ）；１．７５−２．０５（５Ｈ，ｍ）；２．１２−２．４０（４Ｈ，ｍ）；３．０７−３．１７（１Ｈ，ｍ）；３．４０−３．５７（６Ｈ，ｍ）；３．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．４，５．２）；３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．４，３．９）；３．８１−３．８９（１Ｈ，ｍ）；５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）。

【0071】

１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−２−オール
［０７３］３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−１，２−ジオール（４．７５ｇ，８．４７ｍｍｏｌ）を定量して、攪拌棒を備えた２００ｍＬ丸底フラスコに入れた。フラスコをアルゴンでフラッシングし、ピリジン（３０ｍＬ）を充填し、攪拌しながら０℃に冷却した。ＤＭＴｒ−ＣＩ（３．０１ｇ，８．８９ｍｍｏｌ）を定量して２０ｍＬシンチレーションバイアルに入れ、ピリジン（１７ｍＬ）に溶解した。ＤＭＴｒ−ＣＩ溶液を２０分間にわたって攪拌ジオール溶液に滴下して添加した。反応物を一晩攪拌し、その間に室温となる。反応物を無水メタノール（１ｍＬ）を添加することによってクエンチし、反応物を３０分間攪拌した。飽和重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍＬ）を反応混合物に添加し、ＣＯ_２の発生が終わるまでこれを攪拌した。混合物を濃縮乾燥し、水（１００ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）で分配した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を１００ｇ Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰカラムに適用し、酢酸エチル／ヘキサン勾配で溶出して（１０〜２０％、１．５Ｌ、約５０ｍＬ／分）、無色の粘性な油分５０ｇ（４７．９％）を得た。^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）：δ０．６７（３Ｈ，ｓ）；０．８７（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，１．８Ｈｚ）；０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；０．９３−１．６０（３２Ｈ，ｍ）；１．７５−２．０５（５Ｈ，ｍ）；２．１５−２．２５（１Ｈ，ｍ）；２．３２−２．４１（１Ｈ，ｍ）；２．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ）；３．０７−３．２２（２Ｈ，ｍ）；３．３９−３．５７（６Ｈ，ｍ）；３．７９（６Ｈ，ｓ）；３．８０（ｓ，１Ｈ）；３．９０−３．９８（１Ｈ，ｍ）；５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；６．７８−６．８５（ｍ，４Ｈ）；７．１４−７．２５（ｍ，１Ｈ）；７．２６−７．３４（ｍ，６Ｈ）；７．４０−７．４４（ｍ，２Ｈ）。

【0072】

４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸，ＴＥＡ塩
［０７４］１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−２−オール（１．７５ｇ，２．０２ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（０．８１２ｇ，８．１０ｍｍｏｌ）、および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を攪拌棒を備えた１００ｍＬ丸底フラスコ添加した。フラスコにピリジン（１０ｍＬ）を充填した。反応混合物を８０℃で８時間および５０℃で１６時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮し、ＥｔＯＨ（３ｘ２０ｍＬ）とともに共蒸発し、残留ピリジンを除去した。残渣を５０ｇ Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰカラムに適用し、１Ｌの６０／３０／１０ ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ／ＭｅＯＨ（３％ＴＥＡを含む）、続いて５００ｍｌの９０／１０ ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（３％ＴＥＡを含む）を用いて約４０ｍＬ／分で溶出し、無色のワックス１．３１ｇ（６１％）を得た。^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）：δ０．６７（３Ｈ_１ｓ）；０．８６（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，１．８Ｈｚ）；０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；０．９３−１．６０（４１Ｈ，ｍ）；１．７５−２．０５（５Ｈ，ｍ）；２．１５−２．２５（１Ｈ，ｍ）；２．３２−２．４１（１Ｈ，ｍ）；２．５１−２．７２（４Ｈ，ｍ）；２．９７（６Ｈ_１ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）；３．０７−３．２５（２Ｈ，ｍ）；３．３１−３．４８（４Ｈ_１ｍ）；３．５２−３．６１（２Ｈ_１ｍ）；３．７８（６Ｈ_１ｓ）；５．１９（１Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ）；６．７８−６．８５（ｍ，４Ｈ）；７．１４−７．２５（ｍ，１Ｈ）；７．２６−７．３４（ｍ，６Ｈ）；７．４０−７．４４（ｍ，２Ｈ）。

【0073】

「Ｃｈｏｌ−Ｏ−Ｈｅｘ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ」
［０７５］４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸，ＴＥＡ塩（１．００ｇ，０．９５２ｍｍｏｌ）を定量して、２０ｍＬシンチレーションバイアルに入れる。バイアルに２：１ ＡＣＮ：ＤＣＭ ６ｍｌを充填する。ＨＢＴＵ（０．３４３ｇ，０．９０４ｍｍｏｌ）をコハク酸エステル、続いてトリエチルアミン（０．２５ｍＬ）を添加する。２００ｍｌ丸底フラスコにＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１２．５６ｇ）を定量して入れ、１３２μｍｏｌ／ｇのアミンを充填する。ＣＰＧを２：１ ＡＣＮ：ＤＣＭ ７５ｍＬに懸濁する。コハク酸エステル／ＨＢＴＵ混合物をＬＣＡＡ−ＣＰＧ懸濁液に一度に添加し、フラスコを密封し、混合物を合わせ、インキュベートしたオービタルシェーカー上で２５℃、２５０ｒｐｍで４時間攪拌する。ＣＰＧをろ過し、ＡＣＮ、ＤＣＭ、ＤＭＦ、水、メタノール、ＡＣＮ、およびＤＣＭの２００ｍＬアリコートで洗浄する。ＣＰＧを一晩空気乾燥する。次いで、ＣＰＧを清浄な２００ｍＬ丸底フラスコに移す。フラスコをＣＡＰ Ａ溶液４０ｍＬおよびＣＡＰ Ｂ溶液４０ｍＬを充填し、隔壁密封し（septum sealed）、内容物を２５℃、２５０ｒｐｍで３時間攪拌する。次いで、ＣＰＧをろ過し、ＡＣＮ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ、Ｈ_２Ｏ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＡＣＮ、ＤＣＭの２００ｍＬアリコートで十分に洗浄する。ＣＰＧを一晩空気乾燥する。

【0074】

［０７６］ＣＰＧローディング（loading）をＰｏｎ，ＲＴ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００ ３．２．１−３．２．２３によって記述された方法の改良によって測定した。ＣＰＧ（４．２４ｍｇ）を定量して２０ｍＬシンチレーションバイアルに入れた。ジクロロエタン中の５％トリフルオロ酢酸を添加し、バイアルをキャップし、１分間振とうした。溶液の吸光度をＴｈｅｒｍｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｓｙｓ１０ ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計により５０３ｎｍで測定したところ、２．１１４であった。ローディングは次式によって計算した。

【0075】

［０７７］［（体積（ｍＬ）ｘ吸光度）／７６ｍＬｃｍ^−１μｍｏｌ^１］ｘ［１０００／質量（ｍｇ）］＝ローディング（μｍｏｌ／ｇ）：
［（１０ｍＬｘ２．１１４）／７６ｍＬｃｍ^−１μｍｏｌ^１］ｘ［１０００／４．２４ｍｇ］＝６６μｍｏｌ／ｇ
「Ｃｈｏｌ−Ｏ−Ｈｅｘ−ＤＭＴｒアミダイト」
［０７８］１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−（６−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ヘキシルオキシ）プロパン−２−オール（１．６８ｇ，１．９５ｍｍｏｌ）を定量して、攪拌棒を備えた２００ｍＬ丸底フラスコに入れる。フラスコをアルゴンでフラッシングし、隔壁密封し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６８ｍＬ，３．８９ｍｍｏｌ）を充填する。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．４８ｇ，２．０ｍｍｏｌ）を攪拌した反応物に滴下して添加し、反応物を１７時間攪拌する。反応混合物をＤＣＭ５０ｍLで希釈し、飽和重炭酸溶液（２ｘ５０ｍＬ）および食塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮する。残渣を２５ｇ Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰカラムに適用し、酢酸エチル／ヘキサン勾配（５〜１０％、７５０ｍＬ、２５ｍＬ／分）で溶出し、白色のフォーム１．７０ｇ（８２．１％）を得る。^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．６２（３Ｈ，ｓ）；０．８０−１．５７（５３Ｈ，ｍ）；１．７０−１．９５（５Ｈ，ｍ）；１．９６−２．０２（１Ｈ，ｍ）；２．２１−２．２６（１Ｈ，ｍ）；２．５７−２．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ）；２．９７−３．８０（ｍ，２０Ｈ）；３．９７（１Ｈ，ｑｕｉｎｔｕｐｌｅｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ）；６．７８−６．８６（ｍ，４Ｈ）；７．１３−７．２９（ｍ，７Ｈ）；７．３４−７．３９（ｍ，２Ｈ）。

【0076】

実施例２：１−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ））−１２−（コレスト−５−エン−３−オキシ）ドデカン−３−オール官能化ＣＰＧの合成
［０７９］図３は、ポリヌクレオチド３’修飾として使用することができる本明細書に記載されたリンカー構造（ＩＩＩ）の合成を表す。合成の工程をより詳細に以下に記載する。

【0077】

１０−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）デカン−１−オール
［０８０］５００ｍＬ丸底フラスコ中で、コレステリルトシレート（１０．０ｇ，１８．５ｍｍｏｌ）および１，１０−デカンジオール（４８．３ｇ，２７７ｍｍｏｌ）をジオキサン（２００ｍｌ）に懸濁し、白色の懸濁液を得た。フラスコに温度センサーおよび還流コンデンサーを取り付けた。混合物を加熱還流し、一晩攪拌還流した。反応混合物を室温に冷却し、固体をろ過して除いた。溶液を真空で濃縮した。混合物をメタノール（２５０ｍＬ）中で再び溶解し、水（約４０ｍＬ）を添加し、粗製の生成物を沈殿させた。沈殿物をろ過し、真空で乾燥した。残渣を１００ｇ Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰカラムでのカラムクロマトグラフィーを用いて０〜２５％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配（２Ｌ）で溶出してさらに精製した。純粋な分画を合わせ、濃縮し、白色の固体７．８５ｇ（８２％）を得た。^１ＨＮＭＲ（３００ｍＨｚ，ＣＤＣＩ_３）δ０．６９（３Ｈ，ｓ）；０．８５−１．６６（５ＯＨ，ｍ）；１．７５−２．０９（５Ｈ，ｍ）；２．１４−２．２９（１Ｈ，ｍ）；２．３２−２．４３（１Ｈ，ｍ）；３．１４（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．２，４．４Ｈｚ）；３．４６（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．９，０．４Ｈｚ）；３．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）。

【0078】

１０−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）デカナール
［０８１］１００ｍＬ丸底フラスコ中で、固体支持された２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ、フリーラジカル（０．５ｇ，１．１ｍｍｏｌ／ｇ，０．５５３ｍｍｏｌ）および１０−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）デカン−１−オール（３．００ｇ，５．５３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍｌ）に懸濁し、無色の懸濁液を得た。二酢酸ヨードベンゼン（（１．９５８ｇ，６．０８ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、これを室温で一晩攪拌した。反応混合物をろ過し、固体支持体をＤＣＭで洗浄した。ろ液を合わせ、飽和チオ硫酸ナトリウム（２ｘ２０ｍＬ）および食塩水（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた油分を、移動相として１００％ＤＣＭを用いて、カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、無色のワックス２．７Ｏｇ（９０％）を得た。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）δ０．６９（３Ｈ，ｓ）；０．８４−１．７４（４７Ｈ，ｍ）；１．７６−２．０９（５Ｈ，ｍ）；２．１２−２．２６（１Ｈ，ｍ）；２．３２−２．４０（１Ｈ，ｍ）；２．４４（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．４，１．９Ｈｚ）；３．１４（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．２，４．４Ｈｚ）；３．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；９．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）。

【0079】

１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）−３−ヒドロキシドデカナール
［０８２］乾燥２００ｍＬ丸底フラスコ中に、１０−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）デカナール（２．６５ｇ，４．９０ｍｍｏｌ）をアルゴン下でＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解し、無色の溶液を得た。（（１，３−ジオキソラン−２−イル）メチル）マグネシウムブロミド（９．８０ｍｌ，４．９０ｍｍｏｌ）の０．５Ｍ ＴＨＦ溶液を滴下して添加し、得られた溶液を４時間室温で攪拌した。得られた溶液を、ＮａＨＣＯ_３溶液１０ＯｍＬをゆっくりと添加することによってクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を食塩水（１ｘ１０ＯｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、５００ｍＬ丸底フラスコ中で濃縮した。オルトぎ酸トリメチル（１０．８３ｍｌ，９８ｍｍｏｌ）、ＰＰＴＳ（０．２４６ｇ，０．９８０ｍｍｏｌ）、およびメタノール（１０ｍｌ）をフラスコに添加し、内容物を２時間還流した。溶液を室温に冷却し、蒸発乾燥させた。次いで、残渣をアセトン（２０ｍｌ）および１．０Ｎ 塩酸（４．９０ｍｌ，４．９０ｍｍｏｌ）に溶解し、一晩攪拌した。反応混合物を水で２００ｍＬに希釈し、酢酸エチル（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、食塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られたワックスを、４０ｇ Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰカラムでのカラムクロマトグラフィーを用いて０〜５０％勾配（１Ｌ）で溶出して精製した。純粋な分画を合わせ、蒸発乾燥し、１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）−３−ヒドロキシドデカナール（１．９７ｇ，３．３７ｍｍｏｌ，６８．７％収率）を無色のワックスとして得た。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）δ０．６９（３Ｈ，ｓ）；０．８５−１．７４（４９Ｈ，ｍ）；１．７５−２．１３（７Ｈ，ｍ）；２．１４−２．２８（１Ｈ，ｍ）；２．３３−２．４４（１Ｈ，ｍ）；３．１４（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．２，４．４Ｈｚ）；３．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；３．９３−４．１０（１Ｈ，ｍ）；５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；５．４２−５．５５（１Ｈ，ｍ）；９．７８（１Ｈ，ｓ）。

【0080】

１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−１，３−ジオール
［０８３］１００ｍＬ丸底フラスコ中で、１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）−３−ヒドロキシドデカナール（１．９０ｇ，３．２５ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１０ｍｌ）に溶解し、無色の溶液を得た。ＭｅＯＨ（５ｍｌ）をゆっくりと十分に添加し、十分なだけ添加し、溶液中でアルデヒドを保持した。ホウ化水素ナトリウム（０．１８４ｇ，４．８７ｍｍｏｌ）を攪拌溶液に添加し、次いで、これを２時間室温で攪拌した。反応混合物を１Ｎ ＨＣＩ（２ｍＬ）を添加することによってクエンチした。混合物を水で１００ｍＬに希釈し、酢酸エチル（３ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、食塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−１，３−ジオール（１．８５ｇ，３．１５ｍｍｏｌ，収率９７％）を無色のワックスとして得た。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）δ０．６９（３Ｈ，ｓ）；０．８３−２．０７（５８Ｈ，ｍ）；２．１３−２．２８（１Ｈ，ｍ）；２．３２−２．４３（１Ｈ，ｍ）；３．１４（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．２，４．４Ｈｚ）；３．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；３．６０−４．１９（３Ｈ，ｍ）；５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）。

【0081】

１−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ））−１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−３−オール
［０８４］１００ｍＬ丸底フラスコ中で、１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−１，３−ジオール（１．８０ｇ，３．０７ｍｍｏｌ）をピリジン（２０ｍｌ）に溶解し、無色の溶液を得た。混合物を攪拌しながらアルゴン下で０℃に冷却した。ＤＭＴｒ−ＣＩ（１．０９１ｇ，３．２２ｍｍｏｌ）を定量して隔壁密封したシンチレーションバイアルに入れ、ピリジン（１０ｍｌ）に溶解し、黄色の溶液を得た。ＤＭＴｒ−ＣＩ溶液をジオールに滴下して添加した。反応混合物を一晩攪拌し、その間に室温になった。メタノール（２ｍＬ）を添加し、混合物をさらに１５分間攪拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で２００ｍＬに希釈し、酢酸エチル（３ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、食塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られたオイルを、４０ｇ Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰカラムを用いて０〜５０％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配（１Ｌ）で溶出して精製した。純粋な分画を合わせ、蒸発し、１−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ））−１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−３−オール（２．６０ｇ，２．９２ｍｍｏｌ，９５％収率）を無色のオイルとして得た。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）δ０．６９（３Ｈ，ｓ）；０．８３−２．０９（５７Ｈ，ｍ）；２．１４−２．２９（１Ｈ，ｍ）；２．３３−２．４４（１Ｈ，ｍ）；３．０７−３．２２（３Ｈ，ｍ）；３．４７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；３．５３−３．６６（１Ｈ，ｍ）；３．８１（６Ｈ，ｓ）；５．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；６．８０−６．８８（４Ｈ，ｍ），７．２０−７．３５（７Ｈ，ｍ）；７．４０−７．４９（２Ｈ，ｍ）。

【0082】

４−（（１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−３−イル）オキシ）−４−オキソブタン酸
［０８５］２０ｍＬシンチレーションバイアル中で、１−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ））−１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−３−オール（０．５ｇ，０．５６２ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（０．１１３ｇ，１．１２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶解し、無色の溶液を得た。ＴＥＡ（０．３１３ｍｌ，２．２４９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１７時間攪拌するように設定した。ＴＬＣ（２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，ＰＭＡ目視）によって、反応が完了したことを判断した。反応混合物を５％ ＮａＨＰＯ_４溶液（３ｘ１５ｍＬ）および食塩水（１ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、乾燥濃縮し、さらに精製せずに使用した。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ_３）δ０．７０（３Ｈ，ｓ）；０．８３−１．７４（４９Ｈ，ｍ）；１．７７−２．１２（５Ｈ_１ｍ）；２．１４−２．２９（１Ｈ，ｍ）；２．３３−２．４４（１Ｈ，ｍ）；２．５３−２．７２（４Ｈ，ｍ）；３．００−３．０９（２Ｈ，ｍ）；３．１６（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１１．２，４．４Ｈｚ）；３．４８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；３．８０（６Ｈ，ｓ）；４．８５−５．００（１Ｈ，ｍ）；５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；６．７８−６．９０（４Ｈ，ｍ），７．１５−７．３８（７Ｈ，ｍ）；７．４０−７．４９（２Ｈ，ｍ）；９．２９（１Ｈ，ｂｓ）。

【0083】

１−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ））−１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−３−オール官能化ＣＰＧ
［０８６］４−（（１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１２−（コレスト−５−エン−３β−オキシ）ドデカン−３−イル）オキシ）−４−オキソブタン酸（０．３５ｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を定量して、２０ｍＬシンチレーションバイアルに入れる。バイアルに２：１ ＡＣＮ：ＤＣＭ ６ｍＬを充填する。ＨＢＴＵ（０．１３７ｇ，０．３５ｍｍｏｌ）をコハク酸エステルに添加し、続いてトリエチルアミン（０．２５ｍＬ）に添加する。１００ｍＬ丸底フラスコに、定量したＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５．００ｇ）を１３２μｍｏｌ／ｇアミンのローディングとももに入れる。ＣＰＧを２：１ ＡＣＮ：ＤＣＭ ３０ｍＬに懸濁する。コハク酸エステル／ＨＢＴＵ混合物をＬＣＡＡ−ＣＰＧ懸濁液に一度に添加し、フラスコを密封し、合わせた混合物をインキュベートしたオービタルシェーカー上で２５℃、２５０ｒｐｍで４時間攪拌する。ＣＰＧをろ過し、ＡＣＮ、ＤＣＭ、ＤＭＦ、水、メタノール、ＡＣＮ、およびＤＣＭの２００ｍＬアリコートで洗浄する。ＣＰＧを一晩空気乾燥する。次いで、ＣＰＧを清浄な２００ｍＬ丸底フラスコ移す。フラスコを、ＣＡＰ Ａ溶液４０ｍＬおよびＣＡＰ Ｂ溶液４０ｍＬで充填し、隔壁密封し、内容物を２５℃、２５０ｒｐｍで３時間攪拌する。次いで、ＣＰＧをろ過し、ＡＣＮ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ、Ｈ_２Ｏ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＡＣＮ、ＤＣＭの２００ｍＬアリコートで十分に洗浄する。ＣＰＧを一晩空気乾燥する。

【0084】

［０８７］ＣＰＧローディングをＰｏｎ，ＲＴ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００ ３．２．１−３．２．２３によって記述された方法の改良によって測定した。ＣＰＧ（４．２４ｍｇ）を定量して２０ｍＬシンチレーションバイアル中に入れた。ジクロロエタン中の５％トリフルオロ酢酸を添加し、バイアルをキャップし、１分間振とうした。溶液の吸光度をＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｓｙｓ１０ ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計により５０３ｎｍで測定したところ、２．１１４であった。ローディングは次式によって計算した。

【0085】

［（体積（ｍＬ）ｘ吸光度）／７６ｍＬｃｍ^−１μｍｏｌ^１］ｘ［１０００／質量（ｍｇ）］＝ローディング（μｍｏｌ／ｇ）：
［（１０ｍＬｘ２．２６０）／７６ｍＬｃｍ^−１μｍｏｌ^１］ｘ［１０００／５．１２ｍｇ］＝５８μｍｏｌ／ｇ
実施例３：コレステロールの合成後付加
［０８８］カルボニル付加−脱離／還元アミノ化、アミド化、マレイミド−チオールカップリング、水性ディールス・アルダー、および「クリック」などの反応によるコレステロールの合成後付加によって、コレステロールアミダイトを合成する必要なく、同等のコレステロールエーテル構築物が提供される。例えば、コレステロールトシレートをアルキル化して、コレスト−５−エン−３β−オキシアルカノールを得て、これをさらに修飾することで、末端アルデヒド、カルボキシレート、アミン、マレイミド、チオール、ジエン、アジド、アルキン、または他の反応性部分を得て、これをさらに好適に修飾されたオリゴヌクレオチドと反応させることで、実質的に非極性で実質的に直鎖状の、コレステロール部分とのアルキルオキシ結合を保持し、かつ、親油性部分および交換可能なプロトンまたは他の実質的に極性の官能基を含む任意の基の間で３原子以上の距離を維持する、コレステロール接合体を得ることができる。図４を参照のこと。

【0086】

［０８９］オリゴヌクレオチドを相補的な官能基で官能化する場合、コレスト−５−エン−３−オキシアルカノール（Ａ）を修飾して、典型的なバイオコンジュゲーション技法、例えば、アミド化（Ｂ）、ディールス・アルダーバイオコンジュゲーション（Ｃ）、および「クリック」バイオコンジュゲーション（Ｄ）を容易に行うことができる官能基を得ることができる。

【0087】

実施例４：ｍｉＲ−２０８のｉｎ ｖｉｖｏ心臓ノックダウン
［０９０］表２に示されるすべての化学物質について、２ｘ８０ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ配列またはミスマッチ（図５および図６の「ｍｍ」）配列のいずれかを、これらの化学物質を生理食塩水に溶解して用いて、および、コントロールとして生理食塩水のみ（図５および図６の「ｓａｌ」）を用いて（表２）、４匹の成体雄Ｃ５７ＢＩ６マウスに尾の静脈より注入した。表２中のリンカー１は、本明細書に記載するリンカー構造（Ｘｌ）および（ＸＩＩＩ）に対応する。表２中のリンカー２は、本明細書に記載するリンカー構造（Ｘ）および（ＸＩＩ）に対応する。比較のため、構造（ＸＩＶ）のリンカーをコントロールとして用いる。

【化7】

【0088】

［０９１］さらに、ホスホロチオエート（ＰＳ）とは、５’末端の最後の２つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であり、３’末端の最初の５つのヌクレオチド間リン酸結合がホスホロチオエート結合（コレステロールリンカーとオリゴヌクレオチドとの間のリン酸結合を含む）である置換様式をいう。

【表2】

【0089】

［０９２］最後に注入してから３日後、動物を犠牲死させて、心臓、肝臓、肺、および腎を回収した。ＲＮＡを心臓組織から取り出し、ノーザンブロット分析によってｍｉＲ−２０８の心臓発現に対する効果を決定し（図５）、リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−２０８を定量した（図６）。これらのデータから、アンタゴｍｉｒ設計を用いた効率的な心臓ノックダウンが再確認される。しかしながら、コレステロールまたはホスホロチオエートが存在しないため、化学物質によるｉｎ ｖｉｖｏでのｍｉＲ−２０８の有用な心臓ノックダウンの確立が妨げられる。オリゴの５’または３’末端とのコレステロール結合のためのＣ４またはＣ６リンカーの使用は、両方のリンカーがコレステロールの結合に好適であることを示している。Ｃ６をオリゴの３’末端において用いることにより、ｍｉＲ−２０８に対するオリジナルのアンタゴｍｉｒよりもさらに効率的なｍｉＲ−２０８のノックダウンが誘発される（図５および図６）。これらのデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系と異なり、コレステロールおよびホスホロチオエートなどの脂質部分が心筋細胞のノックダウンに望ましく、５’または３’の両方のリンカーがオリゴとのコレステロール結合に十分であり、オリジナルのアンタゴｍｉｒ設計と比較して、同等の、さもなければ高い、ｍｉＲ−２０８のノックダウンを確立することができることを示している。図５を参照のこと。

【0090】

実験プロトコル
ｍｉＲＮＡのノーザンブロッティング
異なる化学物質および接合体に応答するｍｉＲ−２０８のノックダウンを評価するために、ｍｉＲ−２０８に対して指向するプローブを用いたノーザンブロット分析を用いて、心臓でのｍｉＲ−２０８の存在を検出した。トリゾール剤を用いて全ＲＮＡを心臓から集め、その１０μｇをノーザンブブロッティングに用いる。この目的のために、ＲＮＡ試料を２０％アクリルアミド変性ゲル上で流し、電気泳動によってＺｅｔａ−プローブ ＧＴゲノムブロッティング膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にトランスファーする。トランスファー後、ブロットを交差結合させ、８０℃で１時間べークする。ｍｉＲＮＡ検出の感度を最大にするために、オリゴヌクレオチドプローブをＳｔａｒｆｉｒｅ Ｏｌｉｇｏｓキット（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルヴィル）およびα−３２Ｐ ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識する。プローブを、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で３９℃で一晩、膜にハイブリダイズし、その後、それを０．１％ＳＤＳを含む０．５ｘＳＳＣを用いて、３９℃で１０分間、２回洗浄する。ブロットを暴露し、Ｕ６プローブをローディングコントロール（Ｕ６フォワード：５−ＧＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣ−３（配列番号６４）、Ｕ６リバース：５−ＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧ−３（配列番号６５））として用いる。ホスホイメージャー（phosphorimager）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、放射性信号強度を用いて発現の倍率変化を定量する。

【0091】

リアルタイムＰＣＲ分析
［０９３］ノーザンブロット分析に加えて、ｍｉＲＮＡ特異的リアルタイムＰＣＲ分析を行い、ｍｉＲ−２０８ノックダウンレベルを検証し、定量した。製造元の指示書に基づいてＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｉｌ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，カナダオンタリオ州バーリントン）を使用し、各組織試料から得られた２μｇＲＮＡを用いてｃＤＮＡを生成した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩから購入したＴａｑｍａｎプローブを用いて９５℃で３分間の最初の変性工程を行った後、９５℃／３０秒および６０℃／３０秒の間でサイクルさせる（４０サイクル）。増幅産物を融解曲線ソフトウエア（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて通常通りに検査し、比較Ｃｔ法を用いて転写量を比較し、該方法では、内在性ＳｎｏＲＮＡの量に対して基準化され、かつ、コントロール試料に対する標的の量が、２^{−ΔΔＣｔ}によって与えられる。

【0092】

参照文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]