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5883396受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5883396
(24)【登録日】2016年2月12日
(45)【発行日】2016年3月15日
(54)【発明の名称】受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/15 20060101AFI20160301BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20160301BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20160301BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20160301BHJP
A61K 45/00 20060101ALN20160301BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20160301BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20160301BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20160301BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20160301BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20160301BHJP
C12N 1/02 20060101ALN20160301BHJP
【ＦＩ】
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
C12Q1/48ZNA
A61P35/00
!A61K45/00
!A61P43/00 111
!A61K39/395 E
!A61K48/00
!A61K31/7088
!A61K39/395 T
!C12N15/00 A
!C12N1/02
【請求項の数】3
【全頁数】31
(21)【出願番号】特願2012-550938(P2012-550938)
(86)(22)【出願日】2011年12月26日
(86)【国際出願番号】JP2011080083
(87)【国際公開番号】WO2012090939
(87)【国際公開日】20120705
【審査請求日】2014年8月15日
(31)【優先権主張番号】特願2010-290373(P2010-290373)
(32)【優先日】2010年12月27日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504139662
【氏名又は名称】国立大学法人名古屋大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】特許業務法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】高橋 隆
(72)【発明者】
【氏名】山口 知也
【審査官】
深草 亜子
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１０／００８０６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００７／１４６９５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１０／１２４１８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００８／０７６８６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
The American Journal od Pathology，２００７年，Vol.170，p.366-376
【文献】
Science，２００７年，Vol.316，p.1039-1043
【文献】
Oncology Reports，２００５年，Vol.14，p.1583-1588
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｃ１２Ｑ １／４８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＲＯＲ１の機能を検出しうる系に試験化合物を接触させる工程、
（ｂ）ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物を選択する工程、
を含み、かつ前記ＲＯＲ１の機能が、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとの結合、ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃのリン酸化、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの結合、ＲＯＲ１によるＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合、または、ＲＯＲ１によるＥｒｂＢ３のリン酸化である方法。
（ａ）ＲＯＲ１の機能を検出しうる系に試験化合物を接触させる工程、
（ｂ）ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物を選択する工程、
を含み、かつ前記ＲＯＲ１の機能が、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとの結合、ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃのリン酸化、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの結合、ＲＯＲ１によるＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合、または、ＲＯＲ１によるＥｒｂＢ３のリン酸化である方法。
【請求項2】
受容体型チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲまたはＭＥＴである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
癌細胞が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤耐性またはＭＥＴチロシンキナーゼ阻害剤耐性の癌細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＯＲ１を標的とした、受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する方法、当該シグナルを抑制する化合物のスクリーニング方法、当該シグナルを抑制するための薬剤の製造方法、および、当該シグナルを抑制するための薬剤に関する。【背景技術】
【0002】
肺癌は、経済的に良く発展した国々における癌による死亡の主たる原因であり、その中でも腺癌は最も頻度の高い組織学的サブタイプである。【0003】
本発明者らは、肺における分岐形態形成及び生理学的機能に必要な系譜特異的転写因子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であるＴＴＦ−１の持続的な発現と、肺腺癌とは密接に結びついていることを先に報告している(非特許文献１)。また、他の３グループも同様の結論、例えば、肺腺癌における局所的なゲノム異常のゲノム規模での探索を通して、ＴＴＦ−１は系譜生存的癌遺伝子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であるということに至っている（非特許文献２〜４）。ＴＴＦ−１がサーファクタントタンパク質の産生、並びに正常な成人の肺における生理学的機能に欠かせないことから、ＴＴＦ−１の系譜特異的生存シグナルに関与する下流分子の同定が、新たな治療方法の開発に必要である。【0004】
本発明者らは、このような下流分子の同定を試みた結果、ＴＴＦ−１により発現が誘導される遺伝子として、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）遺伝子を同定することに成功している。そして、このＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制することにより、特定の癌細胞の増殖が阻害できることを明らかにしている（特許文献１）。【0005】
しかしながら、ＲＯＲ１が癌細胞の増殖を抑制する機序については、いまだほとんど解明されていない。【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１０/００８０６９号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｔａｎａｋａ，Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００７年、６７巻、６００７〜６０１１ページ
【非特許文献2】Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｊら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００７年、１０４巻、１６６６３〜１６６６８ページ
【非特許文献3】Ｗｅｉｒ，ＢＡら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４５０巻、８９３〜８９８ページ
【非特許文献4】Ｋｗｅｉ，ＫＡら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００８年、２７巻、３６３５〜３６４０ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＲＯＲ１が癌細胞の増殖を抑制する機序のさらなる解明にある。さらなる本発明の目的は、ＲＯＲ１を標的として、当該機序を抑制する化合物をスクリーニングする方法を提供すること、および、当該機序を抑制する化合物を有効成分とする薬剤を提供することにある。【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＲＯＲ１の機能を抑制することにより、癌細胞のアポトーシス促進性シグナルの誘導のみならず、ｃ−Ｓｒｃを介して、ＥＧＦＲが伝達する癌細胞の生存促進性シグナルの抑制を行うことが可能であることを見出した。また、ＲＯＲ１の機能の抑制により、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの結合、およびＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合を介して伝達される、癌細胞の生存促進性シグナルの抑制を行うことが可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、ＲＯＲ１の機能の抑制により、ＥＧＦＲ変異又はＨＧＦが仲介するＭＥＴ活性化によって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を獲得している肺癌細胞株の増殖までもが効果的に抑制されることを見出した。【0010】
これら知見から本発明者らは、ＲＯＲ１を標的として、癌細胞のアポトーシスの誘導のみならず、ＥＧＦＲやＭＥＴなどの受容体型チロシンキナーゼが伝達する癌細胞の生存促進性シグナルの抑制が可能であり、ＲＯＲ１が、癌細胞の増殖抑制剤の開発の重要な標的となりうることを見出し、本発明を完成するに至った。【0011】
従って、本発明は、ＲＯＲ１を標的とした、受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する方法、当該シグナルを抑制する化合物のスクリーニング方法、当該シグナルを抑制するための薬剤の製造方法、および、当該シグナルを抑制するための薬剤に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。（１） 受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＲＯＲ１の機能を検出しうる系に試験化合物を接触させる工程、
（ｂ）ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物を選択する工程、
を含み、かつ前記ＲＯＲ１の機能が、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとの結合、ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃのリン酸化、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの結合、ＲＯＲ１によるＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合、または、ＲＯＲ１によるＥｒｂＢ３のリン酸化である方法。
（２） 受容体型チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲまたはＭＥＴである、（１）に記載の方法。
（３） 癌細胞が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤耐性またはＭＥＴチロシンキナーゼ阻害剤耐性の癌細胞である、（１）または（２）に記載の方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、ＲＯＲ１の機能を抑制して、受容体型チロシンキナーゼが伝達する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制することが可能となった。ＲＯＲ１の機能の抑制により、癌細胞の生存促進性シグナルの抑制と同時に、ｐ３８やＦＯＸＯ１を介したアポトーシス促進性シグナルが惹起される。従って、ＲＯＲ１の機能の抑制により、効果的に癌細胞の増殖を抑制することが可能となる。また、ＲＯＲ１の機能の抑制により、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤などの受容体型チロシンキナーゼ阻害剤に耐性を獲得している癌細胞の生存促進性シグナルをも抑制しうるため、ＲＯＲ１を標的とすることによって、難治性癌に対する治療薬を効率的に開発することが可能となる。ＲＯＲ１は、ｃ−Ｓｒｃなどの下流分子との結合やリン酸化を介したシグナル伝達により機能を発揮することから、例えば、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとの結合を阻害したり、ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃのリン酸化を阻害する化合物は、このような治療薬の有力な候補となる。また、ＲＯＲ１は、ＥＧＦＲなどの他の受容体型チロシンキナーゼと結合し、これら受容体型チロシンキナーゼの活性化状態や下流へのシグナル伝達に関わるリン酸化反応において機能している。従って、ＲＯＲ１とＥＧＦＲなどの他の受容体型チロシンキナーゼとの結合を阻害する化合物、ＲＯＲ１による他の受容体型チロシンキナーゼ同士の結合（例えば、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合）を阻害する化合物、またはＲＯＲ１によるＥｒｂＢ３などの他の受容体型チロシンキナーゼのリン酸化を阻害する化合物なども、このような治療薬の有力な候補となる。【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＲＯＲ１プロモーター領域における、ルシフェラーゼレポーター及びクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイの結果を示す図である。ａは、ＴＴＦ−１恒常発現ＨＰＬ１Ｄ細胞（ｓｔａｂｌｅ ＴＴＦ−１ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ｏｆ ＨＰＬ１Ｄ）において、ＲＯＲ１プロモーター（ＲＯＲ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ）制御下のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．）活性が、ＴＴＦ−１抑制に応じて低下したことを示すグラフである（平均値±標準偏差（ｎ＝３））。ｂは、ＲＯＲ１プロモータ−においてＴＴＦ−１が結合すると予測される部位（ＴＴＦ-1結合候補部位）、並びに、ＣｈＩＰアッセイによって、ＲＯＲ１プロモーターに対してＴＴＦ−１が結合能を有することを示す写真である。
【図2】肺腺癌において、生存に関わるＴＴＦ−１系譜生存的癌遺伝子の下流シグナルにＲＯＲ１が介在していることを示す図である。ａは、ｓｉＲＮＡとアテロコラーゲンとを混合し、腫瘍内に注入してから２週間後に、写真を撮り、腫瘍の重さを量った結果、すなわちＲＯＲ１ｓｉＲＮＡのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフ及び写真である（平均値±標準偏差（ｎ＝７））。ｂは、ＴＴＦ−１＋／ＲＯＲ１＋ ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞において、ＲＯＲ１の発現ベクターと、ＴＴＦ−１に対するショートヘアピンＲＮＡの発現ベクターとを同時に導入してから２週間経過後にコロニー数を数えた結果であり、ＲＯＲ１の導入によって、ＴＴＦ−１ｓｈＲＮＡが惹起する増殖抑制が軽減されることを示すグラフである（平均値±標準偏差（ｎ＝３））。すなわち、ＴＴＦ−１が伝える生存シグナルをＲＯＲ１が担っていることを示している。ｃは、ＲＯＲ１恒常発現細胞株（ｓｔａｂｌｅ ＲＯＲ１ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）のインビボ腫瘍増殖が亢進したことを示す、グラフ及び写真である。なお、パネル上部は皮下注入してから３週間後の腫瘍の平均重量を示し（平均値±標準偏差（ｎ＝５））、パネル下部は、注入してから３週間後の代表的なマウスの写真を示す。
【図3】ＲＯＲ１は、ｃ−Ｓｒｃ−ＰＴＥＮ軸のシグナル伝達を介して生存促進性シグナルの維持に寄与し、また、アポトーシスを促進するｐ３８活性化を抑制する機能を持つことを示す図である。ａは、ｓｉＲＯＲ１処理細胞における、ｃ−Ｓｒｃ、ＰＴＥＮ、ＡＫＴ、ＦＯＸＯ１、及びｐ３８のリン酸化状態の変化を、ウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。ｂは、ＲＯＲ１恒常発現細胞における、リン酸化状態の逆の効果をウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。
【図4】ａは、ｃ−Ｓｒｃの事前導入に次いで、ｓｉＲＯＲ１を導入してから７２時間後にウェスタンブロッティング分析（パネル上部）を行い、ｓｉＲＯＲ１を導入してから５日後に比色分析（パネル下部）によって細胞増殖を測定した結果である。すなわち、ＲＯＲ１抑制に対して、恒常活性型ｃ−Ｓｒｃが有意に拮抗することを示す写真及びグラフ（平均値±標準偏差（ｎ＝３））であり、ｃ−Sｒｃが下流に位置することを示す。なお、「ＶＣ」は対照としての空ベクター、「ＷＴ」は野生型ｃ−Ｓｒｃ、「ＣＡ」は恒常活性型ｃ−Ｓｒｃを示す。ｂは、免疫沈降−ウェスタンブロッティング（ＩＰ−ＷＢ）分析によって、ＣＯＳ-７細胞において、外来性ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとは共免疫沈降することを示す写真である。ｃは、ＩＰ−ＷＢ分析によって、ＲＯＲ１導入２９３Ｔ細胞において、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとが共免疫沈降していることを示す写真である。ｄは、インビトロプルダウンアッセイによって、精製ＲＯＲ１タンパク質とｃ−Ｓｒｃタンパク質との相互作用を示す写真である。ｅは、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の溶解液を用いたＩＰ−ＷＢ分析によって、内因性ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとは共免疫沈降することを示す写真である。なお「ＩｇＧ」は陰性対照を示す。ｆは、ｍｙｃ標識ＲＯＲ１と種々のｃ−Ｓｒｃ欠損変異体とをＣＯＳ-７細胞に導入し、ＩＰ−ＷＢによって、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃ ＳＨ３ドメインとの相互作用を分析した結果を示す写真である。なお、パネル上部は、ｃ−Ｓｒｃ欠損変異体の概要図を示す。ｇは、精製ＧＳＴ標識ｃ−Ｓｒｃドメインを用いたインビトロプルダウンアッセイによって、内因性ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃ ＳＨ３ドメインとが結合し、内因性ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃ ＳＨ２ドメインとは結合しないということを示す写真である。
【図5】ａは、ＲＯＲ１が欠損しているＮＣＩ−Ｈ２３肺腺癌細胞株において、免疫沈降して得られたｃ−Ｓｒｃを基質として用いた、インビトロＲＯＲ１キナーゼアッセイの結果、すなわち、ＡＴＰ存在下、ＧＳＴ−ＲＯＲ１と共にインキュベーションすることによって、ｃ−Ｓｒｃは明らかにリン酸化されることを示す写真である。ｂは、２９３Ｔ細胞の溶解液から免疫沈降して得られたｃ−Ｓｒｃを基質として用いた、インビトロＲＯＲ１キナーゼアッセイにおいて、ｃ−Ｓｒｃがリン酸化されていることを示す写真である。ｃは、基質としてキナーゼ不活性型ｃ−ＳｒｃをＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、この細胞のｃ−Ｓｒｃ免疫沈降物を用いた、インビトロＲＯＲ１キナーゼアッセイの結果を示す写真である。
【図6】ＲＯＲ１の下流にＰＴＥＮが位置することが示す図である。上段は、ＲＯＲ１は、ｃ−Ｓｒｃによって不活化を受けることが知られているＰＴＥＮを抑制的に制御し、それによってＡＫＴ活性化を促し生存促進性シグナルを維持する活性を持つことを示す写真である。すなわち、ＲＯＲ１に対するｓｉＲＮＡとＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡの併用による両者の発現抑制は、ＡＫＴのリン酸化を回復させることを示す写真である。下段は、その結果ＲＯＲ１抑制によって誘導される細胞増殖抑制効果が、ＰＴＥＮを併せて抑制すると軽減されることを示すグラフである（平均値±標準偏差（ｎ＝３））。
【図7】ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの相互作用は、ＥｒｂＢ３のリン酸化反応に必要であることを示す図である。ａは、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとが相互に結合することを示す写真であり、ＲＯＲ１の欠損変異体を用いたＩＰ−ＷＢ解析から、ＥＧＦＲはＥＧＦ刺激下においてＲＯＲ１の細胞外領域と相互作用することを示している。なお、「ＲＯＲ１−ΔＮ」とはＲＯＲ１の細胞外領域を欠損させた変異体であり、「ＲＯＲ１−ΔＣ」とはＲＯＲ１の細胞内領域を欠損させた変異体であることを表わす。ｂは、ＲＯＲ１の細胞外領域における、ＥＧＦＲと結合する結合領域について、更なる詳細な分析をした結果を示す写真である。すなわち、ＥＧＦＲはＲＯＲ１の細胞外領域におけるシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を介して結合していることを示す写真である。なお、「ＲＯＲ１−ΔＩｇ」とはＲＯＲ１のＩｇドメインを欠損させた変異体であり、「ＲＯＲ１−ΔＣＲＤ」とはＲＯＲ１のＣＲＤドメインを欠損させた変異体であり、「ＲＯＲ１−ΔＫｒｉｎｇｌｅ」とはＲＯＲ１のＫｒｉｎｇｌｅドメインを欠損させた変異体であることを表わす。また、「ＲＯＲ１−ΔＩｇ＋ＣＲＤ」は、ＲＯＲ１のＩｇドメイン及びＣＲＤドメインを欠損させた変異体であり、「ＲＯＲ１−ΔＣＲＤ＋Ｋｒｉｎｇｌｅ」は、ＲＯＲ１のＣＲＤドメイン及びＫｒｉｎｇｌｅドメインを欠損させた変異体であり、「ＲＯＲ１−ΔＩｇ＋ＣＲＤ＋Ｋｒｉｎｇｌｅ」は、ＲＯＲ１のＩｇドメイン、ＣＲＤドメイン及びＫｒｉｎｇｌｅドメインを欠損させた変異体であることを表わす。ｃは、ＲＯＲ１恒常発現細胞の溶解液を用いたＩＰ−ＷＢ分析によって、内因性のＲＯＲ１とＥＧＦＲとの共免疫沈降を示したものであり、両者の結合を示す写真である。なお、「ＶＣ」とはＲＯＲ１遺伝子を導入されていないコントロールの細胞溶解液である。ｄは、ＲＯＲ１の発現を抑制したＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の溶解液を用いたＩＰ−ＷＢ分析の結果、すなわち、ＲＯＲ１の抑制によって、内因性ＥＧＦＲとヘテロ二量体を形成して生存促進性シグナルを伝達するＥＧＦＲの重要なパートナー分子のＥｒｂＢ３との結合が阻害されることを示す写真である。ｅは、ＲＯＲ１が抑制されたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において、ＥｒｂＢ３の活性化状態を反映するリン酸化反応について、ウェスタンブロッティング分析を行った結果を示す写真である。すなわち、ＥＧＦ処理によって誘導されるＥｒｂＢ３のリン酸化が、ＲＯＲ１の抑制によって顕著に低下していることを示す写真である。ｆは、ＲＯＲ１の発現を抑制したＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の溶解液を用いたＩＰ−ＷＢ分析によって、ＲＯＲ１の抑制により、内因性ＥｒｂＢ３と、ＥｒｂＢ３のリン酸化部位を認識して結合して生存促進性シグナルを伝達するＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットとの結合が阻害されることを示す写真である。ｇは、ＲＯＲ１恒常発現細胞における、ＥｒｂＢ３のリン酸化状態の増加を、ウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。
【図8】ＲＯＲ１は、肺腺癌におけるＥＧＦＲ及びＭＥＴシグナル伝達を維持するために必要であることを示す図である。ａは、ＲＯＲ１が抑制されたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞及びＳＫ−ＬＣ−５細胞において、潜在的な下流分子について、ウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す。すなわち、ＥＧＦ処理によって誘導されるｃ−Ｓｒｃ、ＡＫＴ、及びＦＯＸＯ１のリン酸化は、ＲＯＲ１の抑制によって顕著に低下していることを示す写真である。bは、ＲＯＲ１が抑制されたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞においては、ＥＧＦＲなどの受容体型チロシンキナーゼがＡＫＴを介して伝える生存促進シグナルによって機能抑制的な調節を受ける、細胞死誘導能を持つＦＯＸＯ１が、ＥＧＦ処理下においても核内に移行した活性化状態となっていることを示す免疫蛍光分析の結果の写真である。なお、スケールバーは３０μｍを示す。ｃは、ゲフィチニブに対する耐性を付与することで知られているＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を有するＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞及びＮＣＩ−Ｈ８２０細胞において、ＲＯＲ１を抑制することによって細胞死が誘導され、増殖が阻害されたことを示す写真及びグラフである。なお、パネル上部はウェスタンブロッティングによる細胞死の惹起を示すカスパーゼ３断片の発現分析の結果を示し、パネル下部は比色アッセイの結果を示す（平均値±標準偏差（ｎ＝３））。ｄは、ゲフィチニブ及び／又はＨＧＦによって処理したＲＯＲ１抑制ＰＣ９細胞における、比色アッセイ及びＲＯＲ１下流についてのウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す。すなわち、ＥＧＦＲ変異体（Ｅ７４６＿Ａ７５０）を有するＰＣ−９細胞において、ＨＧＦが介するＭＥＴ活性化によって生じたゲフィチニブ耐性のＡＫＴリン酸化が、ＲＯＲ１を抑制することによって有意に低下し、顕著な増殖阻害が生じることを示す、写真及びグラフである（平均値±標準偏差（ｎ＝３））。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、受容体型チロシンキナーゼが伝達する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する方法であって、ＲＯＲ１の機能を抑制することを特徴とする方法を提供する。【0015】
本発明において「受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナル」とは、種々の増殖因子（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン様増殖因子など）がチロシンキナーゼ活性をもつ受容体（受容体型チロシンキナーゼ）に結合することによって惹起される、受容体型チロシンキナーゼ及び一連の下流分子のリン酸化反応によって伝達されるシグナルであって、癌細胞における遺伝子発現や代謝などの細胞内環境を、アポトーシスを抑制し生存を促進する状況に誘導するシグナルを意味する。受容体型チロシンキナーゼの下流に位置するＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、代表的な生存促進性シグナルの伝達経路であり、癌細胞の生存促進につながる多くの機能を担っている。例えば、ＰＩ３Ｋによって活性化されたＡＫＴによる、ＦＯＸＯファミリー転写因子等の機能を抑制するリン酸化は、アポトーシス誘導に関わる遺伝子の発現を抑制し細胞の生存維持に重要な働きを担うことが知られている。【0016】
本発明における「受容体型チロシンキナーゼ」は、その活性化により当該生存促進性シグナルを誘導するものであれば特に制限はないが、例えば、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーに属する分子や、ＭＥＴなどが挙げられる。【0017】
受容体型チロシンキナーゼは、一般的に、リガンド刺激（結合）によって二量体化し、活性化の引き金が引かれる(Ｙａｒｄｅｎ，Ｙら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、２００９年、９巻、４６３〜４７５ページ)。例えば、ＥＧＦＲにそのリガンドであるＥＧＦが結合すると、細胞外ドメインのコンフォーメーションが変化し受容体同士が二量体化し、互いをリン酸化し合う、いわゆるトランスアクチィベーションが起こる。このようにしてチロシンリン酸化された受容体型チロシンキナーゼは活性化状態となり、シグナル伝達を担う下流分子へと細胞内シグナルが伝達する。【0018】
本発明におけるＥＧＦＲファミリ―に属する分子としては、例えば、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４が挙げられる(Ｙａｒｄｅｎ，Ｙら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、２００９年、９巻、４６３〜４７５ページ)。【0019】
Ｈｅｒ２以外にはそれぞれに対応する複数のリガンドが存在し、リガンドが各受容体の細胞外ドメインに結合することによって、受容体分子のホモ二量体化やヘテロ二量体化が誘導され、細胞内のチロシンキナーゼドメインが活性化される。例えば、ＥＧＦＲは肺非小細胞癌において高頻度に発現が検出され、約１０％の症例においては遺伝子増幅も伴う。また、肺腺癌に特異的なチロシンキナーゼドメインの点突然変異や欠失変異は、ＥＧＦＲのキナーゼ活性の亢進を来し、主にＥＧＦＲとＥｒｂＢ３とのヘテロ２量体形成を通じて癌の生存シグナルを伝達している。このような変異をもつ癌細胞は、ＥＧＦＲキナーゼの阻害剤（ゲフィチニブ、エルロチニブなど）やアンタゴニストとしての作用を有する抗ＥＧＦ受容体抗体（セツキシマブ）に感受性が高い。一方、ＥＧＦＲにおいて二次的にＴ７９０Ｍが２重変異として生じたり、別の受容体型チロシンキナーゼであるＭＥＴの遺伝子増幅やそのリガンドであるＨＧＦの過剰発現等が生じたりすることにより、生存シグナルがＥＧＦＲやＥｒｂＢ３に代わってＭＥＴから伝達されることがある。これによって、癌細胞が、阻害剤に対する抵抗性を獲得することが臨床上の大きな問題となっている。ＥＧＦＲの遺伝子増幅による過剰発現は、口腔癌、食道癌、脳腫瘍等にも認められる。【0020】
Ｈｅｒ２はリガンドを持たないが恒常的にリガンド結合状態と類似した構造を取ることが知られている。しばしば遺伝子増幅を伴って乳癌や卵巣癌で高頻度に過剰発現しており、予後不良因子でもある。Ｈｅｒ２を標的とする分子標的薬の代表的なものとして、例えばハーセプチンが挙げられる。【0021】
ＥｒｂＢ３はそれ自身のキナーゼ活性は極めて弱いが、ＥＧＦＲとヘテロ二量体を形成してチロシンリン酸化を受け、下流のシグナル伝達分子を効率よく活性化する働きを持つ。特に、ＰＩ３Ｋのサブユニットの１つであるｐ８５はリン酸化ＥｒｂＢ３に結合し、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ軸による生存シグナルの伝達を担っている。ＥｒｂＢ３受容体とそのリガンドは乳癌、卵巣癌や肺癌においてしばしば発現が増加し、その浸潤・転移や個体の生存率の低下と関係している。また、ＥｒｂＢ３は、肺癌におけるゲフィチニブ、結腸癌や頭頸部癌におけるセツキシマブ、乳癌におけるトラスツズマブなどに対する耐性にも関係している。【0022】
ＥｒｂＢ４は、肺癌や胃癌、脳腫瘍において変異が認められているが、他のＥＧＦＲファミリーと異なり、病態の悪性化との関わりについては見出されていない。【0023】
ＭＥＴは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をリガンドとする受容体型チロシンキナーゼであり、細胞の生存、増殖、運動、形態形成などに関わる。ＭＥＴは、前駆体タンパク質からα及びbの二つのサブユニットとして生成され、リガンドであるＨＧＦと結合して二量体化を通じた活性化を受けて、上述の生物学的活性に関わるシグナル伝達を担う。例えば、ＥＧＦＲファミリー（特に、ＥＧＦＲ・ＥｒｂＢ３）が伝達する生存シグナルから、活性化されたＭＥＴによるＰＩ３Ｋ-ＡＫＴ軸を介した生存シグナルへと、依存する生存シグナルが転換することが、ゲフィティブなどのＥＧＦ受容体型キナーゼ阻害剤に対する癌細胞の耐性獲得につながっていると考えられている。このＭＥＴの活性化は、ＭＥＴの遺伝子増幅やそのリガンドであるＨＧＦの過剰発現等によって生じる。また、ＭＥＴは乳癌や大腸癌などの多くの癌において発現が認められ、癌細胞の生存や増殖、浸潤、転移に深く関与している(Ｔｒｕｓｏｌｉｎｏ，Ｌら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０１０年、１１巻、８３４〜８４８ページ)。【0024】
本発明における「ＲＯＲ１」は、受容体型チロシンキナーゼの一つであり、ノックアウトマウスの解析から、骨形成や心臓の発生等に関わることが示唆されている(Ｎｏｍｉ，Ｍら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００１年、２１巻、８３２９〜８３３５ページ)。また近年、慢性リンパ性白血病におけるＲＯＲ１の過剰発現の存在や(Ｆｕｋｕｄａ，Ｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００８年、１０５巻、３０４７〜３０５２ページ)、ある種の乳癌細胞における過剰発現（ＷＯ２００５／１００６０５）の報告がされている。さらに、ＲＯＲ１は子宮頚癌由来のＨｅｌａ細胞とＲＮＡｉ法を用いたキナーゼ遺伝子を対象とする網羅的機能スクリーニングにおいて、Ｈｅｌａ細胞の生存への関与が示唆されている(ＭａｃＫｅｉｇａｎ，ＪＰら、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００５年、７巻、５９１〜６００ページ)。【0025】
本発明においては、ＲＯＲ１の機能を抑制することにより、上記受容体型チロシンキナーゼが伝達する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する。ここで「抑制」とは、完全に抑制すること（すなわち、阻害すること）のみならず、部分的に抑制することをも含む意である。また、「ＲＯＲ１の機能の抑制」には、ＲＯＲ１の活性の抑制および発現の抑制の双方が含まれる。【0026】
本発明においてＲＯＲ１が、ｃ−Ｓｒｃと結合してそれをリン酸化することが見出された。さらに、本発明においてＲＯＲ１が、ＥＧＦＲと結合すること、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合を促進すること、及びＥｒｂＢ３のリン酸化を促進することが見出された。従って、本発明における「ＲＯＲ１の活性の抑制」は、好ましくは、(i)ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃなどの下流分子との結合の抑制、(ii)ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃなどの下流分子のリン酸化の抑制、(iii)ＲＯＲ１とＥＧＦＲなどの受容体型チロシンキナーゼとの結合の抑制、(iv)ＲＯＲ１による他の受容体型チロシンキナーゼ同士の結合（例えば、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合）の抑制、(v)ＲＯＲ１によるＥｒｂＢ３などの受容体型チロシンキナーゼのリン酸化の抑制、である。また、ＲＯＲ１は自己リン酸化することが知られていることから（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，ＷＣら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、２００２年、５９巻、８３〜９６ページ）、(vi)ＲＯＲ１の自己リン酸化の抑制もまた、ＲＯＲ１の機能を抑制するための好ましい態様である。【0027】
本発明において、ＲＯＲ１の機能を抑制し、その生存促進性シグナルを抑制する対象となる「癌細胞」としては、例えば、肺癌、膵癌、悪性中皮腫、乳癌、大腸癌、口腔癌、食道癌などの癌の細胞が挙げられるが、これらに制限されない。癌細胞の由来する生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに制限されない。ＲＯＲ１の機能を抑制することにより、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤耐性の癌細胞を死滅させることが可能であるため、本発明は、このような難治性癌の治療に適用しうる点で好ましい。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＥＫＢ−５６９、ラパチニブ、カネルチニブ、ＨＫＩ−２７２、ＢＩＢＷ２９９２、ＰＦ−００２９９８０４などが挙げられる。また、ＲＯＲ１の機能を抑制することにより、ＭＥＴ受容体型チロシンキナーゼからの生存促進性シグナルを抑制することが可能であるため、本発明は、ＰＨＡ６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＡＲＱ１９７などのＭＥＴチロシンキナーゼ阻害剤耐性の癌の治療に適用しうる点でも好ましい。【0028】
癌細胞におけるＲＯＲ１の機能を抑制するためには、癌細胞にＲＯＲ１の機能を抑制する化合物を作用させればよい。本発明における「ＲＯＲ１の機能を抑制する化合物」としては、例えば、後述する、ＲＯＲ１に結合してその機能を抑制する活性を有する抗ＲＯＲ１タンパク質抗体、ＲＯＲ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、ＲＯＲ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、ＲＯＲ１タンパク質に結合する低分子化合物などが挙げられる。これら化合物は、培養されている癌細胞に対しては、培地への添加や培養細胞への導入により、生体中の癌細胞に対しては、静脈注射などの非経口投与や経口投与などの投与方法で生体に投与することにより、癌細胞に作用させることができる。これら化合物は、当業者に公知の手法で製造し、後述する本発明のスクリーニング方法により所望の活性を有するものを選抜することが可能である。【0029】
本発明は、また、受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法の一つの態様は、ＲＯＲ１の機能を検出しうる系（例えば、ＲＯＲ１を含む試料またはＲＯＲ１遺伝子の発現を検出しうる系）に試験化合物を接触させる工程、および、ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物を選択する工程を含む方法である。【0030】
本発明のスクリーニング方法において使用する試験化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。また、後述する、抗ＲＯＲ１タンパク質抗体、ＲＯＲ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、ＲＯＲ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡが挙げられる。また、ＲＯＲ１タンパク質の構造を基に設計された、ＲＯＲ１タンパク質に結合する構造を有する化合物が挙げられる。【0031】
本発明のスクリーニング方法の一つの態様は、ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物を、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃに代表される下流のシグナル伝達分子との結合の抑制を指標に選択する方法である。すなわち、当該方法は、試験化合物の存在下で、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃなどのシグナル伝達分子とを接触させる工程、ＲＯＲ１とそれらとの結合を検出する工程、および、前記結合を抑制する活性を有する化合物を選択する工程を含む方法である。【0032】
当該方法は、インビトロ結合アッセイ、例えば、精製したＲＯＲ１タンパク質と、精製或いは細胞抽出液中のｃ−Ｓｒｃとを用いたＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）や、本実施例に記載のＧＳＴプルダウンアッセイによって実施することができる。具体的には、試験化合物が添加されたバッファー中にて、Ｈｉｓ標識ｃ−Ｓｒｃと、ＧＳＴ標識ＲＯＲ１でコートしたアフィニティビーズとを接触させて洗浄した後、抗Ｈｉｓ抗体を用いてＲＯＲ１に結合したｃ−Ｓｒｃを検出する。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出されるｃ−Ｓｒｃの量が少なければ、試験化合物は、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとの結合を抑制する活性を有すると評価される。その他、例えば、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴法を利用した方法などを本発明に用いることができる。【0033】
本方法に用いられるＲＯＲ１およびｃ−Ｓｒｃは、完全なタンパク質である必要はなく、両者の結合部位を含むペプチドであってもよい。例えば、ｃ−ＳｒｃについてはＳＨ３ドメイン領域を用いることができる。ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃの由来する生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに制限されない。【0034】
本発明に用いるＲＯＲ１の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００５００３（ＮＭ＿００５０１２）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられ、マウス由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３８８７３（ＮＭ＿０１３８４５）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられる。【0035】
また、本発明に用いるｃ−Ｓｒｃの典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００５４０８（ＮＭ＿００５４１７）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられ、マウス由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３３２９７（ＮＭ＿００９２７１）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられる。【0036】
本発明のスクリーニング方法の他の一つの態様は、ＲＯＲ１の機能を抑制する化合物を、ＲＯＲ１による基質（例えば、ｃ−Ｓｒｃ）のリン酸化を指標に選択する方法である。すなわち、当該方法は、試験化合物の存在下で、ＲＯＲ１と基質とを接触させる工程、ＲＯＲ１による基質のリン酸化を検出する工程、および、前記リン酸化を抑制する活性を有する化合物を選択する工程を含む方法である。【0037】
当該方法は、例えば、ＥＬＩＳＡ法を用いたインビトロキナーゼアッセイによって実施することができる。ＲＯＲ１によってリン酸化を受ける基質としては、ｃ−Ｓｒｃタンパク質或いは部分ペプチド、またはチロシンキナーゼの基質となり得るタンパク質或いは部分ペプチド（例えばチロシン残基を含むガストリンペプチド）を用いることができる。当該方法においては、例えば、ストレプトアビジンでコートしたプレート中で、精製ＲＯＲ1タンパク質、ビオチン化した基質、試験化合物を混合し、インキュベーションした後、ＨＲＰ標識抗リン酸化チロシン抗体を用いて基質のリン酸化量をマイクロプレートリーダーによって検出する。試験化合物の存在下と非存在下で検出した場合における相対的なリン酸化量から、試験化合物によるＲＯＲ１キナーゼ活性の阻害率を算出することができる。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、試験化合物の存在下で検出される基質のリン酸化量が少なければ、試験化合物は、ＲＯＲ１による基質のリン酸化を抑制する活性を有すると評価される。【0038】
また、当該方法は、例えば、本実施例に記載のような、抗リン酸化ｃ−Ｓｒｃ抗体を用いたウェスタンブロッティング分析によって実施することもできる。基質がｃ−Ｓｒｃの場合の方法を例示すれば、内在性のＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとを発現している細胞（例えば、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞）の細胞溶解液に、抗ｃ−Ｓｒｃ抗体を添加して免疫沈降を行う。免疫沈降物をリン酸化バッファー中にインキュベーションし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する。次いで、抗リン酸化ｃ−Ｓｒｃ抗体を用いたウェスタンブロッティング分析を行い、ｃ−Ｓｒｃにおけるリン酸化を検出する。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出されるｃ−Ｓｒｃのリン酸化量が少なければ、試験化合物は、ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃのリン酸化を抑制する活性を有すると評価される。【0039】
本発明のスクリーニング方法の他の一つの態様は、ＲＯＲ１の機能を抑制する化合物を、ＲＯＲ１の自己リン酸化を指標に選択する方法である。すなわち、当該方法は、試験化合物の存在下で、ＲＯＲ１による自己リン酸化を検出する工程、および、前記リン酸化を抑制する活性を有する化合物を選択する工程を含む方法である。当該方法は、例えば、抗リン酸化ＲＯＲ１抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ウェスタンブロッティング分析、イン・セル・ウェスタン分析などにより実施することができる。また、抗ＲＯＲ１抗体により免疫沈降した後に、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブロッティング分析を行ったり、抗リン酸化チロシン抗体により免疫沈降した後に抗ＲＯＲ１抗体を用いたウェスタンブロッティング分析を行ったりすることによっても実施することができる。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出されるＲＯＲ１の自己リン酸化量が少なければ、試験化合物は、ＲＯＲ１の自己リン酸化を抑制する活性を有すると評価される。【0040】
本発明のスクリーニング方法の他の一つの態様は、ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物を、ＲＯＲ１とＥＧＦＲなどの受容体型チロシンキナーゼとの結合の抑制、ＲＯＲ１による他の受容体型チロシンキナーゼ同士の結合（例えば、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合）の抑制、及び、ＲＯＲ１によるＥｒｂＢ３などの受容体型チロシンキナーゼのリン酸化の抑制を指標に選択する方法である。【0041】
ＲＯＲ１とＥＧＦＲなどの他の受容体型チロシンキナーゼとの結合は、インビトロ結合アッセイ、例えば、精製したＲＯＲ１タンパク質またはその部分ペプチド（例えば、ＲＯＲ１タンパク質のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ））と、精製或いは細胞抽出液中の他の受容体型チロシンキナーゼを用いたＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、ＧＳＴプルダウンアッセイ、あるいは本実施例に記載の免疫沈降−ウェスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）法によって実施することができる。他の受容体型チロシンキナーゼがＥＧＦＲである場合の方法を例示すれば、試験化合物が添加されたバッファー中にて、Ｈｉｓ標識ＥＧＦＲと、ＧＳＴ標識ＲＯＲ１でコートしたアフィニティビーズとを接触させて洗浄した後、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を用いてＲＯＲ１に結合したＥＧＦＲを検出する。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出されるＥＧＦＲの量が少なければ、試験化合物は、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの結合を抑制する活性を有すると評価される。その他、例えば、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴法を利用した方法などを用いることもできる。【0042】
ＲＯＲ１による他の受容体型チロシンキナーゼのリン酸化の検出は、上記ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃのリン酸化の検出の場合と同様に、インビトロキナーゼアッセイや抗リン酸化ＥｒｂＢ３抗体などを用いたウェスタンブロッティング分析により実施することができる。【0043】
本方法に用いられるＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ３などは、完全なタンパク質である必要はない。ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ３などの由来する生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに制限されない。【0044】
本発明に用いるＥＧＦＲの典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００５２１９（ＮＭ＿００５２２８）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられ、マウス由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿９９７５３８（ＮＭ＿２０７６５５）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられる。【0045】
また、本発明に用いるＥｒｂＢ３の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００１９７３（ＮＭ＿００１９８２）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられ、マウス由来のものであれば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３４２８３（ＮＭ＿０１０１５３）で特定されるタンパク質（遺伝子）が挙げられる。【0046】
本発明のスクリーニング方法の他の一つの態様は、ＲＯＲ１の機能を抑制する化合物を、ＲＯＲ１遺伝子の発現の抑制を指標に選択する方法である。当該方法としては、例えば、ＲＯＲ１遺伝子の発現を検出しうる系（例えば、ＲＯＲ１遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液）を提供する工程、当該系に試験化合物を接触させ、前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、前記発現を抑制する化合物を選択する工程を含む方法が挙げられる。ここで「機能的に結合した」とは、ＲＯＲ１遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＲＯＲ１遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。【0047】
この方法は、例えば、本実施例に記載のルシフェラーゼレポーターアッセイによって実施することができる。具体的には、ＴＴＦ−１遺伝子を導入して恒常的に発現させたＨＰＬ１Ｄ細胞に、ＲＯＲ１のプロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子が結合されたベクターを導入し、当該細胞に試験化合物を作用させ、ルシフェラーゼ活性を測定する。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出されるルシフェラーゼ活性が低ければ、試験化合物は、ＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制する活性を有すると評価される。【0048】
ＲＯＲ１遺伝子の発現を検出しうる系を利用する態様としては、上記レポーター系を利用する方法以外に、直接的に、ＲＯＲ１遺伝子の発現を検出する方法も本発明において利用可能である。当該方法としては、ＲＯＲ１遺伝子を発現する細胞に試験化合物を接触させる工程、前記細胞におけるＲＯＲ１遺伝子の発現を検出する工程、および前記発現を抑制する化合物を選択する工程を含む方法が挙げられる。このような方法としては、転写レベルの遺伝子発現を検出する場合には、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ドットブロット法などが挙げられ、翻訳レベルの遺伝子発現を検出する場合には、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、イムノブロッティング法、免疫沈降法などが挙げられる。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出されるＲＯＲ１遺伝子の発現が低ければ、試験化合物は、ＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制する活性を有すると評価される。【0049】
上記スクリーニング方法により選択された化合物は、薬理学上許容される担体または媒体と混合することにより、受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制するための薬剤を製造することができる。従って、本発明は、受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制するための薬剤を製造する方法であって、上記スクリーニング方法により選択された化合物を薬理学上許容される担体または媒体と混合する工程を含む方法を提供する。該担体または媒体としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体または媒体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。【0050】
また、本発明は、ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物を有効成分とする、受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制するための薬剤を提供する。ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物としては、例えば、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃに代表される下流のシグナル伝達分子との結合を抑制する活性を有する化合物、ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃなどの基質のリン酸化を抑制する活性を有する化合物、ＲＯＲ１の自己リン酸化を抑制する活性を有する化合物、ＲＯＲ１とＥＧＦＲなどの他の受容体型チロシンキナーゼとの結合を抑制する活性を有する化合物、ＲＯＲ１による他の受容体型チロシンキナーゼ同士の結合（例えば、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との結合）を抑制する活性を有する化合物、ＲＯＲ１によるＥｒｂＢ３などの他の受容体型チロシンキナーゼのリン酸化を抑制する活性を有する化合物、またはＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制する活性を有する化合物が挙げられる。【0051】
ＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物としては、具体的には、抗ＲＯＲ１タンパク質抗体、ＲＯＲ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、ＲＯＲ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、ＲＯＲ１タンパク質に結合する低分子化合物などが挙げられる。【0052】
抗ＲＯＲ１タンパク質抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ＲＯＲ１タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。【0053】
また、抗ＲＯＲ１タンパク質抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を治療薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。【0054】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，２５５−２５８、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１３，６５−９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９１，２２２，５８１−５９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１５，１４６−１５６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：７２２−７２７、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。【0055】
また、抗ＲＯＲ１タンパク質抗体には、望ましい活性を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、さらに、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原への結合活性（アフィニティー）が高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。【0056】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。抗原への結合活性は、例えば、フローサイトメーター、ＥＬＩＳＡ，ウェスタンブロッティング、免疫沈降法等を用いて解析することにより評価することができる。【0057】
さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。【0058】
抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入または欠失などの公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。【0059】
抗ＲＯＲ１タンパク質抗体は、癌の治療に用いる場合には、細胞傷害剤などの癌の治療のための物質が結合されていてもよい。このような抗体を用いることにより、いわゆるミサイル療法を行うことが可能である。【0060】
ＲＯＲ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡとしては、ＲＯＲ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）または該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。また、かかるｄｓＲＮＡは、その一部又は全部において、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ペプチド核酸）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、架橋化核酸）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、グリセロール核酸）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、トレオ―ス核酸）等の人工核酸によって、ＲＮＡが置換されているものであってもよい。【0061】
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡおよび該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作製することができる。【0062】
ｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。【0063】
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３’末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。【0064】
また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。なお、上記ｄｓＲＮＡは、当業者であればそれぞれの鎖を化学合成して調製することも可能である。【0065】
本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｐｉｎ ＲＮＡ）が好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。また、ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがスぺーサー配列を配置した１本鎖のＲＮＡであり、細胞内等でセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとの間で水素結合が生じ、スぺーサー配列がヘアピン構造となるもので、該ヘアピン構造が細胞内で切断されることにより、ｓｉＲＮＡとなり得るものを意味する。【0066】
さらに、標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。【0067】
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。ｄｓＲＮＡとしては、本実施例に記載のｓｉＲＮＡが特に好ましい。【0068】
本発明における「ＲＯＲ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」の他の態様としては、ＲＯＲ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）やＲＯＲ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ（リボザイム）をコードするＤＮＡも挙げられる。【0069】
また、本発明におけるＲＯＲ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドは、例えば、チロシンキナーゼ活性が消失するように改変されたＲＯＲ１タンパク質またはその部分ペプチド、ＲＯＲ１とＳｒｃに代表される下流分子との結合や当該下流分子の活性化を妨げるように改変されたＲＯＲ１タンパク質またはその部分ペプチド、ＲＯＲ１とＥＧＦＲに代表される受容体型チロシンキナーゼとの結合やその活性化を妨げるように改変されたＲＯＲ１タンパク質またはその部分ペプチド（例えば、ＲＯＲ１タンパク質のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ））、或いは、基質や他の受容体型チロシンキナーゼとの結合に関して、ＲＯＲ１上の結合部位と競合するようなタンパク質或いはペプチドとして調製することができる。【0070】
また、本発明におけるＲＯＲ１タンパク質に結合する低分子化合物は、例えば、低分子化合物のライブラリーなどから上記本発明のスクリーニングにより同定し、当業者に公知の合成法により調製することができる。【0071】
本発明の薬剤は、有効成分としてのＲＯＲ１の機能を抑制する活性を有する化合物に加え、他の成分を含むことができる。他の成分としては、例えば、上記の薬理学上許容される担体または媒体が挙げられる。【実施例】
【0072】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【0073】
＜材料と方法＞（１） 細胞株と試薬
ヒト肺腺癌細胞株、ＮＣＩ−Ｈ１９７５，ＮＣＩ−Ｈ８２０、ＰＣ−９、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ４４１、及びＮＣＩ−Ｈ２３は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。ＳＫ−ＬＣ−５、及びＳＫ−ＬＵ−１細胞株は、Ｌｌｏｙｄ Ｊ．Ｏｌｄ（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター）から提供を受けた。そして、これらの細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により維持した。また、不死化肺上皮細胞株 ＨＰＬ１Ｄは「Ｍａｓｕｄａ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９９７年、５７巻、４８９８〜４９０４ページ」の記載の方法に沿って維持した。
【0074】
ゲフィチニブはＢｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ＆ＣｏＫＧから購入し、組み換えＥＧＦ、組み換えＨＧＦは、Ｓｉｇｍａ社、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から各々入手した。【0075】
下記抗体は、各々下記会社から購入した。ａｎｔｉ−ＲＯＲ１（＃４１０２）、ａｎｔｉ−ｃ−Ｓｒｃ（３６Ｄ１０，＃２１０９）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｃ−Ｓｒｃ（Ｙ４１６，＃２１０１）、ａｎｔｉ−ＰＴＥＮ（１３８Ｇ６，＃９５５９）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＴＥＮ（Ｓ３８０／Ｔ３８２／Ｔ３８３，＃９５５４）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｔ３０８，Ｃ３１Ｅ５Ｅ，＃２９６５）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓ４７３，＃９２７１）、ａｎｔｉ−ＦＯＸＯ１（Ｃ２９Ｈ４，＃２８８０）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＦＯＸＯ１（Ｓ２５６，＃９４６１）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８（Ｔ１８０／Ｙ１８２，＃９２１１）、ａｎｔｉ−ｃａｓｐａｓｅ−３（＃９６６２）、及びａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥｒｂＢ３（Ｙ１２８９，＃４７９１）は、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
ａｎｔｉ−ＴＴＦ−１（８Ｇ７Ｇ３／１，Ｍ３５７５）はＤＡＫＯ社から購入した。
ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｔ５１９２）はＳｉｇｍａ社から購入した。
ａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃ（９Ｅ１０，ｓｃ−４０）、ａｎｔｉ−Ｔｙｒ（ＰＹ２０，ｓｃ−５０８）、ａｎｔｉ−ＥｒｂＢ３（ｃ−１７，ｓｃ−２８５）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
ａｎｔｉ−ＧＳＴ（３Ｂ２，Ｍ０７１−３）はＭＢＬ社から購入した。
ａｎｔｉ−ＲＯＲ１（ＴＡ３０２１９３）はＯｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。
ａｎｔｉ−ＰＩ３Ｋ（ｐ８５）（０６−４９７）はＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社から購入した。
ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、及びａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
【0076】
（２） コンストラクトヒトＴＴＦ−１全長ｃＤＮＡをｐＣＭＶ−ｐｕｒｏにて発現させるためのコンストラクト、及び、ＴＴＦ−１発現に対する二重鎖ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をｐＨ１ＲＮＡｎｅｏにて発現させるためのコンストラクトは、「Ｔａｎａｋａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００７年、６７巻、６００７〜６０１１ページ」の記載に沿って構築した。
【0077】
また、ヒトＲＯＲ１全長ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）はｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。さらに、ｍｙｃ標識ＲＯＲ１発現ベクター（ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ｍｙｃ）を作製した。【0078】
また、ヒトＥＧＦＲ全長ｃＤＮＡ（ＲＩＫＥＮ）はｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＥＧＦＲ）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。【0079】
ｐＮｅｏ−ＭＳＶ−ｃ−Ｓｒｃ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ（ＷＴ）、ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｅ（ＣＡ）、及びｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ（ＫＤ）は、Ｄｒ．Ｔｏｎｙ Ｈｕｎｔｅｒ（ソーク研究所）から提供を受け、これらの挿入物をｐＣＭＶｐｕｒｏベクターに導入した。【0080】
また、ｐＲＣ−ＣＭＶ−ｃ−Ｓｒｃ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（ＷＴ）、Δ１５−８４（Δ１５）、Δ９０−１４４（Δ９０）、及びΔ１５０−２４６（Δ１５０）は、Ｄｒ．Ｓａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｔｔｉｌ（カリフォルニア大学サンディエゴ校）から提供を受けた。【0081】
また、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＮ−ｍｙｃおよびｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＣ−ｍｙｃは制限酵素を用いた分子生物学的手法により作製した。【0082】
さらに、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＩｇ−ｍｙｃ、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＣＲＤ−ｍｙｃ、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＫｒｉｎｇｌｅ−ｍｙｃ、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＩｇ＋ＣＲＤ−ｍｙｃ、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＣＲＤ＋Ｋｒｉｎｇｌｅ−ｍｙｃ、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＩｇ＋ＣＲＤ＋Ｋｒｉｎｇｌｅ−ｍｙｃについては、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。以下に、各々の作製に用いたプライマーを示す。ΔＩｇフォワードプライマー：５’−ＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＴＴＧＴ−３’（配列番号：１）、
ΔＩｇリバースプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＧＧＴＴＣＡ−３’（配列番号：２）、
ΔＣＲＤフォワードプライマー：５’−ＡＴＣＣＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号：３）、
ΔＣＲＤリバースプライマー：５’−ＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴ−３’（配列番号：４）、
ΔＫｒｉｎｇｌｅフォワードプライマー：５’−ＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡ−３’（配列番号：５）、
ΔＫｒｉｎｇｌｅリバースプライマー：５’−ＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＴ−３’（配列番号：６）。
【0083】
（３） マイクロアレイ分析ＨＰＬ１Ｄ−ＴＴＦ−１恒常発現細胞（ｓｔａｂｌｅ ｃｌｏｎｅ）、及びＨＰＬ１Ｄ−ＶＣ ｓｔａｂｌｅ ｃｌｏｎｅは、ＦｕＧＥＮＥ６（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＰＬ１Ｄ細胞株に遺伝子導入を行い、ピューロマイシンで処理後、各々の恒常性発現細胞を樹立した。
【0084】
ＨＰＬ１Ｄ−ＴＴＦ−１恒常発現細胞、及びＨＰＬ１Ｄ−ＶＣ ｓｔａｂｌｅ ｃｌｏｎｅからＲＮＡを抽出し、低ＲＮＡ蛍光線形増幅キット（ｌｏｗ ＲＮＡ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、そのメーカーの使用説明書に従ってｃＲＮＡを作製し、Ｃｙ３又はＣｙ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で標識化した。【0085】
標識化ｃＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ４４Ｋヒト全ゲノムマイクロアレイにハイブリダイズし、次いでＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に供した。なお、発現プロファイリング分析は２回行った。【0086】
（４） ウェスタンブロッティング分析、及び免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析ウェスタンブロッティング分析、及び免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）及び化学発光増強システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、標準的な方法により施行した。ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃの生理的な結合を確認するために、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１を単独発現あるいは、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（ＷＴ）、Δ１５−８４（Δ１５）、Δ９０−１４４（Δ９０）、及びΔ１５０−２４６（Δ１５０）といった様々なｃ−Ｓｒｃ発現コンストラクトとともに共発現を行った。これらはトランスフェクション後２４時間で細胞を回収し、免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析を行った。また、ＨＰＬ１Ｄ細胞にｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−ＴＴＦ−１を一過性に発現させ、ウェスタンブロッティング解析によるＲＯＲ１発現誘導の確認を行った。
【0087】
ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの生理的な結合を確認するために、ｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−ＥＧＦＲと共に、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＶＣ、ｐＩＲＥＳ２ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＷＴ、ΔＮ、ΔＣ、ΔＩｇ、ΔＣＲＤ、ΔＫｒｉｎｇｌｅ、ΔＩｇ＋ＣＲＤ、ΔＣＲＤ＋Ｋｒｉｎｇｌｅ、又はΔＩｇ＋ＣＲＤ＋Ｋｒｉｎｇｌｅといった様々なＲＯＲ1欠損変異体発現コンストラクトとの共発現を行った。これらはトランスフェクション後２４時間で培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ：ウシ胎児血清）を含まない培養液に置換し、さらに２４時間培養した。その後、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで処理したのち、細胞を回収し、免疫沈降−ウェスタンブロッティング分析を行った。【0088】
（５） 免疫蛍光染色標準的な免疫蛍光染色法により施した細胞は、ＬＳＭ５ Ｐａｓｃａｌ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて観察した。
【0089】
（６） ルシフェラーゼレポーターアッセイＲＯＲ１ルシフェラーゼレポーターコンストラクトは、ｐＧＬ４ペーシックレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と、ＲＯＲ１のプロモータ−領域 １．０−ｋｂ ゲノム断片を増幅したＰＣＲ産物とを用いて、作製した。なお、ルシフェラーゼレポーター活性の検出は「Ｏｓａｄａ，Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００１年、６１巻、８３３１〜８３３９ページ」の記載に沿って行った。また、ルシフェラーゼレポーター活性は、デュアルレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。また、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に基づき、ホタルルシフェラーゼ活性を標準化した。
【0090】
（７） クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイＳＫ−ＬＣ−５細胞を１％ホルムアミドでクロスリンクした後、回収し、クロマチンを超音波処理により平均５００〜６００ｂｐのなるようせん断した。そして、ＴＴＦ−１特異的抗体を用いて免疫沈降を行った。そして、リバースクロスリンクをした後、免疫沈降して得られたクロマチンをＲＯＲ１のプロモータ−領域を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲに供した。なお、これらのプライマーは下記の通りである。
フォワードプライマー：５’−ＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号：７）
リバースプライマー：５’−ＣＣＣＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＴ−３’（配列番号：８）。
【0091】
（８） ヒトＲＯＲ１、ＴＴＦ−１、及びＰＴＥＮに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ＲＮＡｉを行うため、下記ＲＮＡオリゴマーをＱＩＡＧＥＮ社及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。
５’−ＣＡＧＣＡＡＵＧＧＡＵＧＧＡＡＵＵＵＣＡＡ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃１（配列番号：９）
５’−ＣＣＣＡＧＵＧＡＧＵＡＡＵＣＵＣＡＧＵ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃２（配列番号：１０）
５’−ＣＣＣＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＡＡＣＵＧＵ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃３（配列番号：１１）
５’−ＧＵＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＵＡＣＣＡＣＡ−３’：ｓｉＴＴＦ−１＃１（配列番号：１２）
５’−ＣＧＣＣＧＵＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＵ−３’：ｓｉＴＴＦ−１＃２（配列番号：１３）
５’−ＡＡＧＧＣＧＵＡＵＡＣＡＧＧＡＡＣＡＡＵＡ−３’：ｓｉＰＴＥＮ（配列番号：１４）
また、ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒ）はＱＩＡＧＥＮ社から入手した。
【0092】
ｓｉＲＮＡ（各々２０ｎＭ）のトランスフェクションは、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、そのメーカーの使用説明書に従って行った。そして、細胞は、ウェスタンブロッティング分析のため、トランスフェクションをしてから７２時間後に回収した。【0093】
また、細胞増殖及びアポトーシス誘導は、テトラカラーワン比色アッセイキット（ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ Ｏｎｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｏｒｉｃ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、生化学工業株式会社製）及びＩｎ Ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ社製）を各々用いて、トランスフェクションをしてから５日後に測定した。【0094】
（９） ＲＯＲ１と、ＴＴＦ−１及びｃ−Ｓｒｃとの機能的相互作用解析ＴＴＦ−１の発現を抑制させた肺腺癌細胞における内因性のＲＯＲ１の発現効果を解析するために、ＮＣＩ−Ｈ３５８にｐＨ１ＲＮＡｎｅｏ−ｓｈＴＴＦ−１とｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１を１：４の割合でトランスフェクションを行い、ネオマイシンで２週間処理させた後、コロニー数を測定した。次に、ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃの機能的相互関係を調べるために、野生型ｃ−Ｓｒｃ（ＷＴ）発現ｐＣＭＶｐｕｒｏベクター、又は恒常活性型ｃ−Ｓｒｃ（ＣＡ）発現ｐＣＭＶｐｕｒｏベクターをＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞に導入し、ピューロマイシンで３日間処理させた後、さらにＲＯＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入した。ｓｉＲＮＡを導入してから７２時間後、ウェスタンブロッティング分析のため、細胞を回収した。またｓｉＲＮＡを導入してから５日後に、ＭＴＴアッセイを行った。
【0095】
（１０） インビボ造腫瘍性試験１．０×１０７個のＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞を、８週齢の胸腺欠損ヌードマウス（日本エスエルシー株式会社製）の脇腹下の方の皮下に接種した。接種してから１週間後、１ｎｍｏｌ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＯＲ１＃１、＃２、及び＃３）と２００μｌアテロコラーゲン（Ｋｏｋｅｎ社製）とを混合し、平均５０ｍｍ３の体積を有する腫瘍に注入した。ｓｉＲＮＡを注入してから２週間後、腫瘍の重さを量り、データの平均値±標準誤差（ＳＥ）（ｎ＝７）を求めた。
【0096】
ＲＯＲ１恒常発現株（ｓｔａｂｌｅ ＲＯＲ１ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を用いたインビボ造腫瘍性アッセイは、ＲＯＲ１が恒常的に発現しているＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞あるいは空ベクターが導入されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を１．０×１０７個、同様に８週齢の胸腺欠損ヌードマウス（日本エスエルシー株式会社製）の脇腹下の方の皮下に接種した。このケースにおいて、接種してから３週間後、腫瘍の重さを量り、データの平均値±標準誤差（ＳＥ）（ｎ＝５）を求めた。さらに、腫瘍における種々のタンパク質の発現をウェスタンブロッティングによって分析した。なお、全ての動物実験は、名古屋大学の動物実験に関する規則に従って行った。【0097】
（１１） ＲＯＲ１抑制と、ＥＧＦ、ＨＧＦ、及びゲフィチニブとの併用効果ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞、及びＳＫ−ＬＣ−５細胞を２０ｎＭのｓｉＲＯＲ１又はｓｉＳｃｒで２日間処理し、２４時間の血清飢餓状態ののち、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦで処理し、これらの細胞をウェスタンブロッティング及び免疫蛍光染色による分析に供した。
【0098】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞、及びＮＣＩ−Ｈ８２０細胞は２０ｎＭのｓｉＲＯＲ１又はｓｉＳｃｒで３日間処理し、１μＭ ゲフィチニブで６時間処理したのち、細胞を回収しウェスタンブロッティング分析を行った。また、これらの細胞のＭＴＴアッセイについては、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、４日間１μＭ ゲフィチニブで処理を行い、測定を行った。【0099】
同様に、ｓｉＲＮＡを導入して３日間培養したＰＣ９細胞は、１μＭ ゲフィチニブ及び／又は５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦにて、６時間処理し、ウェスタンブロッティング分析のために細胞を回収した。また、これらの細胞のＭＴＴアッセイについては、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、４日間１μＭ ゲフィチニブ及び／又は５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦで処理を行い、測定を行った。【0100】
（１２） 組み換えタンパク質の調製ＧＳＴ標識ＲＯＲ１（細胞内ドメイン）を、Ｇａｔｅｗａｙシステムを用いてＳｆ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、そのメーカーの使用説明書に従い、発現させた。そして、組み換えＧＳＴ標識ＲＯＲ１タンパク質を、グルタチオン−アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。Ｈｉｓ標識ｃ−Ｓｒｃタンパク質及びＧＳＴタンパク質は、各々Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社及びＡｂｎｏｖａ社より購入した。ｃ−ＳｒｃのＧＳＴ標識ＳＨ２領域及びＧＳＴ標識ＳＨ３領域の組み換えタンパク質は、各々Ｍａｒｌｉｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社及びＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手した。
【0101】
（１３） ＧＳＴプルダウンアッセイ２０ｍＭ ＭＯＰＳ［ｐＨ７．２］、１ｍＭ ジチオスレイトール、５ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、及び７５ｍＭ ＭｇＣｌ２からなるバッファー中にて、精製Ｈｉｓ標識ｃ−Ｓｒｃと、組み換えＧＳＴ又は組み換えＧＳＴ標識ＲＯＲ１が結合したアフィニティビーズを混合した。次いで、ビーズを洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解した。この溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いでａｎｔｉ−ＧＳＴ又はａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロッティング分析に供した。
【0102】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の細胞抽出液を、組み換えＧＳＴ標識ＳＨ２領域及びＧＳＴ標識ＳＨ３領域の組み換えｃ−Ｓｒｃタンパク質が結合したアフィニティビーズと混合した。数回洗浄した後、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解した。この溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いでａｎｔｉ−ＧＳＴ又はａｎｔｉ−ＲＯＲ１抗体を用いたウェスタンブロッティング分析に供した。【0103】
（１４） インビトロキナーゼアッセイＮＣＩ−Ｈ２３細胞、２９３Ｔ細胞の抽出液を用いてｃ−Ｓｒｃの免疫沈降を行い、免疫沈降物を３０℃にて１時間、リン酸化バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＡＴＰ）中にて、ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＲＯＲ１とともにインキュベーションし、次いでａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｃ−Ｓｒｃ抗体を用いたウェスタンブロッティング分析に供した。
【0104】
また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＫＤ−ｃ−Ｓｒｃをトランスフェクションし、ピューロマイシンで５日間処理した細胞を用いて、ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ ｃ−Ｓｒｃを免疫沈降し、ＲＯＲ１キナーゼアッセイのための基質として使用した。【0105】
（実施例１）＜ＴＴＦ−１の系譜特異的生存シグナルに関与するＲＯＲ１の同定＞
ヒトＲＯＲ１遺伝子のプロモーターの１．０−ｋｂ近傍領域を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイによってＴＴＦ−１依存的な活性化であることが示され（図１のａ）、クロマチン免疫沈降アッセイによって、ＲＯＲ１遺伝子のプロモーターにＴＴＦ−１が直接結合することが明らかになり（図１のｂ）、かかる結果から、ＲＯＲ１はＴＴＦ−１の転写標的であることが示された。
【0106】
（実施例２）＜ＲＯＲ１の発現抑性又は発現亢進による肺腺癌細胞の増殖への影響に関する検証＞
アテロコラーゲンを用いたＲＯＲ１ ｓｉＲＮＡ腫瘍内投与による、インビボ治療によって、ＮＣＩ−Ｈ１９７５の異種移植腫瘍の成長は有意に低下した（図２のａ）。
【0107】
また、ショートヘアピンＴＴＦ−１（ｓｈＴＴＦ−１）の発現によってかなりの程度抑制されていたＴＴＦ−１＋／ＲＯＲ１＋ ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞の増殖は、ＲＯＲ１を共発現させることによって有意に回復した（図２のｂ）。このことから、ＴＴＦ−１によって誘導されるＲＯＲ１は、ＴＴＦ−１の生存シグナルの下流において極めて重要なメディエイターであることが示唆される。【0108】
さらに、ＲＯＲ１をＮＣＩ−Ｈ３５８細胞と同程度に外来的に発現させることによって、ＲＯＲ１陰性ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞のインビボにおける異種移植腫瘍の成長は増強された（図２のｃ）。【0109】
（実施例３）＜ＲＯＲ１が介するシグナル伝達における下流分子の同定＞
次に、ＲＯＲ１が介するシグナル伝達の解明のため、潜在的な下流分子の分析をウェスタンブロッティング分析により行った。
【0110】
ＲＯＲ１抑制によってｃ−Ｓｒｃ、ＰＴＥＮ、ＡＫＴ、及びＦＯＸＯ１のリン酸化が低下し、逆にｐ３８のリン酸化が亢進した（図３のa）。一方、ＲＯＲ１を導入したＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞由来の異種移植腫瘍においては逆の効果が観察された（図３のｂ）。【0111】
これらの知見は、発癌シグナル伝達を急に阻害することによって、生存促進性シグナルとアポトーシス促進性シグナルとのバランスが悪くなり、結果として細胞死に至るという「癌遺伝子ショック」モデルと合致する。【0112】
このように、ＲＯＲ１陽性肺腺癌細胞株はＲＯＲ１が介する生存シグナルに依存しており、これが阻害されるとアポトーシス反応が順々に誘発されることになる。【0113】
（実施例４）＜ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃを介した生存シグナルの検証＞
また、ＲＯＲ１をノックダウンした細胞又はＲＯＲ１が過剰発現している細胞において、ｃ−Ｓｒｃの４１６番目のチロシンのリン酸化が増加しているということに注目し、恒常活性型ｃ−ＳｒｃをＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞に導入し、ＲＯＲ１抑制が誘導するリン酸化、並びに細胞の増殖抑制がどのように変化するかを調べた。結果、恒常活性型ｃ−Ｓｒｃが導入されることによって、ＲＯＲ１抑制が誘導するＰＴＥＮ及びＡＫＴのリン酸化状態の変化、並びＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖抑制が顕著に低下することが示され（図４のａ）、肺腺癌におけるＲＯＲ１が介する生存シグナル伝達の少なくとも一部にｃ−Ｓｒｃが関与していることが示唆された。
【0114】
次に、ＲＯＲ１がｃ−Ｓｒｃを制御するメカニズムを解明するために、ＲＯＲ１がｃ−Ｓｒｃに結合するかどうかを調べた。結果、ＣＯＳ７細胞に外来的に導入したｃ−ＳｒｃとＲＯＲ１との間の相互作用（図４のｂ）、及び２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしたＲＯＲ１と内因性ｃ−Ｓｒｃとの相互作用ははっきりと証明された（図４のｃ）。また、精製ＲＯＲ１タンパク質及びｃ−Ｓｒｃタンパク質を用いたインビトロプルダウンアッセイによって、それらの直接的な相互作用が示された（図４のｄ）。さらに、免疫沈降−ウェスタンブロッティング（ＩＰ−ＷＢ）分析によって、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において、内在性ＲＯＲ１とｃ−Ｓｒｃとが相互作用していることが確認された（図４のｅ）。また、種々のｃ−Ｓｒｃ欠失変異体を用いたＩＰ−ＷＢ分析によって、ＲＯＲ１とｃ−ＳｒｃのＳＨ３ドメインとが結合することが明らかになった（図４のｆ）。さらに、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の溶解液を用いたＧＳＴプルダウンアッセイによって、内在性ＲＯＲ１とｃ−ＳｒｃのＳＨ３ドメインとが相互作用することも明らかになった（図４のｇ）。【0115】
（実施例５）＜ＲＯＲ１によるｃ−Ｓｒｃリン酸化に関する検証＞
次にｃ−ＳｒｃはＲＯＲ１によってリン酸化されるかどうかを調べた。すなわち、インビトロＲＯＲ１キナーゼアッセイを、ｃ−Ｓｒｃを基質として用いて、ＮＣＩ−Ｈ２３及び２９３Ｔ細胞の細胞溶解液からｃ−Ｓｒｃを免疫沈降することによって調べた結果、ＲＯＲ１によってｃ−Ｓｒｃはリン酸化されることが明らかになった（図５のａ（ＮＣＩ−Ｈ２３細胞）及び図５のｂ（２９３Ｔ細胞））。
【0116】
さらに、キナーゼ死型のｃ−Ｓｒｃ（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｓｒｃ−ＫＤ）を発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、かかるｃ−Ｓｒｃのリン酸化がｃ−Ｓｒｃの自己リン酸化反応に依るものでないということを確認した。なお、ｃ−Ｓｒｃ−ＫＤは自己リン酸化能がない基質である（図５のｃ）。【0117】
（実施例６）＜ＲＯＲ１による生存シグナルとしてのｃ−Ｓｒｃを介したＰＴＥＮ制御に関する検証＞
ｃ−ＳｒｃはＰＴＥＮをリン酸化することでＰＴＥＮの不活化を誘導することが知られている。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において、ＰＴＥＮを同時に抑制することによって、ＲＯＲ１抑制が誘導するＡＫＴリン酸化への影響、並びにその結果として生じる増殖抑制が大体解消されることが明らかになった（図６）。
【0118】
従って、ＲＯＲ１はｃ−Ｓｒｃに結合し、ｃ−Ｓｒｃをリン酸化すること、並びにｃ−Ｓｒｃは肺腺癌におけるＲＯＲ１−ｃ−Ｓｒｃ−ＰＴＥＮ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ軸を介した生存促進性シグナルの調節に、非常に重要な役割を担っていることが明らかになった。【0119】
（実施例７）＜ＲＯＲ１とＥｒｂＢファミリーとのクロストークについての検証＞
ＥｒｂＢファミリー、特にＥＧＦＲやＥｒｂＢ３が肺癌の生存・増殖において重要な役割を担っていることは良く理解されている。また、最近、受容体型チロシンキナーゼ間におけるクロストークが重要視されており、受容体同士は細胞膜上で非常に近傍に存在し、連絡し合うことで、生存促進性シグナルを担っていると考えられている。そこで、免疫沈降−ウェスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）法により分析した結果、ＥＧＦ刺激下においてＲＯＲ１とＥＧＦＲとは結合することが明らかになった。また、その両者の相互作用はＲＯＲ1の細胞外領域を介して結合していることを見出した（図７のａ）。さらに、詳細なＲＯＲ1の結合領域の検討により、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとは、ＲＯＲ１の細胞外領域に存在するシステインリッチドメインを介して相互作用していることも明らかとなった（図７のｂ）。また、ＲＯＲ１を導入したＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を用いて、内因性のＲＯＲ１とＥＧＦＲとの結合を免疫沈降−ウェスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）法により互いの結合を検出した（図７のｃ）。さらに、ＲＯＲ１の発現を抑制した肺腺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いたＩＰ−ＷＢ分析によって検討したところ、ＲＯＲ１の抑制によって、内因性ＥＧＦＲと、ヘテロ二量体を形成して生存促進性シグナルを伝達するＥＧＦＲの重要なパートナー分子のＥｒｂＢ３との結合が阻害されることが明らかとなった（図７のｄ）。また、肺腺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５においてＲＯＲ１の発現を抑制すると、ＥＧＦ刺激によって生じて生存促進性シグナルを伝えるＥｒｂＢ３の活性化状態を反映するリン酸化の著明な低下が確認された（図７のｅ）。さらに、ＲＯＲ１の発現を抑制した肺腺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５において、ＥｒｂＢ３とＥｒｂＢ３のリン酸化部位を認識して結合して生存促進性シグナルを伝達するＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットとの結合を調べたところ、ＥｒｂＢ３とｐ８５の結合の低下が明らかとなった（図７のｆ）。また、ＲＯＲ１を導入したＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞由来の異種移植腫瘍においてはＥｒｂＢ３のリン酸化反応の増加が観察された（図７のｇ）。
【0120】
したがって、ＲＯＲ１は、ＥＧＦＲなどの受容体型チロシンキナーゼと結合することによって、その生存促進性シグナル伝達に重要な受容体型チロシンキナーゼ間の結合やリン酸化、さらには、その下流のシグナル伝達因子の結合等に重要な役割を担っており、受容体型チロシンキナーゼによる生存促進性シグナルの伝達に必要であることが明らかとなった。【0121】
（実施例８）＜ＥＧＦＲが介するシグナル伝達とＲＯＲ１との関連性についての検証＞
ＥＧＦＲが介するシグナル伝達が肺癌の成長において重要な役割を担っていることは良く理解されている。そこで、次にＥＧＦＲが介するシグナル伝達とＲＯＲ１との関連性を調べた。その結果、ＥＧＦによって誘導されるｃ−Ｓｒｃ、ＡＫＴ、及びＦＯＸＯ１のリン酸化は、ＲＯＲ１抑制によって顕著に阻害されることが明らかになった（図８のａ）。
【0122】
さらに、ＥＧＦの有無に関わらず、ＲＯＲ１が抑制されたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において、ＡＫＴによって不活化される下流分子であり、アポトーシス促進因子であるＦＯＸＯ１の核内繋留（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）が誘導され、それゆえアポトーシスの活性化が誘発されることが明らかになった（図８のｂ）。【0123】
従って、ＲＯＲ１抑制によって誘導されるｐ３８リン酸化はＥＧＦ処理の影響を受けないことから、肺腺癌におけるＥＧＦＲが介する生存促進性シグナル伝達、及びアポトーシス促進性シグナル伝達の抑制に、持続的なＲＯＲ１の発現は必須であるということが示唆された。【0124】
（実施例９）＜ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤耐性の肺癌細胞におけるＲＯＲ１抑制の有効性に関する検証＞
ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞及びＮＣＩ−Ｈ８２０細胞は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を付与するＴ７９０Ｍ変異を合わせて有するＥＧＦＲ遺伝子の２重変異をもつ細胞株である。いずれの細胞株においても、ＥＧＦ添加によって生存促進性シグナルが強く惹起されるが、ＲＯＲ１抑制はそれを顕著に低下させ、アポトーシス促進性シグナルを惹起し、細胞増殖を顕著に抑制した。（図８のｃ）。
【0125】
また、ＭＥＴ受容体型チロシンキナーゼのリガンドであるＨＧＦの過剰発現や、ＭＥＴの遺伝子増幅によって、ＭＥＴの活性化が誘導されることにより、ＥＧＦＲからＭＥＴへと生存に関わる依存対象の切り換えが生じることによって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を獲得するという、さらなるメカニズムが最近報告されている(Ｙａｎｏ，Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００８年、６８巻、９４７９〜９４８７ページ；Ｔｕｒｋｅ，ＡＢら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２０１０年、１７巻、７７〜８８ページ)。そこで、ＨＧＦ／ＭＥＴとＲＯＲ１との関連性について調べた。【0126】
その結果、ＥＧＦＲ変異を有するＰＣ９肺腺癌細胞において、ＨＧＦ処理によりＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性が付与されるたが、一方、ＲＯＲ１抑制によって、ＭＥＴが伝達する生存促進性シグナルは抑性されることが明らかになった（図８のｄ）。【0127】
従って、ＲＯＲ１は、系譜特異的生存癌遺伝子ＴＴＦ−１の下流分子であり、ＥＧＦＲやＭＥＴといった他の受容体型チロシンキナーゼからの生存促進性シグナルを維持し、またアポトーシス促進性シグナルを抑制するうえでも必要とされることが明らかになった。さらに、このことはＲＯＲ１の抑制が、ＥＧＦＲやＭＥＴなどの受容体型チロシンキナーゼ阻害剤への耐性をもつ癌細胞の治療標的として極めて有用であることを示している。【産業上の利用可能性】
【0128】
上記の通り、本発明により、ＲＯＲ１の機能を抑制して、アポトーシス促進性シグナルを亢進させることのみならず、受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制することが可能となった。本発明によれば、ＲＯＲ１の機能を抑制することにより、ＥＧＦＲやＭＥＴなどの受容体型チロシンキナーゼに対する阻害剤に耐性を獲得している癌細胞の増殖を抑制することもできるため、本発明は、難治性癌も含む癌の治療薬の開発に大きく貢献しうるものである。【配列表フリーテキスト】
【0129】
配列番号１〜８＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの塩基配列
配列番号９〜１４
＜２２３＞ 人工的に合成されたオリゴヌクレオチドの配列
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]