特許 5883889 光線力学的診断剤、及び、フォトブリーチング防止剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5883889

(24)【登録日】2016年2月12日

(45)【発行日】2016年3月15日

(54)【発明の名称】光線力学的診断剤、及び、フォトブリーチング防止剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 49/00 20060101AFI20160301BHJP

【ＦＩ】

   A61K49/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2013-555254(P2013-555254)

(86)(22)【出願日】2013年1月22日

(86)【国際出願番号】JP2013051131

(87)【国際公開番号】WO2013111719

(87)【国際公開日】20130801

【審査請求日】2014年7月10日

(31)【優先権主張番号】特願2012-14135(P2012-14135)

(32)【優先日】2012年1月26日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】508123858

【氏名又は名称】ＳＢＩファーマ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(72)【発明者】

【氏名】石塚 昌宏

(72)【発明者】

【氏名】田中 徹

(72)【発明者】

【氏名】小倉 俊一郎

(72)【発明者】

【氏名】石井 琢也

【審査官】 小森 潔

(56)【参考文献】

【文献】 日本レーザー医学会誌，２０１１年，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．２，ｐ１４３−１４８

【文献】 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，２００８年，Ｖｏｌ．５５，ｐ２０−２６

【文献】 Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１９９８年，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．３，ｐ５１８−５２６

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８９年，Ｖｏｌ．１１７，Ｎｏ．１，ｐ９１−９７

【文献】 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７年，Ｖｏｌ．１６１，Ｎｏ．２，ｐ４４２−４５２

【文献】 Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２年，Ｖｏｌ．２１７，ｐ１２５２−１２５５

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ａ，２００７年，Ｖｏｌ．１１１，Ｎｏ．３，ｐ４２９−４４０

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ａ，２００４年，Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．２０，ｐ４３７８−４３８４

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／２２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

同時又は異時に投与するための、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類と、下記式（Ｉ）で示される化合物

【化1】

（式中、Ｒ^１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択され、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ、水酸基を表す。）
又はその塩とを含有する
ことを特徴とする、光線力学的診断剤であって、
ここで、前記ＡＬＡ類は、ＡＬＡまたはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、または、ＡＬＡペンチルエステルである、
光線力学的診断剤。

【請求項2】

下記式（Ｉ）で示される化合物

【化2】

（式中、Ｒ^１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択される基を表し、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ、水酸基を表す。）
又はその塩
を有効成分とする、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）のフォトブリーチング防止剤。

【請求項3】

プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）蓄積部位の検出方法であって、以下のステップ、
あらかじめＡＬＡ類、及び、下記式（Ｉ）で示される化合物

【化3】

（式中、Ｒ^１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択され、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ、水酸基を表す。）又はその塩
を同時又は異時に投与された対象に対し、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の励起光を照射するステップ、
プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の蛍光を検出するステップ
を含む
ことを特徴とする、検出方法であって、
ここで、前記ＡＬＡ類は、ＡＬＡまたはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、または、ＡＬＡペンチルエステルである、
検出方法。

【請求項4】

非ヒト動物用の光線力学的診断方法であって、以下のステップ、
対象に対して、ＡＬＡ類、及び、下記式（Ｉ）で示される化合物

【化4】

（式中、Ｒ^１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択され、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ、水酸基を表す。）又はその塩
を同時又は異時に投与するステップ、
対象に対して、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の励起光を照射するステップ、
プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の蛍光を検出するステップ、
検出されたプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の蛍光に基づき、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）蓄積部位を判定し、病変部の範囲を判断するステップ
を含む
ことを特徴とする、診断方法であって、
ここで、前記ＡＬＡ類は、ＡＬＡまたはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、または、ＡＬＡペンチルエステルである、
診断方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光線力学的診断剤、及び、フォトブリーチング防止剤に関する。さらに詳しくは、ポルフィリン類の前駆物質及び没食子酸類を含有する光線力学的診断剤に関する。また、本発明は、光線力学的診断に用いる検出方法、及び、光線力学的診断方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

化学の分野において、蛍光物質を用いた測定が種々行われている。また、バイオ、医薬、医療等の分野においても、細胞等を蛍光物質により染色し、蛍光顕微鏡下で観察することが行われている。これらの研究において、蛍光アッセイは重要な役割を果たしている。

【0003】

さらに、医療の分野において、近年、がん、イボ、ニキビのような疾患組織の診断方法として、光に反応する化合物（光増感剤）を投与し、光を照射することにより標的箇所の特定を行う光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、以下、ＰＤＤと略す）が注目されている。光線力学的診断（ＰＤＤ）は、例えば、ポルフィリン系光増感剤又はクロリン系光増感剤を患者に投与し、これを疾患組織に集積させ、波長４００ｎｍ付近の光を照射することによって蛍光発光させ、これを観察することにより、疾病の有無及び患部を特定する診断法である。光線力学的診断（ＰＤＤ）は、これまでの診断法と比較して、低侵襲で副作用が少ないため、患者に対する負担が少ないという利点がある。

【0004】

また、この光線力学的診断（ＰＤＤ）で用いる光増感剤として、ポルフィリン系光増感剤の投与に代えて、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与する方法も開発されている。５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）は、アミノ酸の一種であり植物の葉緑素や動物の血液中のヘムなどに必須なポルフィリン類の唯一の原料となる物質である。５−アミノレブリン酸は、動物においては、順に、ポルフォビリノーゲン、ヒドロキシメチルビラン、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩ、プロトポルフィリノーゲンＩＸ、プロトポルフィリンＩＸへと代謝され、プロトポルフィリンは鉄イオンを配位してヘムとなり、ヘムはグロビンと結合してヘモグロビンとなることが知られている。

【0005】

ポルフィリン類は、腫瘍細胞に取り込まれて蓄積されることが知られており、また、一方で、ＡＬＡ類は、腫瘍細胞に取り込まれて前記代謝経路を経て、プロトポルフィリンＩＸの状態で蓄積されることが知られている。いずれの投与にせよ、ポルフィリン類の蛍光を測定して腫瘍の部位を特定し、診断するものであることにかわりはない。

【0006】

しかしながら、光増感剤として用いられるポルフィリン類は、蛍光測定に際し、フォトブリーチング（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ、蛍光退色、蛍光褪色ともいう）を生じ、時間の経過とともに蛍光強度の減少が観察される。フォトブリーチングは、励起蛍光色素分子でまれにみられる化学反応である。この反応は、励起状態にある蛍光物質が基底状態に比べて化学的に活性化され不安定になるために起こる。この反応の結果、蛍光分子は最終的に低蛍光性の構造になる。たとえば、プロトポルフィリンＩＸ（以下、ＰｐＩＸと略す）では、６０秒で蛍光強度が１０分の１以下に低下するなど、非常に早く蛍光が減少してしまうため、蛍光による診断時間が短くなってしまうという問題があった。そこで、このフォトブリーチングを防止する方法が望まれていた。しかしながら、ポルフィリン類のフォトブリーチングを防止する方法はよく知られていなかった。

【0007】

なお、化学・バイオ等の分野でよく用いられる蛍光物質として、ＦＩＴＣが挙げられ、ＦＩＴＣの蛍光減少については、ｐ−パラフェニレンジアミン（ｐ−ｐａｒａｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、ＰＰＤという）、ｎ−プロピルガレート（ｎ−ｐｒｏｐｙｌｇａｌｌａｔｅ、ＮＰＧという）、または、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（１，４−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［２．２．２］ｏｃｔａｎｅ、ＤＡＢＣＯという）の３種類の化合物を用いて、蛍光減少の防止効果について検討された例がある（非特許文献１参照）。しかしながら、これらの化合物が、構造の全く異なる他の蛍光物質であるポルフィリン類に対しても同様の効果を発揮するか否かはわからなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｐ． Ｂｒｙｏｎ ｅｔ ａｌ．， "Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−ｆａｄｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ： Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｌａｓｅｒ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｔｕｄｙ"， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３， Ｖｏｌ．４１， Ｎｏ．１２， ｐ． １８３３−１８４０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、ポルフィリン類のフォトブリーチングを防止すること、ポルフィリン類のフォトブリーチング防止剤を用いて優れた光線力学的診断剤及び光線力学的診断方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、ポルフィリン類について、ポルフィリン類に光を照射すると、発生した活性酸素種により自己酸化され、分解される点に着目し、還元剤を用いると、ポルフィリン類の分解が阻害され、フォトブリーチングを防止する可能性があるという仮説を立てた。本発明者らは、驚くことに、没食子酸類には、ＰｐＩＸのフォトブリーチングを防止する優れた効果があることを見出した。これに対し、ＰＰＤ、ＤＡＢＣＯ、アスコルビン酸やトコフェロール等の還元剤では、全くまたはほとんど効果がなかった。さらに、本発明者らは、ポルフィリン類の前駆物質としてＡＬＡ類を用いた場合においても、没食子酸類を用いることにより、ＰｐＩＸのフォトブリーチングを防止する効果が得られることを見出した。

【0011】

すなわち、本発明は、同時又は異時に投与するためのポルフィリン類の前駆物質と没食子酸類とを含有する光線力学的診断剤に関する。

【0012】

本発明の光線力学的診断剤は、前記没食子酸類が没食子酸アルキルエステルまたはその塩である
ものであってもよい。

【0013】

本発明の光線力学的診断剤は、前記没食子酸類が、下記式（Ｉ）で示される化合物

【化1】

（式中、Ｒ^１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択され、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ、水酸基を表す。）
又はその塩である
ものであってもよい。

【0014】

本発明の光線力学的診断剤は、前記式（Ｉ）において
Ｒ^１が、メチル基、プロピル基、ブチル基、及び、オクチル基からなる群から選択される
ものであってもよい。

【0015】

本発明の光線力学的診断剤は、前記ポルフィリン類の前駆物質が、ＡＬＡ類である
ものであってもよい。

【0016】

本発明の光線力学的診断剤は、前記ＡＬＡ類が下記式（ＩＩ）で示される化合物

【化2】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
又はその塩である
ものであってもよい。

【0017】

本発明の光線力学的診断剤は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が、水素原子、炭素数１〜８のアルカノイル基、及び、炭素数７〜１４のアロイル基からなる群から選択され、
Ｒ^２が、水素原子、直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択される
ものであってもよい。

【0018】

本発明の光線力学的診断剤は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が、水素原子、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、及び、ブチリル基からなる群から選択され、
Ｒ^２が、水素原子、メチル、エチル、プロピル、ブチル、及び、ペンチル基からなる群から選択される
ものであってもよい。

【0019】

本発明の光線力学的診断剤は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が水素原子であり、
Ｒ^２が、水素原子、メチル、エチル、プロピル、ブチル、及び、ペンチル基からなる群から選択される
ものであってもよい。

【0020】

本発明の光線力学的診断剤は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が水素原子であり、
Ｒ^２が水素原子である
ものであってもよい。

【0021】

本発明の別の態様において、本発明は、下記式（Ｉ）で示される化合物

【化3】

（式中、Ｒ^１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択され、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ、水酸基を表す。）
又はその塩を有効成分とする、ポルフィリン類のフォトブリーチング防止剤に関する。

【0022】

本発明のフォトブリーチング防止剤は、
前記ポルフィリン類が、プロトポルフィリンIX、ウロポルフィリンI、ウロポルフィリンIII、コプロポルフィリンI、コプロポルフィリンIII、ヘプタカルボキシルポルフィリンI、ヘプタカルボキシルポルフィリンIII、ヘキサカルボキシルポルフィリンI、ヘキサカルボキシルポルフィリンIII、ペンタカルボキシルポルフィリンI、ペンタカルボキシルポルフィリンIII、イソコプロポルフィリン、ハルデロポルフィリン、イソハルデロポルフィリン、メソポルフィリンIX、デューテロポルフィリンIX、及び、ペンプトポルフィリンからなる群から選択される
ものであってもよい。

【0023】

本発明のフォトブリーチング防止剤は、
前記ポルフィリン類が、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）である
ものであってもよい。

【0024】

本発明の別の態様において、本発明は、ポルフィリン類蓄積部位の検出方法であって、以下のステップ、
あらかじめポルフィリン類の前駆物質及び没食子酸類を同時又は異時に投与された対象に対し、ポルフィリン類の励起光を照射するステップ、
ポルフィリン類の蛍光を検出するステップ
を含む検出方法に関する。

【0025】

本発明の別の態様において、本発明は、光線力学的診断方法であって、以下のステップ、
対象に対して、ポルフィリン類の前駆物質及び没食子酸類を同時又は異時に投与するステップ、
対象に対して、ポルフィリン類の励起光を照射するステップ、
ポルフィリン類の蛍光を検出するステップ、
検出されたポルフィリン類の蛍光に基づき、ポルフィリン類蓄積部位を判定し、病変部の範囲を判断するステップ
を含む診断方法に関する。

【0026】

本発明の光線力学的診断方法は、
前記病変部が腫瘍である
ものであってもよい。

【0027】

本発明の光線力学的診断方法は、
前記対象が、非ヒト動物である
ものであってもよい。

【0028】

本発明の光線力学的診断方法は、
前記ポルフィリン類の前駆物質が、ＡＬＡ類である
ものであってもよい。

【発明の効果】

【0029】

本発明は、ポルフィリン類のフォトブリーチング防止剤を提供する。本発明のフォトブリーチング防止剤を使用することにより、ポルフィリン類、またはその原料となるＡＬＡ類を投与した場合のフォトブリーチングを防止し、光線力学的診断において検出するための蛍光強度をより長時間、より強度に維持することができる。

【0030】

また、ＡＬＡは、動植物細胞内に存在する化合物であり、それ自体は光増感作用を有さず、過剰に細胞内に投与されると、病変部に選択的に取り込まれ、細胞内のヘムの生合成経路内で光増感作用を有するポルフィリン系化合物、特にプロトポルフィリンＩＸを生成し、細胞内に蓄積される性質を有する。

【0031】

本発明において、ＡＬＡ類とフォトブリーチング防止剤とを組み合わせて用いることにより、ポルフィリン類を光増感剤として使用するよりも副作用を少なくし、かつ、従来よりも光線力学的診断における蛍光強度をより長時間、より強度に維持することができる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】図１は、細胞にＡＬＡ類、および、没食子酸類またはその他の還元剤を取り込ませた場合の、各還元剤の存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の変移について、励起光照射後０秒後から１８０秒後まで１０秒毎の蛍光強度をプロットしたものを示す。

【図2】図２は、細胞にＡＬＡ類、および、還元剤（アスコルビン酸、α−トコフェロール、ルテイン）を取り込ませた場合の、各還元剤の存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の変移について、励起光照射後０秒後から１８０秒後まで１０秒毎の蛍光強度をプロットしたものを示す。

【図3】図３は、細胞にＡＬＡ類、および、没食子酸プロピルを取り込ませた場合の、没食子酸プロピル存在下及び非存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の変移について、励起光照射後０秒後から１８０秒後まで１０秒毎の蛍光強度をプロットしたものを示す。図３において、励起光の強度は、それぞれ、０．１ｍＡ、０．２ｍＡ、０．３ｍＡ、０．４ｍＡとした。

【図4】図４は、細胞にＡＬＡ類、および、没食子酸プロピルを取り込ませた場合の、細胞の実体画像（一番上）と、励起光照射０分、１分、２分、３分後に、前記細胞を蛍光顕微鏡を用いて撮影した図を示す。図中の「Ｖｅｈｉｃｌｅ」はコントロールとして、没食子酸プロピル非存在下での細胞を示す。

【図5】図５は、コントロールとして、没食子酸類を含まないＧｌｙ＋ＰＢＳ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図6】図６は、没食子酸類として没食子酸メチルを含むＧｌｙ＋ＰＢＳ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図7】図７は、没食子酸類として没食子酸プロピルを含むＧｌｙ＋ＰＢＳ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図8】図８は、没食子酸類として没食子酸ブチルを含むＧｌｙ＋ＰＢＳ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図9】図９は、コントロールとして、没食子酸類を含まないＤＭＳＯ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図10】図１０は、没食子酸類として没食子酸メチルを含むＤＭＳＯ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図11】図１１は、没食子酸類として没食子酸プロピルを含むＤＭＳＯ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図12】図１２は、没食子酸類として没食子酸ブチルを含むＤＭＳＯ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図13】図１３は、没食子酸類として没食子酸オクチルを含むＤＭＳＯ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを示す。

【図14】図１４は、Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液を用いた場合の、各没食子酸アルキルの存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の変移について、励起光照射後０秒後から１８０秒後まで１０秒毎の蛍光強度をプロットしたものを示す。

【図15】図１５は、ＤＭＳＯ溶液を用いた場合の、各没食子酸アルキルの存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の変移について、励起光照射後０秒後から１８０秒後まで１０秒毎の蛍光強度をプロットしたものを示す。

【図16】図１６は、Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液を用いた場合の、各没食子酸アルキルの存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の変移について、照射直後の蛍光強度を１とした相対値をプロットしたものを示す。

【図17】図１７は、ＤＭＳＯ溶液を用いた場合の、各没食子酸アルキルの存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の変移について、照射直後の蛍光強度を１とした相対値をプロットしたものを示す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本発明のポルフィリン類のフォトブリーチング防止剤としては、没食子酸類を含有し、ポルフィリン類のフォトブリーチング防止効果を有するものであれば特に制限されない。本発明の光線力学的診断剤において、没食子酸類は、ポルフィリン類の前駆物質の投与後に投与することも、同時、または、投与前に投与することもできる。

【0034】

本発明において、没食子酸類とは、没食子酸若しくはその誘導体またはその塩をいう。没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）は、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸ともいい、五倍子、没食子、ハマメリス、茶葉、オークの樹皮など多くの植物に含まれる。没食子酸誘導体としては、カルボキシル基がエステル化された化合物等が挙げられる。没食子酸エステルとしては、アルキルエステルの他、シクロアルキルエステル、アリールエステル、アラルキルエステル等であってもよい。

【0035】

本発明の一態様においては、没食子酸類として、没食子酸アルキルエステルが挙げられる。

【0036】

本発明において、没食子酸誘導体は、下記式（Ｉ）で表わされる化合物

【化4】

（式中、Ｒ^１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択される基を表し、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ、水酸基を表す。）
であってもよい。

【0037】

前記式（Ｉ）のＲ^１におけるアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜１０のアルキル基を挙げることができる。

【0038】

前記式（Ｉ）のＲ^１におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。

【0039】

前記式（Ｉ）のＲ^１におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。

【0040】

前記式（Ｉ）のＲ^１におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。

【0041】

本発明の一態様において、没食子酸誘導体として、前記式（Ｉ）において、
Ｒ^１が、炭素数１〜１０のアルキル基であり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が水酸基である
化合物が好ましい。

【0042】

本発明の一態様において、没食子酸誘導体として、前記式（Ｉ）において、
Ｒ^１が、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、及び、デシル基からなる群から選択され、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が水酸基である
化合物が好ましい。

【0043】

本発明の一態様において、没食子酸誘導体として、前記式（Ｉ）において、
Ｒ^１が、水素原子、メチル基、プロピル基、ブチル基、及び、オクチル基からなる群から選択され、
Ｒ^２，Ｒ^３，Ｒ^４が水酸基である
化合物が好ましい。

【0044】

本発明の一態様において、没食子酸誘導体として、ポルフィリン類の励起光波長である３８０〜４２０ｎｍ付近の吸光度が大きくないものが好ましい。

【0045】

没食子酸類のうち、没食子酸又はその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される塩であれば特に限定されない。

【0046】

以上の没食子酸類のうち、好ましいものは、没食子酸メチルエステル、没食子酸プロピルエステル、没食子酸ブチルエステル、没食子酸オクチルエステル等のアルキルエステル類である。とりわけ、没食子酸メチルエステル、没食子酸プロピルエステル、没食子酸オクチルエステル等を特に好適なものとして例示することができる。

【0047】

上記没食子酸類は、商業的に入手可能である他、化学合成、植物からの抽出など公知の方法によって製造することができる。また、上記没食子酸類は、無水物の他、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、また没食子酸類を単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。

【0048】

ポルフィリン類とは、ポルフィリンの基本骨格を有する化合物をいう。ポルフィリン類としては、ポルフィリン系光増感剤として一般に使用される物質等が挙げられる。また、ポルフィリン類としては、ＡＬＡ類から代謝により生成されるポルフィリン類等も挙げられる。ポルフィリン類は、一般に、４００〜５００ｎｍ付近の吸収帯と、５００〜７００ｎｍ付近の吸収帯を有する。例えば、ＰｐＩＸは、波長４０５ｎｍの励起光を受けると、波長６３５ｎｍにピークを有する赤色蛍光を発する。

【0049】

本発明に使用できるポルフィリン類としては、プロトポルフィリンＩＸ、ウロポルフィリンＩ、ウロポルフィリンＩＩＩ、コプロポルフィリンＩ、コプロポルフィリンＩＩＩ、ヘプタカルボキシルポルフィリンＩ、ヘプタカルボキシルポルフィリンＩＩＩ、ヘキサカルボキシルポルフィリンＩ、ヘキサカルボキシルポルフィリンＩＩＩ、ペンタカルボキシルポルフィリンＩ、ペンタカルボキシルポルフィリンＩＩＩ、イソコプロポルフィリン、ハルデロポルフィリン、イソハルデロポルフィリン、メソポルフィリンＩＸ、デューテロポルフィリンＩＸ、及び、ペンプトポルフィリンからなる群から選択されるものが挙げられる。

【0050】

ポルフィリン類が腫瘍細胞に取り込まれ、蓄積されるメカニズムについて、詳細は明らかではない。本発明の一態様において、蛍光を発し、かつ、腫瘍細胞に蓄積される性質のあるポルフィリン類が好ましい。

【0051】

ポルフィリン類は、商業的に入手可能である他、周知の方法により製造することができる。

【0052】

本発明において、ポルフィリン類の前駆物質とは、生体内で代謝されてポルフィリン類を生成する物質をいう。ポルフィリン類の前駆物質としては、ＡＬＡ類等が挙げられる。

【0053】

本発明の一態様において、ポルフィリン類の前駆物質として、ＡＬＡ類が好ましい。本明細書において、ＡＬＡ類とは、ＡＬＡ若しくはその誘導体又はそれらの塩をいう。

【0054】

本発明において、ＡＬＡは、５−アミノレブリン酸を意味する。ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸ともいい、アミノ酸の１種である。ＡＬＡは、生体内の内在物質であり、ヘムの前駆体として知られている。ＡＬＡはヘム系化合物の共通前駆体であるが、がん細胞においては、ＡＬＡを投与してもヘムが生成されず、ヘム系化合物の前駆体であるプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）が蓄積することが知られている。蓄積したＰｐＩＸに光を照射すると蛍光を発するために光線力学的診断が可能となる。

【0055】

本発明において、ＡＬＡ類は、下記式（ＩＩ）で示される化合物

【化5】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
であってもよい。

【0056】

本発明において、ＡＬＡ類は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が、水素原子、炭素数１〜８のアルカノイル基、及び、炭素数７〜１４のアロイル基からなる群から選択され、
Ｒ^２が、水素原子、直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、及び、炭素数７〜１５のアラルキル基からなる群から選択される
化合物であってもよい。

【0057】

前記式（ＩＩ）のＲ^１におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。

【0058】

前記式（ＩＩ）のＲ^２におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。

【0059】

前記式（ＩＩ）のＲ^２におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。

【0060】

前記式（ＩＩ）のＲ^２におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。

【0061】

前記式（ＩＩ）のＲ^２におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。

【0062】

本発明において、ＡＬＡ類は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が、水素原子、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、及び、ブチリル基からなる群から選択され、
Ｒ^２が、水素原子、メチル、エチル、プロピル、ブチル、及び、ペンチル基からなる群から選択される
化合物であってもよい。

【0063】

本発明において、ＡＬＡ類は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が水素原子であり、
Ｒ^２が、水素原子、メチル、エチル、プロピル、ブチル、及び、ペンチル基からなる群から選択される
化合物であってもよい。

【0064】

本発明において、ＡＬＡ類は、前記式（ＩＩ）において、
Ｒ^１が水素原子であり、
Ｒ^２が水素原子である
化合物であってもよい。

【0065】

好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ^１とＲ^２の組合せが、（ホルミルとメチル）、（アセチルとメチル）、（プロピオニルとメチル）、（ブチリルとメチル）、（ホルミルとエチル）、（アセチルとエチル）、（プロピオニルとエチル）、（ブチリルとエチル）の各組合せである化合物が挙げられる。

【0066】

ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。

【0067】

以上のＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものは、ＡＬＡ、及び、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。とりわけ、ＡＬＡ塩酸塩、ＡＬＡリン酸塩を特に好適なものとして例示することができる。

【0068】

上記ＡＬＡ類は、例えば、化学合成、微生物による生産、酵素による生産など公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またＡＬＡ類を単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。

【0069】

本発明において、フォトブリーチングとは、光増感剤の蛍光の減少が起こることをいう。フォトブリーチングの防止とは、蛍光物質を励起後、一定時間内に生じる蛍光強度の減少の程度を小さくすることをいい、完全に蛍光強度の減少を生じさせないもののみならず、蛍光強度の減少を抑制するものを含む。したがって、フォトブリーチング防止剤とは、フォトブリーチング抑制剤とも呼ぶことができる。

【0070】

光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：以下「ＰＤＤ」ともいう）とは、ポルフィリン類等の光増感剤が腫瘍等に取り込まれて蓄積する性質を利用して、光増感剤またはその前駆物質を対象に投与し、励起光を照射することにより、光増感剤の発する蛍光を検出して、腫瘍等の病変部の部位・範囲を診断する方法である。例えば、ＰｐＩＸは、波長４０５ｎｍの励起光を受けると、波長６３５ｎｍにピークを持つ赤色蛍光を発することから、光線力学的診断による腫瘍の診断に用いることができることが知られており、脳腫瘍や膀胱がんの診断などでの用途が期待されている。

【0071】

光線力学的診断においては、光増感剤の励起光及び蛍光の波長は、各ポルフィリン類の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定結果等に基づき、各化合物に適する波長を適宜選択することができる。
例えば、ＰｐＩＸの励起光照射手段から照射する光としては、ＰｐＩＸを励起させることで、ＰｐＩＸ特有の赤色蛍光が観察できる波長の光が好ましく、いわゆるソーレー帯に属するＰｐＩＸの吸収ピークに属する紫外光に近い紫色の波長であって、具体的には３８０ｎｍ〜４２０ｎｍ、好ましくは４００〜４１０ｎｍ、特に好ましくは４０３〜４０７ｎｍ、中でも４０５ｎｍの波長を有する励起光を挙げることができる。その他のポルフィリン類についても測定して適宜決定することが可能である。

【0072】

光線力学的診断を行う手段としては、ポルフィリン類の励起光照射手段と、励起状態のポルフィリン類特有の蛍光検出手段、あるいは、これらが一体化された手段を例示することができる。

【0073】

上記励起光を照射する光源としては、公知のものを使用することができ、例えば紫色ＬＥＤ、好ましくはフラッシュライト型紫色ＬＥＤや、半導体レーザー等のレーザー光を挙げることができるが、装置がコンパクトになり、コスト面や可搬性において有利である紫色ＬＥＤ、中でもフラッシュライト型紫色ＬＥＤや、紫色半導体ダイオードを好適に例示することができる。

【0074】

上記蛍光を検出する手段としては、肉眼による検出手段やＣＣＤカメラによる検出手段に限らず、膣拡大鏡（コルポスコープ）等の機器を用いた検出手段を挙げることができる。

【0075】

励起光照射手段と赤色蛍光検出手段とが一体化された光線力学的診断の手段としては、光源・計測用細径光ファイバーを挙げることができ、励起光の光源としては、被検体の生体組織の微小に点在する腫瘍についてもポルフィリン類の検出を行うことを可能とするために放射照度が強く、精確な自動識別を可能とするために照射面積が狭い半導体レーザー光源が好ましく、励起光を導光して一端から外部へ出射する励起光導光部を有することが好ましく、励起光導光部としては、具体的には細径光ファイバーを挙げることができる。光源に用いられる素子としては、ＩｎＧａＮ等の半導体混晶を用いることができ、ＩｎＧａＮの配合比を変えることで、紫色光を発振することができる。具体的には直径５．６ｍｍ程度のコンパクトなレーザーダイオードを好適に例示することができる。レーザーダイオードから４レーザーアウトプットのポートと、スペクトル測定用のポートはビルトイン高感度スペクトロスコープで連結されたデスクトップＰＣほどのサイズである装置を例示することができる。また、前記励起光によって励起されたＰｐＩＸが発する蛍光を受光する受光工程においては計測用細径光ファイバーが用いられ、該計測用細径光ファイバーは前記光源用細径光ファイバーと一体化され、受光した蛍光を検出器に導光しポルフィリン類蓄積部位の判定を行う。

【0076】

本発明において、光線力学的診断の対象となる病変部位として、腫瘍部位、前がん病変等が挙げられる。本発明の一態様において、診断の対象としての病変部は腫瘍であることが好ましい。

【0077】

本発明の一態様において、光線力学的診断の対象となる腫瘍は、悪性又は非悪性腫瘍である。悪性腫瘍は、浸潤性に増殖し、転移するなど悪性を示す。悪性腫瘍の中でも多くを占めるのが上皮細胞に由来する癌であり、その他に肉腫、リンパ腫又は白血病を含む。非悪性腫瘍は、悪性腫瘍以外の疾患、例えば良性疾患などを示し、必ずしも治療が容易ということを意味しない。
腫瘍の組織としては特に限定されないが、脳、鼻道、鼻腔、気管、気管支、口腔、咽頭、食道、胃、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、中枢神経系、肝臓、膀胱、尿道、尿管、膵臓、頚管、腹腔、肛門管、子宮頚等が挙げられる。

【0078】

本発明の光線力学的診断剤の投与経路としては、舌下投与も含む経口投与、あるいは吸入投与、点滴を含む静脈内投与、発布剤等による経皮投与、座薬、又は経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ若しくは腸ろうチューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができるが経口投与が一般的である。本発明において、ポルフィリン類前駆物質と没食子酸類とは、異なる投与経路とすることができる。

【0079】

本発明のフォトブリーチング防止剤は、前記投与経路の他、膀胱内などの病変部位に直接投与することもできる。本発明の一態様において、ポルフィリン類前駆物質を経口投与し、フォトブリーチング剤を病変部位に直接投与することが好ましい。

【0080】

本発明の光線力学的診断剤の剤型としては、上記経路投与に応じて適宜決定することができるが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散在、液剤、シロップ等に溶解した水剤、パップ剤、座薬剤等を挙げることができる。本発明において、ポルフィリン類前駆物質と没食子酸類とは、異なる剤型とすることができる。

【0081】

本発明の光線力学的診断剤を調製するために、必要に応じて、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等を添加することができ、具体的には、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。なお、本発明の光線力学的診断剤を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要があり、アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐこともできる。

【0082】

本発明の光線力学的診断剤の量・頻度・期間としては、特に限定されない。光線力学的診断剤を利用しようとする対象の年齢、体重、症状等により適宜最適化することができる。

【0083】

本発明の一態様において、好ましい投与量の例としては、ポルフィリン類前駆物質（例えば、ＡＬＡ類）については、例えば、ＡＬＡ・モル換算で、体重１ｋｇ当たり、０．０００６ｍｍｏｌ〜６ｍｍｏｌ、好ましくは０．００６ｍｍｏｌ〜０．６ｍｍｏｌ、より好ましくは０．０６ｍｍｏｌ〜０．３ｍｍｏｌを挙げることができる。

【0084】

本発明の一態様において、好ましい投与量の例としては、没食子酸類については、例えば、没食子酸プロピル・モル換算で、体重１ｋｇ当たり、０．００００６ｍｍｏｌ〜６００ｍｍｏｌ、好ましくは０．０００６ｍｍｏｌ〜６０ｍｍｏｌ、より好ましくは０．００６ｍｍｏｌ〜３０ｍｍｏｌを挙げることができる。好ましい投与量は、投与経路に応じて適宜決定することができる。例えば、投与経路に応じ、例えば膀胱内直接投与の場合には、没食子酸類の膀胱内の最終濃度が０．０１〜２０％、好ましくは０．１％〜１０％、より好ましくは０．５％〜１０％になるように投与することもできる。

【0085】

その他のポルフィリン類前駆物質、没食子酸類、ＡＬＡ類を用いる場合にも、モル換算をすることにより、好ましい投与量を計算することができる。もっとも、上記、好ましい投与量の範囲は、例示であって、限定するものではない。

【0086】

本発明の一態様において、ポルフィリン類前駆物質（例えば、ＡＬＡ類）と没食子酸類との投与量との割合は、没食子酸類によるフォトブリーチング効果の程度を考慮して、当業者が適宜最適化することができる。

【0087】

本発明の一態様において、好ましいポルフィリン類前駆物質（例えば、ＡＬＡ類）と没食子酸類との投与量との割合について、没食子酸類の投与量を、ＡＬＡ類の投与量に対してモル比で、０．０１〜１００００倍量、好ましくは０．１〜１０００倍量、より好ましくは、１〜１０００倍量を挙げることができる。もっとも、上記投与量割合の範囲は、例示であって、限定するものではない。

【0088】

ポルフィリン類の前駆物質と没食子酸類を含有する光線力学的診断剤において、ポルフィリン類の前駆物質と没食子酸類とを組成物としても、それぞれ単独でも投与することできる。それぞれ単独で投与される場合には、没食子酸類は、ポルフィリン類前駆物質の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。同時という場合については、厳密に、同時でなくとも両者間で相当の間隔をおかずに行われるものであってもよい。

【0089】

ポルフィリン類前駆物質（例えばＡＬＡ類）と没食子酸類とを組み合わせたことを特徴とする光線力学的診断剤の投与と診断の時間的間隔については、ポルフィリン類前駆物質（例えばＡＬＡ類）を投与してから３０分〜８時間、好ましくは１時間から６時間、より好ましくは２時間から５時間、さらに好ましくは３．５時間〜４．５時間後に光線力学的診断を実施することが病変部組織と正常組織とのポルフィリン類濃度の差が大きくなるため好ましい。

【0090】

没食子酸類の投与については、ポルフィリン類前駆物質（例えばＡＬＡ類）の投与前、ポルフィリン類前駆物質（例えばＡＬＡ類）の投与と同時、ポルフィリン類前駆物質（例えばＡＬＡ類）の投与後のいずれでもよい。また、ポルフィリン類前駆物質（例えばＡＬＡ類）と没食子酸類とは異なる投与経路であってもよい。本発明の一態様において、ポルフィリン類前駆物質を経口投与し、没食子酸を病変部位に直接投与することが好ましい。

【0091】

本発明の光線力学的診断剤は、他の既存の光線力学的診断剤及び／又は他のフォトブリーチング防止剤と組み合わせて使用することもできる。既存の光線力学的診断剤の例としては、フォトフリン（商標）、レザフィリン（商標）、インドシアニングリーンなどが挙げられる。他のフォトブリーチング防止剤としては、本発明において見出された没食子酸類の他、他のフォトブリーチング防止剤とを組み合わせうる。併用により、相加的な、場合によっては相乗的な効果が期待できる。

【0092】

本発明におけるポルフィリン類蓄積部位の検出方法としては、例えば、以下のステップ、
あらかじめポルフィリン類の前駆物質及び没食子酸類を同時又は異時に投与された対象に対し、ポルフィリン類の励起光を照射するステップ、
ポルフィリン類の蛍光を検出するステップ
を含む
方法により行うことができる。
ここで、前記対象は、典型的にはヒトであるが、愛玩動物、実験動物、家畜など非ヒト動物である場合も含む。
ここで、ポルフィリン類蓄積部位としては、主に腫瘍または前がん病変などが挙げられる。前記ポルフィリン類の前駆物質の典型的な例は、前記ＡＬＡ類である。

【0093】

本発明における光線力学的診断方法としては、例えば以下の（１）〜（４）のステップを含む方法により行うことができる。
（１）対象に対して、ポルフィリン類の前駆物質及び没食子酸類を同時に又は異時に投与するステップ、
（２）対象に対して、ポルフィリン類の励起光を照射するステップ、
（３）ポルフィリン類の蛍光を検出するステップ、
（４）検出されたポルフィリン類の蛍光に基づき、ポルフィリン類蓄積部位を判定し、病変部の範囲を判断するステップ。
ここで、前記対象は、典型的にはヒトであるが、愛玩動物、実験動物、家畜など非ヒト動物である場合も含む。
また、前記病変部は典型的には腫瘍である。前記ポルフィリン類の前駆物質の典型的な例は、前記ＡＬＡ類である。

【0094】

なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

【0095】

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

【0096】

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

【実施例】

【0097】

<実施例１>
細胞に対し、ＡＬＡ類、および、没食子酸類またはその他の還元剤を取り込ませた場合の、ＡＬＡ類から代謝生成されるＰｐＩＸのフォトブリーチング防止効果の測定

【0098】

ＭＫＮ４５細胞を３５ｍｍディッシュに０．５×１０^６ｃｅｌｌとなるようにまき、３５ｍｍディッシュ上の培養液は２ｍＬとした。０．２Ｍ ＡＬＡ塩酸塩（５−アミノレブリン酸塩酸塩）溶液を３５ｍｍディッシュの培養液２ｍＬに１０μＬ添加し、培養液中のＡＬＡの最終濃度を１ｍＭとした。この３５ｍｍディッシュを５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養した。その後、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、氷上において、以下の各還元剤溶液（５０％グリセロールＰＢＳ溶液に溶解したもの）を１ｍＬ添加し、セルスクレイパーを用いてすぐに細胞をはがし、ピペッティングにより細胞を懸濁した。この各細胞懸濁液の励起光４００ｎｍにおける６３５ｎｍの蛍光強度を測定した。蛍光強度は、励起光照射０秒後から１０秒毎に１８０秒後まで測定した。なお、実施例１に限らず、蛍光強度測定は、励起光照射０秒後以降も励起光を照射しながら行った。

【0099】

各還元剤としては、以下のものを、以下の最終濃度で用いた。パラフェニレンジアミン（Ｐａｒａｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ、以下「ＰＰＤ」と略す）：０．５％
没食子酸プロピル（ｎ−Ｐｒｏｐｙｌ ｇａｌｌａｔｅ、以下、「ＮＰＧ」と略す）：２％
１−４−ジアザビシクロ［２．２．２］−オクタン（１−４−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［２．２．２］−ｏｃｔａｎｅ、以下「ＤＡＢＣＯ」と略す）：５％
Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（商標）：有効成分のアジ化ナトリウムとして約１％
なお、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＡｎｔｉ−ｆａｄｅ剤）は、アジ化ナトリウムを約１％含有する溶液として販売されていたため、５０％グリセロール／ＰＢＳを用いずに、市販の溶液のまま添加して検討を行った。

【0100】

実施例１の結果を図１に示す。種々の還元剤の中で、没食子酸プロピルを用いた場合には、励起光照射から１８０秒経過後においても、コントロールの励起光照射０秒後の蛍光強度に対して２分の１程度の蛍光強度を維持していたことから、優れたフォトブリーチング防止効果が認められた。一方、ＤＡＢＣＯを用いた場合には、フォトブリーチングの防止効果は不十分であることが認められた。また、ＰＰＤを用いた場合には、励起光照射０秒後の蛍光強度自体が大幅に低下してしまい、ＮＰＧのように蛍光強度が高い状態を維持することはできなかった。また、Ａｎｔｉ−ｆａｄｉｎｇ剤として市販されているＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄを用いた場合には、コントロールよりも蛍光強度が低下し、フォトブリーチングの防止効果は認められなかった。

【0101】

<実施例２>
細胞に対し、ＡＬＡ類、および、その他の還元剤を取り込ませた場合の、ＡＬＡ類から代謝生成されるＰｐＩＸのフォトブリーチング防止効果の測定

【0102】

その他の還元剤について、ＰｐＩＸのフォトブリーチング抑制効果について測定した。還元剤としては、以下のものを用いて、以下の方法により、各還元剤溶液を調製し、調製した各溶液をフォトブリーチング測定用のサンプル溶媒として使用した。

【0103】

アスコルビン酸添加溶液（溶媒：ｍｉｌｌｉ Ｑ、添加溶液濃度：１００ｍＭ）５μＬをＰＢＳ １ｍＬに添加し、最終濃度を５００μＭとするアスコルビン酸溶液を調製した。
トコフェロール添加溶液（溶媒：ＤＭＳＯ、添加溶液濃度：１００ｍＭ）５μＬをＰＢＳ １ｍＬに添加し、最終濃度を５００μＭとするトコフェロール溶液を調製した。
ルテイン添加溶液（溶媒：ＤＭＳＯ、添加溶液濃度：２ｍＭ）５μＬをＰＢＳ １ｍＬに添加し、最終濃度を１０μＭとするルテイン溶液を調製した。

【0104】

ＭＫＮ４５細胞を３５ｍｍディッシュに０．５×１０^６ｃｅｌｌとなるようにまき、３５ｍｍディッシュ上の培養液は２ｍＬとした。０．２Ｍ ＡＬＡ塩酸塩（５−アミノレブリン酸塩酸塩）溶液を３５ｍｍディッシュの培養液２ｍＬに１０μＬ添加し、培養液中のＡＬＡの最終濃度を１ｍＭとした。この３５ｍｍディッシュを５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養した。その後、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、上記で調製した各還元剤溶液を１ｍＬ添加し、セルスクレイパーを用いてすぐに細胞をはがし、ピペッティングにより細胞を懸濁した。この各細胞懸濁液の励起光４００ｎｍにおける６３５ｎｍの蛍光強度を測定した。蛍光強度は、励起光照射０秒後から１０秒毎に１８０秒後まで測定した。なお、蛍光強度測定は、励起光照射０秒後以降も励起光を照射しながら行った。

【0105】

実施例２の結果を図２に示す。アスコルビン酸、トコフェロール、ルテインのいずれの存在下においても、コントロールと同様にＰｐＩＸの蛍光強度が速やかに低下することが認められた。したがって、これらの還元剤もＰｐＩＸのフォトブリーチングを防止する効果はないものと認められた。

【0106】

<実施例３>
実施例１と同様の方法で、１％ｎ−プロピル没食子酸（ＮＰＧ）溶液を１ｍＬ添加して励起光の強度を０．１ｍＡ、０．２ｍＡ、０．３ｍＡ、０．４ｍＡと変更して同様に蛍光強度を測定した。

【0107】

実施例３の結果を図３に示す。図中、「ｖｅｈｉｃｌｅ」の記載は、１％ｎ−プロピル没食子酸（ＮＰＧ）溶液の代わりにコントロールとして、５０％グリセロールＰＢＳ溶液を１ｍＬ添加した場合の蛍光強度を示す。
これらの測定結果から算出した半減期を表１に示す。

【表1】

強度の励起光を照射した方が、ＰｐＩＸの分解が進み、早い時期に蛍光が大きく減少する傾向にある。励起光の強度を０．４ｍＡとした場合に、ＮＰＧの添加により、半減期は、２５秒から７５秒へと３倍も長くなったことが認められた。
実施例３の結果について、蛍光顕微鏡による撮影画像を図４に示す。ＮＰＧ１％を添加した場合の方が、長期間蛍光を維持したことが認められた。

【0108】

<実施例４>
溶液中における各没食子酸アルキルによるポルフィリン類のフォトブリーチング防止効果の測定

【0109】

没食子酸類によるポルフィリン類のフォトブリーチング防止効果について、以下の手順で測定した。没食子酸類としては、没食子酸メチル（ＭｅＧ； Ｍｅｔｈｙｌ Ｇａｌｌａｔｅ、ｗａｋｏ社製、カタログＮｏ．１３４−０９８１２）、没食子酸ブチル（ＢｕＧ；Ｂｕｔｙｌ Ｇａｌｌａｔｅ、ｗａｋｏ社製、カタログＮｏ．３２２−６７４７２）、没食子酸ｎ−プロピル（ＰｒＧ； Ｎ−ｐｒｏｐｙｌ Ｇａｌｌａｔｅ、ｗａｋｏ社製、カタログＮｏ．１６２−０６８３２）、没食子酸オクチル（ＯｃＧ； Ｏｃｔｙｌ Ｇａｌｌａｔｅ、ｗａｋｏ社製、カタログＮｏ．３２２−５６４８２）を用いた。ここで用いた没食子酸類は、いずれも直鎖状アルキルを有する化合物である。

【0110】

（１）各没食子酸アルキルの５０ｍＭ溶液を調製するため、１５ｍＬチューブに各没食子酸アルキルを０．３ｍｍｏｌ入れ、５０％グリセロールＰＢＳ溶液（グリセロールとＰＢＳを１：１の割合で混合したもの、以下、「Ｇｌｙ＋ＰＢＳ」または「Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液」と表記することもある）またはＤＭＳＯを６ｍＬ入れ溶解させた。
なお、没食子酸オクチルは、Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液に溶解しなかったため、各没食子酸アルキルのＤＭＳＯ溶液も調製した。没食子酸ブチルは、Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液、ＤＭＳＯに溶解したが、溶液はそれぞれ黄色に着色した溶液となった。

【0111】

（２）（１）で調製した各没食子酸アルキル溶液１０００μＬを用いて３５０ｎｍ〜７５０ｎｍにおける吸光スペクトルの測定を行った。
上記４種の各没食子酸アルキル溶液のうち、没食子酸ブチルのみが、４００ｎｍ付近に吸光度をもつことが判明した。蛍光物質であるプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）は４００ｎｍ付近に鋭い吸光度を持ち、４００ｎｍ付近の光を励起光として用いるため、没食子酸ブチルを用いた場合には、ＰｐＩＸの励起を妨げる可能性があると考えられた。

【0112】

（３）２ｍＬバイアルに没食子酸アルキル ９９０μＬを分注した後に、１００μＭのＰｐＩＸを１０μＬ添加した（ＰｐＩＸの最終濃度１μＭ）。

【0113】

（４）（３）で調製した各没食子酸アルキル＋ＰｐＩＸ溶液を、簡易蛍光測定装置を用いて、蛍光スペクトルの測定を行った。光源としてＬＥＤを用い、励起光の波長は４０２ｎｍを用い、出力電流は０．４ｍＡに設定し、測定間隔は、１０秒毎、１８０秒までとして測定した。

【0114】

実施例４について、没食子酸類の溶媒として、Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液を用いた場合の測定結果を図５〜図８に示す。各図について以下に説明する。なお、図５〜１３について、縦軸は、相対強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）と記載しているが、これは、ブランクとして、ファイバー接続部を塞ぎ、光が入らないようにして測定した時の蛍光強度に対する相対値として示したものである。

【0115】

コントロールとして、没食子酸類を含まないＧｌｙ＋ＰＢＳ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを図５に示す。ＰｐＩＸは、６２７ｎｍ付近をピークとする強い蛍光が測定された。励起光照射０秒後の蛍光強度に対し、わずか３０秒後には５分の１程度に、６０秒後には１０分の１程度に蛍光強度が減少した。

【0116】

各没食子酸類の効果について、没食子酸メチル、没食子酸プロピル、または、没食子酸ブチルを含むＧｌｙ＋ＰＢＳ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを、それぞれ、図６、７、８に示す。励起光照射０秒後の蛍光強度に対し、３０秒後、及び６０秒後においても、ＰｐＩＸの蛍光強度があまり低下せず、ＰｐＩＸのフォトブリーチングを抑制できた。

【0117】

実施例４について、没食子酸類の溶媒として、ＤＭＳＯ溶液を用いた場合の測定結果を図９〜図１３に示す。各図について以下に説明する。

【0118】

コントロールとして、没食子酸類を含まないＤＭＳＯ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを図９に示す。ＰｐＩＸは、６３２ｎｍ付近をピークとする強い蛍光が測定された。ＤＭＳＯを没食子酸類の溶媒に用いた場合にも、Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液を溶媒に用いたときと同様に、励起光照射０秒後の蛍光強度に対し、わずか３０秒後には５分の１程度に、６０秒後には１０分の１程度に蛍光強度が減少した。

【0119】

各没食子酸類の効果について、没食子酸メチル、没食子酸プロピル、没食子酸ブチル、または、没食子酸オクチルを含むＤＭＳＯ溶液中におけるＰｐＩＸの蛍光スペクトルを、それぞれ、図１０、１１、１２、１３に示す。いずれの没食子酸アルキルを用いた場合にも、励起光照射０秒後のＰｐＩＸの蛍光強度に対し、３０秒後、及び６０秒後においても、ＰｐＩＸの蛍光強度があまり低下せず、ＰｐＩＸのフォトブリーチングを抑制できた。なお、没食子酸ブチル存在下において、５００〜５５０ｎｍ付近に蛍光が検出されているのは、没食子酸ブチルに由来するものと考えられる。

【0120】

上記実施例４の結果について、各没食子酸アルキルの存在下及び非存在下におけるＰｐＩＸの蛍光強度の１０秒毎の変移がわかるように、励起光照射後０秒後から１８０秒後まで１０秒毎の蛍光強度（全て励起光出力０．４ｍＡ）をプロットしたものを図１４，１５に示す。各図について以下に説明する。

【0121】

没食子酸類の溶媒として、Ｇｌｙ＋ＰＢＳ溶液を用いた場合の蛍光波長６２７ｎｍの蛍光強度変移を図１５に示した。また、没食子酸類の溶媒として、ＤＭＳＯ溶液を用いた場合の蛍光波長６３２ｎｍの蛍光強度変移を図１６に示した。没食子酸アルキル非存在下（コントロール）では、励起光照射６０秒後にはすでに蛍光強度が１０分の１以下に低下し、顕著なフォトブリーチングが生じているのに対し、各没食子酸アルキル存在下においては、励起光照射６０秒後、１２０秒後、１８０秒後においても蛍光強度があまり低下しなかった。したがって、各没食子酸アルキルには、ＰｐＩＸのフォトブリーチングを抑制する効果があるものと認められた。

【0122】

上記の、没食子酸類の溶媒としてＧｌｙ＋ＰＢＳ溶液、ＤＭＳＯ溶液を用いた場合についての図１４、図１５のそれぞれのプロットに関し、ＰｐＩＸの蛍光強度変移を、照射直後（０秒後）の蛍光強度を１になるように、蛍光強度の相対値を算出し、算出された相対強度を縦軸としてプロットしたものをそれぞれ、図１６、図１７に示す。この蛍光強度の相対値の変移を擬一次反応として扱い、半減期を求め、それぞれ、表２、表３に示した。

【表2】

【表3】

各溶液におけるＰｐＩＸの蛍光強度の半減期は、いずれの没食子酸アルキルの存在下においても、２０倍程度に増大されることが分かった。

【0123】

以上より、本発明者らは、驚くべきことに、没食子酸類には、ＰｐＩＸのフォトブリーチングに対する優れた防止効果があることを見出した。これに対し、ＰＰＤやＤＡＢＣＯの他、還元剤として知られているアスコルビン酸やα−トコフェロール等では、同様の効果はなかった。また、ＡＬＡ類を取り込ませた細胞系においても、没食子酸類によるＰｐＩＸのフォトブリーチング防止効果が認められたことから、ＡＬＡ類を用いた光線力学的診断においても、没食子酸類は優れたフォトブリーチング防止剤となることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】