5887265 ＧＩＰ受容体活性グルカゴン化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5887265

(24)【登録日】2016年2月19日

(45)【発行日】2016年3月16日

(54)【発明の名称】ＧＩＰ受容体活性グルカゴン化合物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/605 20060101AFI20160303BHJP

   A61K 38/26 20060101ALI20160303BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160303BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20160303BHJP

   A61K 47/34 20060101ALI20160303BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20160303BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20160303BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20160303BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/605ZNA

   A61K37/28

   A61P43/00 111

   A61K47/48

   A61K47/34

   A61P3/10

   A61P1/00

   A61P3/04

【請求項の数】22

【全頁数】171

(21)【出願番号】特願2012-516264(P2012-516264)

(86)(22)【出願日】2010年6月16日

(65)【公表番号】特表2012-530145(P2012-530145A)

(43)【公表日】2012年11月29日

(86)【国際出願番号】US2010038825

(87)【国際公開番号】WO2010148089

(87)【国際公開日】20101223

【審査請求日】2013年6月14日

(31)【優先権主張番号】61/187,578

(32)【優先日】2009年6月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】301046787

【氏名又は名称】インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100064012

【弁理士】

【氏名又は名称】浜田 治雄

(74)【代理人】

【識別番号】100173587

【弁理士】

【氏名又は名称】西口 克

(74)【代理人】

【識別番号】100173602

【弁理士】

【氏名又は名称】赤津 悌二

(74)【代理人】

【識別番号】100177080

【弁理士】

【氏名又は名称】齊藤 涼子

(72)【発明者】

【氏名】ディマルキ，リチャード，デー

(72)【発明者】

【氏名】スマイリー，ディビッド，エル

(72)【発明者】

【氏名】ディマルキ，マリア

(72)【発明者】

【氏名】シャベンヌ，ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】デイ，ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】パタースン，ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】ワード，ブライアン，ピー

(72)【発明者】

【氏名】タオ，マー

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１０１０１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０５８６６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２４４２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４３８１６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／６０５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＩＰ受容活性を示すグルカゴン（配列番号１）の一つの類似体であって、該類似体は以下の修飾を備える配列番号１を含むものであり、
（ｉ）前記類似体の２位にイソ酪酸（ＡＩＢ）があり、
（ｉｉ）前記類似体の１６位にＧｌｕがあり、
（ｉｉｉ）前記類似体の１７位にＧｌｎがあり、
（ｉｖ）前記類似体の１８位にＡｌａがあり、
（ｖ）前記類似体の２０位にＬｙｓがあり、
（ｖｉ）前記類似体の２１位にＧｌｕがあり、
（ｖｉｉ）前記類似体の２３位にＩｌｅがあり、
（ｖｉｉｉ）前記類似体の２４位にＡｌａがあり、
（ｉｘ）前記類似体の２９位にＧｌｙがあり、
ここで、前記類似体は、前記類似体の２９位においてアミノ酸に共有結合しているＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２６）のアミノ酸配列、およびさらに一つの付加的なアミノ酸であって、前記類似体の４０位においてＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２６）のＣ末端側に共有結合している、天然アミノ酸に対して非天然であるアシル基又はアルキル基を含むアミノ酸を含み、
前記アシル基又はアルキル基は、前記４０位のアミノ酸の側鎖に直接共有結合しているか、又はスペーサーを介して共有結合しており、
さらに、前記類似体は、前記ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも１０％を示し、
前記類似体のＧＬＰ−１受容体に対する選択性は、ＧＩＰ受容体の選択性の１００分の１より大きく、且つ１００倍より小さい範囲内にある類似体。

【請求項2】

１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓの間にラクタム架橋を含む、請求項１に記載の類似体。

【請求項3】

一つのＣ末端アミドを含む、請求項１又は２に記載の類似体。

【請求項4】

アシル基又はアルキル基を含む前記アミノ酸が、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのアミノ酸であって、
ここで、式Ｉは次式で表され、

【化1】

式ＩＩは次式で表され、

【化2】

そして、式ＩＩＩは次式で表され、

【化3】

ｎは１から４である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項5】

前記式Ｉのアミノ酸がＬｙｓである、請求項４に記載の類似体。

【請求項6】

前記アシル基が、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸アシル基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項7】

前記アシル基が、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アシル基である、請求項６に記載の類似体。

【請求項8】

前記アシル基が、Ｃ１４〜Ｃ１６脂肪酸アシル基である、請求項７に記載の類似体。

【請求項9】

前記アシル又はアルキル基が、スペーサーを介して前記アミノ酸の側鎖に共有結合で結合されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項10】

（Ｉ）前記スペーサーが、（Ａ）３〜１０個の原子長であるか、（Ｂ）アミノ酸若しくはジペプチドであるか、（Ｃ）６−アミノヘキサン酸であるか、又は（Ｄ）Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＰｒｏ−Ｐｒｏからなる群から選択されるジペプチドであるか、あるいは（ＩＩ）前記スペーサー及び前記アシル基の全長が、１４〜２８個の原子長である、請求項９に記載の類似体。

【請求項11】

前記類似体が、（Ａ）親水性部分を含まない場合、前記類似体が、前記ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１（配列番号２）の活性の少なくとも４％を示すか、（Ｂ）前記類似体が親水性部分を含まない場合、前記類似体が、前記グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の少なくとも２０％を示すか、（Ｃ）前記類似体が親水性部分を含まない場合、前記類似体が、３位のアミノ酸修飾を含み、前記グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の１％未満を示すか、（Ｄ）前記類似体が親水性部分を含まない場合、前記類似体が、７位のアミノ酸修飾を含み、前記ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１の活性の１０％未満を示すか、又は（Ａ）および（Ｂ）若しくは（Ｃ）のいずれかの組み合わせであるか、又は（Ｂ）および（Ｄ）の組み合わせである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項12】

親水性部分が、前記類似体の１６、１７、２０、２１、２４位のアミノ酸、又はＣ末端のいずれかに共有結合で結合されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項13】

前記親水性部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１２に記載の類似体。

【請求項14】

前記ＰＥＧが、１，０００ダルトン〜４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の類似体。

【請求項15】

ＧＩＰ受容体活性化に対する前記類似体のＥＣ５０が、１０ｎＭ以下である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項16】

前記類似体が、前記ＧＩＰ受容体に対する野生型ＧＩＰ（配列番号４）の活性の少なくとも２０％を示す、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項17】

前記類似体の前記ＧＩＰ効力が、前記類似体の前記ＧＬＰ−１効力の７５倍以内であり、および／また前記類似体の前記ＧＩＰ効力が、前記類似体のグルカゴン効力の５００倍以内である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項18】

配列番号６６９の前記アミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の類似体。

【請求項19】

２つのグルカゴンペプチドを含む二量体であって、前記グルカゴンペプチドの少なくとも１つが、請求項１〜１８のいずれかに記載の類似体であり、リンカーを介して互いに結合されている二量体。

【請求項20】

請求項１〜１９のいずれか一項に記載の類似体が共役部分に結合された共役体であって、
前記共役部分が、異種性ペプチド又は血漿タンパク質を含むポリペプチド、標的化剤、免疫グロブリン又はそれらの免疫グロブリン断片であって、免疫グロブリン可変領域、ＣＤＲ、若しくはＦｃ領域から成るそれらの免疫グロブリン断片、診断標識、あるいは水溶性ポリマーを含むポリマーから選ばれる一つである、共役体。

【請求項21】

請求項１〜１８のいずれか一項に記載の類似体、請求項１９に記載の二量体、請求項２０に記載の共役体、又はそれらの組み合わせ、及びそれらの薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項22】

体重増加を低減又は体重減少を誘導する糖尿病治療薬剤又は肥満治療薬剤の製造において、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の類似体、請求項１９に記載の二量体、請求項２０に記載の共役体、又はそれらの組み合わせを使用する方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２００９年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／１８７，５７８号の優先権を主張するものである。

【背景技術】

【0002】

プレプログルカゴンは、様々な組織でプロセスされて、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）を含む多数の異なるプログルカゴン由来ペプチドを形成し、グルコース恒常性、インスリン分泌、胃内容排出、及び腸成長、並びに食物摂取量の調節を含む幅広く多様な生理学的機能に関与する１５８個アミノ酸の前駆体ポリペプチドである。グルカゴンは、プレプログルカゴンのアミノ酸３３〜６１に対応する２９個アミノ酸のペプチドであり、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンのアミノ酸７２〜１０８に対応する３７個アミノ酸のペプチドとして産生される。ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド又はＧＬＰ−１（７〜３７）酸は、ＧＬＰ−１の生物学的有効形態であり、ＧＬＰ−１受容体に対して本質的に同等の活性を示す。

【0003】

低血糖症は、血糖レベルが低下し過ぎて、身体活動に十分なエネルギーを供給することができない場合に生じる。成人又は１０歳を超える小児では、低血糖症は、糖尿病治療の副作用を除くとまれであるが、他の薬物治療若しくは疾患、ホルモン若しくは酵素欠損症、又は腫瘍に起因する場合がある。血糖が低下し始めると、膵臓により産生されるホルモンであるグルカゴンは、グリコーゲン分解及びグルコース放出のシグナルを肝臓に伝達し、正常レベルに向う血糖レベルの上昇を引き起こす。従って、グルコース調節におけるグルカゴンの最も認められている役割は、インスリン作用を打ち消し、血糖レベルを維持することである。しかしながら、糖尿病の場合、低血糖症に対するこのグルカゴン応答は障害を受けている場合があり、グルコースレベルを正常範囲に戻すことがより困難になる。

【0004】

低血糖症は、直ちに医学的対応が必要な生命に関わる事象である。グルカゴンの投与は、急性低血糖症を治療するための確立されている薬物治療であり、投与の数分以内に正常なグルコースレベルを回復することができる。グルカゴンが低血糖症の急性治療に使用される場合、結晶形態のグルカゴンを希酸性緩衝液で可溶化し、溶液を筋肉内に注入する。この治療は効果的であるものの、この方法は、意識混濁している人には重荷であり、危険である。従って、関連する生理学的条件下で、親分子の生物学的な性能を維持又は凌駕するが、十分に可溶性であり、安定しており、すぐ注射できる液剤として事前に製剤化することができるグルカゴン類似体が必要とされている。

【0005】

加えて、糖尿病患者は、微小血管合併症を遅延又は予防するために、正常な血糖レベル付近を維持するように奨励される。この目的の達成には、通常は強化インスリン療法が必要とされる。この目的の達成を試みる際に、医師は、糖尿病患者の低血糖症の頻度及び重症度の実質的増加に遭遇している。従って、現行のインスリン療法よりも低血糖症を誘導する可能性がより少ない糖尿病治療には、医薬品及び方法の改良が必要である。

【0006】

ＧＬＰ−１は、グルカゴンと比較して、異なる生物活性を有する。その作用には、インスリン合成及び分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、及び食物摂取量の抑制が含まれる。ＧＬＰ−１は、糖尿病患者の高血糖症（グルコースレベル上昇）を低減することが示されている。ＧＬＰ−１と約５０％のアミノ酸同一性を共有するトカゲ毒由来のペプチドであるエキセンディン−４は、ＧＬＰ−１受容体を活性化し、同様に糖尿病患者の高血糖症を低減することが示されている。

【0007】

ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４が、食物摂取量を低減させ、体重減少を促進するという根拠も存在し、それは糖尿病患者だけでなく肥満に苦しむ患者にとっても有益な効果であろう。肥満の患者は、糖尿病、高血圧、高脂血症、心血管疾患、及び筋骨格疾患のより高いリスクを有する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従って、糖尿病及び肥満を治療するための代替的で好ましくは改良された方法に対する必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本明細書に記載のように、ＧＩＰ受容体に対してアゴニスト活性を示すグルカゴンペプチドの類似体が、本発明により提供される。加えて、そのような類似体を使用する方法が、本明細書で提供される。

【0010】

天然グルカゴン（配列番号１）はＧＩＰ受容体を活性化せず、典型的には、天然グルカゴンは、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰ活性の本質的に０％（例えば、０．００１％未満、０．０００１％未満）の活性を示す。また、天然グルカゴンは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１％を示す。天然グルカゴン（配列番号１）の活性と同等以上の強力なグルカゴン活性、天然ＧＩＰ（配列番号６７５）の活性と同等以上の強力なＧＩＰ活性、及び／又は天然ＧＬＰ−１の活性と同等以上の強力なＧＬＰ−１活性を示すことができるグルカゴンペプチドの類似体をもたらす、天然グルカゴン配列（配列番号１）に対する修飾が、本明細書に記載されている。ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号５２）又はＧＬＰ−１（７〜３７）（酸）（配列番号５０）は、ＧＬＰ−１の生物学的有効形態であり、ＧＬＰ−１受容体に対して本質的に同等の活性を示す。

【0011】

本明細書に記載のデータは、ＧＩＰ活性及びＧＬＰ−１活性を両方とも有するグルカゴン類似体が、糖尿病を含む高血糖症の治療だけでなく体重減少の誘導又は体重増加の予防にも特に有利であることを示す。この活性は、ＧＩＰの拮抗が、１日の食物摂取量及び体重を低減させ、インスリン感受性及びエネルギー消費を増加させるのに望ましいという当技術分野の教示を考慮すると、特に予想外である。（Ｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５０： １５３２−１５４０ （２００７）；及びＡｌｔｈａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００８年４月１７日に電子的に公開された）。

【0012】

従って、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチド類似体は、約１００ｎＭ以下、又は約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、若しくは１ｎＭ以下のＧＩＰ受容体活性化活性のＥＣ５０を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の類似体は、約０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、又は０．１ｎＭの、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の類似体は、多くとも約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、又は１００ｎＭの、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０を示す。幾つかの実施形態では、類似体は、約１００ｎＭ以下、又は約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、若しくは１ｎＭ以下のグルカゴン受容体活性化のＥＣ５０を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の類似体は、約０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、又は０．１ｎＭの、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０を示す。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０は、多くとも約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、又は１００ｎＭである。幾つかの実施形態では、類似体は、約１００ｎＭ以下、又は約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、若しくは１ｎＭ以下のＧＬＰ−１受容体活性化のＥＣ５０を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の類似体は、約０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、又は０．１ｎＭの、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０を示す。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０は、多くとも約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、又は１００ｎＭである。受容体活性化は、受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞でのｃＡＭＰ誘導を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、受容体をコードするＤＮＡ及び実施例１４に記載のｃＡＭＰ反応性エレメントに結合されたルシフェラーゼ遺伝子で同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞のアッセイにより測定することができる。

【0013】

幾つかの実施形態では、類似体は、天然ＧＩＰ（ＧＩＰ効力）と比べたＧＩＰ受容体に対する活性の少なくとも約０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、又は２００％以上を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の類似体は、天然ＧＩＰと比べたＧＩＰ受容体に対する活性の多くとも１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。幾つかの実施形態では、類似体は、天然グルカゴン（グルカゴン効力）と比べたグルカゴン受容体に対する活性の少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、又は５００％以上を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の類似体は、天然グルカゴンと比べたグルカゴン受容体に対する活性の多くとも１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。幾つかの実施形態では、類似体は、天然ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１効力）と比べたＧＬＰ−１受容体に対する活性の少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、又は２００％以上を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の類似体は、天然ＧＬＰ−１と比べたＧＬＰ−１受容体に対する活性の多くとも１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。

【0014】

ある実施形態では、本明細書に記載の類似体及びグルカゴンペプチドは、親水性部分、例えばＰＥＧを欠如する場合は、表示されている活性％を示すが、親水性部分、例えばＰＥＧを含む場合は、活性％の減少（例えば、約１０倍の活性減少）を示す。従って、幾つかの実施形態では、類似体は、親水性部分を欠如する場合、前述の活性％レベルを示し、親水性部分を含む場合は、約１０倍の活性減少を示す。受容体の天然リガンドと比べた受容体に対する類似体の活性は、類似体対天然リガンドのＥＣ５０の逆比として計算される。

【0015】

従って、本発明の１つの態様は、グルカゴン受容体及びＧＩＰ受容体の両方に対して活性を示す類似体（「グルカゴン／ＧＩＰ同時アゴニスト」）を提供する。これら類似体は、ＧＩＰ受容体と比較して、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの選択性を喪失している。幾つかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対する類似体のＥＣ５０は、グルカゴン受容体に対するそのＥＣ５０と、約５０倍、４０倍、３０倍、又は２０倍未満だけ異なる（より高いか又はより低い）。幾つかの実施形態では、類似体のＧＩＰ効力は、そのグルカゴン効力と、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、又は５倍未満だけ異なる（より高いか又はより低い）。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対する類似体のＥＣ５０で除算したＧＩＰ受容体に対する類似体のＥＣ５０の比率は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満である。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０で除算したＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０の比率は、約１又は約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施形態では、類似体のグルカゴン効力と比較した類似体のＧＩＰ効力の比率は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満である。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対する効力で除算したＧＩＰ受容体に対する効力の比率は、約１又は約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１活性は、例えば、７位のアミノ酸の修飾、例えばＩｌｅでの置換、２７又は２８位のアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸（複数可）を欠失させて、２７又は２８個アミノ酸のペプチドを産生すること、又はそれらの組み合わせにより、著しく低減又は破壊される。

【0016】

本発明の別の態様は、グルカゴン、ＧＩＰ、及びＧＬＰ−１受容体に対して活性を示す類似体（「グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト」）を提供する。これら類似体は、ＧＬＰ−１及びＧＩＰ受容体の両方と比較して、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの選択性を喪失している。幾つかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対する類似体のＥＣ５０は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するそのそれぞれのＥＣ５０と、約５０００倍、２５００倍、７５０倍、５００倍、２５０倍、１００倍、５０倍、４０倍、３０倍、又は２０倍未満だけ異なる（より高いか又はより低い）。幾つかの実施形態では、類似体のＧＩＰ効力は、そのグルカゴン及びＧＬＰ−１効力と、約１０００、７５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、又は５倍未満だけ異なる（より高いか又はより低い）。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で除算したＧＩＰ受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０の比率は、約１０，０００、７５００、５０００、２５００、１０００、７５０、５００、２５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、又は１未満である。幾つかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０で除算したＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０の比率は、約５、４、３、２、又は１、又は約１未満（例えば、約０．００００１、０．０００１、０．００１、０．００２５、０．００５、０．００７５、０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０は、約０．１より大きい（例えば、約０．２５より大きい、約０．５より大きい、約０．７５より大きい、約１より大きい）。幾つかの実施形態では、トリアゴニストのＧＬＰ−１効力と比較したトリアゴニストのＧＩＰ効力の比率は、約１０００、７５０、５００、２５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、又は１未満である。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対する効力で除算したＧＩＰ受容体に対する効力の比率は、約５、４、３、２、又は１、又は約１未満（例えば、約０．０００１、０．００１、０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。関連する実施形態では、グルカゴン受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で除算したＧＩＰ受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０の比率は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満である。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０で除算したＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０の比率は、約１又は約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施形態では、トリアゴニストのグルカゴン効力と比較したトリアゴニストのＧＩＰ効力の比率は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満である。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対する効力で除算したＧＩＰ受容体に対する効力の比率は、約１又は約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で除算したＧＬＰ−１受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０の比率は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満である。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０で除算したＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０の比率は、約１又は約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施形態では、トリアゴニストのグルカゴン効力と比較したトリアゴニストのＧＬＰ−１効力の比率は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満である。幾つかの実施形態では、グルカゴン受容体に対する効力で除算したＧＬＰ−１受容体に対する効力の比率は、約１又は約１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。

【0017】

本発明の更に別の態様は、ＧＬＰ−１及びＧＩＰ受容体に対して活性を示すが、グルカゴン活性が、例えば３位のアミノ酸修飾により著しく低減又は破壊されている類似体（「ＧＩＰ／ＧＬＰ−１同時アゴニスト」）を提供する。例えば、この位置における、酸性、塩基性、又は疎水性のアミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）での置換は、グルカゴン活性を低減する。幾つかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対する類似体のＥＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体に対するそのＥＣ５０と、約１０００倍、７５０倍、５００倍、２５０倍、１００倍、５０倍、４０倍、３０倍、又は２０倍未満だけ異なる（より高いか又はより低い）。幾つかの実施形態では、類似体のＧＩＰ効力は、そのＧＬＰ−１効力と、約１０００、７５０、５００、２５０、１００、２５、２０、１５、１０、又は５倍未満だけ異なる（より高いか又はより低い）。幾つかの実施形態では、これら類似体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１０％以下を有し、例えば約１〜１０％、又は約０．１〜１０％、又は約０．１％より大きいが約１０％未満である。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対する類似体のＥＣ５０で除算したＧＩＰ受容体に対する類似体のＥＣ５０の比率は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満、及び１以上である。幾つかの実施形態では、類似体のＧＬＰ−１効力と比較した類似体のＧＩＰ効力の比率は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、又は５未満、及び１以上である。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対する同時アゴニストのＥＣ５０で除算したＧＩＰ受容体に対する同時アゴニストのＥＣ５０の比率は、約１０，０００、７５００、５０００、２５００、１０００、７５０、５００、２５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、又は１未満である。幾つかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０で除算したＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０の比率は、約５、４、３、２、又は１、又は約１未満（例えば、約０．００００１、０．０００１、０．００１、０．００２５、０．００５、０．００７５、０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施形態では、同時アゴニストのＧＬＰ−１効力と比較した同時アゴニストのＧＩＰ効力の比率は、約１０００、７５０、５００、２５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、又は１未満である。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対する効力で除算したＧＩＰ受容体に対する効力の比率は、約５、４、３、２、又は１、又は約１未満（例えば、約０．０００１、０．００１、０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。

【0018】

本発明の更なる態様は、ＧＩＰ受容体に対して活性を示し、グルカゴン及びＧＬＰ−１活性が、例えば３及び７位のアミノ酸修飾により著しく低減又は破壊されている類似体（「ＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチド」）を提供する。幾つかの実施形態では、これら類似体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１０％以下を有し、例えば約１〜１０％、又は約０．１〜１０％、又は約０．１％、０．５％、若しくは１％より大きいが約１％、５％、若しくは１０％未満である。幾つかの実施形態では、これら類似体は、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１０％以下を有し、例えば、約１〜１０％、又は約０．１〜１０％、又は約０．１％、０．５％、若しくは１％より大きいが約１％、５％、若しくは１０％未満である。

【0019】

本発明の幾つかの態様では、ＧＩＰ受容体に対してアゴニスト活性を示す類似体は、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する配列番号１、及び類似体の２９位のアミノ酸のＣ末端側に１〜２１個のアミノ酸（例えば、５〜１８、７〜１５、９〜１２個のアミノ酸）の延長部分を含む。

【0020】

ある態様では、類似体は、少なくとも１個のアミノ酸修飾、及び最大１５個のアミノ酸修飾（例えば、多くとも１５個のアミノ酸修飾、多くとも１０個のアミノ酸修飾）を含む。例えば、類似体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸修飾を有する配列番号１を含むことができる。ある態様では、類似体は、少なくとも１個のアミノ酸修飾、最大１０個のアミノ酸修飾、及び追加的な保存的アミノ酸修飾を含む。更なる態様では、アミノ酸修飾の少なくとも１つは、類似体のＣ末端部分に安定化されたアルファヘリックス構造を付与する。安定化されたアルファヘリックス構造を達成する修飾は、本明細書に記載されている。例えば、アルファヘリックス／分子内架橋の安定化と題する項目の教示を参照されたい。

【0021】

アシル化又はアルキル化されたＣ末端延長部分、又は１〜６個の正荷電アミノ酸を含むＣ末端延長部分を含む類似体は、意外にもＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性の増加を示した。従って、ある態様では、３７〜４３位（配列番号１の付番による）のいずれかに位置する延長部分のアミノ酸の少なくとも１つは、天然アミノ酸に対して非天然であるアシル又はアルキル基を含んでおり、つまり延長部分はアシル化又はアルキル化されている。幾つかの実施形態では、アシル又はアルキル基は、アミノ酸に、例えばアミノ酸の側鎖を介して直接結合されている。他の実施形態では、アシル又はアルキル基は、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサー）を介してアミノ酸に結合されている。アシル又はアルキル基を含む好適なアミノ酸、並びに好適なアシル基及びアルキル基は、本明細書に記載されている。例えば、アシル化及びアルキル化と題する項目の教示を参照されたい。

【0022】

他の実施形態では、延長部分の１〜６個のアミノ酸（例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５個のアミノ酸）は、例えばＬｙｓ等の正荷電アミノ酸、例えば式ＩＶのアミノ酸である。本明細書で使用される場合、用語「正荷電アミノ酸」は、生理学的なｐＨ（例えば、ｐＨ６．８〜８．０、ｐＨ７．０〜７．７）においてその側鎖の原子に正電荷を含む、天然又は非天然のあらゆるアミノ酸を指す。ある態様では、正荷電アミノ酸は、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３位のいずれかに位置する。特定の実施形態では、正荷電アミノ酸は４０位に位置する。

【0023】

他の場合では、延長部分は、本明細書に記載のようにアシル化又はアルキル化されており、本明細書に記載のように１〜６個の正荷電アミノ酸を含む。

【0024】

更に他の実施形態では、ＧＩＰ受容体に対してアゴニスト活性を示す類似体は、（ｉ）少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する配列番号１、（ｉｉ）類似体の２９位のアミノ酸のＣ末端側の１〜２１個のアミノ酸（例えば、５〜１８、７〜１５、９〜１２個のアミノ酸）の延長部分、及び（ｉｉｉ）Ｃ末端延長部分の外側（例えば、１〜２９位のいずれか）に位置する天然アミノ酸に対して非天然であるアシル又はアルキル基を含むアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、類似体は、１０位にアシル化又はアルキル化アミノ酸を含む。特定の態様では、アシル又はアルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸アシル又はＣ４〜Ｃ３０アルキル基である。幾つかの実施形態では、アシル又はアルキル基は、スペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサーを介してアミノ酸に結合されている。ある態様では、類似体は、１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓ間の塩橋、又は１６、２０、２１、及び２４位のいずれか１、２、又は３箇所以上におけるアルファ，アルファ−ニ置換アミノ酸等の、アルファヘリックスを安定化させるアミノ酸修飾を含む。特定の態様では、類似体は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を付与するアミノ酸修飾を更に含む。更なるアミノ酸修飾を含む類似体が、本明細書で企図される。

【0025】

ある実施形態では、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、又は２０％）を示す。幾つかの実施形態では、類似体は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の２０％超（例えば、５０％超、７５％超、１００％超、２００％超、３００％超、５００％超）を示す。幾つかの実施形態では、類似体は、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体の１つ又は両方に対して測定可能なアゴニスト活性を示す。幾つかの態様では、これら受容体（ＧＩＰ受容体及びＧＬＰ−１受容体及び／又はグルカゴン受容体）の選択性は、１００倍以内である。例えば、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体のＧＬＰ−１受容体に対する選択性は、ＧＩＰ受容体及び／又はグルカゴン受容体に対する選択性の１００倍未満、５０倍以内、２５倍以内、１５倍以内、１０倍以内であってもよい。

【0026】

本明細書に記載のように、グルカゴン受容体に対する活性増加も示し、更なる実施形態では、生物物理学的安定性及び／又は水溶解度の増強を示す高度に強力なグルカゴンアゴニスト類似体が提供される。加えて、本発明の別の態様によると、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの選択性を喪失し、従ってそれら２つの受容体の同時アゴニストであるグルカゴンアゴニスト類似体が提供される。グルカゴン類似体内の選択されたアミノ酸修飾は、グルカゴン受容体に比べてＧＬＰ−１受容体に対する類似体の相対的活性を制御することができる。従って、本発明の更に別の態様は、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体に対してより高い活性を有するグルカゴン同時アゴニスト類似体、両受容体に対してほぼ同等の活性を有するグルカゴン同時アゴニスト類似体、及びグルカゴン受容体と比べてＧＬＰ−１受容体に対してより高い活性を有するグルカゴン同時アゴニスト類似体を提供する。後者の種類の同時アゴニストは、グルカゴン受容体に対する活性をほとんど又は全く示さないが、天然ＧＬＰ−１と同じか又はより良好な効力でＧＬＰ−１受容体を活性化する能力を保持するように操作することができる。これら類似体はいずれも、生物物理学的安定性及び／又は水溶解度の増強を付与する修飾を含むこともできる。

【0027】

グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対して同時アゴニズムを示すグルカゴン類似体は、幾つかの応用に有利である。まず第１には、低血糖症を治療するためのグルカゴンの使用は、低血糖レベルを過剰補償し、過剰な血糖レベルをもたらす場合がある。グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストが投与される場合、追加的なＧＬＰ−１刺激は、グルカゴンアゴニスト効果を緩衝化して、低血糖症の治療に起因する過剰なグルコース血中レベルを予防することができる。

【0028】

加えて、本明細書に記載のように、本発明のグルカゴン同時アゴニスト類似体を使用して、単独で又は他の抗糖尿病治療若しくは抗肥満治療と組み合わせて投与すると、高血糖症を制御するか、又は体重減少を誘導するか若しくは体重増加を防止することができる。体重減少を誘導する別の化合物は、小腸に見出される天然消化ホルモンであるオキシントモジュリンである（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００５； ５４：２３９０−２３９５を参照）。オキシントモジュリンは、グルカゴンの２９個アミノ酸の配列（つまり、配列番号１）及びその後に配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８個アミノ酸のカルボキシ端末延長部分を含有する３７個アミノ酸のペプチドである。本発明は、本明細書に記載のグルカゴン類似体が、この８個アミノ酸のカルボキシ末端延長部分（配列番号２７）に随意に結合されていてもよいことを企図するが、幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号２７の８個の連続したカルボキシアミノ酸を欠如する類似体及び類似体の使用も明確に企図する。

【0029】

化合物は、アミノ酸修飾により個別化して、ペプチドのＧＬＰ−１活性を制御することができ、従って本発明のグルカゴン類似体は、特定の状態又は疾患を治療するために特別に製作することができる。より詳しくは、各類似体が、それぞれのグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対して特徴的な相対的活性レベルを示すグルカゴン類似体が本明細書で提供される。例えば、各ペプチドに修飾を行って、天然ＧＬＰ１と比べてＧＬＰ−１受容体に対する活性の少なくとも約１％（少なくとも約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％を含む）から約２００％以上の範囲、及び天然グルカゴンと比べてグルカゴン受容体に対する活性の少なくとも約１％（約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％を含む）から約５００％以上の範囲を有するグルカゴンペプチドを産生することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴン活性の多くとも約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１活性の多くとも約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。天然グルカゴンのアミノ酸配列は配列番号１であり、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミドのアミノ酸配列は配列番号５２であり、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸のアミノ酸配列は配列番号５０である。例示的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの活性の少なくとも１０％及びＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１の活性少なくとも５０％、又はグルカゴン受容体に対して天然グルカゴン活性の少なくとも４０％及びＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１活性の少なくとも４０％、又はグルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の少なくとも６０％及びＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１活性の少なくとも６０％を示すことができる。

【0030】

ＧＬＰ−１受容体と比べたグルカゴン受容体に対するグルカゴンペプチドの選択性は、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の相対的比率（天然ＧＬＰ−１と比べたＧＬＰ−１受容体に対するペプチドの活性で除算された天然グルカゴンと比べたグルカゴン受容体に対するペプチドの活性）として記述することができる。例えば、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の６０％及びＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の６０％を示すグルカゴンペプチドは、１：１比のグルカゴン／ＧＬＰ−１活性を示す。グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の例示的な比率には、約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、若しくは１０：１、又は約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２若しくは１：１．５が含まれる。一例として、１０：１のグルカゴン／ＧＬＰ−１活性比は、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体の選択性が１０倍であることを示す。同様に、１０：１のＧＬＰ−１／グルカゴン活性比は、グルカゴン受容体と比べてＧＬＰ−１受容体の選択性が１０倍であることを示す。

【0031】

１つの実施形態によると、効力の増強並びに随意に溶解度及び安定性の向上を示すグルカゴン類似体が提供される。１つの実施形態では、グルカゴン効力の増強は、天然グルカゴン（配列番号１）の１６位のアミノ酸修飾により提供される。非限定的な例では、そのような効力の増強は、１６位の天然セリンを、グルタミン酸で、又は長さが４個の原子の側鎖を有する別の負荷電アミノ酸で、又はその代わりにグルタミン、ホモグルタミン酸、若しくはホモシステイン酸、若しくは少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有する側鎖を有し、側鎖の長さが約４個（又は３〜５個）の原子である荷電アミノ酸のいずれか１つで置換することにより提供することができる。１つの実施形態では、効力が増強されたグルカゴンアゴニストは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のペプチド、又は配列番号５のグルカゴンアゴニスト類似体を含む。１つの実施形態によると、野生型グルカゴンと比べてグルカゴン受容体に対して増強された効力を有するグルカゴン類似体タンパク質が提供され、このペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０の配列を含み、このグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体に対するその選択性を保持する。

【0032】

グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸修飾、例えば３位の天然グルタミンの置換により低減、維持、又は増強させることができる。１つの実施形態では、３位のアミノ酸を、酸性、塩基性、又は疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）で置換することにより、グルカゴン受容体活性が実質的に低減又は破壊されることが示される。例えば、グルタミン酸、オルニチン、又はノルロイシンで置換されている類似体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の約１０％以下を示し、例えば約１〜１０％、若しくは約０．１〜１０％、又は約０．１％より大きいが約１０％未満であるが、ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。例えば、本明細書に記載の例示的な類似体は、天然グルカゴン活性の約０．５％、約１％、又は約７％を示すが、ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。

【0033】

別の実施形態では、グルカゴンペプチドの３位の天然グルタミンをグルタミン類似体で置換して、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に喪失させず、ある場合には、グルカゴン受容体活性を増強させることができる。例えば、３位にグルタミン類似体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン（例えば、配列番号１）の活性の約５％、約１０％、約２０％、約５０％、又は約８５％以上を示すことができる。幾つかの実施形態では、３位にグルタミン類似体を含むグルカゴンペプチドは、３位の修飾アミノ酸を除いてグルタミン類似体を含むペプチドと同じアミノ酸配列（例えば、配列番号６０１又は配列番号６０２）を有する対応するグルカゴンペプチドの、グルカゴン受容体に対する活性の約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、約２００％、又は約５００％以上を示すことができる。幾つかの実施形態では、３位にグルタミン類似体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して活性の増強を示すが、活性の増強は、天然グルカゴン又は３位の修飾アミノ酸を除いてグルタミン類似体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有する対応するグルカゴンペプチドの活性の多くとも１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％である。

【0034】

幾つかの実施形態では、グルタミン類似体は、構造Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの側鎖を含む天然又は非天然アミノ酸であり、

【0035】

【化1】

【0036】

【化2】

【0037】

【化3】

【0038】

式中、Ｒ^１は、Ｃ_０〜３アルキル又はＣ_０〜３ヘテロアルキルであり、Ｒ^２は、ＮＨＲ^４又はＣ_１〜３アルキルであり、Ｒ^３は、Ｃ_１〜３アルキルであり、Ｒ^４は、Ｈ又はＣ_１〜３アルキルであり、Ｘは、ＮＨ、Ｏ、又はＳであり、Ｙは、ＮＨＲ^４、ＳＲ^３、又はＯＲ^３である。幾つかの実施形態では、ＸはＮＨであるか、又はＹはＮＨＲ^４である。幾つかの実施形態では、Ｒ^１はＣ_０〜２アルキル又はＣ_１ヘテロアルキルである。幾つかの実施形態では、Ｒ^２はＮＨＲ^４又はＣ_１アルキルである。幾つかの実施形態では、Ｒ^４はＨ又はＣ^１アルキルである。構造Ｉの例示的な実施形態では、Ｒ^１はＣＨ_２−Ｓであり、ＸはＮＨであり、Ｒ^２はＣＨ_３であり（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））；Ｒ^１はＣＨ_２であり、ＸはＮＨであり、Ｒ^２はＣＨ_３であり（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））；Ｒ^１はＣ_０アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ^２はＮＨＲ^４であり、Ｒ^４はＨであり（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））；又はＲ^１はＣＨ_２−ＣＨ_２であり、ＸはＮＨであり、Ｒ^２はＣＨ_３である（アセチルオルニチン、Ｏｒｎ（Ａｃ））。構造ＩＩの例示的な実施形態では、Ｒ^１はＣＨ_２であり、ＹはＮＨＲ^４であり、Ｒ^４はＣＨ_３であり（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））、構造ＩＩＩの例示的な実施形態では、Ｒ^１はＣＨ_２であり、Ｒ^４はＨであり（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））、特定の実施形態では、３位のアミノ酸は、Ｄａｂ（Ａｃ）で置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号５９５、配列番号６０１、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、及び配列番号６０６のアミノ酸配列を含むことができる。

【0039】

別の実施形態では、天然グルカゴンペプチドと比べてグルカゴン受容体に対する効力が増強又は保持されているが、ＧＬＰ−１受容体に対する大きな活性増強も示すグルカゴン類似体が提供される。グルカゴンは、通常、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１％を有するが、ＧＬＰ−１は、通常、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの活性の約０．０１％未満を有する。ＧＬＰ−１受容体に対する活性増強は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル酸を、アミド又はエステル等の荷電中性基で置換することにより提供される。１つの実施形態では、これらグルカゴン類似体は、カルボキシ端末アミノ酸が、天然アミノ酸に見出されるカルボキシル酸基の代りのアミド基を有する配列番号２０の配列を含む。これらグルカゴン類似体は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体の両方に対して強力な活性を有し、従って両受容体に対して同時アゴニストとして作用する。１つの実施形態によると、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体同時アゴニストが提供され、このペプチドは配列番号２０の配列を含み、２８位のアミノ酸がＡｓｎ又はＬｙｓであり、２９位のアミノ酸がＴｈｒ−アミドである。

【0040】

ＧＬＰ−１受容体に対する活性増強は、３個の介在アミノ酸により隔てられている２個のアミノ酸、つまりｉが１２〜２５の任意の整数である「ｉ」位のアミノ酸及び「ｉ＋４」位のアミノ酸の側鎖間の分子内架橋、２個の介在アミノ酸、つまりｊが１２〜２７の任意の整数である「ｊ」位のアミノ酸及び「ｊ＋３」位のアミノ酸による分子内架橋、又は６個の介在アミノ酸、つまりｋが１２〜２２の任意の整数である「ｋ」位のアミノ酸及び「ｋ＋７」位のアミノ酸による分子内架橋の形成により、グルカゴンのＣ末端部分にあるアルファヘリックス構造（アミノ酸１２〜２９付近）を安定化させることによっても提供される。例示的な実施形態では、架橋又はリンカーは、長さが約８個（又は約７〜９個）の原子であり、１２及び１６位、又は１６及び２０位、又は２０及び２４位、又は２４及び２８位のアミノ酸側鎖間で形成される。これらアミノ酸の側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、又は塩橋の形成等のイオン性相互作用により、又は共有結合により互いに結合されていてもよい。

【0041】

１つの実施形態によると、配列番号２０のグルカゴンペプチドを含み、１２、２０、又は２８位に位置するリジン残基側鎖と１６又は２４位に位置するグルタミン酸残基側鎖との間でラクタム環が形成されており、その側鎖がラクタム環の形成に寄与しているグルカゴンペプチドの２個のアミノ酸が、３個の介在アミノ酸により互いに隔てられているグルカゴンアゴニストが提供される。１つの実施形態によると、ラクタム保持グルカゴン類似体は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ラクタム保持ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、末端カルボキシル酸の代りにアミド基又はエステル基を含む。１つの実施形態では、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８のグルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８のカルボキシ末端に共有結合で結合された追加的なアミノ酸を更に含む。更なる実施形態では、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択される配列を含み、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９のカルボキシ末端に共有結合で結合された追加的なアミノ酸を更に含むグルカゴンペプチドが提供される。１つの実施形態では、２８位のアミノ酸は、アスパラギン又はリジンであり、２９位のアミノ酸は、トレオニンである。

【0042】

幾つかの特定の実施形態では、グルカゴンアゴニストペプチドのＣ末端部分にあるアルファヘリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の共有結合性分子内架橋の形成により達成される。例えば、好適な共有結合を形成する方法（つまり、共有結合性分子内架橋を形成する手段）には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づく環化、ジスルフィド架橋又は修飾硫黄含有架橋の形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属原子架橋の形成、及びペプチド環化の他の手段のいずれか１つ又は複数が含まれ、アルファヘリックスを安定させるために使用される。

【0043】

ＧＬＰ−１受容体に対する活性増強は、所望の活性を保持する位置に１つ又は複数のα，α−二置換アミノ酸を導入することにより、グルカゴンペプチドのＣ末端部分にあるアルファヘリックス構造（アミノ酸１２〜２９付近）を安定化させることによっても提供される。幾つかの態様では、アルファヘリックスの安定化は、塩橋又は共有結合等の分子内架橋を意図的に導入せずに、この様式で達成される。そのようなペプチドは、分子内架橋を欠如するペプチドとして、本明細書にて考慮することができる。特定の態様では、アルファヘリックスの安定化は、共有結合性分子内架橋、例えばラクタム架橋、ジスルフィド架橋を導入せずに、１つ又は複数のα，α−二置換アミノ酸を導入することにより達成される。そのようなペプチドは、共有結合性分子内架橋を欠如するペプチドとして、本明細書にて考慮することができる。幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は２９位のうちの１、２、３、又は４箇所以上が、α，α−二置換アミノ酸で置換される。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるグルカゴンペプチドの１６位の置換は、塩橋又はラクタムの非存在下で、ＧＬＰ−１活性を増強する。幾つかの実施形態では、１６、２０、２１、又は２４位のうちの１、２、又は３箇所以上が、ＡＩＢで置換される。

【0044】

分子内架橋（例えば、共有結合性分子内架橋）を欠如するグルカゴン類似体ペプチドのＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性増強は、ペプチドの１０位のアミノ酸側鎖にアシル又はアルキル基を付加することにより提供される。幾つかの態様では、アシル又はアルキル基は、天然ではアミノ酸に存在しない。特定の態様では、アシル又はアルキル基は、いかなる天然アミノ酸に対しても非天然である。幾つかの実施形態では、アシル基は、脂肪酸アシル基、例えばＣ４〜Ｃ３０脂肪酸アシル基である。例えば、本明細書では、共有結合性分子内架橋を欠如し、１６位にＡＩＢを含み、Ｃ１４、Ｃ１６、又はＣ１８脂肪酸アシル基が共有結合で１０位のＬｙｓ残基に結合されているグルカゴン類似体ペプチドが提供される。また、分子内架橋（例えば、共有結合性分子内架橋）を欠如し、２及び１６位にＡＩＢを含み、Ｃ１４、Ｃ１６、又はＣ１８脂肪酸アシル基が共有結合で１０位のＬｙｓ残基に結合されているグルカゴン類似体ペプチドが提供される。分子内架橋（例えば、共有結合性分子内架橋）を欠如するそのようなアシル化グルカゴン類似体ペプチドは、本明細書に更に記載のようにペグ化されていてもよい。

【0045】

分子内架橋（例えば、分子内架橋）を欠如するアシル化グルカゴン類似体ペプチドのＧＬＰ−１活性及びグルカゴン活性の更なる増強は、アシル又はアルキル基と１０位のアミノ酸側鎖との間にスペーサーを組み込むことにより達成することができる。幾つかの実施形態によると、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、又は疎水性の二官能性スペーサー）は、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）である。ある特定の実施形態によると、スペーサー及びアシル又はアルキル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば１７〜２８個の、１９〜２６個の原子、１９〜２１個の原子である。分子内架橋（例えば、共有結合性分子内架橋）を欠如するアシル化又はアルキル化ペプチドのＧＬＰ−１活性及びグルカゴン活性を増強するために好適なスペーサーは、本明細書にて更に記載されている。

【0046】

例えば、本明細書では、アシル基又はアルキル基を含み、多くとも１０個のアミノ酸修飾が配列番号１とは異なる非天然グルカゴンペプチドが提供され、アシル又はアルキル基はスペーサーに結合されており、スペーサーは、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸側鎖に結合されており、前記グルカゴンペプチドが、親水性部分、例えばＰＥＧを欠如する場合、前記グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１活性の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、約１００％、約１５０％、約２００％、約４００％、約５００％以上）を示す。幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドが親水性部分、例えばＰＥＧを欠如する場合、グルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の少なくとも０．５％（例えば、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％）を示す。幾つかの実施形態では、上述のグルカゴンペプチドは、上記に示されている活性のいずれか、及びグルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の多くとも約１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示すことができる。幾つかの実施形態では、上述のグルカゴンペプチドは、上記に示されている活性のいずれか、及びＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１活性の多くとも約１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示すことができる。

【0047】

ＧＬＰ−１受容体に対する活性増強は、２０位のアミノ酸修飾によっても提供される。１つの実施形態では、２０位のグルタミンは、電荷を有するか又は水素結合する能力を有するかのいずれかである側鎖を有する別の親水性アミノ酸で置換されており、長さが少なくとも約５個（又は、約４〜６個）の原子であり、例えば、リジン、シトルリン、アルギニン、又はオルニチンである。

【0048】

ＧＬＰ−１活性は、（ｉ）Ｃ末端アルファカルボキシラート基、（ｉｉ）ヒドロキシル基を欠如するアミノ酸、例えばＡｂｕ又はＩｌｅによる７位Ｔｈｒの置換、（ｉｉｉ）２７又は２８位のアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸（複数可）を欠失させて（例えば、２８位のアミノ酸の欠失、２８及び２９位のアミノ酸の欠失）、長さが２７又は２８個アミノ酸のペプチドを産生すること、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを含むことにより低減させることができる。

【0049】

グルカゴン受容体活性を増加又は減少させ、ＧＬＰ−１受容体活性を増加させる上述の修飾はいずれも、個々に又は組み合わせて適用することができる。ＧＬＰ−１受容体活性を増加させる修飾の組み合わせは、そのような修飾のいずれかを単独で使用した場合よりも高いＧＬＰ−活性を提供する場合がある。例えば、本発明は、１６位、２０位、及びＣ末端カルボキシル酸基における修飾を含み、随意に１６及び２０位のアミノ酸間に共有結合を有するグルカゴン類似体；１６位及びＣ末端カルボキシル酸基における修飾を含むグルカゴン類似体；１６及び２０位における修飾を含み、随意に１６及び２０位のアミノ酸間に共有結合を有するグルカゴン類似体；並びに２０位及びＣ末端カルボキシル酸基における修飾を含むグルカゴン類似体を提供し、但し随意に１２位のアミノ酸はＡｒｇではなく、又は但し随意に９位のアミノ酸はＧｌｕではない。

【0050】

本明細書に記載の１又は２位における他の修飾は、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）切断に対するペプチドの耐性を増加させることができる。例えば、２位のアミノ酸は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、又はアミノイソ酪酸で置換されてもよい。その代わりに又はそれに加えて、１位のアミノ酸は、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、又はアルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ、ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で置換されてもよい。

【0051】

２位における修飾（例えば２位のＡＩＢ）及び幾つかの場合では１位における修飾が、グルカゴン活性を時には著しく低減する場合があることが観察され、驚くべきことに、グルカゴン活性のこの低減は、例えば、「ｉ」及び「ｉ＋４」位、例えば１２及び１６位、１６及び２０位、又は２０及び２４位のアミノ酸間の共有結合によって、グルカゴンのＣ末端部分にあるアルファヘリックスを安定化させることにより回復させることができる。幾つかの実施形態では、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリジンとの間のラクタム架橋である。幾つかの実施形態では、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、好適な共有結合を形成する方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づく環化、ジスルフィド架橋又は修飾硫黄含有架橋の形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属原子架橋の形成、及びペプチド環化の他の手段のいずれか１つ又は複数が含まれる。

【0052】

大型芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ）による１位のＨｉｓの非保存的置換を含有し、ＧＬＰ−１活性を有するグルカゴンペプチドは、アルファヘリックスが、分子内架橋により、例えば「ｉ」及び「ｉ＋４」位の、例えば１２及び１６位、１６及び２０位、２０及び２４位のアミノ酸間の共有結合により安定化されれば、ＧＬＰ−１活性を保持することができる。幾つかの実施形態では、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリジンとの間のラクタム架橋である。幾つかの実施形態では、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、好適な共有結合を形成する方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づく環化、ジスルフィド架橋又は修飾硫黄含有架橋の形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属原子架橋の形成、及びペプチド環化の他の手段のいずれか１つ又は複数が含まれる。

【0053】

また更なる例示的な実施形態では、先述の化合物のいずれかを、配列番号１の１５位のアミノ酸を修飾することにより更に修飾して安定性を向上させ、特に酸性又はアルカリ性緩衝液中での経時的なペプチドの分解を低減することができる。

【0054】

別の実施形態では、本明細書で開示されたグルカゴンペプチドの溶解度は、ペプチドに親水性部分を共有結合で結合することにより増強される。１つの実施形態では、親水性部分は、随意にＣ末端延長部分内の１６、１７、２１、２４、２９位の１箇所若しくは複数箇所又はＣ末端アミノ酸においてペプチドに結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。幾つかの実施形態では、その位置の天然アミノ酸は、ペプチドへの親水性部分の結合を容易にするために、親水性部分との架橋結合に好適な側鎖を有するアミノ酸で置換される。他の実施形態では、親水性基を含むように修飾されたアミノ酸は、ペプチドのＣ末端アミノ酸に付加される。１つの実施形態では、ペプチド同時アゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群から選択される配列を含み、前記グルカゴンペプチドの１６、１７、２１、又は２４位のうちの１つのアミノ酸残基側鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖を更に含む。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。更に他の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。

【0055】

別の実施形態では、上記のグルカゴン類似体のいずれかの溶解度は、ペプチドのＣ末端部分に、好ましくは配列番号１の２７位のＣ末端側の位置に、荷電アミノ酸を導入するアミノ酸置換及び／又は付加により向上させることができる。随意に、１、２、又は３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分内に、好ましくは２７位のＣ末端側に導入してもよい。１つの実施形態によると、２８及び／又は２９位の天然アミノ酸（複数可）が、荷電アミノ酸で置換され、及び／又は更なる実施形態では、１〜３個の荷電アミノ酸もペプチドのＣ末端に付加される。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１個、２個、又は全てが、負に荷電されている。グルカゴン活性を依然として保持することを可能にさせる追加的な修飾、例えば保存的置換をグルカゴンペプチドに行ってもよい。１つの実施形態では、配列番号２０のペプチドの類似体が提供され、類似体は、１７〜２６位における１〜２個のアミノ酸置換が配列番号２０と異なっており、１つの実施形態では、類似体は、２０位のアミノ酸置換が配列番号２０のペプチドと異なっている。

【0056】

幾つかの実施形態によると、本明細書で開示されたグルカゴンペプチドは、１又は２個のアミノ酸残基だけＣ末端を切断することにより修飾される。そのような修飾グルカゴンペプチドは、本明細書に示されているように、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対する同様の活性及び効力を保持する。この点で、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載の追加的な修飾のいずれかを随意に有する、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１〜２７又は１〜２８を含むことができる。

【0057】

１つの実施形態によると、本明細書で開示されたグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に第２のペプチド、例えば配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８を付加することにより修飾される。１つの実施形態では、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるペプチド配列を有するグルカゴンペプチドは、ペプチド結合により第２のペプチドに共有結合で結合されており、第２のペプチドは、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択される配列を含む。更なる実施形態では、Ｃ末端延長部分を含むグルカゴンペプチドでは、天然グルカゴンペプチドの２９位のトレオニンがグリシンに置換されている。２９位のトレオニンのグリシン置換を有し、配列番号２６のカルボキシ末端延長部分を含むグルカゴン類似体は、ＧＬＰ−１受容体に対して、配列番号２６のカルボキシ末端延長部分を含むように修飾された天然グルカゴンよりも４倍強力である。ＧＬＰ−１受容体に対する効力は、１８位の天然アルギニンをアラニンに置換することにより更に増強することができる。

【0058】

本明細書で開示されたグルカゴンペプチドはいずれも、アシル基又はアルキル基、例えばＣ４〜Ｃ３０アシル又はアルキル基を含むように修飾することができる。幾つかの態様では、アシル基又はアルキル基は、あらゆる天然アミノ酸に対して非天然である。アシル化又はアルキル化は、グルカゴンペプチドの血中半減期を増加させることができる。アシル化又はアルキル化は、有利には、グルカゴン及び／又はＧＬＰ−１受容体に対する作用開始を遅延及び／又は作用持続時間を延長し、及び／又はＤＰＰ−ＩＶ等のプロテアーゼに対する耐性を向上させる。本明細書に示されているように、グルカゴンペプチドのグルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対する活性は、アシル化した後、実質的に増強されないとしても、維持される。更に、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、実質的に増強されないとしても、グルカゴンペプチドの非アシル化型と同等であった。グルカゴンペプチドは、親水性部分が結合されているのと同じアミノ酸位置で、又は異なるアミノ酸位置でアシル化又はアルキル化されていてもよい。幾つかの実施形態では、本発明は、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸に共有結合で結合されたアシル基又はアルキル基を含むように修飾されたグルカゴンペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸と、アシル基又はアルキル基との間のスペーサーを更に含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、アシル基は、脂肪酸又は胆汁酸、又はその塩、例えばＣ４〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル、又は胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシル又はアルキル基を結合させるのに好適な反応基を有する任意の部分である。例示的な実施形態では、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、又は疎水性の二官能性スペーサーを含む。幾つかの実施形態では、スペーサーは、以下のものからなる群から選択される：Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、及びｍが１〜６の任意の整数であり、ｎが２〜１２の任意の整数であるＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）_ｍＣＯＯＨを含むスペーサー。そのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分、随意にポリエチレングリコールを更に含むこともできる。先述のグルカゴンペプチドはいずれも、２つのアシル基又は２つのアルキル基、又はそれらの組み合わせを含んでいてもよい。

【0059】

従って、本明細書で開示されたように、溶解度及び／又は安定性の向上も示す高度に強力なグルカゴン類似体又はグルカゴン同時アゴニスト類似体が提供される。例示的な高度に強力なグルカゴン類似体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも約２００％を示し、随意に、６〜８の、又は６〜９の、又は７〜９（例えば、ｐＨ７）のｐＨにおいて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶性であり、随意に、２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持する（例えば、元のペプチドの５％以下が、分解又は切断される）。別の例として、例示的なグルカゴン同時アゴニスト類似体は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体の両方（約１：３〜３：１、又は約１：２〜２：１の比率で）に対して、約４０％を超える又は約６０％を超える活性を示し、随意に、６〜８の、又は６〜９、又は７〜９（例えば、ｐＨ７）のｐＨにおいて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶性であり、随意に、２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持する。別の例示的なグルカゴン同時アゴニスト類似体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１７５％以上、及びＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約２０％以下を示し、随意に、６〜８の、又は６〜９の、又は７〜９（例えば、ｐＨ７）のｐＨにおいて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶性であり、随意に、２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持する。更に別の例示的なグルカゴン同時アゴニスト類似体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１０％以下、及びＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも約２０％を示し、随意に、６〜８の、又は６〜９の、又は７〜９（例えば、ｐＨ７）のｐＨにおいて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶性であり、随意に、２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持する。更に別の例示的なグルカゴン同時アゴニスト類似体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の約１０％以下であるが、０．１％、０．５％、又は１％を超える活性示し、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以上を示し、随意に、６〜８の、又は６〜９の、又は７〜９（例えば、ｐＨ７）のｐＨにおいて少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶性であり、随意に、２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持する。幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の多くとも約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。幾つかの実施形態では、そのようなグルカゴン類似体は、天然グルカゴンの対応する位置の天然アミノ酸の少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個を保持する（例えば、天然グルカゴンと比べて１〜７、１〜５、又は１〜３個の修飾を有する）。

【0060】

以下のペプチドのいずれか１つは本発明の化合物から除外されるが、所望のＧＬＰ−１又は同時アゴニスト活性を示し、本明細書に記載の１つ又は複数の更なる修飾をそれに含む以下のペプチドのいずれか、そのような化合物を使用する医薬組成物、キット、及び治療方法が、本発明に含まれていてもよい：［Ａｒｇ１２］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；［Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２０］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；［Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２４］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；［Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２９］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；［Ｇｌｕ９］置換を有する配列番号１のペプチド；Ｈｉｓ１を欠如し、［Ｇｌｕ９、Ｇｌｕ１６、Ｌｙｓ２９］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；［Ｇｌｕ９、Ｇｌｕ１６、Ｌｙｓ２９］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合された［Ｌｙｓ１３、Ｇｌｕ１７］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合された［Ｌｙｓ１７、Ｇｌｕ２１］置換及びＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；Ｈｉｓ１を欠如し、ラクタム架橋を介して結合された［Ｇｌｕ２０、Ｌｙｓ２４］置換を有する配列番号１のペプチド。

【0061】

１つの実施形態によると、好ましくは無菌であり、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度レベルである、本明細書で開示された新規のグルカゴンペプチドのいずれか、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくともＡ濃度のグルカゴンペプチドを含有していてもよく、Ａは、０．００１ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、又は２５ｍｇ／ｍｌ以上である。他の実施形態では、そのような組成物は、最大でＢ濃度のグルカゴンペプチドを含有していてもよく、Ｂは、３０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２３、ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、又は０．１ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態では、組成物は、Ａ〜Ｂｍｇ／ｍｌ、例えば０．００１〜３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のグルカゴンペプチドを含有していてもよい。１つの実施形態では、医薬組成物は、滅菌され随意に種々の容器内に保管されている水溶液を含む。１つの実施形態によると、本発明の化合物を使用して、すぐに注射できる事前に製剤化された溶液を調製することができる。他の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物は、患者に組成物を投与するための使い捨てデバイスを含むキットの一部として更にパーケージ化することができる。容器又はキットは、周囲室温又は冷却温度で保管するように表示されていてもよい。

【0062】

１つの実施形態によると、本発明のグルカゴンペプチドの事前に製剤化された水溶性組成物を使用して、グルコースレベルを急速に増加させるか又は低血糖症を治療する方法が提供される。この方法は、本開示の新規修飾グルカゴンペプチドを含む有効量の水溶液を投与するステップを含む。１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの２１又は２４位でペグ化されており、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。１つの実施形態では、修飾グルカゴン溶液は、低血糖症を罹患している患者に組成物を投与するために使用されるデバイスに事前パッケージ化されている。

【0063】

１つの実施形態によると、インスリン依存性患者の血糖レベルを調節する改良された方法が提供される。この方法は、糖尿病を管理するための治療上有効量のインスリンを投与するステップと、低血糖症を予防するための治療上有効量の本開示の新規修飾グルカゴンペプチドを投与ステップとを含み、前記投与ステップは、互いの１２時間以内に実施される。１つの実施形態では、グルカゴンペプチド及びインスリンは、単一組成物として同時投与され、グルカゴンペプチドは、約５，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するＰＥＧ鎖でペグ化されている。

【0064】

別の実施形態では、腸管の一時的麻痺を誘導するための方法が提供される。この方法は、本明細書で開示されたグルカゴンペプチドの１つ又は複数を患者に投与するステップを含む。

【0065】

メタボリック症候群は、代謝Ｘ症候群、インスリン抵抗症候群、又はＲｅａｖｅｎ症候群としても知られており、５０００万人を超えるアメリカ人に影響を及ぼす障害である。メタボリック症候群は、典型的には、以下のリスク因子の少なくとも３つ以上が当てはまることを特徴とする：（１）腹部肥満（腹部の及び腹部周囲の過剰な脂肪組織）、（２）アテローム生成性脂質異常症（動脈壁におけるプラークの蓄積を増強する高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロール、及び高ＬＤＬコレステロールを含む血中脂質量障害）、（３）高血圧、（４）インスリン抵抗性又はグルコース不耐性、（５）血栓形成促進性状態（例えば、血液中の高フィブリノゲン又はプラスミノゲン活性化因子阻害因子−１）、及び（６）炎症促進性状態（例えば、血中のＣ反応性タンパク質上昇）。他のリスク因子には、老化、ホルモン失調、及び遺伝的疾病素質が含まれていてもよい。

【0066】

メタボリック症候群には、アテローム動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）と呼ばれる、脳卒中及び末梢血管疾患等の、血管プラークの蓄積と関連する冠状動脈性心疾患及び他の障害のリスクが伴う。メタボリック症候群の患者は、その初期段階のインスリン抵抗性状態から末期のＩＩ型糖尿病に進行し、ＡＳＣＶＤのリスクが更に増加する可能性がある。いかなる特定の理論により束縛されないが、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、及び血管疾患間の関係性には、インスリン刺激性血管拡張障害、酸化ストレスの増強よるインスリン抵抗性関連のＮＯ利用能の低下、及びアディポネクチン等の脂肪細胞由来ホルモン異常を含む１つ又は複数の同時発症機序が関与している可能性がある（Ｌｔｅｉｆ ａｎｄ Ｍａｔｈｅｒ， Ｃａｎ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０ （ｓｕｐｐｌ． Ｂ）：６６Ｂ−７６Ｂ （２００４））。

【0067】

２００１年全国コレステロール教育プログラム成人治療調査（ＡＴＰ ＩＩＩ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ）によると、同一個人における以下の体質のうちのいずれか３つが、メタボリック症候群の基準を満たす：（ａ）腹部肥満（男性では１０２ｃｍを超える胴囲、及び女性では８８ｃｍを超える胴囲）、（ｂ）血清トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）、（ｃ）ＨＤＬコレステロール（男性では４０ｍｇ／ｄｌ以下、及び女性では５０ｍｇ／ｄｌ以下）、（ｄ）血圧（１３０／８５以上）、及び（ｅ）空腹時血中グルコース（１１０ｍｇ／ｄｌ以上）。世界保健機構（ＷＨＯ）によると、以下の基準の少なくとも２つと共に高インスリンレベル（空腹時血中グルコース上昇又は食後グルコース上昇のみ）を有する個人が、メタボリック症候群の基準を満たす：（ａ）腹部肥満（０．９を超える胴囲対腰囲比率、少なくとも３０ｋｇ／ｍ^２の肥満度指数、又は３７インチを超える胴囲測定）、（ｂ）少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌのトリグリセリドレベル又は３５ｍｇ／ｄｌ未満のＨＤＬコレステロールを示すコレステロール調査、（ｃ）１４０／９０以上の血圧、又は高血圧の治療中（Ｍａｔｈｕｒ， Ｒｕｃｈｉ， “Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，” ｅｄ． Ｓｈｉｅｌ， Ｊｒ．， Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ， ＭｅｄｉｃｉｎｅＮｅｔ．ｃｏｍ， Ｍａｙ １１， ２００９）。

【0068】

本明細書の目的では、個人が、２００１年全国コレステロール教育プログラム成人治療調査又はＷＨＯにより示された基準のいずれか又は両方を満たせば、その個人は、メタボリック症候群であるとみなされる。

【0069】

いかなる特定の理論に束縛されないが、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、メタボリック症候群の治療に有用である。従って、本発明は、対象体のメタボリック症候群を予防又は治療する、又はその１つ、２つ、又は３つ以上のリスク因子を低減する方法であって、メタボリック症候群又はそのリスク因子を予防又は治療するのに有効な量の、本明細書に記載のグルカゴンペプチドを対象体に投与することを含む方法を提供する。

【0070】

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、単純な脂肪肝（脂肪症）から、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に、肝硬変（不可逆的で進行性の肝臓瘢痕化）に及ぶ幅広い肝臓病を指す。ＮＡＦＬＤの全ての段階には、肝臓細胞（肝細胞）における脂肪蓄積（脂肪浸潤）が共通している。単純な脂肪肝は、あるタイプの脂肪、トリグリセリドの肝臓細胞における異常蓄積であり、炎症又は瘢痕を示さない。ＮＡＳＨでは、脂肪蓄積は、様々な程度の炎症（肝炎）及び肝臓瘢痕化（線維症）に関連する。炎症細胞は、肝臓細胞を破壊する場合がある（肝細胞性ネクローシス）。「脂肪性肝炎」及び「脂肪壊死」という用語では、脂肪性とは脂肪浸潤を指し、肝炎とは肝臓の炎症を指し、ネクローシスとは肝臓細胞の破壊を指す。ＮＡＳＨは、最終的に肝臓瘢痕化（線維症）に結び付き、その後不可逆で進行性の瘢痕化（肝硬変）に結び付く場合がある。ＮＡＳＨによって引き起こされる肝硬変は、広域ＮＡＦＬＤの最後の最も重篤な段階である（Ｍｅｎｄｌｅｒ， Ｍｉｃｈｅｌ， “Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ： Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ （ＮＡＦＬＤ） ａｎｄ Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ （ＮＡＳＨ），” ｅｄ． Ｓｃｈｏｅｎｆｉｅｌｄ， Ｌｅｓｌｉｅ Ｊ．， ＭｅｄｉｃｉｎｅＮｅｔ．ｃｏｍ， Ａｕｇｕｓｔ ２９， ２００５）。

【0071】

アルコール性肝疾患又はアルコール誘発性肝疾患は、アルコールの過剰摂取に関連するか又はそれにより引き起こされる３つの病理学的に異なる肝臓疾患：脂肪肝（脂肪症）、慢性又は急性肝炎、及び肝硬変を包含する。アルコール性肝炎は、臨床検査での異常が疾患の唯一の兆候である軽症の肝炎から、黄疸（ビリルビン滞留により引き起こされる黄色皮膚）、肝性脳障害（肝不全により引き起こされる神経学的機能障害）、腹水症（腹部の液体貯留）、食道静脈瘤出血（食道の静脈瘤）、血液凝固異常、及び昏睡等の合併症を有する重篤な肝機能障害に及び場合がある。組織学的に、アルコール性肝炎は、肝細胞の気球状変性、好中球を有する炎症、及び時にはマロリー体（細胞性中間径フィラメントタンパク質の異常凝集）を有する特徴的な外観を示す。肝硬変は、肝臓の広範な小結節と線維症との組み合わせを解剖学的な特徴とする（Ｗｏｒｍａｎ， Ｈｏｗａｒｄ Ｊ．， “Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ”， Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｗｅｂｓｉｔｅ）。

【0072】

いかなる特定の理論に束縛されないが、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、例えば、脂肪症、脂肪性肝炎、肝炎、肝性炎症、ＮＡＳＨ、肝硬変、又はそれらの合併症を含む、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、又はそれらの任意の段階の治療に有用である。従って、本発明は、対象体のアルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、又はそれらの任意の段階を予防又は治療する方法であって、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、又はそれらの段階を予防又は治療するのに有効な量の、本明細書に記載のグルカゴンペプチドを対象体に投与することを含む方法を提供する。そのような治療方法には、以下のうちの１つ、２つ、又は３以上を低減することを含む：肝臓脂肪含量、肝硬変の発症又は進行、肝細胞癌の発症、炎症の徴候、例えば肝酵素レベル異常（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ及び／又はアラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ、又はＬＤＨ）、血清フェリチン上昇、血清ビリルビン上昇、及び／又は線維症の徴候、例えばＴＧＦ−ベータレベル上昇。好ましい実施形態では、グルカゴンペプチドは、単純な脂肪肝（脂肪症）を超えて進行し、炎症又は肝炎の徴候を示す患者を治療するために使用される。そのような方法は、例えば、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルの低減をもたらすことができる。

【0073】

更に別の実施形態では、高血糖症を治療する方法、又は体重増加を低減又は体重減少を誘導する方法が提供され、それには、本発明のグルカゴンペプチドを含む有効量の水溶液を投与することが伴う。１つの実施形態では、いずれの方法も、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群から選択されるグルカゴンアゴニストを含む有効量の組成物を投与することを含む。別の実施形態では、この方法は、グルカゴンアゴニストを含む有効量の組成物を投与することを含み、グルカゴンアゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるグルカゴンペプチドを含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９は、ペプチド結合により第２のペプチドに結合されており、前記第２のペプチドは、配列番号２６、配列番号２７、又は配列番号２８の配列を含む。更なる実施形態では、従来の用量又は低減された用量のインスリン及び本発明のグルカゴンペプチドを同時投与することを伴う糖尿病を治療する方法が提供される。インスリンを同時投与せずに、本発明のグルカゴンペプチドを用いて糖尿病を治療する方法も提供される。

【0074】

更に別の態様では、本発明は、高血糖症を治療するための新規な方法、及び食欲を減退させるか又は体重減少を促進するための新規な方法であって、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体を両方とも活性化するグルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子（その薬学的に許容される塩を含む）を投与することを含む方法を提供する。グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体の両方のアゴニズム、つまり活性化は、高血糖症の治療に際し、ＧＬＰ−１アゴニズム単独で比較して、予想外の改善性を提供する。従って、グルカゴンアゴニズムの付加は、予想外の相加効果若しくは相乗効果、又は他の予想外の臨床的有益性（複数可）を提供する。そのような方法により、従来の用量のインスリンと共に、低減された量のインスリンと共に、又はインスリンを用いずに投与することが企図される。グルカゴン受容体のアゴニズムは、体重減少の促進又は体重増加の防止に際し、ＧＬＰ−１アゴニズム単独と比較して予想外の有益効果も示す。

【0075】

例示的なグルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子には、本発明のグルカゴンペプチド、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体を両方とも活性化するＧＬＰ−１類似体、グルカゴン及びＧＬＰ−１の融合体、又はグルカゴン類似体及びＧＬＰ−１類似体の融合体、又は化学的に修飾されたそれらの誘導体が含まれる。或いは、グルカゴン受容体を活性化する化合物は、ＧＬＰ−１受容体を活性化する化合物（ＧＬＰ−１類似体、エキセンディン−４類似体、又はそれらの誘導体等）と共に同時投与することができる。本発明は、ＧＬＰ−１アゴニスト類似体と共にグルカゴンアゴニスト類似体を同時投与することも企図する。

【0076】

高血糖症を治療するための、及び／又は食欲を減退させるか若しくは体重減少を促進するためのそのような方法には、随意に１６位及び／又は２０位における修飾と組み合わせて、１２位（例えば、Ａｒｇ１２）における修飾を有するグルカゴン類似体の投与が含まれる。本発明の方法は、３個の介在アミノ酸により隔てられているアミノ酸１２〜２９の領域内の２つのアミノ酸、例えば１２及び１６位、１３及び１７位（例えば、Ｌｙｓ１３ Ｇｌｕ１７又はＧｌｕ１３ Ｌｙｓ１７）、１６及び２０位、１７及び２１位（例えば、Ｌｙｓ１７ Ｇｌｕ２１又はＧｌｕ１７ Ｌｙｓ２１）、２０及び２４位、又は２４及び２８位の側鎖間の分子内架橋を含み、但し随意に９位のアミノ酸はＧｌｕではなく、随意にＣ末端アミド又はエステルを含むグルカゴン類似体の投与も含む。

【0077】

１つの実施形態によると、そのようなグルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子から除外されるのは、そのような方法に有用であることが知られている従来技術のあらゆるグルカゴン類似体又はＧＬＰ−１類似体である。別の実施形態では、糖尿病を治療するためのＧＬＰ−１アゴニスト及びグルカゴンアンタゴニストの両方として作用する、米国特許第６，８６４，０６９号に記載のペプチドも、グルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子として除外される。別の実施形態では、Ｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４：７８９−７９４ （１９８９）、Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ４４：３１０９−３１１６ （２００１）、及びＳａｐｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， ８（５）：２５１−２６２ （２００２）に記載のアンタゴニスト等の、糖尿病を治療するためのグルカゴンアンタゴニストの使用が除外される。更なる実施形態では、オキシントモジュリン（配列番号２７）の８個のＣ末端アミノ酸を含有するオキシントモジュリン又はグルカゴン類似体も、グルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子として除外される。

【0078】

高血糖症を治療するためのそのような方法は、糖尿病、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、又は妊娠性糖尿病、インスリン依存性又はインシュリン非依存性のいずれか、並びに腎症、網膜症、及び血管疾患を含む糖尿病の合併症の低減を含む、様々なタイプの高血糖症に有用であることが予測される。食欲を減退させるか又は体重の減少を促進するためのそのような方法は、体重の低減、体重増加の防止、又は薬物誘導性肥満を含む原因が様々な肥満の治療、及び血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再灌流等）を含む肥満関連合併症の低減に有用であることが予測される。

【0079】

本明細書に記載の治療方法、医薬組成物、キット、及び他の類似実施形態は全て、グルカゴン類似体という用語の使用が、薬学的に許容される塩又はそれらのエステルを全て含むことを企図する。

【図面の簡単な説明】

【0080】

【図1】３７℃でそれぞれ２４、４８、７２、９６、１４４、及び１６６時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ^２１マレイミドＰＥＧ_５Ｋの安定性を示す棒グラフである。

【図2】３７℃でそれぞれ２４、７２、又は１４４時間ｐＨ５にてインキュベートしたグルカゴンＣｙｓ^２１マレイミドＰＥＧ_５ＫのＨＰＬＣ分析から生成されたデータを示す図である。

【図3】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図３Ａでは、グルカゴン類似体Ｅ１６、Ｋ２０（●）、Ｅ１５、Ｅ１６（▲）、Ｅ１６、Ｋ２０（▼）、Ｅ１５、Ｅ１６（▲を９０度左回転させたもの）、Ｅ１６（▲を９０度右回転させたもの）、及びＧｌｕｃ−ＮＨ_２（■）によるグルカゴン受容体の誘導が比較されている。

【図4A】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図４Ａでは、天然グルカゴン（■）と比べた、グルカゴン類似体Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲）、Ｅ３、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▼）、Ｏｒｎ３、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度左回転させたもの）、及びＮｌｅ３、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度右回転させたもの）によるグルカゴン受容体の誘導が比較されている。

【図4B】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図４Ｂでは、天然ＧＬＰ−１（■）と比べた、グルカゴン類似体Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲）、Ｅ３、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▼）、Ｏｒｎ３、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度左回転させたもの）、及びＮｌｅ３、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度右回転させたもの）によるグルカゴン受容体の誘導が比較されている。

【図5A】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図５Ａでは、グルカゴンＮＨ_２（■）と比べた、グルカゴン類似体（Ｅ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）（５ｎＭ、原液）、Ｅ１５、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲）（５ｎＭ、原液）、Ｅ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▼）（１０ｎＭ、原液）、Ｅ１５、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度左回転させたもの）（１０ｎＭ、原液）、及びＥ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度右回転させたもの）によるグルカゴン受容体の誘導が比較されている。

【図5B】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図５Ｂでは、ＧＬＰ−１（■）及びグルカゴン−ＮＨ_２（□）と比べた、グルカゴン類似体（Ｅ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）、Ｅ１５、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲）、及びＥ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度右回転させたもの））によるＧＬＰ−１受容体の誘導が比較されている。

【図6A】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図６Ａでは、グルカゴン（■）と比べた、グルカゴン類似体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）、Ｋ１２ Ｅ１６−ＮＨ_２ラクタム（▲）、Ｅ１６ Ｋ２０−ＮＨ_２ラクタム（▼）、Ｋ２０ Ｅ２４−ＮＨ_２ラクタム（▲を９０度左回転させたもの）、及びＥ２４ Ｋ２８−ＮＨ_２ラクタム（▲を９０度右回転させたもの））によるグルカゴン受容体の誘導が比較されている。

【図6B】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図６Ｂでは、ＧＬＰ−１（■）と比べた、グルカゴン類似体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）、Ｋ１２ Ｅ１６−ＮＨ_２ラクタム（▲）、Ｅ１６ Ｋ２０−ＮＨ_２ラクタム（▼）、Ｋ２０ Ｅ２４−ＮＨ_２ラクタム（▲を９０度左回転させたもの）、及びＥ２４ Ｋ２８−ＮＨ_２ラクタム（▲を９０度右回転させたもの））によるＧＬＰ−１受容体の誘導が比較されている。

【図7A】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図７Ａでは、グルカゴン（■）と比べた、グルカゴン類似体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲）、Ｋ１２、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム（▼）、Ｅ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度左回転させたもの）、及びＥ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム（▲を９０度右回転させたもの））によるグルカゴン受容体の誘導が比較されている。

【図7B】グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図７Ｂでは、ＧＬＰ−１（■）と比べた、グルカゴン類似体（Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（●）、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲）、Ｋ１２、Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム（▼）、Ｅ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２（▲を９０度左回転させたもの）、及びＥ１６、Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ_２ラクタム（▲を９０度右回転させたもの））によるＧＬＰ−１受容体の誘導が比較されている。

【図8A】グルカゴン受容体（図８Ａ）に対するグルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す図であり、ｈＥ＝ホモグルタミン酸であり、ｈＣ＝ホモシステイン酸である。

【図8B】ＧＬＰ−１受容体（図８Ｂ）に対するグルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す図であり、ｈＥ＝ホモグルタミン酸であり、ｈＣ＝ホモシステイン酸である。

【図8C】グルカゴン受容体（図８Ｃ）に対するグルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す図であり、ｈＥ＝ホモグルタミン酸であり、ｈＣ＝ホモシステイン酸である。

【図8D】ＧＬＰ−１受容体（図８Ｄ）に対するグルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す図であり、ｈＥ＝ホモグルタミン酸であり、ｈＣ＝ホモシステイン酸である。

【図8E】グルカゴン受容体（図８Ｅ）に対するグルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す図であり、ｈＥ＝ホモグルタミン酸であり、ｈＣ＝ホモシステイン酸である。

【図8F】ＧＬＰ−１受容体（図８Ｆ）に対するグルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを表す図であり、ｈＥ＝ホモグルタミン酸であり、ｈＣ＝ホモシステイン酸である。

【図9A】天然グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸１７〜２６位が、天然ＧＬＰ−１（配列番号５０）の１７〜２６位のアミノ酸で置換されたＧＬＰ（１７〜２６）グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図９Ａでは、指定のＧＬＰ（１７〜２６）グルカゴン類似体によるグルカゴン受容体の誘導が比較されている。

【図9B】天然グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸１７〜２６位が、天然ＧＬＰ−１（配列番号５０）の１７〜２６位のアミノ酸で置換されたＧＬＰ（１７〜２６）グルカゴン類似体による受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。より詳しくは、図９Ｂでは、指定のＧＬＰ（１７〜２６）グルカゴン類似体によるＧＬＰ−１受容体の誘導が比較されている。

【図10A】表示されている量のそれぞれの化合物を皮下注射したマウスの体重減少を誘導する、本発明のグルカゴンペプチドの能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。図１０Ａに列挙されたグルカゴンペプチドの配列識別子は以下の通りである。図１０Ａでは、キメラ２ Ａｉｂ２ Ｃ２４ ４０Ｋ ＰＥＧ（配列番号４８６）、Ａｉｂ２ Ｃ２４ キメラ２ ４０Ｋラクタム（配列番号５０４）、及びＡｉｂ２ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｇｌｕｃ−ＮＨ２ Ｌａｃ ４０Ｋ（配列番号５２８）。

【図10B】表示されている量のそれぞれの化合物を皮下注射したマウスの体重減少を誘導する、本発明のグルカゴンペプチドの能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。図１０Ｂに列挙されたグルカゴンペプチドの配列識別子は以下の通りである。図１０Ｂでは、Ａｉｂ２ Ｃ２４ Ｃｈｉ２ ラクタム ４０Ｋ（配列番号５０４）、ＤＭＩＡ１ Ｃ２４ Ｃｈｉ２ ラクタム ４０Ｋ（配列番号５０５）、キメラ２ ＤＭＩＡ１ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１９）、及びキメラ２ Ａｉｂ２ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号４８６）、ここでは配列の最後の数字は使用された用量、７０又は３５０ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかを表す。

【図10C】表示されている量のそれぞれの化合物を皮下注射したマウスの体重減少を誘導する、本発明のグルカゴンペプチドの能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。図１０Ｃに列挙されたグルカゴンペプチドの配列識別子は以下の通りである。図１０Ｃでは、ＡＩＢ２ ラクタム有り Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５０４）、ＡＩＢ２ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有り Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５２８）、ＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有り、Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１０）、ＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有り ＣＥＸ ４０Ｋ（配列番号５１３）、及びＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム無し ＣＥＸ ４０Ｋ（配列番号５２９）。

【図10D】表示されている量のそれぞれの化合物を皮下注射したマウスの体重減少を誘導する、本発明のグルカゴンペプチドの能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。図１０Ｄに列挙されたグルカゴンペプチドの配列識別子は以下の通りである。図１０Ｄでは、ＡＩＢ２ ラクタム有り Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５０４）、ＡＩＢ２ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有り Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５２８）、ＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有り Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１０）、及びＤＭＩＡ１ Ｅ１６ Ｋ２０ ラクタム有り／Ｃｅｘ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号５１３）、ここでは配列の最後の数は、使用された用量、１４又は７０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｗｋを表す。

【図10E】表示されている量のそれぞれの化合物を皮下注射したマウスの体重減少を誘導する、本発明のグルカゴンペプチドの能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。図１０Ｅに列挙されたグルカゴンペプチドの配列識別子は以下の通りである。図１０Ｅでは、ＡＩＢ２ ラクタム無し Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号４８６）、Ｃｈｉ２ ＡＩＢ２ Ｃ２４ ＣＥＸ ４０Ｋ（配列番号５３３）、ＡＩＢ２ Ｅ１６ Ａ１８ Ｋ２０ Ｃ２４ ４０Ｋ（配列番号４９２）、ＡＩＢ２ ラクタム無し ＣＥＸ Ｇ２９ Ｃ４０ ４０Ｋ（配列番号４８８）、ＡＩＢ２ ラクタム無し ＣＥＸ Ｃ４０ Ｃ４１−２（配列番号５３２）、ＡＩＢ２ ラクタム無し ＣＥＸ Ｃ２４ Ｃ４０−２（配列番号５３１）、及びＡＩＢ２ ラクタム無し Ｃ２４ ６０Ｋ（配列番号４９８）、４０Ｋ又は６０Ｋという表示は、グルカゴンペプチドに結合されたポリエチレン鎖の分子量を表す。

【図11】表示されている量の化合物を皮下注射したマウスにおいて、アシル化グルカゴンペプチドが体重減少を誘導する（図１１）能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。

【図12】表示されている量の化合物を皮下注射したマウスにおいて、食物摂取量を減少させる（図１２）能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。

【図13】表示されている量の化合物を皮下注射したマウスにおいて、血糖レベルを低下させる（図１３）能力を実証するｉｎ ｖｉｖｏデータを提供するグラフである。

【図14】グルカゴン類似体によるグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体媒介性ｃＡＭＰ誘導を示すデータを示す図である。

【図15】２ｎｍｏｌ／ｋｇの媒体のみ（三角形）、キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（白抜き正方形）、又はキメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（逆三角形）で処置し、その後ペプチドを投与した１５分後にグルコース負荷したＤＩＯマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を時間（分）の関数として表すグラフである。

【図16】２０ｎｍｏｌ／ｋｇの媒体のみ（三角形）、キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（白抜き正方形）、又はキメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（逆三角形）で処置し、その後ペプチドを投与した１５分後にグルコース負荷したＤＩＯマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を時間（分）の関数として表すグラフである。

【図17】７０ｎｍｏｌ／ｋｇの媒体のみ（逆三角形）、キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（白抜き三角形）、キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（菱形）、又はキメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（白抜き正方形）で処置し、その後ペプチドを投与した１５分後にグルコース負荷したＤＩＯマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を時間（分）の関数として表すグラフである。

【図18】７０ｎｍｏｌ／ｋｇの媒体のみ（逆三角形）、キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（白抜き三角形）、キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（菱形）、又はキメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（白抜き正方形）で処置し、その後ペプチドを投与した２４時間後にグルコース負荷したＤＩＯマウスにおける血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を時間（分）の関数として表すグラフである。

【図19】１５又は７０ｎｍｏｌ／ｋｇの媒体のみ（菱形及び実線）；キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、白抜き菱形及び点線；７０ｎｍｏｌ／ｋｇ、白抜き三角形及び実線）；キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ ＰＥＧ（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、黒抜き三角形及び点線；７０ｎｍｏｌ／ｋｇ、黒抜き三角形及び実線）；キメラ−２ ＡＩＢ^２、Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ Ｐｅｇ（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、逆三角形及び点線；７０ｎｍｏｌ／ｋｇ；逆三角形及び実線）で処置したＤＩＯマウスの体重変化（％）を時間（日）の関数として表すグラフである。

【図20】１０、２０、４０、又は８０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４又は２０ｎｍｏｌ／ｋｇのキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、又は媒体対照をＱＷ注射した１４日後のマウスの総体重変化（％）を表すグラフである。

【図21】グルコース注射の２４時間前に、１０、２０、４０、又は８０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４又は２０ｎｍｏｌ／ｋｇのキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、又は媒体対照を注射したマウスのグルコース注射に応答した血糖レベル（ｍｇ／ｄＬ）表すグラフである。

【図22】表示されている用量の媒体対照、リラグルチド、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド、又はβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを注射したマウスの総体重変化（％）を表すグラフである。

【図23】表示されている用量の媒体対照、リラグルチド、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド、又はβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを注射したマウスの、研究７日目に測定した体脂肪量（ｇ）を表すグラフである。

【図24】表示されている用量の媒体対照、リラグルチド、（Ｃ１６）グルカゴンアミド、γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド、ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド、又はβＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミドを注射したマウスの血糖値の変化（ｍｇ／ｄＬ；７日目レベル−０日目レベル）を表すグラフである。

【図25】１０％ＴＦＥを含む又は含まないかのいずれかである１０ｍＭリン酸（ｐＨ５．９）中のペプチドＸ−ＰＥＧ又はペプチドＹ−ＰＥＧの平均残基楕円率を波長（ｎｍ）の関数として表すグラフである。

【図26】グルカゴン、ＧＬＰ−１、ペプチドＸ、ペプチドＸ−ＰＥＧ、ペプチドＹ、又はペプチドＹ−ＰＥＧの、グルカゴン受容体（左）又はＧＬＰ−１受容体（右）のいずれかに対する結合に応答して産生されたｃＡＭＰ％を濃度（ｎＭ）の関数として表すグラフである。

【図27】媒体対照、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又はペプチドＹ−ＰＥＧで１週間処置した食餌誘導性肥満マウスにおける、Ａ）体重、Ｂ）体脂肪量、Ｃ）食物摂取量、及びＤ）空腹時血中グルコースレベルに対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す一連のグラフである。より詳しくは、図２７Ａは、体重（ＢＷ）の変化％を時間（日）の関数として表すグラフであり、図２７Ｂは、７日目に測定した体脂肪量の変化％を（最初の体脂肪量測定と比較して）表すグラフであり、図２７Ｃは、７日目に測定した研究の経過全体にわたる総食物摂取量（ｇ）を表すグラフであり、図２７Ｄは、７日目に測定した血糖値（ｍｇ／ｄＬ）の変化を（最初の血糖レベルと比較して）表すグラフである。

【図28】様々な用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／週）のペプチドＸ−ＰＥＧ（図２８Ａ及び２８Ｂ）又はペプチドＹ−ＰＥＧ（図２８Ｃ及び２８Ｄ）のいずれかで処置したマウスにおける、体重（図２８Ａ及び２８Ｃ）及び空腹時血中グルコースレベル（図２８Ｂ及び２８Ｄ）に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す一連のグラフである。

【図29】媒体対照、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又はペプチドＹ−ＰＥＧで１か月間処置した食餌誘導性肥満マウスにおける、Ａ）体重（ＢＷ）、Ｂ）体脂肪量、Ｃ）総食物摂取量、Ｄ）エネルギー消費量、Ｅ）呼吸商、Ｆ）自発運動活性、Ｇ）空腹時血中グルコース、Ｈ）糖耐性、及びＩ）全血漿インスリンレベルに対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す一連のグラフである。

【図30】媒体対照、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又はペプチドＹ−ＰＥＧで１か月間処置した食餌誘導性肥満マウスにおける、Ａ）食物摂取量、Ｂ）総エネルギー消費量、Ｃ）総呼吸商、Ｄ）自発運動活性、Ｅ）総自発運動活性、Ｆ）ｉｐＧＴＴ曲線下面積、Ｇ）血漿Ｃ−ペプチドレベル、Ｈ）ＰＥＰＣＫ／ＨＰＲＴ発現倍数、及びＩ）Ｇ６Ｐ／ＨＰＲＴ発現倍数の熱量測定に対する３週目のｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す一連のグラフである。

【図31】媒体対照、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又はペプチドＹ−ＰＥＧで１か月間処置した食餌誘導性肥満マウスにおける、血漿中のＡ）コレステロール、Ｂ）コレステロールＦＰＬＣ、Ｃ）トリグリセリド、Ｄ）レプチン、Ｅ）レジスチン、及びＦ）アディポネクチンに対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を実証する一連のグラフである。

【図32】媒体対照、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又はペプチドＹ−ＰＥＧで処置したマウスにおける、ホルモン感受性リパーゼのリン酸化（ｐＨＳＬ）により反映されるような、Ａ）ＢＡＴ ＵＣＰ−１発現レベル及びＢ）白色脂肪組織に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を実証する一連のグラフである。

【図33】ＤＩＯラットにおける、媒体対照、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又はペプチドＹ−ＰＥＧのＡ）体重及びＢ）体脂肪量に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す一連のグラフである。図３３Ｃは、ペプチドＹ−ＰＥＧ、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又は媒体で２週間処置したマウスから単離された精巣上体脂肪組織における、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量的に評価された、ＴＦＩＩＢに対するＣＤ６８の相対的発現を表すグラフである。データは、ＴＦＩＩＢ ｍＲＮＡ発現に対して正規化され、平均±ＳＥＭとして表されている相対的ＣＤ６８ ｍＲＮＡ発現として示されている。

【図34】媒体対照、ペプチドＸ−ＰＥＧ、又はペプチドＹ−ＰＥＧで処置したＧＬＰ−１−Ｒノックアウトマウスにおける、体重（ＢＷ；３４Ａ及び３４Ｂ）、体脂肪量（３４Ｃ）、食物摂取量（３４Ｄ）、及び血糖レベル（３４Ｅ及び３４Ｆ）に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す一連のグラフである。

【図35】媒体対照、ペプチドＶ、又はペプチドＵで処置したＤＩＯマウスにおける、体重（３５Ａ）、血糖（３５Ｂ）、及び体脂肪量（３５Ｃ）に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す一連のグラフである。

【図36】（ ）内に示されている用量の媒体、リラグルチド、グルカゴンアミド、ＭＴ−２６１、ＭＴ−３４５、ＭＴ−３４７、又はＭＴ−３４８を注射したマウスの、研究１４日目に測定された総体重変化％を表すグラフである。

【図37】媒体、ＭＴ−２７８、ＭＴ−３５８、ＭＴ−２６１、ＭＴ−２９７、又はＭＴ−３６４を注射したマウスの、研究７日目に測定された総体重変化％を表すグラフである。

【図38】媒体、ペプチド８３、ペプチド９００、ペプチド９０１、又はＭＴ−３６４を注射したマウスの、研究７日目に測定された総体重変化％を表すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0081】

定義
本発明を記載及び請求するに際して、以下の用語は、下記に示した定義に従って使用されるものとする。

【0082】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油乳剤等の乳剤、及び種々のタイプの湿潤剤等の標準的医薬担体のいずれかを含む。この用語は、ヒトを含む動物での使用に、米国連邦政府の規制当局により承認されているか又は米国薬局方に列挙されている作用剤のいずれをも包含する。

【0083】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」は、親化合物の生物活性を保持し、生物学的に又は別様に望ましくないというわけではない化合物の塩を指す。本明細書で開示された化合物の多くは、アミノ及び／又はカルボキシル基又はそれに類似した基が存在することにより、酸性塩及び／又は塩基性塩を形成することが可能である。

【0084】

薬学的に許容される塩基付加塩は、無機及び有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩には、単なる例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、これらに限定されないが、第一級、第二級、及び第三級アミンの塩が含まれる。

【0085】

薬学的に許容される酸付加塩は、無機及び有機酸から調製することができる。無機酸に由来する塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、及びリン酸等が含まれる。有機酸に由来する塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、珪皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエン−スルホン酸、及びサリチル酸等が含まれる。

【0086】

本明細書で使用される場合、用語「治療」は、特定の疾患又は状態の予防、又は特定の疾患又は状態に伴う症状の緩和、及び／又は前記症状を予防又は解消することを含む。例えば、本明細書で使用される場合、用語「糖尿病を治療する」は、一般的に、正常なレベルに向かって血糖レベルを変化させることを指し、所与の状況に応じて血糖レベルを増加又は減少させることを含んでいてもよい。

【0087】

本明細書で使用される場合、「有効」量又は「治療上有効量」のグルカゴンペプチドは、所望の効果を提供するための、無毒であるが十分な量のペプチドを指す。例えば、１つの所望の効果は、例えば血糖レベルの増加により測定される、低血糖症の予防又は治療だろう。本開示の同時アゴニスト類似体の代替的な所望な効果には、例えば血糖レベルを正常値により近づくように変化させることにより測定される高血糖症の治療、例えば体重の減少又は体重増加の防止若しくは低減により測定される体重減少の誘導／体重増加の防止、又は体脂分布の正常化が含まれる。「有効」である量は、個体の年齢及び全身状態、及び投与方法等に応じて、対象体毎に変動するだろう。従って、正確な「有効量」を指定することは必ずしも可能ではない。しかしながら、任意の個々の症例における適切な「有効」量は、日常的な実験作業を使用して、当業者により決定することができる。

【0088】

用語「非経口」は、消化管を介してではなく、皮下、筋肉内、脊髄内、又は静脈内等の、幾つかの他の経路によることを意味する。

【0089】

本明細書で使用される場合、用語「精製された」及び類似の用語は、天然又は自然環境中でその分子又は化合物に通常伴っている夾雑物を実質的含まない形態の分子又は化合物の単離に関する。本明細書で使用される場合、用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対的な定義として意図される。用語「精製されたポリペプチド」は、本明細書では、これらに限定されないが、核酸分子、脂質、及び炭水化物を含む他の化合物から分離されたポリペプチドを記述するために使用される。

【0090】

用語「単離された」は、参照される物質が、その元々の環境（例えば、それが天然である場合は、自然環境）から取り出されることを必要とする。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドは単離されていないが、天然系に同時に存在する物質の幾つか又は全てから分離された同じポリヌクレオチドは、単離されている。

【0091】

本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、３個以上のアミノ酸の配列、及び典型的には５０個のアミノ酸未満の配列を包含し、アミノ酸は天然又は非天然アミノ酸である。非天然アミノ酸は、ｉｎ ｖｉｖｏでは天然に生じないが、それにもかかわらず本明細書に記載のペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を指す。

【0092】

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、ポリマーの長さに関わらず、アミノ酸のポリマーを参照するために同義的に使用される。典型的には、ポリペプチド及びタンパク質は、「ペプチド」より長いポリマー長さを有する。

【0093】

「グルカゴンペプチド」は、本明細書で使用される場合、配列番号１のアミノ酸配列、又はこのペプチドのアミノ酸置換、付加、欠失、又は翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、ラクタム架橋形成、及びペグ化等の分子内共有結合）を含む配列番号１のアミノ酸配列のあらゆる類似体のいずれかを含む任意のペプチドを含み、類似体は、グルカゴン又はＧＬＰ−１受容体活性を刺激し、活性は、例えば実施例１４に記載のアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定される。

【0094】

用語「グルカゴンアゴニスト」は、グルカゴン受容体活性を刺激するグルカゴンペプチドを含む複合体を指し、活性は、例えば実施例１４に記載のアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定される。

【0095】

本明細書で使用される場合、「グルカゴンアゴニスト類似体」は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択される配列を含むグルカゴンペプチドであるか、又は２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９位の１つ又は複数に１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含むように修飾されたそのような配列の類似体である。

【0096】

本明細書で使用される場合、アミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換、付加、又は欠失を指し、ヒトタンパク質に一般的に見出される２０種のアミノ酸並びに異型又は非天然のアミノ酸のいずれかの置換又は付加を含む。本出願の全体にわたって、数字による特定のアミノ酸位置への参照（例えば、２８位）は全て、天然グルカゴン（配列番号１）のその位置にあるアミノ酸又はその任意の類似体の対応するアミノ酸位置にあるアミノ酸を指す。例えば、本明細書では、「２８位」に対する参照は、配列番号１の最初のアミノ酸が欠失されたグルカゴン類似体の対応する２７位を意味するものとする。同様に、本明細書では、「２８位」に対する参照は、配列番号１のＮ末端の前に１個のアミノ酸が付加されたグルカゴン類似体の対応する２９位を意味するものとする。異型アミノ酸の販売元には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、ＣｈｅｍＰｅｐ社（マイアミ、フロリダ州）、及びＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）が含まれる。異型アミノ酸は、市販の販売業者から購入してもよく、ｄｅ ｎｏｖｏ合成してもよく、又は他のアミノ酸から化学的に修飾若しくは誘導してもよい。

【0097】

本明細書で使用される場合、「グルカゴン同時アゴニスト」は、天然グルカゴンと比べて少なくとも約１０％から約５００％以上のグルカゴン受容体に対する活性を示し、天然ＧＬＰ−１と比べて少なくとも約１０％から約２００％以上のＧＬＰ−１受容体に対する活性も示すグルカゴンペプチドである。

【0098】

本明細書で使用される場合、「グルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子」は、天然グルカゴンと比べて少なくとも約１０％のグルカゴン受容体に対する活性を示し、天然ＧＬＰ−１と比べて少なくとも約１０％のＧＬＰ−１受容体に対する活性も示す分子である。

【0099】

本明細書で使用される場合、用語「天然グルカゴン」は、配列番号１の配列からなるペプチドを指し、用語「天然ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号５２の配列からなる）、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号５０の配列からなる）、又はそれら２つの化合物の混合物を指す総称である。本明細書で使用される場合、いかなる更なる指定のない「グルカゴン」又は「ＧＬＰ−１」に対する一般的な言及は、それぞれ天然グルカゴン又は天然ＧＬＰ−１を意味することが意図される。

【0100】

本明細書で使用される場合、アミノ酸「置換」は、異なるアミノ酸残基による１つのアミノ酸残基の置換を指す。

【0101】

本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書では、以下の５つの群の１つの中での交換と定義される：
Ｉ．小型の脂肪族、無極性、又は微極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性、負荷電の残基並びにそれらのアミド及びエステル：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸、及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性、正荷電の残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型の脂肪族、無極性の残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン

【0102】

本明細書で使用される場合、一般的用語「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、エチレンオキシド及び水の縮合ポリマーの混合物を指し、分岐鎖又は直鎖であり、一般式Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨにより表され、ｎは少なくとも９である。いかなる更なる特徴付けがなければ、この用語は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、その近似的平均分子量を示す数値の接尾辞と組み合わせて使用される。例えば、ＰＥＧ−５，０００は、約５，０００の総分子量平均を有するポリエチレングリコール鎖を指す。

【0103】

本明細書で使用される場合、用語「ペグ化」及び類似用語は、ポリエチレングリコール鎖を化合物に結合することによりその天然状態から修飾された化合物を指す。「ペグ化グルカゴンペプチド」は、ＰＥＧ鎖がグルカゴンペプチドに共有結合で結合されたグルカゴンペプチドである。

【0104】

本明細書で使用される場合、ペプチドに対する一般的な参照は、修飾されたアミノ末端及びカルボキシ末端を有するペプチドを包含することが意図される。例えば、末端のカルボキシル酸の代りのアミド基を含むアミノ酸鎖は、標準的アミノ酸を指定するアミノ酸配列により包含されることが意図される。

【0105】

本明細書で使用される場合、「リンカー」は、２つの別々の物質を互いに結合する結合、分子、又は分子の群である。リンカーは、２つの物質の最適な離間を提供することができるか、又は２つの物質が互いから分離されることを可能にする切断可能な結合を更に提供することができる。切断可能な連結には、光切断可能な基、酸で切断可能な部分、塩基で切断可能な部分、及び酵素切断可能な基が含まれる。

【0106】

本明細書で使用される場合、「二量体」は、リンカーを介して互いに共有結合で結合された２つのサブユニットを含む複合体である。用語二量体は、いかなる制限的な言語を伴わずに使用された場合、ホモ二量体及びヘテロ二量体を両方とも包含する。ホモ二量体は、２つの同一サブユニットを含み、ヘテロ二量体は異なる２つのサブユニットを含むが、２つのサブユニットは互いに実質的に類似している。

【0107】

本明細書で使用される場合、用語「荷電アミノ酸」は、生理学的なｐＨの水溶液中で負に荷電（つまり、脱プロトン化）されるか、又は正に荷電（つまり、プロトン化）される側鎖を含むアミノ酸を指す。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、及びホモグルタミン酸が含まれ、正荷電アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質に一般的に見出される２０種のアミノ酸、並びに異型又は非天然アミノ酸の荷電アミノ酸が含まれる。

【0108】

本明細書で使用される場合、用語「酸性アミノ酸」は、例えばカルボキシル酸基又はスルホン酸基を含む第２の酸性部分を含むアミノ酸を指す。

【0109】

用語「アルキル」は、指定数の炭素原子を含有する直鎖又は分岐炭化水素を指す。例示的なアルキルには、メチル、エチル、及び直鎖プロピル基が含まれる。

【0110】

用語「ヘテロアルキル」は、構造の骨格に指定数の炭素原子及び少なくとも１個のヘテロ原子を含有する直鎖又は分岐炭化水素を指す。本明細書の目的に好適なヘテロ原子には、これらに限定されないが、Ｎ、Ｓ、及びＯが含まれる。

【0111】

実施形態
本発明は、グルカゴン受容体、又はＧＬＰ−１受容体、又は両受容体に対する活性の増加又は減少を示すグルカゴンペプチドを提供する。本発明は、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体に対する選択性が変更されたグルカゴンペプチドも提供する。

【0112】

グルカゴン受容体に対する活性増加は、本明細書に記載のように天然グルカゴン（配列番号１）の１６位のアミノ酸を修飾することにより提供される。

【0113】

グルカゴン受容体に対する活性の維持又は増加は、グルタミン類似体（例えば、（Ｄａｂ（Ａｃ））による天然グルカゴンの３位のアミノ酸修飾によっても提供される。

【0114】

グルカゴン受容体に対する活性低減は、本明細書に記載のように、例えば３位のアミノ酸を酸性、塩基性、又は疎水性のアミノ酸で置換することにより提供される。

【0115】

ＧＬＰ−１受容体に対する活性増加は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル酸を、アミド又はエステル等の荷電中性基で置換することにより提供される。

【0116】

ＧＬＰ−１受容体の活性増加は、グルカゴンのＣ末端部分のアルファヘリックス（例えば、残基１２〜２９付近）を安定化させる修飾により提供される。幾つかの実施形態では、そのような修飾は、本明細書に記載のように、３個の介在アミノ酸により隔てられている２つのアミノ酸、例えば１２及び１６位、又は１６及び２０位、又は２０及び２４位の側鎖間の分子内架橋の形成を可能にする。他の実施形態では、そのような修飾には、１つ又はα，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢを、１６、２０、２１、又は２４位の１箇所又は複数個所に導入する挿入修飾又は置換修飾が含まれる。

【0117】

分子内架橋、例えば共有結合性分子内架橋を欠如するペプチドのＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性増加は、アシル又はアルキル基をペプチドの１０位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合させることにより提供され、アシル又はアルキル基は１０位のアミノ酸に対して非天然である。分子内架橋、例えば、共有結合性分子内架橋を欠如するそのようなペプチドのＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する更なる活性増加は、アシル又はアルキル基と１０位のアミノ酸側鎖との間にスペーサーを組み込むことにより達成することができる。好適なスペーサーは、本明細書中に記載されており、これらに限定されないが、長さが３〜１０個の原子であるスペーサーが含まれる。

【0118】

ＧＬＰ−１受容体に対する活性増加は、本明細書に記載のように、２０位のアミノ酸を修飾することにより提供される。

【0119】

ＧＬＰ−１受容体に対する活性増加は、配列番号２６のＣ末端延長部分を含むグルカゴン類似体において提供される。配列番号２６を含むそのような類似体のＧＬＰ−１活性は、本明細書に記載のように、１８、２８、若しくは２９位の、又は１８及び２９位のアミノ酸を修飾することにより更に増加させることができる。

【0120】

１及び２位のアミノ酸修飾により低減されたグルカゴン活性の回復は、本明細書に記載のように、３個の介在アミノ酸より隔てられている２個のアミノ酸、例えば１２及び１６位、又は１６及び２０位、又は２０及び２４位の側鎖間の共有結合により提供される。

【0121】

ＧＬＰ−１効力の更に適度な増加は、１０位のアミノ酸をＴｒｐに修飾することにより提供される。

【0122】

グルカゴン受容体活性を増加又は減少させ、ＧＬＰ−１受容体活性を増加させる上述の修飾はいずれも、個々に又は組み合わせで適用することができる。上述の修飾はいずれも、溶解度及び／又は安定性及び／又は作用持続時間の増加等の他の所望の特性を付与する他の修飾と組み合わせることもできる。或いは、上述の修飾はいずれも、溶解度又は安定性又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の修飾と組み合わせることができる。例示的な修飾には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：
（Ａ）例えば、１、２、又は３個以上荷電アミノ酸を天然グルカゴンのＣ末端部分に、好ましくは２７位のＣ末端側の位置に導入することによる溶解度の向上。そのような荷電アミノ酸は、例えば２８又は２９位の天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、又はその代わりに荷電アミノ酸を、例えば２７、２８、又は２９位の後に付加することにより導入することができる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１個、２個、３個、又は全てが、負に荷電されている。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１個、２個、３個、又は全てが、正に荷電されている。そのような修飾は、溶解度を増加させ、約５．５〜８の所定のｐＨ、例えばｐＨ７にて、２５℃で２４時間後に測定した場合に、天然グルカゴンと比べて少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、又は３０倍以上の溶解度を提供する、
（Ｂ）本明細書に記載のように、ポリエチレングリコール鎖等の親水性部分を、例えばペプチドの１６、１７、２０、２１、２４、若しくは２９位、又はＣ末端アミノ酸に付加することによる、溶解度及び作用持続時間又は血中半減期の増加、
（Ｃ）１５位のアスパラギン酸の修飾による、例えば、欠失又はグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、若しくはホモシステイン酸での置換による増加。そのような修飾は、５．５〜８の範囲内のｐＨで分解又は切断を低減することができ、例えば、２５℃で２４時間後に元々のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を保持する、
（Ｄ）２７位のメチオニンの修飾による、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換よる安定性の増加。そのような修飾は、酸化的分解反応を低減することができる。安定性は、２０又は２４位のＧｌｎの修飾によっても、例えばＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＡＩＢでの置換によっても増加させることができる。そのような修飾は、Ｇｌｎの脱アミド化により生じる分解を低減することができる。安定性は、２１位のＡｓｐの修飾により、例えばＧｌｕでの置換によっても増加させることができる。そのような修飾は、Ａｓｐが脱水されて環式スクシンイミド中間体が形成され、その後イソ−アスパラギン酸へと異性化することより生じる分解を低減することができる、
（Ｅ）本明細書に記載の１又は２位のアミノ酸の修飾による、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）切断に対する耐性の増加、
（Ｆ）活性に影響を及ぼさない保存的又は非保存的置換、付加、又は欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９位の１個所又は複数個所での保存的置換；２７、２８、又は２９位の１個所又は複数個所の欠失；又はＣ末端カルボキシル酸基の代りのＣ末端アミド又はエステルと随意に組み合わせたアミノ酸２９の欠失、
（Ｇ）本明細書に記載のＣ末端延長部分の付加、
（Ｈ）例えば、本明細書に記載のように、グルカゴンペプチドのアシル化又はアルキル化による、血中半減期の増加及び／又は作用持続時間の延長及び／又は作用開始の遅延、
（Ｉ）本明細書中に記載のホモ二量体化又はヘテロ二量体化。

【0123】

例示的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴン配列と比べて、合計１個の、最大２個の、最大３個の、最大４個の、最大５個の、最大６個の、最大７個の、最大８個の、最大９個の、又は最大１０個のアミノ酸修飾を含んでいてもよい。

【0124】

他の修飾には、以下が含まれる：１位のＨｉｓを大型芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はアミノ−Ｐｈｅ）で置換すること、
２位のＳｅｒをＡｌａで置換すること、
１０位のＴｙｒをＶａｌ又はＰｈｅで置換すること、
１２位のＬｙｓをＡｒｇで置換すること、
１５位のＡｓｐをＧｌｕで置換すること、
１６位のＳｅｒをＴｈｒ又はＡＩＢで置換すること。

【0125】

本明細書で開示された１つの実施形態は、野生型ペプチドであるＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）に対して修飾して、グルカゴン受容体に対するペプチドの効力を増強させたグルカゴンアゴニストに関する。驚くべきことに、本出願人らは、天然グルカゴン（配列番号１）の１６位の通常に生じるセリンを、選択された酸性アミノ酸で置換し、検証されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルアッセイにおいてｃＡＭＰ合成を刺激するその能力の点で、グルカゴンの効力を増強することができることを発見した（実施例１４を参照）。より詳しくは、この置換は、グルカゴン受容体に対する類似体の効力を、少なくとも２倍、４倍、５倍、及び最大１０倍まで増強する。また、この置換は、天然グルカゴンと比べて、ＧＬＰ−１受容体に対する類似体の活性を、少なくとも５倍、１０倍、又は１５倍増強するが、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴン受容体の選択性が維持される。

【0126】

１つの実施形態によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン、又はグリシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。１つの実施形態によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、１つの実施形態では、セリン残基はグルタミン酸で置換される。１つの実施形態では、グルカゴン受容体に対する特異性が増強されたグルカゴンペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のペプチド、又はそれらのグルカゴンアゴニスト類似体を含み、カルボキシ端末アミノ酸は、その天然カルボキシル酸基を保持する。１つの実施形態によると、ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（配列番号１０）の配列を含むグルカゴンアゴニストが提供され、このペプチドは、実施例１４のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃＡＭＰアッセイにより測定すると、天然グルカゴンに比べて、グルカゴン受容体に対しておよそ５倍の効力増強を示す。

【0127】

親水性部分
本発明のグルカゴンペプチドは、生理学的なｐＨの水溶液中でのペプチドの溶解度及び安定性を向上させると共に、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持するように更に修飾することができる。ＰＥＧ基等の親水性部分は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の好適な条件下でグルカゴンペプチドに結合させることができる。ＰＥＧ部分の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、又はヒドラジノ基）よる、標的化合物の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、又はヒドラジノ基）に対する、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加反応、チオールアルキル化、又は他の化学選択的な結合／連結方法を含む、当技術分野で公知の任意の手段を使用することができる。水溶性ポリマーを１つ又は複数のタンパク質に結合するために使用することができる活性基には、限定ではないが、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジジリン、オキシラン、５−ピリジル、及びアルファ−ハロゲン化アシル基（例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸）が含まれる。還元的アルキル化によりペプチドに結合される場合、選択されたポリマーは、重合度が制御されるように、単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５４： ４７７−４８５ （２００２）；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ５４： ４５９−４７６ （２００２）；及びＺａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． １６： １５７−１８２ （１９９５）を参照されたい。

【0128】

本発明の特定の態様では、チオールを有するグルカゴンペプチドのアミノ酸残基は、ＰＥＧ等の親水性部分で修飾される。幾つかの実施形態では、チオールが、マレイミド活性化ＰＥＧにマイケル付加反応で修飾され、下記に示されているチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドがもたらされる。

【0129】

【化4】

【0130】

幾つかの実施形態では、チオールが、ハロアセチル活性化ＰＥＧに求核置換反応で修飾され、下記に示されているチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドがもたらされる。

【0131】

【化5】

【0132】

好適な親水性部分には、以下のものが含まれる：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（ベータ−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）、及び他のポリアキレン（ｐｏｌｙａｋｙｌｅｎｅ）オキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）又は他のポリサッカライドポリマー、フィコール、又はデキストラン、並びにそれらの混合物。デキストランは、主にα１−６結合により結合された、グルコースサブユニットのポリサッカライドポリマーである。多数の分子量範囲、例えば、約１ｋＤ〜約１００ｋＤ、又は約５、１０、１５、又は２０ｋＤ〜約２０、３０、４０、５０、６０、７０、又は９０ｋＤのデキストランが入手可能である。直鎖又は分枝ポリマーが企図される。その結果生じる結合体の調製物は、本質的に単分散系であってもよく、又は多分散系であってもよく、１個のペプチド当たり約０．５、０．７、１、１．２、１．５、又は２個のポリマー部分を有してもよい。

【0133】

１つの実施形態によると、配列番号９又は配列番号１０のペプチドの１７、２１、及び２４位に親水性基を導入することにより、生理学的なｐＨを有する溶液中で高度に強力なグルカゴン類似体の溶解度及び安定性が向上すると予測される。そのような基の導入は、例えば、血中半減期の長期化により測定される作用持続時間も増加させる。好適な親水性部分には、ＰＥＧ、ＰＥＧのホモポリマー又はコポリマー、ＰＥＧのモノメチル置換ポリマー（ｍＰＥＧ）、又はポリオキシエチレングリセロール（ＰＯＧ）を含む、当技術分野で公知の任意の水溶性ポリマーが含まれる。１つの実施形態によると、親水性基は、ポリエチレン（ＰＥＧ）鎖を含む。より詳しくは、１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号６又は配列番号７の配列を含み、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの２１及び２４位に存在するアミノ酸の側鎖に共有結合で連結され、ペプチドのカルボキシ端末アミノ酸は、カルボキシル酸基を有する。

【0134】

結合体
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが、随意に共有結合により、及び随意にリンカーにより、結合部分に結合されている他の結合体も包含する。結合は、共有結合化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールス、又は疎水性若しくは親水性相互作用等の物理学的力により達成することができる。様々な非共有結合結合系を使用することができ、それらには、ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着分子パートナー、又は互いに対して親和性を有する任意の結合パートナー又はそれらの断片が含まれる。

【0135】

ペプチドは、これら標的アミノ酸の側鎖又はＮ−若しくはＣ−末端残基と反応することが可能な有機誘導体化剤とペプチドの標的側鎖とを反応させることにより、直接的共有結合で結合部分に結合することができる。ペプチド又は結合部分の反応基には、例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、又はヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイル スルホサクシニミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、又は当技術分野で公知の他の作用剤が含まれる。或いは、結合部分は、ポリサッカライド又はポリペプチド担体等の中間担体により、間接的にペプチドに結合させることができる。ポリサッカライド担体の例には、アミノデキストランが含まれる。好適なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、及びこれらアミノ酸と他のアミノ酸、例えばセリンとの混合ポリマー等が含まれ、その結果生じる負荷担体に望ましい溶解度特性を付与する。

【0136】

システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸、クロロアセトアミド等のα−ハロアセタート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体をもたらす。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾアート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても誘導体化される。

【0137】

ヒスチジル残基は、この作用剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるため、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカルボナートと反応させることにより誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、その反応は、好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施される。

【0138】

リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボキシル酸無水物と反応させる。これら作用剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基の誘導体化に好適な他の試薬には、メチルピコリンイミダート等のイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。

【0139】

アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来の試薬、それらの中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンと反応させることにより修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫ_ａが高いため、アルカリ条件で反応を実施することが必要である。更に、これら試薬は、リジン基並びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応させることもできる。

【0140】

チロシル残基の特異的修飾を行うことができ、特に興味深いのは、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識をチロシル残基に導入することである。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。

【0141】

カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、式中Ｒ及びＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等の異なるアルキル基である。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。

【0142】

他の修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ． ７９−８６ （１９８３））、アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボキシル酸基のアミド化若しくはエステル化が含まれる。

【0143】

別のタイプの共有結合性修飾には、化学的又は酵素的にグリコシドをペプチドに結合させることを伴う。糖（複数可）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのスルフヒドリル基等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、又はヒドロキシプロリンのヒドロキシル基等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン又はトリプトファンの芳香族基等の芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これら方法は、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第８７／０５３３０号、及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。

【0144】

本明細書に記載のグルカゴンペプチドのいずれかに結合することができる例示的な結合部分には、これらに限定されないが、異種性ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的化剤、免疫グロブリン又はその部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ、又はＦｃ領域）、放射性同位元素、蛍光体、又は酵素標識等の診断標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療薬又は診断薬が含まれる。１つの実施形態では、本発明のグルカゴンペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン、及びグロブリンからなる群から選択される。１つの実施形態では、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミン又はトランスフェリンである。

【0145】

幾つかの実施形態では、リンカーは、１〜約６０個の原子、又は１〜３０個以上の原子、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子、又は１０〜２０個の原子の長さの鎖を含む。幾つかの実施形態では、鎖原子は全て炭素原子である。幾つかの実施形態では、リンカーの骨格にある鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性の結合体を提供するように、それらの予測される溶解度（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施形態では、リンカーは、酵素又は他の触媒による切断、又は標的組織若しくは器官若しくは細胞に見出される加水分解性条件の影響を受けやすい官能基を提供する。幾つかの実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の可能性を低減するのに十分な程度の長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体全体は、融合タンパク質であってもよい。そのようなペプチジルリンカーは、任意の長さであってもよい。例示的なリンカーは、長さが約１〜５０個のアミノ酸、長さが５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個、又は１０〜３０個のアミノ酸である。そのような融合タンパク質は、その代わりに、当業者に公知の組換え遺伝子工学法により産生することができる。

【0146】

上述のように、幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、免疫グロブリン又はその部分（例えば可変領域、ＣＤＲ、又はＦｃ領域）に結合、例えば融合される。公知のタイプの免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域は、Ｉｇ重鎖のＣ末端領域であり、再利用等の活性を実行するＦｃ受容体への結合（これにより、半減期延長がもたらされる）、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する。

【0147】

例えば、幾つかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６〜重鎖のＣ末端に及ぶ。「ヒンジ領域」は、一般的に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２３０に及び（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関与するシステインをアラインすることによりＩｇＧ１配列とアラインすることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常はアミノ酸２３１〜アミノ酸３４１に及ぶ。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常はアミノ酸３４２〜４４７に及ぶ。免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片又は領域のアミノ酸付番への参照は全て、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄに基づく。関連する実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖、例えばＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ２及びＣＨ３領域、又はＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域に由来する１つ又は複数の天然又は修飾定常領域を含んでいてもよい。

【0148】

好適な結合部分には、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の部分が含まれる。ＦｃＲｎ、サルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、免疫グロブリンを再利用し、それらを血液循環中に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶解析に基づいて記述されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９）。ＦｃＲｎとＦｃとの主な接触区域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの接合部付近にある。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触は全て、単一のＩｇ重鎖内にある。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、及び３１４、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、及び４３３〜４３６が含まれる。

【0149】

幾つかの結合部分は、ＦｃγＲ結合部位（複数可）を含んでいてもよく、又は含んでいなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに関与する。ＦｃγＲと直接的に接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（下部ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ／Ｅループ）、及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０６： ２６７−２７３， ２０００）。ＩｇＥの下部ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関与する（Ｈｅｎｒｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６， １５５６８−１５５７８， １９９７）。ＩｇＡ受容体結合に関与する残基は、Ｌｅｗｉｓら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７５：６６９４−７０１， ２００５）に記載されている。ＩｇＥ受容体結合に関与するアミノ酸残基は、Ｓａｙｅｒｓら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７９（３４）：３５３２０−５， ２００４）に記載されている。

【0150】

アミノ酸修飾は、免疫グロブリンのＦｃ領域になされている場合がある。そのような変異体Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、及び／又はＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１−３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに親和性の増加を付与すると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａが含まれる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１）。他の突然変異は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡに対するＦｃ領域の結合を、ＦｃＲｎへの親和性を著しく低減することなく低減することができる。例えば、Ｆｃ領域の２９７位のＡｓｎをＡｌａ又は別のアミノ酸で置換することにより、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位が取り除かれて、免疫原性の低減がもたらされ、同時にＦｃ領域の半減期が延長され、並びにＦｃγＲに対する結合の低減がもたらされる場合がある（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：８４７；Ｆｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８： １６３２；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１）。ＦｃγＲに対する結合を低減する、ＩｇＧ１の２３３〜２３６位のアミノ酸修飾がなされている（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ １９９５， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７及びＡｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：２６１３）。幾つかの例示的なアミノ酸置換は、米国特許第７，３５５，００８号及び第７，３８１，４０８号に記載されており、各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0151】

融合タンパク質及び末端延長部分
本開示は、第２のペプチド又はポリペプチドが、グルカゴンペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合されたグルカゴン融合ペプチド又はタンパク質も包含する。より詳しくは、融合グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含む配列番号５５、配列番号９、又は配列番号１０のグルカゴンアゴニストを含んでいてもよい。１つの実施形態では、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合によりグルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合される。本出願人らは、エキセンディン−４（例えば、配列番号２６又は配列番号２９）のＣ末端延長ペプチドを含むグルカゴン融合ペプチドにおいて、２９位の天然トレオニン残基をグリシンに置換することにより、ＧＬＰ−１受容体活性が劇的に増加されることを発見した。このアミノ酸置換を、本明細書で開示された他の修飾と共に使用して、ＧＬＰ−１受容体用のグルカゴン類似体の親和性を増強することができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換は、本明細書に記載のように、Ｓ１６Ｅ及びＮ２０Ｋアミノ酸置換と、随意にアミノ酸１６及び２０間のラクタム架橋と、及び随意にＰＥＧ鎖の付加と組み合わせて使用することができる。１つの実施形態では、配列番号６４の配列を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストが提供される。１つの実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号５５、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択され、ＰＥＧ鎖は、１７、２１、２４位、又はＣ末端アミノ酸に、又は２１及び２４位の両方に存在する場合、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。より詳しくは、１つの実施形態では、グルカゴンペプチドセグメントは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号６３からなる群から選択され、ＰＥＧ鎖は、５００〜５，０００の範囲から選択される。１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５及び配列番号６５の配列を含む融合ペプチドであり、配列番号６５のペプチドは、配列番号５５のカルボキシ末端に結合されている。

【0152】

荷電中性Ｃ末端
１つの実施形態によると、配列番号１０のグルカゴンペプチドの追加的化学修飾は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する相対的活性が事実上同じになるまで、ＧＬＰ−１受容体効力の増加をもたらす。従って、１つの実施形態では、本発明のグルカゴンペプチドの末端アミノ酸が、天然アミノ酸に存在するカルボキシル酸基の代りのアミド基を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストが提供される。それぞれのグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴン類似体の相対的活性は、グルカゴンペプチドを更に修飾して、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の約４０％〜約５００％以上を示し、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１活性の約２０％〜約２００％以上、例えばＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンの通常の活性と比べて５０倍、１００倍以上の増加を示す類似体を生成することにより調整することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン活性の最大約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１活性の最大約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、又は１，０００，０００％を示す。

【0153】

アルファヘリックス／分子内架橋の安定化
更なる実施形態では、ペプチドのカルボキシ末端の３次元構造を安定化させるために、２個のアミノ酸側鎖間に分子内架橋が形成されている、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性の増加を示すグルカゴン類似体が提供される。これら２個のアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、塩橋の形成等のイオン性相互作用により、又は共有結合により互いに結合することができる。これら２個のアミノ酸側鎖が１つ又は複数の共有結合により互いに結合されている場合、本明細書では、ペプチドは共有結合性分子内架橋を含むとみなすことができる。これら２個のアミノ酸側鎖が、非共有結合、例えば水素結合、イオン性相互作用により互いに結合されている場合、本明細書では、ペプチドは非共有結合性分子内架橋を含むとみなすことができる。

【0154】

幾つかの実施形態では、分子内架橋は、３個のアミノ酸で隔てられる２個のアミノ酸、例えばｉ及びｉ＋４位のアミノ酸間で形成され、ｉは、１２〜２５の任意の整数である（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５）。より詳しくは、アミノ酸対１２及び１６、１６及び２０、２０及び２４、又は２４及び２８（ｉ＝１２、１６、２０、又は２４であるアミノ酸対）の側鎖が互いに結合され、従ってグルカゴンアルファヘリックスを安定化させる。或いは、ｉは１７であってもよい。

【0155】

ｉ及びｉ＋４位のアミノ酸が分子内架橋により結合されている幾つかの特定の実施形態では、リンカーのサイズは、約８個の原子、又は約７〜９個の原子である。

【0156】

他の実施形態では、分子内架橋は、２個のアミノ酸で隔てられる２個のアミノ酸間、例えばｊ及びｊ＋３位のアミノ酸間で形成され、ｊは、１２〜２６の任意の整数である（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６）。幾つかの特定の実施形態では、ｊは１７である。

【0157】

ｊ及びｉ＋３位のアミノ酸が分子内架橋により結合されている幾つかの特定の実施形態では、リンカーのサイズは、約６個の原子、又は約５〜７個の原子である。

【0158】

更に他の実施形態では、分子内架橋は、６個のアミノ酸で隔てられている２個のアミノ酸間、例えばｋ及びｋ＋７位のアミノ酸間で形成され、ｋは、１２〜２２の任意の整数である（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２）。幾つかの特定の実施形態では、ｋは、１２、１３、又は１７である。例示的な実施形態では、ｋは１７である。

【0159】

共有結合で結合されて６原子結合架橋を形成することが可能なアミノ酸対の例には、Ｏｒｎ及びＡｓｐ、Ｇｌｕ及び式中ｎが２である式Ｉのアミノ酸、並びにホモグルタミン酸及び式中ｎが１である式Ｉのアミノ酸が含まれ、式Ｉは下記の通りである。

【0160】

【化6】

【0161】

共有結合で結合されて７原子結合架橋を形成することが可能なアミノ酸対の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、又はホモｓｅｒ−ホモｇｌｕ（ラクトン）が含まれる。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸対の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモｇｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）が含まれる。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸対の例には、ホモｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモｇｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）が含まれる。これらアミノ酸の側鎖はいずれも、アルファヘリックスの３次元構造が破壊されない限り、追加的な化学基で更に置換されていてもよい。当業者であれば、同様のサイズ及び所望の効果の安定化構造を生成することになる、化学的に修飾された誘導体を含む代替対又は代替アミノ酸類似体を想起することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は、長さが６個の原子であり、所望の効果を提供するために更に修飾することができる。共有結合が無くとも、上述のアミノ酸対、又は当業者が想起することのできる類似した対も、非共有結合により、例えば塩橋又は水素結合相互作用の形成により、アルファヘリックスに安定性の付加を提供することができる。

【0162】

更なる例示的な実施形態には、随意にラクタム架橋を有する以下の対が含まれる：１２位のＧｌｕ及び１６位のＬｙｓ；１２位の天然Ｌｙｓ及び１６位のＧｌｕ；１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓ；１６位のＬｙｓ及び２０位のＧｌｕ；２０位のＧｌｕ及び２４位のＬｙｓ；２０位のＬｙｓ及び２４位のＧｌｕ；２４位のＧｌｕ及び２８位のＬｙｓ；２４位のＬｙｓ及び２８位のＧｌｕ。

【0163】

１つの実施形態によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニスト活性を示すグルカゴン類似体であって、配列番号１１、４７、４８、及び４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む類似体が提供される。１つの実施形態では、側鎖は、互いに共有結合で結合されており、１つの実施形態では、２個のアミノ酸は、互いに結合されてラクタム環を形成する。ラクタム環のサイズは、アミノ酸側鎖の長さに応じて様々であってもよく、１つの実施形態では、ラクタムは、リジンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸側鎖に結合させることにより形成される。

【0164】

ラクタム環のアミド結合の順序は逆転させることができる（例えば、ラクタム環は、Ｌｙｓ１２及びＧｌｕ１６又はその代わりにＧｌｕ１２及びＬｙｓ１６の側鎖間に形成することができる）。１つの実施形態によると、アミノ酸対１２及び１６、１６及び２０、２０及び２４、２４及び２８からなる群から選択されるアミノ酸対の側鎖間に少なくとも１つのラクタム環が形成されている配列番号４５のグルカゴン類似体が提供される。１つの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストであって、同時アゴニストが配列番号２０のグルカゴンペプチド類似体を含み、ペプチドが、アミノ酸１２及び１６位間、又はアミノ酸１６及び２０位間に形成された分子内ラクタム架橋を含む同時アゴニストが提供される。１つの実施形態では、配列番号２０の配列を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストであって、分子内ラクタム架橋が、アミノ酸１２及び１６位間、アミノ酸１６及び２０位間、又はアミノ酸２０及び２４位間に形成されており、２９位のアミノ酸がグリシンであり、配列番号２９の配列が、配列番号２０のＣ末端アミノ酸に結合されている同時アゴニストが提供される。更なる実施形態では、２８位のアミノ酸はアスパラギン酸である。

【0165】

ラクタム架橋以外の分子内架橋を使用して、グルカゴン類似体ペプチドのアルファヘリックスを安定化させることができる。１つの実施形態では、分子内架橋は疎水性架橋である。この場合、分子内架橋は、随意に、グルカゴン類似体ペプチドのアルファヘリックスの疎水性面の一部である２個のアミノ酸の側鎖間にある。例えば、疎水性架橋により結合されるアミノ酸の１個は、１０、１４、及び１８位のアミノ酸であってもよい。

【0166】

１つの特定の態様では、全炭化水素架橋系を使用して、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスの１つ又は２つのターンを架橋するために、オレフィンメタセシスを使用する。この場合、グルカゴンペプチドは、様々な長さのオレフィンの側鎖を保持し、ｉ及びｉ＋４又はｉ＋７位がＲ又はＳ立体化学のいずれかの配置であるα−メチル化アミノ酸を含むことができる。例えば、オレフィン側鎖は、式中ｎが１〜６の任意の整数である（ＣＨ_２）ｎを含むことができる。１つの実施形態では、８原子の長さの架橋の場合、ｎは３である。そのような分子内架橋を形成する好適な方法は、当技術分野に記述されている。例えば、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２２： ５８９１−５８９２ （２０００）及びＷａｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５： １４６６−１４７０ （２００４）を参照されたい。或いは、グルカゴンペプチドは、隣接するヘリックスターンに位置するＯ−アリルＳｅｒ残基を含むことができ、それらはルテニウム触媒性閉環メタセシスにより一緒に架橋される。そのような架橋手順は、例えば、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ， Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３７： ３２８１−３２８４ （１９９８）に記述されている。

【0167】

別の特定の態様では、シスチンのペプチド模倣体として広く採用されている非天然チオ−ジアラニンアミノ酸、ランチオニンの使用が、アルファヘリックスの１つのターンを架橋するために使用される。ランチオニンに基づく環化の好適な方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５： １３９９−１４０１ （２００４）；Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． ５１： ４３２−４３６ （１９９８）；Ｐｏｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３５： ４１８５−４１９４ （１９９２）；Ｏｓａｐａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４０： ２２４１−２２５１ （１９９７）；Ｆｕｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ． ６５： ２２２７−２２４０ （１９９２）；Ｈａｒｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３６： ７３−８０ （１９７１）；Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｏ， Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． ６８： １３０３−１３０８ （１９９６）；及びＯｓａｐａｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５９９−１６００ （１９９３）を参照されたい。

【0168】

幾つかの実施形態では、α，ω−ジアミノアルカンテザー、例えば、ｉ及びｉ＋７位の２個のＧｌｕ残基間の１，４−ジアミノプロパン及び１，５−ジアミノペンタンを使用して、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスを安定化させる。そのようなテザーは、ジアミノアルカンテザーの長さに応じて、長さが９原子以上の架橋の形成に結び付く。そのようなテザーで架橋されたペプチドを生成する好適な方法は、当技術分野に記述されている。例えば、Ｐｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９： ４５５−４６０ （１９９７）を参照されたい。

【0169】

本発明の更に別の実施形態では、ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスの１つ又は２つのターンを架橋する。或いは、１つ又は両方の硫黄原子がメチレン基で置換されており、等配電子的な大環状化をもたらす修飾ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスを安定化させる。ジスルフィド架橋又は硫黄に基づく環化でペプチドを修飾する好適な方法は、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３： ９３９１−９３９２ （１９９１）及びＲｕｄｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｊｏｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ２０： ５７０−５７１ （１９６４）に記述されている。

【0170】

更に別の実施形態では、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスは、ｉ及びｉ＋４に位置する２個のＨｉｓ残基又はＨｉｓ及びＣｙｓ対による金属原子の結合により安定化される。金属原子は、例えば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、又はＣｄ（ＩＩ）であってもよい。金属結合に基づくアルファヘリックス安定化のそのような方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｔａｂｏｒ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５５： １１７１１−１１７４３ （１９９９）；Ｇｈａｄｉｒｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２： １６３０−１６３２ （１９９０）；及びＧｈａｄｉｒｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９： ９０６３−９０６４ （１９９７）を参照されたい。

【0171】

或いは、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスは、ペプチド環化の他の手段により安定化させることができ、それら手段は、Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｓｃｉ． ９： ４７１−５０１ （２００３）に概説されている。アルファヘリックスは、アミド架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバマート架橋、及びスルホンアミド架橋等の形成により安定化させることができる。例えば、チオエステル架橋を、Ｃ末端とＣｙｓ残基の側鎖との間で形成することができる。或いは、チオエステルは、チオール（Ｃｙｓ）及びカルボキシル酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）を有するアミノ酸の側鎖により形成することができる。別の方法では、ジカルボキシル酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）等の架橋剤は、遊離アミノ、ヒドロキシル、チオール基、及びそれらの組み合わせ等の、アミノ酸側鎖の２つの官能基間に結合を導入することができる。

【0172】

１つの実施形態によると、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスは、ｉ及びｉ＋４位に疎水性アミノ酸を組み込むことにより安定化される。例えば、ｉはＴｙｒであってもよく、ｉ＋４はＶａｌ又はＬｅｕのいずれかであってもよく；ｉはＰｈｅであってもよく、ｉ＋４はＣｙｓ又はＭｅｔであってもよく；ＩはＣｙｓであってもよく、ｉ＋４はＭｅｔであってもよく；又はｉはＰｈｅであってもよく、ｉ＋４はＩｌｅであってもよい。本明細書の目的の場合、上記のアミノ酸対は逆転していてもよく、ｉ位に指定されているアミノ酸は、その代わりにｉ＋４位に位置してもよく、ｉ＋４位のアミノ酸は、ｉ位に位置してもよいことが理解されるべきである。

【0173】

本発明の更に別の実施形態によると、ＧＬＰ−１活性が増強されたグルカゴンペプチドは、（ａ）α，α−二置換アミノ酸による１２〜２９位のアミノ酸内の１つ又は複数の置換、及び随意に（ｂ）Ｃ末端アミドを含む。幾つかの態様では、そのようなグルカゴンペプチドは、特に、グルカゴンのＣ末端部分にあるアルファ−ヘリックス（１２〜２９位付近）を安定化させる分子内架橋、例えば共有結合性分子内架橋を欠如することが認識されるべきである。幾つかの実施形態では、グルカゴンの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は２９位のうちの１、２、３、又は４つ以上が、α，α−二置換アミノ酸、例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、メチル、エチル、プロピル、及びｎ−ブチルから選択される同じ又は異なる基で、又はシクロオクタン若しくはシクロヘプタン（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボキシル酸）で二置換されたアミノ酸で置換されている。例えば、ＡＩＢによる１６位の置換は、分子内架橋、例えば非共有結合性分子内架橋（例えば、塩橋）、又は共有結合性分子内架橋（例えば、ラクタム）の非存在下で、ＧＬＰ−１活性を増強する。幾つかの実施形態では、１６、２０、２１、又は２４位の１、２、又は３箇所以上が、ＡＩＢで置換される。そのようなグルカゴンペプチドは、本明細書に記載の他の修飾の１つ又は複数を更に含むことができ、それらには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：アシル化、アルキル化、ペグ化、Ｃ末端の１〜２個のアミノ酸の欠失、Ｃ末端における荷電アミノ酸の付加及び／又置換、アミドによるＣ末端カルボキシラートの置換、Ｃ末端延長部分の付加、並びに保存的及び／又は非保存的アミノ酸置換、例えば、Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換、Ｇｌｕ（又は類似のアミノ酸）による１５位のＡｓｐの置換、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成するアミノ酸による１位及び／又は２位の置換、Ａｌａによる２位のＳｅｒの置換、Ｖａｌ又はＰｈｅによる１０位のＴｙｒの置換、Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換、Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、又はＡＩＢによる２０及び／又は２４位のＧｌｎの置換、Ｇｌｕ又はＴｈｒによる１６位のＳｅｒの置換、Ａｌａによる１８位のＡｒｇの置換、Ｌｙｓによる２０位のＧｌｎの置換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐ、及びＡｓｎ又はＣｙｓによる２４位のＧｌｎ。幾つかの実施形態では、先述のグルカゴンペプチドは、２９位にＧｌｎ又はＧｌｙを含むか、又は２８位のアミノ酸のＣ末端側へのＣ末端延長部分、例えばＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２６）の付加を含む。特定の態様では、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端カルボキシラートの代りに、アミド基、アシル基、例えばＣ１６脂肪酸、及び親水性部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つ又は複数を含む。

【0174】

また、別の特定の態様では、グルカゴンペプチドは、配列番号１〜２５、３０〜６４、及び６６〜５５５のいずれかのアミノ酸配列を含み、それら配列は、配列番号１と比べて多くとも１０個の修飾を含み、１６、２０、２１、及び／又は２４位にＡＩＢによる１つ又は複数のアミノ酸置換含み、ペプチドは、ペプチドの２個のアミノ酸の側鎖間の分子内架橋、例えば共有結合性分子内架橋を欠如している。従って、より特定の態様では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５６〜５６１のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0175】

幾つかの実施形態によると、分子内架橋を欠如するグルカゴンペプチドは、α，α−二置換アミノ酸によるアミノ酸１２〜２９位内の１つ又は複数の置換、及びグルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されたアシル又はアルキル基を含む。特定の実施形態では、アシル又はアルキル基は、天然ではアミノ酸に存在しない。ある態様では、アシル又はアルキル基は、１０位のアミノ酸に対して非天然である。例示的な実施形態では、分子内架橋を欠如するグルカゴンペプチドは、配列番号５５６〜５６１のいずれかのアミノ酸配列、及びグルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されたアシル又はアルキル基を含む。分子内架橋を欠如するそのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、アシル化されていない対応するペプチドと比較して、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性の増強を示す。アシル又はアルキル基とペプチドの１０位のアミノ酸側鎖との間にスペーサーを組み込むことにより、分子内架橋を欠如するアシル化グルカゴンペプチドによるＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する更なる活性の増強が達成される。スペーサーが組み込まれているか又は組み込まれていないアシル化及びアルキル化は、本明細書に更に記述されている。

【0176】

１位における修飾
本発明の１つの実施形態によると、ＧＬＰ−１活性が増強されたグルカゴンペプチドは、（ａ）大型芳香族アミノ酸による１位のＨｉｓのアミノ酸置換、及び（ｂ）この分子のＣ末端部分にあるそのアルファヘリックス（例えば、１２〜２９位付近）を安定化させる分子内架橋を含む。特定の実施形態では、１位のアミノ酸は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ、又は３−アミノ−Ｔｙｒである。特定の態様では、分子内架橋は、３個の介在アミノ酸により隔てられている２個のアミノ酸の側鎖間、つまりアミノ酸ｉ及びｉ＋４位の側鎖間にある。幾つかの実施形態では、分子内架橋はラクタム架橋である。本発明のより特定の実施形態では、グルカゴンペプチドは、１位に大型芳香族アミノ酸、並びにペプチドの１６及び２０位のアミノ酸間のラクタム架橋を含む。そのようなグルカゴンペプチドは、本明細書に記載の他の修飾の１つ又は複数（例えば、２、３、４、又は５つ以上）を更に含んでいてもよい。例えば、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端カルボキシラートの代りにアミドを含んでいてもよい。従って、１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５５のアミノ酸配列を含む。

【0177】

アシル化
１つの実施形態によると、グルカゴンペプチドは、アシル基、例えば天然アミノ酸に対して非天然であるアシル基を含む。アシル基は、ペプチドが、（ｉ）血中半減期の長期化、（ｉｉ）作用開始の遅延、（ｉｉｉ）作用持続時間の延長、（ｉｖ）ＤＰＰ−ＩＶ等のプロテアーゼに対する耐性の向上、並びに（ｖ）ＧＬＰ−１受容体、ＧＩＰ受容体、及び／又はグルカゴン受容体に対する効力増加のうちの１つ又は複数を示すことの原因となる。本明細書に示されているように、アシル化グルカゴンペプチドは、対応する非アシル化グルカゴンペプチドと比較して、グルカゴン受容体、ＧＩＰ受容体、及び／又はＧＬＰ−１受容体に対する活性減少を示さない。むしろ、幾つかの場合では、アシル化グルカゴンペプチドは、実際に、ＧＬＰ−１受容体、ＧＩＰ受容体、及び／又はグルカゴン受容体に対する活性増加を示す。従って、アシル化類似体の効力は、増強されない場合でも、グルカゴン同時アゴニスト類似体の非アシル化型と同等である。

【0178】

１つの実施形態によると、グルカゴンペプチドは、血中半減期の長期化、及び／又は作用開始の遅延、及び／又は作用持続時間の延長、及び／又はＤＰＰ−ＩＶ等のプロテアーゼに対する耐性の向上のために、エステル、チオエステル、又はアミド結合によりグルカゴンペプチドに結合されているアシル基を含むように修飾される。

【0179】

アシル化は、グルカゴン及び／又はＧＬＰ−１活性及び／又はＧＩＰ活性が、増強されないとしても保持される限り、１〜２９位のいずれかを含むグルカゴンペプチド内の任意の位置、Ｃ末端延長部分内の位置、又はＣ末端アミノ酸において実施することができる。非限定的な例には、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３位（配列番号１のアミノ酸の付番による）が含まれる。特定の実施形態では、アシル化は、グルカゴンペプチドの１０又は４０位で生じ、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有結合性分子内架橋（例えば、ラクタム架橋）を欠如しており、Ｃ末端延長部分を含む。分子内架橋を欠如し、Ｃ末端延長部分を含むそのようなアシル化ペプチドは、対応する非アシル化ペプチドと比較して、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、及びグルカゴン受容体に対する活性の増強を示す。従って、アシル化が生じる位置は、グルカゴン類似体の全体的な活性特性を変更する場合がある。

【0180】

グルカゴンペプチドは、親水性部分が結合されているのと同じアミノ酸位置で、又は異なるアミノ酸位置でアシル化されていてもよい。非限定的な例には、１０又は４０位のアシル化、及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分の１つ又は複数の位置、例えばＣ末端延長部分内の２４、２８、２９、又は４０位の、又はＣ末端の（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加による）ペグ化が含まれる。

【0181】

アシル基は、グルカゴンペプチドのアミノ酸に共有結合で直接的に結合されていてもよく、又はスペーサーを介して間接的にグルカゴンペプチドのアミノ酸に結合されていてもよく、スペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ酸とアシル基との間に配置される。

【0182】

本発明の特定の態様では、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的アシル化により、アシル基を含むように修飾される。幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールにより直接的にアシル化される。幾つかの実施形態では、アシル化は、１０、２０、２４、２９、又は４０位にある。この点で、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ又は複数を含み、１０、２０、２４、２９、又は４０位のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸に修飾されている、配列番号１の修飾されたアミノ酸配列を含むことができる。本発明の幾つかの特定の実施形態では、グルカゴンペプチドの直接的アシル化は、１０又は４０位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールにより生じる。

【0183】

幾つかの実施形態では、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。

【0184】

【化7】

【0185】

幾つかの例示的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４の場合は（Ｌｙｓ）、又はｎが３の場合は（Ｏｒｎ）のアミノ酸である。

【0186】

幾つかの実施形態では、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。

【0187】

【化8】

【0188】

幾つかの例示的な実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１の場合は（Ｓｅｒ）のアミノ酸である。

【0189】

幾つかの実施形態では、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。

【0190】

【化9】

【0191】

幾つかの例示的な実施形態では、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１の場合は（Ｃｙｓ）のアミノ酸である。

【0192】

更なる他の実施形態では、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合された水素が、第２の側鎖で置換されていることを除き、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む二置換アミノ酸である。

【0193】

本発明の１つの実施形態では、アシル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアシル基の間にスペーサーを含む。幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、共有結合でアシル基に結合されているスペーサーに共有結合で結合されている。

【0194】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸、又は側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。スペーサーが結合されているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸（例えば、一置換又は二置換のα−置換アミノ酸）であってもよい。例えば、側鎖ＮＨ_２、−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕ）が好適である。この点で、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ又は複数を含み、１０、２０、２４、２９、及び４０位のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はカルボキシラートを含む任意のアミノ酸に修飾されている、配列番号１の修飾されたアミノ酸配列を含むことができる。

【0195】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸、又は側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。

【0196】

アシル化がスペーサーのアミン基により生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンにより生じ得る。アルファアミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であってもよい。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び８−アミノオクタン酸であってもよい。或いは、スペーサーのアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであってもよい。

【0197】

スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミン及び側鎖アミンを両方ともアシル化することが可能であり、その結果グルカゴンペプチドがジアシル化される。本発明の実施形態には、そのようなジアシル化分子が含まれる。

【0198】

アシル化がスペーサーのヒドロキシル基により生じる場合、ジペプチド又はトリペプチドのアミノ酸又はアミノ酸の１つは、式ＩＩのアミノ酸であってもよい。特定の例示的な実施形態では、アミノ酸はＳｅｒである。

【0199】

アシル化がスペーサーのチオール基により生じる場合、ジペプチド又はトリペプチドのアミノ酸又はアミノ酸の１つは、式ＩＩＩのアミノ酸であってもよい。特定の例示的な実施形態では、アミノ酸はＣｙｓである。

【0200】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーである。ある実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、２つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、チオール基及びカルボキシラートを含む。特定の実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシラートを含む。この点で、スペーサーは、例えば、ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨを含むことができ、式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．社（ルーイビル、ケンタッキー州）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸等である。

【0201】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、疎水性の二官能性スペーサーである。疎水性の二官能性のスペーサーは、当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全体が組み込まれるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９６）を参照されたい。ある実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、２つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基及びカルボキシラートを含む。カルボキシラート及びヒドロキシル基又はチオール基を含む好適な疎水性の二官能性スペーサーは、当技術分野で公知であり、例えば、８−ヒドロキシオクタン酸及び８−メルカプトオクタン酸が含まれる。

【0202】

幾つかの実施形態では、二官能性スペーサーは、カルボキシラート基間に１〜７個の炭素原子の非分岐メチレンを含むジカルボキシル酸ではない。幾つかの実施形態では、二官能性スペーサーは、カルボキシラート基間に１〜７個の炭素原子の非分岐メチレンを含むジカルボキシル酸である。

【0203】

スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、又は疎水性の二官能性スペーサー）は、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子、（例えば、６、７、８、９、又は１０個の原子）である。より特定の実施形態では、スペーサーは、長さが約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）であり、アシル基は、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アシル基、例えば、Ｃ１４脂肪酸アシル基、Ｃ１６脂肪酸アシル基であり、従ってスペーサー及びアシル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個の原子である。幾つかの実施形態では、スペーサー及びアシル基の長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６、１９〜２１個）の原子である。

【0204】

ある先述の実施形態によると、二官能性スペーサーは、長さが３〜１０個の原子であるアミノ酸骨格を含む合成又は天然アミノ酸（これらに限定されないが、本明細書に記載されているもののいずれかを含む）であってもよい（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び８−アミノオクタン酸）。或いは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）であるペプチド骨格を有するジペプチド又はトリペプチドスペーサーであってもよい。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーの各アミノ酸は、ジペプチド又はトリペプチドの他のアミノ酸（複数可）と同じであってもよく又は異なっていてもよく、以下のものからなる群から独立して選択することができる：例えば、天然アミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤ又はＬ異性体のいずれか、又は以下のものからなる群から選択される非天然アミノ酸のあらゆるＤ又はＬ異性体を含む天然及び／又は非天然アミノ酸：β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボキシル酸、アミノピペリジンカルボキシル酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボキシル酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボキシル酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リジン、ジメチル−リジン、トリメチル−リジン、メタノプロリン、メチオニンースルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ_２））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラーアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ_２））、４−シアノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボキシル酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、チロシンスルファートテトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、及びアルキル化３−メルカプトプロピオン酸。

【0205】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、全体的に負電荷を含み、例えば、１個又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、基本構造Ａ−Ｂのジペプチドのいずれでもなく、Ａは、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、及びＰｒｏからなる群から選択され、Ｂは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、以下のものからなる群から選択される：Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ。

【0206】

幾つかの例示的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、又はチオールをアシル化することにより、アシル基を含むように修飾され、スペーサーは、グルカゴンペプチドの１０、２０、２４、２９、又は４０位のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に結合されている。

【0207】

更により特定の実施形態では、アシル基は、グルカゴンペプチドの１０又は４０位のアミノ酸に結合されており、スペーサー及びアシル基の長さは、１４〜２８個の原子である。１０又は４０位のアミノ酸は、幾つかの態様では、式Ｉのアミノ酸、例えばＬｙｓ、又は式Ｉと関連する二置換アミノ酸である。より特定の実施形態では、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有結合性分子内架橋を欠如する。グルカゴンペプチドは、例えば、ペプチドのアルファヘリックスを安定化させるための１つ又は複数のアルファ，アルファ二置換アミノ酸、例えばＡＩＢを含むペプチドであってもよい。従って、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号５５５〜５６１及び６１０〜６１２のいずれかのアミノ酸配列、表２０及び２８の又は配列番号６５７〜６６９のＡＩＢ含有ペプチドを含むことができる。

【0208】

アミン、ヒドロキシル、及びチオールによるペプチドアシル化の好適な方法は、当技術分野で公知である。例えば、実施例１９（アミンによるアシル化の方法について）、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１８： ３７７−３８２ （１９９６）；Ｓｈｉｍｏｈｉｇａｓｈｉ ａｎｄ Ｓｔａｍｍｅｒ， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ １９： ５４−６２ （１９８２）；及びＰｒｅｖｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２６３： ７−１３ （１９７２）（ヒドロキシルによるアシル化の方法について）；及びＳａｎ ａｎｄ Ｓｉｌｖｉｕｓ， Ｊ Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ ６６： １６９−１８０ （２００５）（チオールによるアシル化の方法について）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． “Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ｐａｇｅｓ １， ２−１２ （１９９０）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌ Ｒｅｓ． “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ” Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ： ２ ｐｐ．１７１−１７６ （１９８９）を参照されたい。

【0209】

アシル化グルカゴンペプチドのアシル基は、任意のサイズ、例えば任意の長さの炭素鎖であってもよく、直鎖であってもよく、又は分岐していてもよい。本発明の幾つかの特定の実施形態では、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸、又はＣ３０脂肪酸のいずれであってもよい。幾つかの実施形態では、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸又はＣ１６脂肪酸である。

【0210】

代替的な実施形態では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、これらに限定されないが、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及びコレステロール酸を含む、任意の好適な胆汁酸であってもよい。

【0211】

本発明の幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドにより長鎖アルカンをアシル化することにより、アシル基を含むように修飾される。特定の態様では、長鎖アルカンは、グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するアミン、ヒドロキシル、又はチオール基（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、及びヘキサデカンチオール）を含む。グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態は、グルカゴンペプチドのアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の一部であってもよく、又はペプチド骨格の一部であってもよい。

【0212】

ある実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドに結合されるスペーサーにより長鎖アルカンをアシル化することにより、アシル基を含むように修飾される。特定の態様では、長鎖アルカンは、スペーサーのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するアミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。カルボキシル基又はその活性化形態を含む好適なスペーサーは、本明細書に記載されており、例えば、二官能性スペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、及び疎水性の二官能性スペーサーが含まれる。

【0213】

本明細書で使用される場合、用語「カルボキシル基の活性化形態」は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘを有するカルボキシル基を指し、式中Ｘは脱離基であり、Ｒはグルカゴンペプチド又はスペーサーである。例えば、カルボキシル基の活性化形態には、これらに限定されないが、塩化アシル、酸無水物、及びエステルが含まれていてもよい。幾つかの実施形態では、活性化カルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）脱離基を有するエステルである。

【0214】

長鎖アルカンが、グルカゴンペプチド又はスペーサーによりアシル化されている本発明のこれら態様に関して、長鎖アルカンは、任意のサイズであってもよく、任意の長さの炭素鎖を含んでいてもよい。長鎖アルカンは、直鎖であってもよく、又は分岐していてもよい。ある態様では、長連鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン、又はＣ３０アルカンのいずれであってもよい。幾つかの実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカンを含む。

【0215】

また、幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドのアミン、ヒドロキシル、又はチオール基が、コレステロール酸でアシル化される。特定の実施形態では、グルカゴンペプチドは、アルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサー、又はアルキル化３−メルカプトプロピオン酸スペーサーによりコレステロール酸に結合される。アルキル化デス−アミノＣｙｓスペーサーは、例えば、ドデカエチレングリコール部分を含むデス−アミノＣｙｓスペーサーであってもよい。

【0216】

本明細書に記載のアシル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されていてもよい。幾つかの特定の実施形態では、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載の方法のいずれか等の任意の好適な方法により達成することができる。この点で、アシル化グルカゴンペプチドは、本明細書に記載の修飾のいずれかを含む配列番号１を含んでいてもよく、１０、２０、２４、２９、及び４０位のアミノ酸の少なくとも１つはアシル基を含み、１６、１７、２１、２４、２９、４０位、Ｃ末端延長部分内の位置のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸のうちの少なくとも１つが、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅへと修飾されており、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合で結合されている。幾つかの実施形態では、アシル基は、随意に、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーにより１０又は４０位に結合されており、親水性部分は、２４位のＣｙｓ残基に組み込まれている。

【0217】

或いは、アシル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、スペーサーは、アシル化されており、かつ親水性部分を含むように修飾されている。好適なスペーサーの非限定的な例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。

【0218】

本発明の特定の態様では、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号５３４〜５４４、５４６〜５４９、及び６５７〜６６９のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0219】

アルキル化
幾つかの実施形態によると、グルカゴンペプチドは、アルキル基、例えば、天然ではアミノ酸に生じないアルキル基（例えば、天然アミノ酸に対して非天然であるアルキル基）を含むように修飾される。任意の特定の理論に束縛されないが、グルカゴンペプチドのアルキル化は、同じではないとしても、グルカゴンペプチドのアシル化と同様の効果、例えば、血中半減期の長期化、作用開始の遅延、作用持続時間の延長、ＤＰＰ−ＩＶ等のプロテアーゼに対する耐性の向上、及びＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する効力の増加を達成することになると考えられる。

【0220】

アルキル化は、グルカゴン活性が保持される限り、１〜２９位のいずれかを含むグルカゴンペプチド内の任意の位置、Ｃ末端延長部分内の位置、又はＣ末端アミノ酸において実施することができる。非限定的な例には、配列番号１のアミノ酸の付番による、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３位が含まれる。アルキル基は、グルカゴンペプチドのアミノ酸に共有結合で直接的に結合されていてもよく、又はスペーサーを介して間接的にグルカゴンペプチドのアミノ酸に結合されていてもよく、スペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ酸とアルキル基との間に配置される。グルカゴンペプチドは、親水性部分が結合されているのと同じアミノ酸位置で、又は異なるアミノ酸位置でアルキル化されていてもよい。非限定的な例には、４０位のアルキル化、及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分の１つ又は複数の位置、例えばＣ末端延長部分内の２４、２８、２９、又は４０位の、又はＣ末端の（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加による）ペグ化が含まれる。

【0221】

本発明の特定の態様では、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的アルキル化により、アルキル基を含むように修飾される。幾つかの実施形態では、アルキル化は、１０、２０、２４、２９、又は４０位にある。この点で、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ又は複数を含み、１０、２０、２４、２９、又は４０位のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸へと修飾されている、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含むことができる。本発明の幾つかの特定の実施形態では、グルカゴンペプチドの直接的アルキル化は、４０位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールにより生じる。

【0222】

幾つかの実施形態では、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４の場合は（Ｌｙｓ）、又はｎが３の場合は（Ｏｒｎ）のアミノ酸である。

【0223】

他の実施形態では、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１の場合は（Ｓｅｒ）のアミノ酸である。

【0224】

更なる他の実施形態では、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施形態では、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１の場合は（Ｃｙｓ）のアミノ酸である。

【0225】

更なる他の実施形態では、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合された水素が、第２の側鎖で置換されていることを除き、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む二置換アミノ酸である。

【0226】

本発明の１つの実施形態では、アルキル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、共有結合でアルキル基に結合されているスペーサーに共有結合で結合されている。幾つかの例示的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、又はチオールをアルキル化することにより、アルキル基を含むように修飾され、スペーサーは、グルカゴンペプチドの１０、２０、２４、２９、又は４０位のアミノ酸の側鎖に結合されている。スペーサーが結合されているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であってもよい。例えば、側鎖ＮＨ_２、−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕ）が好適である。この点で、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ又は複数を含み、１０、２０、２４、２９、又は４０位のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸へと修飾されている、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含むことができる。

【0227】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸、又は側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。

【0228】

アルキル化がスペーサーのアミン基により生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンにより生じる場合がある。アルファアミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であってもよい。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び８−アミノオクタン酸であってもよい。或いは、アルキル化が酸性残基のアルファアミンに生じる場合、スペーサーのアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ、Ｇｌｕであってもよい。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミン及び側鎖アミンを両方ともアルキル化することが可能であり、その結果グルカゴンペプチドはジアルキル化される。本発明の実施形態には、そのようなジアルキル化された分子が含まれる。

【0229】

アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基により生じる場合、ジペプチド又はトリペプチドのアミノ酸又はアミノ酸の１つは、式ＩＩのアミノ酸であってもよい。特定の例示的な実施形態では、アミノ酸はＳｅｒである。

【0230】

アルキル化がスペーサーのチオール基により生じる場合、ジペプチド又はトリペプチドのアミノ酸又はアミノ酸の１つは、式ＩＩＩのアミノ酸であってもよい。特定の例示的な実施形態では、アミノ酸はＣｙｓである。

【0231】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーである。ある実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、２つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、チオール基及びカルボキシラートを含む。特定の実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシラートを含む。この点で、スペーサーは、例えば、ＮＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＣＯＯＨを含むことができ、式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．社（ルーイビル、ケンタッキー州）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸等である。

【0232】

幾つかの実施形態では、スペーサーは、疎水性の二官能性スペーサーである。ある実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、２つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基及びカルボキシラートを含む。他の実施形態では、疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基及びカルボキシラートを含む。カルボキシラート及びヒドロキシル基又はチオール基を含む好適な疎水性の二官能性スペーサーは、当技術分野で公知であり、例えば、８−ヒドロキシオクタン酸、８−メルカプトオクタン酸が含まれる。

【0233】

スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、又は疎水性の二官能性スペーサー）は、特定の実施形態では、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子、（例えば、６、７、８、９、又は１０個の原子））である。より特定の実施形態では、スペーサーは、長さが約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）であり、アルキル基は、Ｃ１２〜Ｃ１８アルキル基、例えば、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１６アルキル基であり、そのため、スペーサー及びアルキル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個の原子である。幾つかの実施形態では、スペーサー及びアルキルの長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６、１９〜２１個）の原子である。

【0234】

ある先述の実施形態によると、二官能性スペーサーは、長さが３〜１０個の原子であるアミノ酸骨格を含む合成又は天然アミノ酸であってもよい（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び８−アミノオクタン酸）。或いは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）であるペプチド骨格を有するジペプチド又はトリペプチドスペーサーであってもよい。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーは、例えば、本明細書で教示されているアミノ酸のいずれかを含む天然及び／又は非天然アミノ酸で構成されていてもよい。幾つかの実施形態では、スペーサーは、全体的に負電荷を含み、例えば、１個又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、以下のものからなる群から選択される：Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ。

【0235】

アミン、ヒドロキシル、及びチオールによるペプチドアルキル化の好適な方法は、当技術分野で公知である。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴンペプチドのヒドロキシル基とアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。また、ハロゲン化アルキルによるペプチドの求核置換反応により、エーテル、チオエーテル、又はアミノ結合のいずれかをもたらすことができる。

【0236】

アルキル化グルカゴンペプチドのアルキル基は、任意のサイズ、例えば任意の長さの炭素鎖であってもよく、直鎖であってもよく、又は分岐していてもよい。本発明の幾つかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、又はＣ３０アルキルのいずれであってもよい。幾つかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、例えばＣ１４アルキル又はＣ１６アルキルである。

【0237】

幾つかの特定の実施形態では、アルキル基は、胆汁酸、例えばコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及びコレステロール酸のステロイド部分を含む。

【0238】

本発明の幾つかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、求核性長鎖アルカンをグルカゴンペプチドと反応させることにより、アルキル基を含むように修飾され、グルカゴンペプチドは求核置換に好適な脱離基を含む。特定の態様では、長鎖アルカンの求核基は、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、及びヘキサデカンチオール）。グルカゴンペプチドの脱離基は、アミノ酸側鎖の一部であってもよく、又はペプチド骨格の一部であってもよい。好適な脱離基には、例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド、ハロゲン、及びスルホン酸エステルが含んでいる。

【0239】

ある実施形態では、グルカゴンペプチドは、求核性長鎖アルカンをグルカゴンペプチドに結合されているスペーサーと反応させることにより、アルキル基を含むように修飾され、スペーサーは脱離基を含む。特定の態様では、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。ある実施形態では、脱離基を含むスペーサーは、本明細書で考察されている任意のスペーサー、例えば、好適な脱離基を更に含むアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、及び疎水性の二官能性スペーサーであってもよい。

【0240】

長鎖アルカンが、グルカゴンペプチド又はスペーサーによりアルキル化される本発明のこれら態様に関して、長鎖アルカンは、任意のサイズであってもよく、任意の長さの炭素鎖を含んでいてもよい。長鎖アルカンは、直鎖であってもよく、又は分岐していてもよい。ある態様では、長連鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン、又はＣ３０アルカンのいずれであってもよい。幾つかの実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカンを含む。

【0241】

また、幾つかの実施形態では、アルキル化は、グルカゴンペプチドとコレステロール部分との間に生じてもよい。例えば、コレステロールのヒドロキシル基は、長鎖アルカンの脱離基を置換して、コレステロール−グルカゴンペプチド生成物を形成することができる。

【0242】

本明細書に記載のアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されていてもよい。幾つかの特定の実施形態では、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載の方法のいずれか等の任意の好適な手段により達成することができる。この点で、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１、又は本明細書に記載のアミノ酸修飾の１つ又は複数を含むその修飾アミノ酸配列を含んでいてもよく、１０、２０、２４、２９、及び４０位のアミノ酸の少なくとも１つがアルキル基を含み、１６、１７、２１、２４、２９、４０位、Ｃ末端延長部分内の位置のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の少なくとも１つが、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅへと修飾されており、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合で結合されている。幾つかの実施形態では、アルキル基は、随意に、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介して４０位に結合されており、親水性部分は、２４位のＣｙｓ残基に組み込まれている。

【0243】

或いは、アルキル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、スペーサーは、アルキル化されており、かつ親水性部分を含むように修飾されている。好適なスペーサーの非限定的な例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。

【0244】

Ｃ末端切断
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのＣ末端の１個又は２個のアミノ酸（つまり、２９及び／又は２８位）の切断又は欠失により、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する活性及び／又は効力に影響を及ぼすことなく更に修飾される。この点で、グルカゴンペプチドは、随意に本明細書に記載の１つ又は複数の修飾を有する天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１〜２７又は１〜２８を含むことができる。

【0245】

１つの実施形態では、切断型グルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号５５０又は配列番号５５１を含む。別の実施形態では、切断型グルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号５５２又は配列番号５５３を含む。

【0246】

荷電Ｃ末端残基
配列番号２０のグルカゴンペプチドの溶解度は、例えば、１、２、又は３個以上の荷電アミノ酸を、配列番号２０のグルカゴンペプチドのＣ末端部分に、好ましくは２７位のＣ末端側の位置に導入することにより更に向上させることができる。そのような荷電アミノ酸は、例えば２８又は２９位の天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、又はその代わりに荷電アミノ酸を、例えば２７、２８、又は２９位の後に付加することにより導入することができる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１個、２個、３個、又は全てが、負に荷電されている。或いは、溶解度は、ポリエチレングリコール等の親水性部分を共有結合でペプチドに結合することにより増強することができる。

【0247】

例示的な実施形態
１つの実施形態によると、配列番号５５の配列を含むグルカゴン類似体であって、前記類似体が、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２４、２７、２８、及び２９位から選択される１〜３個のアミノ酸で配列番号５５と異なっており、前記グルカゴンペプチドが、ＧＬＰ−１受容体に対して天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す類似体が提供される。

【0248】

１つの実施形態によると、以下の配列を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストが提供される：
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３３）、配列中、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＬｙｓであり、２４位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、又は酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、但し１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、又はその代わりに１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位又は２８位のいずれかはＬｙｓである。１つの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、２８位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、２９位のアミノ酸がグルタミン酸である配列番号３３の配列を含む。別の実施形態では、２８位のアミノ酸は天然アスパラギンであり、２９位のアミノ酸は、グリシンであり、配列番号２９又は配列番号６５のアミノ酸配列が、配列番号３３のカルボキシ末端に共有結合で結合されている。

【0249】

１つの実施形態では、追加的な酸性アミノ酸がペプチドのカルボキシ末端に付加されている配列番号３３の配列を含む同時アゴニストが提供される。更なる実施形態では、グルカゴン類似体のカルボキシ端末アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボキシル酸基の代りのアミドを有する。１つの実施形態では、グルカゴン類似体は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0250】

１つの実施形態によると、配列番号３３のグルカゴンペプチド類似体であって、前記類似体が、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、及び２７位から選択される１〜３個のアミノ酸により配列番号３３と異なっており、但し１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位がリジンであるか、又はラクタム架橋が、２４位のアミノ酸と２０又は２８位のアミノ酸のいずれかとの間で形成されるかのいずれかである類似体が提供される。１つの実施形態によると、類似体は、１、２、３、２１、及び２７位から選択される１〜３個のアミノ酸が配列番号３３と異なっている。１つの実施形態では、配列番号３３のグルカゴンペプチド類似体は、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、及び２７位から選択される１〜２個のアミノ酸、又は１つの実施形態では単一のアミノ酸がその配列と異なっており、但し１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位がリジンであるか、又はラクタム架橋が、２４位のアミノ酸と２０又は２８位のアミノ酸のいずれかとの間で形成されるかのいずれかである。

【0251】

別の実施形態によると、比較的選択的なＧＬＰ−１受容体アゴニストであって、ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５３）を含み、配列中、３位のＸａａが、Ｇｌｕ、Ｏｒｎ、又はＮｌｅからなるアミノ酸の群から選択され、１５位のＸａａが、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａが、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａが、Ｇｌｎ又はＬｙｓであり、２４位のＸａａが、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａが、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａが、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、又は酸性アミノ酸であり、Ｒが、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ_２、配列番号２６、又は配列番号２９であり、但し１６位がセリンである場合、２０位がＬｙｓであるか、又はその代わりに１６位がセリンである場合、２４位がＧｌｕであり、２０位又は２８位のいずれかがＬｙｓであるアゴニストが提供される。１つの実施形態では、３位のアミノ酸はグルタミン酸である。１つの実施形態では、２８及び／又は２９位で置換される酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。１つの実施形態では、同時アゴニストペプチドを含むグルカゴンペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に付加された追加的な酸性アミノ酸を更に含む配列番号３３の配列を含む。更なる実施形態では、グルカゴン類似体のカルボキシ端末アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボキシル酸基の代りにアミドを有する。

【0252】

１つの実施形態によると、以下からなる群から選択される修飾グルカゴンペプチドを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストが提供される：
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３４）、配列中、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＬｙｓであり、２４位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｓｐ、又はＬｙｓであり、Ｒは、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ又はＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ_２、配列番号２６、又は配列番号２９であり、但し１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、又はその代わりに１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位又は２８位のいずれかはＬｙｓである。１つの実施形態では、ＲはＣＯＮＨ_２であり、１５位のＸａａはＡｓｐであり、１６位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０及び２４位のＸａａｓは、各々Ｇｌｎであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ又はＡｓｐであり、２９位のＸａａはＴｈｒである。１つの実施形態では、１５及び１６位のＸａａは、各々Ｇｌｕであり、２０及び２４位のＸａａは、各々Ｇｌｎであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ又はＡｓｐであり、２９位のＸａａはＴｈｒであり、ＲはＣＯＮＨ_２である。

【0253】

親ペプチドの活性の少なくとも幾らかを保持しつつ、天然グルカゴンペプチドのある位置を修飾することができることが報告されている。従って、出願人らは、配列番号１１のペプチドの２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９位の位置に位置するアミノ酸の１つ又は複数を、天然グルカゴンペプチドに存在するものとは異なるアミノ酸で置換し、グルカゴン受容体に対する活性を依然として保持させることができると予測する。１つの実施形態では、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化的分解を防止する。別の実施形態では、２０位のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、又はシトルレン（Ｃｉｔｒｕｌｌｅｎｅ）と置換され、及び／又は２１位は、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、又はホモシステイン酸で置換される。

【0254】

１つの実施形態では、配列番号２０のグルカゴンペプチド類似体であって、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２７、２８、又は２９位から選択される１〜６個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっており、但し１６位がセリンである場合、２０位がリジンであるか、又はその代わりに１６位がセリンである場合、２４位がＧｌｕであり、２０又は２８位のいずれかがＬｙｓである類似体が提供される。別の実施形態によると、配列番号２０のグルカゴンペプチド類似体であって、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、又は２９位から選択される１〜３個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている類似体が提供される。別の実施形態では、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１１のグルカゴン類似体であって、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、又は２１位から選択される１〜２個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっており、更なる実施形態では、１〜２個の異なるアミノ酸が、天然グルカゴン配列（配列番号１）に存在するアミノ酸と比べて保存的なアミノ酸である類似体が提供される。１つの実施形態では、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のグルカゴンペプチドであって、グルカゴンペプチドが、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２７、又は２９位から選択される位置に１、２、又は３個のアミノ酸置換を更に含むグルカゴンペプチドが提供される。１つの実施形態では、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、又は２９位の置換は、保守的なアミノ酸置換である。

【0255】

１つの実施形態によると、配列番号３３の配列の変異体を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストであって、変異体の１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７、２８、及び２９位から選択される１〜１０個のアミノ酸が、それぞれ配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている同時アゴニストが提供される。１つの実施形態によると、配列番号３３の配列の変異体であって、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７、及びＧｌｙ２９からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換が配列番号３３と異なる変異体が提供される。１つの実施形態によると、配列番号３３の配列の変異体を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストであって、変異体の１７〜２６位から選択される１〜２個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている同時アゴニストが提供される。１つの実施形態によると、配列番号３３の配列の変異体であって、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、及びＡｌａ２４からなる群から選択されるアミノ酸置換が配列番号３３と異なる変異体が提供される。１つの実施形態によると、配列番号３３の配列の変異体であって、１８位のアミノ酸置換が配列番号３３と異なっており、置換されたアミノ酸が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＧｌｙからなる群から選択される変異体が提供される。１つの実施形態によると、配列番号３３の配列の変異体であって、１８位のＡｌａのアミノ酸置換が配列番号３３と異なっている変異体が提供される。そのような変異は、配列番号５５により包含される。別の実施形態では、配列番号３３の配列の変異体を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストであって、変異体の７〜２２位から選択される１〜２個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている同時アゴニストが提供され、更なる実施形態では、配列番号３３の変異体であって、２０及び２１位の１又は２個のアミノ酸が配列番号３３と異なっている変異体が提供される。１つの実施形態によると、以下の配列を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストが提供される：ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５１）を含み、式中、１５位のＸａａが、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、又はホモシステイン酸であり、１６位のＸａａが、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、又はホモシステイン酸であり、２０位のＸａａが、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、又はシトルリンであり、２１位のＸａａが、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、又はホモシステイン酸であり、２４位のＸａａが、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａが、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａが、Ｔｈｒ又は酸性アミノ酸であり、Ｒが、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ_２である。１つの実施形態では、ＲはＣＯＮＨ_２である。１つの実施形態によると、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４７、配列番号４８、又は配列番号４９の変異体を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストであって、変異体が、２０位のアミノ酸置換で前記配列と異なっている同時アゴニストが提供される。１つの実施形態では、２０位のアミノ酸置換は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、又はシトルリンからなる群から選択される。

【0256】

１つの実施形態では、配列番号３４の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、２位にセリン以外のアミノ酸を有することにより配列番号３４と異なっている類似体が提供される。１つの実施形態では、セリン残基は、アミノイソ酪酸、Ｄ−アラニンで置換され、１つの実施形態では、セリン残基は、アミノイソ酪酸で置換される。そのような修飾は、親化合物の固有の効力を保持しつつ（例えば、親化合物の効力の少なくとも７５、８０、８５、９０、又は９５％以上）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断を抑制する。１つの実施形態では、例えば、１、２、又は３個以上荷電アミノ酸を天然グルカゴンのＣ末端部分に、好ましくは２７位のＣ末端側に導入することにより、類似体の溶解度が増加される。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１個、２個、３個、又は全てが、負に荷電されている。別の実施形態では、類似体は、２８又は２９位の天然アミノ酸を置換した酸性アミノ酸、又は配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を更に含む。

【0257】

１つの実施形態では、本明細書で開示されたグルカゴン類似体を、１又は２位で更に修飾して、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減させる。１つの実施形態では、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のグルカゴン類似体であって、２位の置換が親分子と異なっており、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶによる切断に対する感受性の低減（つまり、耐性）を示す類似体が提供される。より詳しくは、１つの実施形態位置では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、アミノ酪酸、グリシン、Ｎ−メチルセリン、及びアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。１つの実施形態位置では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、及びアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。別の実施形態位置では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、及びアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号２１又は配列番号２２の配列を含む。

【0258】

１つの実施形態では、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のグルカゴン類似体であって、１位の置換が親分子と異なっており、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性の低減（つまり、耐性）を示す類似体が提供される。より詳しくは、類似体ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、及びホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。別の実施形態では、配列番号３４の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有することが配列番号３４と異なっている類似体が提供される。１つの実施形態では、例えば、１、２、又は３個以上荷電アミノ酸を天然グルカゴンのＣ末端部分に、好ましくは２７位のＣ末端側に導入することにより、類似体の溶解度が増加される。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１個、２個、３個、又は全てが、負に荷電されている。別の実施形態では、類似体は、２８又は２９位の天然アミノ酸を置換した酸性アミノ酸、又は配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を更に含む。１つの実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。

【0259】

１つの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、１個のアミノ酸の、又は配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるペプチドの追加的なカルボキシ末端延長部分を更に含む配列番号２０の配列を含む。単一のアミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加されている実施形態では、アミノ酸は、典型的には２０種の一般的アミノ酸の１つから選択され、１つの実施形態では、追加的カルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボキシル酸の代りにアミド基を有する。１つの実施形態では、追加的アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びグリシンからなる群から選択される。

【0260】

代替的な実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストであって、ペプチドが、グルタミン酸残基及びリジン残基の側鎖間に形成された少なくとも１つのラクタム環を含み、グルタミン酸残基及びリジン残基が、３個のアミノ酸により隔てられている同時アゴニストが提供される。１つの実施形態では、ラクタム保持グルカゴンペプチドのカルボキシ端末アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボキシル酸の代りにアミド基を有する。より詳しくは、１つの実施形態では、以下のものからなる群から選択される修飾グルカゴンペプチドを含むグルカゴン及びＧＬＰ−１同時アゴニストが提供される：
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６６）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６７）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６８）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６９）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１６）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１７）
ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１８）

【0261】

式中、２８位のＸａａ＝Ａｓｐ又はＡｓｎであり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ又はＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ_２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択され、配列番号６６の場合は１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕとの間に、配列番号６７の場合は１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓとの間に、配列番号６８の場合は２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕとの間に、配列番号６９の場合は２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓとの間に、配列番号１６の場合は２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕとの間及び２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕとの間に、配列番号１７の場合は１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕとの間及び２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓとの間に、及び配列番号１８の場合は１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓとの間及び２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓとの間に、ラクタム架橋が形成されている。１つの実施形態では、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ_２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、グリシンからなる群から選択され、２８位のアミノ酸はＡｓｎであり、２９位のアミノ酸はトレオニンである。１つの実施形態では、ＲはＣＯＮＨ_２であり、２８位のアミノ酸はＡｓｎであり、２９位のアミノ酸は、トレオニンである。別の実施形態では、Ｒは、配列番号２６、配列番号２９、及び配列番号６５からなる群から選択され、２９位のアミノ酸はグリシンである。

【0262】

更なる実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択され、ペプチドは、１つのアミノ酸の、又は配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるペプチドの追加的なカルボキシ末端延長部分を更に含む。１つの実施形態では、末端延長部分は、配列番号２６、配列番号２９、又は配列番号６５の配列を含み、グルカゴンペプチドは、配列番号５５の配列を含む。１つの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、配列番号３３の配列を含み、１６位のアミノ酸はグルタミン酸であり、２０位のアミノ酸はリジンであり、２８位のアミノ酸はアスパラギンであり、配列番号２６又は配列番号２９のアミノ酸は、配列番号３３のカルボキシ末端に結合されている。

【0263】

単一のアミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加されている実施形態では、アミノ酸は、典型的には２０種の一般的アミノ酸の１つから選択され、１つの実施形態では、アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボキシル酸の代りにアミド基を有する。１つの実施形態では、追加的なアミノ酸は、グルタミン酸、及びアスパラギン酸、及びグリシンからなる群から選択される。グルカゴンアゴニスト類似体がカルボキシ末端延長部分を更に含む実施形態では、延長部分のカルボキシ末端アミノ酸は、１つの実施形態では、カルボキシル酸ではなく、アミド基又はエステル基で終了する。

【0264】

別の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、以下の配列を含む：ＮＨ_２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−ＣＯＮＨ_２（配列番号１９）、式中３０位のＸａａは、任意のアミノ酸を表す。１つの実施形態では、Ｘａａは、２０種の一般的アミノ酸の１つから選択され、１つの実施形態では、アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はグリシンである。このペプチドの溶解度は、配列番号１９の１７、２１、２４、又は３０位のアミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖を共有結合で結合させることより更に向上させることができる。更なる実施形態では、ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるペプチドの追加的なカルボキシ末端延長部分を含む。１つの実施形態によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２の配列を含む。

【0265】

配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号６４のグルカゴン配列の内部に追加的な部位特異的修飾を行って、様々な度合いのＧＬＰ−１アゴニズムを有する一組のグルカゴンアゴニストを産出することができる。従って、各受容体に対して事実上同一のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を有するペプチドが、調製及び特徴付けられた。同様に、２つの受容体の各々に対して効力が選択的に１０倍増強されたペプチドが、特定及び特徴付けられた。上記のように、グルタミン酸による１６位のセリン残基の置換は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体の両方に対する天然グルカゴンの効力を増強するが、グルカゴン受容体に対するおよそ１０倍の選択性を維持する。加えて、３位の天然グルタミンをグルタミン酸で置換することにより（配列番号２２）、ＧＬＰ−１受容体に対するおよそ１０倍の選択性を示すグルカゴン類似体が生成される。

【0266】

グルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニストペプチドの溶解度は、ペプチドの１６、１７、２１、及び２４位に親水性基を導入することにより、又は単一の修飾アミノ酸（つまり、親水性基を含むように修飾されたアミノ酸）をグルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニストペプチドのカルボキシ末端に付加することより、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持させつつ、生理学的なｐＨの水溶液中で更に増強することができる。１つの実施形態によると、親水性基は、ポリエチレン（ＰＥＧ）鎖を含む。より詳しくは、１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８の配列を含み、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１６、１７、２１、２４、２９位のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合で結合されており、但しペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７、２１、又は２４位のアミノ酸残基に共有結合で結合されており、ペプチドが、配列番号１４又は配列番号１５を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１６、１７、又は２１位のアミノ酸残基に共有結合で結合されており、ペプチドが、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７又は２１位のアミノ酸残基に共有結合で結合されている。

【0267】

１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３の配列を含み、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１７、２１、２４位のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合で結合されており、ペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸は、天然アミノ酸のカルボキシ酸基の代りにアミド基を有する。１つの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群から選択される配列を含み、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１９の１７、２１、又は２４位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されているか、又は配列番号１４及び配列番号１５の１６、１７、又は２１位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されているか、又は配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８の１７又は２１位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されている。別の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、配列番号１１又は配列番号１９の配列を含み、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１７、２１、又は２４位のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合で結合されている。

【0268】

１つの実施形態によると、及び上記の段落に記載の制限に従うと、グルカゴン同時アゴニストペプチドは、１６、１７、２１、２４、又は２９位、又はＣ末端アミノ酸に１つ又は複数のアミノ酸置換を含有するように修飾されており、天然アミノ酸は、例えばＰＥＧ含む親水性部分との架橋に好適な側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然ペプチドは、天然アミノ酸又は合成（非天然）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然アミノ酸は、ｉｎ ｖｉｖｏでは天然に生じないが、にもかかわらず本明細書に記載のペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を指す。或いは、例えばＰＥＧ含む親水性部分との架橋に好適な側鎖を有するアミノ酸を、本明細書で開示されたグルカゴン類似体のいずれかのカルボキシ末端に付加することができる。１つの実施形態によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストペプチドにおいて、１６、１７、２１、２４、又は２９位からなる群から選択される位置のアミノ酸置換が行われ、天然アミノ酸が、リシン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、及びアセチルフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、置換するアミノ酸は、アミノ酸の側鎖に共有結合で結合されたＰＥＧ鎖を更に含む。１つの実施形態では、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群から選択されるグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１７又は２１位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されているＰＥＧ鎖を含むように更に修飾される。１つの実施形態によると、ペグ化グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体同時アゴニストは、配列番号２６、配列番号２７、又は配列番号２９の配列を更に含む。

【0269】

別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５又は配列番号５６の配列を含み、配列番号５５又は配列番号５６のＣ末端アミノ酸に結合された配列番号２６、配列番号２９、又は配列番号６５のＣ末端延長部分を更に含み、随意にペプチドの１７、１８、２１、２４、又は２９位のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合で結合されたＰＥＧ鎖を更に含む。別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５又は配列番号５６の配列を含み、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの２１又は２４位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されており、ペプチドは、配列番号２６又は配列番号２９のＣ末端延長部分を更に含む。

【0270】

別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５、又は配列番号３３、又は配列番号３４の配列を含み、追加的なアミノ酸が、配列番号３３又は配列番号３４のＣ末端に付加されており、ＰＥＧ鎖が、付加されたアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されている。更なる実施形態では、ペグ化グルカゴン類似体は、配列番号３３又は配列番号３４のＣ末端アミノ酸に結合された配列番号２６又は配列番号２９のＣ末端延長部分を更に含む。別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１９の配列を含み、ＰＥＧ鎖が、グルカゴンペプチドの３０位のアミノ酸の側鎖に共有結合で結合されており、ペプチドは、配列番号１９のＣ末端アミノ酸に結合された配列番号２６又は配列番号２９のＣ末端延長部分を更に含む。

【0271】

ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形態であってもよく、又は分岐していてもよい。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。代替的な実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。１つの実施形態によると、ペグ化グルカゴンペプチドは、グルカゴン鎖の総分子量が、約１，０００〜約５，０００ダルトンであるグルカゴンペプチドに共有結合で結合された２つ以上のポリエチレン鎖を含む。１つの実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号５からなるペプチド又は配列番号５のグルカゴンアゴニスト類似体を含み、ＰＥＧ鎖が、２１位及び２４位のアミノ酸残基に共有結合で結合されており、２つのＰＥＧ鎖を合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。

【0272】

ある例示的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、最大１０個のアミノ酸修飾を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、アシル化又はアルキル化されている１０位のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、１０位のアミノ酸が、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸でアシル化又はアルキル化されている。ある態様では、１０位のアミノ酸は、天然アミノ酸に対して非天然であるアシル基又はアルキル基を含む。

【0273】

ある実施形態では、アシル化又はアルキル化されている１０位のアミノ酸を含むグルカゴンペプチドは、安定化されたアルファヘリックスを含む。従ってある態様では、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載のアシル又はアルキル基、及び分子内架橋、例えばｉ位のアミノ酸及びｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間の共有結合性分子内架橋（例えば、ラクタム架橋）を含み、ｉは１２、１６、２０、又は２４である。その代わりに又はそれに加えて、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載のアシル又はアルキル基を含み、グルカゴンペプチドの１６、２０、２１、及び／又は２４位の１、２、又は３箇所以上は、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。幾つかの場合、非天然グルカゴンペプチドは、１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓを含み、随意にラクタム架橋はＧｌｕ及びＬｙｓを結合し、随意にグルカゴンペプチドは、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の修飾を更に含む：１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、及び２４位のＡｌａ。

【0274】

また、グルカゴンペプチドが、アシル化又はアルキル化されている１０位のアミノ酸を含む実施形態のいずれかでは、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端アルファカルボキシラートの代わりにＣ末端アミドを更に含むことができる。

【0275】

幾つかの実施形態では、本明細書に記載のアシル又はアルキル基を含むグルカゴンペプチドは、１位、２位、又は１位及び２位にアミノ酸置換を更に含み、アミノ酸置換（複数可）は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。例えば、１位のＨｉｓは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、及びホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されていてもよい。その代わりに又はそれに加えて、２位のＳｅｒは、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、又はアミノイソ酪酸で置換されてもよい。

【0276】

本明細書に記載のアシル化又はアルキル化されている１０位のアミノ酸を含むグルカゴンペプチドは、配列番号１と実質的に関連する任意のアミノ酸配列を含むことができる。例えば、グルカゴンペプチドは、最大１０個のアミノ酸修飾（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の修飾）を有する配列番号１を含む。ある実施形態では、アシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と２５％を超えて同一である（例えば、配列番号１と３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて、又はほぼ１００％同一である）。ある特定の実施形態では、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載のアシル化又はアルキル化された１０位のアミノ酸を有する配列番号５５を含むペプチドである。グルカゴンペプチドは、配列番号５５、１つ又は２つのアミノ酸修飾、２〜４、９〜１８、２０、２３〜２５、３３、４０〜４４、５３、５６、６１、６２、６４、６６〜５１４、及び５３４を有する５５のいずれかを含んでいてもよい。

【0277】

これら実施形態のアシル又はアルキル基は、本明細書に記載の任意のアシル又はアルキル基であってもよい。例えば、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（例えば、Ｃ８〜Ｃ２４）脂肪酸アシル基であってもよく、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（例えば、Ｃ８〜Ｃ２４）アルキル基であってもよい。

【0278】

アシル又はアルキル基が結合されているアミノ酸は、本明細書に記載のアミノ酸のいずれであってもよく、例えば、式Ｉ（例えば、Ｌｙｓ）、式ＩＩ、及び式ＩＩＩのいずれのアミノ酸であってもよい。

【0279】

幾つかの実施形態では、アシル基又はアルキル基は、１０位のアミノ酸に直接結合されている。幾つかの実施形態では、アシル又はアルキル基は、例えば、長さが３〜１０個の原子であるスペーサー、例えば、アミノ酸又はジペプチド等のスペーサーを介して１０位のアミノ酸に結合されている。アシル又はアルキル基を結合させるために好適なスペーサーは、本明細書に記載されている。

【0280】

本発明の幾つかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示すグルカゴンペプチドの類似体が提供される。ある実施形態の類似体は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（随意に、最大１５個のアミノ酸修飾）を有する配列番号１のアミノ酸配列、及び類似体の２９位のアミノ酸のＣ末端側に１〜２１個のアミノ酸の延長部分を含む。

【0281】

ある態様では、類似体は、少なくとも１つのアミノ酸修飾及び最大１５個のアミノ酸修飾（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のアミノ酸修飾、最大１０個のアミノ酸修飾）を含む。ある態様では、類似体は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、最大１０個のアミノ酸修飾、及び追加的な保存的アミノ酸修飾を含む。保存的なアミノ酸修飾は、本明細書に記載されている。

【0282】

幾つかの態様では、アミノ酸修飾の少なくとも１つは、類似体のＣ末端部分に安定化されたアルファヘリックス構造を付与する。安定化されたアルファヘリックス構造を達成する修飾は、本明細書に記載されている。例えば、アルファヘリックス／分子内架橋の安定化と題する項目の教示を参照されたい。幾つかの態様では、類似体は、類似体の２個のアミノ酸の側鎖間の分子内架橋（例えば、共有結合性分子内架橋、非共有結合性分子内架橋）を含む。ある態様では、分子内架橋は、ｉ位及びｉ＋４位のアミノ酸の側鎖を結合し、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０、又は２４である。他の態様では、分子内架橋は、ｊが１７であるｊ位及びｊ＋３位のアミノ酸の側鎖、又はｋが１２〜２２の任意の整数であるｋ位及びｋ＋７位のアミノ酸の側鎖を接続する。ある実施形態では、分子内架橋は、共有結合性分子内架橋、例えばラクタム架橋である。特定の態様では、ラクタム架橋は、１６及び２０位のアミノ酸の側鎖を接続する。特定の態様では、１６及び２０位のアミノ酸の１つは正荷電アミノ酸であり、他方は負荷電アミノ酸である。例えば、類似体は、１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓの側鎖を接続するラクタム架橋を含んでいてもよい。他の態様では、負荷電アミノ酸及び正荷電アミノ酸は、塩橋を形成する。この場合、分子内架橋は、非共有結合性分子内架橋である。

【0283】

特定の態様では、安定化されたアルファヘリックスを付与するアミノ酸修飾は、α，α−二置換アミノ酸による配列番号１のアミノ酸の挿入又は置換である。アルファヘリックスを安定化させるための好適なα，α−二置換アミノ酸は、本明細書に記載されており、例えばＡＩＢが含まれる。幾つかの態様では、配列番号１の１６、２０、２１、及び２４位のアミノ酸の１、２、又は３個以上が、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。特定の実施形態では、１６位のアミノ酸はＡＩＢである。

【0284】

ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す類似体は、本明細書に記載されている修飾のいずれか等の追加的な修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸修飾は、ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体の１つ又は両方に対する活性を増加又は減少させることができる。アミノ酸修飾は、ペプチドの安定性を増加させ、例えば、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ分解に対する耐性を増加させ、アミノ酸１５と１６との間の結合を安定化させることができる。アミノ酸修飾は、ペプチドの溶解度を増加させることができ、及び／又はＧＩＰ、グルカゴン、及びＧＬＰ−１受容体のいずれかに対する類似体の作用時間を変更することができる。これらのタイプの修飾のいずれの組み合わせが、ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す類似体に存在していてもよい。

【0285】

従って、幾つかの態様では、類似体は、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、及び２４位のＡｌａ、Ａｓｎ、若しくはＣｙｓ、又はそれらの保存的なアミノ酸置換の１つ又は複数を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。幾つかの態様では、類似体は、Ｃ末端アルファカルボキシラートの代りにＣ末端アミドを含む。ある実施形態では、類似体は、１位、２位、又は１位及び２位にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換（複数可）はＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。好適なアミノ酸置換は、本明細書に記載されている。例えば、１位のＤＭＩＡ、及び／又は２位のｄ−Ｓｅｒ若しくはＡＩＢである。

【0286】

幾つかの実施形態では、類似体は、２７及び／又は２８位が、並びに随意に２９位が修飾されている。例えば、２７位のＭｅｔは、大型脂肪族アミノ酸、随意にＬｅｕで置換されており、２８位のＡｓｎは、小型脂肪族アミノ酸、随意にＡｌａで置換されており、２９位のＴｈｒは、小型脂肪族アミノ酸、随意にＧｌｙで置換されている。任意の特定の理論に束縛されないが、２７〜２９位のＬＡＧによる置換は、それらの位置の配列番号１の天然ＭＮＴ配列と比べて、ＧＩＰ活性の増加を提供すると考えられる。幾つかの態様では、１位のアミノ酸は、イミダゾール環を含むアミノ酸、例えばＨＩｓ、Ｈｉｓの類似体であり、類似体は、本明細書に記載のように、２７及び／又は２８位が、並びに随意に２９位が修飾されている。

【0287】

それに加えて又はその代わりに、類似体は、以下のうちの１つ又は組み合わせを含んでいてもよい：（ａ）Ａｌａによる２位のＳｅｒの置換；（ｂ）Ｇｌｕ又はグルタミン類似体による３位のＧｌｎの置換；（ｃ）Ｉｌｅによる７位のＴｈｒの置換；（ｄ）Ｔｒｐ、又は天然アミノ酸に対して非天然であるアシル若しくはアルキル基を含むアミノ酸による１０位のＴｙｒの置換；（ｅ）Ｉｌｅによる１２位のＬｙｓの置換；（ｆ）Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；（ｇ）Ｇｌｕによる１６位のＳｅｒの置換；（ｈ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；（ｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；（ｊ）Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；（ｋ）荷電アミノ酸、随意にＡｓｐ又はＧｌｕによる２９位のＡｓｎの置換；及び（ｌ）Ｇｌｙ又は荷電アミノ酸、随意にＡｓｐ又はＧｌｕによる２９位のＴｈｒの置換。

【0288】

ある態様では、類似体は、修飾によりＧＩＰアゴニスト活性が付与される１位のアミノ酸修飾を含んでいない。幾つかの態様では、１位のアミノ酸は、大型芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｙｒではない。幾つかの実施形態では、１位のアミノ酸は、イミダゾール環を含むアミノ酸、例えばＨｉｓ、Ｈｉｓの類似体である。ある実施形態では、類似体は、米国特許出願第６１／１５１，３４９号で開示された化合物のいずれでもない。ある態様では、類似体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある態様では、類似体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかの修飾アミノ酸配列を含み、１２位のアミノ酸はＩｌｅであり、及び／又は２７位のアミノ酸はＬｅｕであり、及び／又は２８位のアミノ酸はＡｌａである。ある態様では、類似体は、配列番号６７６、６７７、６７９、６８０のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0289】

ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す類似体に関して、類似体は、１〜２１個のアミノ酸（例えば、５〜１９、７〜１５、及び９〜１２個のアミノ酸）の延長部分を含む。類似体の延長部分は、延長部分が１〜２１個のアミノ酸である限り、いかなるアミノ酸配列を含んでいてもよい。幾つかの態様では、延長部分は、７〜１５個のアミノ酸であり、他の態様では、延長部分は、９〜１２個のアミノ酸である。幾つかの実施形態では、延長部分は、（ｉ）配列番号２６又は６７４のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２６又は６７４のアミノ酸配列と高度な配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を有するアミノ酸配列、又は（ｉｉｉ）１つ又は複数の保存的アミノ酸修飾を有する（ｉ）又は（ｉｉ）のアミノ酸配列を含む。

【0290】

幾つかの実施形態では、延長部分のアミノ酸の少なくとも１つは、アシル化又はアルキル化されている。アシル又はアルキル基を含むアミノ酸は、類似体の伸長部分の任意の位置に位置していてもよい。ある実施形態では、伸長部分のアシル化又はアルキル化アミノ酸は、類似体の３７、３８、３９、４０、４１、又は４２位（配列番号１の付番による）の１つに位置する。ある実施形態では、アシル化又はアルキル化アミノ酸は、類似体の４０位に位置する。

【0291】

例示的な実施形態では、アシル又はアルキル基は、天然アミノ酸に対して非天然であるアシル又はアルキル基である。例えば、アシル又はアルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８）脂肪酸アシル基又はＣ４〜Ｃ３０（例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル基であってもよい。アシル又はアルキル基は、本明細書で考察されたもののいずれであってもよい。

【0292】

幾つかの実施形態では、アシル又はアルキル基は、アミノ酸に、例えばアミノ酸の側鎖により直接的に結合されている。他の実施形態では、アシル又はアルキル基は、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサー）を介してアミノ酸に結合されている。ある態様では、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、６−アミノヘキサン酸、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ベータ−Ａｌａ、ガンマ−Ｇｌｕ（例えば、ガンマ−Ｇｌｕ−ガンマ−Ｇｌｕ）の１つ又は２つを含むアミノ酸又はジペプチドである。特定の態様では、スペーサーの全長は、１４〜２８個の原子である。

【0293】

また、例示的な実施形態では、アシル又はアルキル基が結合されるアミノ酸は、例えば、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのアミノ酸を含む、本明細書に記載されているもののいずれであってもよい。例えば、アシル化又はアルキル化されるアミノ酸は、Ｌｙｓであってもよい。アシル又はアルキル基を含む好適なアミノ酸、並びに好適なアシル基、アルキル基、及びスペーサーは、本明細書に記載されている。例えば、アシル化及びアルキル化と題する項目の教示を参照されたい。

【0294】

他の実施形態では、延長部分の１〜６個のアミノ酸（例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５個のアミノ酸）は、例えばＬｙｓ等の正荷電アミノ酸、例えば式ＩＶのアミノ酸である。本明細書で使用される場合、用語「正荷電アミノ酸」は、生理学的なｐＨにおいてその側鎖の原子に正電荷を含む、天然又は非天然のあらゆるアミノ酸を指す。ある態様では、正荷電アミノ酸は、３７、３８、３９、４０、４１、４２、及び４３位のいずれかに位置する。特定の実施形態では、正荷電アミノ酸は、４０位に位置する。

【0295】

他の場合では、延長部分は、本明細書に記載のようにアシル化又はアルキル化されており、本明細書に記載のように１〜６個の正荷電アミノ酸を含む。

【0296】

更に他の実施形態では、ＧＩＰ受容体に対してアゴニスト活性を示す類似体は、（ｉ）少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する配列番号１、（ｉｉ）類似体の２９位のアミノ酸のＣ末端側の１〜２１個のアミノ酸（例えば、５〜１８、７〜１５、９〜１２個のアミノ酸）の延長部分、及び（ｉｉｉ）Ｃ末端延長部分の外側（例えば、１〜２９位のいずれか）に位置する天然アミノ酸に対して非天然であるアシル又はアルキル基を含むアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、類似体は、１０位にアシル化又はアルキル化アミノ酸を含む。特定の態様では、アシル又はアルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸アシル又はＣ４〜Ｃ３０アルキル基である。幾つかの実施形態では、アシル又はアルキル基は、スペーサー、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサーを介してアミノ酸に結合されている。ある態様では、類似体は、１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓとの間の塩橋、又は１６、２０、２１、及び２４位のいずれか１、２、３箇所以上におけるアルファ，アルファ−ニ置換アミノ酸等のアルファヘリックスを安定化させるアミノ酸修飾を含む。特定の態様では、類似体は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を付与するアミノ酸修飾、例えば１位のＤＭＩＡ、２位のＡＩＢを更に含む。更なるアミノ酸修飾を含む類似体が、本明細書で企図されている。

【0297】

ある実施形態では、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体は、類似体が親水性部分、例えばＰＥＧを欠如する場合、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、又は２０％）を示す。幾つかの実施形態では、類似体は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の１０％超（例えば、２０％超、５０％超、７５％超、１００％超、２００％超、３００％超、５００％超）を示す。幾つかの実施形態では、類似体は、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体の１つ又は両方に対する検出可能なアゴニスト活性を示す。幾つかの態様では、これら受容体（ＧＩＰ受容体及びＧＬＰ−１受容体及び／又はグルカゴン受容体）の効力及び／又は選択性は、１０００倍、７５０倍、５００倍、２５０倍、又は１００倍以内（より高いか又はより低い）である。例えば、ＧＩＰ受容体活性を有する類似体のＧＬＰ−１受容体に対する選択性は、ＧＩＰ受容体及び／又はグルカゴン受容体に対する選択性の１０００倍、５００倍、１００倍未満、５０倍以内、２５倍以内、１５倍以内、１０倍以内（より高いか又はより低い）であってもよい。

【0298】

本明細書に記載の態様のいずれかでは、本発明では、国際公開第２０１０／０１１４３９号、国際公開第２００８／１０１０１７号、又は国際公開第２００９／１５５２５８号に記載のペプチドのいずれかが除外されていてもよい。

【0299】

使用
実施例において詳細に記載されているように、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然ペプチドと比べて生物活性の増強を示すと共に、生物物理学的な安定性及び水溶解度の増強を示す。従って、本発明のグルカゴンアゴニストは、天然グルカゴンペプチドについて以前に記述されているあらゆる使用に好適であると考えられる。従って、本明細書に記載の修飾グルカゴンペプチドを使用して、低血糖症を治療するか又は血糖レベルを増加させることができ、放射線医学的使用のために腸の一時的麻痺を誘導するか、又はグルカゴンの血中レベル低下に起因する他の代謝疾患を治療することができる。本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、体重の低減若しくは維持、又は高血糖症の治療、又は血糖レベルの低下、又は血糖レベルの正常化にも使用することができると予測される。

【0300】

本発明のグルカゴンペプチドは、単独で又は他の抗糖尿病薬若しくは抗肥満薬と組み合わせて投与することができる。当技術分野で公知の又は研究中の抗糖尿病薬には、以下のものが含まれる：インスリン、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブライド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）、又はグリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）等のスルホニル尿素；レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）又はナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）等のメグリチニド；メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）又はフェンホルミン等のビグアニド；ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）又はトログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）又は他のＰＰＡＲγ阻害剤等のチアゾリジンジオン；ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）等の、炭水化物消化を阻害するアルファグルコシダーゼ阻害剤；エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）又はプラムリンチド；ビルダグリプチン又はシタグリプチン等のジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）阻害剤；グルコキナーゼ活性化因子（ＧＫＡ）；グルカゴン受容体アンタゴニスト（ＧＲＡ）；又はＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害剤。

【0301】

当技術分野で公知の又は研究中の抗肥満薬には、以下のものが含まれる：フェネチルアミンタイプ刺激薬、フェンテルミン（随意に、フェンフルラミン又はデクスフェンフルラミンと共に）、ジエチルプロピオン（Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（Ｐｒｅｌｕ−２（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ベンズフェタミン（Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、シブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標））を含む食欲抑制薬；リモナバン（Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）；Ｑｎｅｘａ（トピラマート及びフェンテルミン）、Ｅｘｃａｌｉａ（ブプロピオン及びゾニサミド）若しくはＣｏｎｔｒａｖｅ（ブプロピオン及びナルトレキソン）；又はＸＥＮＩＣＡＬ（オルリスタット）若しくはＣｅｔｉｌｉｓｔａｔ（ＡＴＬ−９６２としても知られている）若しくはＧＴ３８９−２５５に類似のリパーゼ阻害剤。

【0302】

本開示の１つの態様は、低血糖症の治療に使用される本開示のグルカゴンアゴニストの事前に製剤化された水溶液に関する。本明細書に記載のアゴニスト組成物の安定性及び溶解度の向上は、迅速投与及び低血糖症治療用の、グルカゴンの事前に製剤化された水溶液の調製を可能にする。１つの実施形態では、低血糖症を罹患している患者に投与するための、ペグ化グルカゴンアゴニストを含む溶液が提供され、ペグ化グルカゴンアゴニストに結合されたＰＥＧ鎖の総分子量は、約５００〜約５，０００ダルトンである。１つの実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるペプチド、並びに配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５のグルカゴンアゴニスト類似体、又は配列番号２０の配列を含むグルカゴンのペグ化ラクタム誘導体を含み、前記グルカゴンペプチドのアミノ酸残基の側鎖は、ポリエチレングリコール鎖に共有結合で結合されている。

【0303】

低血糖症の治療を含むがそれに限定されない本発明による治療方法は、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内、髄腔内、経皮的、経直腸、経口、経鼻、又は吸入による等、非経口を含む任意の標準的な投与経路を使用して、本開示のグルカゴンアゴニストを患者に投与するステップを含んでいてもよい。１つの実施形態では、組成物は、皮下又は筋肉内に投与される。１つの実施形態では、組成物は非経口的に投与され、グルカゴン組成物は、注射器に事前にパッケージ化されている。別の実施形態では、組成物は、吸入器又は他のアエロゾル化薬物送達デバイスに事前にパッケージ化されている。

【0304】

驚くべきことに、出願人らは、親ペプチドの生物活性及び特異性を保持するペグ化グルカゴンペプチドを調製することができることを発見した。しかしながら、結合されたＰＥＧの総分子量が５，０００ダルトンを超えるように、ＰＥＧ鎖の長さを増加させること又はペプチドに複数のＰＥＧ鎖を結合させることにより、修飾グルカゴンの作用時間が遅延し始める。１つの実施形態によると、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５のグルカゴンペプチド、又はそのグルカゴンアゴニスト類似体、又は配列番号２０の配列を含むグルカゴンのペグ化ラクタム誘導体が提供され、ペプチドは、１つ又は複数のポリエチレングリコール鎖を含み、結合されたＰＥＧの総分子量は５，０００ダルトンを超えており、１つの実施形態では１０，０００ダルトンを超えているが４０，０００ダルトン未満である。そのような修飾グルカゴンペプチドは、活性時間の遅延又は長期化を示すが、生物活性を喪失しない。従って、そのような化合物を投与して、投与されたグルカゴンペプチドの効果を拡張することができる。

【0305】

１０，０００ダルトンを超える分子量を有するＰＥＧ鎖に共有結合で結合されるように修飾されたグルカゴンペプチドをインスリンと共に投与して、インスリンの作用を緩衝化し、糖尿病患者において安定した血糖レベルの維持を支援することができる。本開示の修飾グルカゴンペプチドは、単一組成物として、別々の溶液として同時に、インスリンと共に同時投与してもよく、又はその代わりにインスリン及び修飾グルカゴンペプチドは、互いと比べて異なる時点で投与してもよい。１つの実施形態では、インスリンを含む組成物、及び修飾グルカゴンペプチドを含む組成物は、互いに１２時間以内に投与される。投与されたインスリンに対する修飾グルカゴンペプチドの正確な比率は、部分的には患者のグルカゴンレベルの決定に依存し、日常的な実験作業により決定することができる。

【0306】

１つの実施形態によると、インスリン、及び配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５からなる群から選択される修飾グルカゴンペプチド及びそれらのグルカゴンアゴニスト類似体を含む組成物が提供され、修飾グルカゴンペプチドは、１７、２１、２４位、又は２１及び２４位のアミノ酸側鎖に共有結合で結合されたポリエチレングリコール鎖を更に含む。１つの実施形態では、組成物は、インスリン及びグルカゴン類似体を含む水溶液である。グルカゴンペプチドが、配列番号２４又は配列番号２５の配列を含む実施形態では、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの２１又は２４位に共有結合で結合されている。１つの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。

【0307】

１つの実施形態によると、本明細書で開示された修飾グルカゴンペプチドは、腸管の一時的麻痺を誘導するために使用される。この方法は、放射線医学的目的に有用性を有し、ペグ化グルカゴンペプチド、ｃ末端延長部分を含むグルカゴンペプチド、又はそのようなペプチドの二量体を含む有効量の医薬組成物を投与するステップを含む。１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択される配列を含む。１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、約１，０００〜４０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖を含み、ＰＥＧ鎖は、２１又は２４位のアミノ酸残基に共有結合で結合されている。１つの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択される配列を含む。１つの実施形態では、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。

【0308】

更なる実施形態では、腸管の一時的麻痺を誘導するために使用される組成物は、第１の修飾グルカゴンペプチド及び第２の修飾グルカゴンペプチドを含む。第１の修飾ペプチドは、随意に約５００〜約５，０００ダルトンのＰＥＧ鎖に結合されている配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択される配列を含み、第２のペプチドは、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖に共有結合で結合されている配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択される配列を含む。この実施形態では、各ペプチドのＰＥＧ鎖は、それぞれのペプチドの１７、２１、又は２４位のいずれかのアミノ酸残基に互いに独立して共有結合で結合されている。

【0309】

オキシントモジュリン、小腸に見出される天然の消化ホルモンは、ラット又はヒトに投与されると体重減少を引き起こすことが報告されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００５； ５４：２３９０−２３９５を参照）。オキシントモジュリンは、グルカゴンの２９個アミノ酸の配列（つまり、配列番号１）及びその後に配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８個アミノ酸のカルボキシ端末延長部分を含有する３７個アミノ酸のペプチドである。従って、出願人らは、オキシントモジュリンのグルカゴンペプチド部分を、本明細書で開示された修飾グルカゴンペプチドで置換することにより、オキシントモジュリンの生物活性（つまり、食欲抑制、及び体重減少／体重維持の誘導）を保持すると共に、化合物の溶解度及び安定性を向上させ、薬物動態を向上させることができると考える。加えて、出願人らは、本発明のグルカゴンペプチドを含み、オキシントモジュリンの端末の４個のアミノ酸が除去されている切断型オキシントモジュリンも、食欲抑制、及び体重減少／体重維持の誘導に有効であろうと考える。

【0310】

従って、本発明は、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のカルボキシ末端延長部分を有する本発明の修飾グルカゴンペプチドも包含する。これら化合物は、体重減少を誘導又は体重増加を防止するために個体に投与することができる。１つの実施形態によると、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む配列番号３３又は配列番号２０のグルカゴンアゴニスト類似体は、体重減少を誘導又は体重増加を防止するために個体に投与される。より詳しくは、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択される配列を含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む。

【0311】

エキセンディン−４は、３９個のアミノ酸で構成されるペプチドである。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１として知られている受容体の強力な刺激因子である。このペプチドも、食欲を抑制し、体重減少を誘導することが報告されている。出願人らは、エキセンディン−４の末端配列は、グルカゴンのカルボキシ末端に付加されると、グルカゴンの生物活性を妨害せずに、グルカゴンの溶解度及び安定性を向上させる。１つの実施形態では、エキセンディン−４の端末の１０個のアミノ酸（つまり、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）の配列）は、本開示のグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に結合される。これら融合タンパク質は、食欲を抑制し、体重減少／体重維持を誘導するための薬理学的活性を有することが予想される。１つの実施形態によると、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号２９のアミノ酸配列を更に含む配列番号３３又は配列番号２０のグルカゴンアゴニスト類似体が、体重減少を誘導又は体重増加を防止するために個体に投与される。より詳しくは、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号５５、及び配列番号５６からなる群から選択される配列を含み、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号２９のアミノ酸配列を更に含む。１つの実施形態では、投与されたグルカゴンペプチド類似体は、配列番号６４の配列を含む。

【0312】

多量体
本開示は、本明細書で開示された修飾グルカゴンペプチドの多量体も包含する。当業者に公知の標準的結合剤及び手順を使用して、２つ以上の修飾グルカゴンペプチドを一緒に結合させることができる。例えば、特に、システイン、リシン オルニチン、ホモシステイン、又はアセチルフェニルアラニン残基で置換されたグルカゴンペプチド（例えば、配列番号３及び配列番号４）の場合、二官能性チオール架橋リンカー及び二官能性アミン架橋リンカーを使用することにより、２つの修飾グルカゴンペプチド間で二量体を形成することができる。二量体はホモ二量体であってもよく、又はその代わりにヘテロ二量体であってもよい。ある実施形態では、２つの（又はより多くの）グルカゴンペプチドを接続するリンカーは、ＰＥＧ、例えば５ｋＤａ ＰＥＧ、２０ｋＤａ ＰＥＧである。幾つかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合である。例えば、二量体の各単量体は、Ｃｙｓ残基（例えば、端末又は内部に位置するＣｙｓ）を含んでいてもよく、各Ｃｙｓ残基の硫黄原子は、ジスルフィド結合の形成に寄与する。本発明の幾つかの態様では、単量体は、末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端又はＣ末端）により、内部アミノ酸により、又は少なくとも１つの単量体の末端アミノ酸及び少なくとも１つの他の単量体の内部アミノ酸により接続される。特定の態様では、単量体は、Ｎ末端アミノ酸によっては接続されていない。幾つかの態様では、多量体の単量体は、各単量体のＣ末端アミノ酸が一緒に結合される「尾−尾」配向性で共に結合される。

【0313】

１つの実施形態では、二量体は、グルカゴン融合ペプチドのホモ二量体を含み、グルカゴンペプチド部分は、配列番号１１又は配列番号２０、及びグルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、二量体は、配列番号１１のグルカゴンアゴニスト類似体のホモ二量体を含み、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの２１又は２４位に共有結合で結合されているポリエチレングリコール鎖を更に含む。

【0314】

１つの実施形態によると、リンカーを介して第２のグルカゴンペプチドに結合された第１のグルカゴンペプチドを含む二量体が提供され、第１のグルカゴンペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１からなる群から選択されるペプチドを含み、第２のグルカゴンペプチドは、配列番号２０を含む。別の実施形態によると、リンカーを介して第２のグルカゴンペプチドに結合された第１のグルカゴンペプチドを含む二量体が提供され、前記第１のグルカゴンペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１からなる群から選択される配列を含み、第２のグルカゴンペプチドは、配列番号１１、及び前記グルカゴンポリペプチドの薬学的に許容される塩を含む。別の実施形態によると、リンカーを介して第２のグルカゴンペプチドに結合された第１のグルカゴンペプチドを含む二量体が提供され、前記第１のグルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択され、第２のグルカゴンペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８、及び前記グルカゴンポリペプチドの薬学的に許容される塩からなる群から独立して選択される。１つの実施形態では、第１のグルカゴンペプチドは、配列番号２０からなる群から選択され、第２のグルカゴンペプチドは、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１１からなる群から独立して選択される。１つの実施形態では、二量体は、各ペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を含む２つのペプチド間で形成される。

【0315】

キット
本発明の修飾グルカゴンペプチドは、１つの実施形態によると、キットの一部として提供することができる。１つの実施形態では、グルカゴンアゴニストをその必要性のある患者の投与するためのキットが提供され、キットは、１）配列番号２０、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１の配列を含むグルカゴンペプチド；２）配列番号１１、配列番号２０、又は配列番号５５のグルカゴンアゴニスト類似体、及びグルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を含むグルカゴン融合ペプチド；及び３）グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合された配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、又は配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含み、１７、２１、又は２４位に共有結合で結合されたＰＥＧ鎖が、約５００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、配列番号１１又は配列番号５１のペグ化グルカゴンペプチドからなる群から選択される修飾グルカゴンペプチドを含む。１つの実施形態では、キットは、グルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニストを含み、ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択される配列を含む。

【0316】

１つの実施形態では、キットは、患者にグルカゴン組成物を投与するためのデバイス、例えば注射針、ペンデバイス、ジェット式注射器、又は他の無針注射器を備えている。その代わりに又はそれに加えて、キットは、１つ又は複数の容器、例えばバイアル、チューブ、ボトル、単一又は多チャンバー充填済注射器、カートリッジ、輸液ポンプ（外部又は埋込型）、ジェット式注射器、及び充填済ペンデバイス等を含み、随意に凍結乾燥形態の又は水溶液のグルカゴンペプチドを含む。好ましくは、キットは、使用説明書も含むだろう。１つの実施形態によると、キットのデバイスは、エアロゾル投薬デバイスであり、組成物は、エーロゾルデバイス内に事前にパッケージ化されている。別の実施形態では、キットは注射器及び針を含み、１つの実施形態では、無菌グルカゴン組成物は、注射器内に事前にパッケージ化されている。

【0317】

医薬製剤
１つの実施形態によると、組成物が本開示のグルカゴンペプチド、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、任意の薬学的に許容される成分を含むことができ、それらには、例えば、以下のものが含まれる：酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴霧体、空気置換剤（ａｉｒ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝血剤、抗菌保存剤、酸化防止剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、界面活性剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、皮膚軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、被膜形成剤、香味強化剤、流動促進剤（ｆｌｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）、軟膏基剤、軟膏剤、油性媒体、有機基剤、香錠基剤、色素、可塑剤、研磨剤、保存剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味料、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性作用剤、増粘剤、水吸収剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、又は湿潤剤。

【0318】

幾つかの実施形態では、医薬組成物は、以下の成分いずれか１つ又は組み合わせを含む：アカシア、アセスルファムカリウム、アセチルトリブチルシトラート、アセチルトリエチルシトラート、寒天、アルブミン、アルコール、脱水アルコール、変性アルコール、希アルコール、アロイリチン酸、アルギン酸、脂肪族ポリエステル、アルミナ、水酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、アミロペクチン、α−アミロース、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスパルテーム、静菌注射用蒸留水、ベントナイト、ベントナイトマグマ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、ブチルパラベンナトリウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、脱水リン酸水素カルシウム、第三リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水化物、キャノーラ油、カルボマー、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−カロチン、カラゲナン、ヒマシ油、水添ヒマシ油、陽イオン性乳化ろう、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、粉末セルロース、ケイ化微結晶性セルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、セトステアリルアルコール、セトリミド、セチルアルコール、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、コレステロール、酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、クロロジフルオロエタン（ＨＣＦＣ）、クロロジフルオロメタン、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）クロロフェノキシエタノール、クロロキシレノール、コーンシロップ固形物、無水クエン酸、クエン酸一水和物、ココアバター、着色剤、トウモロコシ油、綿実油、クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、シクラミン酸、シクロデキストリン、デキストラート、デキストリン、デキストロース、デキストロース無水物、ジアゾリジニル尿素、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチル、ジフルオロエタン（ＨＦＣ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）等のシクロデキストリン型化合物、ジメチルエーテル、フタル酸ジメチル、二カリウムエデンタート（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｅｄｅｎｔａｔｅ）、ニナトリウムエデンタート（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｅｄｅｎａｔｅ）、リン酸水素二ナトリウム、ドキュセートカルシウム、ドキュセートカリウム、ドキュセートナトリウム、没食子酸ドデシル、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エデンタートカルシウムニナトリウム（ｅｄｅｎｔａｔｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｄｉｓｏｄｉｕｍ）、エドト酸（ｅｄｔｉｃ ａｃｉｄ）、エグルミン（ｅｇｌｕｍｉｎｅ）、エチルアルコール、エチルセルロース、没食子酸エチル、エチルラウレート、エチルマルトール、オレイン酸エチル、エチルパラベン、エチルパラベンカリウム、エチルパラベンナトリウム、エチルバニリン、フルクトース、液体フルクトース、粉砕フルクトース、無発熱性物質フルクトース、粉末フルクトース、フマル酸、ゼラチン、グルコース、液体グルコース、飽和植物脂肪酸のグリセリド混合物、グリセリン、グリセリルベヘナート、グリセリルモノオレアート、グリセリルモノステアラート、自己乳化グリセリルモノステアラート、グリセリルパルミトステアラート、グリシン、グリコール、グリコフロール、グアーガム、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、高フルクトースシロップ、ヒト血清アルブミン、炭化水素（ＨＣ）、希塩酸、硬化植物油、ＩＩ型、ヒドロキシエチルセルロース、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、イミド尿素、インジゴカルミン、イオン交換剤、酸化鉄、イソプロピルアルコール、イソプロピルミリスタート、イソプロピルパルミタート、等張性生理食塩水、カオリン、乳酸、ラクチトール、ラクトース、ラノリン、ラノリンアルコール、無水ラノリン、レシチン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、炭酸マグネシウム、規定濃度炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム無水物、炭酸水酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム無水物、リンゴ酸、麦芽、マルチトール、マルチトール溶液、マルトデキストリン、マルトール、マルトース、マンニトール、中鎖トリグリセライド、メグルミン、メントール、メチルセルロース、メタクリル酸メチル、オレイン酸メチル、メチルパラベン、メチルパラベンカリウム、メチルパラベンナトリウム、微結晶性セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、鉱油、軽油、鉱油及びラノリンアルコール、油類、オリーブオイル、モノエタノールアミン、モンモリロナイト、没食子オクチル、オレイン酸、パルミチン酸、パラフィン、落花生油、ペトロラタム、ペトロラタム及びラノリンアルコール、医薬品用グレース、フェノール、液化フェノール、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ポラクリリン、ポラクリリンカリウム、ポロキサマー、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリラート、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリメタクリラート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンステアラート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、重炭酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カリウム無水物、リン酸水素カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、プロピオン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドン、プロパノール、プロピオン酸、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、没食子酸プロピル、プロピルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、硫酸プロタミン、菜種油、リンゲル液、サッカリン、サッカリンアンモニウム、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、サフラワー油、サポナイト、血清タンパク質、胡麻油、コロイドシリカ、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、無水クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム脱水物、塩化ナトリウム、サイクラミン酸ナトリウム、ナトリウムエデンタート（ｓｏｄｉｕｍ ｅｄｅｎｔａｔｅ）、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、二塩基、リン酸ナトリウム、一塩基、リン酸ナトリウム、三塩基、無水プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ナトリウムステアリルフマラート、亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンエステル（ソルビタン脂肪酸エステル）、ソルビトール、７０％ソルビトール溶液、大豆油、鯨ろう、デンプン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、滅菌トウモロコシデンプン、ステアリン酸、精製ステアリン酸、ステアリルアルコール、スクロース、糖、圧縮糖（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｇａｒ）、粉砂糖、球状糖（ｓｕｇａｒ ｓｐｈｅｒｅ）、転化糖、Ｓｕｇａｒｔａｂ、サンセットイエローＦＣＦ、合成パラフィン、タルク、酒石酸、タルトラジン、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ）、カカオ脂、チメロサール、二酸化チタン、アルファトコフェロール、酢酸トコフェリル、アルファトコフェリル酸スクシナート、ベータトコフェロール、デルタ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、トラガント、トリアセチン、クエン酸トリブチル、トリエタノールアミン、クエン酸トリエチル、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド、トリス緩衝液、三ナトリウムエデンタート（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｅｄｅｎｔａｔｅ）、バニリン、Ｉ型硬化植物油、水、軟水、硬水、無二酸化炭素水、無発熱性物質水、注射用蒸留水、吸入用滅菌水、注射用滅菌水、洗浄用滅菌水、ろう、陰イオン性乳化ろう、カルナウバろう、陽イオン性乳化ろう、セチルエステルろう、微結晶性ろう、非イオン性乳化ろう、坐剤ろう、白ろう、黄ろう、白色ワセリン、羊毛脂、キサンタンガム、キシリトール、ゼイン、プロピオン酸亜鉛、亜鉛塩、ステアリン酸亜鉛、又は参照によりその全体が組み込まれるｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ． Ｈ． Ｋｉｂｂｅ （Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ， ２０００）中の任意の賦形剤。参照によりその全体が組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８０）には、薬学的に許容される組成物の製剤化に使用される種々の成分、及びそれを調製するための公知の技術が開示されている。あらゆる従来の作用剤は、医薬組成物と適合性がない場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される。補完的な活性成分を、組成物に組み込むこともできる。

【0319】

本明細書で開示された医薬製剤は、下記に記載のように、短期間作用性、迅速放出性、長期間作用性、又は徐放性に設計することができる。医薬製剤は、即時放出、制御放出、又は遅延放出用に製剤化することもできる。即時放出用組成物には、例えば、ミセル又はリポソーム、又は他の幾つかのカプセル化形態が更に含まれていてもよく、又は長期保管及び／若しくは送達効果を提供するために長期間放出形態で投与してもよい。開示された医薬製剤は、例えば、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、隔週、３週間毎、毎月、又は隔月を含む、任意の投薬計画により投与することができる。

【0320】

幾つかの実施形態では、先述の成分（複数可）は、例えば、少なくともＡ等の任意の濃度で医薬組成物中に存在してもよく、Ａは、０．０００１重量／容積％、０．００１重量／容積％、０．０１重量／容積％、０．１重量／容積％、１重量／容積％、２重量／容積％、５重量／容積％、１０重量／容積％、２０重量／容積％、３０重量／容積％、４０重量／容積％、５０重量／容積％、６０重量／容積％、７０重量／容積％、８０重量／容積％、又は９０重量／容積％である。幾つかの実施形態では、先述の成分（複数可）は、例えば、多くともＢ等の任意の濃度で医薬組成物中に存在してもよく、Ｂは、９０重量／容積％、８０重量／容積％、７０重量／容積％、６０重量／容積％、５０重量／容積％、４０重量／容積％、３０重量／容積％、２０重量／容積％、１０重量／容積％、５重量／容積％、２重量／容積％、１重量／容積％、０．１重量／容積％、０．００１％重量／容積％、又は０．０００１％である。他の実施形態では、先述の成分（複数可）は、例えば、約Ａ〜約Ｂ等の任意の濃度範囲で医薬組成物中に存在してもよい。幾つかの実施形態では、Ａは０．０００１％であり、Ｂは９０％である。

【0321】

医薬組成物は、生理学的適合性ｐＨを達成するように製剤化することができる。幾つかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、製剤及び投与経路に応じて、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７、少なくとも７．５、少なくとも８、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、又は少なくとも１０．５からｐＨ１１以内であってもよい。ある実施形態では、医薬組成物は、生理学的適合性ｐＨを達成するように緩衝剤を含んでいてもよい。緩衝剤には、例えば、リン酸緩衝剤（例えば、ＰＢＳ）、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジラート、及びＭＥＳ等の、所望のｐＨで緩衝化が可能な任意の化合物が含まれていてもよい。ある実施形態では、緩衝剤の強度は、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２０ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、又は少なくとも２００ｍＭである。幾つかの実施形態では、緩衝剤の強度は、多くとも３００ｍＭ（例えば、多くとも２００ｍＭ、多くとも１００ｍＭ、多くとも９０ｍＭ、多くとも８０ｍＭ、多くとも７０ｍＭ、多くとも６０ｍＭ、多くとも５０ｍＭ、多くとも４０ｍＭ、多くとも３０ｍＭ、多くとも２０ｍＭ、多くとも１０ｍＭ、多くとも５ｍＭ、多くとも１ｍＭ）である。

【0322】

３位の修飾
本明細書に記載のグルカゴン類似体、グルカゴンアゴニスト類似体、グルカゴン同時アゴニスト、及びグルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子を含むグルカゴンペプチドはいずれも、３位における修飾、例えばＧｌｕによるＧｌｎの置換を含むように修飾して、グルカゴン受容体に対する選択性と比較して、ＧＬＰ−１受容体に対する高い選択性、例えば１０倍の選択性を有するペプチドを生成することができる。

【0323】

本明細書に記載のグルカゴン類似体、グルカゴンアゴニスト類似体、グルカゴン同時アゴニスト、及びグルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニスト分子を含むグルカゴンペプチドはいずれも、３位における修飾、例えばグルタミン類似体（例えば、Ｄａｂ（Ａｃ））によるＧｌｎの置換を含むように修飾して、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に喪失することなく、幾つかの場合にはグルカゴン受容体活性を増強することができる。

【0324】

調製方法
本発明の化合物は、標準的合成法、組換えＤＮＡ技術、又はペプチド及び融合タンパク質を調製する任意の他の方法により調製することができる。標準的組換えＤＮＡ技術により、特定の非天然アミノ酸を発現させることはできないが、それらを調製するための技術は当技術分野で公知である。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物は、適用可能な場合、標準的ペプチド化学反応に加えて、標準的有機化学反応により合成することができる。

【0325】

実施例
基本合成プロトコール：
グルカゴン類似体は、改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製４３０Ａペプチド合成機を用いて、０．２ミリモルのＢｏｃ Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）Ｐａｍレジンから開始し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」単一カップリング法を使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（フィッシャー、イリノイ州）から取得した。使用した側鎖保護基は、以下の通りだった：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）、及びＴｒｐ（ＣＨＯ）。Ｎ末端Ｈｉｓの側鎖保護基は、Ｂｏｃだった。

【0326】

各々の完成したペプチジルレジンを、ジメチルホルムアミド中２０％ピペルジン（ｐｉｐｅｒｄｉｎｅ）溶液で処理して、ホルミル基をトリプトファンから除去した。ｐ−クレゾール及び硫化ジメチルの存在下で液体水素フルオリド切断を実施した。切断は、ＨＦ装置（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ社製）を使用して、氷浴中で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残基をジエチルエーテルに懸濁し、固形物質をろ過した。各ペプチドを、３０〜７０ｍｌ酢酸水溶液に抽出し、希釈等量をＨＰＬＣで分析した［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ、０．４６ｘ５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５Ｃ、２１４ｎｍ、Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル、１０分間で１０％から８０％Ｂの勾配］。

【0327】

２．２×２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラムを使用してＦＰＬＣで精製を実施しながら、２１４ｎｍでＵＶをモニターし、５分間の画分を収集した。均質な画分を混合し凍結乾燥して、９５％超の産物純度を得た。正確な分子量及び純度は、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析を使用して確認した。

【0328】

基本ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類似体を、リン酸緩衝生理食塩水に溶解し（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸を添加する（全容積の１０〜１５％）。過剰（２倍）マレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Ｎｅｋｔａｒ社製）を添加し、反応物を室温で撹拌しつつ、ＨＰＬＣで反応進行をモニターする。８〜２４時間後に、反応混合物を酸性化し、分取用逆相カラムに負荷して、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用して精製する。適切な画分を混合し凍結乾燥して、所望のペグ化類似体を得た。

【0329】

実施例１
グルカゴンＣｙｓ^１７（１〜２９）及び類似のモノＣｙｓ類似体の合成
０．２ミリモルのＢｏｃ Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）Ｐａｍレジン（ＳｙｎＣｈｅｍ社製）を６０ｍｌ反応槽に投入し、下記の配列を入力し、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリング法を使用して、改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａペプチド合成機で実行した。

【0330】

【化10】

【0331】

以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、及びＴｙｒ（ＢｒＺ）。完成したペプチジルレジンを、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理してＴｒｐホルミル保護を除去し、その後ＨＦ反応槽に移し、減圧下で乾燥した。１．０ｍｌのｐ−クレゾール及び０．５ｍｌのジメヒルスルフィド（ｄｉｍｅｈｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ）を、磁気撹拌子と共に添加した。槽をＨＦ装置（Ｐｅｎｎｉｓｕｌａ Ｌａｂｓ社製）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、減圧し、およそ１０ｍｌの液体フッ化水素を凝縮した。反応を氷浴中で１時間撹拌し、その後ＨＦを減圧下で除去した。残基をエチルエーテルに懸濁し、固形物をろ過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０ｍｌの酢酸水溶液に抽出した。切断抽出物の少量試料を用いて分析ＨＰＬＣを実施した［０．４６×５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５Ｃ、２１４ｎｍ、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間で１０％Ｂから８０％Ｂ）。残りの抽出物を、２．２×２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣシステムを使用してアセトニトリル勾配を実施した。２１４ｎｍのＵＶをモニター（２．０Ａ）しながら、５分間の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間で３０％Ｂから１００％Ｂ。

【0332】

最も純粋な産物を含有する画分（４８〜５２）を混合して凍結し、凍結乾燥して、３０．１ｍｇを得た。産物のＨＰＬＣ分析は、９０％超の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、３４２９．７の所望の質量を示した。グルカゴンＣｙｓ^２１、グルカゴンＣｙｓ^２４、及びグルカゴンＣｙｓ^２９を同様に調製した。

【0333】

実施例２
グルカゴン−Ｃｅｘ及び他のＣ末端延長類似体の合成
２８５ｍｇ（０．２ミリモル）のメトキシベンズヒドリルアミンレジン（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を６０ｍｌ反応槽に投入し、下記の配列を入力し、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリング法を使用して、改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａペプチド合成機で実行した。

【0334】

【化11】

【0335】

以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、及びＴｙｒ（ＢｒＺ）。完成したペプチジルレジンを、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理してＴｒｐホルミル保護を除去し、その後ＨＦ反応槽に移し、減圧下で乾燥した。１．０ｍｌのｐ−クレゾール及び０．５ｍｌのジメヒルスルフィドを、磁気撹拌子と共に添加した。槽をＨＦ装置（Ｐｅｎｎｉｓｕｌａ Ｌａｂｓ社製）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、減圧し、およそ１０ｍｌの液体フッ化水素を凝縮した。反応を氷浴中で１時間撹拌し、その後ＨＦを減圧下で除去した。残基をエチルエーテルに懸濁し、固形物をろ過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０ｍｌの酢酸水溶液に抽出した。切断抽出物の等量に対して分析ＨＰＬＣを実施した［０．４６×５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５Ｃ、２１４ｎｍ、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間で１０％Ｂから８０％Ｂ）。抽出物を、２．２×２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣシステムを使用してアセトニトリル勾配を実施して溶出した。２１４ｎｍのＵＶをモニター（２．０Ａ）しながら、５分間の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間で３０％Ｂから１００％Ｂ。画分５８〜６５を混合し、凍結し、凍結乾燥して、１９８．１ｍｇを得た。

【0336】

産物のＨＰＬＣ分析は、９５％超の純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、Ｃ末端アミドとしての産物が有する４３１６．７の所望の理論的質量が存在することを示した。オキシントモジュリン及びオキシントモジュリン−ＫＲＮＲを、適切に負荷したＰＡＭ−レジンで始まるＣ末端カルボキシル酸として同様に調製した。

【0337】

実施例３
グルカゴンＣｙｓ^１７Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
１５．１ｍｇのグルカゴンＣｙｓ^１７（１〜２９）及び２７．３ｍｇのメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド 平均分子量５０００（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）を、３．５ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５ｍｌの０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行をＨＰＬＣ分析でモニターした［０．４６×５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５Ｃ、２１４ｎｍ（０．５Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間で１０％から８０％Ｂ］。．

【0338】

５時間後、反応混合物を、２．２×２５ｃｍ Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣでアセトニトリル勾配を実施しながら、２１４ｎｍのＵＶ波長をモニターし、５分間の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、勾配＝４５０分間で３０％Ｂから１００％Ｂ。産物に対応する画分を混合し、凍結し、凍結乾燥して２５．９ｍｇを得た。

【0339】

この産物をＨＰＬＣで分析し［０．４６×５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５Ｃ、２１４ｎｍ（０．５Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間で１０％Ｂから８０％Ｂ］、およそ９０％の純度を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル解析は、８７００〜９５００の広域質量範囲を示した（ＰＥＧ誘導体に典型的）。これは、開始グルカゴンペプチド（３４２９）の質量におよそ５，０００ａ．ｍ．ｕ．が付加されたことを示す。

【0340】

実施例４
グルカゴンＣｙｓ^２１Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２１．６ｍｇのグルカゴンＣｙｓ^２１（１〜２９）及び２４ｍｇのｍＰＥＧ−ＭＡＬ−５０００（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）を、３．５ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５ｍｌの０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加した。反応物を室温で撹拌した。２時間後、更に１２．７ｍｇのｍＰＥＧ−ＭＡＬ−５０００を添加した。８時間後、反応混合物を、２．２×２５ｃｍのＶｙｄａｃ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣを用いてアセトニトリル勾配を４ｍｌ／分で実施しながら、５分間の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間で３０％Ｂから８０％Ｂ。

【0341】

産物の出現に対応する画分を混合し、凍結し、凍結乾燥して３４ｍｇを得た。この産物の分析ＨＰＬＣによる分析は［０．４６×５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５Ｃ、２１４ｎｍ（０．５Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間で１０％Ｂから８０％Ｂ］、開始グルカゴンペプチドの分だけ異なる均質な産物を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル解析は、８７００〜９７００の広域質量範囲を示した（ＰＥＧ誘導体に典型的）。これは、開始グルカゴンペプチド（３４７０）の質量におよそ５，０００ａ．ｍ．ｕ．が付加されたことを示す。

【0342】

実施例５
グルカゴンＣｙｓ^２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．１ｍｇのグルカゴンＣ^２４（１〜２９）及び３９．５ｍｇのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）を、３．５ｍｌのＰＢＳに撹拌しながら溶解し、０．５ｍｌの０．０１Ｍ ＥＤＴＡを添加した。反応物を室温で７時間撹拌し、その後更に４０ｍｇのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を添加した。およそ１５時間後、反応混合物を、２．２×２５ｃｍのＶｙｄａｃ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣを使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分間の画分を、２１４ｎｍのＵＶをモニター（２．０Ａ）しながら収集した。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝４５０分間で３０％Ｂから１００％Ｂ。産物に対応する画分を混合し、凍結し、凍結乾燥して４５．８ｍｇを得た。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、グルカゴンＣ^２４（３４５７．８）よりおよそ５，０００ａ．ｍ．ｕ．大きな、最大９１７５．２の典型的なＰＥＧ広域シグナルを示した。

【0343】

実施例６
グルカゴンＣｙｓ^２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−２０Ｋ
２５．７ｍｇのグルカゴンＣ^２４（１〜２９）及び４０．７ｍｇのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）を、３．５ｍｌのＰＢＳに室温で撹拌しながら溶解し、０．５ｍｌの０．０１Ｍ ＥＤＴＡを添加した。６時間後、産物に対する出発物質の比率は、ＨＰＬＣで決定したところ、およそ６０：４０だった。更に２５．１ｍｇのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋを添加し、反応物を更に１６時間撹拌させた。産物比率が著しくは向上しなかったため、反応混合物を、２．２×２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷し、４５０分間で３０％Ｂから１００％Ｂの勾配を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣで精製した。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、流速＝４ｍｌ／分、２１４ｎｍのＵＶをモニター（２．０Ａ）しながら、５分間の画分を収集した。均質な産物を含有する画分を混合し、凍結し、凍結乾燥して、２５．７ｍｇを得た。分析ＨＰＬＣで決定した純度は約９０％だった。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、２３，０００〜２７，０００の広域ピークを示し、これは、グルカゴンＣ^２４（３４５７．８）よりおよそ２０，０００ａ．ｍ．ｕ．大きかった。

【0344】

実施例７
グルカゴンＣｙｓ^２９Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．０ｍｇのグルカゴンＣ^２９（１〜２９）及び２４．７ｍｇのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）を、３．５ｍｌのＰＢＳに室温で撹拌しながら溶解し、０．５ｍｌの０．０１Ｍ ＥＤＴＡを添加した。４時間後、更に１５．６ｍｇのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を添加して、反応を完了へと推進した。８時間後、反応混合物を、２．２×２５ｃｍのＶｙｄａｃ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣでアセトニトリル勾配を実施した。５分間の画分を、２１４ｎｍのＵＶをモニター（２．０Ａ）しながら収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。画分７５〜９７を混合し、凍結し、凍結乾燥して、ＨＰＬＣで回収した出発物質（画分５８〜６３）と異なる４０．０ｍｇの産物を得た。この産物の分析ＨＰＬＣによる分析［０．４６×５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５Ｃ、２１４ｎｍ（０．５Ａ）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間で１０％Ｂから８０％Ｂ］は、９５％超の純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、出発物質（３４８４．８）よりも５，５４０ａ．ｍ．ｕ．大きい８，０００〜１０，０００（最大９０２５．３）の質量範囲を有するＰＥＧ成分が存在することを示した。

【0345】

実施例８
グルカゴンＣｙｓ^２４（２−ブチロラクトン）
２４．７ｍｇのグルカゴンＣｙｓ^２４（１〜２９）に、４ｍｌの０．０５Ｍ重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリル、及び５．５μｌの２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトン溶液（９００μｌアセトニトリル中１００μｌ）を添加した。室温で３時間撹拌した後、更に１０５μｌのラクトン溶液を反応混合物に添加し、それを更に１５時間撹拌した。反応混合物を１０％酢酸水溶液で１０ｍｌに希釈し、２．２×２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷した。アセトニトリル勾配（４５０分間で２０％Ｂから８０％Ｂ）をＰｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣで実施しながら、５分間の画分を収集し、２１４ｎｍのＵＶをモニターーした（２．０Ａ）。流速＝４ｍｌ／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７４〜７７を混合し、凍結し、凍結乾燥して、７．５ｍｇを得た。ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、３５４０．７の質量、つまり出発物質よりも８４質量単位だけ大きな質量を示した。この結果は、単一のブチロラクトン部分の付加と一致する。

【0346】

実施例９
グルカゴンＣｙｓ^２４（Ｓ−カルボキシメチル）
１８．１ｍｇのグルカゴンＣｙｓ^２４（１〜２９）を、９．４ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．２）に溶解し、０．６ｍｌのブロモ酢酸溶液（アセトニトリル中１．３ｍｇ／ｍｌ）を添加した。反応物を室温で撹拌し、反応進行を分析ＨＰＬＣで追跡した。１時間後、更に０．１ｍｌのブロモ酢酸溶液を添加した。反応物を更に６０分間撹拌し、その後酢酸水溶液で酸性化し、２．２×２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８分取用逆相カラムに負荷して精製した。アセトニトリル勾配をＰｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣで実施しながら（流速＝４ｍｌ／分）、５分間の画分を収集し、２１４ｎｍのＵＶをモニターした（２．０Ａ）。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。画分２６〜２９を混合し、凍結し、凍結乾燥して、数ｍｇを得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、所望の産物の３５１５の質量を確認した。

【0347】

【化12】

【0348】

実施例１０
グルカゴンＣｙｓ^２４マレイミド、ＰＥＧ−３．４Ｋ−二量体
１６ｍｇのグルカゴンＣｙｓ^２４及び１．０２ｍｇのＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−３４００、ポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミド 平均分子量３４００（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃｓ社製）を、３．５のリン酸緩衝生理食塩水及び０．５ｍｌの０．０１Ｍ ＥＤＴＡに溶解し、反応物を室温で撹拌した。１６時間後、更に１６ｍｇのグルカゴンＣｙｓ^２４を添加し、撹拌を継続した。およそ４０時間後に、反応混合物をＰｈａｒｍｃｉａ社製ＰｅｐＲＰＣ １６／１０カラムに負荷し、アセトニトリル勾配をＰｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰＬＣで実施しながら、２分間の画分を収集し、２１４ｎｍのＵＶをモニターした（２．０Ａ）。流速＝２ｍｌ／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分６９〜７４を混合し、凍結し、凍結乾燥して、１０．４ｍｇを得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル解析は、所望の二量体と一致する９５００〜１１，０００の範囲の成分を示す。

【0349】

【化13】

【0350】

実施例１１
グルカゴンラクタムの合成
２８５ｍｇ（０．２ミリモル）のメトキシベンズヒドリルアミンレジン（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を６０ｍＬ反応槽に投入し、下記の配列を、Ｂｏｃ ＤＥＰＢＴ活性化単一カップリング法を使用して、改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａペプチド合成機で構築した。

【0351】

【化14】

【0352】

以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯＦｍ）、Ｈｉｓ（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。ラクタムが１６〜２０、２０〜２４、又は２４〜２８から構築された場合、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）を１２位に使用した。完成したペプチジルレジンを、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで１時間循環させながら処理し、Ｔｒｐホルミル基を除去し、並びにＬｙｓ１２及びＧｌｕ１６からＦｍｏｃ及びＯＦｍ保護を除去した。陽性ニンヒドリン試験で除去を確認した際、レジンをジメチルホルムアミドで洗浄し、その後ジクロロメタンで洗浄し、その後再びジメチルホルムアミドで洗浄した。ジメチルホルムアミド及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中５２０ｍｇ（１ミリモル）のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）でレジンを処理した。反応物を８〜１０時間進行させ、陰性ニンヒドリン反応で環化を確認した。レジンをジメチルホルムアミドで、その後ジクロロメタンで洗浄し、その後トリフルオロ酢酸で１０分間処理した。Ｂｏｃ基の除去は、陽性ニンヒドリン反応で確認した。レジンをジメチルホルムアミド及びジクロロメタンで洗浄し、乾燥し、その後フッ化水素酸（ＨＦ）反応槽に移した。５００μＬのｐ−クレゾールを磁気撹拌子と共に添加した。反応槽を、ドライアイス／メタノール浴中で冷却されたＨＦ装置（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ社製）に取り付け、減圧し、およそ１０ｍＬの液体フッ化水素酸を反応槽に凝縮させた。反応物を氷浴で１時間撹拌し、その後ＨＦを減圧下で除去した。残基をエチルエーテルに懸濁し、固形物をろ過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを１５０ｍＬの２０％アセトニトリル／１％酢酸で可溶化した。

【0353】

可溶化された粗ペプチドの分析ＨＰＬＣ分析は、以下の条件下で実施した［４．６×３０ｍｍ Ｘｔｅｒｒａ Ｃ８、１．５０ｍＬ／分、２２０ｎｍ、Ａ緩衝液０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液０．１％ＴＦＡ／１００％ＡＣＮ、１５分間で５〜９５％Ｂの勾配］。抽出物を水で２倍に希釈し、２．２×２５ｃｍのＶｙｄａｃ Ｃ４分取用逆相カラムに負荷し、Ｗａｔｅｒｓ社製ＨＰＬＣシステムでアセトニトリル勾配を使用して溶出した（Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＣＡＮであり、勾配は、１５．００ｍｌ／分の流速にて１２０分間で０〜１００％Ｂだった）。精製ペプチドのＨＰＬＣ分析は、９５％超の純度を示し、エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル解析は、１２〜１６間のラクタムの３５０６Ｄａの質量を確認した。１６〜２０、２０〜２４、及び２４〜２８間のラクタムを同様に調製した。

【0354】

実施例１２
グルカゴン溶解度アッセイ：
グルカゴン（又は類似体）の溶液（１ｍｇ／ｍｌ又は３ｍｇ／ｍｌ）を、０．０１ＮのＨＣｌ中に調製する。１００μｌの原液を、０．０１ＮのＨＣｌで１ｍｌに希釈し、ＵＶ吸光度（２７６ｎｍ）を決定する。残りの原液のｐＨを、２００〜２５０μｌの０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ９．２）を使用してｐＨ７に調整する。溶液を４℃で一晩静置させておき、その後遠心分離する。その後１００μｌの上清を０．０１ＮのＨＣｌで１ｍｌに希釈し、ＵＶ吸光度を決定する（重複して）。

【0355】

最初の吸光度測定は、容積増加を補正し、以下の計算を使用して溶解度パーセントを確立する：

【0356】

【数1】

【0357】

結果は表１に示されており、グルカゴン−Ｃｅｘは、配列番号２６のカルボキシ末端追加部分が加えられた野生型グルカゴン（配列番号１）を表し、グルカゴン−Ｃｅｘ Ｒ^１２は、配列番号３９を表す。

【0358】

【表1】

【0359】

実施例１３
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体に対するペプチドの親和性は、シンチレーション近接アッセイ技術を使用する競合結合アッセイで測定した。シンチレーション接近アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１重量／容積％のウシ血清アルブミン）で製作されたペプチドの連続３倍希釈物を、９６ウエル白色／透明底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．社製、アクトン、マサチューセッツ州）中で、１ウエル当たり１〜６マイクログラム０．０５ｎＭ（３−［^１２５Ｉ］−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現する細胞から調製された原形質膜断片、及び１ｍｇ／ウエルのポリエチレンイミン処理小麦胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）と混合する。回転振とう器で５分間８００ｒｐｍにて振とうした後、プレートを室温で１２時間インキュベートし、その後ＭｉｃｒｏＢｅｔａ１４５０液体シンチレーション計数器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州）で測定した。非特異的結合（ＮＳＢ）放射能を、検査試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「コールド」天然リガンドを有するウエル中で測定し、総結合放射能は、競合体を有していないウエル中で検出した。特異的結合パーセントは、以下のように計算した：特異的結合％＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））Ｘ１００。ＩＣ_５０値は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州）を使用することにより決定した。

【0360】

実施例１４
機能的アッセイ−ｃＡＭＰ合成
グルカゴン類似体がｃＡＭＰを誘導する能力を、ホタルルシフェラーゼに基づくリポーターアッセイで測定した。グルカゴン受容体又はＧＬＰ−１受容体のいずれか、及びｃＡＭＰ反応性エレメントに結合されたルシフェラーゼ遺伝子で同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を、０．２５％のウシ増殖血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製、ローガン、ユタ州）で補完されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、カリフォルニア州）中で１６時間培養することにより血清除去し、その後、９６ウエルポリ−Ｄ−リシンでコーティングされた「Ｂｉｏｃｏａｔ」プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、サンノゼ、カリフォルニア州）中で、グルカゴン、ＧＬＰ−１、又は新規グルカゴン類似体のいずれかの連続希釈物と共に、３７℃、５％ＣＯ_２にて５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、１００マイクロリットルのＬｕｃＬｉｔｅルミネセンス基質試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州）を、各ウエルに添加した。プレートを手短に振とうし、暗所で１０分間インキュベートし、光出力を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ−１４５０液体シンチレーション計数器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州）で測定した。有効５０％濃度を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州）を使用することにより計算した。結果は、図３〜９及び表２〜１０に示されている。

【0361】

【表2】

【0362】

【表3】

【0363】

【表4】

【0364】

【表5】

【0365】

【表6】

【0366】

【表7】

【0367】

【表8】

【0368】

【表9】

【0369】

【表10】

【0370】

実施例１５
グルカゴンＣｙｓ−マレイミドＰＥＧ類似体の安定性アッセイ
各グルカゴン類似体を水又はＰＢＳに溶解し、初期ＨＰＬＣ分析を実施した。ｐＨ（４、５、６、７）を調整した後、試料を、指定の期間にわたって３７℃でインキュベートし、ＨＰＬＣにより再分析してペプチドの完全性を決定した。指定の目的ペプチドの濃度を決定し、完全性を維持しているパーセントを、初期分析と比べて計算した。グルカゴンＣｙｓ^２１−マレイミドＰＥＧ５Ｋの結果は、図１及び２に示されている。

【0371】

実施例１６
上記の実施例１〜１１で一般的に述されているように、以下のグルカゴンペプチドを構築する：
以下の配列の全てにおいて、「ａ」は、Ｃ末端アミドを意味する。

【0372】

【化15】

【0373】

【化16】

【0374】

上記の配列では、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓである。

【0375】

【化17】

【0376】

【化18】

【0377】

上記の配列では、Ｘ２＝アミノイソ酪酸である。

【0378】

【化19】

【0379】

上記の配列では、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）である。

【0380】

【化20】

【0381】

【化21】

【0382】

【化22】

【0383】

上記の配列では、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓである。

【0384】

【化23】

【0385】

上記の配列では、Ｘ２＝アミノイソ酪酸である。

【0386】

【化24】

【0387】

【化25】

【0388】

上記の配列では、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）である。

【0389】

【化26】

【0390】

【化27】

【0391】

上記の配列では、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0392】

【化28】

【0393】

上記の配列では、Ｘ２＝アミノイソ酪酸であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0394】

【化29】

【0395】

【化30】

【0396】

上記の配列では、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0397】

【化31】

【0398】

【化32】

【0399】

上記の配列では、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0400】

【化33】

【0401】

【化34】

【0402】

上記の配列では、Ｘ２＝アミノイソ酪酸であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0403】

【化35】

【0404】

上記の配列では、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0405】

【化36】

【0406】

式中、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0407】

【化37】

【0408】

式中、Ｘ２＝アミノイソ酪酸であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0409】

【化38】

【0410】

式中、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0411】

【化39】

【0412】

【化40】

【0413】

式中、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0414】

【化41】

【0415】

式中、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0416】

【化42】

【0417】

式中、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0418】

【化43】

【0419】

【化44】

【0420】

上記の配列では、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓである。

【0421】

【化45】

【0422】

上記の配列では、Ｘ２＝アミノイソ酪酸である。

【0423】

【化46】

【0424】

上記の配列では、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）である。

【0425】

【化47】

【0426】

【化48】

【0427】

上記の配列では、Ｘ１＝（デス−アミノ）Ｈｉｓである。

【0428】

【化49】

【0429】

上記の配列では、Ｘ２＝アミノイソ酪酸である。

【0430】

【化50】

【0431】

【化51】

【0432】

上記の配列では、Ｘ２＝（Ｄ−Ａｌａ）である。

【0433】

上記の実施例１〜１１に一般的に述られているように、約５以上のＧＬＰ−１／グルカゴン活性比率を有する以下のグルカゴンペプチドも構築する。一般的に、これらペプチドでは、２位のＡＩＢは、ＤＰＰ ＩＶ耐性を提供するだけでなく、グルカゴン活性を著しく低減する。

【0434】

【0435】

上記の配列では、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0436】

【化52】

【0437】

【化53】

【0438】

上記の配列では、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0439】

上記の実施例１〜１１に一般的に述べられているように、ＧＬＰ−１／グルカゴン同時アゴニストである以下のグルカゴンペプチドも構築する。アミノ酸１６及び２０間のラクタム架橋の形成は、２位の置換により引き起こされたグルカゴン活性の低減を回復させる。

【0440】

【化54】

【0441】

上記の配列では、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0442】

【化55】

【0443】

上記の配列では、Ｘ１＝ＤＭＩＡ（アルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸）であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0444】

【化56】

【0445】

式中、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0446】

【化57】

【0447】

上記の配列では、Ｘ２＝ＡＩＢであり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0448】

【化58】

【0449】

上記の配列では、Ｘ１＝ＤＭＩＡ（アルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸）であり、Ｃ^＊は、Ｃｙｓ又は親水性ポリマーに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約２０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓであるか、又はその代わりにＣ^＊は、約４０ｋＤ平均重量のポリエチレングリコールに結合されたＣｙｓである。

【0450】

【化59】

【0451】

【化60】

【0452】

式中、
Ｘ１＝Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、又はアルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、又はイミダゾール酢酸であり、
Ｘ２＝Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリン、又はアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニン、及びＤ−アラニンであり、
Ｘ３＝Ａｌａ、Ｇｌｎ、又はＣｙｓ−ＰＥＧであり、
Ｘ４＝Ｔｈｒ−ＣＯＮＨ２又はＣｙｓ−ＰＥＧ又はＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５１５）又はＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）であり、
但し、Ｘ３がＣｙｓ−ＰＥＧである場合、Ｘ４は、Ｃｙｓ−ＰＥＧ又はＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）ではなく、Ｘ２＝Ｓｅｒの場合、Ｘ１はＨｉｓではない。
Ｘ５＝Ａｌａ又はＡｒｇである。

【0453】

【化61】

【0454】

式中、
Ｘ１＝Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、又はアルファ，アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、又はイミダゾール酢酸であり、
Ｘ２＝Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリン、又はアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニン、及びＤ−アラニンであり、
Ｘ３＝Ａｌａ、Ｇｌｎ、又はＣｙｓ−ＰＥＧであり、
Ｘ４＝Ｔｈｒ−ＣＯＮＨ２又はＣｙｓ−ＰＥＧ又はＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５１５）又はＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）であり、
但し、Ｘ３がＣｙｓ−ＰＥＧである場合、Ｘ４は、Ｃｙｓ−ＰＥＧ又はＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）ではなく、Ｘ２＝Ｓｅｒの場合、Ｘ１はＨｉｓではない。
Ｘ５＝Ａｌａ又はＡｒｇである。
ＨＳＥＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＹＬＤ ＥＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷ ＬＸＮＴａ（配列番号５５４）、式中、２７位のＸはノルロイシンであり、２９位のアミノ酸はアミノ化されている。

【0455】

上記の配列はいずれも、追加的な修飾、例えば、効力を増強するために使用することができるＷ１０又はＲ２０置換を含むがこれらに限定されない、活性を破壊しない１、２、３、４、又は５つの修飾を含むことができる。上記の配列はいずれも、ＤＰＰ ＩＶ耐性を付与する修飾を含まずに生成することもでき、つまり１位が天然Ｈｉｓであり、２位が天然Ｓｅｒである。加えて、上記の化合物はいずれも、異種性ポリペプチド、免疫グロブリン若しくはその部分（例えば、Ｆｃ領域）、標的化剤、診断用標識、又は診断薬若しくは治療薬等の結合体に随意に結合されていてもよい。

【0456】

実施例１７
グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に結合された配列番号２６のｃ末端延長部分を含むように修飾された以下のグルカゴンペプチドを、上記の実施例１〜１１に一般的に記述されているように構築し、実施例１４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用してＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性をアッセイした。

【0457】

表１１は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する種々のグルカゴン類似体の活性を表す。データは、配列番号２６のｃ末端延長部分を含むグルカゴン類似体の場合、１６、２０、２８、及び２９位のアミノ酸置換は、ＧＬＰ−１受容体に対する類似体活性に影響を及ぼす場合があるを示す。

【0458】

【表11】

【0459】

実施例１８
表１２は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するそれらの相対活性を比較する、種々のグルカゴンペプチドについて蓄積されたｉｎ ｖｉｔｒｏデータを表す。

【0460】

【表12-1】

【0461】

【表12-2】

【0462】

実施例１９
アシル化及び／又はペグ化ペプチドを以下のように調製した。ペプチドを、ＣＳ Ｂｉｏ４８８６型ペプチド合成機又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４３０Ａペプチド合成機のいずれかを使用して、固体担体レジンで合成した。Ｉｎ ｓｉｔｕ中和化学を、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４０： １８０−１９３ （１９９２）に記載のように使用した。アシル化ペプチドの場合、アシル化する標的アミノ酸残基（例えば、１０位）を、Ｎε−ＦＭＯＣリジン残基で置換した。完成したＮ末端ＢＯＣ保護ペプチドを、ＤＭＦ中２０％のピペリジンで３０分間処理して、ＦＭＯＣ／ホルミル基を除去した。遊離ε−アミノＬｙｓ残基への結合は、ＤＭＦ／ＤＩＥＡ中で、１０倍過剰モル量のＦＭＯＣ保護スペーサーアミノ酸（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）又はアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）のいずれか及びＰｙＢＯＰ又はＤＥＰＢＴ結合試薬を結合することにより達成した。その後スペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基を除去した後で、アシル鎖との結合を繰り返す。１００％ＴＦＡで最終的処理することにより、あらゆる側鎖保護基及びＮ末端ＢＯＣ基の除去がもたらされた。ペプチドレジンを、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥し、その後ＨＦ／ｐ−クレゾール９５：５を０℃で１時間使用して担体から切断した。エーテル抽出した後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和した。その後、この溶液の試料が正しい分子量のペプチドを含有していることを、ＥＳＩ−ＭＳにより検証した。正しいペプチドを、１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ〜１００％ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡの線形勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製には、Ｖｙｄａｃ社製Ｃ１８ ２２ｍｍ×２５０ｍｍタンパク質カラムを使用した。アシル化ペプチド類似体は、一般的に２０：８０の緩衝液比率で溶出を完了させた。部分を一緒に貯溜して、分析ＲＰ−ＨＰＬＣで純度を検証した。純粋な画分を凍結乾燥して、白色固形ペプチドを得た。収率は、典型的には、合成に応じて１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲だった。

【0463】

ペプチドがラクタム架橋及びアシル化の標的残基を含む場合、アシル化は、ペプチド骨格にそのアミノ酸を付加する際に、上述のように実施する。

【0464】

ペプチドペグ化の場合、４０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド（Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ社製）を、７Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中のモル当量のペプチドと、両ペプチド及びＰＥＧを溶解して清澄溶液にするために必要な最少量の溶媒（２〜３ｍｇのペプチドを使用する反応の場合、一般的に２ｍＬ未満）を使用して反応させた。室温で４〜６時間激しく撹拌を実施し、反応物を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ペグ化産物は、出発物質とは別に出現し、滞留時間の減少を示した。精製は、初期ペプチド精製に使用した条件と同様の条件を用いて、Ｖｙｄａｃ社製Ｃ４カラムで実施した。溶出は、５０：５０の緩衝液比率付近で生じた。純粋なペグ化ペプチドの画分を見出し、凍結乾燥した。収率は５０％超であり、反応毎に変動した。

【0465】

ペプチドは、グルカゴン受容体（ＧＬＵＲ）又はＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）のいずれか及びｃＡＭＰ反応性エレメントに結合されたルシフェラーゼ遺伝子を用いてＨＥＫ２９３細胞を同時形質移入することにより、生物活性を分析した。形質移入された細胞は、０．２５％ウシ増殖血清で補完されたたＤＭＥＭ中で１６時間培養することにより血清除去し、その後選択された類似体の連続希釈物及びグルカゴン又はＧＬＰ−１のいずれかと共にそれぞれ５時間インキュベートした。ペプチド吸光度測定値は、Ｇｅｎｅｓｙｓ６分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用いて、２８０ｎｍのＵＶ吸光度測定から得た。ベールの法則を使用して、各類似体中のトリプトファン及びチロシン残基の数に基づく溶液濃度を計算した。インキュベーションの終了時に、１００μＬのＬｕｃＬｉｔｅルミネセンス基質試薬を各ウエルに添加し、プレートを密閉し、振とうし、ｃＡＭＰ検出のためにＷａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘルミネセンス計数器に配置した。有効５０％濃度（ＥＣ５０）を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州）を使用して計算した。

【0466】

アシル化されたグルカゴンに基づく同時アゴニストペプチドを調製した。選択されたこれらペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ結果は、表１３に示されている。天然グルカゴンのようにアシル化されていないペプチドは、１ｍｇ／ｍＬ濃度ではリン酸緩衝生理食塩水溶液に不溶性であったが、アシル化により、中性ｐＨにおけるペプチド溶解度が増強されることを観察した。

【0467】

【表13】

【0468】

４つのアシル化ペプチドは全て、ＧＬＰ−１受容体に対する効力増加を示した。トリプトファンスペーサーを付加することにより、グルカゴン受容体に対するより良好な効力が提供された。Ｃ１８のアシル鎖長が、わずかに好ましい。

【0469】

アシル化は、ペプチドの半減期を数時間以上延長させることができるが、数十ｋＤａの範囲の反復を有するペグ化は、更にそれを超えて延長させることができる。両タイプの修飾を含むペプチドを調製した。これらペプチドは、血中半減期の延長、並びにＤＰＰ−ＩＶ及び他のプロテアーゼに対する耐性を示すと予測される。選択されたこれらペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ結果は、表１４に示されている。

【0470】

【表14】

【0471】

３つのペプチドのうちの２つは、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体の両方に対するそれらの高効力を保持し、１ｎＭ未満のＥＣ５０を示した。Ｋ^１０−Ｗ−Ｃ_１８アシル化及びペグ化ペプチドは、両受容体に対して約１０倍の効力喪失を示した。この一連のペプチドは、１０位のアシル化が、グルカゴンペプチドのＣ末端部分、例えば、２４、２８、又は２９位、Ｃ末端延長部分内、又はＣ末端でのＰＥＧ化と同等であることを示す。

【0472】

実施例２０
種々のアシル化グルカゴン同時アゴニストペプチドを、本質的に実施例１９に記載のように製作し、ｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験した。特に、ペプチドＡ（２位にＡＩＢ、１６位にＧｌｕ、１７位にＧｌｎ、１８位にＡｌａ、２０位にＬｙｓ、２１位にＧｌｕ、２３位にＩｌｅ、２４位にＣｙｓを含有するように修飾され、Ｃｙｓが４０Ｋ ＰＥＧと結合されており、Ｃ末端がアミドである配列番号１）を、１０位にＬｙｓを含むように更に修飾した。Ｌｙｓ１０を、Ｃ８脂肪酸鎖、Ｃ１４脂肪酸鎖、Ｃ１６脂肪酸鎖、又はＣ１８脂肪酸鎖でアシル化した。

【0473】

アシル化ペプチドの各々のＧＬＰ−１受容体に対する活性を、実施例１４に記載のようにアッセイし、対照としてのＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号５０）活性と比較した。表１５に示されている、ＧＬＰ−１受容体に対するアシル化ペプチドの各々のＥＣ５０は、ＧＬＰ−１ペプチドのＥＣ５０と同様である。

【0474】

【表15】

【0475】

その後、食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスに、種々のアシル化及び非アシル化ペプチド又は媒体のみをＱＷ（７０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週）で２週間皮下注射することにより、ペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで試験した。４４ｇの初期平均体重を有する１群当たり６匹のマウスを試験した。体重、体組成、食物摂取量、及び血糖レベルを、定期的に決定した。

【0476】

図１１に示されているように、アシル化ペプチドは、非アシル化ペプチドと同程度に体重減少を引き起こすことができる。図１１に示されているように、約７〜１２％の体重減少が、アシル化ペプチドで処置した最初の３日以内に達成される。図１２に示されているように、アシル化ペプチドは、食物摂取量の減少を引き起こした。更に、図１３に示されているように、アシル化ペプチドの自由摂取血糖レベルは、処置の１日後に低減した。

【0477】

実施例２１
以下のアシル化グルカゴン同時アゴニストペプチドを、本質的に実施例１９に記載のように製作した。
（Ａ）「キメラ−２ Ａｉｂ２ Ｌｙｓ１０−Ｃ１８ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：以下の修飾：１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、及び２４位のＡｌａ、及びＣ末端アミドを含む天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）（「キメラ２」）を、２位のＡＩＢ、Ｃ１８脂肪酸でアシル化されたＬｙｓ１０、及び４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化された２４位のＣｙｓで更に修飾した；
（Ｂ）「キメラ−２ Ａｉｂ２ Ｌｙｓ１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：キメラ２を、２位のＡＩＢ、Ｃ１６脂肪酸でアシル化されたＬｙｓ１０、４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化されたＣｙｓ２４で更に修飾した；
（Ｃ）「グルカゴン Ｌｙｓ１０−Ｃ１８ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：以下の修飾：１６位のＧｌｕ、２０位のＬｙｓ、及びＣ末端アミドを含む天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）（「Ｅ１６Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２」）を、Ｃ１８脂肪酸でアシル化されたＬｙｓ１０、及び４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化されたＣｙｓ２４で更に修飾した；
（Ｄ）「グルカゴンＬｙｓ１０−ＴｒｐＣ１６ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：Ｅ１６Ｋ２０グルカゴン−ＮＨ２を、Ｃ１６脂肪酸でアシル化されたＴｒｐスペーサーに結合されたＬｙｓ１０で更に修飾した；
（Ｅ）「グルカゴンＬｙｓ１０−ＴｒｐＣ１８ Ｅ１６ Ｋ２０ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）」：Ｅ１６Ｋ２０グルカゴン−ＮＨ２を、Ｃ１８脂肪酸でアシル化されたＴｒｐスペーサーに結合されたＬｙｓ１０で更に修飾した。

【0478】

アシル化グルカゴン同時アゴニストペプチドを、基本的に実施例１４に記述されているように、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するそれらの活性について試験した。（ＧＬＰ−１（７〜３７）ＯＨ（ＧＬＰ−１のアミノ酸７〜３７）、グルカゴン（１〜２９）ＯＨ（配列番号１）、及びキメラ２ Ｃｙｓ２４（４０Ｋ）（Ｃｙｓ２４に４０Ｋ ＰＥＧを有するキメラ２）と比較した、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体の各々に対するＥＣ５０は、表１６に示されている通りである。

【0479】

【表16】

【0480】

実施例２２
以下のアシル化グルカゴン同時アゴニストペプチドを、本質的に実施例１９に記載のように製作した。
（Ａ）ペプチドＡ：以下の修飾：１６位のＧｌｕ、２０位のＬｙｓ、及びＣ末端アミドを含む天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）（「Ｅ１６Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２」）；
（Ｂ）ペプチドＢ：Ｃ１６脂肪酸でアシル化されたＬｙｓ１０を更に含むＥ１６Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２；
（Ｃ）ペプチドＣ：Ｃ１８脂肪酸でアシル化されたＬｙｓ１０を更に含むＥ１６Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２；
（Ｄ）ペプチドＤ：Ｃ１６脂肪酸でアシル化されたＧｌｕ（スペーサー残基）に結合されたＬｙｓ１０を更に含むＥ１６Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２；
（Ｅ）ペプチドＥ：Ｃ１８脂肪酸でアシル化されたＴｒｐ（スペーサー残基）に結合されたＬｙｓ１０を更に含むＥ１６Ｋ２０−グルカゴン−ＮＨ２。

【0481】

ペプチドの活性は、基本的に実施例１４に従ってアッセイし、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体の各々に対するＥＣ５０は、表１７に示されている。

【0482】

【表17】

【0483】

実施例２３
以下の修飾：１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、２４位のＡｌａ、２７位のＶａｌ、２８位のＬｙｓ、及びＣ末端アミドを有する配列番号１のアミノ酸配列を含むグルカゴン同時アゴニストペプチド（「キメラ１」）を製作した。キメラ１のＣ末端切断型を、キメラ１（「Ｃｈｉ１（１〜２８）」）の２９位のアミノ酸を欠失することにより、又はキメラ１（「Ｃｈｉ１（１〜２７）」）の２８及び２９位のアミノ酸を両方とも欠失することにより製作した。

【0484】

また、以下の修飾：１６位のＧｌｕ、Ｃ末端アミドを有する配列番号１のアミノ酸配列を含むグルカゴンペプチド（「Ｅ１６ Ｇｌｕｃ−ＮＨ２」）は、２９位のアミノ酸を欠失することによるか（「Ｅ１６ ＧｌｕｃＮＨ２」（１〜２８））、又は２８及び２９位のアミノ酸を両方とも欠失することによるかのいずれかにより（「Ｅ１６ ＧｌｕｃＮＨ２」（１〜２７））、Ｃ末端を切断した。

【0485】

切断型ペプチド並びに非切断型ペプチドのグルカゴン受容体及びＧＬＰ−Ｉ受容体に対する活性を、基本的に実施例１４に従って機能的活性についてアッセイした。Ｅ１６ ＧｌｕｃＮＨ２ペプチド又はキメラ１ペプチドの２８及び２９位のアミノ酸欠失は、グルカゴン受容体に対するペプチドの活性に著しくは影響を及ぼさなかった。Ｅ１６ ＧｌｕｃＮＨ２の２８及び２９位のアミノ酸欠失は、ＧＬＰ−１受容体に対するペプチドの効力を測定可能なほど変更しないと考えられた。キメラ１ペプチドの２８及び２９位のアミノ酸欠失は、ＧＬＰ−１受容体に対するその活性に影響を及ぼさなかった。

【0486】

キメラ１ペプチド及びＥ１６ ＧｌｕｃＮＨ２ペプチドのいずれの２９位アミノ酸の欠失も、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体のいずれの活性に対しても著しくは影響を及ぼさなかった。

【0487】

実施例２４
食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスに、以下のうちの１つを、０．２、２、２０、又は７０ｎｍｏｌ／ｋｇで約１５分の時点にて腹腔内に注射した：
（Ａ）媒体のみ、
（Ｂ）以下の修飾：１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、及び２４位のＡｌａ、及びＣ末端アミドを含み（「キメラ２」）、２位のＡＩＢ、及び４０Ｋ ＰＥＧ基でペグ化されている２４位のＣｙｓを含むように更に修飾されている天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号１）（「キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）、
（Ｃ）２位のＡＩＢ、Ｃ８脂肪酸でアシル化されている１０位のＬｙｓ、及び４０Ｋ ＰＥＧでペグ化されている２４位のＣｙｓを含むように更に修飾されているキメラ２（「キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）、又は
（Ｄ）２位のＡＩＢ、Ｃ１６脂肪酸でアシル化されている１０位のＬｙｓ、及び４０Ｋ ＰＥＧでペグ化されている２４位のＣｙｓを含むように更に修飾されているキメラ２（「キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）。

【0488】

２５％（容積／容積）グルコースを含む生理食塩水を、０分の時点で１．５ｇ／ｋｇ体重の用量で注射した。血糖レベルを、−１５、０、１５、３０、６０、及び１２０分の時点で測定した。

【0489】

図１５〜１７は、表示されている時点における、それぞれ２、２０、及び７０ｎｍｏｌ／ｋｇで注射したマウスの血糖レベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す。試験した用量の全てで、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤは、マウスの血糖を低下させる最大の能力を示した。図１７に示されているように、このペプチドは、キメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤと同様の活性を示した。

【0490】

実施例２５
ＤＩＯマウスに、以下のうちの１つを７０ｎｍｏｌ／ｋｇで約２４時間の時点にて腹腔内注射した：
（Ａ）媒体のみ、
（Ｂ）上記の実施例２４に記載のキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ
（Ｃ）上記の実施例２４に記載のキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、又は
（Ｄ）上記の実施例２４に記載のようなキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ。

【0491】

２５％（容積／容積）グルコースを含む生理食塩水を、０分の時点で１．５ｇ／ｋｇ体重の用量で注射した。血糖レベルを、０、１５、３０、６０、及び１２０分の時点で測定した。

【0492】

図１８は、表示されている時点におけるマウスの血糖レベル（ｍｇ／ｄＬ）を示す。３つのペプチドは全て、マウスの血糖低下に著しい活性を示す。

【0493】

実施例２６
ＤＩＯマウスに、媒体のみ、又は以下のうちの１つを１５若しくは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで腹腔内注射した：
（Ａ）上記の実施例２４に記載のキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ
（Ｂ）上記の実施例２４に記載のキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ、又は
（Ｃ）上記の実施例２４に記載のキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ。

【0494】

体重を、注射前、及び注射の１、３、５、及び７日後に測定した。

【0495】

図１９は、各群のマウスの体重変化％を示す。両試験用量で、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ及びキメラ−２−ＡＩＢ^２ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤは、体重を低下させる能力が同等であることを示す。より高い試験用量では、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤは、著しい体重低下能力を示す。

【0496】

実施例２７
１位のチロシン、並びにＥ１６及びＫ２０間のラクタム架橋（並びにＣ末端カルボキシラートの代りにアミド）を含む配列番号５５５のペプチドを、本質的に上述のように合成し、実施例１４によりＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。各受容体に対するペプチドのＥＣ５０は、図１８に示されている。

【0497】

【表18】

【0498】

これらデータに基づいて、配列番号５５５のペプチドは、例示的なグルカゴン／ＧＬＰ−１同時アゴニストペプチドだったことが決定された。

【0499】

実施例２８
配列番号１（グルカゴン（ｌ〜２９））のペプチド、Ｃ末端カルボキシラートを置換したアミドを有する配列番号１のペプチド（グルカゴン（１〜２９ａ））、並びに２及び１６位の各々にＡＩＢを有し、Ｃ末端カルボキシラートを置換したアミドを有する配列番号１のペプチド（グルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ａｉｂ^１６）を、本質的に上述のように合成した。その後、これらペプチドを、ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対する活性について、実施例１４に記載の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。各ペプチドのＥＣ５０は、図１９に示されている。

【0500】

【表19】

【0501】

実施例２９
以下のペプチドを、本質的に上述のように合成した：
（１）実施例２８に記載のグルカゴン（１〜２９）、
（２）２４位のＣｙｓ、及びＣ１６脂肪酸を含むＴｒｐに共有結合で結合された１０位のＬｙｓを有するグルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ａｉｂ^１６（実施例２８に記載）（「グルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４」）、
（３）Ｃｙｓが４０ｋＤ ＰＥＧ基を含むグルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４（「グルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）、
（４）２０位のＡｉｂを含むグルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ｃｙｓ^２４（「グルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ａｉｂ^２０ Ｃｙｓ^２４」）及び、
（５）Ｃｙｓが４０ｋＤ ＰＥＧ基を含むグルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ａｉｂ^２０ Ｃｙｓ^２４（「グルカゴン（１〜２９ａ）Ａｉｂ^２ Ｌｙｓ^１０−Ｔｒｐ−Ｃ１６ Ａｉｂ^１６ Ａｉｂ^２０ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ」）。
その後、これらペプチドを、ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対する活性について、実施例１４に記載の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。各ペプチドのＥＣ５０は、表２０に示されている。

【0502】

【表20】

【0503】

実施例３０
アシル化及びペグ化グルカゴンペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効果をＤＩＯマウスで試験した。特に、各群が５８ｇの平均初期体重を有する６群のＤＩＯマウス（１群当たり８匹のマウス）に、１０、２０、４０、又は８０ｎｍｏｌ／ｋｇのアシル化及びペグ化グルカゴンペプチド又は媒体対照を、週１回で２週間腹腔内に注射した。この研究で使用したアシル化及びペグ化グルカゴンペプチドは、キメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤ（実施例２６に記載）及びペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４（実施例２０に記載）だった。

【0504】

マウスの体重変化及びマウスによる食物摂取量の変化を、注射の０、１、３、５、７、８、１０、１２、及び１４日後に測定した。マウスの血糖レベルを、１４日間の全体にわたってモニターした。アシル化又はペグ化ペプチド投与の１時間又は２４時間後に生理食塩水中２５％グルコースを注射し、グルコース注射の−６０、０、１５、３０、６０、又は１２０分後に血糖レベルを測定することにより、グルコース負荷試験を実施した。

【0505】

図２０に示されているように、４０又は８０ｎｍｏｌ／ｋｇのアシル化又はペグ化ペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４を注射したマウスの総体重は、媒体対照を注射したマウスと比較して低減された。

【0506】

図２１に示されているように、グルコース注射に応答した、２０、４０、又は８０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＡ Ｋ^１０−Ｃ_１４、又は２０ｎｍｏｌ／ｋｇのキメラ−２ ＡＩＢ^２ Ｋ^１０−Ｃ８ Ｃｙｓ^２４−４０ｋＤを注射したマウスの血糖レベルは、媒体対照と比較して低下した。

【0507】

実施例３１
共有結合性分子内架橋を含むか又は欠如するアシル化グルカゴン類似体ペプチドを、固相合成により製作し、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について試験した。各受容体に対するＥＣ５０（ｎＭ）、及び対応する受容体に対する天然ペプチドと比べたペプチドの活性％は、表２１に示されている。

【0508】

【表21】

【0509】

共有結合性分子内架橋を欠如し、２位のＡＩＢ、１６位のＡＩＢ、及び１０位のＬｙｓ残基にスペーサーを介して結合された脂肪酸アシル基を含む幾つかのグルカゴン類似体を、本質的に本明細書に記載のように製作した。アシル化グルカゴン類似体は、スペーサーのタイプ、ペグ化の存在又は非存在、及び／又はアシル基のサイズが異なっていた。アシル化グルカゴン類似体を、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について、本質的に実施例１４に記載のように試験した。各ペプチドのグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体の構造及びｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の要約は、表２２及び２３に示されている。

【0510】

【表22】

【0511】

【表23】

【0512】

表２２及び２３に示されているように、スペーサーを介して結合された脂肪酸アシル基を含むペプチドは、ペプチド骨格に直接結合された脂肪酸アシル基を含むペプチドと比較して、それらの効力を著しく増加させた。

【0513】

実施例３２
各々が４８．７ｇの平均体重を有するＤＩＯマウス（１群当たり８匹のマウス）に、媒体のみ、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ又は１００ｎｍｏｌ／ｋｇのアシル化グルカゴン類似体ペプチド、又は長期間作用性ＧＬＰ−１類似体であるリラグルチド（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社製、デンマーク）を、７日間毎日皮下注射した。アシル化グルカゴン類似体は以下の通りだった：
１０位のＴｙｒがアシル化Ｌｙｓ残基に修飾された野生型のグルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、アシル化ＬｙｓがＣ１６脂肪酸アシル基を含み、Ｃ末端カルボキシラートがアミド基で置換された「（Ｃ１６）グルカゴンアミド」、
Ｃ１６脂肪酸アシル基が、ガンマ−Ｇｌｕ−ガンマ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介して１０位のＬｙｓ（下記のアシル化Ｌｙｓの構造を参照）に結合されたことを除いて、Ｃ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「γＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミド」、

【0514】

【化62】

【0515】

Ｃ１６脂肪酸アシル基が、Ａｌａ−Ａｌａジペプチドスペーサーを介して１０位のＬｙｓに結合されたことを除いて、Ｃ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「ＡＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド」、及び
Ｃ１６脂肪酸アシル基が、β−Ａｌａ−β−Ａｌａジペプチドスペーサーを介して１０位のＬｙｓに結合されたことを除いて、Ｃ１６グルカゴンアミドと同じ構造を含む「βＡβＡ−Ｃ１６グルカゴンアミド」。

【0516】

マウスの体重を毎日モニターし、総体重変化（％）を図２２に示す。図２２に示されているように、ほとんどのアシル化グルカゴンペプチドは、各用量において体重の低減を引き起こした。リラグルチドはおよそ１２％の体重減少を示したが、グルカゴン類似体ペプチドγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドは、同じ用量で、マウスの体重減少を引き起こす能力が最大であったこと示した。より低用量のγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドでさえ、体重の実質的減少を引き起こした。

【0517】

マウスの体脂肪量を、研究の７日目に測定した。図２３に示されているように、１００ｎｍｏｌ／ｋｇのγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドを投与したマウスは、最も低い体脂肪量を示した。

【0518】

アッセイの経過中にマウスの血糖レベルもモニターした。図２４に示されているように、より高用量のグルカゴン類似体ペプチドγＥ−γＥ−Ｃ１６グルカゴンアミドは、リラグルチドと同様にマウスの血糖レベルを減少させるように作用した。

【0519】

実施例３３
ＧＬＰ−Ｉ活性を有するグルカゴン類似体ペプチドのアシル化を、以下のように評価した。２位のＡＩＢ及び２４位のＣｙｓ（４０ｋＤａ ＰＥＧ分子を含む）を有するキメラ２の構造を含む非アシル化グルカゴン類似体ペプチドを、１０位のアシル化Ｌｙｓ残基を含むように修飾した。非アシル化グルカゴン類似体ペプチドは、配列番号５８０のアミノ酸配列を含んでいた。１０位のＬｙｓは、Ｃ８、Ｃ１４、Ｃ１６、又はＣ１８脂肪酸アシル基でアシル化されており、アシル化ペプチドは、それぞれ配列番号５３４〜５３７の構造を含んでいた。非アシル化ペプチド及びそのアシル化型のＧＬＰ−１受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、本質的に本明細書に記載のように試験した。ＧＬＰ−１受容体に対する各ペプチドのＥＣ５０は、表２４に示されている。

【0520】

【表24】

【0521】

実施例３４
グルカゴン類似体ペプチドを、本明細書に記載のように固相ペプチド合成により製作し、ペプチドの１０又は３０位のいずれかをアシル化した。ペプチド及びそれらの構造は以下の通りだった：
アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号５８１）を含み、式中２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、３０位のＬｙｓがＣ１４脂肪酸アシル基でアシル化されており、Ｃ末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドｄＳ２Ｅ１６Ｋ２０Ｋ３０−Ｃ１４Ｇｌｕｃアミド」；
アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号５８２）を含み、式中２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、１０位のＬｙｓがＣ１４脂肪酸アシル基でアシル化されており、Ｃ末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドｄＳ２Ｋ１０（Ｃ１４）Ｅ１６Ｋ２０−Ｇｌｕｃアミド」；
アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号５８３）を含み、式中２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、３０位のＬｙｓがＣ１６脂肪酸アシル基でアシル化されており、Ｃ末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドｄＳ２Ｅ１６Ｋ２０Ｋ３０−Ｃ１６Ｇｌｕｃアミド」；
アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号５８４）を含み、式中２位のＸがｄ−Ｓｅｒであり、１０位のＬｙｓがＣ１６脂肪酸アシル基でアシル化されており、Ｃ末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドｄＳ２Ｋ１０（Ｃ１６）Ｅ１６Ｋ２０−Ｇｌｕｃアミド」；
アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴ−アミド（配列番号５８５）を含み、式中２位のＸがＡＩＢであり、１０位のＫがＣ１８脂肪酸アシル基でアシル化されており、２４位のＣｙｓが４０ｋＤａ ＰＥＧ分子を含み、Ｃ末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドキメラ２−ＡＩＢ２−Ｋ１０アシル化」；及び
アミノ酸配列ＨＸＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴＫ−アミド（配列番号５８６）を含み、式中２位のＸがＡＩＢであり、１０位のＫがＣ１８脂肪酸アシル基でアシル化されており、２４位のＣｙｓが４０ｋＤａ ＰＥＧ分子を含み、Ｃ末端カルボキシラートがアミドで置換されている「ペプチドキメラ２−ＡＩＢ２−Ｋ３０−アシル化」。

【0522】

ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対する各ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、本質的に実施例１４に記載のように試験した。結果は表２５に示されている。

【0523】

【表25】

【0524】

実施例３５
固相ペプチド合成を使用して、Ｘ＝ＤＭＩＡである配列ＸＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＣＷＬＭＮＴ−ＮＨ_２を構築した（配列番号５８７）。１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓを選択的に脱保護した後、ペプチドをラクタム架橋によりレジン上で環化した。その後、切断後の粗ペプチドを分取用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳにより特徴付けた（［Ｍ＋Ｈ］の計算値：３４７９．９；実測値３４８０．９）。ペプチド前駆体及びヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧ（ＮＯＦ）（１：１）を、７Ｍ尿素／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５中で４５分間室温にて混合することにより、ペグ化を実施し、ＰＥＧとペプチドのＣｙｓとの間に共有結合性チオエーテル結合を形成した。

【0525】

【化63】

【0526】

ペグ化ペプチドを、分取用ＨＰＬＣにより精製し、所望の画分を収集及び凍結乾燥して、白色に近い粉末を得た。産物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した（４４０００〜４６０００、広域ピーク）。

【0527】

ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、本質的に実施例１４に記載のように試験した。ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対するＥＣ５０は、それぞれ０．３２７ｎＭ及び０．０４２ｎＭだった。

【0528】

実施例３６
固相ペプチド合成を使用して、Ｘ＝ＡＩＢであるペプチド前駆体ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＭＮＴ−ＮＨ_２（配列番号５８９）を調製した。その後、粗ペプチドを分取用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳにより特徴付けた（［Ｍ＋Ｈ］の計算値：３４１２．８；実測値３４１３．９）。ペプチド前駆体及びヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧ（ＮＯＦ）（１：１）を、７Ｍ尿素／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５中で４５分間室温にて混合することにより、ペグ化を実施し、ＰＥＧとペプチドのＣｙｓとの間に共有結合性チオエーテル結合を形成した。

【0529】

【化64】

【0530】

ペグ化ペプチドを、分取用ＨＰＬＣにより精製し、所望の画分を収集及び凍結乾燥して、白色に近い粉末を得た。産物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した（４４０００〜４６０００、広域ピーク）。

【0531】

ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、本質的に実施例１４に記載のように試験した。ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に対するＥＣ５０は、それぞれ０．０２７ｎＭ及び３３ｎＭだった。

【0532】

実施例３７
ペプチドＪ

【0533】

【化65】

【0534】

又はペプチドＫ

【0535】

【化66】

【0536】

の骨格を含み、３位に追加的修飾を有する上記のグルカゴン類似体ペプチドを、固相ペプチド合成により、本質的に本明細書に記載のように製作した。グルカゴン受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について、ペプチドを本質的に実施例１４に記載のように試験した。各ペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）は、表２６に示されている。

【0537】

【表26】

【0538】

表２６に示されているように、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に喪失することなく、３位を複数のアミノ酸で置換することができ、ある場合には、修飾、例えばペプチドＫの骨格のＤａｂ（Ａｃ）及びＱ（Ｍｅ）は、実際に活性を増加させた。

【0539】

実施例３８
種々のグルカゴン類似体骨格に３位のＤａｂ（Ａｃ）を含むグルカゴン類似体ペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作し、グルカゴン受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を試験した。各ペプチドの構造及び活性は、表２７に示されている。

【0540】

【表27】

【0541】

実施例３９
配列番号１を含み、２及び１６位にＡＩＢ及び１０位にＬｙｓを有し、１０位のＬｙｓがＣ１６脂肪酸アシル基に共有結合で結合され、Ｃ末端カルボキシラートの代りにアミドを有する第１のグルカゴン類似体ペプチド（ＡＩＢ２、ＡＩＢ１６、Ｋ１０（Ｃ１６）Ｇｌｕｃアミド）を、本質的に本明細書に記載のように製作した。第２のグルカゴン類似体ペプチド（ＡＩＢ２、ＡＩＢ１６、Ｋ１０（Ｃ１６）、Ｋ３０ Ｇｌｕｃアミド）は、ＬｙｓがＣ末端に付加されたことを除いて、第１のグルカゴン類似体ペプチドと同じ構造を有する。ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、本質的に実施例１４に記載のように試験し、２０％ヒト血漿を含む溶液中で更に試験した。各受容体に対するペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）は、表２８に示されている。

【0542】

【表28】

【0543】

実施例４０
レプチンの発見は、エネルギーバランス及び体脂肪過多を制御する内分泌系の存在を明らかにした。また、レプチンの発見により、世界的流行疾患となったものを管理するための環境的及び薬理学的手法を特定する手段として、肥満研究に関心及び投資が集まった。十分に効果的で安全な肥満の薬理学的治療はまだ出現しておらず、持続的に体重を減少させることが証明された唯一の選択肢は、外科手術である。作用持続時間が持続的な単一ペプチドの強力な満腹誘導効果及び脂肪分解効果を達成する２つの内分泌ホルモン受容体に対する受容体アゴニズムのコンビナトリアル効能が本明細書で報告されている。天然ＧＬＰ−１と同等なＧＬＰ１−Ｒに対する活性を有するが、それらのグルカゴン受容体アゴニズムのレベルが互いに異なる２つの特異的なグルカゴン類似体を、げっ歯動物肥満モデルで薬理学的に研究した。異なるグルカゴン及びＧＬＰ−１活性を有する一連の高効力類似体から選択されたそれらペグ化ペプチドを週１回投与することにより、食餌誘導性肥満マウス（平均体重約５０ｇ）の脂肪過多及び糖耐性レベルが１か月以内に正常化された。体重減少は、食物摂取量の減少及びエネルギー消費量の増加に起因する体脂肪減少の結果であり、グルカゴン受容体アゴニズムのレベルと共に増加した。これら同時アゴニスト化合物は、肝臓脂肪症を含むグルコース及び脂質代謝も正常化した。効果は用量依存的であり、食餌誘導性肥満ラットで繰り返すことに成功した。これら前臨床研究は、完全なＧＬＰ−１アゴニズムが、適切な度合いのグルカゴン受容体活性化により増強される場合、体脂肪低減を実質的に及び安全に加速することができることを示す。本明細書に示されている知見は、臨床検査の根拠を確立し、メタボリック症候群に対する魅力的な新規治療選択肢を示唆する。

【0544】

実施例４１
以下の物質及び方法は、実施例４２〜５１に記載の実験に関する。

【0545】

Ｂｏｃペプチド合成及び切断
ペプチド合成は、改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４３０Ａペプチド合成機で、０．２ｍｍｏｌの４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）レジン（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、フィッシャーズ、インディアナ州）を使用して実施した。固相ペプチド合成には、Ｂｏｃ−化学の場合、ｉｎ ｓｉｔｕ中和を使用した（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １３：３１−４４ （２００７））。完成したペプチジルレジンを、０℃で１時間ＨＦ／ｐ−クレゾール（１０：０．５容積／容積）で処理した。ＨＦを減圧下で除去し、脱保護したペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄した。ペプチドを２０％アセトニトリル／１％酢酸に溶解し、凍結乾燥した。ほとんどのペプチドは、Ｂｏｃ化学により調製した。以下の側鎖保護基を、Ｂｏｃ−アミノ酸（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨ０）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。ペプチド分子量を、エレクトロスプレーイオン化又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認し、別記のように精製した。

【0546】

ラクタム合成
ｉ及びｉ＋４ラクタム形成を有する環化ペプチドをレジン上で合成した。Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−ＯＨガンマエステル（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、ルーイビル、ケンタッキー州）及びＬｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を、ラクタム形成に関与する位置のＧｌｕ（ＯｃＨｅｘ）及びＬｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）の代わりに用いた。完全に保護されたペプチジルレジンをＤＭＦ中２０％ピペリジンで４５分間処理して、Ｆｍｏｃ及びＯＦｍ保護基を除去した。レジン上でのラクタム形成は、ＤＭＦ／ＤＩＥＡ中で、５当量のベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）（Ｆｌｕｋａ社製）で５時間処理した後に達成された。ラクタム形成は、ニンヒドリン分析及び開環形態のペプチドと比べて１８の質量低減により確認した。

【0547】

ペプチド精製
レジンから切断した後、粗ペプチド抽出物を、分析的逆相ＨＰＬＣにより分析した。分析的分離を、Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラム（０．４６×５ｃｍ）を用いて、０．１％ＴＦＡ中でアセトニトリル勾配により実施した。分析的解析の後、粗抽出物を、Ｖｙｄａｃ社製Ｃ４又はＣ１８カラム（２．２×２５ｃｍ）を用いて、０．１％ＴＦＡ中でアセトニトリル勾配により半分取用クロマトグラフィーにより精製した。同じ条件を使用してペグ化ペプチドを精製した。分析的分離用に列挙した条件を使用した分析的逆相ＨＰＬＣにより、分取画分の純度を分析した（＞９５％）。ペプチド質量及び純度は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析により確認した。ペグ化ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、４３４００にわたる幅の広い質量範囲を示した。精製ペプチドを凍結乾燥し、４℃で保管した。

【0548】

ペプチドのペグ化
精製ペプチドを、７Ｍ尿素／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中で、メトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド−４０Ｋ（Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ社製、ケンブリッジ）と１：１モル比で混合した。反応進行を分析的逆相ＨＰＬＣによりモニターし、遊離ペプチドは、３０分以内に消費された。反応を０．１％ＴＦＡで停止させ、別記のように精製及び特徴付けた。

【0549】

グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体媒介性ｃＡＭＰ合成
各ペプチド類似体を、グルカゴン（Ｇｃｇ）及びＧＬＰ−１受容体を介してｃＡＭＰ産生を刺激するその能力について試験した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧｃｇＲ又はＧＬＰ−１Ｒ ｃＤＮＡ、及びｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に結合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子で同時形質移入した。０．２５％ウシ増殖血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製、ローガン、ユタ州）で補完されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、カリフォルニア州）中で培養することにより、細胞を１６時間血清除去した。グルカゴン及びＧＬＰ−１類似体の連続希釈物を、同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を含有する９６ウエルポリ−Ｄ−リジンコーティングプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、サンホゼ、カリフォルニア州）に添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて５時間インキュベートした。インキュベーションした後、当量容積（１００μＬ）のＬｕｃＬｉｔｅルミネセンス基質試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州）を、各ウエルに添加し、プレートを８００ｒｐｍで３分間振とうした。プレートを、暗所で１０分間インキュベートし、光出力を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ−１４５０液体シンチレーション計数器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ウェルズリー、マサチューセッツ州）で定量化した。有効５０％濃度（ＥＣ５０）を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社製、ノーサンプトン、マサチューセッツ州）により計算した。

【0550】

円偏光二色性測定
ペプチドを、ＴＦＥ濃度を増加させながら１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５．９に溶解し、ペプチド濃度を定量化した。ＣＤ測定用に各試料を１０μＭに希釈した。ＣＤデータは、窒素を常に流動させ、温度調節を２５℃に設定した１ｍｍ光路長セルを備えたＪＡＳＣＯ社製Ｊ−７１５円偏光二色性分光旋光計で収集した。スペクトルデータは、１００ｎｍ／分の走査速度及び１ｎｍ波長ステップで、２７０〜１９０ｎｍの走査を５回蓄積した。ＪＡＳＣＯスペクトルマネージャーソフトウェアで、溶媒シグナルを減算し、データを滑らかにした（Ｓａｖｉｔｚｋｙ ａｎｄ Ｇｏｌａｙ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ３６： １６２７ （１９６４））。得られたミリ度値を、ｄｅｇｃｍ^２ｄｍｏｌ^−１の単位を有する平均残基楕円率に変換した。計算した平均残基楕円率値を、ＤＩＣＨＲＯＷＥＢ（Ｗｈｉｔｍｏｒｅ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ８９：３９２− ４００ （２００８）；Ｗｈｉｔｍｏｒｅ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｗ６６８−Ｗ６７３ （２００４））に入力して、ヘリシティパーセント値を得た。

【0551】

動物
Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から取得し、脂肪から５８％ｋｃａｌを有する高スクロース餌であるＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ社製の糖尿病誘発餌を与えた。マウスを、２２℃の１２：１２時間明暗サイクルで食餌及び水を自由に摂取させ、単一で又は集団で飼育した。研究は全て、シンシナティ大学の組織内動物実験委員会により承認され、それに従って実施された。

【0552】

体組成測定
全体組成（脂肪及び除脂肪体重）をＮＭＲ技術（ＥｃｈｏＭＲＩ社製、ヒューストン、テキサス州）を使用して測定した。

【0553】

エネルギーバランス生理学的測定
エネルギー摂取量及び消費量並びにホームケージ活性を、混合型間接熱量測定システム（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、バートホンブルク、ドイツ）を使用することにより評価した。酸素消費量及びＣＯ_２産生量を、４５分毎に合計１２０時間（１２時間の順応期含む）測定して、呼吸商及びエネルギー消費量を決定した。食餌及び水分摂取量並びに食事パターンを、尺度を密閉ケージ環境に統合することにより、間接熱量測定評価と同時に１２０時間連続して決定した。食事は、最短期間が６０秒間の食餌摂取事象であり、食餌摂取事象間には３００秒間の中断があると定義した。ホームケージ自発運動活性を、光線がケージの底部及び上部レベルを走査する多次元赤外線光線システムを使用して決定し、活性は光線の中断として表された。静止運動活性（そわそわすること）は、ケージ底部レベルにおける１本の単一光線の連続した中断として定義し、歩行運動は、ケージ底部レベルの任意の２本の異なる光線の中断として定義し、立ち上がりは、ケージ底部及び上部レベルの両方における光線の同時中断として定義した。

【0554】

血液パラメーター
６時間の断食後に、ＥＤＴＡをコーティングしたＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製、ニュルンベルク、ドイツ）を使用して、血液を尾部静脈から採取し、直ちに氷上で冷却した。３，０００ｇ及び４℃で１５分間遠心分離した後、血漿を−８０℃で保管した。血漿インスリンを、Ｌｉｎｃｏ社製のラジオイムノアッセイ（感受性ラットインスリンＲＩＡ；Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、セントチャールズ、ミズーリ州）により定量化した。血漿ＴＧ及びコレステロール値を、酵素アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製、ウォルサム、マサチューセッツ州）により測定した。試料は、５匹の動物／群に由来する貯留試料（０．２５ｍｌ）を、リポタンパク質分離用に直列に接続した２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲルろ過にかけたことを除いて、個々に分析した。アッセイは全て、製造業者の説明書に従って実施した。

【0555】

グルコース負荷試験
糖耐性の決定の場合、マウスを６時間断食させ、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）用に、体重１ｋｇ当たり２ｇのグルコース（０．９％生理食塩水中５０％Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ社製））を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。尾部血糖レベル（ｍｇ／ｄｌ）を、注射前（０分）及び注射の１５、３０、６０、９０、及び１２０分後に、携帯型グルコメーター（ＴｈｅｒａＳｅｎｓｅ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ）を使用することにより測定した。

【0556】

ＷＡＴ ＨＳｌのウエスタンブロット
脂肪組織を１．５ｍｌの微量遠心チューブに配置し、組織溶解器（Ｒｅｔｓｃｈ，Ｉｎｃ．社製、ニュータウン、ペンシルバニア州、カタログ番号８５２１０）を３０ｈｚで３分間使用して、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＦ、０．５Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．１ｍＭバナジン酸Ｎａ、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンを有する１×ＰＢＳ、１％ノニデットＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中で溶解した。試料を１２，０００ｒｐｍで１５分間（４℃）遠心し、その際にインターナタント（ｉｎｔｅｒｎａｔａｎｔ）を新しいチューブに取り出し、氷上で１５秒間超音波処理した。試料を１４，０００ｒｐｍで１０分間（４℃）遠心し、インターナタントを新しいチューブに収集した。試料を再び１９，０００ｒｐｍで１０分間（４℃）遠心し、インターナタントを新しいチューブに収集した。その後、等量の試料をタンパク質アッセイのために取り出した。その後、試料を４×ＳＤＳ／ＤＴＴ緩衝液中で２分間沸騰させた。細胞溶解産物に由来する５０μｇのタンパク質を、９％（重量／容積）アクリルアミド分離ゲルのＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけ、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ ｎｉｃｔｒｏセルロース膜に移した。膜をブロッキングし、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製の目的一次抗体（ＨＳＬ（４１０７）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製のホスホ−ＨＳＬ（ｓｅｒ６６０）（４１２６））で探索した。洗浄した後、ＨＲＰ結合抗（ウサギＩｇＧ）又は抗（マウスＩｇＧ）（ＨＲＰ結合抗ウサギ及び抗マウス二次抗体は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入した（１７０−６５１５及び１７０−６５１６））のいずれかを使用して、一次抗体検出を実施し、高感度化学ルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して検出し、ＣＬ−Ｘｐｏｓｕｒｅフィルム（Ｐｉｅｒｃｅ社製）に露光させた。

【0557】

免疫組織化学
白色精巣上体脂肪組織のパラフィン包埋切片（５μｍ）を、記載のようにヘマトキシリン／エオシンで染色した（Ｏｇｄｅｎ， Ｃ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． ＪＡＭＡ ２９５： １５４９−１５５５ （２００６））。個々のマウス組織ブロックの各々について、３つの異なる高倍率視野の各々からの１００個の細胞の脂肪細胞サイズを、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ５．１ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製、ベセスダ、メリーランド州、米国）を使用して、面積測定値として定量化した。

【0558】

オイルレッド染色
肝臓組織中の脂質蓄積を視覚化するために、犠牲時に回収した肝臓の４〜８ｍｍ断面をオイルレッドＯ染料で染色した。２０×及び４０×の両倍率での画像を［複合レンズ］顕微鏡を使用して得た。

【0559】

定量ＲＴ−ＰＣＲ手順
給餌状態（午前給餌の１〜４時間後）で断頭することにより動物を犠牲にし、種々の組織を試料採取し、凍結クランプし、後にリアルタイム定量ＰＣＲ（ｉｃｙｃｌｅｒ、ＢｉｏＲａｄ社製）によりＰＥＰＣＫ、Ｇ６Ｐ、及びＨＰＲＴ（ハウスキーピング）のｍＲＮＡ発現を測定するために−８０℃で保管した。

【0560】

標準的プロトコールを使用してＲＮｅａｓｙ脂質組織キット（Ｑｉａｇｅｎ社製、Ｃａ＃７４８０４）を使用し、全ＲＮＡを凍結組織試料から抽出した。ＲＮＡ濃度及び純度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して分光光度法により決定した。ＲＴ−ＰＣＲのｃＤＮＡテンプレートを、２μｇの全ＲＮＡを使用して得た。逆転写反応は、１０×ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液、ＤＮａｓｅＩ、増幅等級、１Ｕ／μｌ、ｄｅｐｃ−Ｈ_２Ｏ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、オリゴ（ｄＴ）２０（５０μＭ）、５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ、及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて実施した。

【0561】

０．５μＭの終濃度の順方向及び逆方向プライマーを含有する蛍光染料ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＢｉｏＲａｄ社製、Ｃａ＃１７０８８８２）を使用して、合成ｃＤＮＡをＰＣＲにより更に増幅した。産物純度を、解離曲線により確認した。一貫した増幅を産出しない無テンプレート対照は、全てのアッセイに含まれていた。検量線を使用してＰＥＰＣＫ又はＧ６Ｐの相対的濃度を取得し、結果を、ハウスキーピング遺伝子として使用したＨＰＲＴの濃度により補正した。結果を、媒体のパーセントとして表し、媒体群の平均を１００％と設定し、その後研究した３群の動物の各個々の値を計算した。

【0562】

プライマー配列
ＰＥＰＣＫ、Ｇ６Ｐ、及びＨＰＲＴのプライマー配列は、ＮＩＨウェブサイトから取得し、プライマーはＩＤＴ ＤＮＡ社により生成された。

【0563】

逆転写及び定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＣＤ６８ ｍＲＮＡ発現を、記載のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量化した（Ｎｏｍｉｙａｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１７：２８７７−２８８８ （２００７））。手短かに言えば、犠牲時に、１００ｍｇの精巣上体脂肪組織をＴＲＩＺＯＬでホモジナイズし、全ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ反応は、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用して実施した。各試料を三重反復で分析し、ＴＦＩＩＢ ｍＲＮＡ発現の値に対して正規化した。使用したマウスプライマー配列は以下の通りだった：ＣＤ６８、５’−ＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＴＴＧＴＧ−３’（順方向）（配列番号６３８）、５’−ＣＣＡＡＡＧＧＴＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＧＡ−３’（逆方向）（配列番号６３９）；及びＴＦＩＩＢ、５’−ＣＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号６４０）、５’−ＣＡＡＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣ−３’（逆方向）（配列番号６４１）。

【0564】

統計分析
別様の指示がない限り、統計分析は全て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの一元配置ＡＮＯＶＡ及びカラム統計を使用して実施した。記載のＰ値は、一元配置分散分析用である。結果は全て、平均±ＳＥとして示されている（受容体活性化データは、±Ｓ．Ｄである）。．

【0565】

実施例４２
アミノ酸修飾を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む２つのグルカゴンペプチド、ペプチドＸ及びＹを本明細書に記載のように製作した。両ペプチドは、２位のＡＩＢ、１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、及び２４位のＣｙｓを含んでいた。２４位のＣｙｓにおける部位特異的な４０−ｋｄペグ化を、マレイミド官能化直鎖ｐｅｇとの反応により達成し、ペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧを得た。ペプチドＹ及びＹ−ＰＥＧは、二次構造を安定化し、グルカゴンアゴニズムを増強させるために、単一の側鎖ラクタム架橋がペプチドＹ又はペプチドＹ−ＰＥＧの中間部分に導入されていた点で、それぞれペプチドＸ及びＸ−ＰＥＧとは異なっていた。１６位のＧｌｕ及び２０位のＬｙｓの２つの側鎖を、ペプチド構築中に側鎖アミドとして共有結合で結合した。ペプチドのこの大環状化は、２１個原子のラクタムを表す。ペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧの溶解度を試験し、生理学的緩衝液中に２５ｍｇ／ｍｌを超える濃度で溶解することが見出され、ペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧは、１週間の血漿とのｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションに対して完全に耐性であることが判明した。

【0566】

実施例４３
種々の濃度のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）水溶液に可溶化された際のペプチドの二次立体構造を、円偏光二色性により分析した（図２５）。グルカゴンは、試験した中で最もヘリックス性の少ないペプチドであり、０、１０、及び２０％のＴＦＥ溶液中でそれぞれ１０、１５、及び３３％のヘリシティ計算値を有した（表２９）。同じ実験条件下で、ＧＬＰ−１は、１４、２９、及び５５％のヘリシティ増強を示し、これら２つのペプチドが、一次構造並びに二次構造において異なることを示した。ペグ化部分が、分子の９０％を超える質量に相当するという事実にも関わらず、ペグ化の際にペプチドＸ及びＹのヘリシティに著しい変化はなかった（表２９）。対照的に、ＴＦＥの非存在下におけるリン酸緩衝液中のペプチドＹの見かけ上のヘリシティは、ペプチドＸのおよそ２倍であり、１７％〜３６％だった。結果的に、これら２つのキメラペプチド（ペプチドＸ−ＰＥＧ及びペプチドＹ−ＰＥＧ）のペグ化形態は、二次構造がかなり異なっており（図２５）、生物学的特性の違いは、これら二次構造の違いの結果である可能性が高い。

【0567】

【表29】

【0568】

実施例４４
２つのペプチド（ペプチドＸ及びＹ）及びそれらの４０−ｋｄペグ化誘導体（ペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧ）を、細胞に基づくＣＲＥル−シフェラーゼリポーターアッセイにおいてｃＡＭＰ合成を刺激するそれらの能力について評価した（図２６）。表３０に示されているように、天然グルカゴンは、０．０５５±０．０１４ｎＭの有効濃度（ＥＣ５０）で、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）は、はるかにより高い濃度である３．２９±０．３９ｎＭのＥＣ５０で、グルカゴン受容体を最大半量に活性化した。対照的に、ＧＬＰ−１は、０．０２８±０．００９ｎＭのＥＣ５０でその受容体を活性化し、グルカゴン受容体（ＧｃｇＲ）に対する相互作用が１μＭを超えるＥＣ５０で生じたという点で高度に特異的であることが判明した。それらの受容体に対する天然リガンドの特異性のダイナミックレンジは、１００万を超えている。ＧＬＰ−１Ｒに対するペプチドＸ−ＰＥＧの効力は、天然ＧＬＰ−１の効力の２倍であり、相対的な意味で、ＧｃｇＲに対して更により増強された。しかしながら、ＧｃｇＲ活性は、天然グルカゴンのおよそ１０％に過ぎなかった。ラクタムを導入することにより、グルカゴンアゴニズムは完全に回復したが、ＧＬＰ−１Ｒに対しては変化がなかった。結果的に、ペプチドＹ−ＰＥＧは、２つのそれぞれの受容体に対する天然リガンドと比較して、十分に強力な、ほとんどバランスのとれた同時アゴニストである。各ペプチドのペグ化により、ＧｃｇＲに対しては１０倍ほど、ＧＬＰ−１Ｒに対しては５倍ほど効力が低減された。ＧｃｇＲに対する活性喪失がわずかに増強されたのは、Ｃ末端配列が、グルカゴン受容体相互作用に対してより大きな相対的重要性を持つことの結果である可能性がある。ペグ化ペプチド（ペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧ）は、ＧＬＰ−１Ｒに対して、天然ＧＬＰ−１よりわずかに強力ではなかったが、依然としてナノモル以下のＥＣ５０を示した。ペプチドＸ−ＰＥＧは、ＧＬＰ−１Ｒに対して、このペプチド、つまりペプチドＹ−ＰＥＧのラクタム型より７倍選択的である。従って、これら２つのＤＰＰ−４耐性ペプチドは、持続性ｉｎ ｖｉｖｏ時間−作用実験に好適であり、ＧＬＰ−１Ｒアゴニズムは良好に一致するが、グルカゴンアゴニズムは異なっている。

【0569】

【表30】

【0570】

実施例４５
４０−ｋｄペグ化ペプチドであるペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧを、食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７Ｂ６マウスに対する週１回の皮下（ｓ．ｃ）注射剤として使用した。３２５ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＹ−ＰＥＧの単回注射は、１週間で体重を５０．９±１．４ｇから３７．８±０．８ｇへと２５．８％減少させた（ｐ＜０．０００１、ｎ＝８／群）。ペプチドＸ−ＰＥＧの同様な投与は有効だったが、効力がかなり低く、体重減少は９％だった（４９．１±１．５１ｇ〜４４．６８±１．３８ｇ）。生理食塩水注射対照マウスに、体重変化はなかった（以前：５０．６１±１．３２ｇ、以後：５０．８７±１．４６ｇ、図２７Ａ）。体重変化は、体脂肪量減少の結果であり（ラクタムペプチドの場合は４１．９％、開環形態の場合は２２．２％、対照の場合は２．３％、ｐ＜０．００１、図２７Ｂ）、平均毎日食物摂取量の有意な減少と一致した（ペプチドＹ−ＰＥＧ：０．４０±０．２９ｇ／日、ペプチドＸ−ＰＥＧ：１．８３±０．８１ｇ／日、生理食塩水：２．７０±０．７８ｇ／日、ｐ＜０．０００１、図２７Ｃ）。血糖は、対照と比較して両ペプチドで有意に減少し、ペプチドＹ−ＰＥＧでわずかにより減少した（ペプチドＹ−ＰＥＧ：−９０．１ｍｇ／ｄＬ、ペプチドＸ−ＰＥＧ：−７９．６ｍｇ／ｄＬ、対照：−２３．９ｇ／ｄＬ、ｐ＝０．０４３３、図２７Ｄ）。２つのペプチド（ペプチドＸ−ＰＥＧ及びペプチドＹ−ＰＥＧ）間の相対的な違いは、統計的に有意ではなかった。

【0571】

実施例４６
別の実験では、６つの異なる用量（０、７、１４、３５、７０、３５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）のペプチドＹ−ＰＥＧ及びペプチドＸ−ＰＥＧの単回皮下注射は、体重及び血糖の線形応答性で用量依存的な減少を示した（図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃ、及び２８Ｄ）。これは、観察された効果が、急速で過度な体重減少の間接的影響以外に、薬理学的に明白な毒性とは関連しないことが示唆される。効果の大きさは、ペプチドＹ−ＰＥＧがより顕著であり、グルカゴンアゴニズムの追加的要素が、ペプチドの効力を向上させることを示す。

【0572】

実施例４７
別の実験では、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＹ−ＰＥＧ又はペプチドＸ−ＰＥＧの毎週皮下注射は、ＤＩＯマウスの体重をそれぞれ２８．１％及び２０．１％減少させた（ｐ＜０．０００１、ｎ＝７〜８／群、図２９Ａ）。体重変化は、体脂肪量の減少と関連していた（ペプチドＹ−ＰＥＧの場合は−６２．９％、ペプチドＸ−ＰＥＧの場合は−５２．２％、及び対照の場合は５．１％、ｐ＜０．０００１、図２９Ｂ）。食物摂取量に対するこれらより低用量の長期的効果（ｐ＝０．９５、図２９Ｃ）は、より高用量での短期的効果（図２７Ｃ）ほど高くなかった。エネルギー消費量は、媒体（１２．７１±０．４５ｋｃａｌ／［ｋｇ＊ｈ］、ｐ＝０．０１８７）と比較して、ペプチドＹ−ＰＥＧ（１４．６０±０．６９ｋｃａｌ／［ｋｇ＊ｈ］）及びペプチドＸ−ＰＥＧ（１７．１９±１．４９ｋｃａｌ／［ｋｇ＊ｈ］）で増加したが、呼吸商は、減少する傾向があり（図２９Ｄ及び２９Ｅ；ペプチドＹ−ＰＥＧの場合は０．７１９±０．０１、ペプチドＸ−ＰＥＧの場合は０．７２５±０．０１、及び媒体の場合は０．７５５±０．０１、ｐ＝０．１０２８）、熱発生の増加及び栄養素配分の変更が、全体的に負のエネルギーバランスを説明することができることを示した。自発運動活性が処置群及び対照間で変わらなかったため、エネルギー消費量の増加は、自発的身体活動誘導性熱発生（ＮＥＡＴ）の変化と関連しなかった（ｐ＝０．４２８１、図２９Ｆ）。急性摂食の自動オンラインモニタリング及び食物摂取量の長期モニタリングはいずれも、カロリー摂取量のいかなる違いも明らかにしなかった（自動ｐ＝０．６６７、長期ｐ＝０．９４８４、図３０Ａ）。

【0573】

血糖レベルは、最初の注射後３日目に開始した処置期間にわたって著しく減少した（平均減少：ペプチドＹ−ＰＥＧ −３２％、ペプチドＸ−ＰＥＧ −２４．５％、対照：−２．７％、ｐ＜０．０００１、図２９Ｇ）。３日目の腹腔内（ｉ．ｐ．）グルコース負荷に応答して、血糖ピーク（図２９Ｈ）及び特性（ＡＵＣ）（図３０Ｆ）は、媒体処理対照と比較して、２つの処置群（ペプチドＹ−ＰＥＧ １４１８３±１０７２、ペプチドＸ−ＰＥＧ １３７９４±８２４．１）で著しくより低かった（３４１２５±３１４２、ｐ＜０．０００１）。ペプチドＹ−ＰＥＧ又はペプチドＸ−ＰＥＧによる処置の１か月後、血漿インスリンは、対照と比較して（２６７５ｐｇ／ｍｌ）、処置群でより低く（１１９４ｐｇ／ｍｌ、１０３４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０２４４）、インスリン感受性が向上されたことが示唆された（図２９Ｉ）。血漿Ｃ−ペプチドレベルは、媒体と比べて（１０７７ｐｇ／ｍｌ）、ペプチドＹ−ＰＥＧ又はペプチドＸ−ＰＥＧ（７３８．８ｐｇ／ｍｌ、６２４．７ｐｇ／ｍｌ）による処置の１か月後に減少する傾向があった（ｐ＝０．１０８）（図３０Ｇ）。

【0574】

主要な現象が種を超えて一般化されるか否かを決定するために、両化合物を、食餌誘導性肥満ラットに投与した（平均体重７７７．４＋／−２．１ｇ、用量７０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週、週１回注射、３週間の処置）。ペプチドＹ−ＰＥＧ及びペプチドＸ−ＰＥＧは各々、ＤＩＯラットの体重（ペプチドＸ−ＰＥＧ：−１１．１５＋／−０．８８％；ペプチドＹ−ＰＥＧ：−２０．５８＋／−２．２６％、媒体：１．０９＋／−０．５６％）（ｐ＜０．０００１）及び体脂肪量（ペプチドＸ−ＰＥＧ：−１９．１７＋／−２．０３％；ペプチドＹ−ＰＥＧ：−３３．７６＋／−４．７６％、媒体：０．６５＋／−１．２０％、ｐ＜０．０００１）を減少させ、この抗肥満治療手法の種非依存的適用可能性が確認された。

【0575】

実施例４８
ペプチドＸ−ＰＥＧ及びペプチドＹ−ＰＥＧによる２７日間にわたる長期皮下処置は、媒体と比べて（２５４．０ ２５．３３ｍｇ／ｄＬ、ｐ＝０．０４４１；図３１Ａ）、ＤＩＯマウスの総コレステロールを減少させた（それぞれ、１０６．９±６．３ｍｇ／ｄＬ及び２００．８±２９．５８ｍｇ／ｄＬ）。別の実験では、０日目及び７日目に７０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＸ−ＰＥＧ、ペプチドＹ−ＰＥＧ、又は媒体を皮下で受容したＤＩＯマウスを、９日目に評価した。ペプチドＹ−ＰＥＧは、血漿トリグリセリド、ＬＤＬコレステロール、及び総コレステロールを減少させ（媒体１７７．７±１１．８ｍｇ／ｄＬと比較して、総コレステロールは６３．０ ２．４９ｍｇ／ｄＬ）（ｐ＜０．０００１）、ＬＤＬからＨＤＬコレステロールへの切替を引き起こした可能性がある（図３１Ｂ）。ペプチドＸ−ＰＥＧは、ＬＤＬ及びＨＤＬコレステロールを両方とも減少させたが、トリグリセリドには著しい影響を及ぼさなかった（図３１Ｃ）。レプチンは有意に減少した（ペプチドＹ−ＰＥＧの場合は３３４３±７２３．３ｐｇ／ｍｌ；ペプチドＸ−ＰＥＧの場合は７３０８±２９２７、及び媒体の場合は１８，６４２±６１２４、ｐ＝０．０４２６、図３１Ｄ、３１Ｅ、３１Ｆ）。２７日間の長期処置は、肝臓脂質含有量も正常化したが、対照ＤＩＯマウスは著しい脂肪肝を維持した（データ非表示）。

【0576】

実施例４９
ペプチドＸ−ＰＥＧ又はペプチドＹ−ＰＥＧによる１か月間の処置は、ＤＩＯマウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）のリン酸化の増加をもたらし（ペプチドＸ−ＰＥＧ：１．１３５±０．３１５；ペプチドＹ−ＰＥＧ：１．６２５±０．１４９；媒体：０．５９７±０．２０４；ｐ＝０．０３６９；図３２Ｂ）、ＷＡＴ脂肪分解に対するグルカゴン特異的直接効果を示唆した。用量が３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週のペプチドＹ−ＰＥＧ及びペプチドＸ−ＰＥＧで２週間処置したマウスの体脂肪量が減少したと同時に、精巣上体脂肪組織中の脂肪細胞サイズが、対照マウスと比較して著しく低減した（データ非表示）。しかしながら、体脂肪量を減少させ、脂肪細胞をより小さくしたにも関わらず、ペプチドＹ−ＰＥＧ及びペプチドＸ−ＰＥＧによるこの２週間の短期処置は、ＣＤ６８のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量化したところ、脂肪組織マクロファージ含有量の著しい低減とは関連しなかった（図３３Ｃ）。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の脱共役タンパク質Ｉ（ＵＣＰ１）レベルは、ペプチドＸ−ＰＥＧにより増加されたが、ペプチドＹ−ＰＥＧ処置では増加せず（ペプチドＸ−ＰＥＧ ２．１６７±０．４２９、ペプチドＹ−ＰＥＧ １．２８７±０．１５５８、及び媒体１．０±０．１１８；ｐ＝０．０２６４；図３２Ａ）、ＢＡＴに対するＧＬＰ−１の、熱発生を停止させる特異的作用と一致した。肝臓グルコース新生を反映する肝臓遺伝子発現は、ペプチドＸ−ＰＥＧ又はペプチドＹ−ＰＥＧ（図３０Ｈ及び３０Ｉ）のいずれによっても影響を受けなかった。組織学的検査は、膵島が、ペプチドＸ−ＰＥＧ処置後に、より小さくなる傾向があることを示した（データ非表示）。

【0577】

実施例５０
ペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧのＧＬＰ−１Ｒ及びＧｃｇＲアゴニスト成分の寄与を精査するために、高脂肪食で飼育したＧＬＰ−１受容体ノックアウト（ＧＬＰ−１Ｒ−／−）マウスに、各々を１か月間投与した。ペプチドＸ−ＰＥＧは、生理食塩水と比較して、体重（ｐ＞０．０５；図３４Ａ及び３４Ｂ）及び体脂肪量（ｐ＞０．０５；図３４Ｃ）の低減を引き起こした。ペプチドＹ−ＰＥＧは、ＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスの体重（ｐ＝０．００２５）及び体脂肪量（ｐ＝０．００２５）の有意な減少を引き起こした（図３４Ａ〜３４Ｃ）。ペプチドＸ−ＰＥＧは、ＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスの食物摂取量に影響を及ぼさなかったが、ペプチドＹ−ＰＥＧは、食物摂取量を有意に抑制した（ｐ＝０．０１７）（図３４Ｄ）。ペプチドＹ−ＰＥＧは、機能性ＧＬＰ−１Ｒの非存在下でのグルコース負荷試験において血糖を増加させる傾向を有し（しかし、ペプチドＸ−ＰＥＧはその傾向を有しない）（ｐ＝０．０３）（図３４Ｅ及び３４Ｆ）、グルカゴン誘導性高血糖症を防御するために同時アゴニストのＧＬＰ−１成分が必要であることが示唆された。

【0578】

実施例５１
グルカゴンアゴニズムに寄与することができるペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧの効果に関する独立した評価として、同等なＧＬＰ−１Ｒ効力を有するが、著しく異なるＧｃｇＲ活性を有する２つの追加的なペプチドアゴニストを研究した。２つのペプチド（ペプチドＵ及びＶ）は、ペプチドＸ−ＰＥＧ及びＹ−ＰＥＧに関する。ペプチドＵ及びＶは、以下の修飾：１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、及び２４位のＣｙｓを有する配列番号１のアミノ酸配列を含むが、２４位のＣｙｓに２０−ｋｄペグ化を含み、２位のＡＩＢを含んでいない。ペプチドＶは、グルカゴンアゴニズムを１０倍を超えて選択的に低減したＧｌｕによるＧｌｎ３の置換を更に含んでいた。ペプチドＵ及びペプチドＶはいずれも、ラクタム架橋を含んでいなかった。ＤＩＯマウスを５０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドＶにより毎日皮下で１週間処置することにより、ペプチドＵと比べて体重低下に対する効果が低減することが明らかになった（それぞれ、−９．０９±０．８０対−１３．７１±０．９２ｇ、ｐ＜０．０００１；図３５Ａ）。

【0579】

実施例５２
γ−Ｇｌｕスペーサー又はγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介してＬｙｓ残基に結合されたＣ１６脂肪酸アシル基を含み、Ｌｙｓ残基が１０位又はＣ末端（２９位）に位置するグルカゴンペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した。グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について、ペプチドを本明細書に記載のように試験した。結果は表３１に示されている。

【0580】

【表31】

【0581】

実施例５３
表３２に示されているペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した：

【0582】

【表32】

【0583】

表３２のペプチドは全て、配列番号６２４、６３１、及び６３２のペプチドを除いて、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体の両方に対して強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示した。

【0584】

表３３に概説されている変更を除いて、天然グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＡ組のペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作する。

【0585】

【表33-1】

【0586】

【表33-2】

【0587】

【表33-3】

【0588】

【表33-4】

【0589】

２７位のＭｅｔがノルロイシンで置換されていることを除いて、Ａ組のペプチドと同じ構造を有するペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作する。これら修飾ペプチドは、Ｂ組のペプチドである。

【0590】

２４位のＧｌｎが、４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合で結合されたＣｙｓで置換されていることを除いて、Ａ及びＢ組のペプチドと同じ構造を有するペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作する。これらペグ化ペプチドは、Ｃ組のペプチドを形成する。

【0591】

１０位のＴｙｒが、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、又はＣ１８脂肪酸アシル基に共有結合で結合されたＬｙｓで置換されていることを除いて、Ａ、Ｂ、又はＣ組のペプチドと同じ構造を有するペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作する。Ｃ８脂肪酸アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｄ組のペプチドを形成する。Ｃ１２脂肪酸アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｅ組のペプチドを形成する。Ｃ１４脂肪酸アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｆ組のペプチドを形成する。Ｃ１６脂肪酸アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｇ組のペプチドを形成する。Ｃ１８脂肪酸アシル基でアシル化されたペプチドは、Ｈ組のペプチドを形成する。

【0592】

脂肪酸アシル基が１０位のＬｙｓにスペーサーを介して結合されていることを除いて、Ｄ〜Ｈ組のペプチドと同じ構造を有するペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作する。γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕスペーサーを含むペプチドは、Ｉ組のペプチドを形成する。γ−Ｇｌｕスペーサーを含むペプチドは、Ｊ組のペプチドを形成する。Ａｌａ−Ａｌａスペーサーを含むペプチドは、Ｋ組のペプチドを形成する。β−Ａｌａ−β−Ａｌａスペーサーを含むペプチドは、Ｌ組のペプチドを形成する。

【0593】

実施例５４
最大１５個のアミノ酸修飾、１〜２１個アミノ酸のＣ末端延長部分を有する配列番号１を含み、（ａ）延長部分がアシル化又はアルキル化されており、及び／又は（ｂ）延長部分が１〜６個の正荷電アミノ酸を含むグルカゴンペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した。グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＩＰ受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について、ペプチドを、本質的に実施例１４に記載のように試験した。ペプチド及びそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の構造は、表３４に要約されている。

【0594】

【表34】

【0595】

表３４に示されているように、非ペグ化ペプチドは全て、０．１％を超える、ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示し、ペプチドｍｔ−３４５、ｍｔ−３６２、及びｍｔ−３６４は、ＧＩＰ受容体に対する特別に強力な活性を示した。ペプチドｍｔ−３５０、ｍｔ−３５１、及びｍｔ−３５２は、恐らくはこれらペプチドがペグ化されていたという事実のため０．１％未満の活性を示した。

【0596】

実施例５５
ｍｔ−３４５（配列番号６５７の構造を有する）のｉｎ ｖｉｖｏ効果は、他のアシル化ペプチド（リラグルチド、ｍｔ−２６１（配列番号６７０）、及びｍｔ−３４７（配列番号６５９））、及び非アシル化ペプチド（ｍｔ−３４８；配列番号６６０）の効果と比較した。ペプチドｍｔ−３４５、ｍｔ−２６１、及びｍｔ−３４７は、アミノ酸修飾を有するグルカゴンのアミノ酸配列（配列番号１）を含み、２９位のアミノ酸のＣ末端側のＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２６）の延長部分、その後に４０位のアシル化Ｌｙｓを更に含んでいた。ペプチドｍｔ−３４５は、２位のＡＩＢ、１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、２４位のＣｙｓ、２９位のＧｌｙ、２９位のＧｌｙのｃ末端側の配列番号２６、及び４０位のアシル化Ｌｙｓを含んでいた。ｍｔ−３４５のアシル基は、Ｃ１４脂肪酸アシル基だった。ペプチドｍｔ−２６１は、ｍｔ−２６１が、１位のＴｙｒ、３位のＧｌｕ、１２位のＩｌｅ、１６位のＬｙｓ、２０位のＡＩＢ、２３位のＶａｌ、２４位のＡｓｎ、２７位のＬｅｕ、２８位のＡｌａ、及び４０位のＣ１６脂肪酸アシル基を含んでいたことを除いては、ｍｔ−３４５と同様の構造を有していた。ｍｔ−３４７及びｍｔ−３４８の構造は、ｍｔ−３４７及びｍｔ−３４８が１６位のＡＩＢを含んでいたことを除いては、ｍｔ−３４５の構造と同一だった。ｍｔ−３４７の構造は、ｍｔ−３４７が４０位のＣ１４脂肪酸アシル基を含み、ｍｔ−３４８がアシル基を欠いたことを除いては、ｍｔ−３４８の構造と同じだった。

【0597】

グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＩＰ受容体に対する、ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、本質的に実施例１４に記載のように試験した。相対的活性は、表３５に示されている。

【0598】

【表35】

【0599】

ペプチドを、１０又は３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下注射により、１１群の８匹Ｃ５７Ｂ１／６マウスに２週間毎日投与した。マウスの初期平均体重は５１ｇだった。マウスは６か月齢であり、糖尿病誘発性食餌を４か月間与えていた。１群のマウスは媒体対照を受容し、別の群は、Ｃ末端アルファカルボキシラートの代りにＣ末端アミド化を有する配列番号１のアミノ酸配列を含んでいたグルカゴンアミド対照ペプチドを受容した。

【0600】

ペプチドを受容した各群のマウスの体重は、媒体対照と比較して、研究の経過にわたって着実に減少した。しかしながら、図３６に示されているように、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのｍｔ−２６１又はｍｔ−３４５を受容したマウスの総体重変化が、最も著しかった（約２０％）。グルカゴンアミドペプチドを投与したマウスも、ｍｔ−２６１及びｍｔ−３４５によるものと同様の総体重減少を示したが、グルカゴンアミドの用量は、ｍｔ−２６１及びｍｔ−３４５の用量の３倍ほどだった。体重に対する効果は、リラグルチドの効果より明らかに著しかった。

【0601】

マウス群による食物摂取量も研究中に評価した。ｍｔ−２６１又はｍｔ−３４５ペプチドを受容したマウスは、最も低い食物摂取量を示した。

【0602】

マウスの血糖レベルも研究した。リラグルチド、ｍｔ−２６１、又はｍｔ−３４５を投与したマウスは、７日目（ペプチドを最初に投与した７日後）に血糖レベルの全体的な減少を示した。しかしながら、１４日目に測定した際には、減少の程度はより少なかった。

【0603】

実施例５６
アシル化Ｃ末端延長部分を含むグルカゴンペプチドを、本質的に本明細書に記載のように製作した。ペプチドｍｔ−２７８、ｍｔ−２６１、ｍｔ−２９７、及びｍｔ−３５８は、以下のアミノ酸修飾：１位のＴｙｒ、２及び２０位のＡＩＢ、１６位のＬｙｓ、１２位のＩｌｅ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２９位のＧｌｙ、２９位のアミノ酸のＣ末端側の配列番号２６のアミノ酸配列、及び４０位のアシル化Ｌｙｓを有する配列番号１のアミノ酸配列を含んでいた。ペプチドｍｔ−３６４は、１位のＨｉｓ、１６位のＧｌｕ、及び２０位のＬｙｓを含むことにより他のペプチドと構造が異なっていた。これらペプチドの構造の詳細な説明は、本明細書に添付した配列表に記述されている：ｍｔ−３６４（配列番号６６９）、ｍｔ−２６１（配列番号２７０）、ｍｔ−２７８（配列番号２７１）、ｍｔ−２９７（配列番号２７２）、及びｍｔ−３５８（配列番号６７３）。

【0604】

グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＩＰ受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について、ペプチドを本質的に実施例１４に記載のように試験した。示されている受容体に対する天然ホルモンと比較したペプチドの活性は、表３６に示されている。

【0605】

【表36】

【0606】

その後、糖尿病誘発性食餌を６か月間与えていた８か月齢のＣ５７Ｂ１／６マウスの体重、食物摂取量、血糖レベル、及び体脂肪量に対するそれらの効果について、ペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで試験した。１１群の８匹マウスに、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチドを１週間毎日皮下に注射した。マウスは、５３ｇの初期体重を有していた。

【0607】

媒体のみを注射したマウスと比較して、ｍｔ−２７８、ｍｔ−２６１、又はｍｔ−３６４を注射したマウスの体重は、研究の経過にわたって着実に減少した。図３７に示されているように、ｍｔ−３６４を注射したマウスは、１週間にわたる研究の終了までに最も大きな体重減少を示し、１５％を超える体重減少を達成した。ｍｔ−２７８又はｍｔ−２６１を注射したマウスも、実質的な（１０％を超える）体重減少を示した。

【0608】

マウスによる総食物摂取量をモニターし、ｍｔ−３６４又はｍｔ−２６１を注射したマウスによる研究の終了までの総食物摂取量は、媒体のみを注射したマウスによる総食物摂取量の５０％未満の総食物摂取量を示した。

【0609】

マウスの体脂肪量を、研究の全体にわたって測定した。ｍｔ−３６４、ｍｔ−２７８、又はｍｔ−２６１を注射したマウスは、媒体のみを注射したマウスの体脂肪量未満の体脂肪量を示した。

【0610】

血糖レベルに対する効果を更に評価した。研究の最終日（７日目）に、ｍｔ−３６４又はｍｔ−２６１を注射したマウスは、０日目に測定した血糖レベルと比較して６０％を超える血糖レベルの減少を示した。加えてｍｔ−２７８を注射したマウスも、血糖の実質的な減少を示した（約４０％の減少）。

【0611】

実施例５７
Ｃ末端アルファカルボキシラートの代りにＣ末端アミドを有するグルカゴンの類似体を、本質的に本明細書に記載のように製作した：
ペプチド８３は、２位のＡＩＢ、１６位のＡＩＢ、及び１０位のＬｙｓを有し、Ｌｙｓが、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介してＣ１６脂肪酸アシル基を含んでいた配列番号１の構造を含んでいた。
ペプチド９００は、２位のＡＩＢ、１６位のＡＩＢ、及び配列番号２６を含むＣ末端延長部分、及び４０位のＬｙｓを有し、Ｌｙｓが、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介してＣ１６脂肪酸アシル基を含んでいた配列番号１の構造を含んでいた。
ペプチド９０１は、２位のＡＩＢ、１６位のＡＩＢ、及び配列番号２６を含むＣ末端延長部分、及び１０位のＬｙｓを有し、Ｌｙｓが、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介してＣ１６脂肪酸アシル基を含んでいた配列番号１の構造を含んでいた。
ペプチドｍｔ−３６４は、配列番号６６９の構造を含んでいた。

【0612】

グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＩＰ受容体の各々に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性について、類似体を本質的に本明細書に記載のように試験した。結果は表３７に示されている。

【0613】

【表37】

【0614】

９群の８匹ＤＩＯマウス（系統：Ｃ５７Ｂ１６ＷＴ）に、表３７のペプチドのうちの１つを１０ｎｍｏｌ／ｋｇで７日間毎日皮下に注射した。マウスの平均初期体重は５７．６ｇだった。マウスはおよそ１０か月齢であり、高脂肪食餌を約８か月間与えていた。

【0615】

総体重変化を７日目に測定した。図３８に示されているように、表３７のペプチドを注射したマウスは全て、媒体対照と比較して体重減少を示した。全て同様のペプチド構造を有するペプチド８３、９００、及び９０１の中でも、ペプチド９００及び９０１は、最も大きな体重減少を示した。興味深いことには、ペプチド９００及び９０１の各々は、アシル化されていたがＣ末端延長部分を含んでいなかったペプチド８３とは対照的に、Ｃ末端延長部分を含み、アシル化されていた。１０位がアシル化されていたペプチド９０１は、４０位がアシル化されていたペプチド９００（約１０％の減少）より大きな減少（約１５％の減少）を示した。しかしながら、体重に対するこれらペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ効果は、依然としてＭＴ−３６４の効果ほど著しくはなかった。ＭＴ−３６４を注射したマウスは、約２０％の減少を示した。

【0616】

出版物、特許出願、及び特許を含む、本明細書に引用された全ての参考文献は、あたかも参照により組み込まれているように各参考文献が個々に及び具体的に示され、文献全体が本明細書に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0617】

用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び本発明を説明する状況（特に添付の特許請求の範囲の状況）での類似の指示対象は、本明細書で別様に指示されておらず、状況と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数を両方とも包含すると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「含んでいる」、及び「含有する」は、別様の指示がない限り、非限定的な用語として解釈されるべきである（つまり、「〜を含むがそれらに限定されない」ことを意味する）。

【0618】

本明細書では、数値の範囲の列挙は、別様の指定がない限り、個別の値の各々が範囲及び各エンドポイント以内にあることを個々に参照する簡潔な表記方法としての役割を果たすことが単に意図されているに過ぎず、個別の数値及びエンドポイントの各々は、あたかもそれが個々に本明細書に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。

【0619】

本明細書に記載の方法は全て、本明細書に別様の指定がない限り、又は状況と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的言語（例えば「等の」）の使用は、本発明をより良好に明確にすることを単に意図しているに過ぎず、別様に特許請求されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中の言語は、任意の非特許請求要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈されるべきでない。

【0620】

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載されており、それらには、本発明を実施するために本発明者らが認知している最良の形態が含まれる。好ましい実施形態の変異形態は、当業者であれば先述の説明を読めば自明となるだろう。本発明者らは、当業者がそのような変異形態を必要に応じて使用することを予想しており、本発明者らは、本発明が本明細書に特に記載したのと別様に実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法により許容されるように、添付の特許請求の範囲に記述されている主題の改変及び等価物を全て含む。更に、その考え得る全ての変異形態の上述要素のあらゆる組み合わせも、本明細書に別様の指定がない限り、又は状況と明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]