特許 5889924 ｃ−ＭＥＴの二量体化を阻害する新規な抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5889924

(24)【登録日】2016年2月26日

(45)【発行日】2016年3月22日

(54)【発明の名称】ｃ−ＭＥＴの二量体化を阻害する新規な抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160308BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20160308BHJP

   C12N 5/12 20060101ALI20160308BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160308BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160308BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160308BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160308BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20160308BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20160308BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160308BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160308BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20160308BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20160308BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/30

   C12N5/12

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A01K67/027

   C12P21/08

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   G01N33/50 Z

   G01N33/574 A

【請求項の数】33

【外国語出願】

【全頁数】85

(21)【出願番号】特願2014-617(P2014-617)

(22)【出願日】2014年1月6日

(62)【分割の表示】特願2010-515513(P2010-515513)の分割

【原出願日】2008年7月10日

(65)【公開番号】特開2014-113154(P2014-113154A)

(43)【公開日】2014年6月26日

【審査請求日】2014年2月4日

(31)【優先権主張番号】07301231.2

(32)【優先日】2007年7月12日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】60/929,789

(32)【優先日】2007年7月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/020,639

(32)【優先日】2008年1月11日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】CNCM  CNCM I-3732

(73)【特許権者】

【識別番号】500033483

【氏名又は名称】ピエール、ファーブル、メディカマン

(74)【代理人】

【識別番号】100117787

【弁理士】

【氏名又は名称】勝沼 宏仁

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100107342

【弁理士】

【氏名又は名称】横田 修孝

(74)【代理人】

【識別番号】100137497

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 未知子

(72)【発明者】

【氏名】リリアンヌ、ゲシュ

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２３３９６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０１５３７１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許第０６２０７１５２（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 Cancer Res.，２００６年 ２月 １日，Vol.66, No.3，p.1721-1729

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、それぞれ配列番号１３、１１および１４のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、単離された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその機能的二価フラグメントの１つ。

【請求項2】

配列番号１９のアミノ酸配列の重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列の軽鎖とを含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその機能的二価フラグメントの１つ。

【請求項3】

２００７年３月１４日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、パリ）に番号Ｉ−３７３２として寄託された、請求項１または２に記載の抗体を分泌することができるネズミハイブリドーマ。

【請求項4】

リガンド依存的およびリガンド非依存的双方のｃ−Ｍｅｔの活性化を阻害することができる、請求項１または２に記載の単離された抗体。

【請求項5】

ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合することができる、請求項４に記載の単離された抗体。

【請求項6】

少なくとも１つの腫瘍型の腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％を阻害することができる、請求項５に記載の単離された抗体。

【請求項7】

ｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害することができる、請求項６に記載の単離された抗体。

【請求項8】

モノクローナル抗体である、請求項１、２および４〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体。

【請求項9】

二価である、請求項１、２および４〜８のいずれか一項に記載の単離された抗体。

【請求項10】

抗体がキメラ抗体であり、マウスとは異種の抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域をさらに含んでなる、請求項１、２および４〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的二価フラグメントの一つ。

【請求項11】

前記異種がヒトである、請求項１０に記載のキメラ抗体またはその機能的二価フラグメントの一つ。

【請求項12】

ヒト種抗体に由来する軽鎖定常領域が、κ領域であり、ヒト種抗体に由来する重鎖定常領域が、κ、γ−１、γ−２、およびγ−４領域から選択されるヒト化抗体である、請求項１１に記載のキメラ抗体またはその機能的二価フラグメントの１つ。

【請求項13】

次の核酸：
ａ）請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的二価フラグメントの１つをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）
・配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９の配列ならびに配列番号３６、配列番号３４および配列番号３７の配列を含んでなる核酸配列
からなる配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｃ）
・配列番号４２および配列番号４５の配列を含んでなる核酸配列
からなる配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｄ）ｂ）またはｃ）で定義された核酸の対応するＲＮＡ核酸；ならびに
ｅ）ａ）、ｂ）およびｃ）で定義された核酸の相補的核酸
から選択される、単離された核酸。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸を含んでなるベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載のベクターを含んでなる単離された宿主細胞。

【請求項16】

請求項１４に記載のベクターにより形質転換された少なくとも１つの細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。

【請求項17】

請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的二価フラグメントの１つを製造するためのプロセスであって、以下の段階：
ａ）請求項１５に記載の細胞の、培地および適当な培養条件での培養；および
ｂ）培養培地または前記培養細胞から出発する、このようにして得られた前記抗体またはそれらの機能的二価フラグメントの１つの回収
を含んでなる、プロセス。

【請求項18】

薬剤としての、請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項19】

有効成分として、請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載の、または請求項１７に記載のプロセスにより得られる、抗体またはその機能的二価フラグメントの１つからなる化合物を含んでなる、組成物。

【請求項20】

同時、個別または逐次使用のための組合せ物として抗腫瘍抗体をさらに含んでなる、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

同時、個別または逐次使用のための組合せ物として細胞傷害性／細胞増殖抑制剤をさらに含んでなる、請求項１９または２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が、同時使用のための前記抗体または前記機能的二価フラグメントと化学的にカップリングされる、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗脈管形成剤、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン薬、および免疫調節剤からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が、有糸分裂阻害剤である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記抗体またはその機能的二価フラグメントの１つの少なくとも１つが、細胞毒素および／または放射性元素とコンジュゲートされる、請求項２０に記載の組成物。

【請求項26】

薬剤としての、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載される抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。

【請求項28】

腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害に用いるための、請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的二価フラグメントの１つを含んでなる医薬組成物、あるいは請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

癌の予防または治療に用いるための、請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的二価フラグメントの１つを含んでなる医薬組成物、あるいは請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

前記癌が、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、膠芽腫または結腸癌から選択される癌である、請求項２９に記載の医薬組成物または組成物。

【請求項31】

前記癌が、ＨＧＦ依存性および非依存性のＭｅｔ活性化関連癌である、請求項２９または３０に記載の医薬組成物または組成物。

【請求項32】

ｃ−Ｍｅｔ受容体の異常な存在が疑われる生体サンプルから始まるｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過少発現により引き起こされる疾病を検出するのを補助する方法であって、該生体サンプルと、請求項１、２および４〜１２のいずれか一項に記載される、または請求項３に記載のハイブリドーマにより生産される抗体とを接触させることを含んでなる、方法。

【請求項33】

該抗体が標識される、請求項３２に記載のｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過少発現により引き起こされる疾病を検出するのを補助する方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

技術分野
本発明は、ヒトｃ−Ｍｅｔ受容体と特異的に結合することができ、かつ／または該受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる新規な抗体、特に、ネズミ、キメラおよびヒト化起源のモノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体をコードするアミノ酸および核酸配列に関する。より詳しくは、本発明による抗体は、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害することができる。本発明はまた、該受容体の過剰発現に関連する癌またはいずれかの病状の予防的処置および／または治療的処置のための薬剤としての、ならびにｃ−Ｍｅｔの過剰発現に関連する疾病の診断のためのプロセスまたはキットにおける、これらの抗体の使用も含む。本発明は最後に、このような抗体を、腫瘍の進行もしくは転移に関与する他の増殖因子に対する他の抗体および／または化学化合物、および／または毒素とコンジュゲートさせた化合物および／または抗癌剤または薬剤と組み合わせて含んでなる物および／または組成物、ならびにある種の癌の予防および／または治療にためのそれらの使用を含んでなる。

【0002】

発明の背景
トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、イマチニブおよびゲフィチニブ阻害剤などの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）標的薬は、選択された癌の処置のためにこのタンパク質種を標的化することの重要性を示している。

【0003】

ｃ−ＭｅｔはＲＴＫサブファミリーの基本型メンバーであり、これにはまたＲＯＮおよびＳＥＡも含まれる。ｃ−Ｍｅｔ ＲＴＫファミリーは他のＲＴＫファミリーとは構造的に異なり、分散因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対する、唯一知られている高親和性受容体である[D.P. Bottaro et al, Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al, Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]。ｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦは種々の組織で広く発現し、それらの発現は通常それぞれ上皮起源および間葉起源の細胞に限定されている[M. F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]。それらは双方とも正常な哺乳類の発生に必要であり、細胞の遊走、形態形成分化および三次元管構造の組織化、ならびに成長および脈管形成に特に重要であることが示されている[F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]。ｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦの制御された調節が哺乳類の発生、組織の維持および修復に重要であることが示されている[Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh J, Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2): 155-66; Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1): 146-51]とともに、それらの調節不全が癌の進行に関連づけられている。

【0004】

ｃ−Ｍｅｔの不適切な活性化により引き起こされる異常なシグナル伝達はヒトの癌に最も頻繁に見られる変化の１つであり、腫瘍形成および転移に重要な役割を果たしている[Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300]。

【0005】

不適切なｃ−Ｍｅｔの活性化は、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現を含むリガンド依存的および非依存的機構、および／またはパラ分泌または自己分泌の活性化、または機能的突然変異における増分により起こり得る[J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]。しかしながら、ＡＴＰおよびチロシン含有ペプチド基質に対するキナーゼの結合親和性および結合速度を調節するには、リガンドの存在下または不在下でのｃ−Ｍｅｔ受容体のオリゴマー化が必要である[Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8]。活性化されたｃ−Ｍｅｔは、細胞質ドメインに位置する多重ドッキング部位にシグナル伝達エフェクターを動員し、その結果、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＳｒｃおよびＳｔａｔ３を含むいくつかの重要なシグナル伝達経路が活性化される[Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]。これらの経路は腫瘍細胞の増殖、浸潤および脈管形成に、また、アポトーシスの回避に不可欠である[Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 122-30; Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]。さらに、他のＲＴＫに比べてｃ−Ｍｅｔシグナル伝達のユニークな一面は、その報告されている、焦点接着複合体(focal adhesion complexes)およびα６β４インテグリン[Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54]、ＣＤ４４ｖ６[Van der Voort R, Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi E, Pals ST, J Biol Chem. 1999, 274(10):6499-506]、プレキシンＢ１またはセマフォリン[Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23:5131-7]などの非キナーゼ結合相手との相互作用であり、これらがこの受容体による細胞機能の調節の複雑性にさらに加わる。最後に、最近のデータは、ｃ−Ｍｅｔが腫瘍のゲフィチニブまたはエルロチニブ耐性に関与している可能性があることを示し、ＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔの双方を標的とする化合物の組合せが極めて重要となり得ることを示唆している[Engelman JA at al., Science, 2007, 316:1039-43]。

【0006】

ここ数年で、癌細胞系統においてｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達を減弱するために多くの異なる戦略が開発されてきた。これらの戦略は、ｉ）ｃ−ＭｅｔまたはＨＧＦ／ＳＦに対する抗体の中和[Cao B, Su Y, Oskarsson M, Zhao P, Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, Schwall R, Westphal M, Lamszus K, Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52]またはｃ−Ｍｅｔへのリガンドの結合を防ぐためのＨＧＦ／ＳＦアンタゴニストＮＫ４の使用[Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T, Cancer Res., 2000, 60:6737-43]、ｉｉ）キナーゼ活性を遮断するｃ−Ｍｅｔに対する小ＡＴＰ結合部位阻害剤[Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan E, Le P, Chen J, Wang X, Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55]、ｉｉｉ）マルチドッキング部位(multidocking site)への接近を妨げる、操作されたＳＨ２ドメインポリペプチドおよび受容体またはリガンドの発現を低下させるＲＮＡｉまたはリボザイムを含む。これらのアプローチのほとんどは、腫瘍阻害をもたらすｃ−Ｍｅｔの選択的阻害を示し、ｃ−Ｍｅｔが癌における治療的介入に重要となり得ることを示す。

【0007】

ｃ−Ｍｅｔの標的化のために作出された分子のうちいくつかは抗体である。

【0008】

種々のモデルに単独で加えた場合には強力なアゴニストとして、また、Ｆａｂフラグメントとして用いる場合にはアンタゴニストとして挙動する、Genentech［ＷＯ９６／３８５５７］により作出された抗ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５抗体が最も包括的に記載されている。ｏｎｅ ａｒｍｅｄ ５Ｄ５（ＯＡ５Ｄ５）と記載され、大腸菌(E. coli)において組換えタンパク質として生産される、この抗体の一価操作型も、Genentechによる特許出願［ＷＯ２００６／０１５３７１］の対象である。しかしながら、その特定のスキャフォールドのために抗体として認識され得ないこの分子は、ヒトにおいて免疫原性であり得る突然変異も示す。活性という点で、この非グリコシル化分子はエフェクター機能を欠き、最終的に、ＯＡ５Ｄ５がｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害するということを示す明らかなデータは無い。さらに、Ｇ５５ in vivoモデル、すなわち、ｃ−Ｍｅｔを発現するが、ＨＧＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質は発現せず、リガンドとは独立に成長する膠芽腫細胞系統において試験した場合、一腕（one armed）抗ｃ−ＭｅｔはＧ５５腫瘍成長に有意な効果を持たず、このことはＯＡ５Ｄ５が主としてＨＧＦ結合を遮断することにより働き、ＨＧＦとは独立に活性化された腫瘍を標的とすることはできないことを示唆する[Martens T. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152]。

【0009】

ｃ−Ｍｅｔを標的とする別の抗体は、Pfizerにより「主としてｃ−Ｍｅｔアンタゴニスト、場合によってはｃ−Ｍｅｔアゴニストとして」働く抗体として記載されている［ＷＯ２００５／０１６３８２］。

【0010】

この出願には、ｃ−Ｍｅｔ二量体化に対するPfizer抗体の効果を示すデータは記載されていない。

【0011】

本発明の革新的な態様の１つは、内因性のアゴニスト活性を持たず、かつ、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害するマウスモノクローナル抗体を作出することである。リガンド依存性腫瘍を標的とすることに加え、このアプローチは、その過剰発現、またはシグナル伝達のためにオリゴマー化になお依存する細胞内ドメインの突然変異のためにリガンド非依存性のｃ−Ｍｅｔの活性化も損なう。このような抗体の活性のもう１つの態様は、ｃ−Ｍｅｔ機能の障害をもたらす、ｃ−Ｍｅｔとその相手との相互作用に対する立体障害であり得る。これらの抗体は、ｃ−Ｍｅｔ受容体の特異的遮断に関連する機能に加え、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどのエフェクター機能を獲得するように、好ましくは、限定されないが、ヒトＩｇＧ１としてヒト化および操作される。

【0012】

発明の開示
驚くことに、発明者らは、ｃ−Ｍｅｔと結合することができるだけでなく、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害することもできる抗体を初めて作出することができた。先行技術においてｃ−Ｍｅｔとその相手との二量体化を阻害することができる抗体が興味深いものであり得ることが示唆されることがあったとしても、そうすることができる抗体が開示または明らかに示唆されることは無かった。さらに、抗体特異性に関しては、このような活性な抗体の作出に成功したことは全く明らかでなかった。

【0013】

第１の態様において、本発明の対象は、本発明による抗体の作製および選択のための方法である。

【0014】

より詳しくは、本発明は、リガンド依存的および非依存的双方のｃ−Ｍｅｔの活性化を阻害することができる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つの選択のためのプロセスであって、
ｉ）作製された抗体をスクリーニングし、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合することができる抗体を選択する工程；
ｉｉ）選択された工程ｉ）の抗体をイン・ビトロで評価し、少なくとも１つの腫瘍型の腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％または８０％を阻害することができる抗体を選択する工程；および次いで
ｉｉｉ）選択された工程ｉｉ）の抗体を試験し、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害することができる抗体を選択する工程
を含んでなるプロセスに関する。

【0015】

以上に説明したように、ｃ−Ｍｅｔ二量体化の阻害は本発明の主要な態様であり、抗体それ自体、より大きな患者集団に実際の利益を提供する。リガンド依存性活性化ｃ−Ｍｅｔ癌だけでなく、本発明の範囲内である限り、非依存性活性化ｃ−Ｍｅｔ癌も、本発明のプロセスにより作製された抗体で処置可能である。

【0016】

抗体の作製は、例えば、骨髄腫細胞と、免疫マウスまたは選択された骨髄腫細胞に適合する他の種由来の脾臓細胞との融合など、当業者に既知の任意の方法によって実現することができる[Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]。

【0017】

免疫動物としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスを含んでよく、これは直接ヒト抗体を産生する。もう１つの可能性のある実施形態としては、ライブラリーをスクリーニングするためにファージディスプレー技術を用いることからなる。

【0018】

スクリーニング工程ｉ）は、当業者に知られている方法またはプロセスにより実現することができる。非限定例としては、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、免疫組織化学、ＦＡＣＳ分析および機能的スクリーニングが挙げられる。好ましいプロセスは、ｃ−Ｍｅｔ組換えタンパク質に対するＥＬＩＳＡにより、さらにその後、生産された抗体が腫瘍細胞上の天然受容体も認識し得ることを確認するために少なくとも腫瘍細胞系統に対してＦＡＣＳ分析によりスクリーニングすることからなる。このプロセスは以下の実施例でより詳しく記載する。

【0019】

また、工程ｉｉ）も、例えば、３Ｈ−チミジンまたは他のいずれかのＤＮＡ染色剤、ＭＴＴ、ＡＴＰ評価などの使用といった既知の方法またはプロセスによって常套的に実現することができる。本発明において好ましい腫瘍細胞モデルはＢｘＰＣ３モデルからなる。

【0020】

ｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害するとは、好ましくはｃ−Ｍｅｔホモ二量体化と理解すべきである。

【0021】

本発明のプロセスの選択の工程ｉｉｉ）の好ましい実施形態では、該工程ｉｉｉ）は、ｃ−Ｍｅｔ−ＲＬｕｃ／ｃ−Ｍｅｔ−ＹＦＰの双方を発現する細胞に対するＢＲＥＴ分析により抗体を評価すること、およびＢＲＥＴシグナルの少なくとも３０％、好ましくは３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、最も好ましくは６０％を阻害することができる抗体を選択することからなる。

【0022】

このＢＲＥＴ技術は、タンパク質の二量体化の代表的なものとして知られる技術である[Angers et al, PNAS, 2000, 97:3684-89]。

【0023】

このプロセスの工程ｉｉｉ）で用いられるＢＲＥＴ技術は当業者によく知られており、以下の実施例で詳説する。より詳しくは、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）は、生物発光ドナー（ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ））と蛍光アクセプターであるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）の突然変異体の間で起こる非放射性エネルギー移動である。本出願には、ＥＹＦＰ（増強黄色蛍光タンパク質）を用いた。移動の有効性は配向およびドナーとアクセプター間の距離に依存する。そして、エネルギー移動はこれら２つの分子が近接している場合にのみ起こり得る（１〜１０ｎｍ）。この特性はタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを作出するために使用される。実際、２つの相手の間の相互作用を研究するためには、一方をウミシイタケルシフェラーゼと、もう一方をＧＦＰの黄色突然変異体と遺伝的に融合させる。融合タンパク質は、必須ではないが一般に、哺乳類細胞で発現させる。その膜透過性基質（セレンテラジン）の存在下で、Ｒｌｕｃは青色の光を発する。ＧＦＰ突然変異体がＲｌｕｃから１０ｎｍより近ければエネルギー移動が起こり、さらなる黄色シグナルが検出できる。このＢＲＥＴシグナルは、アクセプターにより発せられた光とドナーにより発せられた光の間の比として測定される。従って、ＢＲＥＴシグナルは、これらの２つの融合タンパク質が近接されるほど、またはコンフォメーション変化がＲｌｕｃとＧＦＰ突然変異体を接近させるほど増強される。

【0024】

ＢＲＥＴ分析が好ましい実施形態である場合、当業者に知られているいずれの方法を用いてｃ−Ｍｅｔ二量体化を測定してもよい。限定されるものではないが、以下の技術：ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）、ＦＬＩＭ（蛍光寿命画像測定）またはＳＷ−ＦＣＣＳ（単一波長蛍光相関分光法）が挙げられる。

【0025】

共免疫沈降、αスクリーン、化学架橋、二重ハイブリッド、アフィニティークロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡまたはファーウエスタンブロットなどの他の従来技術も使用することができる。

【0026】

第２の態様において、本発明の対象は、前記の方法により得られる単離された抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体である。該抗体またはそのフラグメントまたは誘導体の１つはヒトｃ−Ｍｅｔと特異的に結合することができ、必要に応じて、好ましくはさらにそのリガンドＨＧＦの本来の接着を阻害することができ、かつ／または該ｃ−Ｍｅｔのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができ、該抗体はまたｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害することもできる。より詳しくは、該抗体はリガンド依存性およびリガンド非依存性双方のｃ−Ｍｅｔの活性化を阻害することができる。

【0027】

「機能的フラグメントおよび誘導体」とは、本明細書の以降で詳細に定義する。

【0028】

ここで、本発明は天然型の抗体に関連するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境になく、天然源から精製により単離または取得することができた、あるいはまた遺伝子組換えによって、もしくは化学合成によって取得することができたものであり、さらに記載されているように、非天然アミノ酸を含み得るものと理解されるべきである。

【0029】

より詳しくは、本発明の他の態様によれば、抗体（該抗体は配列番号１〜１７および５６〜６１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲから選択される少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含んでなることを特徴とする）、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つが特許請求される。

【0030】

その配列が最適なアライメントの後に配列番号１〜１７および５６〜６１の配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する抗体またはフラグメントもしくは誘導体は等価であり、結果として本発明の一部であるものとして理解されるべきである。

【0031】

ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴにより定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。

【0032】

ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体、鎖型または種が何であれ、可変ドメインを比較するために定義された[Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。このＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置であり、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番の標準境界決定を提供する。ギャップは非占有位置に相当するので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧の中に示され、ドットで区切られる、例えば［８．８．１３］）は極めて重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフで、また、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造で用いられる。

【0033】

３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲがある。本明細書においてＣＤＲとは、場合によって、抗原または抗原を認識するエピトープに対する抗体の親和性により結合を担う大部分のアミノ酸残基を含む、これらの領域のうち１つ、またはこれらの領域のいくつか、さらには全部を示すために用いられる。

【0034】

本発明の意味において、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性のパーセンテージ」とは、最良のアライメント（最適なアライメント）後に得られる、比較する２配列間のヌクレオチドの、または同一のアミノ酸残基のパーセンテージを示すものとし、このパーセンテージは単に統計的なものであり、２つの配列間の違いはランダムに、それらの全長にわたって分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列の比較は、それらを最適な方法でアラインした後にこれらの配列を比較することにより慣行し、この比較はセグメントによるか、または「比較ウィンドウ」により行うことができる。比較のための配列の最適なアライメントは、手作業の他、Smith および Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482],のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman および Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson および Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)の類似性検索法の手段によるか、これらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡあるいはまたＢＬＡＳＴ ＮまたはＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウエア）の手段によって行うことができる。

【0035】

２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、最適な方法でアラインしたこれら２つの配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適なアライメントのための参照配列に対して付加または欠失を含み得る。同一性のパーセンテージは、２配列間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である同一の位置の数を、この同一の位置の数を比較ウィンドウの位置の総数で割り、得られた結果に１００を掛け、これらの２配列間の同一性パーセンテージを得ることにより算出される。

【0036】

例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.htmlのサイトで入手できるＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)を使用することができ、用いるパラメーターはデフォルトで示されているものであり（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、「エクステンションギャップペナルティー」：２；選択されるマトリックスは、例えば、このプログラムにより提案されているマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ ６２」である）、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムにより直接算出される。

【0037】

参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有するアミノ酸配列とは、参照配列に対してある種の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換、末端切断または延長が好ましい。１以上の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合、被置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。ここで「等価なアミノ酸」とは、基本構造のアミノ酸の１つで置換され得るが、対応する抗体の生物活性を実質的に変更しないいずれのアミノ酸も示すことをねらいとし、このようなものは以降で、特に実施例で定義する。これらの等価なアミノ酸は、それらに代わるアミノ酸との構造的相同性か、または実施可能な異なる抗体間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかによって決定することができる。

【0038】

例として、対応する改変抗体の生物活性の著しい改変を生じさせることなく実施可能な置換の可能性が挙げられる。

【0039】

非限定例として、以下の表１は、改変抗体の生物活性が保存される、考えられ得る置換の可能性を示す。もちろん、同じ条件で逆の置換も可能である。

【0040】

【表1】

【0041】

ここで、本発明は、天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境になく、天然源から精製により単離または取得することができた、あるいはまた遺伝子組換えによって、もしくは化学合成によって取得することができたものであり、さらに記載されているように、非天然アミノ酸を含み得るものと理解されるべきである。

【0042】

第一のアプローチでは、抗体はその重鎖配列により定義される。より詳しくは、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、配列番号１〜９および５６〜５８のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲから少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含むことを特徴とする。

【0043】

挙げられる配列は以下のものである。

【化1】

【0044】

重鎖のＣＤＲは、前記配列、すなわち、配列番号１〜９および５６〜５８の中で無作為に選択することができる。

【0045】

好ましい態様によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号１、４、７または５６のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２、５、８または５７のミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３、６、９または５８のアミノ酸配列を含んでなる）
から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含んでなる。

【0046】

前記態様の第一の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号１のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなる。

【0047】

より詳しくは、この第一の実施形態によれば、前記抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含んでなる。

【化2】

【0048】

前記態様の第二の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなる。

【0049】

前記第二の実施形態の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、好ましくは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含んでなる。

【化3】

【0050】

前記態様の第三の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号７のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号８のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなる。

【0051】

前記第三の実施形態の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含んでなる。

【化4】

【0052】

前記態様の第四の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号５６のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５７のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５８のアミノ酸配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなる。

【0053】

前記第四の実施形態の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、好ましくは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含んでなる。

【化5】

【0054】

第二のアプローチでは、抗体は以下にその軽鎖配列により定義される。より詳しくは、本発明の第二の特定の態様によれば、抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、配列番号１０〜１７および５９〜６１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。

【0055】

挙げられる配列は以下のものである。

【化6】

【0056】

軽鎖のＣＤＲは、前記配列、すなわち、配列番号１０〜１７および５９〜６１の中で無作為に選択することができる。

【0057】

もう１つの好ましい態様によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲ（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１０、１３、１５または５９のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１１、１６または６０のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号１２、１４、１７または６１のアミノ酸配列を含んでなる）
を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0058】

前記のもう１つの態様の第一の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなる）を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0059】

より詳しくは、この第一の実施形態の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖を含んでなる。

【化7】

【0060】

前記のもう１つの態様の第二の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号１４のアミノ酸配列を含む）を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0061】

前記第二の実施形態の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、好ましくは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖を含んでなる。

【化8】

【0062】

前記のもう１つの態様の第三の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３配列番号１７のアミノ酸配列を含む）を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0063】

前記第三の実施形態の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、好ましくは、配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖を含んでなる。

【化9】

【0064】

前記のもう１つの態様の第四の実施形態によれば、本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６１のアミノ酸配列を含む）を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0065】

前記第三の実施形態の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、好ましくは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖を含んでなる。

【化10】

【0066】

第三のアプローチによれば、抗体は以下、その軽鎖配列とその重鎖配列の双方によって定義される。本発明の抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、配列番号１８、１９、２０または６２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号２１、２２、２３または６３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。

【0067】

より詳しくは、本発明の、２２４Ｇ１１と呼ばれる、好ましい抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、それぞれ配列番号１０、１１および１２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0068】

もう１つの態様において、抗体２２４Ｇ１１は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなる重鎖と配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0069】

本発明の、２２７Ｈ１と呼ばれるもう１つの好ましい抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、それぞれ配列番号１３、１１および１４のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0070】

もう１つの態様において、抗体２２７Ｈ１は、配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0071】

２２３Ｃ４と呼ばれる、さらにもう１つの好ましい抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、それぞれ配列番号７、８および９のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、それぞれ配列番号１５、１６および１７のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0072】

もう１つの態様において、抗体２２３Ｃ４は、配列番号２０のアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0073】

１１Ｅ１と呼ばれる、さらにもう１つの好ましい抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、それぞれ配列番号５６、５７および５８を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、それぞれ配列番号５９、６０および６１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0074】

もう１つの態様において、抗体１１Ｅ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖と、配列番号６３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0075】

もう１つの態様によれば、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌することができるネズミハイブリドーマ、特に、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, National Collection of Microorganism Cultures) (Institut Pasteur, Paris, France)に寄託されたようなネズミ起源のハイブリドーマに関する。

【0076】

本発明のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＣＮＣＭに、２００７年３月１４日にＣＮＣＭ Ｉ−３７２４（１１Ｅ１に相当）、Ｉ−３７３１（２２４Ｇ１１に相当）、Ｉ−３７３２（２２７Ｈ１に相当）として、また、２００７年７月６日にＩ−３７８６（２２３Ｃ４に相当）として寄託されたハイブリドーマにより分泌される。これらのハイブリドーマは、免疫マウス脾細胞と骨髄腫細胞系統（Ｓｐ２０ Ａｇ１４）との細胞融合から得られるネズミハイブリドーマからなる。

【0077】

以下の表２は、好ましい抗体に関する要素を再分類したものである。

【0078】

【表2】

【0079】

表２から、抗体２２７Ｈ１と２２４Ｇ１１のＣＤＲ−Ｌ２が類似していることが明らかである。この例は、記載されているＣＤＲ配列から無作為に選択された少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体を含んでなる本願の特許請求の範囲を明らかに裏付ける。

【0080】

好ましい実施形態によれば、本発明はモノクローナル抗体に関する。

【0081】

「モノクローナル抗体」とは、その通常の意味に従い、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を表して用いられ、すなわち、この集団に含まれる個々の抗体は、微量で存在し得る自然に起こる潜在的突然変異以外は同じである。言い換えれば、モノクローナル抗体は、細胞の単一のクローン（例えば、ハイブリドーマ細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡで形質転換された原核生物宿主細胞など）の増殖から得られ、一般に、単一のクラスおよびサブクラスの重鎖と単一のタイプの軽鎖を特徴とする均質な抗体からなる。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原に向けられる。さらに、異なる決定基またはエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。

【0082】

本明細書において、抗体化合物またはそれらの配列と結合したポリペプチド、ポリペプチド配列、アミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質という用語は互換的である。

【0083】

同様の特定の態様によれば、本発明は、抗体がマウスとは異種、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域をさらに含むこと、好ましい様式では、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域がそれぞれκおよびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とする、本発明によるキメラ抗体またはその機能的フラグメントの１つに関する。

【0084】

本願において、ＩｇＧ１はエフェクター機能、最も好ましくはＡＤＣＣおよびＣＤＣを得ていることが好ましい。

【0085】

当業者ならば、エフェクター機能が、例えば、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）；食作用；および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションを含むことを認識しているであろう。

【0086】

本発明の抗体は、好ましくは、特異的モノクローナル抗体、特に、ネズミ、キメラまたはヒト化起源のものであり、これらは当業者に周知の標準法に従って得ることができる。

【0087】

一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体、特にネズミ起源のものの作製に関しては、手引き書"Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術またはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)により記載されているハイブリドーマからの作製技術を参照することができる。

【0088】

本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、本発明によるモノクローナル抗体により特異的に認識されるエピトープを含むｃ−Ｍｅｔまたはそのフラグメントの１つに対して免疫された動物細胞から得ることができる。該ｃ−Ｍｅｔまたはそのフラグメントの１つは、特に、ｃ−ＭｅｔをコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列で出発する遺伝子組換えによる、またはｃ−Ｍｅｔのペプチド配列に含まれるアミノ酸配列から出発するペプチド合成による、通常の研究法に従って作製することができる。

【0089】

本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、本発明によるモノクローナル抗体により特異的に認識されるエピトープを含むｃ−Ｍｅｔまたはそのフラグメントの１つが予め固定化されたアフィニティーカラムで精製することができる。より詳しくは、該モノクローナル抗体は、Ａタンパク質および／またはＧタンパク質でのクロマトグラフィーにより、その後に残留タンパク質夾雑物ならびにＤＮＡおよびＬＰＳを除去することを目的とするイオン交換クロマトグラフィー（それ自体の後に二量体または他の多量体の存在による潜在的凝集物を除去するためにセファロース（商標）ゲルで排除クロマトグラフィーを行う、または行わない）を行って、または行わずに精製することができる。いっそうより好ましい様式では、これらの技術を全て同時に、または連続的に用いることができる。

【0090】

キメラまたはヒト化抗体もまた本発明による抗体に含まれる。

【0091】

キメラ抗体とは、所定の種の抗体に由来する天然可変（軽鎖および重鎖）領域を、該所定の種とは異種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリなど）の抗体の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含む抗体を示すものとする。

【0092】

本発明によるキメラ型の抗体またはそれらのフラグメントは、遺伝子組換えの技術を用いることで作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒト、特にネズミ、モノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより作製することができる。このような組換え遺伝子によりコードされている本発明のキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はネズミＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのイソ型はヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。キメラ抗体の作製方法に関しては、例えば、Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)、Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984)または米国特許第４，８１６，５６７号の文献を参照することができる。

【0093】

ヒト化抗体とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、この抗体分子の他の部分は１つの（またはいくつかの）ヒト抗体に由来する抗体を示すものとする。さらに、骨格（ＦＲと呼ばれる）のセグメントのいくつかの残基は、結合の親和性を保存するよう改変することができる(Jones et al., Nature, 321 :522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。

【0094】

本発明のヒト化抗体またはそれらのフラグメントは、当業者に既知の技術（例えば、Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992;またはBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992）の文献に記載されているものなど）によって作製することができる。

【0095】

例えば、Protein Design Lab (PDL)によりＥＰ０４５１２６１、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９１２７、ＥＰ０５６６６４７または米国特許第５，５３０，１０１号、同第６，１８０，３７０号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号に記載されている「ＣＤＲグラフト」法など、他のヒト化法も知られている。次の特許出願も挙げられる：米国特許第５，６３９，６４１号、同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号。

【0096】

本発明による抗体の「機能的フラグメント」とは、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは、単鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディー、またはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）_２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」は、ポリ（エチレン）グリコールを表す）などのポリ（アルキレン）グリコールの付加などの化学修飾により、またはリポソームへの封入によりその半減期が延長されているいずれかのフラグメントといった抗体フラグメントを示すものとし、該フラグメントは、特にｃ−Ｍｅｔを認識し、それと結合する能力および必要であれば、ｃ−Ｍｅｔの活性を阻害する能力など、それが由来している抗体の活性を部分的にでも、一般的な様式で発揮し得るという点で、本発明の配列番号１〜１７および５６〜６１の配列の特徴的なＣＤＲを少なくとも１つ有する。

【0097】

好ましくは、該機能的フラグメントは、それらが由来している抗体の軽鎖または重鎖の可変の部分的配列で構成され、またはそれを含み、該部分的配列は、それが由来している抗体と同じ結合特異性と、ｃ−Ｍｅｔに対して、好ましくは、それが由来している抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０に相当する十分な親和性を保持するに十分なものである。このような機能的フラグメントは、それが由来している抗体の配列の最低５個のアミノ酸、好ましくは、６、７、８、９、１０、１２、１５、２５、５０および１００個の連続するアミノ酸を含む。

【0098】

好ましくは、これらの機能的フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型またはダイアボディーのフラグメントであり、一般に、それが由来している抗体と同じ結合特異性を有する。本発明のより好ましい実施形態では、これらのフラグメントはＦ（ａｂ’）_２フラグメントなどの二価フラグメントの中から選択される。本発明によれば、本発明の抗体フラグメントは、上記のものなどの抗体から出発して、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化および／または化学的還元によるジスルフィド橋の切断によるなどの方法によって得ることができる。別の様式では、本発明に含まれる抗体フラグメントは、また、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって、あるいはまた例えば、Applied Biosystems社により供給されているものなどの自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成によって得ることができる。

【0099】

「二価フラグメント」とは、２本の腕を含んでなる任意の抗体フラグメント、より詳しくはＦ（ａｂ’）_２フラグメントと理解すべきである。

【0100】

より詳しくは、本発明は、本発明の抗体またはそれらの機能的フラグメント、特に、遺伝子組換えまたは化学合成により得られたキメラまたはヒト化抗体を含む。

【0101】

本発明の抗体の「誘導体」とは、タンパク質スキャフォールドと、その結合能を維持するために、元の抗体から選択された少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる結合タンパク質を意味する。このような化合物は当業者によく知られており、本明細書の以下でより詳しく記載する。

【0102】

より詳しくは、本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、該誘導体が、元の抗体のパラトピックな(paratopic)認識特性を保存するために少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされたスキャフォールドを含む結合タンパク質からなることを特徴とする。

【0103】

本発明に記載される６つのＣＤＲ配列のうち１つまたは数個をタンパク質スキャフォールド上に提供することができる。この場合、タンパク質スキャフォールドは、グラフトされたＣＤＲの適切な折りたたみを用いてタンパク質主鎖を再生産し、これによりそれ（またはそれら）がそれらの抗原パラトピック認識特性を維持できるようになる。

【0104】

当業者であれば、元の抗体から選択された少なくとも１つのＣＤＲがグラフト可能なタンパク質スキャフォールドを選択することができる。より詳しくは、選択されるこのようなスキャフォールドが次のようないくつかの特徴を示すべきであることが知られている(Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187)。
・系統発生的に良好な保存
・周知の三次元分子組織を有する堅牢な構造（例えば、結晶学またはＮＭＲ）
・小型
・翻訳後修飾が全く無いか、程度が低いこと
・生産、発現および精製が容易であること

【0105】

このようなタンパク質スキャフォールドとしては、限定されるものではないが、フィブロネクチン、好ましくは、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮｆｎ１０）、リポカリン、アンチカリン(Skerra A., J. Biotechnol, 2001, 74(4):257-75)、ブドウ球菌Ａタンパク質のドメインＢからのＺタンパク質誘導体、チオレドキシンＡまたは「アンキリンリピート」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」または「テトラトリコペプチドリピート」などのリピートドメインを有するいずれかのタンパク質からなる群から選択される構造である。

【0106】

また、毒素（例えば、サソリ、昆虫、植物または軟体動物毒素など）または神経一酸化窒素合成酵素（ＰＩＮ）のタンパク質阻害剤に由来するスキャフォールド誘導体も挙げられる。

【0107】

このようなハイブリッド構築の非限定例として、抗ＣＤ４抗体、すなわち、１３Ｂ８．２抗体のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）の、ＰＩＮの露出ループの１つへの挿入が挙げられる。得られた結合タンパク質の結合特性は、元の抗体と依然として類似したままである(Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344)。また、抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）の、ネオカルジノスタチンのループへのグラフトも挙げられる(Nicaise et al., 2004)。

【0108】

本発明の場合、保存のために着目されるＣＤＲは、限定されるものではないが、ＣＤＲ−Ｌ２であり、それはこれが同定されている本発明の２つの抗体、すなわち、２２７Ｈ１および２２４Ｇ１１で保存されているからである。

【0109】

上述のように、このようなタンパク質スキャフォールドは元の抗体に由来する１〜６のＣＤＲを含むことができる。好ましい実施形態では、限定されるものではないが、当業者ならば重鎖から少なくとも１つのＣＤＲを選択することができる（重鎖は特に抗体特異性に関連することが知られている）。着目するＣＤＲの選択は当業者には既知の方法を用いて明らかになる(BES et al, FEBS letters 508, 2001, 67-74)。

【0110】

１つの証拠として、これらの例は非限定的なものであり、既知または記載されている他のスキャフォールドを本明細書に含めなければならない。

【0111】

新規な態様によれば、本発明は、次の核酸：
ａ）本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）
・配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６の配列ならびに配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５の配列を含んでなる核酸配列；
・配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９の配列ならびに配列番号３６、配列番号３４および配列番号３７の配列を含んでなる核酸配列；
・配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２の配列ならびに配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０の配列を含んでなる核酸配列；
・配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６の配列ならびに配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９の配列を含んでなる核酸配列
からなる配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｃ）
・配列番号４１および配列番号４４の配列を含んでなる核酸配列；
・配列番号４２および配列番号４５の配列を含んでなる核酸配列；
・配列番号４３および配列番号４６の配列を含んでなる核酸配列；
・配列番号７０および配列番号７１の配列を含んでなる核酸配列
からなる配列群から選択されるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｄ）ｂ）またはｃ）で定義された核酸の対応するＲＮＡ核酸；
ｅ）ａ）、ｂ）およびｃ）で定義された核酸の相補的核酸；ならびに
ｆ）高ストリンジェント条件下で配列番号２４〜４０および６４〜６９の配列の少なくとも１つのＣＤＲとハイブリダイズすることができる少なくとも１８のヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする、単離された核酸に関する。

【0112】

核酸、核酸配列(nucleic or nucleic acid sequence)、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列とは、本明細書において違いなく用いられ、ヌクレオチドの正確な結合を示すものとし、これらは修飾または非修飾型であり、核酸のフラグメントまたは領域の定義を可能とし、非天然ヌクレオチドを含有または含有せず、二本鎖ＤＮＡＭの場合と同様に、該ＤＮＡの転写産物については一本鎖ＤＮＡに相当し得る。

【0113】

ここでまた、本発明はそれらの天然の染色体環境、すなわち自然状態のヌクレオチド配列に関するものではないと理解されなければならない。本発明は単離および／または精製された配列に関するものであり、すなわち、それらは、少なくとも部分的に改変されたそれらの環境から、例えばコピーによって直接的または間接的に選択されたものである。従って、ここでもまた、例えば宿主細胞の手段による遺伝子組換えによって得られた、または化学合成によって得られた、単離された核酸を示すものとする。

【0114】

高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションとは、２つの相補的ＤＮＡフラグメント間のハイブリダイゼーションを維持させるように温度条件およびイオン強度条件が選択されることを意味する。例としては、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義するための高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション工程の条件は以下のものが有利である。

【0115】

ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブサイズに応じた温度（すなわち、プローブサイズ＞１００ヌクレオチドの場合は４２℃）で２０時間の本ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄１回、という二段階で行う。最後の洗浄は、プローブサイズ＞１００ヌクレオチドの場合は６０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で行う。定義されたサイズのポリヌクレオチドに関する上記の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当業者ならば、Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の教示に従って、より大きな、または小さなサイズのオリゴヌクレオチドに適合させることができる。

【0116】

本発明はまた、本発明による核酸を含んでなるベクターに関する。

【0117】

本発明は、特に、本発明によるヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを目的とする。

【0118】

本発明のベクターは好ましくは、所定の宿主細胞でのヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とする要素を含む。従って、ベクターはプロモーター、翻訳の開始および終結シグナル、ならびに転写調節の適当な領域を含む。ベクターは宿主細胞で安定に維持できなければならず、所望により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを有することができる。これらの種々の要素は、当業者により、用いる宿主細胞に対して選択および至適化される。この趣意で、本発明のヌクレオチド配列は選択された宿主の自己複製ベクターまたは選択された宿主の組込型ベクターに挿入することができる。

【0119】

このようなベクターは当業者により現在用いられている方法で作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学的方法などの標準的な方法によって適当な宿主に導入することができる。

【0120】

本発明によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは、本発明のヌクレオチド配列のクローニングまたは発現のために宿主細胞を形質転換するのに有用である。

【0121】

本発明はまた、本発明によるベクターにより形質転換された、または本発明によるベクターを含む宿主細胞を含む。

【0122】

宿主細胞は原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞、あるいはまた酵母細胞もしくは動物細胞、特に、哺乳類細胞から選択することができる。また、昆虫細胞または植物細胞を用いることもできる。

【0123】

本発明はまた、本発明に従って形質転換された少なくとも１つの細胞を含む、ヒト以外の動物に関する。

【0124】

別の態様によれば、本発明の対象は、本発明による抗体またはその機能的フラグメントの１つの製造方法であって、
ａ）本発明による宿主細胞の、培地および適当な培養条件での培養；および
ｂ）培養培地または該培養細胞から出発する、このようにして得られた該抗体またはそれらの機能的フラグメントの１つの回収
を含んでなることを特徴とする方法である。

【0125】

本発明に従って形質転換された細胞は、本発明による組換えポリペプチドの製造方法で使用可能である。本発明によるベクターおよび／またはベクターで形質転換された細胞を用いることを特徴とする、本発明によるポリペプチドの組換え型での製造方法は、それら自体本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターにより形質転換された細胞は、該ポリペプチドおよび該組換えペプチドの発現を可能とする条件下で培養され、回収される。

【0126】

既に述べたように、宿主細胞は原核生物系または真核生物系から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系で分泌を促進する本発明によるヌクレオチド配列を同定することができる。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌を意図した組換えタンパク質の生産のために有利に使用することができる。実際、これらの目的組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部よりもむしろ細胞培養の上清中に存在するという事実により促進される。

【0127】

また、化学合成によって本発明によるポリペプチドを製造することもできる。このような製造方法もまた本発明の課題である。当業者ならば、例えば、固相を用いる技術[Steward et al, 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)]、または部分的固相を用いる技術、または溶液中でのフラグメントの縮合によるか、もしくは化学合成による技術など、化学合成法を知っている。化学合成によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた本発明に含まれる。

【0128】

本発明によるプロセスによって得ることができる抗体またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の１つもまた本発明に含まれる。

【0129】

本発明はまた、薬剤としての本発明の抗体に関する。

【0130】

本発明はまた、好ましくは賦形剤および／または薬学上許容されるビヒクルと混合した、本発明による抗体またはその機能的フラグメントの１つからなる化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物に関する。

【0131】

本発明のもう１つの補足的実施形態は、同時、個別または逐次使用のための組合せ物として抗腫瘍抗体をさらに含んでなる、上記のような組成物からなる。

【0132】

最も好ましくは、該第二の抗腫瘍抗体は、抗ＩＧＦ−ＩＲ、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦなどの抗体、または当業者に知られている他の抗腫瘍抗体から選択することができる。上述の抗体の機能的フラグメントもしくは誘導体の、第二の抗体としての使用も本発明の一部であることは明らかである。

【0133】

最も好ましい抗体として、例えば抗体Ｃ２２５(Erbitux)などの抗ＥＧＦＲ抗体が選択される。

【0134】

「同時使用」とは、本発明による組成物の２種類の成分を単一かつ同一の剤形で投与することを意味するものと理解される。

【0135】

「個別使用」とは、本発明による組成物の２種類の成分を異なる剤形で同時に投与することを意味するものと理解される。

【0136】

「逐次使用」とは、本発明による組成物の２種類の成分をそれぞれ異なる剤形で順次投与することを意味するものと理解される。

【0137】

一般的な様式では、本発明による組成物は癌処置の有効性を著しく高める。言い換えれば、本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の治療効果は、細胞傷害性薬剤の投与により予期されない方法で増強される。本発明の組成物によりもたらされる、それに次ぐもう１つの主要な利点は、有効成分のより低い有効用量での使用の可能性に関するものであり、これにより、副作用、特に細胞傷害性薬の作用の出現リスクが回避または軽減される。

【0138】

さらに、本発明による組成物により、予期される治療効果がより迅速に得られる。

【0139】

本発明による組成物はまた、同時、個別または逐次使用用の組合せ物として細胞傷害性／細胞増殖抑制性剤をさらに含むことを特徴とし得る。

【0140】

「抗癌治療薬」または「細胞傷害性／細胞増殖抑制剤」とは、対象に投与した際に対象の身体において癌の発達を治療または予防する物質が意図される。このような薬剤の非限定例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗脈管形成剤、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン薬または免疫調節剤が挙げられる。

【0141】

このような薬剤は、例えば、ＶＩＤＡＬの２００１版の、癌学および血液学の「細胞傷害性」の欄に付属している化合物に当てられた頁に挙げられており、この文献に参照として引用されているこれらの細胞傷害性化合物が本明細書において好ましい細胞傷害性薬剤として挙げられる。

【0142】

より詳しくは、本発明では次の薬剤が好ましい。

【0143】

「アルキル化剤」とは、細胞内でいずれかの分子、好ましくは核酸（例えばＤＮＡ）を架橋またはアルキル化することができるいずれの物質も指す。アルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブコル(chlorambucol)、メルファレン(melphalen)、クロリドレート(chlorydrate)、ピポブロメン(pipobromen)、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウム(disodic-phosphate)またはエストラムスチンなどのナイトロジェンマスタード；シクロホスファミド、アルトレタミン、トロフォスファミド、スルホホスファミドまたはイフォスファミドなどのオキサゾホリン(oxazophorins)；チオテパ、トリエチレンアミンまたはアルテトラミン(altetramine)などのアジリジンまたはイミン−エチレン；カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン(fotemustin)またはロムスチンなどのニトロソ尿素；ブスルファン、トレオスルファンまたはインプロスルファンなどのスルホン酸アルキル；ダカルバジンなどのトリアゼン；またはシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金錯体が挙げられる。

【0144】

「代謝拮抗剤」とは、ある種の活性、通常はＤＮＡ合成を妨げることにより細胞の成長および／または代謝を遮断する物質を指す。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデスオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシンおよびペントスタチンが挙げられる。

【0145】

「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の合成を回避または阻害し得る化合物を指す。抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびプロカルバジンが挙げられる。

【0146】

「有糸分裂阻害剤」は、細胞周期および有糸分裂の正常な進行を妨げる。一般に、微小管阻害剤またはパクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキソイドは有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイドも有糸分裂を阻害することができる。

【0147】

「クロマチン機能阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」とは、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩなどの、クロマチンモデリングタンパク質の正常な機能を阻害する物質を指す。クロマチン機能阻害剤としては、トポイソメラーゼＩについては、カンプトテシンおよびその誘導体（トポテカンまたはイリノテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩについては、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。

【0148】

「抗脈管形成剤」とは、血管の成長を阻害する薬物、化合物、物質または薬剤を指す。抗脈管形成剤の例としては、限定されるものではないが、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチンおよびビタキシンが挙げられる。

【0149】

「抗エストロゲン」または「抗エストロゲン作用薬」とは、エストロゲンの作用を低下させる、エストロゲンの作用に拮抗する、またはエストロゲンの作用を阻害するいずれの物質も指す。抗エストロゲン薬の例としては、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタンが挙げられる。

【0150】

「抗アンドロゲン」または「抗アンドロゲン作用薬」とは、アンドロゲンの作用を低下させる、アンドロゲンの作用に拮抗する、またはアンドロゲンの作用を阻害するいずれの物質も指す。抗アンドロゲン作用薬の例としては、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリドおよびシミチジン(cimitidine)が挙げられる。

【0151】

「免疫調節剤」とは、免疫系を刺激する物質である。
免疫調節剤の例としては、インターフェロン、インターロイキン（アルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフリトックス(denileukin diflitox)およびインターロイキン−２など）、腫瘍壊死因子（タソネルミンなど）または他の免疫調節剤（レンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃまたはレバミゾールと５−フルオロウラシルとの組合せなど）が挙げられる。

【0152】

より詳しくは、当業者ならば、"Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique"により編集され、"traite de chimie therapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans Ie traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003"と題された手引き書を参照することができる。

【0153】

また、化学薬剤または細胞傷害性薬剤としては、例えばゲフィチニブまたはエルロチニブなど、全てのキナーゼ阻害剤を挙げることができる。

【0154】

特に好ましい実施形態では、本発明による組合せ物としての該組成物は、該細胞傷害性薬剤が前記抗体と同時使用のために化学的にカップリングされることを特徴とする。

【0155】

該細胞傷害性薬剤と本発明による抗体とのカップリングを促進させるために、特に、ポリエチレングリコールのようなポリ（アルキレン）グリコール、あるいはまたアミノ酸などのカップリングさせる２つの化合物間にスペーサー分子を導入することができ、あるいは別の実施形態では、本発明による抗体と反応し得る官能基が導入された該細胞傷害性薬剤の活性な誘導体を使用することができる。これらのカップリング技術は当業者によく知られており、本明細書では展開しない。

【0156】

本発明は、別の態様において、少なくとも前記の抗体またはそれらの機能的フラグメントもしくは誘導体の１つのうちの１つが細胞毒素および／または放射性元素とコンジュゲートされていることを特徴とする組成物に関する。

【0157】

好ましくは、該毒素または放射性元素は、ｃ−Ｍｅｔを発現する細胞の少なくとも１つの細胞活性を阻害することができ、より好ましくは、該細胞の成長または増殖を妨げることができる、特に該細胞を完全に不活性化することができる。

【0158】

好ましくは、該毒素はまた、腸内細菌毒素、特に、シュードモナス外毒素Ａである。

【0159】

好ましくは、治療に用いる抗体とコンジュゲートされる放射性元素（または放射性同位元素）は、γ線を放射する放射性同位元素、好ましくは、ヨウ素^１３１、イットリウム^９０、金^１９９、パラジウム^１００、銅^６７、ビスマス^２１７およびアンチモン^２１１である。β線およびα線を放射する放射性同位元素も同様に治療に使用することができる。

【0160】

本発明による抗体またはその機能的フラグメントの１つのうち少なくとも１つとコンジュゲートされた毒素または放射性元素とは、該毒素または放射性元素と該少なくとも１つの抗体との結合を、特に、連結分子を用い、または用いずに、これら２つの化合物間の共有結合により可能とするいずれの手段も示すものとする。

【0161】

このコンジュゲートの成分の総てまたは一部の、化学的（共有結合的）、静電気的または非共有結合的様式における結合を可能とする薬剤としては、特に、ベンゾキノン、カルボジイミドおよびより詳しくは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチル−アミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ−アセテート（ＳＡＴＡ）、紫外線（Ｕ．Ｖ．）と反応する１以上のフェニルアジド基を有する架橋剤、好ましくは、Ｎ−［−４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミド−イル（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が挙げられる。

【0162】

特に放射性元素のためのもう１つのカップリング形態は、二官能性イオンキレート剤の使用からなり得る。

【0163】

これらのキレートのうち、金属、特に放射性金属、および免疫グロブリンを結合するために開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）に由来するキレートを挙げることができる。よって、ＤＴＰＡおよびその誘導体は、リガンド−金属錯体の安定性および堅牢性を高めるために炭素鎖上で種々の基により置換することができる(Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991);米国特許第４，８３１，１７５号)。

【0164】

例えば、医療および生物学において長い間、それらの遊離形態かまたは金属イオンとの錯体の形態のいずれかで広く使用されてきたジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびその誘導体は、金属イオンと安定なキレートを形成し、癌治療における放射性免疫複合体の開発のための抗体などの治療上または診断上重要なタンパク質とカップリングされるという注目すべき特徴を有する(Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990))。

【0165】

また、好ましくは、本発明による該コンジュゲートを形成する少なくとも１つの抗体は、その機能的フラグメント、特に、ｓｃＦｖフラグメントなどのそれらのＦｃ成分の切断されたフラグメントから選択される。

【0166】

すでに述べたように、本発明の好ましい実施形態では、該細胞傷害性／細胞増殖抑制剤または該毒素および／または放射性元素は、同時使用のための組成物の少なくとも１つの要素と化学的にカップリングされる。

【0167】

本発明は、記載されている組成物を薬剤として含んでなる。

【0168】

本発明はさらに、薬剤の製造のための本発明による組成物の使用を含んでなる。

【0169】

別の態様において、本発明は、腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害を意図した薬剤の製造のための、上記のような抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つおよび／または組成物の使用に関する。

【0170】

本発明の別の態様は、癌の予防または治療を意図した薬剤の製造のための、上記のような抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つおよび／または組成物の使用または上述の使用からなる。

【0171】

本発明にはまた、患者における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害することを意図した方法であって、それを必要とする患者に本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つ、本発明によるハイブリドーマによって生産された抗体または本発明による組成物を投与することを含んでなる方法を含む。

【0172】

本発明はさらに、必要とする患者における癌の予防または治療のための方法であって、患者に本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つ、本発明によるハイブリドーマによって生産された抗体または本発明による組成物を投与することを含んでなる方法を含む。

【0173】

特定の好ましい態様において、該癌は前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、膠芽腫または結腸癌から選択される癌である。

【0174】

以上で説明したように、本発明の利点は、ＨＧＦ依存性および非依存性のＭｅｔ活性化関連癌の処置を可能とすることである。

【0175】

本発明は、さらにもう１つの態様において、ｃ−Ｍｅｔ受容体の異常な存在が疑われる生体サンプルから出発する、ｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過少発現により誘発される疾病のin vitro診断法を包含し、この方法は該生体サンプルを本発明の抗体と接触させる工程を含み、該抗体を必要に応じて標識することができることを特徴とする。

【0176】

好ましくは、該診断法におけるｃ−Ｍｅｔ受容体の異常な存在に関連する疾病は癌である。

【0177】

該抗体またはその機能的フラグメントの１つは、検出可能かつ／または定量可能なシグナルを得るために免疫複合体または標識抗体の形態で存在することができる。

【0178】

本発明による標識された抗体またはそれらの機能的フラグメントとしては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼもしくはグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素と、またはビオチン、ジゴキシゲニンもしくは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子によりコンジュゲートさせることができる免疫複合体と呼ばれる抗体が挙げられる。蛍光標識もまた、本発明による抗体またはそれらの機能的フラグメントとコンジュゲートさせることができ、特に、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミンおよびその誘導体、ＧＦＰ（ＧＦＰとは「緑色蛍光タンパク質」）、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。このようなコンジュゲートでは、本発明による抗体またはそれらの機能的フラグメントは、当業者に既知の方法により製造することができる。それらは酵素または蛍光標識と直接、またはスペーサー基もしくはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）などの架橋基の介在により、または治療用コンジュゲートに関して上述したものなどのカップリング剤の存在下でカップリングさせることができる。フルオレセイン型の標識を含有するコンジュゲートはイソチオシアネートとの反応により製造することができる。

【0179】

他のコンジュゲートとしてはまた、ルミノールおよびジオキセタンなどの化学発光標識、ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物発光標識、あるいはまたヨウ素^１２３、ヨウ素^１２５、ヨウ素^１２６、ヨウ素^１３３、臭素^７７、テクネチウム^９９ｍ、インジウム^１１１、インジウム^１１３ｍ、ガリウム^６７、ガリウム^６８、ルテニウム^９５、ルテニウム^９７、ルテニウム^１０３、ルテニウム^１０５、水銀^１０７、水銀^２０３、レニウム^９９ｍ、レニウム^１０１、レニウム^１０５、スカンジウム^４７、テルル^１２１ｍ、テルル^１２２ｍ、テルル^１２５ｍ、ツリウム^１６５、ツリウム^１６７、ツリウム^１６８、フッ素^１８、イットリウム^１９９、ヨウ素^１３１などの放射性標識が挙げられる。治療用放射性同位元素を抗体と直接または上述のＥＤＴＡ、ＤＴＰＡなどのキレート剤を介してカップリングさせるために存在する当業者に既知の方法は、診断において使用可能な放射性元素に関しても使用可能である。また、クロラミンＴ法[Hunter W.M. and Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495]によるＮａ［Ｉ^１２５］を用いた標識、あるいはまたCrockford et al.（米国特許第４，４２４，２００号）によるテクネチウム^９９ｍを用いた標識またはHnatowich（米国特許第４，４７９，９３０号）により記載されているＤＴＰＡを介した結合を挙げることができる。

【0180】

よって、本発明による抗体またはそれらの機能的フラグメントは、生体サンプルにおけるｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過少発現、好ましくは過剰発現の検出および／または定量のためのプロセスで使用することができ、このプロセスは、
ａ）生体サンプルを本発明による抗体またはその機能的フラグメントの１つと接触させる工程；および
ｂ）形成され得るｃ−Ｍｅｔ／抗体複合体を示す工程
を含む。

【0181】

特定の実施形態では、本発明による抗体またはそれらの機能的フラグメントは、ｃ−Ｍｅｔ依存性癌の予防的処置および／または治療的処置の有効性のモニタリングのために、生体サンプルにおいてｃ−Ｍｅｔ受容体を検出および／または定量するためのプロセスにおいて使用することができる。

【0182】

より一般には、本発明による抗体またはそれらの機能的フラグメントは有利にも、ｃ−Ｍｅｔ−受容体の発現が定性的および／または定量的に観察されなければならない状況で使用することができる。

【0183】

好ましくは、生体サンプルはヒト起源の血清、全血、細胞、組織サンプルまたは生検などの体液からなる。

【0184】

このような検出および／または投与を行うために、いずれの手順または慣例の試験を用いてもよい。該試験は競合もしくはサンドイッチ試験、または抗体−抗原型の免疫複合体の形成に依存する当業者に既知のいずれの試験であってもよい。本発明の適用の後、抗体またはその機能的フラグメントの１つ固定化または標識することができる。この固定化は当業者に公知の多くの支持体上で行うことができる。これらの支持体は特に、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンまたは天然もしくは修飾細胞であり得る。これらの支持体は可溶性であっても不溶性であってもよい。

【0185】

例として、好ましい方法は免疫蛍光またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術または等価なものにより、ＥＬＩＳＡに従った免疫酵素法をもたらす。

【0186】

よって、本発明はまた、ｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過少発現により誘発される疾病の診断法を行うため、または生体サンプルにおけるｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過少発現、好ましくは該受容体の過剰発現の検出および／または定量法を行うために必要なキットまたはセットを含んでなり、該キットまたはセットは以下の要素：
ａ）本発明による抗体またはその機能的フラグメントの１つ；
ｂ）場合によって、免疫反応に好適な培地を形成するための試薬；
ｃ）場合によって、免疫反応により生じるｃ−Ｍｅｔ／抗体複合体を示し得る試薬
を含んでなることを特徴とする。

【0187】

本発明の対象は、また、ｃ−Ｍｅｔ受容体を発現または過剰発現する細胞への生物学的に活性な化合物の特異的標的化を意図した薬剤を製造するための、本発明による抗体または組成物の使用である。

【0188】

ここで、生物学的に活性な化合物とは、細胞の活性、特にそれらの成長、それらの増殖、転写または遺伝子翻訳を調節、特に阻害することができるいずれの化合物も示すものとする。

【0189】

本発明の対象はまた、好ましくは標識された、特に放射性標識された本発明による抗体またはその機能的フラグメントの１つを含んでなるイン・ビボ診断試薬、および医療画像法における、特に、細胞によるｃ−Ｍｅｔ受容体の発現または過剰発現に関連する癌の検出のためのその使用である。

【0190】

本発明はまた、組合せ物としての組成物または薬剤としての本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ／毒素コンジュゲートまたは放射性元素に関する。

【0191】

好ましくは、組合せ物としての該組成物または本発明による該コンジュゲートは、賦形剤および／または薬学上許容されるビヒクルと混合される。

【0192】

本記載において、薬学上許容されるビヒクルは、二次反応を引き起こさずに医薬組成物に入れられ、例えば有効化合物の投与の助長、体内でのその寿命の延長および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の上昇、あるいはまたその保存性の向上を可能とする化合物または化合物の組合せを示すものとする。これらの薬学上許容されるビヒクルは周知のものであり、当業者によって、選択された有効化合物の性質および投与様式に関して適したものとされる。

【0193】

好ましくは、これらの化合物は全身経路により、特に、静脈経路、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路により、または経口経路により投与される。より好ましい様式では、該本発明による抗体を含んでなる組成物は、一連の様式で数回投与される。

【0194】

それらの投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、処置に対する耐用性ならびに示されている副作用など、患者に適した処置の確立を全般的に考慮した基準に従って決定することができる。

【0195】

本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面を含む本明細書の続きで明らかとなる。

【実施例】

【0196】

実施例１：ｃ−Ｍｅｔに対する抗体の作製
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を作製するため、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、その原形質膜でｃ−Ｍｅｔを発現するＣＨＯトランスフェクト細胞系統で皮下的に３〜５回（２０×１０^６細胞／用量／マウス）か、あるいは初回免疫ではフロイントの完全アジュバントと、また、追加免疫ではフロイントの不完全アジュバントと混合したｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン融合タンパク質（１０〜１５μｇ／用量／マウス）（R&D Systems、カタログ番号３５８ＭＴ）またはこの組換えタンパク質のフラグメントで２〜３回免役した。マウスにＣＨＯ−ｃＭｅｔ細胞と組換えタンパク質の双方を施した混合プロトコールも行った。細胞融合の３日前に、組換えタンパク質またはフラグメントでｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．にてマウスに追加免疫を行った。

【0197】

次に、マウスの脾臓を採取し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と融合させ、ＨＡＴ選択を行った。４回の融合を行った。一般に、特にネズミ起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの作製については、特に手引き書"Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術またはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されているハイブリドーマ作製技術を参照することができる。

【0198】

生産された抗体が腫瘍細胞上の天然受容体も認識することができることを確認するため、得られたハイブリドーマをまずｃ−Ｍｅｔ組換えタンパク質に対するＥＬＩＳＡ、その後、Ａ５４９ＮＳＣＬＣ細胞系統、ＢｘＰＣ３膵臓細胞系統およびＵ８７−ＭＧ膠芽腫細胞系統に対するＦＡＣＳ分析によりスクリーニングした（代表的なプロフィールを図１に示した）。これらの２つの試験に対する陽性反応体を増幅し、クローニングし、ハイブリドーマセットを回収、精製し、ＢｘＰＣ３モデルにおいてそのin vitro細胞増殖阻害能をスクリーニングした。

【0199】

そのため、５００００ＢｘＰＣ３細胞を９６ウェルプレートのＲＰＭＩ培地２ｍＭＬ中にプレーティングした。グルタミン、ＳＶＦ不含。プレーティング２４時間後、１００ｎｇ／ｍｌのｈＨＧＦを加える６０分前に、供試抗体を０．００９７〜４０μｇ／ｍｌの終濃度で加えた。３日後、細胞を０．５μＣｉの［^３Ｈ］チミジンで１６時間刺激した。トリクロロ酢酸不溶性ＤＮＡに組み込まれた［^３Ｈ］チミジンの量を液体シンチレーション計数により定量した。結果は各Ｍａｂの内因性アゴニスト効果を真に評価するため、生データとして表した（図２Ａおよび２Ｂ）。

【0200】

次に、細胞増殖を少なくとも５０％阻害する抗体をｃ−Ｍｅｔトランスフェクト細胞に対するＢＲＥＴ分析により上清で評価した。そのため、Ｃ−Ｍｅｔ−ＲｌｕｃまたはＣ−Ｍｅｔ−ＲｌｕｃとＣ−Ｍｅｔ−Ｋ１１００Ａ−ＹＦＰを発現するＣＨＯ安定細胞系統を作製した。ＢＲＥＴ実験の１日または２日前に、細胞を白色９６ウェルマイクロプレートのＤＭＥＭ−Ｆ１２／ＦＢＳ５％培養培地中に分注した。まず、細胞を３７℃、ＣＯ_２ ５％で培養し、細胞をプレートに接着させた。次に、細胞を２００μｌ ＤＭＥＭ／ウェルで一晩飢餓状態にした。実験直前にＤＭＥＭを除去し、すぐに細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中、供試抗体または対照化合物の存在下または不在下、３７℃で１０分間インキュベートした後、ＨＧＦを含む、または含まないセレンテラジンを終容量５０μｌで添加した。３７℃でさらに１０分間インキュベートした後、Ｍｉｔｈｒａｓ照度計(Berthold)（１秒／波長／ウェル、繰り返し１５回）を用い、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍで光放射捕捉を開始した。

【0201】

ＢＲＥＴ比はこれまでに[Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3684-3689]、［（５３０ｎｍでの放射）−（４８５ｎｍでの放射）×Ｃｆ］／（４８５ｎｍでの放射）｛ここで、Ｃｆは、同じ実験条件でＲｌｕｃ融合タンパク質単独を発現する細胞に関する（５３０ｎｍでの放射）／（４８５ｎｍでの放射）に相当する｝として定義されている。この式の簡略化は、これらの２つの相手が存在した場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比を、同じ実験条件下で、アッセイにウミシイタケ(R. reniformis)ルシフェラーゼと融合された相手が存在した場合にのみ得られる５３０／４８５ｎｍ比で補正したものに相当することを示す。読み取りやすいように、結果はミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表し、ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を掛けたものに相当する。

【0202】

この第二のin vitro試験の後、ｉ）増殖の機能的試験において分子全体として内在活性を持たず、ｉｉ）ＢｘＰＣ３増殖を有意に阻害し（図２Ａおよび２Ｂ）、かつｉｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害する（図３）、４つの抗体が選択された。これらのＩｇＧ１κイソ型の３つの抗体を１１Ｅ１、２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４および２２７Ｈ１とした。これらの実験では、Genentechにより作製され、ＡＴＣＣにおいて入手可能な５Ｄ５ Ｍａｂを内在アゴニスト活性の対照として加えた。

【0203】

図２Ａおよび２Ｂは、１１Ｅ１、２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４および２２７Ｈ１が、リガンドの不在下で細胞増殖の用量依存的刺激を誘導した５Ｄ５とは対照的にアゴニスト活性を持たなかった。選択された４つの抗体では、細胞増殖の有意な阻害が見られた。５Ｄ５は本試験で、ＨＧＦにより誘導される細胞増殖に作用を持たなかった。

【0204】

二量体化の遮断に関して評価すると、それぞれ２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４、１１Ｅ１および２２７Ｈ１について二量体化の３２、５５、６９および５２％阻害に達する有意な効果が見られた。

【0205】

実施例２：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体によるタンパク質認識
選択された３つの抗体の認識パターンを特徴付けるため、組換えｃ−Ｍｅｔタンパク質、その単量体フラグメント（組換えｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃタンパク質の切断によって得られる）および組換えＳＥＭＡドメインを用いて３種類のＥＬＩＳＡが設定された。

【0206】

図４に示される結果は、これらの４つの抗体が二量体および単量体双方のタンパク質を認識したことを示した。これらのＥＬＩＳＡを行うため、ヒト二量体ｃ−Ｍｅｔタンパク質（R&D sytems、カタログ番号３５８ＭＴ）を４℃で一晩、ＰＢＳ中０．７μｇ／ｍｌの濃度でコーティングする。プレート（Costarカタログ番号３６９０）を３７℃にて２時間、０．５％ゼラチン溶液で飽和させた後、ハイブリドーマ上清を３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳで１回すすぎ、抗マウスＨＲＰ−抗体（Jackson ImmunoResearch、カタログ番号１１５−０３５−１６４）を各ウェルにＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ中、０．１％ゼラチン／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１／５０００希釈で加え、これらのプレートを３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳで３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ基質(Uptima)を加えることによりペルオキシダーゼの活性を明らかにした。この反応を室温で５分間行わせる。５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液を加えることで反応を停止させ、プレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取る。同様のプロトコールを単量体ｃ−ＭｅｔおよびＳＥＭＡドメインに対しても行ったが、この場合、タンパク質はそれぞれ５および３μｇ／ｍｌでコーティングした。

【0207】

陽性対照として含めた５Ｄ５ Ｍａｂは、予測されたように、ＳＥＭＡタンパク質を認識した。２２４Ｇ１１、２２７Ｈ１および２２３Ｃ４はＳＥＭＡドメインと結合しなかった。１１Ｅ１はＳＥＭＡと結合することができる。

【0208】

双方ともＳＥＭＡドメインを認識する１１Ｅ１および５Ｄ５が重複エピトープをめぐって競合するかどうかを調べるため、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を行った。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、リアルタイムで結合事象をモニタリングすることによる表面プラズモン共鳴現象送受信データに基づくものであった。従って、それはいわゆる「エピトープマッピング」実験で抗体を分類するのに有用である。抗原分子に同時に結合することができない抗体の組は同じ群（同一または隣接する結合部位）に分類される。これに対し、それらの個々の結合部位が両抗体の同時結合を可能とするほど十分離れていれば、これらは２つの異なる群二分類される。このような実験では、抗原は一般にリガンドとして用いられ（センサーチップ上に固定され）、抗体はアナライトとして標識せずに用いられる（液相）。

【0209】

記載されている実験は総て、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ装置(GE Healthcare Europe GmbH)にて行った。マウス抗Ｔａｇ−６Ｈｉｓ Ｍａｂ（R&D System 参照番号ＭＡＢ０５０）により活性化されたＣＭ５センサーチップ(BIAcore)は、アミンカップリングキット(BIAcore)を使用することにより製造業者の説明書に従って作製されたものであった。ランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ）および再生バッファー（グリシン、ＨＣｌ）はBIAcoreから得られる。キメラ分子ｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ−Ｔａｇ Ｈｉｓとして作製された組換え可溶型ヒトＨＧＦ受容体はR&D systems（参照番号３５８−ＭＴ−ＣＦ）から入手した。これらの次件は２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。ランニングバッファー中、ｃ−Ｍｅｔの１０μｇ／ｍｌ溶液をフローセル２（ｆｃ２）に１分注入すると、一般に、２７０ＲＵの可溶型ｃ−Ｍｅｔが捕捉された。フローセル１（ｆｃ１）を、抗体とセンサーチップマトリックスとの非特異的結合を確認するための参照として用いた。

【0210】

供試抗体の連続的注射を行った。抗体を両フローセルに２分間注入した。次に、二次抗体（または同じもの）を同じ条件で注入した。有意な結合が見られなければ、他の抗体の３回目の注入を行った。その後、センサーチップを、再生バッファーを３０秒１回注入することにより再生した。この段階で抗体およびｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃのいずれかを廃棄した。

【0211】

結果の分析：
抗体「Ａ」の、抗体「Ｂ」の結合を遮断する能力を、ＢＩＡ／Ｃ比＝（Ｒ２Ａ／Ｂ／Ｒ１Ｂ）×１００（式中、Ｒ２Ａ／Ｂは、Ｍａｂ「Ａ」に後に注入した場合のＭＡｂ「Ｂ」の結合に相当する応答であり、Ｒ１Ｂは、最初に注入した場合のＭＡｂ「Ｂ」の結合に相当する応答である）により算出する。ＢＩＡ／Ｃが２０％を下回る場合は、ＡがＢの結合を遮断することができ、従って、ＡとＢは近接した結合部位を有することを意味する。

【0212】

２つのＭａｂ、１１Ｅ１と５Ｄ５を用いてエピトープマッピングを行った。

【0213】

【表3】

【0214】

各１０μｇ／ｍｌ濃度のＭａｂ ５Ｄ５（１回目）、５Ｄ５（２回目）および１１Ｅ１（３回目）の２分間の連続的注入により捕捉されたｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃの２７０ＲＵ周辺の結合を可視化すると、５Ｄ５および１１Ｅ１が明らかに２つの異なる部位に結合することが示された（図５Ａ）。この所見を抗体の順序を逆にすることで確認した（図５Ｂ）。

【0215】

表３は、異なる順序のこれら２つの抗体で得られた算出比をまとめたものである。黒い値（７５％超）は、Ｍａｂ ＡがＭａｂ Ｂの結合を遮断しないことを意味する。太字／斜体の値（２０％未満）は、両抗体（ＡおよびＢ）の結合部位が同一または同時に結合ができないほどに十分近接していることを意味する。

【0216】

実施例３：ｃ−Ｍｅｔリン酸化に対するＭａｂの効果
ｃ−Ｍｅｔリン酸化に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の活性を調べるため、ホスホｃ−Ｍｅｔ ＥＬＩＳＡアッセイを設定した。要するに、５０００００のＡ５４９細胞を６ウェルプレートの各ウェルのＦ１２Ｋ培地＋１０％ＦＣＳ中に播種した。ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）添加の１６時間前に、細胞を飢餓状態とし、リガンド刺激の１５分前に各供試抗体を終濃度３０μｇ／ｍｌで加えた。ＨＧＦ添加の１５分後、冷溶解バッファーを加え、細胞を掻き取り、細胞溶解液を採取し、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をＢＣＡキット(Pierce)で定量し、−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ヤギ抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｒ＆Ｄ 参照番号ＡＦ２７６）を捕捉抗体として用い（４℃で一晩コーティング）、ＴＢＳ−ＢＳＡ５％バッファーを用いた飽和工程（室温で１時間）の後、種々の細胞溶解液からのタンパク質２５μｇを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。室温で９０分のインキュベーション時間の後、プレートを４回洗浄し、抗ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ抗体（ウサギ抗ｐＹ１２３０−１２３４−１２３５ ｃ−Ｍｅｔ）を加えた。さらに１時間インキュベートし、４回洗浄した後、抗ウサギ−ＨＲＰ(Biosource)を室温で１時間加え、次に、ルミノール基質を加えた後、Ｍｉｔｈｒａｓ装置で発光を評価した。図６Ｂに示されている結果は、１１Ｅ１、２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４および２２７Ｈ１は、より弱いｃ−Ｍｅｔリン酸化阻害（４２％）を示した５Ｄ５ Ｍａｂに比べ、それぞれ６８、５４、８０および６５％ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害することを示した。この試験において、４つの候補抗体で弱い基礎作用（２０％未満）が見られた（図６Ａ）。本特許で示されている種々の例に記載されるように、この弱い基礎作用は、他のin vitroおよびin vivo試験で、抗体の活性の結果ではない。対照として用いた５Ｄ５は本試験で有意な基礎作用を示した。

【0217】

実施例４：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による放射性標識ＨＧＦの置換
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体がＨＧＦに代わることができるかどうかを調べるため、結合実験を設定した。要するに、Ａタンパク質ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ ９６ウェルマイクロプレート(Perkin Elmer)をＰＢＳ中０．５％ゼラチンで飽和させ（２００μｌ／ウェル、室温で２時間）た後、コーティングタンパク質として組換えｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ(R&D Systems)を加えた。各ウェルにＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ溶液２０００μｌを加えた。その後、プレートを４℃で一晩インキュベートした。残っているフリーのＡタンパク質部位を無関連のｈＩｇＧ（ＰＢＳ中０．５μｇ／ウェル）で室温にて２時間さらに飽和させた。各段階の後にプレートをＰＢＳで洗浄した。

【0218】

競合アッセイでは、固定化されたｃ−Ｍｅｔに対する２００ｐＭの［^１２５Ｉ］−ＨＧＦ（比活性〜２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の結合を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、０．１ｐＭ〜１μＭの範囲の、種々の濃度の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体１１Ｅ１、２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４、２２７Ｈ１またはＨＧＦ(R&D Systems)の存在下で測定した。プレートを室温で６時間インキュベートした後、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンターで計数した。非特異的結合は、１μＭのＨＧＦの存在下で測定した。ｃ−Ｍｅｔに向けられていないが、大腸菌タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体９Ｇ４をマウスＩｇＧ１イソ型対照として用いた。

【0219】

全特異的［^１２５Ｉ］−ＨＧＦ結合のパーセントを、片対数グラフにリガンド濃度の関数としてプロットした。放射性リガンドの結合を５０％阻害するのに要する種々の阻害剤の濃度（ＩＣ_５０）を、得られたシグモイド競合曲線からグラフ的に求めた（図７Ａおよび７Ｂ）。

【0220】

予測されたように、非放射性標識ＨＧＦは、固定化されたｃ−Ｍｅｔに対する［^１２５Ｉ］−ＨＧＦの結合に完全に置き代わることができ、一方、対照抗体９Ｇ４はＨＧＦ遮断活性を示さなかった（図７Ａおよび７Ｂ）。モノクローナル抗ｃ−Ｍｅｔ抗体１１Ｅ１、２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４および２２７Ｈ１は、固定化ｃ−Ｍｅｔに対する［^１２５Ｉ］−ＨＧＦの結合を阻害することができ、ＩＣ_５０値はそれぞれ２０ｎＭ、３ｎＭ、２．７ｎＭおよび５．８ｎＭであった。抗体２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４および２２７Ｈ１に関して求められたＩＣ_５０値は、非放射性標識ＨＧＦ（３〜５ｎＭの間で含まれた）に関して求められたＩＣ_５０値に匹敵するものであったが、抗体１１Ｅ１はより高いＩＣ_５０値を示した。

【0221】

実施例５：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による浸潤の阻害
浸潤プロセスに対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の阻害効果を評価するため、Ａ５４９細胞をＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商標）マトリゲル（商標）浸潤チャンバー（孔径８μｍのポリカーボネート膜を有する６．５ｍｍ径のウェル）の上のチャンバーにプレーティングした。浸潤アッセイを行う２４時間前にＡ４５９細胞を飢餓状態とした。その後、５０００００のＡ５４９細胞を、各チャンバーの上のウェルの、供試抗体（Ｍａｂ終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含む、または含まないマトリゲルコーティング上の走化性バッファー（ＤＭＥＭ培地、０．１％ＢＳＡ、１２ｍＭＨｅｐｅｓ）にプレーティングした。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、下のチャンバーに４００ｎｇ／ｍｌのｒｈＨＧＦを含有する増殖培地または増殖培地単独のいずれかを満たした。これらのチャンバーをさらに４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。インキュベーションが終わったところで、フィルターの上面に残った細胞を綿棒で穏やかに取り除き、フィルターの下面に移動した細胞を溶解させ、ＣｙＱｕａｎｔ ＧＲ色素バッファー(Invitrogen)で染色し、蛍光リーダーＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０を用いて計数した。総ての条件を３反復で試験した。

【0222】

予測されたように、ＨＧＦは、陽性対照として含めた１０％ＦＣＳで見られたものに匹敵する腫瘍細胞の有意な浸潤を誘導した（図８）。イソ型対照として含めたネズミＩｇＧ１ ９Ｇ４は、ＩｇＧを含まずにプレーティングした細胞に比べ、基本浸潤またはＨＧＦ誘導浸潤に有意な効果を示さない。１１Ｅ１、２２４Ｇ１１、２２３Ｃ４および２２７Ｈ１を単独で加えた場合にはアゴニスト作用は見られず、３つのＭａｂではＨＧＦ誘導浸潤の有意かつ匹敵する阻害が見られた。

【0223】

実施例６：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による創傷治癒の阻害
ＨＧＦは運動を刺激する。抗ＨＧＦ抗体が遊走を阻害することができたことを調べるため、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を高密度になるまで増殖させ、Ｐ２００ピペットチップでギャップを作った。次に、細胞を、１１Ｅ１の存在下または不在下、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）でそのギャップ間で遊走するよう刺激した。また、１１Ｅ１単独のウェルも評価した。各試験条件を６反復で評価し、３回の独立した実験を行った。一晩インキュベートした後、細胞をＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎカメラ（対物４倍）で観察した。

【0224】

ＨＧＦは有意な遊走を誘導し、その結果、一晩でギャップが完全に埋まった（図９）。イソ型対照として用いた９Ｇ４無関連ＩｇＧ１は細胞遊走に効果がない。予測されたように、５Ｄ５を単独で加えた場合にはアゴニスト効果が見られたが、ギャップが開いたままの部分では、ＨＧＦの存在下でのこの抗体で、有意な細胞遊走阻害が見られる。５Ｄ５のＦａｂフラグメントは、単独で加えた場合、アゴニスト効果を持たない。しかしながら、ＨＧＦの存在下では、このフラグメントの活性は見られなかった。イソ型対照９Ｇ４で見られたように、ＭＡｂ １１Ｅ１は、単独で加えた場合にはアゴニスト効果を持たず、ＨＧＦの存在下では完全なアンタゴニストとして振る舞った。

【0225】

実施例７：拡散アッセイ
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、２４ウェルプレートの、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに低密度（１．１０^４細胞／ウェル）で播種し、２４時間増殖させた後に、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）と供試抗体（１０μｇ／ｍｌ）を同時に加えた。７２時間インキュベートした後、コロニーを固定し、メタノール中０．２％のクリスタルバイオレットで染色し、拡散を視覚的に評価した。各試験条件を３反復で評価し、３回の独立した実験を行った。

【0226】

ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞へのＨＧＦの添加は、有意な細胞拡散を誘導した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。イソ型対照として含めた９Ｇ４抗体は単独でもＨＧＦの存在下でも効果は無い。予測されたように、５Ｄ５抗体は単独では有意なアゴニスト効果を示し、５Ｄ５をＨＧＦとともに加えた場合では阻害効果は見られなかった（図１０Ａ）。単独で加えた１１Ｅ１（図１０Ａ）にも２２４Ｇ１１（図１０Ｂ）にもアゴニスト効果は見られなかった。ＨＧＦの存在下では、これらの抗体の極めて有意な阻害効果が示された（図１０Ａおよび１０Ｂ）。

【0227】

実施例８：三次元管形成アッセイ
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、２４ウェルプレートの、１０％ＦＣＳ／マトリゲル（５０／５０）を含むＤＭＥＭに１．１０^４細胞／ウェルで播種し、３０分間インキュベートした後、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）と供試抗体（１０μｇ／ｍｌ）を同時に加えた。７日間インキュベートした後、細胞を管形成に関して視覚的に評価した。各試験条件を３反復で評価し、３回の独立した実験を行った。

【0228】

ＨＧＦの添加は有意なＳＫ−ＨＥＰ−１管形成を誘導した（図１１）。イソ型対照として含めた抗体９Ｇ４は、単独でもＨＧＦの存在下でも効果は無かった。予測されたように、５Ｄ５抗体は単独では有意なアゴニスト効果を示し、５Ｄ５をＨＧＦとともに加えた場合では阻害効果は見られなかった。単独で加えた１１Ｅ１、２２３Ｃ４および２２４Ｇ１１にはアゴニスト効果は見られず、１１Ｅ１および２２３Ｃ４の双方で、ＨＧＦの存在下では完全な阻害効果が示された。２２４Ｇ１１Ｍａｂでは、部分的ではあるが有意な阻害が見られた。

【0229】

実施例９：スフェロイドの形成
in vivo状態に近いモデルで抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のin vitro腫瘍成長阻害能を評価するため、ヒト膠芽腫細胞Ｕ−８７ＭＧ（ＡＴＣＣ ＃ ＨＴＢ−１４）スフェロイドを生じさせた。単層として増殖させた細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、１０％ＦＢＳを添加した完全細胞培養培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁させた。丸底９６プレートの１ウェルのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中に６２５個の細胞を接種することによりスフェロイドを誘導した。底に細胞が接着するのを防ぐため、プレートを９５％エタノール中ポリＨＥＭＡでプレコーティングし、室温で風乾させた。これらのプレートを、加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ_２の標準細胞培養条件下でインキュベートした。スフェロイド培養３〜７日後に精製モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。培養４日後に一度、ＨＧＦ（４００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。スフェロイドは少なくとも１０日間、培養維持した。その後、ａｘｉｏ ｖｉｓｉｏｎソフトウエアの自動測定モジュールを用いてスフェロイドの面積を測定することにより、スフェロイドの成長をモニタリングした。面積はμｍ^２で表した。各条件につき８〜１６個のスフェロイドを評価した。

【0230】

図１２Ａおよび１２Ｂは、１０％ＦＣＳの存在下、ＨＧＦを完全培地に加えた場合には、刺激が見られなかったことを示す。予測されたように、９Ｇ４イソ型対照はスフェロイド成長に効果を示さない。１１Ｅ１および２２３Ｃ４は、ＨＧＦの存在下でも不在下でもスフェロイドの成長を有意に低下させた。５Ｄ５ Ｆａｂフラグメントでは効果は見られなかった。

【0231】

実施例１０：Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおける抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂのin vivo活性
６〜８週齢の無胸腺マウスを無菌フィルタートップケージで飼い、無菌条件で維持し、フランスおよび欧州ガイドラインに従って取り扱った。ｃ−Ｍｅｔを発現し、リガンドＨＧＦを自己分泌する膠芽腫細胞系統Ｕ８７−ＭＧをin vivo評価のために選択した。マウスに５×１０^６細胞を皮下注射した。そして、細胞移植６日後に腫瘍は測定可能となり（およそ１００ｍｍ^３）、匹敵する腫瘍サイズを有する６匹の群に分け、各供試抗体１ｍｇ／用量で１週間に２回処置した。これらのマウスを異種移植の成長速度および体重変化の観察のため追跡した。腫瘍体積は式：π（Ｐｉ）／６×長さ×幅×高さで計算した。

【0232】

得られた結果を図１３にまとめたが、総ての供試抗体がＵ８７−ＭＧ細胞のin vivo増殖を有意に阻害することが示された。パネルＡにおける中和抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩｇＧ１）の使用は、見られたこのin vivo阻害が特にＨＧＦ−ｃＭｅｔ軸の調節に関連することを示す。

【0233】

実施例１１：ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおける抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂのin vivo活性
ＮＣＩ−Ｈ４４１は乳頭状肺腺癌に由来し、高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現し、ｃ−Ｍｅｔ ＲＴＫの構成的リン酸化を示す。

【0234】

この細胞系統が高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現し、ＨＧＦを産生することができるかどうかを調べるため、定量的ＲＴ−ＰＣＲとＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡ(Quantikine HGF; R&D systems)の双方を行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、細胞系統の全ＨＧＦまたはｃＭｅｔ転写物発現レベルを、標準的なＴａｑＭａｎ（商標）技術を用いて定量的ＰＣＲにより評価した。ＨＧＦまたはｃ−Ｍｅｔ転写物レベルをハウスキーピング遺伝子リボゾームタンパク質ラージＰＯ（ＲＰＬ０）に対してノーマライズし、結果をノーマライズされた発現値として評価した（２−ｄｄＣＴ法）。

【0235】

ＲＰＬ０のプライマー／プローブセットは、フォワード５’−ｇａａａｃｔｃｔｇｃａｔｔｃｔｃｇｃｔｔｃｃｔｇ−３’（配列番号４７）；リバース５’−ａｇｇａｃｔｃｇｔｔｔｇｔａｃｃｃｇｔｔｇａ−３’（配列番号４８）；およびプローブ５’−（ＦＡＭ）−ｔｇｃａｇａｔｔｇｇｃｔａｃｃｃａａｃｔｇｔｔｇｃａ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号４９）であった。ＨＧＦのプライマー／プローブセットは、フォワード５’−ａａｃａａｔｇｃｃｔｃｔｇｇｔｔｃｃ−３’（配列番号５０）；リバース５’−ｃｔｔｇｔａｇｃｔｇｃｇｔｃｃｔｔｔａｃ−３’（配列番号５１）；およびプローブ５’−（ＦＡＭ）−ｃｃｔｔｃａａｔａｇｃａｔｇｔｃａａｇｔｇｇａｇｔｇａ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号５２）であった。ｃＭｅｔのプライマー／プローブセットは、フォワード５’−ｃａｔｔａａａｇｇａｇａｃｃｔｃａｃｃａｔａｇｃｔａａｔ−３’（配列番号５３）；リバース５’−ｃｃｔｇａｔｃｇａｇａａａｃｃａｃａａｃｃｔ−３’（配列番号５４）；およびプローブ５’−（ＦＡＭ）−ｃａｔｇａａｇｃｇａｃｃｃｔｃｔｇａｔｇｔｃｃｃａ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号５５）であった。温度周期プロトコールは、５０℃で２分間の融解、９５℃１０分、その後、９５℃１５秒および６２℃１分の４０サイクルからなった。

【0236】

ＮＣＩ−Ｈ４４１ではＨＧＦのｍＲＮＡは見られず（図１４）、ＮＣＩ−Ｈ４４１上清においては、ＥＬＩＳＡによりＨＧＦは検出できない。これらの実験において、ＨＧＦに関して自己分泌細胞系統であることが知られている膠芽腫細胞系統Ｕ８７−ＭＧを陽性対照として含めた。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｕ８７−ＭＧにおいて有意なレベルのＨＧＦ ｍＲＮＡを示し、Ｕ８７−ＭＧ細胞の上清において細胞１００万個当たり１．９ｎｇのＨＧＦが検出された。定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析（図１５Ａおよび１５Ｂ）は双方とも、予測されたように、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞がｃ−Ｍｅｔを有意に過剰発現したこと、およびこの発現がＵ８７−ＭＧ細胞に関して見られたものよりも劇的に高かったことを示した。この実験では、ＭＣＦ−７細胞系統を陰性対照として含めた。これらのことを考え合わせると、ＮＣＩ−Ｈ４４１は、ＨＧＦリガンドとは独立に増殖可能な非自己分泌性の構成的に活性化される細胞系統であることが明らかであり、ここでは、リガンド非依存的なｃ−ｍｅｔの二量体化がその受容体の過剰発現の結果として起こった。非自己分泌性細胞系統のin vivo活性に対する抗ｃ−ｍｅｔ抗体の評価から、ｃ−ｍｅｔの二量体化に影響を及ぼすそれらの効力についてのいくつかの洞察を得ることができた。

【0237】

図１６は、２２４Ｇ１１、１１Ｅ１および２２７Ｈ１はＮＣＩ−Ｈ４４１のin vivo増殖を有意に阻害したことを示し、二量体化を阻害することができるこれらの抗体は、リガンド依存的阻害に加え、ｃ−ｍｅｔのリガンド非依存的阻害も標的化することができることを示唆する。本明細書で上述したように、この特性をもって、２２４Ｇ１１、１１Ｅ１および２２７Ｈ１が５Ｄ５一腕（ＯＡ−５Ｄ５）抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とは異なることが示されている。

【0238】

実施例１２：抗体２２４Ｇ１１のＣＤＲグラフトによるヒト化プロセス
Ｉ−軽鎖可変ドメインのヒト化
２４Ｇ１１ＶＬのヌクレオチド配列とネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、２２４Ｇ１１ ＶＬのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。

【0239】

それぞれＶ領域に関して９９．３１％、Ｊ領域に関して９４．２８％の配列同一性を有するネズミＩＧＫＶ３−５^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために２２４Ｇ１１ＶＬ配列をそのまま用いることにした。

【0240】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図１７Ａに、Ｊ遺伝子に関しては図１７Ｂに示す。

【0241】

２２４Ｇ１１ＶＬのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２４Ｇ１１ＶＬとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、２２４Ｇ１１ＶＬのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。選択の至適化に関しては、より良い相同性を検索するためにタンパク質配列間のアライメントを行った。

【0242】

これらの２つの補足的方法により、ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬ ＣＤＲに関して可能性のある２つの受容ヒトＶ配列が同定された。ヌクレオチドアライメントにより、７５．９９％の配列同一性を有するヒトＩＧＫＶ３−１１^＊０１生殖細胞系遺伝子が得られ、タンパク質アライメントにより、６７．３０％の配列同一性を有するヒトＩＧＫＶ４−１^＊０１生殖細胞系遺伝子が得られる。両場合において、最も近い２つの生殖細胞系遺伝子と分析された配列が異なるＣＤＲ１アミノ酸長を示す（２２４Ｇ１１ ＶＬでは１０アミノ酸；ＩＧＫＶ３−１１^＊０１では６アミノ酸；ＩＧＫＶ４−１^＊０１では１２アミノ酸）ことは注目に値する。

【0243】

Ｊ領域に関しては、最良の相同性スコアがまずヒトで得られ、ヒトＩＧＫＪ３^＊０１は８０％の配列同一性を示す。しかし、ヒトＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子とのアライメントで、より多数の連続同一ヌクレオチドおよびより良いアミノ酸一致が見られた（配列同一性７７．１４％）。よって、ＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子をネズミ１１Ｅ１ ＶＬ ＣＤＲの受容ヒトＪ領域として選択した。

【0244】

アライメントは、Ｖ領域に関しては図１８Ａに、Ｊ領域に関しては図１８Ｂに示す。

【0245】

ヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＬ
ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬ ＣＤＲに関する２つの受容ヒトＶ領域の可能性が得られたので、２２４Ｇ１１ ＶＬドメインの２つのヒト化型を記載する。１つは、ＣＤＲ１長の短いヒトフレームワークに対する最初の試みに相当し（ＩＧＫＶ３−１１^＊０１）、もう１つはＣＤＲ１長の長いものに相当する（ＩＧＫＶ４−１^＊０１）。

【0246】

ａ）ＩＧＫＶ３−１１^＊０１に基づくヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＬ
ヒト化プロセスにおける以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＫＶ３−１１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２およびまたネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0247】

図１９Ａに示されているように、２２４Ｇ１１ ＶＬ配列における太字の残基は、２２４Ｇ１１ ＶＬドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＫＶ３−１１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２）の間で異なることが分かった２５のアミノ酸に相当する。

【0248】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、２５の異なる残基のうち３つが最終的に変異されているべきであると特定された。これらの３つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＭ３９からヒトＬ、Ｈ４０からＡおよびＲ８４からＧへのものである。これらランク１の残基を図１９Ａに、２２４Ｇ１１ ＨＺ１ＶＬ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0249】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0250】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、残基１５（Ｌ／Ｐ）、４９（Ｐ／Ａ）、６７（Ｌ／Ｒ）、６８（Ｅ／Ａ）、９３（Ｐ／Ｓ）および９９（Ｖ／Ｆ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0251】

もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、２５の異なるアミノ酸のうち他のランク３の１６の残基総てが再考可能である。

【0252】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0253】

図１９Ａは、明らかに同定された上述の突然変異を有する、完成されたＩＧＫＶ３−１１^＊０１に基づくヒト化２２４Ｇ１１ ＶＬを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0254】

ｂ）ＩＧＫＶ４−１^＊０１に基づくヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＬ
ヒト化プロセスの以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＫＶ４−１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２およびまたネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0255】

図１９Ｂに示されているように、２２４Ｇ１１ ＶＬ配列における太字の残基は、２２４Ｇ１１ ＶＬドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＫＶ４−１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２）の間で異なることが分かった２５のアミノ酸に相当する。

【0256】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、２２の異なる残基のうち４つが最終的に変異されているべきであると特定された。これらの４つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＬ４からヒトＭ、Ｍ３９からＬ、Ｈ４０からＡ、およびＲ８４からＧへのものである。これらランク１の残基を図１９Ｂに、２２４Ｇ１１ ＨＺ２ＶＬ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0257】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0258】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、残基２５（Ａ／Ｓ）、６６（Ｎ／Ｔ）、６７（Ｌ／Ｒ）および９３（Ｐ／Ｓ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。
もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、２２の異なるアミノ酸のうち他のランク３の１４の残基総てが再考可能である。

【0259】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0260】

図１９Ｂは、明らかに同定された上述の突然変異を有する、完成されたＩＧＫＶ４−１^＊０１に基づくヒト化２２４Ｇ１１ ＶＬを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0261】

ＩＩ−重鎖可変ドメインのヒト化
２２４Ｇ１１ ＶＨヌクレオチド配列とネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、２２４Ｇ１１ ＶＨのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。

【0262】

それぞれＶ領域に関して９２．７０％、Ｄ領域に関して７５．００％、Ｊ領域に関して８９．３６％の配列同一性を有するネズミＩＧＨＶ１−１８^＊０１、ＩＧＨＤ２−４^＊０１およびＩＧＨＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために２２４Ｇ１１ ＶＨ配列をそのまま用いることにした。

【0263】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図２０Ａに、Ｄ遺伝子に関しては図２０Ｂに、Ｊ遺伝子に関しては図２０Ｃに示す。

【0264】

２２４Ｇ１１ＶＨのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２４Ｇ１１ ＶＨとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、２２４Ｇ１１ ＶＨのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。選択の至適化に関しては、より良い相同性を検索するためにタンパク質配列間のアライメントを行った。

【0265】

これらの２つの補足的方法により、ヌクレオチドレベルで７５．００％、タンパク質レベルで６４．３０％の配列同一性を有するネズミ２２４Ｇ１１ ＶＨ ＣＤＲに関する同じ受容ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２Ｖ配列が同定された。

【0266】

Ｄ領域がＶＨドメイン内のＣＤＲ３領域に厳格に属していることは注目に値する。このヒト化プロセスは「ＣＤＲグラフト」アプローチに基づく。この戦略においては、最も近いヒトＤ遺伝子の分析は有用でない。

【0267】

Ｊ領域の相同性検索により、７８．７２％の配列同一性を有するヒトＩＧＨＪ４^＊０４生殖細胞系遺伝子が同定された。

【0268】

よって、ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２ Ｖ生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４^＊０１ Ｊ生殖細胞系遺伝子が、ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択された。

【0269】

アライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図２１Ａに、Ｊ遺伝子に関しては図２１Ｂに示す。

【0270】

ヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＨ
ヒト化プロセスにおける以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＨＶ１−２^＊０２およびＩＧＨＪ４^＊０１およびまたネズミ２２４Ｇ１１ ＶＨのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0271】

図２２に示されているように、２２４Ｇ１１ ＶＨ配列における太字の残基は、２２４Ｇ１１ ＶＨドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＨＶ１−２^＊０２およびＩＧＨＪ４^＊０１）の間で異なることが分かった３０のアミノ酸に相当する。

【0272】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、３０の異なる残基のうち４つが最終的に変異されていると特定された。これらの４つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＤ５１からヒトＥ、Ｇ５５からＷ、Ｖ８０からＲおよびＫ８２からＴへのものである。これらランク１の残基を図２２に、２２４Ｇ１１ ＨＺＶＨ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0273】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0274】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、残基２５（Ｔ／Ａ）、４８（Ｅ／Ｑ）、４９（Ｓ／Ｇ）、５３（Ｉ／Ｍ）、７６（Ａ／Ｖ）、７８（Ｌ／Ｍ）および９０（Ｄ／Ｅ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0275】

もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、３０の異なるアミノ酸のうち他のランク３の１９の残基総てが再考可能である。

【0276】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0277】

図２２は、明らかに同定された上述の突然変異を有する、ヒト化２２４Ｇ１１ ＶＨを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0278】

実施例１３：抗体２２７Ｈ１のＣＤＲグラフトによるヒト化プロセス
Ｉ−軽鎖可変ドメインのヒト化
２２７Ｈ１ ＶＬのヌクレオチド配列とネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、２２７Ｈ１ ＶＬのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。

【0279】

それぞれＶ領域に関して９６．９０％、Ｊ領域に関して９７．２９％の配列同一性を有するネズミＩＧＫＶ３−５^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために２２７Ｈ１ ＶＬ配列をそのまま用いることにした。

【0280】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図２３Ａに、Ｊ遺伝子に関しては図２３Ｂに示す。

【0281】

２２７Ｈ１ ＶＬのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２７Ｈ１ ＶＬとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、２２７Ｈ１ ＶＬのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。選択の至適化に関しては、より良い相同性を検索するためにタンパク質配列間のアライメントを行った。

【0282】

これらの２つの補足的方法により、ネズミ２２７Ｈ１ ＶＬ ＣＤＲに関して可能性のある２つの受容ヒトＶ配列が同定された。ヌクレオチドアライメントにより、７４９１％の配列同一性を有するヒトＩＧＫＶ３−１１^＊０１生殖細胞系遺伝子が得られ、タンパク質アライメントにより、６４．００％の配列同一性を有するヒトＩＧＫＶ４−１^＊０１生殖細胞系遺伝子が得られる。両場合において、最も近い２つの生殖細胞系遺伝子と分析された配列が異なるＣＤＲ１アミノ酸長を示す（２２７Ｈ１ ＶＬでは１０アミノ酸；ＩＧＫＶ３−１１^＊０１では６アミノ酸；ＩＧＫＶ４−１^＊０１では１２アミノ酸）ことは注目に値する。

【0283】

Ｊ領域に関しては、最良の相同性スコアがまずヒトで得られ、ヒトＩＧＫＪ３^＊０１は７８．３８％の配列同一性を示す。しかし、ヒトＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子とのアライメントで、より多数の連続同一ヌクレオチドおよびより良いアミノ酸一致が見られた（配列同一性７５．６８％）。よって、ＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子をネズミ２２７Ｈ１ ＶＬ ＣＤＲの受容ヒトＪ領域として選択した。

【0284】

アライメントは、Ｖ領域に関しては図２４Ａに、Ｊ領域に関しては図２４Ｂに示す。

【0285】

ヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＬ
ネズミ２２７Ｈ１ ＶＬ ＣＤＲに関する２つの受容ヒトＶ領域の可能性が得られたので、２２７Ｈ１ ＶＬドメインの２つのヒト化型を記載する。１つは、ＣＤＲ１長の短いヒトフレームワークに対する最初の試みに相当し（ＩＧＫＶ３−１１^＊０１）、もう１つはＣＤＲ１長の長いものに相当する（ＩＧＫＶ４−１^＊０１）。

【0286】

ａ）ＩＧＫＶ３−１１^＊０１に基づくヒト化型２２７Ｈ１ ＶＬ
ヒト化プロセスにおける以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＫＶ３−１１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２およびまたネズミ２２７Ｈ１ ＶＬのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0287】

図２５Ａに示されているように、２２７Ｈ１ ＶＬ配列における太字の残基は、２２７Ｈ１ ＶＬドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＫＶ３−１１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２）の間で異なることが分かった２６のアミノ酸に相当する。

【0288】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、２６の異なる残基のうち３つが最終的に変異されていると特定された。これらの３つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＩ３９からヒトＬ、Ｈ４０からＡおよびＲ８４からＧへのものである。これらランク１の残基を図２５Ａに、２２７Ｈ１ ＨＺ１ＶＬ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0289】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0290】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、残基１５（Ｌ／Ｐ）、２５（Ｖ／Ａ）、４９（Ｐ／Ａ）、６７（Ｌ／Ｒ）、６８（Ｅ／Ａ）、９３（Ｐ／Ｓ）および９９（Ｓ／Ｆ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0291】

もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、２５の異なるアミノ酸のうち他のランク３の１６の残基総てが再考可能である。

【0292】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0293】

図２５Ａは、明らかに同定された上述の突然変異を有する、完成されたＩＧＫＶ３−１１^＊０１に基づくヒト化２２７Ｈ１ ＶＬを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0294】

ｂ）ＩＧＫＶ４−１^＊０１に基づくヒト化型２２７Ｈ１ ＶＬ
ヒト化プロセスの以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＫＶ４−１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２およびまたネズミ２２７Ｈ１ ＶＬのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0295】

図２５Ｂに示されているように、２２７Ｈ１ ＶＬ配列における太字の残基は、２２７Ｈ１ ＶＬドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＫＶ４−１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２）の間で異なることが分かった２４のアミノ酸に相当する。

【0296】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、２４の異なる残基のうち４つが最終的に変異されていると特定された。これらの４つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＬ４からヒトＭ、Ｉ３９からＬ、Ｈ４０からＡ、およびＲ８４からＧへのものである。これらランク１の残基を図２５Ｂに、２２７Ｈ１ ＨＺ２ＶＬ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0297】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0298】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、残基２５（Ｖ／Ｓ）、６６（Ｎ／Ｔ）、６７（Ｌ／Ｒ）および９３（Ｐ／Ｓ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0299】

もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、２２の異なるアミノ酸のうち他のランク３の６つの残基総てが再考可能である。

【0300】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0301】

図２５Ｂは、明らかに同定された上述の突然変異を有する、完成されたＩＧＫＶ４−１^＊０１に基づくヒト化２２７Ｈ１ ＶＬを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0302】

ＩＩ−重鎖可変ドメインのヒト化
２２７Ｈ１ ＶＨヌクレオチド配列とネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、２２７Ｈ１ ＶＨのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。
それぞれＶ領域に関して９２．７０％、Ｄ領域に関して６３．６３％、Ｊ領域に関して９１．４８％の配列同一性を有するネズミＩＧＨＶ１−１８^＊０１、ＩＧＨＤ１−１^＊０２およびＩＧＨＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために２２７Ｈ１ ＶＨ配列をそのまま用いることにした。

【0303】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図２６Ａに、Ｄ遺伝子に関しては図２６Ｂに、Ｊ遺伝子に関しては図２６Ｃに示す。

【0304】

２２７Ｈ１ ＶＨのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２４Ｇ１１ ＶＨとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、２２７Ｈ１ ＶＨのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。このように、７２．９２％の配列同一性を有するネズミ２２４Ｇ１１ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２Ｖ配列が同定された。

【0305】

Ｄ領域がＶＨドメイン内のＣＤＲ３領域に厳格に属していることは注目に値する。このヒト化プロセスは「ＣＤＲグラフト」アプローチに基づく。この戦略においては、最も近いヒトＤ領域の分析は有用でない。

【0306】

Ｊ領域の相同性検索により、７８．７２％の配列同一性を有するヒトＩＧＨＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。

【0307】

よって、ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２ Ｖ生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４^＊０１ Ｊ生殖細胞系遺伝子が、ネズミ２２７Ｈ１ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択された。

【0308】

アライメントは、Ｖ領域に関しては図２７Ａに、Ｊ領域に関しては図２７Ｂに示す。
選択の至適化のため、当業者ならば、選択の助けとするためにタンパク質配列間のアライメントを行うこともできる。

【0309】

ヒト化型２２７Ｈ１ ＶＨ
ヒト化プロセスにおける以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＨＶ１−２^＊０２およびＩＧＨＪ４^＊０１およびまたネズミ２２７Ｈ１ ＶＨのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0310】

図２８に示されているように、２２７Ｈ１ ＶＨ配列における太字の残基は、２２７Ｈ１ ＶＨドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＨＶ１−２^＊０２およびＩＧＨＪ４^＊０１）の間で異なることが分かった３２のアミノ酸に相当する。

【0311】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、３２の異なる残基のうち６つが最終的に変異されていると特定された。これらの６つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＬ３９からヒトＭ、Ｎ４０からＨ、Ｌ５５からＷ、Ｔ６６からＮ、Ｖ８０からＲおよびＫ８２からＴへのものである。これらランク１の残基を図２８に、２２７Ｈ１ ＨＺＶＨ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0312】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0313】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、４８（Ｋ／Ｑ）、４９（Ｔ／Ｇ）、５３（Ｉ／Ｍ）、７６（Ａ／Ｖ）および７８（Ｌ／Ｍ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0314】

もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、３０の異なるアミノ酸のうち他のランク３の２１の残基総てが再考可能である。

【0315】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0316】

図２８は、明らかに同定された上述の突然変異を有する、ヒト化２２７Ｈ１ ＶＨを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0317】

実施例１４：抗体２２３Ｃ４のＣＤＲグラフトによるヒト化プロセス
Ｉ−軽鎖可変ドメインのヒト化
２２３Ｃ４ ＶＬのヌクレオチド配列とネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、２２３Ｃ４ ＶＬのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。

【0318】

それぞれＶ領域に関して９９．６４％、Ｊ領域に関して９４．５９％の配列同一性を有するネズミＩＧＫＶ１２−４６^＊０１およびＩＧＫＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために２２３Ｃ４ ＶＬ配列をそのまま用いることにした。

【0319】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図２９Ａに、Ｊ遺伝子に関しては図２９Ｂに示す。

【0320】

２２３Ｃ４ ＶＬのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２３Ｃ４ ＶＬとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、２２３Ｃ４ ＶＬのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。

【0321】

それぞれＶ領域に関して７８．４９％、Ｊ領域に関して８１．０８％の配列同一性を有するヒトＩＧＫＶ１−ＮＬ１^＊０１およびＩＧＫＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。よって、Ｖ領域に関しては生殖細胞系遺伝子ＩＧＫＶ１−ＮＬ１^＊０１、Ｊ領域に関してはＩＧＫＪ２^＊０１を、ネズミ２２３Ｃ４ ＶＬ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択した。

【0322】

アライメントは、Ｖ領域に関しては図３０Ａに、Ｊ領域に関しては図３０Ｂに示す。

【0323】

選択の至適化のため、当業者ならば、選択の助けとするためにタンパク質配列間のアライメントを行うこともできる。

【0324】

ヒト化型２２３Ｃ４ ＶＬ
ヒト化プロセスの以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＫＶ１−ＮＬ１^＊０１およびＩＧＫＪ２^＊０１およびまたネズミ２２３Ｃ４ ＶＬのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0325】

プロセスのこの段階で、２２３Ｃ４ネズミＦｖドメインの分子モデルを開発することができ、分子の三次元構造の維持または抗原結合部位および機能におけるそれらの役割のために保存すべきネズミ残基の選択に有用である。より詳しくは、最終的に変異させる９残基が同定された。

【0326】

第一段階では、ＣＤＲアンカーまたは構造に関与する残基を検討する。このような残基は残基６６（Ｒ／Ｎ）および残基６８（Ｆ／Ｖ）である。

【0327】

第二段階では、溶媒に曝される残基およびそれ自体免疫原性に関与し得る残基も検討する。これらは残基４９（Ａ／Ｓ）、５１（Ｋ／Ｑ）、６９（Ｓ／Ｄ）、８６（Ｄ／Ｑ）および９２（Ｓ／Ｎ）である。

【0328】

次に、第三の段階では、可変ドメインの構造／折りたたみに関与する残基も変異させることができる。これらの残基は残基４６（Ｐ／Ｑ）および残基９６（Ｐ／Ｓ）である。

【0329】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0330】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、以下の残基、すなわち、９（Ｓ／Ａ）、１３（Ａ／Ｖ）、１７（Ｄ／Ｅ）、１８（Ｒ／Ｔ）、５４（Ｌ／Ｖ）、８８（Ｔ／Ｓ）、９０（Ｔ／Ｋ）、１００（Ａ／Ｇ）および１０１（Ｔ／Ｓ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0331】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0332】

図３１は、明らかに同定された上述の突然変異を有する、ヒト化２２３Ｃ４ ＶＬを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0333】

ＩＩ−重鎖可変ドメインのヒト化
２２３Ｃ４ ＶＨのヌクレオチド配列ネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、２２３Ｃ４ ＶＨのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。

【0334】

それぞれＶ領域に関して９８．９５％、Ｄ領域に関して７２．７２％、Ｊ領域に関して９８．１１％の配列同一性を有するネズミＩＧＨＶ１−１８^＊０１、ＩＧＨＤ６−３^＊０１およびＩＧＨＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために２２３Ｃ４ ＶＨ配列をそのまま用いることにした。

【0335】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図３２Ａに、Ｄ遺伝子に関しては図３２Ｂに、Ｊ遺伝子に関しては図３２Ｃに示す。

【0336】

２２３Ｃ４ ＶＨのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２３Ｃ４ ＶＨとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、２２３Ｃ４ ＶＨのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。

【0337】

それぞれＶ領域に関して７６．３８％、Ｄ領域に関して７５．００％、Ｊ領域に関して７７．４１％の配列同一性を有するヒトＩＧＨＶ１−２^＊０１、ＩＧＨＤ１−２６^＊０１およびＩＧＨＪ６^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。よって、Ｖ領域に関しては生殖細胞系遺伝子ＩＧＨＶ１−２^＊０２、Ｊ領域に関してはＩＧＨＪ６^＊０１を、ネズミ２２３Ｃ４ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択した。

【0338】

アライメントは、Ｖ領域に関しては図３３Ａに、Ｄ領域に関しては図３３Ｂに、Ｊ領域に関しては図３３Ｃに示す。

【0339】

選択の至適化のため、当業者ならば、選択の助けとするためにタンパク質配列間のアライメントを行うこともできる。

【0340】

ヒト化型２２３Ｃ４ ＶＨ
ヒト化プロセスの以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＨＶ１−２^＊０２およびＩＧＨＪ６^＊０１およびまたネズミ２２３Ｃ４ ＶＨのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0341】

プロセスのこの段階で、２２３Ｃ４ネズミＦｖドメインの分子モデルを開発することができ、分子の三次元構造の維持または抗原結合部位および機能におけるそれらの役割のために保存すべきネズミ残基の選択に有用である。より詳しくは、最終的に変異させる１４残基が同定された。

【0342】

第一段階では、ＣＤＲアンカーまたは構造に関与する残基を検討する。このような残基は残基４０（Ｈ／Ｄ）、４５（Ａ／Ｓ）、５５（Ｗ／Ｄ）、６６（Ｎ／Ｉ）および６７（Ｙ／Ｆ）である。

【0343】

第二段階では、溶媒に曝される残基およびそれ自体免疫原性に関与し得る残基も検討する。これらは残基１（Ｑ／Ｅ）、３（Ｑ／Ｌ）、５（Ｖ／Ｑ）、４８（Ｑ／Ｍ）および８０（Ｒ／Ｖ）である。

【0344】

次に、第三の段階では、可変ドメインの構造／折りたたみに関与する残基も変異させることができる。これらは残基９（Ａ／Ｐ）、１３（Ｋ／Ｖ）、２２（Ｓ／Ｐ）および４６（Ｐ／Ｈ）である。

【0345】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0346】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、以下の残基、すなわち、１２（Ｖ／Ｌ）、２１（Ｖ／Ｉ）、４３（Ｒ／Ｋ）、４９（Ｇ／Ｓ）、５３（Ｍ／Ｉ）、６８（Ａ／Ｎ）、７２（Ｑ／Ｋ）、７５（Ｒ／Ｋ）、７６（Ｖ／Ａ）、７８（Ｍ／Ｌ）、８２（Ｔ／Ｋ）、８４（Ｉ／Ｓ）、９２（Ｓ／Ｒ）、９３（Ｒ／Ｓ）、９５（Ｒ／Ｔ）および９７（Ｄ／Ｅ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0347】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0348】

図３４は、明らかに同定された上述の突然変異を有する、ヒト化２２３Ｃ４ ＶＨを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0349】

実施例１５：確立された異種移植ＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍モデルに対する、ネズミ２２４Ｇ１１ ＭＡｂ単独または化学療法薬ナベルビン（登録商標）と組み合わせた場合の抗腫瘍活性
化学療法薬アプローチの成功はアポトーシス誘導薬に対する細胞応答および細胞内のアポトーシス誘導経路とアポトーシス阻害経路のバランスに依存する。細胞の生存に対する活性化ｃ−Ｍｅｔの保護効果が報告されている。それは主として、ＰＩ３−Ｋにより媒介されるシグナル伝達の結果としての抗アポトーシスＢｃｌ−ｘ１およびＢｃｌ−２タンパク質の発現の増加によるものであり、これが次にミトコンドリア依存性アポトーシスを阻害する（カスパーゼ９）。

【0350】

実際、アポトーシスプロセスに対して顕著な調節作用を有するＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ系は癌細胞の化学感受性にも影響を及ぼし得ると考えられる。この仮説は、肺癌処置に用いられる市販の化学療法薬ナベルビン（登録商標）で検証されている(as been tested)(Aapro et al, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 40:251-263; Curran et al, Drugs Aging. 2002, 19:695-697)。異種移植ＮＣＩ−Ｈ４４１ ＮＳＣＬＣモデルを用いたが、これはこの細胞系統がナベルビン(Kraus-Berthier et al., Clin. Cancer Res., 2000; 6:297-304)とｃ−Ｍｅｔ標的療法(Zou H. T. et al., Cancer Res. 2007, 67: 4408-4417)の双方に感受性があることが従前に記載されていたからである。

【0351】

要するに、ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳおよび１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を移植２日前に分割したところ、それらは指数増殖期であった。１０００万個のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞をＰＢＳ中、７週齢のスイスヌードマウスに移植した。移植３日後に腫瘍を測定し、動物を匹敵するサイズの６匹の４群に分けた。マウスに負荷量２ｍｇの２２４Ｇ１１／マウスをｉ．ｐ．処置し、その後、１週間に２回、４３日間、１ｍｇの抗体／マウスをｉ．ｐ．処置した。９Ｇ４ ＭＡｂをイソ型対照として用いた。

【0352】

ナベルビン（登録商標）は、８ｍｇ／ｋｇの用量で、細胞注射後５日目、１２日目、１９日目にｉ．ｐ．注射により与えた。２２４Ｇ１１とナベルビン（登録商標）の併用療法では、これら２種類の化合物を別個に投与した。この実験では、２種類の化合物をそれらの至適用量で用いた。腫瘍体積は１週間に２回測定し、式：ｐ／６×長さ×幅×高さにより計算した。

【0353】

図３５は、２２４Ｇ１１が、単剤療法として単独で用いた場合、ナベルビン（登録商標）と同等の効果があることを示す。両治療法を組み合わせる有意な利点は、６３日目に６匹中３匹に見られた完全な腫瘍退縮で見られた。

【0354】

実施例１６：Ｃ−Ｍｅｔ阻害剤および脈管形成
種々の腫瘍細胞機能の調節におけるその直接的役割に加え、ｃ−ｍｅｔの活性化も腫瘍脈管形成にも関連付けられている。内皮細胞はｃ−Ｍｅｔを発現し、ＨＧＦは内皮細胞の増殖、浸潤および運動を刺激する(Nakamura Y. et al., Biochem. Biophys. Res., Commun. 1995, 215:483-488; Bussolino F. et al., J. Cell Biol. 1992, 119:629-641)。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔによる血管内皮細胞における増殖、浸潤および運動の調和のとれた調節は、in vitroにおいて３Ｄ毛細内皮管の形成をもたらすことが示されている(Rosen E. M. et al., Supplementum to Experientia 1991, 59:76-88)。

【0355】

抗ｃ−Ｍｅｔ ＭＡｂのＨＧＦ誘導脈管形成妨害能を調べるため、ｉ）ＨＵＶＥＣ増殖に対するＭＡｂの評価およびｉｉ）ＨＵＶＥＣ管形成に関するＭＡｂの試験を含む２セットの実験を行った。

【0356】

増殖実験では、予めラミニンをコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルに７５００のＨＵＶＥＣをプレーティングした。細胞を、０．５％ＦＢＳとヘパリンを添加したＥＭＢ−２アッセイ培地で２４時間増殖させた。その後、供試ＭＡｂ（０．１５〜４０μｇ／ｍｌ）を加え、１時間後に２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを加えた。添加２４時間後に、細胞を０．５μＣｉの［^３Ｈ］チミジンで刺激した。組み込まれた［^３Ｈ］チミジンの量を液体シンチレーション計数により定量した。この実験で、９Ｇ４ ＭＡｂは、ＩｇＧ１イソ型対照として用いた無関連抗体である。

【0357】

図３６に生データとして表された結果は、予測されたように、ＨＧＦがＨＵＶＥＣ細胞増殖の有効なインデューサーであることを示す。ＨＧＦの不在下で評価した抗体は、供試用量によらずＨＵＶＥＣに対するアゴニスト増殖活性を示さなかった。１１Ｅ１および２２４Ｇ１１ ＭＡｂの双方では、ＨＧＦの存在下で、劇的な用量依存的阻害が見られた。

【0358】

ＨＵＶＥＣ管形成の評価では、供試抗体とともに３０分インキュベートした２５０００の細胞を、マトリゲルをコーティングした４８ウェルプレートにプレーティングした。その後、ＨＧＦ５０ｎｇ／ｍｌを加え、プレートを３７℃でインキュベートした。その後、培地を採取し、５μＭのＣＭＦＤＡを１５分間加えた後に顕微鏡観察を行った。

【0359】

図３７に示された結果は、予測されたように、ＨＧＦが有意な管形成を誘導することを示す。ＩｇＧ１イソ型対照として含められた９Ｇ４抗体はＨＧＦ誘導管形成に対して効果は無かったが、１１Ｅ１および２２４Ｇ１１は双方とも劇的に管形成を阻害する。

【0360】

実施例１７：抗体１１Ｅ１のＣＤＲグラフトによるヒト化プロセス
Ｉ−軽鎖可変ドメインのヒト化
１１Ｅ１ ＶＬのヌクレオチド配列とネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、１１Ｅ１ ＶＬのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。

【0361】

それぞれＶ領域に関して９８．５８％、Ｊ領域に関して９７．２２％の配列同一性を有するネズミＩＧＫＶ４−７９^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために１１Ｅ１ ＶＬ配列をそのまま用いることにした。

【0362】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図３８Ａに、Ｊ遺伝子に関しては図３８Ｂに示す。

【0363】

１１Ｅ１ ＶＬのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、１１Ｅ１ ＶＬとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、１１Ｅ１ ＶＬのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。

【0364】

両生殖細胞系遺伝子について、Ｖ領域に関して６９．８６％の配列同一性を有するヒトＩＧＫＶ３−７＊０２およびＩＧＫＶ３Ｄ−７^＊０１が同定された。ＩＧＫＶ３−７^＊０２ヒト生殖細胞系遺伝子は、ＩＭＧＴデータベースにおいて「ＯＲＦ」として知られ、このことは、この配列がヒトゲノムに見られるものであったが、いくつかの組換えの問題が存在し、非機能的なＩＧＫＶ３−７^＊０２由来の天然抗体となった可能性があることを意味する。よって、ＩＧＫＶ３Ｄ−７^＊０１生殖細胞系遺伝子をネズミ１１Ｅ１ ＶＬ ＣＤＲに関する受容ヒトＶ領域として選択した。

【0365】

Ｊ領域に関しては、最良の相同性スコアがまずヒトで得られ、ヒトＩＧＫＪ３^＊０１は７８．３８％の配列同一性を示す。しかし、ヒトＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子とのアライメントで、より多数の連続同一ヌクレオチドおよびより良いアミノ酸一致が見られた（配列同一性７５．６８％）。よって、ＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子をネズミ１１Ｅ１ ＶＬ ＣＤＲの受容ヒトＪ領域として選択した。

【0366】

アライメントは、Ｖ領域に関しては図３９Ａに、Ｊ領域に関しては図３９Ｂに示す。

【0367】

選択の至適化のため、当業者ならば、選択の助けとするためにタンパク質配列間のアライメントを行うこともできる。

【0368】

ヒト化型１１Ｅ１ ＶＬ
ヒト化プロセスにおける以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＫＶ３Ｄ−７^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２およびまたネズミ１１Ｅ１ ＶＬのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0369】

図４０に示されているように、１１Ｅ１ ＶＬ配列における太字の残基は、１１Ｅ１ ＶＬドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＫＶ３Ｄ−７^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０２）の間で異なることが分かった３０のアミノ酸に相当する。

【0370】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、３０の異なる残基のうち４つが最終的に変異されていると特定された。これらの４つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＬ４からヒトＭ、Ｙ４０からＳ、Ｙ８７からＦおよびＴ９６からＰへのものである。これらランク１の残基を図４０に、１１Ｅ１ ＨＺＶＬ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0371】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0372】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、残基２４（Ｓ／Ｒ）、５３（Ｗ／Ｌ）、６６（Ｉ／Ｔ）、６７（Ｌ／Ｒ）、８６（Ｓ／Ｄ）、９５（Ｑ／Ｅ）、９９（Ａ／Ｆ）または１２１（Ｅ／Ｄ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0373】

もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、３０の異なるアミノ酸のうち他のランク３の１８の残基総てが再考可能である。

【0374】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0375】

図４０は、明らかに同定された上述の突然変異を有する、完成されたヒト化１１Ｅ１ ＶＬを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0376】

ＩＩ−重鎖可変ドメインのヒト化
１１Ｅ１ ＶＨのヌクレオチド配列とネズミ生殖細胞系遺伝子との比較
事前工程として、１１Ｅ１ ＶＨのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://imgt.cines.fr)のネズミ生殖細胞系遺伝子配列の部と比較した。

【0377】

それぞれＶ領域に関して９４．１０％、Ｄ領域に関して６６．６７％、Ｊ領域に関して１００％の配列同一性を有するネズミＩＧＨＶ１−７^＊０１、ＩＧＨＤ４−１^＊０１およびＩＧＨＪ３^＊０１生殖細胞系遺伝子が同定された。得られた同一性を考慮して、ヒト相同性を検索するために１１Ｅ１ ＶＨ配列をそのまま用いることにした。

【0378】

これらのアライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図４１Ａに、Ｄ遺伝子に関しては図４１Ｂに、Ｊ遺伝子に関しては図４１Ｃに示す。

【0379】

１１Ｅ１ ＶＨのヌクレオチド配列とヒト生殖細胞系遺伝子との比較
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、１１Ｅ１ ＶＨとの最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このため、１１Ｅ１ ＶＨのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベースのヒト生殖細胞系遺伝子配列の部とアラインした。選択の至適化に関しては、より良い相同性を検索するためにタンパク質配列間のアライメントを行った。

【0380】

これらの２つの補足的方法により、ネズミ１１Ｅ１ ＶＨ ＣＤＲに関して可能性のある２つの受容ヒトＶ配列が同定された。ヌクレオチドアライメントにより、７５．６９％の配列同一性を有するヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２生殖細胞系遺伝子が得られ、タンパク質アライメントにより、７１．１０％の配列同一性を有するヒトＩＧＨＶ１−４６^＊０１生殖細胞系遺伝子が得られる。

【0381】

Ｄ領域がＶＨドメイン内のＣＤＲ３領域に厳格に属していることは注目に値する。このヒト化プロセスは「ＣＤＲグラフト」アプローチに基づく。この戦略においては、最も近いヒトＤ領域の分析は有用でない。

【0382】

Ｊ領域の相同性検索により、８０．８５％の配列同一性を有するヒトＩＧＨＪ４^＊０３生殖細胞系遺伝子が同定された。

【0383】

よって、全体的な類似性の検索と配列アライメントから、ヒトＩＧＨＶ１−４６^＊０１ Ｖ生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４^＊０３ Ｊ生殖細胞系遺伝子が、ネズミ１１Ｅ１ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択された。

【0384】

アライメントは、Ｖ遺伝子に関しては図４２Ａに、Ｊ遺伝子に関しては図４２Ｂに示す。

【0385】

ヒト化型１１Ｅ１ ＶＨ
ヒト化プロセスにおける以下の工程は、選択された生殖細胞系遺伝子配列ＩＧＨＶ１−４６^＊０１およびＩＧＨＪ４^＊０３およびまたネズミ１１Ｅ１ ＶＨのＣＤＲをこれらの生殖細胞系遺伝子配列のフレームワークに連結することからなる。

【0386】

図４３に示されているように、１１Ｅ１ ＶＨ配列における太字の残基は、１１Ｅ１ ＶＨドメインと選択されたヒトフレームワーク（ヒトＦＲ、すなわち、ＩＧＨＶ１−４６^＊０１およびＩＧＨＪ４^＊０３）の間で異なることが分かった２６のアミノ酸に相当する。

【0387】

ＶＨ／ＶＬ境界、抗原結合またはＣＤＲ構造におけるそれらの既知の関与、ネズミ残基とヒト残基の間のアミノ酸クラスの変化、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在などのいくつかの基準を考慮して、２６の異なる残基のうち５つが最終的に変異されていると特定された。これらの５つの最も重要な定義された残基およびそれらのヒト対応物への突然変異は、ネズミＮ４０からヒトＨ、Ｙ５５からＩ、Ｄ６６からＳ、Ａ８０からＲおよびＫ８２からＴへのものである。これらランク１の残基を図４３に、１１Ｅ１ ＨＺＶＨ配列に太字の残基として示す（そこでは、それらはネズミのままである）。

【0388】

もちろん、上述の検討残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。

【0389】

分子モデルの助けで、他の突然変異を同定することもできる。もう１つの好ましい実施形態では、次のランク２の残基、すなわち、残基５３（Ｉ／Ｍ）、７１（Ｌ／Ｆ）、７６（Ａ／Ｖ）、７８（Ｌ／Ｍ）および８７（Ａ／Ｖ）が挙げられ、これらにおける突然変異も考えることができる。

【0390】

もちろん、最終的に検討する上述の残基に限定されるものではなく、好ましい突然変異として考えるべきである。もう１つの好ましい実施形態では、２６の異なるアミノ酸のうち他のランク３の１６の残基総てが再考可能である。

【0391】

上述の突然変異は総て、個々にまたは種々の組合せで検討される。

【0392】

図４３は、明らかに同定された上述の突然変異を有する、完成されたヒト化１１Ｅ１ ＶＨを表す。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0393】

実施例１８：ｃ−ｍｅｔリン酸化に対する精製Ｍａｂの効果
実施例３において、リン酸化に対する抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂの効果を、評価する各ハイブリドーマからの投与上清を評価した。精製１１Ｅ１および２２４Ｇ１１ Ｍａｂを用い、終濃度３０μｇ／ｍｌ（２００ｎＭ）かまたは各抗体のＩＣ_５０を求めるために０．００１５〜３０μｇ／ｍｌ（０．０１〜２００ｎＭ）の用量範囲のいずれかで評価する試験を再び行った。用いたプロトコールは実施例３に記載されているものと同じである。

【0394】

独立した３回の実験の結果を図４４に示すが、ひと度精製された１１Ｅ１および２２４Ｇ１１は、Ａ５４９細胞に単独で加えた場合にアゴニスト効果を示さず、ＨＧＦの存在下でのアンタゴニスト効果はそれぞれ８７％および７５％であった。予測されたように、アゴニスト陽性対照として含められた５Ｄ５ Ｍａｂは、単独で加えた場合に有意な（５８％）アゴニスト効果を示し、ＨＧＦの存在下では中程度のアンタゴニスト効果（３９％）を示したに過ぎなかった。ＥＣ_５０の算出に関しては、１１Ｅ１および２２４Ｇ１１はナノモルのＩＣ_５０を有していた。

【0395】

実施例１９：ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおける２２４Ｇ１１およびナベルビン（登録商標）のin vivo組合せ
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を指数増殖期にある移植２日前に分割した。１０００万個のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を無胸腺ヌードマウスに移植した。移植５日後に腫瘍は測定可能となり、動物を匹敵するサイズの６匹の群に分けた。マウスに負荷量２ｍｇの２２４Ｇ１１ Ｍａｂ／マウスをｉ．ｐ．処置し、その後、１週間に２回、３８日まで、１ｍｇの抗体／マウス、または８ｍｇ／ｋｇのナベルビン（登録商標）注射３回（５日目、１２日目、１９日目）をｉ．ｐ．処置した。併用処置を施した第三群も含めた。ナベルビン（登録商標）はｉ．ｐ．注射により与えた。腫瘍体積は１週間に２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さにより計算し、動物の体重をナベルビン（登録商標）処置中、毎日モニタリングした。統計分析は、ｔ検定かマン・ホイットニー検定のいずれかを用い、各測定時において行った。この実験では、最初の注射から４１日後の単独療法処置群の平均腫瘍体積は、２２４Ｇ１１、ナベルビン（登録商標）およびナベルビン（登録商標）＋２２４Ｇ１１に関してそれぞれ７２％、７６％および９９．８％減少する。４１日目に、併用療法は単独療法処置に比べて腫瘍増殖を有意に改善し（４１日目にナベルビン（登録商標）単独に比べてｐ≦０．０４１、２２４Ｇ１１に比べてｐ≦０．００２）、併用療法では６匹のうち４匹が腫瘍を持っていなかった。結果を図４５に示す。

【0396】

これらの結果は処置終了後５０日（８８日目）に確認したものであり、この時、併用処置受容マウスの６６％が依然として腫瘍を持っていなかった。

【0397】

実施例２０：ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおける２２４Ｇ１１とドキソルビシンのin vivo組合せ
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を指数増殖期にある移植２日前に分割した。１０００万個のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を無胸腺ヌードマウスに移植した。移植５日後に腫瘍は測定可能となり、動物を匹敵するサイズの６匹の群に分けた。マウスに負荷量２ｍｇの２２４Ｇ１１ Ｍａｂ／マウスをｉ．ｐ．処置し、その後、１週間に２回、１ｍｇの抗体／マウス、または５ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン注射４回（５日目、１２日目、１９日目、２６日目）をｉ．ｐ．処置した。併用処置を施した第三群も含めた。ドキソルビシンはｉ．ｖ．注射により与えた。腫瘍体積は１週間に２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さにより計算し、動物の体重をドキソルビシン処置中、毎日モニタリングした。統計分析は、ｔ検定かマン・ホイットニー検定のいずれかを用い、各測定時において行った。単独療法および併用療法とも、対照群に比べて有意な抗腫瘍活性を示した（１１日目〜３９日目 ｐ≦０．００２）。結果を図４６に示す。

【0398】

併用処置も、１１日目〜３９日目に単独療法処置に比べて有意な抗腫瘍増殖活性を示し、ドキソルビシンと抗ｃ−Ｍｅｔ処置を組み合わせることに利点があることを示唆する。

【0399】

実施例２１：ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルに対する２２４Ｇ１１とドセタキセルのin vivo組合せ
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を指数増殖期にある移植２日前に分割した。９００万個のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を無胸腺ヌードマウスに移植した。移植５日後に腫瘍は測定可能となり、動物を匹敵するサイズの６匹の群に分けた。マウスに負荷量２ｍｇの２２４Ｇ１１ Ｍａｂ／マウスをｉ．ｐ．処置し、その後、１週間に２回、１ｍｇの抗体／マウスまたは７．５ｍｇ／ｋｇのドセタキセル注射４回（５日目、１２日目、１９日目、２６日目）をｉ．ｐ．処置した。併用処置を施した第三群も含めた。ドセタキセルはｉ．ｐ．注射により与えた。腫瘍体積は１週間に２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さにより計算し、動物の体重をドセタキセル処置中、毎日モニタリングした。統計分析は、ｔ検定かマン・ホイットニー検定のいずれかを用い、各測定時において行った。単独療法および併用療法とも、対照群に比べて有意な抗腫瘍活性を示した（１１日目〜３５日目 ｐ≦０．００２）。結果を図４７に示す。

【0400】

併用処置も、１８日目〜３５日目に単独療法処置に比べて有意な抗腫瘍増殖活性を示し、ドセタキセルと抗ｃ−Ｍｅｔ処置を組み合わせることに利点があることを示唆する。

【0401】

実施例２２：Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルに対する２２４Ｇ１１およびテモゾロマイドのin vivo組合せ
ＡＴＣＣからのＵ８７−ＭＧ細胞を通常、ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を指数増殖期にある移植２日前に分割した。５００万個のＵ８７−ＭＧ細胞を無胸腺ヌードマウスに移植した。移植１９日後に腫瘍は測定可能となり、動物を匹敵するサイズの６匹の群に分けた。マウスに負荷量２ｍｇの２２４Ｇ１１ Ｍａｂ／マウスをｉ．ｐ．処置し、その後、１週間に２回、１ｍｇの抗体／マウスまたは５ｍｇ／ｋｇのテモゾロマイド注射３回（１９日目、２６日目、３３日目）をｉ．ｐ．処置した。併用処置を施した第三群も含めた。テモゾロマイドはｉ．ｐ．注射により与えた。腫瘍体積は１週間に２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さにより計算し、動物の体重をテモゾロマイド処置中、毎日モニタリングした。統計分析は、ｔ検定かマン・ホイットニー検定のいずれかを用い、各測定時において行った。単独療法および併用療法とも、対照群に比べて有意な抗腫瘍活性を示した（２２日目〜３２日目 ｐ≦０．００２）（対照マウスは倫理的な理由で安楽死させた）。結果を図４８に示す。

【0402】

併用処置も単独療法処置に比べて有意な抗腫瘍増殖活性を示す（テモゾロマイドでは２２日目〜４３日目（対照マウスは倫理的な理由で安楽死させた）ｐ≦０．００２、２２４Ｇ１１では２９日目〜５３日目（処置の最終日））。これらのデータを考え合わせると、テモゾロマイドと抗ｃ−Ｍｅｔ処置を組み合わせることに利点があることを示唆する。

【0403】

実施例２３：スフェロイド形成
他のＭａｂに関して実施例９にすでに記載されているように、本発明者らはＵ８７−ＭＧスフェロイドモデルにおいて２２４Ｇ１１ Ｍａｂのin vitro腫瘍増殖阻害能を評価した。そのため、単層として増殖させたＵ８７−ＭＧ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、完全細胞培養培地に再懸濁させた。６２５個の細胞を丸底９６プレートの一ウェルのＤＭＥＭ−２．５％ＦＣＳ中に接種することによりスフェロイドを誘導した。底に細胞が接着するのを防ぐため、プレートを９５％エタノール中ポリＨＥＭＡでプレコーティングし、室温で風乾させた。これらのプレートを、加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ_２の標準細胞培養条件下でインキュベートした。スフェロイド培養４〜１０日後に精製モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。スフェロイドは１７日間、培養維持した。その後、ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウエアの自動測定モジュールを用いてスフェロイドの面積を測定することにより、スフェロイドの成長をモニタリングした。面積はμｍ^２で表した。各条件につき８〜１６個のスフェロイドを評価した。抗体の添加前、培養１０日後および培養１７日後のスフェロイドの大きさを測定した。

【0404】

この条件で均質なスフェロイドが得られ、抗体の添加前には統計学的な違いは見られなかった（図４９Ａ）。

【0405】

図４９Ｂ〜４９Ｄに示されるように、イソ型対照９Ｇ４は、培養１０日後または１７日後のスフェロイドの成長に影響を及ぼさなかった。５Ｄ５の添加はスフェロイドの大きさに大きな影響を及ぼさなかったが、２２４Ｇ１１および１１Ｅ１のいずれかの添加は腫瘍増殖を著しく阻害した。

【0406】

実施例２４：ホスホ−ｃ−Ｍｅｔアッセイにおけるキメラ型およびヒト化型２２４Ｇ１１のin vitro活性
機能的アッセイにおいてネズミ型、キメラ型およびヒト化型のin vitro有効性を比較するため、２２４Ｇ１１ハイブリドーマから得られる培養上清およびＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞を投与し、実施例３に記載のとおりに試験した。図５０にまとめられたデータは、図６Ｂにすでに記載されているように、未精製ネズミ抗体に関して予測された結果を示した。キメラおよびヒト化未精製抗体はいずれも、単独で加えた場合（図５０Ａ）またはＨＧＦの存在下でインキュベートした場合（図５０Ｂ）のいずれかにおいて匹敵する活性を示した。

【0407】

実施例２５：Ｂｉａｃｏｒｅ分析による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の親和性定数（ＫＤ）の決定
精製１１Ｅ１および２２４Ｇ１１抗体の結合親和性は、抗原として、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン(R&D Systems)と融合された組換えｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＭＷ＝１２９ｋＤａ）を用い、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘにより検討した。ｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質と抗体は双方とも二価の化合物であるので、パパイン切断によりｍＡｂ １１Ｅ１および２２４Ｇ１１のＦａｂフラグメント（ＭＷ＝５０ｋＤａ）を作製し、精製し、アビジティーパラメーターとの干渉を避けるためにこのアッセイで用いた。アッセイのため、抗ヒスチジンタグ捕捉抗体をＣＭ５センサーチップにコーティングした。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰであり、流速は３０μｌ／ｍｉｎとし、試験は２５℃で行った。可溶性ｃ−Ｍｅｔ（ＥＣＤ＿Ｍ１）_２−Ｆｃ−（ＨＨＨＨＨＨ）_２抗原をセンサーチップ上に捕捉し（２７０ＲＵ前後）、供試抗体をアナライトとして液相中で用いた。センサーチップを、両フローセル上で、グリシン、ＨＣｌ ｐＨ１．５バッファーを用いて１分３０秒再生した。

【0408】

図５１はこの分析の原理を示す。得られた動態パラメーターを以下の表４にまとめる。それらは、１１Ｅ１および２２４Ｇ１１抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が組換えｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質と、約４０ｐＭの範囲の匹敵する親和性で結合することを示す。

【0409】

【表4】

【0410】

実施例２６：無胸腺ヌードマウスにおけるヒトＨＧＦ供給源としてのＭＲＣ５細胞を同時移植したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する２２４Ｇ１１のin vivo活性
ＡＴＣＣからのＭＤＡ−ＭＢ−２１３およびＭＲＣ５細胞を通常、ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミンで培養した。細胞を指数増殖期にある移植２日前に分割した。５００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２１３細胞および５０００００個のＭＲＣ５細胞を無胸腺ヌードマウスに同時移植した。移植１２日後に腫瘍は測定可能となり、動物を匹敵するサイズの６匹の群に分けた。マウスに負荷量２ｍｇの２２４Ｇ１１ Ｍａｂ／マウスをｉ．ｐ．処置し、その後、１週間に２回、１ｍｇの抗体／マウスをｉ．ｐ．処置した。腫瘍体積は１週間に２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さにより計算した。

【0411】

図５２に記載されている結果は、対照群の１つと比べ、２２４Ｇ１１で処置したマウスの腫瘍成長中央値における有意な差を示した。

【0412】

実施例２７：抗体２２７Ｈ１、１１Ｅ１および２２４Ｇ１１のヒト化に対する補足的要素
一般法
抗ｃＭｅｔ抗体のヒト化は、各可変ドメインにおいて分析されたアミノ酸に関して各鎖独立に順次行った。このヒト化プロセスを、最初の試みとして、組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイで評価し、ヒト化抗体の結合活性を組換えキメラ抗体と比較する。第二の試みにおいて、抗ｃＭｅｔヒト化抗体をプラスチックにコーティングされた組換えＨＧＦ上へのＦｃ−ｃＭｅｔの結合に取って代わる能力に関して評価し、この競合アッセイによりネズミ型、キメラ型およびヒト化型の抗ｃＭｅｔ抗体の比較が可能となる。

【0413】

図５３および５４は、２２７Ｈ１、１１Ｅ１および２２４Ｇ１１ネズミモノクローナル抗体の典型的な抗ｃＭｅｔ結合を例示している。

【0414】

図５３は、検出された精製ネズミ抗体の抗ｃＭｅｔ直接結合活性を示す。このアッセイでは、ネズミモノクローナル抗ｃＭｅｔ抗体は様々であるが、なお用量依存的な抗ｃＭｅｔ結合活性を示す。

【0415】

図５４は、精製ネズミ抗体のＨＧＦ−ｃＭｅｔ結合競合活性を示す。この競合アッセイから、１１Ｅ１モノクローナル抗体に対して中程度であって、完全なものではないが、信頼できる競合活性を有するこれらの抗ｃＭｅｔモノクローナル抗体間の信頼できる違いが明らかになり、一方、ネズミ２２４Ｇ１１および２２７Ｈ１は、高い抗体濃度で最大ＨＧＦ結合置換１００％という類似の競合活性パターンを示す。２２４Ｇ１１モノクローナル抗体は最良のＩＣ_５０値を示す。

【0416】

ネズミ抗体の直接結合活性はそれら固有のＨＧＦ結合競合特性を反映していないことは注目に値する。

【0417】

これら２つのアッセイを用いて、ネズミ抗ｃＭｅｔ抗体の組換えキメラ型およびヒト化型の特性決定を行った。このため、要するに、ネズミまたはヒト化型の抗ｃＭｅｔ可変ドメインをＬＯＮＺＡのｐＣＯＮｐｌｕｓ発現ベクター系にクローニングし、組換えＩｇＧｉ／κ由来抗体をＣＨＯ細胞で発現させた。発現培養上清を濃縮し、ＰＢＳに対して十分に透析した後、発現した抗体濃度に関して用量を決定し、そのまま対応する抗ｃＭｅｔ結合活性の評価に用いた。組換えキメラ型またはヒト化型をより良く特性決定するため、直接結合アッセイおよびＨＧＦ競合アッセイの双方を評価した。

【0418】

実施例２７−１：２２７Ｈ１重鎖可変ドメインのヒト化
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２７Ｈ１ ＶＨネズミ配列と最大の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。このようにして、ＩＭＧＴデータベースの助けで、ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２Ｖ生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４^＊０１ Ｊ生殖細胞系遺伝子を、ネズミ２２７Ｈ１ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒト配列が選択された。

【0419】

図５５は、ネズミ２２７Ｈ１ ＶＨドメインと選択されたヒトフレームワークとのアミノ酸アライメントを表す。ヒトＦＲレーンでは、２２７Ｈ１ネズミＶＨドメインと異なることが分かったアミノ酸のみを表す。ＨＺ３ＶＨ、ＨＺ２ＶＨおよびＨＺ１ＶＨレーンは、明らかに同定された上述（「変化」レーン）の突然変異を有する２２７Ｈ１ ＶＨドメインの完成されたヒト化型に相当する。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0420】

第一の一連の実験では、本発明者らは、２２７Ｈ１キメラ軽鎖と組み合わさって発現される場合の、第一の３つのヒト化型２２７Ｈ１ネズミＶＨドメインを構築し、その抗ｃＭｅｔ結合活性を分析した。抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイから得られた結果を図５６に示す。この実験において、供試キメラまたは部分的ヒト化組換え抗体の結合能に違いは見られなかった。この点で、ネズミ２２７Ｈ１ ＶＨドメインと選択されたヒトフレームワークの間に違いが見られた３２のアミノ酸のうち２６を分析したところ、キメラ軽鎖と組み合わせた場合、２２７Ｈ１ヒト化ＶＨドメインの抗ｃＭｅｔ結合活性には無関連であることが分かった。

【0421】

ＨＺ１ＶＨヒト化型２２７Ｈ１ ＶＨドメインの最後の６つのネズミ残基の部位特異的突然変異誘発分析に関して、本発明者らは原型のＨＺ４ＶＨ「完全ＩＭＧＴヒト化」を構築し、その抗ｃＭｅｔ結合特性を試験した。結果は、直接結合アッセイに関しては図５７に、ＨＧＦ結合競合アッセイに関しては図５８に示す。組換えキメラ型とヒト化型双方の２２７Ｈ１は親ネズミ抗体よりも良好な競合活性を示すことは注目に値する。

【0422】

しかしながらやはり、「完全ＩＭＧＴ」ヒト化２２７Ｈ１ ＶＨドメインの抗ｃＭｅｔ結合特性に関して得られた実験データを考慮して、図５９に示される、結果として得られるアミノ酸配列が選択され、次に、バイオインフォマティック分析を行い、いわゆる２２７Ｈ１−ＨＺ ＶＨヒト化可変ドメインの「ヒト性」レベルを評価した。

【0423】

このため、ＩＭＧＴツールを用い、ヒトデータベースに対するフレームワーク配列の単純な比較を行った。フレームワーク残基に相当する分析した８９のアミノ酸のうち、このプロセスの間に本発明者らが到達したヒト化レベルが与えられれば、８９がヒト起源を持つと信頼できることが分かった。ＣＤＲに由来する残基だけが異なることが分かるが、もしそうであれば、対応するヒト生殖細胞系遺伝子と違いがあり、明らかに超可変性の位置にある。ＩＭＧＴナンバリング体系および相同性分析ツールに基づき、本発明者らはまず、ネズミ起源の抗体可変ドメインを完全にヒト化した。

【0424】

実施例２７−２：１１Ｅ１モノクローナル抗体のヒト化
Ｉ−１１Ｅ１重鎖可変ドメインのヒト化
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、１１Ｅ１ ＶＨネズミ配列と最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。よって、ＩＭＧＴデータベースの助けで、ヒトＩＧＨＶ１−４６^＊０１ Ｖ生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４^＊０３ Ｊ生殖細胞系遺伝子をネズミ１１Ｅ１ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択した。

【0425】

図６０は、ネズミ１１Ｅ１ ＶＨドメインと選択されたヒトフレームワークとのアミノ酸アライメントを示す。ヒトＦＲレーンでは、１１Ｅ１ネズミＶＨドメインとは異なることが分かったアミノ酸のみを示す。ＨＺ ＶＨ３、ＨＺ ＶＨ２およびＨＺ ＶＨ１レーンは、明らかに同定された上述（「変化」レーン）の突然変異を有する、完成されたヒト化型１１Ｅ１ ＶＨドメインに相当する。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0426】

第一の一連の実験では、本発明者らは、１１Ｅ１キメラ軽鎖と組み合わさって発現される場合の、第一の３つのヒト化型１１Ｅ１ネズミＶＨドメインを構築し、その抗ｃＭｅｔ結合活性を分析した。抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイから得られた結果を図６１に示す。この実験において、供試１１Ｅ１由来キメラまたは部分的ヒト化組換え抗体の類似の結合能が見られた。この点で、ネズミ１１Ｅ１ ＶＨドメインと選択されたヒトフレームワークの間に違いが見られた２４のアミノ酸のうち１９を分析したところ、キメラ軽鎖と組み合わせた場合、１１Ｅ１ヒト化ＶＨドメインの抗ｃＭｅｔ結合活性には無関連であることが分かった。

【0427】

ＩＩ−１１Ｅ１軽鎖可変ドメインのヒト化
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、１１Ｅ１ ＶＬネズミ配列と最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。よって、ＩＭＧＴデータベースの助けで、ヒトＩＧＫＶ３Ｄ−７^＊０１ Ｖ生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＫＪ４^＊０１ Ｊ生殖細胞系遺伝子をネズミ１１Ｅ１ ＶＬ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択した。

【0428】

図６２は、ネズミ１１Ｅ１ ＶＬドメインと選択されたヒトフレームワークとのアミノ酸アライメントを示す。ヒトＦＲレーンでは、１１Ｅ１ネズミＶＬドメインとは異なることが分かったアミノ酸のみを示す。ＨＺ ＶＬ３、ＨＺ ＶＬ２およびＨＺ ＶＬ１レーンは、明らかに同定された上述（「変化」レーン）の突然変異を有する、完成されたヒト化型１１Ｅ１ ＶＬドメインに相当する。提案された各突然変異の下の数字は、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0429】

第一の一連の実験では、本発明者らは、１１Ｅ１キメラ重鎖と組み合わさって発現される場合の、第一の３つのヒト化型１１Ｅ１ネズミＶＬドメインを構築し、その抗ｃＭｅｔ結合活性を分析した。抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイから得られた結果を図６３に示す。この実験において、供試１１Ｅ１由来キメラまたは部分的ヒト化組換え抗体の類似の結合能が見られた。この点で、ネズミ１１Ｅ１ ＶＬドメインと選択されたヒトフレームワークの間に違いが見られた３０のアミノ酸のうち２６を分析したところ、キメラ重鎖と組み合わせた場合、１１Ｅ１ヒト化ＶＬドメインの抗ｃＭｅｔ結合活性には無関連であることが分かった。

【0430】

ＩＩＩ−１１Ｅ１抗体のヒト化
１１Ｅ１モノクローナル抗体のヒト化のこの段階で、得られる理論的ヒト化抗体配列は、親ネズミＶＨドメイン由来の５つのＣＤＲ外残基と親ネズミＶＬ配列に由来の４つのＣＤＲ外残基のみを含む（図６０、レーンＨＺ ＶＨ１および図６２、レーンＨＺ ＶＬ１参照）。次に、得られた１１Ｅ１抗体の重鎖および軽鎖ヒト化型を組み合わせたものをすぐに特性決定することにした。結果は、抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイに関して図６４に示す。

【0431】

この実験では、供試１１Ｅ１由来キメラまたはヒト化組換え抗体に関して類似の結合能が見られた。ＨＧＦ結合競合特性の分析および残っている９つのネズミ残基の分布の部位特異的突然変異誘発分析を独立に、またはこの選択されたＶＨ１／ＶＬ１「プレヒト化」型１１Ｅ１モノクローナル抗体と組み合わせて行った。

【0432】

実施例２７−３：２２４Ｇ１１モノクローナル抗体ヒト化
Ｉ−２２４Ｇ１１重鎖可変ドメインのヒト化
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２４Ｇ１１ ＶＨネズミ配列と最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。

【0433】

２２４Ｇ１１と２２７Ｈ１ ＶＨドメイン配列との高い配列相同性を考慮して、また、ＩＭＧＴデータベースツールの使用により確認されたように、同じヒトＩＧＨＶ １−２^＊０２Ｖ生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４^＊０１ Ｊ生殖細胞系遺伝子がこのようにネズミ２２４Ｇ１１ ＶＨ ＣＤＲに関する受容ヒト配列として選択された。

【0434】

この高い相同性に基づき、２２７Ｈ１ ＶＨドメインのヒト化（実施例２７参照）から得られたヒト化情報を移行することにし、次に、本発明者らは、選択されたヒトフレームワークを有するネズミ２２７Ｈ１および２２４Ｇ１１ＶＨドメインのアミノ酸アライメントを表す、図６５に示されているような「完全ＩＭＧＴ」ヒト化型を設計した。ヒトＦＲレーンでは、２２４Ｇ１１ネズミＶＨドメインとは異なることが分かったアミノ酸のみを示す。ＨＺＶＨ０レーンは、「完全ＩＭＧＴ」２２７Ｈ１−ＨＺＶＨドメインに関して得られた「完全ＩＭＧＴ」ヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＨドメインに相当する。

【0435】

次に、「完全ＩＭＧＴ」ヒト化型２２４Ｇ１１ネズミＶＨドメインを構築し、２２４Ｇ１１キメラ軽鎖と組み合わさって発現される場合の、その抗ｃＭｅｔ結合活性を分析した。抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイから得られた結果を図６６に示し、図６７はＨＧＦ結合競合アッセイを示す。「完全ＩＭＧＴ」ヒト化２２４Ｇ１１ ＶＨドメインの抗ｃＭｅｔ結合特性に関して得られた実験データを考慮し、図６５に示される、結果として得られるアミノ酸配列が選択され、次に、バイオインフォマティック分析を行い、いわゆる２２４Ｇ１１−ＨＺ ＶＨ０ドメインの「ヒト性」レベルを評価した。

【0436】

ここで適用されたヒト化戦略を考える場合、２２４Ｇ１１ ＨＺ ＶＨ０配列のヒト性分析に関して実施例２７を参照しなければならない。２２７Ｈ１ ＶＨドメインのヒト化に関して記載されているように、本発明者らはＩＭＧＴナンバリング体系および相同性分析ツールの信頼性を確認し、また、それらの固有の相同性の制限下で、このヒト化戦略を抗体間で移行できる可能性を示す。

【0437】

ＩＩ−２２４Ｇ１１軽鎖可変ドメインのヒト化
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するため、２２４Ｇ１１ ＶＬネズミ配列と最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。ＩＭＧＴデータベース分析ツールの助けで、ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬ ＣＤＲに関する２つの可能性のある受容ヒトＶ領域が同定された。そして、２２４Ｇ１１ ＶＬ ドメインに関して２つのヒト化戦略が計画された。１つはＣＤＲ１長の短いヒトフレームワークに関する最初の試みに相当し（ＩＧＫＶ３−１１^＊０１）、もう１つはＣＤＲ１長の長いものに相当する（ＩＧＫＶ４−１^＊０１）。

【0438】

図６８は、ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬドメインと２つの選択されたヒトフレームワークとのアミノ酸アライメントを示す。短鎖型および長鎖型Ｈｕ−ＦＲ双方のＦＲレーンでは、２２４Ｇ１１ネズミＶＬドメインとは異なることが分かったアミノ酸のみを示す。ＨＺ ＶＬ３およびＨＺ ＶＬ６レーンは、明らかに同定された上述（「ランク」レーン）の突然変異を有する２２４Ｇ１１ ＶＬドメインの基本ヒト化型に相当する。提案された各突然変異の下の数字は、基本「短鎖型」ＣＤＲ１フレームワークが選択される場合であれ「長鎖型」ＣＤＲ１フレームワークが選択される場合であれ、その突然変異がなされるランクに相当する。

【0439】

第一の一連の実験では、２２４Ｇ１１ネズミＶＬドメインのこれらの２つの基本ヒト化型を構築し、２２４Ｇ１１キメラ重鎖と組み合わさって発現される場合の、その抗ｃＭｅｔ結合活性を分析した。抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイから得られた結果を図６９に示す。この実験において、キメラおよびＨＺ ＶＬ６（「長鎖ＣＤＲ１」）型に関しては類似の抗ｃＭｅｔ結合活性が得られたが、ＨＺ ＶＬ３「短鎖ＣＤＲ１」）組換え２２４Ｇ１１由来抗体に関しては結合はほとんど検出されなかった。

【0440】

第二の一連の実験では、本発明者らは、２２４Ｇ１１キメラ重鎖と組み合わさって発現される場合の、完成されたヒト化型ＨＺ ＶＬ６由来２２４Ｇ１１ ＶＨドメインを構築し、その抗ｃＭｅｔ結合活性を分析した。さらに２つのヒト化型も分析し、ＨＺ ＶＬ５型では、第三群（ランク３）の７残基がヒト化され、ＨＺ ＶＬ４型では、第一群（ランク１）の４残基だけがネズミのままであった。

【0441】

抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイから得られた結果を図７０に示す。この実験において、供試２２４Ｇ１１由来キメラまたは部分的ヒト化組換え抗体の結合能に違いは見られなかった。この点で、ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬドメインと選択された「長鎖ＣＤＲ１」ヒトフレームワークの間に違いが見られた２２のアミノ酸のうち１８を分析したところ、キメラ重鎖と組み合わせた場合、２２４Ｇ１１ヒト化ＶＬドメインの抗ｃＭｅｔ結合活性には無関連であることが分かった。

【0442】

次に、このＨＺ ＶＬ４ヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＬドメインのＨＧＦ結合競合アッセイを調べた。図７１に示されるように、得られた結果は、ネズミおよび組換えキメラおよびＨＺ ＶＬ４ヒト化２２４Ｇ１１由来抗体の類似の競合活性を示す。

【0443】

２２４Ｇ１１ ＶＬドメインのヒト化のこの段階で、得られた配列に含まれるネズミ親配列からのＣＤＲ外残基は４個だけである。図７２に示されるように、§で表示されたこれらの４残基はＬ４、Ｍ３９、Ｈ４０およびＲ８４である。

【0444】

ＩＭＧＴナンバリング体系および相同性分析ツールに基づき、本発明者らは、ＣＤＲ長に関して構造的な違いを示すヒトフレームワークはヒト化プロセスになお好適であり得ることを示した。次に、得られた重鎖および軽鎖ヒト化型２２４Ｇ１１抗体を特性決定することにした。次に、ＶＨ０ヒト化型重鎖と組み合わさって発現される場合の、残っている４つのネズミ残基の分布の部位特異的突然変異誘発分析を行った。

【0445】

ＩＩＩ−２２４Ｇ１１抗体のヒト化
第一の一連の実験では、本発明者らは、完全ヒト化型２２４Ｇ１１抗体を構築し、その抗ｃＭｅｔ結合活性を分析した。この組換え型はそれぞれＶＨ０およびＶＬ４ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインを包含する。抗ｃＭｅｔ直接結合アッセイから得られた結果を図７３に示す。この実験において、完全ヒト２２４Ｇ１１抗ｃＭｅｔ結合活性は「単鎖」ヒト化およびキメラ組換え２２４Ｇ１１型のものと類似していることが分かった。

【0446】

次に、ＨＧＦ結合競合アッセイにおいて２２４Ｇ１１ ＶＬドメインの完全ヒト化型を調べた。得られた結果は、図７４に示されるように、親ネズミおよび組換えキメラおよび完全ヒト化２２４Ｇ１１由来抗体の類似の競合活性を示す。

【0447】

２２４Ｇ１１抗体ヒト化のこの段階で、得られた配列に含まれるネズミ親軽鎖可変ドメイン配列からのＣＤＲ外残基は４個だけである。本発明者らは、次に、ＶＨ０ヒト化重鎖と組み合わさって発現される場合の、ＶＬ４ヒト化ＶＬドメインの部位特異的突然変異誘発単一変異体を分析した。直接結合アッセイに関して図７５に例示されるように、本発明者らは、調べた４つから可能性のある関連残基を同定した（Ｍ３９とＨ４０）。

【0448】

ＨＺ ＶＨ０ヒト化２２４Ｇ１１ＶＨドメインと組み合わさって発現される場合の、ＨＺ ＶＬ４ヒト化２２４Ｇ１１ＶＬドメインの多重突然変異体を分析することにした。直接結合アッセイに関して図７６に、また、ＨＧＦ結合競合アッセイに関して図７７に示されるように、ＶＬ４ドメインの複数のアミノ酸突然変異体を分析し、最良のヒト化組合せを特定した。単一突然変異体分析に基づけば、最良の抗ｃＭｅｔ活性を示し得る二重および三重突然変異体に着目された。ＶＨ０／ＶＬ４−２ｘ突然変異体は、二重突然変異Ｌ４Ｍ／Ｒ８４Ｇを有するＨＺ ＶＬ４ ２２４Ｇ１１ヒト化ＶＬドメインとともに発現されたＨＺ ＶＨ０ ２２４Ｇ１１ヒト化ＶＨドメインに相当する。ＶＨ０／ＶＬ４−３ｘ突然変異体は、三重突然変異Ｌ４Ｍ／Ｍ３９Ｌ／Ｒ８４Ｇを有するＨＺ ＶＬ４ ２２４Ｇ１１ヒト化ＶＬドメインとともに発現されたＨＺ ＶＨ０ ２２４Ｇ１１ヒト化ＶＨドメインに相当する。

【0449】

完全ヒト化２２４Ｇ１１抗体の抗ｃＭｅｔ結合特性に関して得られた実験データを校了し、次に、重鎖および軽鎖双方の可変ドメイン配列のバイオインフォマティック分析を行い、ＶＨ０／ＶＬ４−２ｘおよびＶＨ０／ＶＬ４−３ｘの最良のヒト化型の「ヒト性」レベルを評価した。ＶＨ０ ２２４Ｇ１１ ＶＨドメインの「完全ＩＭＧＴ」ヒト化は予め示されていた。ＶＬ４−２ｘおよび−３ｘ２２４Ｇ１１ヒト化ＶＬドメイン型のヒト性レベルを考慮すれば、それらはネズミ残基Ｍ３９および／またはＨ４０のみを含む。これら２つの可能性のある重要な残基はＣＤＲ１の末端に位置し、Ｍ３９はＮ末端ＣＤＲアンカーである。本発明者らが２２４Ｇ１１ ＶＬドメインのヒト化の際に直面したＣＤＲ長の問題を考慮し、また、それらの位置をＶＬ ＣＤＲ１のＫａｂａｔ定義の一部と考えれば、完全ヒト化２２４Ｇ１１抗体のヒト性レベルは、保存されたネズミ残基が最小限であるため免疫原性の著しい低減を示すはずである。

【図面の簡単な説明】

【0450】

【図1】選択された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＦＡＣＳプロフィールの例。

【図2】ｃ−Ｍｅｔを標的とする抗体によるＢＸＰＣ３増殖のイン・ビトロ阻害。

【図3】ｃ−Ｍｅｔ二量体化の阻害。

【図4】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体によるタンパク質認識。

【図5】ＢＩＡｃｏｒｅ分析による１１Ｅ１および５Ｄ５の「エピトープマッピング」。

【図6】ｃ−Ｍｅｔリン酸化に対するＭＡｂの効果。

【図7】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による放射性標識ＨＧＦの置換。

【図8】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による浸潤の阻害［この図では、ＳＶＦはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を意味する］。

【図9】創傷治癒に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効果。

【図10】拡散アッセイ。

【図11】三次元管形成アッセイ。

【図12】スフェロイド形成に対する抗体の効果。

【図13】Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおける抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂのイン・ビボ活性。

【図14】腫瘍細胞系統セットによるＨＧＦ発現。

【図15】ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞系統の特性決定；図１５Ａは定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に相当し、図１５ＢはＦＡＣＳ分析に相当する。

【図16】ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルに対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のイン・ビボ活性。

【図17A】ネズミＩＧＫＶ３−５^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＬのアライメント。

【図17B】ネズミＩＧＫＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＬのアライメント。

【図18A】ヒトＩＧＫＶ３−１１^＊０１およびＩＧＫＶ４−１^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＬのアライメント。

【図18B】ヒトＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＬのアライメント。

【図19A】突然変異を有する、ＩＧＫＶ３−１１^＊０１に基づくヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＬ。

【図19B】突然変異を有する、ＩＧＫＶ４−１^＊０１に基づくヒト化型２２４Ｇ１１ ＶＬ。

【図20A】ネズミＩＧＨＶ１−１８^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＨのアライメント。

【図20B】ネズミＩＧＨＤ２−４^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＨのアライメント。

【図20C】ネズミＩＧＨＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＨのアライメント。

【図21A】ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＨのアライメント。

【図21B】ヒトＩＧＨＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２４Ｇ１１ ＶＨのアライメント。

【図22】突然変異を有するヒト化２２４Ｇ１１ ＶＨ。

【図23A】ネズミＩＧＫＶ３−５^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＬのアライメント。

【図23B】ネズミＩＧＫＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＬのアライメント。

【図24A】ヒトＩＧＫＶ３−１１^＊０１およびＩＧＫＶ４−１^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＬのアライメント。

【図24B】ヒトＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＬのアライメント。

【図25A】突然変異を有する、ＩＧＫＶ３−１１^＊０１に基づくヒト化型２２７Ｈ１ ＶＬ。

【図25B】突然変異を有する、ＩＧＫＶ４−１^＊０１に基づくヒト化型２２７Ｈ１ ＶＬ。

【図26A】ネズミＩＧＨＶ１−１８^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＨのアライメント。

【図26B】ネズミＩＧＨＤ１−１^＊０２生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＨのアライメント。

【図26C】ネズミＩＧＨＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＨのアライメント。

【図27A】ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＨのアライメント。

【図27B】； ヒトＩＧＨＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２７Ｈ１ ＶＨのアライメント。

【図28】突然変異を有するヒト化２２７Ｈ１ ＶＨ。

【図29A】ネズミＩＧＫＶ１２−４６^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＬのアライメント。

【図29B】ネズミＩＧＫＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＬのアライメント。

【図30A】ヒトＩＧＫＶ１−ＮＬ１^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＬのアライメント。

【図30B】ヒトＩＧＫＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＬのアライメント。

【図31】突然変異を有するヒト化２２３Ｃ４ ＶＬ。

【図32A】ネズミＩＧＨＶ１−１８^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＨのアライメント。

【図32B】ネズミＩＧＨＤ６−３^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＨのアライメント。

【図32C】ネズミＩＧＨＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＨのアライメント。

【図33A】ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＨのアライメント。

【図33B】ヒトＩＧＨＤ１−２６^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＨのアライメント。

【図33C】ヒトＩＧＨＪ６^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する２２３Ｃ４ ＶＨのアライメント。

【図34】突然変異を有するヒト化２２３Ｃ４ ＶＨ。

【図35】確立された異種移植ＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍モデルに対する、ネズミ２２４Ｇ１１ Ｍａｂ単独またはナベルビン（登録商標）と組み合わせた場合の抗腫瘍活性。

【図36】ＨＵＶＥＣの増殖に対する抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂの評価。

【図37】ＨＵＶＥＣの管形成に対する抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂの評価。

【図38A】ネズミＩＧＫＶ４−７９^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＬのアライメント。

【図38B】ネズミＩＧＫＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＬのアライメント。

【図39A】ヒトＩＧＫＶ３Ｄ−７^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＬのアライメント。

【図39B】ヒトＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＬのアライメント。

【図40】記載の突然変異を有するヒト化型１１Ｅ１ ＶＬ。

【図41A】ネズミＩＧＨＶ１−７^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＨのアライメント。

【図41B】ネズミＩＧＨＤ４−１^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＨのアライメント。

【図41C】ネズミＩＧＨＪ３^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＨのアライメント。

【図42A】ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２およびＩＧＨＶ１−４６^＊０１生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＨのアライメント。

【図42B】ヒトＩＧＨＪ４^＊０３生殖細胞系遺伝子に対する１１Ｅ１ ＶＨのアライメント。

【図43】突然変異を有するヒト化１１Ｅ１ ＶＨ。

【図44】Ａ５４９細胞に対するｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイ。ＨＧＦの不在下または存在下における、３０μｇ／ｍｌ（図４４Ａ）かまたはＥＣ_５０値を求めるための０．００１５〜３０μｇ／ｍｌの用量範囲（図４４Ｂ）での１１Ｅ１および２２４Ｇ１１精製Ｍａｂの評価。

【図45】ＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおける２２４Ｇ１１ Ｍａｂとナベルビン（登録商標）のイン・ビボ組合せ。

【図46】ＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおける２２４Ｇ１１ Ｍａｂとドキソルビシンのイン・ビボ組合せ。

【図47】ＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおける２２４Ｇ１１ Ｍａｂとドセタキセルのイン・ビボ組合せ。

【図48】ＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおける２２４Ｇ１１ Ｍａｂとテモゾロマイドのイン・ビボ組合せ。

【図49】Ｕ８７−ＭＧスフェロイド成長に対する抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂの効果。

【図50】ホスホ−ｃ−Ｍｅｔアッセイにおけるキメラおよびヒト化型の２２４Ｇ１１のイン・ビトロ活性。

【図51】Ｂｉａｃｏｒｅ分析の設定。

【図52】無胸腺ヌードマウスにおけるヒトＨＧＦ供給源としてのＭＲＣ５細胞と同時移植したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する２２４Ｇ１１のイン・ビボ活性。

【図53】ＥＬＩＳＡに基づくＦｃ−ｃＭｅｔに対する結合実験。抗Ｆｃ−ｃ−Ｍｅｔ結合活性は、精製ネズミモノクローナル抗体１１Ｅ１、２２４Ｇ１１および２２７Ｈ１の検出に抗ネズミＦｃコンジュゲートを用い、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔ上への用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した。

【図54】ＨＧＦ−ｃＭｅｔ競合アッセイ。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイでは、精製ネズミモノクローナル抗体１１Ｅ１、２２４Ｇ１１および２２７Ｈ１の存在下、プラスチックにコーティングされたＨＧＦに対する組換えＦｃ−ｃＭＥＴの残留結合を抗ネズミＦｃコンジュゲートで検出し、４５０ｎｍで測定した。

【図55】２２７Ｈ１由来組換えＶＨドメインのアミノ酸配列アライメント。２２７Ｈ１ ＶＨアミノ酸配列を選択されたヒト受容フレームワーク配列とアラインし、ネズミ２２７Ｈ１ ＶＨ配列と異なることが分かったアミノ酸のみを示した。２２７Ｈ１ ＨＺ１、ＨＺ２およびＨＺ３ ＶＨ配列は、完成されたヒト化型２２７Ｈ１ネズミＶＨドメインに相当し、残っているネズミ残基を太字で示す。ＨＺ３では、１０残基（^＊）がそれらのヒト対応部分に自動的に変化していた。ＨＺ２では、第三群（３）の７残基が検討された。ＨＺ１ＶＨでは、第二群（２）の９残基がそれらのヒト対応部分に変異しており、第一群（１）の６残基のみがネズミのままであった。

【図56】組換え２２７Ｈ１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化２２７Ｈ１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するヒト化ＶＨドメイン由来２２７Ｈ１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図57】組換え２２７Ｈ１由来抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化２２７Ｈ１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するヒト化ＨＺ４ＶＨ由来２２７Ｈ１抗体の用量依存性的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図58】２２７Ｈ１ネズミおよび組換え抗体のＨＧＦ−ｃＭｅｔ競合アッセイ。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイでは、種々の形態の２２７Ｈ１抗体の存在下、プラスチックにコーティングされたＨＧＦに対する組換えＦｃ−ｃＭｅｔの残留結合を、ビオチン化された無関連の抗ｃＭｅｔ抗体で検出した。精製ネズミ２２７Ｈ１モノクローナル抗体、キメラおよびＨＺ４ＶＨ由来ヒト化２２７Ｈ１由来組換え抗体を試験し、４５０ｎｍで測定した場合のそれらのＨＧＦ−ｃＭｅｔ結合との競合能を比較した。

【図59】２２７Ｈ１−ＨＺ ＶＨヒト化可変ドメイン配列。^＊は、それらのヒト対応物へと事実上変化したアミノ酸に相当し、！は、ＨＺ３からＨＺ１への遂行の際にヒト化されたアミノ酸に相当し、§は、最終的な２２７Ｈ１−ＨＺ ＶＨ配列においてヒト化されていたアミノ酸に相当する。

【図60】１１Ｅ１由来組換えＶＨドメインのアミノ酸配列アライメント。１１Ｅ１ ＶＨアミノ酸配列を選択されたヒト受容フレームワーク配列とアラインし、ネズミ１１Ｅ１ ＶＨ配列と異なることが分かったアミノ酸のみを示した。１１Ｅ１ ＨＺ ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３配列は、完成されたヒト化型１１Ｅ１ネズミＶＨドメインに相当し、残っているネズミ残基を太字で示す。ＨＺ ＶＨ３では、７残基（^＊）がそれらのヒト対応物に自動的に変化していた。ＨＺ ＶＨ２では、第三群（３）の７残基が検討された。ＨＺ ＶＨ１では、第二群（２）の５残基がそれらのヒト対応部分に変異しており、第一群（１）の５残基のみがネズミのままであった。

【図61】組換え１１Ｅ１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化１１Ｅ１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するヒト化ＶＨドメイン由来１１Ｅ１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図62】１１Ｅ１由来組換えＶＬドメインのアミノ酸配列アライメント。１１Ｅ１ ＶＬアミノ酸配列を選択されたヒト受容フレームワーク配列とアラインし、ネズミ１１Ｅ１ ＶＬ配列と異なることが分かったアミノ酸のみを示した。１１Ｅ１ ＨＺ ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３配列は、完成されたヒト化型１１Ｅ１ネズミＶＬドメインに相当し、残っているネズミ残基を太字で示す。ＨＺ ＶＬ３では、１０残基（^＊）がそれらのヒト対応物に自動的に変化していた。ＨＺ ＶＬ２では、第三群（３）の８残基が検討された。ＨＺ ＶＬ１では、第二群（２）の８残基がそれらのヒト対応部分に変異しており、第一群（１）の４残基のみがネズミのままであった。

【図63】組換え１１Ｅ１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化１１Ｅ１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するヒト化ＶＬドメイン由来１１Ｅ１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図64】組換え１１Ｅ１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化１１Ｅ１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対する一重または二重ヒト化ドメイン由来１１Ｅ１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図65】２２４Ｇ１１ ＶＨドメイン配列のアミノ酸配列アライメント。２２４Ｇ１１ ＶＨアミノ酸配列を２２７Ｈ１ ＶＨ配列とともに（下線は非相同残基）、また、選択されたヒト受容フレームワーク配列とアラインし、ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＨ配列と異なることが分かったアミノ酸のみを示した。２２４Ｇ１１ ＨＺ ＶＨ０配列は、「２２７Ｈ１に基づく／全ＩＭＧＴ」ヒト化型２２４Ｇ１１ネズミＶＨドメインに相当する。この配列では、ＩＭＧＴ−ＣＤＲの外側にネズミのままの残基は無い。

【図66】組換え２２４Ｇ１１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびＨＺＶＨ０由来ヒト化２２４Ｇ１１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するＨＺＶＨ０「全ＩＭＧＴ」ヒト化ＶＨドメイン由来２２４Ｇ１１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図67】２２４Ｇ１１ネズミおよび組換え抗体のＨＧＦ−ｃＭｅｔ競合アッセイ。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイでは、種々の形態の２２４Ｇ１１抗体の存在下、プラスチックにコーティングされたＨＧＦに対する組換えＦｃ−ｃＭｅｔの残留結合を、ビオチン化された無関連の抗ｃＭｅｔ抗体で検出した。精製ネズミ２２４Ｇ１１モノクローナル抗体、キメラおよびＨＺ４ＶＨ０由来ヒト化２２４Ｇ１１由来組換え抗体を試験し、４５０ｎｍで測定した場合のそれらのＨＧＦ−ｃＭｅｔ結合との競合能を比較した。

【図68】２２４Ｇ１１ ＶＬドメイン配列のアミノ酸配列アライメント。２２４Ｇ１１ ＶＬアミノ酸配列を２つの選択されたヒト受容フレームワーク配列とアラインし、ネズミ２２４Ｇ１１ ＶＬ配列と異なることが分かったアミノ酸のみを示した。２２４Ｇ１１ ＨＺ ＶＬ３配列は「短鎖ＣＤＲ１」ヒト化型２２４Ｇ１１ネズミＶＨドメインに相当し、一方、ＨＺ ＶＬ６は「長鎖ＣＤＲ１」型に相当し、残っているネズミ残基を太字で示す。双方の基本ヒト化型に関して、残っているネズミ残基をさらなるヒト化プロセスのためにランク付けし、^＊は基本型においてヒト化されたアミノ酸に相当に、３、２および１は完成されたヒト化型の設計のための残基群に相当する。

【図69】組換え２２４Ｇ１１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化２２Ｇ１１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するヒト化ＶＬ３およびＶＬ６ドメイン由来２２４Ｇ１１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図70】組換え２２４Ｇ１１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化２２４Ｇ１１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対するヒト化ドメイン由来２２４Ｇ１１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図71】２２４Ｇ１１ネズミおよび組換え抗体のＨＧＦ−ｃＭｅｔ競合アッセイ。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイでは、種々の形態の２２４Ｇ１１抗体の存在下、プラスチックにコーティングされたＨＧＦに対する組換えＦｃ−ｃＭｅｔの残留結合を、ビオチン化された無関連の抗ｃＭｅｔ抗体で検出した。精製ネズミ２２４Ｇ１１モノクローナル抗体、キメラおよびＨＺ ＶＨ４由来ヒト化２２４Ｇ１１由来組換え抗体を試験し、４５０ｎｍで測定した場合のそれらのＨＧＦ−ｃＭｅｔ結合との競合能を比較した。

【図72】ＶＬ４ヒト化２２４Ｇ１１ ＶＬドメイン配列のアミノ酸配列。^＊は、基本ＨＺ ＶＬ６型においてそれらのヒト対応物へと事実上変化したアミノ酸に相当し、！は、ＨＺ ＶＬ６からＨＺ ＶＬ４への遂行の際にヒト化されたアミノ酸に相当し、§は、２２４Ｇ１１−ＨＺ ＶＬ４配列においてネズミのままであるアミノ酸に相当する。

【図73】組換え２２４Ｇ１１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化２２Ｇ１１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対する一重または二重ヒト化ドメイン由来２２４Ｇ１１抗体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図74】２２４Ｇ１１ネズミおよび組換え抗体のＨＧＦ−ｃＭｅｔ競合アッセイ。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイでは、種々の形態の２２４Ｇ１１抗体の存在下、プラスチックにコーティングされたＨＧＦに対する組換えＦｃ−ｃＭｅｔの残留結合を、ビオチン化された無関連の抗ｃＭｅｔ抗体で検出した。精製ネズミ２２４Ｇ１１モノクローナル抗体、キメラおよび完全ヒト化２２４Ｇ１１由来組換え抗体を試験し、４５０ｎｍで測定した場合のそれらのＨＧＦ−ｃＭｅｔ結合との競合能を比較した。

【図75】組換え２２４Ｇ１１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化２２Ｇ１１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対する、ＶＬ４由来完全ヒト化２２４Ｇ１１抗体の単一突然変異体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図76】組換え２２４Ｇ１１抗体のＦｃ−ｃＭｅｔに対するＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。抗Ｆｃ−ｃＭｅｔ結合活性は、キメラおよびヒト化２２Ｇ１１由来組換え抗体を検出するために抗ヒトＦｃコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。プラスチックにコーティングされた組換えＦｃ−ｃＭｅｔに対する、ＶＬ４由来完全ヒト化２２４Ｇ１１抗体の単一および多重突然変異体の用量依存的結合活性を４５０ｎｍで測定した後、親／参照キメラ抗体のそれと比較した。

【図77】２２４Ｇ１１ネズミおよび組換え抗体のＨＧＦ−ｃＭｅｔ競合アッセイ。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイでは、種々の形態の２２４Ｇ１１抗体の存在下、プラスチックにコーティングされたＨＧＦに対する組換えＦｃ−ｃＭｅｔの残留結合を、ビオチン化された無関連の抗ｃＭｅｔ抗体で検出した。精製ネズミ２２４Ｇ１１モノクローナル抗体、キメラおよびＶＬ４由来完全ヒト化２２４Ｇ１１組換え抗体の単一または多重突然変異体を試験し、４５０ｎｍで測定した場合のそれらのＨＧＦ−ｃＭｅｔ結合との競合能を比較した。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15b】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図34】

【図35】

【図36】

【図38A】

【図38B】

【図39A】

【図39B】

【図40】

【図41A】

【図41B】

【図41C】

【図42A】

【図42B】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図9】

【図10】

【図11】

【図15a】

【図37】

【図49】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]