特許 5890840 心臓健康状態のマーカーとしての体液ＢＩＮ１

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5890840

(24)【登録日】2016年2月26日

(45)【発行日】2016年3月22日

(54)【発明の名称】心臓健康状態のマーカーとしての体液ＢＩＮ１

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20160308BHJP

   G01N 33/53 20060101ALN20160308BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   !G01N33/53 D

【請求項の数】19

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2013-535102(P2013-535102)

(86)(22)【出願日】2011年10月20日

(65)【公表番号】特表2013-545090(P2013-545090A)

(43)【公表日】2013年12月19日

(86)【国際出願番号】US2011057155

(87)【国際公開番号】WO2012054764

(87)【国際公開日】20120426

【審査請求日】2014年10月10日

(31)【優先権主張番号】61/405,044

(32)【優先日】2010年10月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】100149294

【弁理士】

【氏名又は名称】内田 直人

(72)【発明者】

【氏名】ショー，ロビン

(72)【発明者】

【氏名】ホン，テンテン

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００９２９８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２４５５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Mol Cell Biol，２００３年，Vol.23 No.12 Page.4295-4306

【文献】 Science，２００２年，Vol.297 No.5584 Page.1193-1196

【文献】 厚生労働省がん研究助成金による研究報告集，２００４年，Vol.2003 Page.245-251

【文献】 小児科臨床，２０１０年，Vol.63 No.9 Page.1899-1905

【文献】 Handbook of Immunohistochemistry and In Situ Hybridization of Human Carcinomas (2005), Volume 2, 431-437

【文献】 Cancer biology & therapy, (2007 Feb) Vol. 6, No. 2, pp. 192-4

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト被検体における非急性の心不全の可能性を評価するための方法であって、
被検体から得られた体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを測定することと、
該ＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体における非急性の心不全の可能性を評価することとを含み、
このとき正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの減少が、非急性の心不全の可能性の増加を示す、方法。

【請求項2】

前記の評価することが、ＢＩＮ１タンパク質レベルに基づいて被検体を分類することを含み、
このとき、ＢＩＮ１タンパク質レベルが正常ＢＩＮ１タンパク質レベルの６０％〜４５％の第一の範囲内にある場合には、被検体が高次の心臓機能クラスに分類され、
ＢＩＮ１タンパク質レベルが正常ＢＩＮ１タンパク質レベルの４０％〜０％の第二の範囲内にある場合には、被検体が低次の心臓機能クラスに分類される
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

高次の心臓機能クラスがニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラス１またはクラス２であり、低次の心臓機能クラスがＮＹＨＡクラス３またはクラス４である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

体液試料が、血液試料、血清試料または血漿試料を含む、請求項１から３のいずれか一に記載の方法。

【請求項5】

慢性心不全と診断されたヒト被検体における心臓死亡率を予測するための方法であって、
被検体から得られた体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを測定することと、
該ＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体における心臓死亡率を予測することとを含み、
このとき正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの減少が、心臓死亡率の増加と相関している、方法。

【請求項6】

被検体が心不全について治療を受けている、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

治療が機械的補助機器の使用を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

治療が心臓移植を含む，請求項６に記載の方法。

【請求項9】

治療が免疫抑制療法を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

体液試料が血液試料、血清試料または血漿試料を含む、請求項５から９のいずれか一に記載の方法。

【請求項11】

慢性心不全または不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）と診断されたヒト被検体の心臓の転帰不良のリスクを予測するための方法であって、
被検体から得られた体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを測定することと、
該ＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体における転帰不良のリスクを予測することとを含み、
このとき正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの減少が、心臓の転帰不良のリスクの増加と相関している、方法。

【請求項12】

被検体が慢性心不全患者と診断されている、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

被検体が心不全のための治療を受けている、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

治療が薬物療法を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

治療が機械的補助機器の使用を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

被検体が不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）患者と診断されている、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

心臓の転帰不良が心不全を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

心臓の転帰不良のリスクの増加が心臓死亡率の増加を含む、請求項１１から１７のいずれか一に記載の方法。

【請求項19】

体液試料が、血液試料、血清試料または血漿試料を含む、請求項１１から１８のいずれか一に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

先行技術出願との相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）に準じて、本出願は、２０１０年１０月２０日出願の米国仮特許出願番号６１／４０５０４４の優先権を主張する。当該出願は出典明記によってその全体が本明細書中に援用される。

【0002】

連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＨＬＢＩ）から与えられた助成番号ＨＬ０９４４１４による政府の援助を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

本発明は、心臓の健康状態とそれを評価する方法に関する。

【0004】

序論
過去１０年間で、心不全は心血管医学の中で突出した公衆衛生問題に急増している。心不全は世界中で２３万人弱、およそ６万のアメリカ人を襲っている。しかしながら、心不全の病態生理学はまだよく理解されておらず、この疾患による死亡率および経済的負担は高いままである。心臓のバイオマーカーの開発は急性心不全の診断だけでなく心筋梗塞の診断を決定する際に役立っている。

【0005】

しかし、心臓の定常状態の生化学的健康状態を測定するマーカーが必要とされている。また、確実に心不全患者の将来の転帰を予測することができるマーカーも必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、被検体の心臓の健康状態を評価する際において被検体の生体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルの使用を伴う方法を提供する。前記方法はまた、心不全を有する患者を評価する際の用途を見出す。また、これらの方法は、心不全患者及び心臓移植を受けた患者における治療選択肢および治療の有効性を評価する際に有用である。

【0007】

したがって、被検体の心臓の健康状態を評価するための方法が提供される。この方法は、被検体から得られた体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを決定することと、該ＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体の心臓の健康状態を評価することとを含み、このとき正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの減少が、心臓の健康状態不良と正の相関がある。ある実施形態において、被検体は、急性でない心臓症状を有する個体であってよい。ある実施形態において、被検体は、心不全に関連する危険因子を有する個体であってよい。ある実施形態において、被検体は、慢性心不全患者であってよい。

【0008】

ある実施形態において、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、急性でない心臓症状を有する患者の心不全の心臓機能分類を決定するために用いられてよく、このときＢＩＮ１タンパク質レベルは心臓機能分類と相関がある。ある実施形態において、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、慢性心不全患者の心不全の心臓機能分類を決定するために用いられてよく、このときＢＩＮ１タンパク質レベルは心臓機能分類と相関がある。ある実施形態において、慢性心不全の患者は、心不全の治療を受けていてよい。ある実施形態において、治療は、機械的補助機器の使用を含んでよい。ある実施形態において、治療は心臓移植を含んでよい。ある実施形態において、治療は免疫抑制療法を含んでよい。

【0009】

ある実施形態において、ここに記載の方法でアッセイされる体液試料は、血液試料、血清試料または血漿試料を含んでよい。

【0010】

また、被検体の転帰不良のリスクを予測する方法であって、被検体から得られた体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを測定することと、該ＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体における転帰不良のリスクを予測することとを含み、このとき正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの減少が、転帰不良のリスクの増加と相関している方法が提供される。

【0011】

ある実施形態において、被検体は、急性でない心臓症状を有する被検体であってよい。ある実施形態において、被検体は、慢性心不全と診断された被検体であってよい。ある実施形態において、被検体は心不全の治療を受けていてよい。ある実施形態において、心不全の治療は薬物療法を含んでよい。ある実施形態において、心不全の治療は機械的補助機器を含んでよい。

【0012】

ある実施形態において、転帰不良のリスクの増加は、心不全のリスクの増加を含んでよい。ある実施形態において、転帰不良のリスクの増加は、心臓性死亡率のリスクの増加を含んでよい。

【0013】

また、被検体の、深刻な心臓事象などの急性の心臓症状の診断を容易にする方法であって、被検体から得られた体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを測定することと、該ＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体の急性の心臓症状の診断を容易にすることとを含み、このとき正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの増加が急性心臓症状を示す方法が、本明細書中に開示される。ある実施形態において、被検体は心不全と診断されていてよい。ある実施形態において、被検体は心不全の治療を受けていてよい。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１Ａおよび１Ｂは、心不全患者および年齢が一致する心不全でないコントロール群における血清ＢＩＮ１タンパク質レベルを示す。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、血清ＢＩＮ１のタンパク質レベルが、性別（図２Ａ）または年齢（図２Ｂ）と相関しないことを示す。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、血清ＢＩＮ１タンパク質レベルが、体重（図３Ａ）または肥満度指数（ＢＭＩ）（図３Ｂ）と相関しないことを示す。

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、血清ＢＩＮ１タンパク質レベルが、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）（図４Ａ）または肺毛細血管楔入圧（ＰＣＷＰ）（図４Ｂ）と相関しないことを示す。

【図5】図５Ａおよび図５Ｂは、血清ＢＩＮ１が心拍出量（ＣＯ）（図５Ａ）および心臓指数（ＣＩ）（図５Ｂ）と相関することを示す。

【図6】図６は、血清ＢＩＮ１がニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類（クラス１〜クラス４）と相関することを示す。

【図7】図７Ａおよび図７Ｂは、血清ＢＩＮ１の低さと死亡リスクの高さが相関することを示す。

【図8】図８は、血漿ＢＩＮ１が不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）心不全患者で低いことを示す。

【図9】図９は、血漿ＢＩＮ１がＡＲＶＣ患者では重篤な心疾患（心不全および／または心室性不整脈）を予測することを示す。

【図10】図１０は、血漿ＢＩＮ１が将来の心室性不整脈を予測することを示す。

【図11】図１１は、血漿ＢＩＮ１がＡＲＶＣ進行に伴って減少することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

例示的実施形態の詳細な説明
本発明を説明する前に、本発明は記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら異なっていてもよいことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図しないこともまた理解されるべきである。

【0016】

値の範囲が示される場合、その範囲の上限および下限の間にある各値もまた、文脈により別途明確に規定されない限り下限の単位の１０分の１まで、明確に開示されることが理解される。記載されている範囲における任意の記載されている値または間にある値の間のより小さい各範囲およびその記載されている範囲における任意の別の記載されている値または間にある値は、本発明の範囲内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、それぞれ独立に、その範囲に包含されてもよく、または除外されてもよく、そのより小さい範囲中にいずれかの限界が含まれる、いずれの限界も含まれない、またはいずれの限界も含まれる各範囲もまた、記載されている範囲における任意の明確に除外されている限界を条件として、本発明の範囲内に包含される。記載されている範囲が、限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれている限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

【0017】

別途規定されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様のまたは等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、いくつかの潜在的なおよび例示的な方法および材料を、以下に記載する。本明細書において言及されたすべての刊行物は、刊行物が関連して引用された方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する程度まで、組み込まれている刊行物のすべての開示に優先することが理解される。

【0018】

本明細書で使用される場合および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別途明確に規定されない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの試料（ａ ｓａｍｐｌｅ）」への言及は、複数のそのような試料を包含し、「その試料（ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ）」への言及は、１つまたは複数の試料および当業者に知られているその等価物への言及を包含するなどである。

【0019】

特許請求の範囲は、任意選択であってもよい任意の要素を除外するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の詳述、または「消極的」限定の使用に関連して、「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語の使用のための先行詞として機能することを意図されている。

【0020】

本明細書において論じられている刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ示されている。本明細書において、本発明が、先行発明のために、そのような刊行物に先行するという権利を有さないことの承認として解釈されるものはない。さらに、示されている刊行日は、それぞれ独立に確認する必要があるであろう実際の刊行日と異なる場合がある。

【0021】

定義
本明細書において使用される「予後」なる用語は、例えば不良な心臓健康状態を有する被検体、例えばＣＨＦ患者などの心臓疾患患者における生存の可能性などの、患者における疾患の特定の転帰の可能性の予測を指す。
「評価する」および「査定する」なる用語は交換可能に用いられ、対象の症状の診断および／または予後を容易にすることを指し、症状の重症度を評価することを含みうる。したがって、本開示内容においては「評価する」および「査定する」は、例えば、被検体の心臓健康状態を評価する、不良な臨床転帰（例えば、特定期間内での心臓健康状態の低下）の可能性を決定する、そしてある一定期間にわたる心臓症状のモニタリングを容易にするためにのＢＩＮ１タンパク質レベルの使用を包含しうる。例えば、ＢＩＮ１タンパク質レベルを、心臓健康状態を改善する特定の治療投薬計画の有効性を評価するために用いることもできるし、一定期間にわたる患者の心臓症状の進行をモニタリング、予測または追跡する（すなわち、注目または観察する）ために用いることもできる。

【0022】

「体液」および「生体液」なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、被検体、例えば哺乳動物、例えばヒトからの液体の生体試料を指す。このような体液には、血液（例えば、全血またはその分画（例えば血清、血漿）、このとき血液は身体の動脈または静脈から採取されてよい）および心膜液などの水性の液体が含まれる。本開示内容の文脈において対象とする特定の体液には、全血、血清、血漿および他の血液由来の試料が含まれ、このとき「血液試料」なる用語は全血またはその分画（例えば血清、血漿）を包含することを意味する。試料の種類は、アッセイの様式に合うように選択されうる。

【0023】

本明細書で用いられる「不良な心臓（ｈｅａｒｔ、ｃａｒｄｉａｃ）健康状態」は、心臓が、正常な健康状態にある心臓機能の最適レベルと比較して、最適レベル以下で機能していて、被検体が将来深刻な心臓事象を有するなどの急性心臓症状を生じる危険にある被検体の心臓の健康状態を指す。不良健康状態の心臓と分類される心臓は、医療処置や他の予防措置が無い場合に、機能を悪化させる、例えば心不全増悪などの急性心臓症状を生じる可能性がある。

【0024】

被検体（例えば心不全患者）と関連して本明細書で用いられる「転帰不良」または「心臓転帰不良」は、急性の心臓症状、例えば心臓死を引き起こしうる深刻な心臓事象などの心臓の健康状態の不良または低下に関連した転帰を指す。「転帰不良」には、例えば、ある期間における、左室駆出率（ＬＶＥＦ）が改善しないこと、または機械的デバイスサポート（例えば、左室補助機器（ＬＶＡＤ）埋込み）の必要性、または心臓移植の必要性、深刻な心臓事象、または心臓死が含まれる。

【0025】

本明細書で用いられる「心臓機能分類」なる表現は、心不全患者の心臓の機能状態に基づいて心不全患者を分類することを指す。心臓機能分類は、例えばＮＹＨＡ機能分類、米国心臓病学会財団／米国心臓協会（ＡＣＣ／ＡＨＡ）機能分類などの、当分野で認知された基準であり得る。

【0026】

本明細書で用いられるように、「相関する」なる用語は、２つの変数間の統計学的な関連を指すために用いられ、その関連は、線形的でも非線形的でもよく、変数の特定範囲を超えていてもよい。「正の相関」（または「直接相関」）は、第一変数と第二変数との間の直接的統計学的相関を指す（例えば、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときのＢＩＮ１タンパク質レベルの低減は心臓健康状態の低減と統計学的に関連しており、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときのＢＩＮ１タンパク質レベルの増加は心臓健康状態の増加と統計学的に関連している）。「負の相関」（または「逆相関」）は、第一変数と第二変数との間の逆の統計学的相関を指す（例えば、正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときのＢＩＮ１タンパク質レベルの低減は転帰不良のリスクの増加と統計学的に関連している）。

【0027】

「心不全（ＨＦ）」または「うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）」（ＣＨＦ）および「うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｃａｒｄｉａｃ ｆａｉｌｕｒｅ）」（ＣＣＦ）なる用語は、本明細書において互いに交換可能に使用され、心臓の、全身に十分な量の血液を満たす、または送り出す能力、体の組織における適当な血液循環を維持する能力、または静脈循環によって戻ってきた静脈血を拍出する能力を損なう、任意の構造的または機能的な心臓障害の結果として生じ得る臨床症状を指す。

【0028】

「末期心不全」なる用語は、従来の医学療法に抵抗性のＣＨＦを指す。末期心不全の患者は高い死亡率を有する。これらの患者は、多数回の頻繁な入院、静脈内薬物療法を頻繁に経験し、大動脈内バルーンポンプ、心室補助機器、および心臓移植などの外科的療法を必要とする。

【0029】

「末期拡張型心筋症」および「末期ＣＨＦ」なる用語は、本明細書において互いに交換可能に使用される。

【0030】

「心筋症」または「心筋疾患」なる用語は、任意の理由による、心筋（すなわち、心臓の筋肉）の機能低下を指す。本明細書において使用される場合、「心筋症」なる用語は、「外因性心筋症」および「内因性心筋症」を包含する。外因性心筋症において、例えば、虚血性心筋症など、主な病理は心筋自体の外側にある。内因性心筋症において、例えば、拡張型心筋症（ＤＣＭ）など、心筋の衰弱は特定できる外部の原因によるものではない。ＤＣＭでは、心臓（特に、左心室）が拡張し、ポンプ機能が低下する。

【0031】

「虚血性心筋症」なる用語は、アテローム性動脈硬化症および冠動脈閉塞などの、冠動脈疾患の結果として生じる心筋症を指す。

【0032】

「非虚血性心筋症」なる用語は、冠動脈疾患によるものではない心筋症を指す。

【0033】

「心臓症状」なる用語は、被検体の心臓の任意の機能低下を指す。例えば、心不全、虚血性心筋症、非虚血性心筋症、拡張型心筋症などと診断された被検体は、心臓症状を有すると診断される。

【0034】

症状または疾患を「治療すること」またはその「治療」なる用語は、被検体に臨床上の利益をもたらすことを包含し、以下を包含する：（１）疾患を阻害すること、すなわち、疾患またはその症状の発症を停止もしくは低減させること、または（２）疾患を軽減すること、すなわち、疾患またはその臨床症状の退行をもたらすこと。

【0035】

「個体」、「被検体」、「宿主」および「患者」なる用語は、本明細書で交換可能に用いられ、診断、治療または療法が望ましいとされる任意の哺乳動物被検体、特にヒトを指す。哺乳動物被検体は、イヌ、ウマ、ウシまたはヒトであってよい。

【0036】

概要
本開示内容の方法は、被検体の体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルが被検体の心臓の健康状態を評価するのに有用であり、急性心臓症状の診断だけでなく被検体の転帰不良のリスクの予測を容易にするという発見に基づいている。

【0037】

一般に、急性の心臓症状がない被検体では、体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルの低減は、心臓組織の健康状態の衰退と正に相関しており、ゆえに心不全患者では転帰不良の可能性が増す。例えば、被検体の心臓健康状態が低減するにつれて、被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルが、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較して低減する。例えば、患者の心臓死亡率のリスクが増すにつれて、被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルが正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較して低減する。「心臓死亡率」なる用語は、本明細書において使用される場合、心臓疾患による患者死亡率を指す。したがって、体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルは、心臓組織の健康状態が低下するにつれて低下するＢＩＮ１タンパク質レベルの値を提供するためにアッセイされる、予後診断マーカー並びに心臓健康状態のマーカーとして使用することができる。

【0038】

体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルは、急性の心臓症状、例えば深刻な心臓事象、急性心不全増悪または急性冠動脈症候群の生化学的診断を提供するのに有用である。正常なＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの被検体の体液中のＢＩＮ１レベルの有意な増加は、急性の心臓症状を示す。

【0039】

ＢＩＮ１タンパク質レベルはＢＩＮ１タンパク質の検出により測定することができる。ＢＩＮ１タンパク質レベルをアッセイするための例示的な方法を以下に提供する。

【0040】

本開示内容の方法は以降でさらに詳細に説明する。

【0041】

ＢＩＮ１
ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）遺伝子は、腫瘍抑制因子の特徴を有するＭｙｃ相互作用タンパク質としてもともと同定された、核内サイトゾルタンパク質をコードする。ＢＩＮ１はまた、アンフィフィシンＩＩ、アンフィフィシン様、およびボックス依存性ＭＹＣ相互作用タンパク質１としても知られている。ＢＩＮ１遺伝子の選択的スプライシングは、１０個の異なるアイソフォームをコードする転写変異体をもたらす。ＢＩＮ１のアイソフォームは、いたるところで発現されるものもあれば、組織特異的な発現を示すものもある。ＢＩＮ１アイソフォーム１〜７はニューロンにおいて発現される。アイソフォーム８は筋肉特異的であるが、アイソフォーム９および１０はいたるところに存在する。中枢神経系において発現されるアイソフォームは、シナプス小胞エンドサイトーシスに関与している可能性があり、ダイナニム、シナプトジャニン、エンドフィリンおよびクラスリンと相互作用する可能性がある。腫瘍細胞系において発現される異常型スプライス変異体もまた記載されている。

【0042】

ＢＩＮ１発現は、ＢＩＮ１アイソフォームの１つまたは複数の検出によってアッセイすることができる。ＢＩＮ１アイソフォーム１タンパク質（ＮＰ＿６４７５９３．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム２タンパク質（ＮＰ＿６４７５９４．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム３タンパク質（ＮＰ＿６４７５９５．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム４タンパク質（ＮＰ＿６４７５９６．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム５タンパク質（ＮＰ＿６４７５９７．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム６タンパク質（ＮＰ＿６４７５９８．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム７タンパク質（ＮＰ＿６４７５９９．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム８タンパク質（ＮＰ＿００４２９６．１）、ＢＩＮ１アイソフォーム９タンパク質（ＮＰ＿６４７６００．１）、ならびにＢＩＮ１アイソフォーム１０タンパク質（ＮＰ＿６４７６０１．１）配列が、当技術分野において利用可能である。

【0043】

ある特定の実施形態では、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、ＢＩＮ１アイソフォーム８タンパク質の検出によってアッセイされてもよい。別の実施形態では、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、ＢＩＮ１アイソフォーム９タンパク質の検出によってアッセイされてもよい。別の実施形態では、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、ＢＩＮ１アイソフォーム８タンパク質およびＢＩＮ１アイソフォーム９タンパク質の両方の検出によってアッセイされる。例示的な実施形態において、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、ＢＩＮ１アイソフォーム８タンパク質およびＢＩＮ１アイソフォーム９タンパク質により共有されているアミノ酸配列または構造的特徴の検出によって、アッセイされてもよい。

【0044】

一般に、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、様々なＢＩＮ１アイソフォームにより共有されているアミノ酸配列および／または構造の特徴の検出を提供する試薬を使用することによって、例えば、２以上のＢＩＮ１アイソフォームにより共有されているエピトープ（一または複数）に結合する抗体を使用することによって、アッセイされてもよい。

【0045】

ＢＩＮ１タンパク質レベルをアッセイするための方法
ＢＩＮ１タンパク質レベルはＢＩＮ１ポリペプチドを検出することによってアッセイすることができる。ＢＩＮ１ポリペプチドのレベルは、定量的なウェスタンブロット、免疫沈降、免疫吸着アッセイ等のような免疫アッセイによって検出することができる。

【0046】

一般に、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、患者由来の体液の試料でアッセイすることができる。体液は、血液試料、例えば全血、血清または血漿であってよい。体液は、ＢＩＮ１タンパク質レベルをアッセイする前に新たに取得してもよいし、アッセイの前に保存されていてもよいし、および／または他の方法で処理されていてもよい。患者試料は、直接または適度に希釈、通常およそ１：１０、およそ１：１００、およそ１：５００、およそ１：１０００、およそ１：１００００でかつ最高およそ１：５００００までに希釈して用いられてよい。免疫アッセイは、任意の生理学的な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水等で行われてよい。

【0047】

免疫検出
免疫検出方法が、ＢＩＮ１タンパク質のレベルを検出するために適し得る。したがって、ＢＩＮ１タンパク質に特異的な、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体などの抗体または抗血清を、ＢＩＮ１タンパク質レベルを評定するために使用することができる。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識または西洋わさびペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素による抗体自体の直接的な標識化によって検出することができる。あるいは、一次抗体に特異的な、抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と共役させて、標識されていない一次抗体が用いられてよい。ある特定の例において、患者の体液試料におけるＢＩＮ１タンパク質レベルは、正常な心臓を有する被検体の体液におけるＢＩＮ１タンパク質レベルと比較され得る。免疫検出プロトコールおよびキットは、当技術分野においてよく知られており、市販されている。

【0048】

特定の場合において、体液試料中に存在するＢＩＮ１タンパク質の量は、ウェスタンブロットによって決定することができる。例えば、血清などの体液試料に存在するタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＢＩＮ１に特異的な抗体または抗血清を使用することによってＢＩＮ１を検出することができる。少なくとも１つの正規化タンパク質、例えばβ−アクチンなどのハウスキーピングタンパク質もまた、同時にまたは並行して検出して、ＢＩＮタンパク質レベルを正規化するために使用することができる。

【0049】

代替の実施形態において、ＢＩＮ１ポリペプチドレベルを、過剰の抗ＢＩＮ１抗体を使用してＢＩＮ１免疫沈降を実施し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫沈降物の分離、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ゲルの染色、例えば、クマシーブルーまたは銀染色により検出することによって測定してもよい。ユビキチンなどのコントロールタンパク質の免疫沈降はまた、同時にまたは並行して行われてもよい。場合によって、対応する正常な被検体由来の体液に対して同じ手順が行われてもよい。

【0050】

特定の場合において、免疫吸着アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））を用いてＢＩＮ１タンパク質レベルが検出されうる。一般に、固体支持体はまず、成分が十分に支持体に固定されるような適切な結合条件下で固相の成分（例えば、ＢＩＮ１タンパク質または抗ＢＩＮ１抗体）と反応する。必要に応じて、支持体への固相成分の固定化は、まず良好な結合特性を有するタンパク質へ固相成分を共役させることによって促すことができる。好適な共役タンパク質には、限定されるものではないが、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン等の高分子、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、および当業者によく知られた他のタンパク質が含まれる。支持体に抗原を結合するために使用することができる他の分子には、多糖類、ポリ乳酸類、ポリグリコール酸類、重合アミノ酸類、アミノ酸コポリマー、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等が含まれる。このような分子と固相成分にこれらの分子を結合する方法は当業者によく知られている。例として、Brinkley, M. A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13、Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63、およびAnjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30: 1 17-124を参照のこと。

【0051】

固相成分と固体支持体とを接触させた後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって支持体から除去される。生物学的試料またはその画分を添加する前に、不溶性支持体上の非特異的結合部位、すなわち、標的ペプチドによって占有されていない部位は、一般的にブロックされる。好適なブロッキング剤には、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のような非干渉性タンパク質が含まれる。例えばトゥイーン、ＮＰ４０、ＴＸ１００等の、非干渉濃度のいくつかの界面活性剤が用いられてよい。

【0052】

支持体に結合した固相成分がＢＩＮ１結合部分、例えば抗ＢＩＮ１抗体である実施形態において、結合した固相成分は次いで、アッセイされる生体試料と好適な結合条件下で接触される。洗浄後、二次的結合部分を含有する溶液が好適な結合条件下で添加され、このとき二次的結合体はＢＩＮ１結合部分に結合したＢＩＮ１と選択的に会合することができるものである。ＢＩＮ１結合部分は、例えば抗ＢＩＮ１抗体、ＢＩＮ１結合タンパク質（例えばＣａｖｌ．２）から選択されてよい。

【0053】

支持体に結合した固相成分が体液試料中に存在するＢＩＮ１ポリペプチドである実施形態において、結合した固相成分は次いで、ＢＩＮ１結合部分、例えば抗ＢＩＮ１抗体と好適な結合条件下で接触される。洗浄後、二次的結合部分を含有する溶液が好適な結合条件下で添加され、このとき二次的結合体はＢＩＮ１結合部分と選択的に会合することができるものである。

【0054】

次いで、当分野でよく知られる技術を用いて二次的結合体の存在を検出することができる。ある実施形態において、二次結合体部分を含む溶液は、抗ＢＩＮ１抗体に結合する二次抗体を含む溶液である。二次抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの血清、例えばマウス抗ヒト抗体、ヤギ抗ヒト抗体、ウサギ抗ヒト抗体などの形態であってよい。

【0055】

二次抗体は、結合の直接または間接的な検出および／または定量を容易にするために標識されてよい。二次的結合体部分の結合を直接測定するための標識の例には、^３Ｈまたは^１２５Ｉ等の放射性標識、蛍光部分、染料、ビーズ、化学発光部分、電気的化学発光部分、コロイド粒子などが含まれる。有用な標識には、蛍光色素、例えばＣｙ２、Ｃｙ３で、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２ ’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）が含まれる。結合を間接的に測定するための標識の例には、基質が発色または発光産物を提供する場合の酵素が含まれる。ある実施形態では、二次抗体は、好適な基質を添加した後に検出可能な産物のシグナルを提供することができる共役結合した酵素にて標識される。共役に用いるために好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが含まれる。市販されていなくても、このような抗体−酵素共役体は当業者に知られる技術によって容易に製造される。あるいは、二次抗体は標識されていなくてもよく、標識された三次抗体が用いられてよい。結果として生じたシグナルは増幅されるので、この技術はＢＩＮ１が少量しか存在しない場合に有用であろう。

【0056】

二次抗体が結合した後、不溶性支持体は通常、再度非特異的結合分子が洗い流され、結合した共役体によって産生されるシグナルが従来法によって検出される。酵素共役体が用いられる場合、好適な酵素基質が与えられ、検出可能な産物が生成される。より具体的には、ペルオキシダーゼが選択された酵素共役体である場合、基質の組み合わせはＨ_２Ｏ_２とＯ−フェニレンジアミンであり、好適な反応条件下で発色産物が生じる。上記のような他の酵素共役体に好適な基質は当業者に知られている。様々な有用な共役体またはその産物を検出するために好適な反応条件および方法も当業者に知られている。例えば、Ｏ−フェニレンジアミン基質の産物の場合、分光光度計にて通常４９０−４９５ｎｍの吸光度が測定される。

【0057】

一般的に、検出されたＢＩＮ１タンパク質の量は、正常な被検体由来のコントロール試料、または健康な心臓を有する被検体の体液中に存在するＢＩＮ１の公知の正常な範囲ないしはレベル、または転帰不良の心不全患者に存在する公知のＢＩＮ１タンパク質レベル範囲、または転帰が不良でない心不全患者に存在する公知のＢＩＮ１タンパク質レベルの範囲と比較される。

【0058】

サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ様式などの免疫吸着アッセイを用いることもでき、このときの固体支持体（例えばマイクロタイタープレートの壁面）は抗ＢＩＮ１抗体などのＢＩＮ１結合部分にてコートされる。次いで、アッセイする生体試料がコートされたウェルに添加される。場合によって、公知の濃度のＢＩＮ１タンパク質を含む一連の標準物質が試料ないしはその一定分量と平行してアッセイされ、コントロールとされてよい。

【0059】

希釈していようがいまいが、通常およそ０．００１から１ｍｌの試料で十分である。必要であれば、試料の希釈は緩衝液（トリス、ＰＢＳなど）で行い、ｐＨを５〜１０に安定化し、場合によって、トゥイーン２０などの界面活性剤、非特異的バックグラウンド遮断タンパク質、またはウシ血清アルブミンまたはウサギ血清などの血清成分も含んでいてよい。さらに、ある実施形態では、用いる場合には各試料および標準物質は複数のウェルに添加し、それぞれについて平均値が得られるようにする。試験およびコントロール試料はそれぞれ固体支持体と共に、抗体が抗原と結合するのに十分な時間インキュベートされる。一般に、およそ０．１〜３時間で十分であり、通常１時間で十分である。

【0060】

標的抗原への抗体の結合を可能にするのに十分な期間インキュベートした後、支持体（一または複数）を洗浄して結合していない抗原を除去することができる。一般に、適切なpH、通常７〜８の希釈した非イオン性界面活性剤の培地が洗浄培地として使用される。リン酸緩衝生理食塩水などの等張性緩衝液が洗浄工程で用いられてよい。試料中に存在する非特異的結合タンパク質を完全に洗い流すために十分な量で、１から６回の洗浄を行ってよい。好ましくは、洗浄工程は、コートされたＢＩＮ１−結合部分に結合したＢＩＮ１ポリペプチドの解離を引き起こさない。洗浄の後、検出可能に標識された二次結合分子が添加される。二次結合分子はＢＥＮ１結合部分、例えば抗−ＢＩＮ１抗体であってよい。二次結合分子は、任意の捕獲されたＢＩＮ１と反応し、支持体が洗浄され、二次結合分子の存在は当分野で周知の方法を用いて検出される。

【0061】

このようなアッセイでは、二次抗体の濃度は一般におよそ０．１〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくはおよそ１μｇ／ｍｌであろう。二次抗体を含有する溶液は一般に、およそｐＨ６．５〜９．５の範囲に緩衝化される。インキュベートの時間は、二次抗体が結合できる分子を結合するために十分な時間である。一般に、およそ０．１〜３時間が十分であり、通常１時間が十分であろう。二次抗体が結合した後、基本的には先の洗浄の項で記載したように、通常、不溶性支持体は非特異的結合物質がないように再度洗浄される。非特異的結合物質が洗い流された後、結合コンジュゲートによって生成されるシグナルを定法によって検出される。

【0062】

対象の方法で用いられる固体支持体には、ニトロセルロース（例えば膜状またはマイクロタイターウェル様式）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；フッ化ポリビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロンメンブレン；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどの基質が含まれる。

【0063】

固体支持体はウシ血清アルブミンなどのタンパク質にてブロックするか、体液試料をブロッキングタンパク質の存在下で固体支持体とインキュベートしてよい。

【0064】

メソスケールディスカバリー（登録商標）アッセイ
体液試料中のＢＩＮ１タンパク質のレベルを測定するための方法は、メソスケールディスカバリー（登録商標）（ＭＳＤ）プラットフォームを用いるアッセイ様式で行ってよい。一般的に、電気化学発光標識にコンジュゲートする二次結合体部分を用い、ＭＳＤプラットフォームで二次結合体部分からの電気化学発光を検出する。

【0065】

ＭＳＤ技術は、プレートの下部に一体化された電極を持つマルチスポット（登録商標）とマルチアレイ（登録商標）の使用を伴う。電気化学発光の検出は、電気化学的に刺激を受けたときに光を発光する標識を用いる。刺激のメカニズム（電気）がシグナル（光）と分離されているのでバックグラウンドシグナルは最小限である。標識は安定であり、様々な共役化学を介して二次結合体部分にカップリングしうる。これらはおよそ６２０ｎｍで光を励起し、消色問題を取り除く。各標識の反復励起サイクルを用いてシグナルを増幅し、光ラベルを強め、感度を改善してもよい。ＭＳＤのマイクロプレートの下部に位置する電極で検出工程が開始する。電極に十分近い標識が刺激され、検出され、非洗浄アッセイを可能にする。ＭＳＤリードバッファは、電気化学発光シグナルを強める反応体を含有する。

【0066】

第１の分子は、受動的吸収によるマイクロプレートへの直接結合によってＭＳＤマイクロプレートに結合してもよい。第一分子に結合した第二分子は、第三分子を介して直接または間接的に第二分子に結合している電気化学発光タグを電気的に刺激することによって検出されうる。ゆえに、第一のＢＩＮ１結合部分は、受動的吸収によってプレートに結合してよく、ＢＩＮ１結合部分に結合した試料中の目的の試料とＢＩＮ１とが共にインキュベートされてよい。結合したＢＩＮ１は第二ＢＩＮ１結合部分によって検出され、この検出は、第二ＢＩＮ１結合部分に特異的な電気化学発光タグ付加抗体を用いて行われてよい。

【0067】

あるいは、第一分子は予めコーティングしたＭＳＤマイクロプレート上に固定化されてよい。ＭＳＤマイクロプレートは、例えばアビジンまたはストレプトアビジンで予めコーティングされ、第一分子がビオチンにコンジュゲートする。固定化された第一分子への第二分子の結合は上記のように検出してよい。

【0068】

あるいは、第一および第二の分子を含む複合体はマイクロプレート上に固定され、上記のように検出されてよい。

【0069】

電気化学発光タグの電気刺激のため、またタグの刺激から生じるシグナルの測定のために、ＳＥＣＴＯＲ機器が用いられてよい。

【0070】

電気化学発光タグには、スルホタグなどのＭＳＤ−ＴＡＧ（商標）、並びにＭＳＤアッセイプラットフォームと互換性がある他の電気化学発光タグが含まれる。

【0071】

試料
生物学的流体試料は、BIN1タンパク質が存在しうる任意の試料とすることができる。上記のように、哺乳動物、例えばヒトからの液体の生物学的試料は、ＢＩＮ１タンパク質レベルを検出するためにアッセイすることができる。このような流体には、血液（例えば、全血またはその画分（例えば、血清、血漿））、心嚢液などの水性流体が含まれる。

【0072】

特に、対象とする体液流体には、全血、血清、血漿および他の血液由来の試料が含まれる。「血液試料」なる用語は、全血またはその分画（例えば血清、血漿）を包含することを意図する。試料の種類は、アッセイ形式と適合するように選択することができる。

【0073】

サンプル量は、特定のアッセイ形式と適合する任意の量であってよい。ある実施形態では、試料は、ＢＩＮ１ポリペプチドのレベルについてアッセイする前に適切な溶液で希釈されるであろう。一般に、生体試料を希釈するのに適する溶液には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液が含まれ、他の項目、例えば非特異的ブロック試薬、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トリトンＸ-１００、トゥイーン２０などの界面活性剤などが含まれてよい。

【0074】

アッセイのための適切なコントロール試料には、体液試料、例えば心不全でない（つまり正常な心臓）と診断されている被検体から採取した血液試料、または、既知の所定量のＢＩＮ１を含む試料（つまりポジティブコントロール）が含まれる。ポジティブコントロールの例としては、ＢＩＮ１タンパク質を発現する細胞株の細胞溶解物であってもよい。この場合、コントロール試料は、コントロールから期待される結果が得られる場合にアッセイが正しく実行され、試薬が安定であることを保証するものである。

【0075】

多くの実施形態では、体液試料に適した初期供給源は血液試料である。よって、被検体のアッセイに用いた試料は、一般に、血液由来試料である。血液試料は全血でもその分画、例えば血清、血漿などから得てもよく、いくつかの実施形態では、試料は血液由来であり、血液を凝固させ、血清を分離し、回収してＢＩＮ１検出アッセイに使用される。

【0076】

試料が血清または血清由来の試料である実施形態において、試料は、一般に、流体試料である。流体血清試料を製造するための任意の便利な方法を使用してよい。多くの実施形態において、本方法は、穿刺（例えば、指穿刺、静脈穿刺）によって静脈血を凝固又は血清分離管に入れ、血液を凝固させ、凝固した血液から血清を遠心分離することを用いる。次いで、血清を回収し、分析するまで保存する。場合によって、血液は、静脈穿刺によって被検体から採取されてよい。０．１〜０．５ｍｌを用いて血清または血漿を調製してよい。血清は採血直後に調製してもよい。チューブは、血清が除去された後、遠心分離後４時間室温に放置してもよい。血清を分注し、−２０℃で保存してよい。血漿は、血液試料にＥＤＴＡ（終濃度５ｍＭ）を添加することにより調製することができる。血液試料を遠心分離し、上清を除去し、−２０℃で保存することができる。患者由来の試料が得られたら、試料をアッセイしてＢＩＮ１のレベルを測定する。

【0077】

試料はＢＩＮ１のレベルの検出を高めるために様々な方法で処理してよい。例えば、試料が血液である場合、赤血球はアッセイの前に（例えば、遠心分離により）試料から除去してもよい。また、ＢＩＮ１の存在の検出は、当技術分野でよく知られる手順（例えば酸沈殿、アルコール沈殿、塩析、疎水性沈殿、濾過（３０ｋＤより大きい分子を保持することができるフィルタ、例えばＣｅｎｔｒｉｍ３０（商標）を用いたもの）、アフィニティー精製）を用いて試料を濃縮することによって向上してもよい。場合によって、ある種のタンパク質はアッセイを行う前に試料から除いてもよい。

【0078】

心臓健康状態および心臓死亡率のリスクの予後を評価する際のＢＩＮ１タンパク質レベルの使用
被検体の体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて、被検体の心臓健康状態の評価および／又は臨床転帰不良のリスクを決定することができる。ＢＩＮ１タンパク質レベルはまた、急性心臓症状（例えば、心筋梗塞）の診断を容易にするために使用することができる。心臓の健康状態を評価することは、被検体、例えば臨床上心不全を有すると診断された被検体の、転帰不良のリスクを予測することを含み得る。

【0079】

一般に、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルよりも、体液（例えば、血液）中のＢＩＮ１タンパク質レベルが低いことは、被検体の心臓健康状態の衰退を示しており、被検体の心臓の健康状態の評価および／または転帰不良の可能性の予測に役立つ。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルの減少は、心臓の健康状態の低下または心臓の健康不良と正の相関がある。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときのＢＩＮ１タンパク質レベルの減少は、例えば、将来の急性心臓症状、心臓死亡率、心室性不整脈など、転帰不良のリスクの増加と相関している。

【0080】

しかしながら、体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルが正常ＢＩＮ１タンパク質レベルよりも有意に高い場合には、急性心臓症状または心筋梗塞などの深刻な心臓事象の診断を容易にする。

【0081】

ゆえに、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、心臓健康状態の評価、転帰の予測、深刻な心臓事象などの急性心臓症状の診断の容易化に使用できるだけでなく、深刻な心臓事象を有していない被検体と深刻な心臓事象を有している被検体とを区別するためのマーカーともなる。

【0082】

ＢＩＮ１タンパク質レベルの使用については以下により詳細に記載する。

【0083】

ＢＩＮ１タンパク質レベルの使用
この方法は、被検体、例えば深刻な心臓事象などの急性心臓症状を有する個体、急性心臓症状を有さない個体、例えば急性でない心臓症状または明らかでない心臓症状を有する個体からの体液試料中のBIN1タンパク質レベルをアッセイすること含むことができる。

【0084】

ＢＩＮ１タンパク質レベルの分析は、ＢＩＮ１タンパク質レベルと正常ＢＩＮ１タンパク質レベルとの比較を含むことができる。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルは健康な心臓を示すことがわかっているＢＩＮ１タンパク質レベルであってよい。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルは一般に、心不全がない被検体からの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを指す。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルは、心臓機能が心臓の形態全体、左心室駆出率、心臓カテーテルの試験からおよび／または個々の医療記録に心臓関連症状がないことから正常であると推定された個体などから入手された体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルから測定することができる。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルは、その心臓機能が正常であると推定された複数の個体から入手された体液試料を組み合わせることによって得たプールした体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルから測定することができる。したがって、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルは、その心臓機能が正常であると推定された複数の個体から入手された体液試料を組み合わせることによって得たプールした体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルであってよい。

【0085】

ＢＩＮ１タンパク質レベルの分析は、健康な個体からの体液試料のプールした試料におけるＢＩＮ１タンパク質レベルに対するＢＩＮ１タンパク質レベルの正規化を含むことができる。

【0086】

被検体の心臓健康状態を評価する、および／または転帰を予測する、または急性心臓症状の診断を容易にするためのＢＩＮ１タンパク質レベルの測定は、さらに、一または複数の心不全の血清学的マーカー、例えばＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、および／またはクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、および／またはＣＫ−ＭＢ；および／またはトロポニン（特に、心臓トロポニンＴおよび心臓トロポニンＩ）の測定を含んでよい。心不全の血清学的マーカーのアッセイは、被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルのアッセイの前、後またはと同時に行ってよい。

【0087】

被検体の心臓健康状態を評価する、および／または転帰を予測する、または急性心臓症状の診断を容易にするためのＢＩＮ１タンパク質レベルの測定は、通常心臓健康状態を診断するために行われる他の身体的評価、例えば、足首の腫れ、水貯留による突然の体重増加、運動能力の低下、胸痛、悪心、めまいなどの身体症状のスクリーニングと組み合わせて行われてよい。

【0088】

ある実施形態では、被検体の心臓健康状態を評価する、および／または転帰を予測する、または急性心臓症状の診断を容易にするためのＢＩＮ１タンパク質レベルの測定は、さらに、一または複数の心不全の血清学的マーカーのレベルの測定、および／または被検体の身体的評価の実施を含んでよい。

【0089】

心臓健康状態の診断の容易化および／または転帰予測の容易化のための被検体のＢＩＮ１タンパク質レベルの使用
体液（例えば血液）中のＢＩＮ１タンパク質レベルは、心臓健康状態の診断の容易化および／または転帰の予測の容易化に有用である。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの被検体の体液（例えば血液）中のＢＩＮ１タンパク質レベルの低減は、被検体の心臓健康状態の衰退を示す。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの被検体の体液（例えば血液）中のＢＩＮ１タンパク質レベルの低減は、被検体の心臓健康状態の評価および／または転帰不良の可能性の予測を容易にすることができる。被検体は、明らかでない心臓症状または急性でない心臓症状を有する被検体、例えば深刻な心臓事象を有さない被検体であってよい。

【0090】

正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの顕著な低減は、患者は不良な心臓健康状態を有することを示す。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの顕著な低減は、転帰不良の可能性の増加と相関する。一方、正常値に近いＢＩＮ１タンパク質レベルは、被検体が良好な心臓健康状態を有することを示すか、または心不全患者の場合には転帰不良、例えば急性心臓症状または心臓死亡率の可能性の低減を示す。

【0091】

正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルが低い場合、被検体が不良な心臓健康状態を有し、転帰不良、例えば急性の心臓症状、心臓死亡率、心室性不整脈の可能性の増加が予測されることを示す。一般に、正常ＢＩＮレベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルの少なくとも２０％の減少は有意な低減であり、被検体が不良な心臓健康状態を有することを示す。例えば、正常ＢＩＮレベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルの２０％以上の減少、または３０％以上の減少、または４０％以上の減少、または４５％以上の減少、または５０％以上の減少、または５５％以上の減少、または60％以上の減少、または65％以上の減少、または70％以上の減少、または75％以上の減少、または80％以上の減少、または85％以上の減少、または90％の減少またはそれ以上は、被検体が不良な心臓健康状態を有することを示す。ＣＨＦ患者では、正常ＢＩＮレベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルの少なくとも２５％の減少は、心臓死亡率の可能性の増加を示す。

【0092】

一般に、正常ＢＩＮレベル（または正常範囲）と比較してＢＩＮ１タンパク質レベルの少なくとも２５％の減少、例えば３０％の減少、４０％の減少、５０％の減少、７５％の減少またはそれ以上を有する患者は転帰不良のリスクが増加する。

【0093】

ＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて、ＢＩＮ１タンパク質レベルの評価後一定期間にわたって転帰不良のリスク、例えばその後の３か月〜６０か月、例えば６か月〜１８か月にわたって、その後の６か月〜１２か月、または１２か月〜１８か月、または１８か月〜２４か月、２４か月〜３０か月、または３０か月〜３６か月、または３６か月〜４２か月、または３６か月〜４８か月、または２４か月〜５４か月、または２４か月〜６０か月またはそれ以上にわたってＣＨＦ患者の転帰不良のリスクを予測してもよい。

【0094】

また、患者のＢＩＮ１タンパク質レベルは、閾値と比較して評価されてよい。「閾値」または「リスク閾値」は、相対的な複数の転帰の区別を容易にする、例えば比較的高リスクの転帰不良を比較的低リスクの転帰不良と区別することを容易にするために選択される値である。例えば、ほとんどの場合、閾値は、およそその値以下は転帰不良のリスクが比較的高く、それより上は転帰不良のリスクが比較的低い値である。

【0095】

場合によって、第一の閾値および第二の閾値の２つの閾値があってよい。例えば、第一の閾値以下であるが第二の閾値よりも上であるＢＩＮ１タンパク質レベルは、評価を行った時点では被検体は不良な心臓健康状態を有するが、転帰不良のリスクはないことを示しうる。第二の閾値以下のＢＩＮ１タンパク質レベルは、被検体が不良な心臓健康状態を有し、急性心臓症状、心臓死亡率などの転帰不良の高リスクにあることを示しうる。

【0096】

例えば、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルよりも約３０％未満のＢＩＮ１タンパク質レベルが第一の閾値を表し、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルよりも約５０％未満のＢＩＮ１タンパク質レベルが第二の閾値を表す。第一の閾値よりも低いＢＩＮ１タンパク質レベルを有する被検体は、この閾値以上のＢＩＮ１タンパク質レベルを有する被検体と比較して不良な心臓健康状態を有する。第一の閾値より低いが第二の閾値よりは高いＢＩＮ１タンパク質レベルを有する被検体は、不良な心臓健康状態を有するが、転帰不良のリスクは低い。第二の閾値より低いＢＩＮ１タンパク質レベルを有する被検体は、転帰不良のリスクが相対的に増加しており、この閾値以上のＢＩＮ１タンパク質レベルを有する心臓病患者は転帰不良のリスクが相対的に減少している。

【0097】

また、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、異なる機能的分類間で心不全患者を分類するために用いることもできる。一般に、第一の範囲（例えば正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ６０％〜４５％）内のＢＩＮ１タンパク質レベルを有する心不全患者は、高次の機能分類（例えばＮＹＨＡクラス１またはクラス２）に分類されうるが、第二の範囲（例えば正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ４０％〜０％）内のＢＩＮ１タンパク質レベルを有する心不全患者は、低次の機能分類（例えばＮＹＨＡクラス３またはクラス４）に分類されうる、低次の機能分類に分類される第二の範囲（例えば正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ４０％〜０％）内のＢＩＮ１タンパク質レベルを有する心不全患者は、さらに、クラス３と４の間で、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ２０％以下のＢＩＮ１タンパク質レベルを有する患者をクラス４に分類し、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ２０％より上であるが正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ４０％以下のＢＩＮ１タンパク質レベルを有する患者をクラス３に分類してよい。

【0098】

ＢＩＮ１タンパク質レベルは、評価後一定の期間にわたって転帰不良のリスクを、例えばＣＨＦ患者の転帰不良のリスクをその後５年にわたって、例えば３か月〜６０か月、例えばその後６か月〜１２か月にわたって、または１２か月〜１８か月、または１８か月〜２４か月、２４か月〜３０か月、または３０か月〜３６か月、または３６か月〜４２か月、または３６か月〜４８か月、または２４か月〜５４か月、または２４か月〜６０か月またはそれ以上にわたって予測するために用いてよい。

【0099】

ＢＩＮ１タンパク質レベルは、被検体の不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）を診断するために用いてよい。さらに、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、疾患の重症度を診断する、および／またはＡＲＶＣと診断された被検体の疾患進行を予測するために用いられてよい。一般に、正常ＢＩＮ１レベルと比較したときの、ＡＲＶＣと診断された患者の体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルの減少は、ＡＲＶＣの重症度の増加と相関しており、例えばＡＲＶＣのさらなる進行および／または将来の不整脈など転帰不良の高リスクが予測される。さらに、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、ＡＲＶＣと診断された被検体の心臓健康状態を評価するための方法に用いられうる。この方法には、ＡＲＶＣと診断された被検体から入手された体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを測定することと、そのＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体の心臓健康状態を評価することが含まれ得、このとき正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの低減が、ＡＲＶＣの重症度と正の相関がある。

【0100】

ＢＩＮ１タンパク質レベルは、ＡＲＶＣと診断された被検体のＡＲＶＣのさらなる進行および／または将来の不整脈事象といった転帰不良のリスクを予測する方法に用いられてよい。この方法には、ＡＲＶＣと診断された被検体から入手された体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを測定することと、そのＢＩＮ１タンパク質レベルを用いて被検体の転帰不良のリスクを予測することが含まれ得、このとき正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの低減が、重度ＡＲＶＣへのＡＲＶＣの進行および／または将来の不整脈事象（一または複数）の発症といった転帰不良のリスクの増加と相関している。

【0101】

急性心臓症状の診断を容易にするためのＢＩＮ１タンパク質レベルの使用
被検体の体液試料におけるＢＩＮ１タンパク質レベルの測定は、深刻な心臓事象などの急性心臓症状の診断を容易にする際に有益である。一般に、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較して体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルの有意な増加は被検体での深刻な心臓事象を示す。ゆえに、体液のＢＩＮ１タンパク質レベルは、急性心臓症状を持たない被検体と、深刻な心臓事象などの急性心臓症状を有する被検体を区別するためのマーカーとして有益である。このようなアッセイは、深刻な心臓事象の症状を違ったふうに表す被検体における鑑別診断を容易にすることができる。したがって、深刻な心臓事象の症状を示す被検体において、深刻な心臓事象の発症は、被検体の体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルが正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較して有意に増加しているか否かで診断することができる。一方、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルが有意に増加していなければ、被検体は深刻な心臓事象を持っていないことを示す。

【0102】

急性心臓症状または深刻な心臓事象には、急性冠症候群、心筋梗塞、または急性劇症性心筋炎が含まれうる。

【0103】

正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較したときの有意に高い体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルは、被検体が急性心臓症状を有することを示す。一般に、正常ＢＩＮ１レベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルの少なくとも２０％の増加を有意とし、被検体が深刻な心臓事象などの急性心臓症状を有することを示す。例えば、正常ＢＩＮ１レベル（または正常な範囲）と比較してＢＩＮ１タンパク質レベルの２０％の増加、３０％の増加、４０％の増加、５０％の増加、７５％の増加またはそれ以上を有する患者は、急性心臓症状を有する。

【0104】

被検体
一般に、本明細書中に記載される方法に適する被検体は、哺乳動物被検体、例えばイヌ、ウシ、ウマ、またはヒト被検体である。

【0105】

急性心臓症状を持たない被検体
本明細書中の方法を用いた評価に適する被検体には、急性心臓症状を持たない被検体、例えば心臓症状を明確には持たない被検体、急性ではなく慢性の心臓症状を持つ被検体などが含まれる。

【0106】

ここで用いられる「明確でない心臓（ｈｅａｒｔまたはｃａｒｄｉａｃ）症状」なる用語は、被検体においてまだ臨床症状となっていない心臓機能の低下を有する被検体を指す。「明確でない心臓症状」を有する被検体には、例えば、明らかな臨床症状をまだ表していない心臓不全の初期段階にある患者が含まれる。このような被検体には、心臓関連の健康問題に罹りやすい個体、例えば、心臓関連の問題の家族歴がある個体、例えば心臓症状を患ったことがある近親者；肥満症および／または高血圧症および/または高コレステロールなどに罹患している個体；過去に心臓症状を患ったことがある個体が含まれうる。

【0107】

被検体の心臓健康状態を評価するためにＢＩＮ１の体液レベルが測定される被検体には、個体が心臓症状を有することを示しうる症状を示す個体、例えば、胸の痛み、めまい、息切れ、吐き気、発汗などを示す個体が含まれうる。

【0108】

被検体の心臓健康状態を評価するためにＢＩＮ１の体液レベルが測定されうる被検体には、急性でない心臓症状を有すると診断される個体が含まれうる。ここで用いられる「急性でない心臓（ｈｅａｒｔまたはｃａｒｄｉａｃ）症状」なる用語は、心臓状態と関連する臨床症状を表すが、その心臓症状が急性でなく、例えば、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、慢性心不全、慢性進行性非虚血性心筋症、または慢性進行性虚血性心筋症である被検体を指す。急性でない心臓症状を有する被検体は一般に、心臓症状の治療で入院しておらず、循環器外来で管理されうる。

【0109】

急性心臓症状を有する被検体
本明細書中の方法を用いた評価に適する被検体には、急性心臓症状を有する被検体が含まれる。ここで用いられる「急性心臓（ｈｅａｒｔまたはｃａｒｄｉａｃ）症状」なる用語は、心臓状態と関連する臨床症状を表し、その症状が急性でない心臓症状を有する被検体によって表される臨床症状よりも重症である被検体を指す。急性心臓症状を有する被検体は通常、心臓症状および定期的なモニタリングのために入院しているか、または時に頻回な外来臨床管理で管理されうる。「急性心臓症状」には、深刻な心臓事象、例えば、急性冠症候群、心筋梗塞、または急性劇症性心筋炎が含まれる。急性心臓症状を有する被検体は、急性心臓症状の他の血清学的な証拠を有し得、例えば、正常レベルより高いＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を有する、正常レベルより高いクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を有する、正常レベルより高いＣＫ−ＭＢを有する、または正常レベルより高いトロポニン（特に、心臓トロポニンＴおよび心臓トロポニンＩ）を有する。場合によって、急性心臓症状を有する被検体は上記の徴候の２以上を有しうる。

【0110】

臨床応用
被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルは、心臓健康状態の評価を容易にする際に、転帰不良のリスクを予測する際に、また、深刻な心臓事象などの急性心臓症状を診断するために有益である。ある実施態様では、ＢＩＮ１タンパク質レベルは、心臓健康状態の評価を容易にする際に、転帰不良のリスクを予測する際に、急性心臓症状を診断するために、心臓疾患の他の徴候と併せて用いられる。

【0111】

急性でない心臓症状を有する被検体
急性でない心臓症状患者の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの測定は、先に述べたように、患者に機能的分類、例えばニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラス１−４に割り当てるために用いられうる。この機能的分類は、心臓移植を受けるための患者への優先順位を決定するために用いられうる。急性でない心臓症状患者の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルの測定は、ＣＨＦ治療への応答評価を容易にするため、および／または治療計画の変更を導くために用いられうる。

【0112】

一般に、急性でない心臓症状を有する患者の場合、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルが低ければ低いほど、心臓の回復が不良である可能性が高くなるので、患者は、心臓移植を受けることについて高い優先順位が割り当てられる。あるいは、急性でない心臓症状の患者が正常近くのＢＩＮレベルを有する場合、心臓は回復する機会があることが予測でき、この患者は、心臓移植を受けることについて低い優先順位が割り当てられうる。一般に、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較してＢＩＮ１タンパク質レベルが低ければ低いほど、心臓移植を受けることについての患者の優先順位が高くなる。

【0113】

同様に、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較してやや減少したＢＩＮ１を有する患者では、患者の回復を促すために患者を左心補助循環機器に置く優先が増すであろう。左心補助循環機器の除去は、ＢＩＮレベルの正常または正常近くのレベルへの回復と合わされうる。

【0114】

ＢＩＮ１タンパク質レベルは、心臓死亡率のリスクを決定するために用いてよい。一般に、ＢＩＮ１タンパク質レベルが低ければ低いほど、心臓死亡率のリスクは高くなる。例えば、場合によって、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルの４０％以下のＢＩＮ１タンパク質レベル、例えば正常ＢＩＮ１タンパク質レベルの３０％以下、または２０％以下は、適当な医学的介入が無い場合には５年以内の心臓死亡率が予測される。適当な医学的介入には、心臓移植、ＬＶＡＤなどが含まれうる。

【0115】

転帰不良、例えば急性心臓症状、心臓死亡率のリスクの決定は、ＣＨＦ治療の有効性を評価する、および治療方策への変更を決定するために用いられうる。ＣＨＦ患者は、例えば手術、機械的補助機器、両心室ペースメーカー、心臓移植、および薬物療法による処置を受けているかもしれない。ＣＨＦ治療の有効性は、ＢＩＮ１レベルのアッセイにより評価してもよい。一般に、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルと比較して低いＢＩＮ１は、心不全の可能性が高く、治療が有効でないことを示す。このような治療有効性の決定は、治療を変更するために用いてよい。例えば、それは心臓移植について高い優先順位にある患者を分類することによる。

【0116】

一方、ＣＨＦ治療はＢＩＮレベルを安定化し、結果として正常または正常に近いレベル、例えば閾値レベルよりも上にしうる。衰えた心臓が回復するにつれ、ＢＩＮ１タンパク質レベルは正常または正常近くのＢＩＮ１タンパク質レベルとなる。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルは、心不全の可能性が低く、治療が有効であることを示す。この情報は、心臓移植を受けることについて低い優先順位の患者を分類するために用いてよく、大動脈内バルーンポンプ、心室補助機器、静脈心臓治療などの他の治療を示しうる。

【0117】

ＢＩＮ１タンパク質レベルは治療の選択肢を決定するために用いられてよい。例えば、正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ４０％未満のＢＩＮ１タンパク質レベルは、転帰不良のリスクの増加と相関しうる。正常ＢＩＮ１タンパク質レベルのおよそ４０％以下、３０％以下、２０％以下のＢＩＮ１タンパク質レベルは、将来、例えば、次の３か月〜６０か月、例えば３か月〜６か月、６か月〜８か月、８か月〜１２か月、１２か月〜１８か月、１８か月〜２４か月、１８か月〜３０か月、１８か月〜４６か月、１８か月〜６０か月の患者の転帰不良と正の相関がありうる。転帰不良は、死、ＬＶＡＤ移植、またはＬＶＥＦの改善なしまたはＬＶＥＦのさらなる悪化であってよい。この情報は、心臓移植を受けることについて高い優先順位の患者を分類するために用いてよく、大動脈内バルーンポンプ、心室補助機器、静脈心臓治療などの他の治療を示しうる。

【0118】

急性心臓症状を有する被検体
急性心臓症状を有することが疑われる被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルを評価することは、深刻な心臓事象などの急性心臓症状の診断を容易にするのに有用である。急性心臓症状の診断には、急性心臓症状の既知のマーカー、例えばＢＮＰ、ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、および／またはトロポニンのタンパク質レベルの評価と併せて、上記のように、被検体の体液中のＢＩＮ１タンパク質レベルの評価が含まれうる。「〜と併せて」という表現には、ＢＩＮ１タンパク質レベルと急性心臓症状の他のマーカーの連続的または同時の評価が含まれる。急性心臓症状を有することが疑われる被検体において急性心臓症状を診断すると、被検体の治療プロとコール（一または複数）の決定を容易にすることができる。

【0119】

キット
本開示の方法において使用するための材料は、よく知られている手順に従って製造されるキットの調製に適している。本開示はしたがって、臨床転帰の予測、治療の選択肢の決定、または治療に対する反応の予測などのためにＢＩＮ１のレベルを定量するためのＢＩＮ１結合部分（一または複数）でありうる作用物質を具備するキットを提供する。加えて、キットは、場合によって、識別のための記述もしくはラベルまたは本開示の方法におけるそれらの使用に関する使用説明書とともに試薬（一または複数）を具備してよい。キットは、例えば、作製済み（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）マイクロアレイ、緩衝液、抗体、酵素基質、本開示のものを含む、方法において利用される様々な試薬（典型的には、濃縮された形態で）の１つまたは複数をそれぞれ含む、容器（方法の自動化された実行において使用するのに適したマイクロタイタープレートを含む）を具備してよい。予後のおよび／または予測的な情報を推定または定量するために使用される数学アルゴリズムもまた、当然、キットの潜在的な構成要素である。

【0120】

本開示により提供される方法はまた、全体または一部分において自動化されていてもよい。

【0121】

報告
本開示の方法は、ＢＩＮ１のレベルをアッセイした結果を要約した報告の作成に適している。ある実施形態では、報告は被検体の心臓健康状態の決定を含みうる。ある特定の実施形態では、報告は、ＣＨＦ患者における心臓死亡リスクの決定を包含していてもよい。本明細書において記載される「報告」は、被検体の体液試料中のＢＩＮ１タンパク質レベルおよび／または心臓死亡リスクに関する対象とする情報を提供する報告要素を包含する電子文書または有形の文書である。報告は、完全にまたは部分的に電子的に作成されてもよく、例えば、電子ディスプレイ（例えば、コンピュータのモニター）上に提示される。報告はさらに、１）試験設備に関する情報；２）サービス提供者情報；３）患者データ；４）試料データ；５）ａ）適応；ｂ）試験データを含む様々な情報を包含し得る解釈レポート、および６）別の特徴、のうち１つまたは複数を包含することができる。

【0122】

本開示は、したがって、報告およびそれに起因する報告を作成する方法を提供する。報告は、患者から得られる体液試料におけるＢＩＮ１のレベルの要約を包含していてもよい。報告は、心臓死亡リスクの評価を包含していてもよい。報告は、手術単独または療法と組み合わせた手術などの治療モダリティに関する推奨を包含していてもよい。報告は、電子的フォーマットでまたは紙上で提示されてもよい。本明細書において開示されている方法はさらに、報告を作成または出力するステップを包含することができ、この報告は、電子的媒体（例えば、コンピュータのモニター上の電子ディスプレイ）の形態で、または有形媒体（例えば、紙または別の有形媒体上に印刷された報告）の形態で提供することができる。

【0123】

明確にするために、「クライアント」と互いに交換可能に使用される「ユーザー」という用語は、報告が送信される人または実体を指すことを意味し、例えば以下の、ａ）試料を採取する；ｂ）試料を処理する；ｃ）試料または処理された試料を提供する；およびｄ）心臓死亡リスク評価において使用するためのデータを作成する、のうち１つまたは複数を行う同じ人または実体とすることができることに留意するべきである。場合によっては、試料採取および／または試料処理および／またはデータ作成を提供する人（一または複数）または実体（一または複数）、および結果および／または報告を受け取る人は異なる人であってもよいが、混乱を回避するために、本明細書において両者とも「ユーザー」または「クライアント」と称される。ある特定の実施形態では、例えば、この方法が単一のコンピュータにおいて完全に実行される場合、ユーザーまたはクライアントは、データ入力およびデータ出力の検証を提供する。「ユーザー」は、医療専門家（例えば、臨床医、検査技師、医師（例えば、心臓専門医、外科医、かかりつけ医）など）とすることができる。

【0124】

ユーザーが方法の一部分を実行するのみの実施形態において、本発明の方法によるコンピュータ化されたデータ処理の後、データ出力を検証する（例えば、完全な報告を提供するための発信前の結果、完全な報告、または「不完全な」報告を検証し、手作業による介入および解釈的報告の完了を提供するなど）個体は、本明細書において「レビュアー」と称される。レビュアーは、ユーザーとは遠隔にある位置に（例えば、ユーザーが位置し得る医療施設とは別々に提供されるサービスに）位置していてもよい。

【0125】

政府の規制または別の制限（例えば、健康状態、医療過誤、または責任保険による要件）が適用される場合、すべての結果は、全面的にまたは部分的に電子的に作成されているかどうかにかかわらず、ユーザーへの発信の前に品質管理ルーチンにかけられる。

【0126】

コンピュータによるシステムおよび方法
本明細書に記載の方法およびシステムは、非常に多くの方法で実行することができる。特に興味深い一実施形態において、この方法は、通信インフラストラクチャー、例えば、インターネットの使用を伴う。いくつかの本発明の実施形態が、下記に論じられている。本発明は、様々な形態のハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、プロセッサ、またはそれらの組み合わせで実行されてもよいこともまた理解されるべきである。本明細書に記載の方法およびシステムは、ハードウェアとソフトウェアの組み合わせとして実行することができる。ソフトウェアは、プログラム記憶デバイスにおいてタンジブルに組み入れられているアプリケーションプログラム、またはユーザーのコンピュータ使用環境において（例えば、アプレットとして）およびレビュアーが関連付けられたリモートサイトに（例えば、サービス提供者の施設に）位置していてもよいレビュアーのコンピュータ使用環境において実行されるソフトウェアの異なる部分として実行することができる。いくつかの実施形態において、ＢＩＮ１タンパク質レベルを使用してＣＨＦ患者における心臓死亡リスクを決定するステップは、リスクを計算するためのアルゴリズムを実行するようにプログラムされたコンピュータによって実施される。別の例において、対象方法は、コンピュータに、ＢＩＮ１のレベルに基づいてＣＨＦ患者における心臓死亡リスクを計算するためのアルゴリズムを実行させるステップを包含する。

【0127】

本明細書に記載のアルゴリズムを実行するためのアプリケーションプログラムは、任意の適したアーキテクチャを備えたマシンによって、アップロードおよび実行することができる。一般に、このマシンは、１つまたは複数の中央処理ユニット（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、および入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース（複数可）などのハードウェアを有するコンピュータプラットホームを伴う。このコンピュータプラットホームはまた、オペレーティングシステムおよびマイクロ命令コードを包含する。本明細書に記載の様々な処理および機能は、オペレーティングシステムを介して実行されるマイクロ命令コードの一部またはアプリケーションプログラムの一部（またはそれらの組み合わせ）のいずれかであってもよい。加えて、様々な別の周辺デバイスが、さらなるデータ記憶デバイスおよび印刷デバイスなどのコンピュータプラットホームと接続されていてもよい。

【0128】

コンピュータシステムとして、システムは、一般に、プロセッサユニットを包含する。プロセッサユニットは、動作して、試験データ（例えば、ＢＩＮ１タンパク質のレベル、およびＢＮＰタンパク質レベル）を包含し得る；また、患者データなどの別のデータも包含していてもよい情報を受信する。受信したこの情報を、データベースにおいて少なくとも一時的に保管することができ、データを分析して上記の報告を作成する。

【0129】

入力および出力データの一部またはすべてはまた、電子的に送信することができ、特定の出力データ（例えば、報告）は、電子的にまたは電話によって（例えば、ファクシミリによって、例えば、ファックスバックなどのデバイスを使用して）送ることができる。例示的な出力受信デバイスは、表示要素、プリンタ、ファクシミリデバイスなどを包含することができる。送信および／または表示の電子的形態は、電子メール、対話式テレビなどを包含することができる。特に興味深い一実施形態において、入力データのすべてまたは一部および／または出力データのすべてまたは一部（例えば、通常、少なくとも最終の報告）が典型的なブラウザとのアクセス、好ましくは機密アクセスのためにウェブサーバー上に維持される。データは、必要に応じて、アクセスする、または医療専門家に送ることができる。最終報告のすべてまたは一部を包含する入力および出力データを使用して、医療施設の機密データベース中に存在し得る患者のカルテを追加することができる。

【0130】

本明細書に記載の方法において使用するためのシステムは、一般に、少なくとも１つのコンピュータプロセッサ（例えば、方法が全体として単一の場所で行われる場合）または少なくとも２つのネットワーク化されたコンピュータプロセッサ（例えば、データがユーザー（本明細書において「クライアント」とも称される）によって入力され、解析のためにリモートサイトの第２のコンピュータプロセッサに送信される場合、このとき、第１および第２のコンピュータプロセッサは、ネットワークによって、例えば、イントラネットまたはインターネットを介して接続されている）を包含する。システムはまた、入力のためのユーザーコンポーネント（一または複数）；ならびにデータ、作成された報告、および手作業による介入の検証のためのレビュアーコンポーネント（一または複数）を包含することができる。システムのさらなるコンポーネントは、サーバーコンポーネント（一または複数）；およびデータを保存するためのデータベース（一または複数）（例えば、報告要素、例えば、解釈的報告要素のデータベース、またはユーザーによるデータ入力およびデータ出力を包含することができるリレーショナルデータベース（ＲＤＢ）のような）を包含することができる。コンピュータプロセッサは、パーソナルデスクトップコンピュータ（例えば、ＩＢＭ、Ｄｅｌｌ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈなど）、携帯用コンピュータ、メインフレーム、ミニコンピュータ、または別のコンピュータデバイスにおいて典型的に見出されるプロセッサとすることができる。

【0131】

ネットワーク化されたクライアント／サーバーアーキテクチャは、必要に応じて選択することができ、例えば、伝統的な２層または３層クライアントサーバーモデルとすることができる。リレーショナルデータベース管理システム（ＲＤＭＳ）は、アプリケーションサーバーコンポーネントの一部または別個のコンポーネント（ＲＤＢマシン）のいずれかとして、データベースにインターフェースを提供する。

【0132】

一例において、このアーキテクチャは、データベース中心のクライアント／サーバーアーキテクチャとして提供され、このアーキテクチャにおいて、クライアントアプリケーションは、一般に、データベース（または、データベースサーバー）への要求を行い、必要に応じて様々な報告要素と、特に解釈的報告要素、特に解釈テキストおよび警告とともに報告を追加するアプリケーションサーバーからのサービスを要求する。サーバー（複数可）（例えば、アプリケーションサーバーマシンの一部または別個のＲＤＢ／リレーショナルデータベースマシンのいずれかとして）は、クライアントの要求に応じる。

【0133】

入力クライアントコンポーネントは、最大範囲の能力およびアプリケーションを実行するための特徴を提供する、完全な独立型のパーソナルコンピュータとすることができる。クライアントコンポーネントは、通常、任意の所望のオペレーティングシステムのもとで動作し、通信エレメント（例えば、モデムまたはネットワークに接続するための別のハードウェア）、１つまたは複数の入力デバイス（例えば、キーボード、マウス、キーパッド、または情報またはコマンドを転送するために使用される別のデバイス）、記憶エレメント（例えば、ハードドライブまたは別のコンピュータで読取り可能な、コンピュータで書き込み可能な記憶媒体）、および表示エレメント（例えば、モニター、テレビ、ＬＣＤ、ＬＥＤ、または情報をユーザーに伝達する別の表示デバイス）を包含する。ユーザーは、入力デバイスを介してコンピュータプロセッサに入力コマンドを入力する。一般に、ユーザーインターフェースは、ウェブブラウザアプリケーション用のグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）である。

【0134】

サーバーコンポーネント（複数可）は、パーソナルコンピュータ、ミニコンピュータ、またはメインフレームとすることができ、データ管理、クライアント間の情報共有、ネットワーク管理運営およびセキュリティを提供する。アプリケーションおよび使用される任意のデータベースは、同じまたは異なるサーバー上にあってよい。

【0135】

メインフレームなど単一のマシン、マシンの集合体、または別の適当な構成における処理を含む、クライアントおよびサーバー（複数可）のための別のコンピュータの配置が想定される。一般に、クライアントおよびサーバーマシンは、一緒に作動して、本開示の処理を達成する。

【0136】

使用される場合、データベース（複数可）は、通常、データベースサーバーコンポーネントと接続されており、データを保持する任意のデバイスとすることができる。例えば、データベースは、コンピュータ（例えば、ＣＤＲＯＭ、内蔵ハードドライブ、テープドライブ）用の磁気記憶デバイスまたは光学記憶デバイスであってよい。データベースは、サーバーコンポーネントの遠隔（ネットワーク、モデムなどを介するアクセスによって）に、またはサーバーコンポーネントのローカルに位置することができる。

【0137】

システムおよび方法において使用される場合、データベースは、データ項目間の関係に従って構成およびアクセスされるリレーショナルデータベースとすることができる。リレーショナルデータベースは、一般に、複数のテーブル（実体）で構成される。テーブルの行は、レコード（別個の項目についての情報の集合）を表し、列は、フィールド（レコードの特定の属性）を表す。その最も単純な概念において、リレーショナルデータベースは、少なくとも１つの共通フィールドを介して互いに「関連付けられる」データエントリーの集合である。

【0138】

コンピュータおよびプリンタを備え付けたさらなるワークステションが、データを入力するための、および、いくつかの実施形態において、所望であれば、適切な報告を作成するための、サービスの時点で使用されてもよい。コンピュータ（複数可）は、アプリケーションを起動するためのショートカット（例えば、デスクトップ上の）を有することにより、必要に応じて、データエントリー、送信、解析、報告の受取などの開始を容易にすることができる。

【0139】

コンピュータで読取り可能な記憶媒体
本開示はまた、コンピュータ使用環境において実行されるときに、本明細書において記載されている通りに心臓死亡リスクの計算のすべてまたは一部を行うためのアルゴリズムの実行を提供するプログラムが保存されている、コンピュータで読取り可能な記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、メモリーキー、フラッシュメモリーカード、ディスケットなど）を想定する。コンピュータで読取り可能な媒体が本明細書に記載の方法を行うための完全なプログラムが入っている場合、プログラムは、出力を収集、解析、および作成するためのプログラム使用説明書を包含し、一般に、本明細書に記載の通りユーザーと情報交換するため、解析情報とともにそのデータを処理するため、そのユーザーのための独自の印刷媒体または電子的媒体を作成するための、コンピュータで読取り可能なコードデバイスを包含する。

【0140】

記憶媒体が、本明細書に記載の方法の一部の実行を提供するプログラム（例えば、本方法のユーザー側の態様（例えば、データ入力、報告受取能力など））を提供する場合、プログラムは、遠隔地のコンピュータ使用環境への、ユーザーによるデータ入力の送信（例えば、インターネットを介して、イントラネットを介して、など）を提供する。データの処理または処理の完了を、遠隔地で行い、報告を作成する。報告および完全な報告を提供するための任意の必要とされた手作業による介入の完了の検証後、次いで、完全な報告が、電子文書または印刷文書（例えば、ファックスまたは郵送される紙の報告）としてユーザーに送り返される。本発明に従うプログラムの入っている記憶媒体は、適した基板またはそのような使用説明書を得ることができるウェブアドレス上に記録された使用説明書（例えば、プログラムインストール、使用に関するものなど）とともにパッケージ化することができる。コンピュータで読取り可能な記憶媒体はまた、対象方法のアッセイステップを行うための１つまたは複数の試薬（例えば、プライマー、プローブ、アレイ、または別のそのようなキットコンポーネント）と組み合わせて提供することもできる。

【実施例】

【0141】

以下の実施例は、本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載され、本発明者らが本発明者らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図せず、以下の実験がすべての実施された実験である、または実施された実験が以下の実験だけであることを表すこともまた意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験的誤差および偏差が計上されるべきである。別途指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度である。

【0142】

材料および方法
ＢＩＮ１ ＥＬＩＳＡアッセイ。 市販のＥＬＩＳＡ試薬セット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＢＩＮ１ ＥＬＩＳＡアッセイを設定した。簡単に言うと、９６ウェルプレートに捕捉抗体マウス抗ＢＩＮ１（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）を塗り広げ、４℃に終夜置いた。室温で１時間かけて希釈緩衝液にて洗浄およびブロッキングを行った後、標準物質と試料の両方を加え、回転させながら室温で１時間インキュベートし、ＢＩＮ１を捕捉した。一連の洗浄の後、次いで一次ヤギ抗ＢＩＮ１抗体（１：１０００、Ａｂｅａｍ）を加え、捕捉されたＢＩＮ１タンパク質を検出した。十分に洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ二次抗体（１：４０００、Ａｂｅａｍ）とともにインキュベートすることによって結合した一次ヤギ抗ＢＩＮ１を検出した。最後に、洗浄した後、基質であるＴＭＢを加えて１時間置き、停止緩衝液にて反応を止めた。マイクロプレート読み取り機（ＢｉｏＲａｄ）を用いて各ウェルの４０５ｎｍ波形の吸光度をすぐに読み取った。

【0143】

ＢＩＮ１標準物質は外来性ＢＩＮ１を過剰に発現する２９３ＦＴ細胞の可溶化液から生成した。標準物質中のＢＩＮ１濃度は可溶化液中の総タンパク質濃度を示した。標準曲線（Ｒ^２＞０．９８）は０．０４ｎｇ／μｌから２０ｎｇ／μｌの標準範囲から生成した。血清試料の場合、全量１００μｌの血清試料を各ウェルに添加した。ＢＩＮ１の量は標準曲線から生成し、ｎｇ／μｌで表した。

【0144】

心拍出量は、心臓カテーテル検査室で行う侵襲性右心カテーテル処置中に測定した。バルーンが先端に付いた肺動脈カテーテルを静脈系内に挿入し、右心房、次いで右心室、次いで肺動脈へと進ませた。次いで、心拍出量は、温度希釈技術（近位ポートを介して冷生理食塩水を注入することと、拍出量を推定するために遠位ポートでの温度変化を記録することから構成される）またはフィック技術（推定された酸素消費量をヘマトクリットおよび動脈および混合静脈血酸素飽和度から得られた動脈−静脈の酸素勾配によって割ることから構成される）によって得られる。

【0145】

実施例１ 健康な被検体および心不全被検体における血清ＢＩＮ１タンパク質レベル
５６人の心不全と診断された患者と２８人の年齢が一致する健康個体（コントロール）において血清ＢＩＮ１タンパク質レベルを測定した。ＵＣＳＦの高度心不全および移植クリニックの心不全患者から血清試料を入手した。ＥＬＩＳＡアッセイによってＢＩＮ１タンパク質レベルを測定し、図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａは、ＢＩＮ１タンパク質レベルとして測定したＢＩＮ１度数分布と特定のＢＩＮ１タンパク質レベルを示す心不全患者およびコントロールの割合を示す。図１Ａを見ると、およそ９μｇ／ｍｌ付近に集中した血清ＢＩＮ１タンパク質レベルを持つコントロール個体と比較して、より低いレベルの血清ＢＩＮ１を持つ心不全患者の割合が多かった。図１Ｂは、コントロール個体と心不全患者の平均血清ＢＩＮ１レベルを示す。

【0146】

図１Ａおよび１Ｂ。心不全クリニックの血清ＢＩＮ１はコントロールとは異なる。図１Ａ。ＵＣＳＦの高度心不全および移植クリニックの心不全患者（黒色バー）と年齢が一致するコントロール（灰色バー）の血清ＢＩＮ１タンパク質レベルのヒストグラム。心不全患者の度数分布は正常血清ＢＩＮ１の左に推移しているのがわかる。図１Ｂ。およそ３分の１の心不全患者であるコントロール患者（灰色）の平均血清ＢＩＮ１タンパク質レベル（^＊＊＊ｐ＜０．００５）。

【0147】

データは、欠陥心臓のＢＩＮ１は心不全でない患者（コントロール群）のＢＩＮ１の半分未満であることを示す。

【0148】

実施例２ ＢＩＮ１タンパク質レベルは性別、年齢、体重または肥満度指数（ＢＭＩ）と相関しない
心不全患者において測定された血清ＢＩＮ１タンパク質を、患者の年齢、性別、体重およびＢＭＩに対してプロットした。年齢、性別、体重またはＢＭＩと血清ＢＩＮ１タンパク質レベルとの相関は明らかでなかった。

【0149】

図２Ａおよび図２Ｂ。血清ＢＩＮ１は性別および年齢と相関しない。試験中の患者では、男性対女性患者（図２Ａ）および年齢（図２Ｂ）でのＢＩＮ１タンパク質レベルの有意差はない。

【0150】

図３Ａおよび３Ｂ。血清ＢＩＮ１は体重およびＢＭＩとは相関しない。試験した患者では、体重（ポンド）または肥満度指数（体重（キログラム）を身長（メートル）の二乗で除したもの）に対して評価した場合、ＢＩＮ１タンパク質レベルの有意差はない。

【0151】

実施例３ ＢＩＮ１タンパク質レベルは肺動脈楔入圧と相関しない
試験した心不全患者では、左心室駆出分画率（ＬＶＥＦ）は心エコーによって得、侵襲性心カテーテル法の血行動態を行って肺動脈楔入圧（ＰＣＷＰ）を測定した。ＢＩＮ１タンパク質レベルとこれら２つのパラメータには有意差はない（図４Ａおよび４Ｂ）。ＰＣＷＰは、血清マーカーＢＮＰに反映される心臓内充填圧力の測定値であることを注記する。

【0152】

実施例４ ＢＩＮ１タンパク質レベルは心拍出量および心臓指数と相関する
図５Ａおよび５Ｂは、血清ＢＩＮ１が侵襲的に測定した心拍出量および心臓指数と直接相関することを示す。血清ＢＩＮ１が低ければ低いほど、心拍出量が小さくなる。血清ＢＩＮ１は心拍出量を測定する肺動脈カテーテルよりも侵襲性がはるかに低いので、有用なマーカーである。

【0153】

図５Ａおよび５Ｂ。血清ＢＩＮ１は心拍出量と相関する。ＢＩＮ１と（フィック方程式によって）侵襲的に測定された心拍出量（リットル／分）および心臓指数（推定体表面積ｍ２により除した心拍出量）との間におよその直線関係がある。

【0154】

実施例５ ＢＩＮ１タンパク質レベルはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能的分類と相関する
ＵＣＳＦの高度心不全および移植クリニックの心不全専門心臓専門医によってＮＹＨＡ機能分類を決定した。ＮＹＨＡスケールのクラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶによって定義されるように患者機能状態によって割り振った後にＢＩＮ１をプロットした。ＮＹＨＡスケールは、ＢＩＮ１タンパク質レベルを測定するために血液試料を採取した時点の患者の臨床兆候から得た。クラスの増加は症状の悪化を示す。クラス４（またはＩＶ）は安静時に症状を示す患者を包含する。これら患者での予後は極めて不良である。

【0155】

図６に示すように、血清ＢＩＮ１タンパク質レベルとＮＹＨＡ機能分類との間には強い相関がある。低いＢＩＮ１レベルはＮＹＨＡクラス４と相関するのに対して、相対的に高いＢＩＮレベルはＮＹＨＡクラス１または２と相関する。最初の列（最も左の列）はＮＹＨＡクラスＩＶであり、次の列はクラスＩＩＩ、その次の列はクラスＩＩ、最後の列（最も右の列）はクラスＩである。

【0156】

血清ＢＩＮ１タンパク質レベルとの強い相関は、今では主観的な身体検査とは関係なく、血液試験により機能的分類が試験され、定量化されうることを示す。

【0157】

実施例６ ＢＩＮ１タンパク質レベルは死亡率と相関している
ＢＩＮ１タンパク質レベルを評価した心不全患者は５年間にわたって遡及研究にて追跡調査した。図７Ａおよび７Ｂは、ＢＩＮ１タンパク質レベルが低い患者において死亡率が高いことを示す。逆に、ＢＩＮ１が高い患者はその同じ期間生存する可能性があったことを示す。これらデータは、心不全患者の血清に基づく予測にＢＩＮ１タンパク質レベルを有益であることを示す。５以上のＢＩＮ１を有する患者は、その後５年のうちに移植または左室補助機器などの他の先進治療の必要がないであろう。ＢＩＮ１が低い患者はこれら治療を必要とするであろう。５のＢＩＮ１は正常の５０％であることを注記する（図１Ａおよび１Ｂ）。ゆえに、ＢＩＮ１は全心不全集団を階層化しえる。

【0158】

図７Ａ。血清ＢＩＮ１は死亡率と相関する。血清採取後５年間追跡調査を行った患者では、平均ＢＩＮ１タンパク質レベルは死亡者（左バー）と生存者（右バー）との間である。低いＢＩＮ１からその後５年間の死亡率の有意な増加が予測される。

【0159】

図７Ｂ。血清ＢＩＮ１から死亡率が予測される。２．５以上の血清ＢＩＮ１タンパク質レベルに対して２．５未満の血清ＢＩＮ１タンパク質レベルを有する心不全患者のカプラン・マイヤー生存曲線。５年間にわたり、２．５未満のＢＩＮ１を有する患者は生存確率が有意に低い。

【0160】

実施例７ ＢＩＮ１タンパク質レベルは疾患重症度と相関し、ＡＲＶＣ患者における将来の不整脈事象を予測する
ＡＲＶＣは、心室筋の局所性またはびまん性の線維脂肪性置換に特徴がある疾患であり、結果として再発性心室性不整脈および右および/または左心室機能障害が生じうる(Basso C. et al., Lancet 2009; 373: 1289-300)。この疾患は家族性であり、デスモソーム機能には様々な原因遺伝子が関与することが示されている(Sen-Chowdhry S., et al., J Cardiovasc Electrophysiol 2005; 16: 927-35)。疾患重症度および進行は、無症候性疾患から重度の心不全および難治性心室性不整脈への範囲となりうる(Hulot JS, et al., Circulation 2004; 1 10: 1879-84)。現在、ＡＲＶＣ患者での将来の不整脈負荷を予測すること、またはどの患者が進行性不整脈を発症するかを予測することは難しい。臨床進行リスクが高い個体を同定するための試験は非常に臨床上の利便性があるであろう。

【0161】

方法
患者。 試験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の病院およびジョンズホプキンス大学によって承認された（Western IRB、臨床データはジョンズホプキンスプロトコールにより集めた）。すべての登録患者にはインフォームドコンセントを行った。ＡＲＶＣと診断された３１人の患者からおよそ７年間にわたって静脈血試料を採取した。７人の患者は異なる時点で２回採血した。血液試料を得、４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心し、後のＥＬＩＳＡ分析のために血清を−８０℃の冷凍庫に保存した。MRI、ＲＶ血管造影、右心カテーテル検査、心エコー、病理、ＥＣＧ、平均加算ＥＣＧ、ホルターモニター結果、家族歴や遺伝子型を含む各患者の対応する臨床データを、ＡＲＶＣ診断の確認のために記録した。

【0162】

アッセイ結果を非公開にした２つの異なる心臓病専門医によって、改訂版国際専門調査団基準(Marcus F.I., et al. Circulation 2010; 121 : 1533-41)に従って有用なデータによりＡＲＶＣの診断が確認される場合に、患者を試験に含めた。除外基準には、偽ＢＩＮ１測定が予測される、不十分なデータを含め、採血時の心室頻拍（VT）急性発作または複数の除細動事象の診断または存在を確認した。

【0163】

ＡＲＶＣの可能性がある最初の３１人の患者のうち、２４人を最終分析に含めた。３人の患者はデータが不完全なために除外し、２人は診断基準に満たないために除外した。試験採血時に活動期ＶＴ発作および複数の除細動事象を有していた２人の患者も除外した。患者の特徴を表１に示す。

【0164】

コントロール群は、肥満、高血圧または心臓病の既往のない、４８人の年齢、性別およびＢＭＩが一致する健康コントロールからなる。これらコントロールは、健康体ボランティアの血漿試料および臨床データを含む大きなＵＣＳＦのデータベースから識別した。すべての登録者からこれら標本の将来の使用についての同意を得た。

【0165】

血漿ＢＩＮ１の測定。 市販のＥＬＩＳＡ試薬セット（BD Bioscience, San Diego, CA）を用いて、高感度のＥＬＩＳＡを設定し、ヒト血漿中のＢＩＮ１を定量化した。このアッセイ系はヒトＢＩＮ１に対して２つの抗体を使用する。マウスモノクローナル抗ＢＩＮ１(コーティング緩衝液中１：５００、Sigma, St. Louis, MO）を捕捉抗体に用い、一次ヤギ抗ＢＩＮ１抗体（１％ＢＳＡ中１ ：５００、Everest, Clifton, NJ）を検出抗体に用いた。ＢＩＮ１標準物質は、外来性ヒトＢＩＮ１を過剰発現する２９３ＦＴ細胞の可溶化液から生成した。標準曲線（Ｒ^２＞０．９８）を作成し、各試料中のＢＩＮ１の相対量を決定した。各個体の決定されたＢＩＮ１の血漿濃度を正規化し、３人の２５歳健康体成人男性からプールした血漿中のＢＩＮ１値の割合として表した。このアッセイは、アッセイ間での可変性が５％未満であり、高い再現性がある。次いで、血漿ＢＩＮ１レベルをすべてのＡＲＶＣおよびコントロールの試料から二通り測定した。連続して採血した患者では、はじめに採取した試料を横断的分析に用いた。

【0166】

ＡＲＶＣ患者における基礎特徴と将来の不整脈事象の測定。 すべての臨床データはＢＩＮ１アッセイ結果を知らせていない人によって入手された。基礎ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラス、ＲＶおよびＬＶ機能、心室性不整脈歴を各患者について記録した。ＮＹＨＡクラスはカルテ審査から得、ＲＶおよびＬＶ機能は心エコー検査により決定し、心室性不整脈歴はカルテ審査とＩＣＤ（植え込み型除細動器）照合データから得た。定量的不整脈分析のために、心室性不整脈事象を以下のように分類した：心臓突然死または持続性心室頻拍（ＶＴ）の既往を一事象とし、持続性ＶＴまたは心室細動（ＶＦ）のための適切なＩＣＤ治療を（終了までに複数回の治療が必要であったとしても）一事象とし、持続性ＶＴまたはＶＴ発作のための入院を１．５事象と分類した。前向き分析では、基礎血漿採取から最終追跡調査日までのすべての不整脈事象を記録した。連続採血を行った患者についも、第二血液検査時のＮＹＨＡクラス、間欠性不整脈歴、ＬＶおよびＲＶ機能を記録した。

【0167】

統計。 すべての統計学的分析にプリズム５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた。データは平均±ＳＥで表す。コントロール群とＡＲＶＣ群との間のＢＩＮ１を比較するために両側性非パラメトリックマンホイットニー検定を用いた。心不全患者と健康コントロールとのＢＩＮ１比較のために、両側性スチューデントｔ検定を、２群の有意差分散のためにウエルチ補正とともに用いた。ＢＩＮ１と基礎連続変数との相関関係を試験するために、スピアマン分析を行った。重度の基礎疾患を有する患者を診断して将来の不整脈事象の予測のための試験をするために、非パラメトリック受診者動作曲線（ＲＯＣ）分析を用い、ＢＩＮ１値の感度と特異度を決定した。同一患者内の連続的ＢＩＮ１レベルを比較するために、一対両側スチューデントｔ検定を行った。

【0168】

結果
患者の特徴および基礎ＢＩＮ１レベル。 年齢、性別またはＢＭＩに関して２４人のＡＲＶＣ患者と４８人のコントロールとの間に統計学的な有意差はなかった（表１）。
（表１）ＡＲＶＣ患者とコントロールの基礎特徴

【0169】

２４人のＡＲＶＣ患者のうち、２１人は診断のための少なくとも２つの主要基準を満たし、３人は１つの主要基準と２つの副基準を満たした。８人（３３％）はＡＲＶＣの家族歴が確認された。基礎採血時には、１６人（７０％）は少なくとも１回の心室性不整脈事象を持ち、７人（３０％）はＮＹＨＡクラスＩＩ以上であり、４人（１８％）はＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶであった。４人の患者（１８％）は中程度〜重度のＲＶ機能障害を持っていた。２４人のうち２３人の患者はＩＣＤを持っており、ＩＣＤ装着後の平均追跡調査期間は最初の採血時まで４．４±４．３年であった。ＩＣＤを持つ患者のうち、１３人（５７％）は一次予防のために装着され、１０人（４３％）は二次予防のために装着されていた。

【0170】

ＡＲＶＣ集団またはコントロール集団において血漿ＢＩＮ１は年齢、性別またはＢＭＩと有意な相関はなかった。ＡＲＶＣ患者において、ＢＩＮ１は腎機能と関連がなかった（表２）。平均値６０±１０、中央値２７のコントロールに比べて、ＡＲＶＣ集団での平均血漿ＢＩＮ１レベルは３７±１、中央値１７であった（ｐ＜０．０５）（表１）。

【0171】

ＢＩＮ１の横断分析。 ＡＲＶＣ集団内で、症候性心不全の有（ＮＹＨＡクラスＩＩ−ＩＶ）または無（ＮＹＨＡクラスＩ）に対して測定したＢＩＮ１を調査した。症候性心不全を有するＡＲＶＣ患者では、平均ＢＩＮ１レベルが１５＋７（ｎ＝７）であったのに対して、臨床上心不全がないＡＲＶＣ患者では平均ＢＩＮ１レベルが６０±１７（ｎ＝１５）であった（ｐ＜０．０５）。結果を図８に示す。

【0172】

図８。血漿ＢＩＮ１はＨＦを有するＡＲＶＣでは低い。心不全を持たないＡＲＶＣ患者（６０＋１７、ＮＹＨＡ Ｉ、ｎ＝１５、左側のプロット）と比較して、症候性心不全を有するＡＲＶＣ患者では、血漿ＢＩＮ１（平均±ＳＥ）が有意に低い（１５＋７、ＮＹＨＡ ＩＩ−ＩＶ、Ｎ＝７、右側のプロット)。Ｐ＜０．０５。（血漿ＢＩＮ１は３人の２５歳健康体男性からプールした血漿中のＢＩＮ１の割合として表す）。

【0173】

次いで、スピアマン分析を行い、基礎的臨床連続変数と血漿ＢＩＮ１との相関を判定した（表２）。
（表２）ＡＲＶＣ患者およびコントロールにおける基礎特徴とのＢＩＮ１相関

【0174】

はじめの血漿測定の時点までは、血漿ＢＩＮ１レベルは、心室性不整脈事象の累積回数（Ｒｈｏ −０．６０、ｐ＜０．０１）並びに心室性不整脈事象の割合（Ｒｈｏ −０．４６、ｐ＜０．０５）と逆の相関があった（表２）。複数の試料がある患者では、第一試料をこの分析に用いた。血漿ＢＩＮ１はＩＣＤ追跡調査の長さとは有意な相関がなかった。

【0175】

重度および軽度のＡＲＶＣを有する患者を区別するための血漿ＢＩＮ１の能力を評価するために、受診者動作曲線分析を行った（図９）。重度のＡＲＶＣはＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶ心不全または１より大きな心室性不整脈事象と定義した。３３未満のカットオフ値では、血漿ＢＩＮ１は、ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶ心不全状態または１より大きな心室性不整脈事象の予測に関して８２％の感度と８２％の特異度であった（ＲＯＣ ＡＵＣ ０．８８±０．０７）。ゆえに、低い血漿ＢＩＮ１は重度ＡＲＶＣの発症と相関している。

【0176】

図９。血漿ＢＩＮ１は疾患重症度を予測する。受診者動作曲線分析は、低い血漿ＢＩＮ１は、ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶまたは１より大きな心室性不整脈と定義される重度ＡＲＶＣを予測することを示す。３３より小さい血漿ＢＩＮ１（矢印で示す）は、ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶ心不全または１より大きな心室性不整脈事象を有する患者の予測に関して８２％の感度と８２％の特異度であった（ＲＯＣ ＡＵＣ ０．８８、ＳＥ±０．０７、Ｐ＜０．０１）。

【0177】

将来の不整脈事象の予測因子としての血漿ＢＩＮ１の分析。 ＡＲＶＣコホートでの初回採血後の平均追跡調査は３．３±１．７年であった。３０未満のＢＩＮ１から将来の不整脈の確率が高いことが予測され（０．５／年より多い、図１０）、感度８３％、特異度８８％および確度８５％（ＲＯＣ ＡＵＣ ０．８９±０．０９）であった。ＢＩＮ１と基礎心不全との相関が観察され、心不全患者での不整脈のリスクがあがることが知られているので、基礎の心不全状態に照らして層別分析を行った。基礎時に軽度の心不全症状を有する患者（ＮＹＨＡクラスＩまたはＩＩ、ｎ＝２０）では、３０未満のＢＩＮ１は将来の不整脈事象の確率が予測され、感度８３％、特異度８０％および確度８２％であった（ＲＯＣ ＡＵＣ ０．８２±０．１４）。基礎時に無症候性の患者（ＮＹＨＡクラスＩ、ｎ＝１７）では、３０未満のＢＩＮ１は将来の不整脈事象の確率が高いことが予測され、感度８２％、特異度６７％および確度７９％（ＲＯＣ ＡＵＣ ０．７６±０．２１）であった。基礎時にＮＹＨＡクラスＩＩ以上の心不全のみは高い将来の不整脈事象に関して３．６１の未補正相対リスク（９５％ＣＩ １．２５−１０．３７、ｐ＜０．０５）であった。

【0178】

図１０。血漿ＢＩＮ１から将来の心不全不整脈が予測される。受診者動作曲線分析は、低い血漿ＢＩＮ１から高い将来の心室性不整脈が予測されることを示す。３０未満の血漿ＢＩＮ１（矢印で示す）から将来の不整脈の確率が高いことが予測され（０．５／年より多い）、感度８３％、特異度８８％および確度８５％であった（ＲＯＣ ＡＵＣ ０．８９、ＳＥ±０．０９、Ｐ＜０．０１）。

【0179】

連続採血を行ったＡＲＶＣ患者のＢＩＮ１。 連続採血試料は７人のＡＲＶＣ患者と３人のコントロールから得た（図１１）。概して、ＢＩＮ１値は進行性ＡＲＶＣ患者において低減していた。患者１は新たなＲＶ機能不全を発症し、ＶＦの第一エピソードを有していた。患者２は増悪中のＲＶ機能不全を発症し、複数のＶＦ事象を有していた。患者３は高い持続性不整脈負荷（３．８事象／年）を有し、新たなＲＶ機能不全を発症した。初回採血の時点で、患者４はＡＲＶＣの基準を満たさなかったが、追跡調査の間、患者は、ホルターモニター上の、ＥＣＧリードＶ１−Ｖ３では新たなＴ波逆転を、Ｖ１ではイプシロン波を、高い非持続性のＶＴ負荷による動悸を発症した。患者４は慢性のＡＲＶＣのためにＩＣＤを装着していたが、持続性ＶＴまたはＶＦ、心不全、または心室機能不全は持っていなかった。患者５は、ＬＶの機能が７０％から４９％へ低下しており、軽度から中程度のＲＶ機能不全を進行していた。患者６は、基礎時に軽度のＲＶ機能不全を有していたが、中程度のＲＶ機能不全と５回の異なる心室性不整脈事象を発症した。患者７は、追跡期間中に軽度のＲＶ機能不全を発症し、高い心室性不整脈確率を有していた（２．１事象／年）。まとめると、臨床的に進行していた患者はその血漿ＢＩＮ１レベルの低減を示した（６３％の低減、ｐ＜０．０５）。それに対して、３人の健康体コントロールでは（図１１）、２年間にわたってＢＩＮ１レベルの有意な変化はなかった。

【0180】

図１１。血漿ＢＩＮ１はＡＲＶＣ進行により低減する。コントロール（○、ｎ＝３）およびＡＲＶＣ患者（□、ｎ＝７）における連続血漿ＢＩＮ１値を示す。血漿ＢＩＮ１は健康体コントロールでは同程度であったのに対して（６５±２０から７２±２８の平均＋ＳＥ、ＮＳ）、疾患進行中のＡＲＶＣ患者では有意な低減（６３％の低減）が見られた（８０±３２から３０±１７、ｐ＜０．０５）。ＡＲＶＣ患者のＢＩＮ１値は以下の通りである（第一矢印、第二矢印）：患者１（２３７、１３０）、患者２（１４５、１３０）、患者３（７４、３５）、患者４（５２、＜５）、患者５（３３、１６）、患者６（１０、８）、患者７（８、９）。（血漿ＢＩＮ１は、３人の２５歳健康男性からプールされた血漿におけるＢＩＮ１の割合として表す）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】