特許 5891247 イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン化合物およびＰＩ３キナーゼ／ｍＴＯＲ二重阻害剤としてのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5891247

(24)【登録日】2016年2月26日

(45)【発行日】2016年3月22日

(54)【発明の名称】イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン化合物およびＰＩ３キナーゼ／ｍＴＯＲ二重阻害剤としてのその使用

(51)【国際特許分類】

   C07D 471/04 20060101AFI20160308BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20160308BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160308BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20160308BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160308BHJP

【ＦＩ】

   C07D471/04 105C

   C07D471/04CSP

   A61K31/4745

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P43/00 121

【請求項の数】7

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2013-549509(P2013-549509)

(86)(22)【出願日】2012年1月11日

(65)【公表番号】特表2014-502638(P2014-502638A)

(43)【公表日】2014年2月3日

(86)【国際出願番号】US2012020897

(87)【国際公開番号】WO2012097039

(87)【国際公開日】20120719

【審査請求日】2015年1月8日

(31)【優先権主張番号】61/432,958

(32)【優先日】2011年1月14日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100068526

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 恭生

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100138900

【弁理士】

【氏名又は名称】新田 昌宏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド・アンソニー・バーダ

(72)【発明者】

【氏名】メアリー・マーガレット・メイダー

【審査官】 早川 裕之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５１１５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５３１５６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１３９７４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０３８１６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１２２８０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／００１２１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０７７０３１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ４７１／０４

Ａ６１Ｋ ３１／４７４５

Ａ６１Ｐ ３５／００〜０２

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンである化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。

【請求項2】

８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンである、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

２θ±０．２において、８．５７ならびに９．０６、１５．９３、１８．２９および１８．８７の１つ以上で生じる特性ピークを有するＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる結晶形態の８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンである、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項5】

治療に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。

【請求項6】

癌の治療に使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。

【請求項7】

前記癌が、膀胱癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、非小細胞肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、膠芽細胞腫、肺癌、腎癌、肉腫、造血およびリンパ系組織癌、ＣＮＳ癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、肝癌、皮膚癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌、上気道消化管癌、および泌尿器癌からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のための化合物または塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＰＩ３キナーゼ／ｍＴＯＲ二重阻害剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、広範囲の細胞プロセスを調節する細胞内シグナル伝達カスケードを伝搬する脂質キナーゼのファミリーである。例えば、ＰＩ３Ｋ活性化は、癌細胞増殖、生存および代謝を促進するシグナル変換カスケードを開始する。ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）は、遺伝子、エピジェネティック、および環境状態に反応して細胞周期の進行および細胞増殖を調整する重要なシグナル伝達ノードである。ｍＴＯＲシグナル伝達に関与する経路は前癌状態のヒト組織において異常調節される。ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲが細胞周期経路において持続する役割を考慮して、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害は、癌などの特定のヒトの疾患の治療に有用であり得る。

【0003】

ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤は当該分野において公知である。特許文献１は、ＰＩ３−Ｋα酵素および／またはＰＩ３−Ｋα／ｍＴＯＲ二重阻害剤の調節因子または阻害剤であると主張されている特定のイミダゾ［１，５］ナフチリジン化合物を開示している。特許文献２および特許文献３は、タンパク質または脂質キナーゼ依存性疾患、特にＰＩ３Ｋ依存性疾患の治療に使用するために主張されている特定のイミダゾキノリノン化合物を開示している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２０１０／０３８１６５号

【特許文献2】国際公開第２０１０／１３９７３１号

【特許文献3】国際公開第２０１０／１３９７４７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

癌などの細胞増殖障害の治療に使用され得る、代替のＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、特に改良された溶解度などの有益な物理特性、および／または改良されたインビボ有効性などの望ましい臨床特性および／または薬物動態性能を有する有効なＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を提供する必要性が存在する。本発明は有効なＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を提供する。より具体的には、本発明は、抗癌剤として有用である、有益な物理特性および／または望ましい臨床特性を有する有効なＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンである化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。

【0007】

特定の実施形態として、本発明は、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンである化合物を提供する。

【0008】

別の実施形態は、結晶形態の８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンである。

【0009】

本発明はまた、２θ±０．２において、８．５７ならびに９．０６、１５．９３、１８．２９、および１８．８７の１つ以上で発生する特性ピークを有するＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる結晶形態における８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンを提供する。

【0010】

本発明は、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0011】

本発明は、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を含み、さらに１種以上の治療成分を含む医薬組成物を提供する。

【0012】

本発明は、有効量の８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、癌を治療する方法を提供する。

【0013】

本発明は、癌の治療のための医薬を製造するための、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。

【0014】

本発明は、治療に使用するための、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。

【0015】

本発明は、癌の治療に使用するための、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。

【0016】

さらに、本発明は、癌が、膀胱癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、ＮＳＣＬＣ、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、膠芽細胞腫、肺癌、腎癌、肉腫、造血およびリンパ系組織癌、ＣＮＳ癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、肝癌、皮膚癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌、上気道消化管癌および泌尿器癌からなる群から選択される、本明細書に記載される方法および使用の好ましい実施形態を提供する。

【0017】

上記および本発明の説明全体にわたって使用する場合、以下の用語は他に示さない限り、以下の意味を有することが理解される。

【0018】

「薬学的に許容可能な塩」または「薬学的に許容可能な塩（複数も含む）」とは、本発明の化合物の比較的非毒性の無機および有機塩を指す。

【0019】

「治療」、「治療する」、「治療している」などの用語は、障害の進行の遅延または反転を含むことを意味する。これらの用語はまた、障害または病態が実際に排除されない場合でさえも、および障害または病態の進行自体が遅延または反転されない場合でさえも、障害または病態の１つ以上の症状の軽減、改善、減衰、排除、または減少を含む。

【0020】

「治療有効量」または「有効量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床医により求められる組織、系、動物、哺乳動物、またはヒトに対して生物学的または医学的反応あるいは所望の治療効果を導く本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物の量を意味する。

【0021】

本発明の化合物は、例えば、複数の無機酸および有機酸と反応して薬学的に許容可能な塩を生成できる。そのような薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法は当該分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，１９７７年１月を参照のこと。

【0022】

本発明の化合物は好ましくは、１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈物、または賦形剤を使用して医薬組成物として製剤化され、種々の経路により投与される。好ましくは、そのような組成物は経口、皮下、または静脈内投与用である。そのような医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは当該分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ｅｄｓ．，２１ｓｔ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２００５）を参照のこと。

【0023】

実際に投与される本発明の化合物の量は、治療される病態、選択される投与経路、投与される本発明の実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、および反応、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連状態下で医師により決定される。通常、１日当たりの投与量は約１ｍｇ〜約２０００ｍｇの範囲内である。一部の例において、上記の範囲の下限以下の投与量レベルが十分以上であってもよく、一方、他の場合において、さらに多くの用量が利用されてもよい。

【0024】

本発明の化合物は、当該分野において公知の種々の手順、ならびに以下の調製例および実施例に記載されている手順により調製されてもよい。記載されている経路の各々についての特定の合成工程は、本発明の化合物を調製するために異なる方法で組み合わされてもよい。

【0025】

試薬および開始物質は一般に当業者に容易に入手可能である。他のものは、公知の構造的に類似した化合物の合成と類似した技術である、有機および複素環化学の標準的な技術ならびにいずれかの新規手順を含む、以下の調製例および実施例に記載されている手順により作製され得る。以下の調製例および実施例は、さらに詳細に本発明を例示し、化合物の典型的な合成を表すために提供される。本発明の化合物の命名は概して、ＳｙｍｙｘＤｒａｗ３．２により提供される。

【0026】

本明細書で使用する場合、以下の用語は示した意味を有する：本明細書で使用する場合、以下の用語は示した意味を有する：「ＡＴＰ」はアデノシン三リン酸を指し、「ＡＵＣ」は曲線下の面積を指し、「ＣＮＳ」は中枢神経系を指し、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指し、「４Ｅ−ＢＰ１」は４Ｅ結合タンパク質１を指し、「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール−ビス（ａ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸を指し、「ＧＦＰ」は緑色蛍光タンパク質を指し、「ＧＳＴ」はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを指し、「ＨＥＣ」はヒドロキシエチルセルロースを指し、「ＨＥＰＥＳ」はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸を指し、「ＨＰＬＣ」は高圧液体クロマトグラフィーを指し、「ＩＣ５０」は半分の最大阻害濃度を指し、「ＩＭＤＭ」はイスコフ改変ダルベッコ培地を指し、「ＭＥＭ」は最小必須培地を指し、「ＭＳ」は質量分析を指し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し、「ＮＳＣＬＣ」は非小細胞肺癌を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＰＧＫ」はホスホグリセリン酸キナーゼを指し、「ＰＩＰ２」はホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェートを指し、「ＰＯ」は経口を指し、「ＰＯＰＳ」はパルミトイル−オレオイルホスファチジルセリンを指し、「ＰＰＩ」はプロトンポンプ阻害剤を指し、「ＲＰＭＩ」はロズウェルパーク記念研究所を指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し、「ＴＭＥＤ５０」は閾値最小有効用量を指し、「ＴＲ−ＦＲＥＴ」は時間分解蛍光エネルギー移動を指し、「Ｔｒｉｓ」はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指し、「Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ」は４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテルを指し、「Ｔｗｅｅｎ−２０」はポリソルベート２０を指し、「ＸＲＤ」はＸ線粉末回折を指す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

調製例１
（２Ｓ）−２−メトキシプロパン−１−アミン塩酸塩

【化1】

テトラヒドロフラン（１０Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル［（２Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル］カルバメート（８７０ｇ、４．９６ｍｏｌ）の溶液を５℃に冷却する。水素化ナトリウム（６０％分散、２４８ｇ、６．２１ｍｏｌ、１．２５当量）を８分にわたって少しずつ加える。反応物を５℃で３０分間攪拌する。ヨウ化メチル（３８７ｍＬ、６．２１ｍｏｌ、１．２５当量）を５分にわたって滴下して加え、反応を５〜１０℃にて４５分間進行させる。反応を水（１Ｌ）でクエンチし、酢酸エチル（４Ｌ）で抽出する。有機層を得、それを真空中で濃縮して、残渣を得る。残渣をトルエン（２×１Ｌ）と共に共蒸発させ、ジクロロメタン（２Ｌ）で希釈し、濾過する。残留固体をさらなるジクロロメタン（５００ｍＬ）でリンスする。真空中で合わせたジクロロメタン液体濾過物を濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］カルバメート（８８０ｇ、９４％）の粗中間体を得る。

【0028】

ジクロロメタン（３．２２Ｌ）中で粗中間体ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］カルバメート（８０６ｇ、４．２６ｍｍｏｌ）を懸濁し、１５℃にて３０分にわたってジオキサン（２．６６Ｌ）中の４ＭのＨＣｌを滴下して加える。混合物を室温にて２時間攪拌する。濾過し、さらなるジクロロメタン（２×２５０ｍＬ）で固体残渣を洗浄し、真空中で揮発性物質を除去して、固体沈殿物を得る。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）を固体に加え、濾過し、固体をさらなるメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、さらに固体をアセトン（４×５００ｍＬ）で洗浄して、白色固体を標題化合物（１７１ｇ、３２％）として得る。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：８．１１（ｓ，３Ｈ），３．６２−３．５５（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．６８（ｄｄ，Ｊ＝８．５，１３．２Ｈｚ，１Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）。

【0029】

調製例２
エチル６−ブロモ−４−クロロ−キノリン−３−カルボキシレート

【化2】

窒素雰囲気下で無水ジメチルホルムアミド（１４８．６ｍＬ）中に６−ブロモ−４−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸エチルエステル（１１ｇ、３７ｍｍｏｌ）を懸濁する。５分にわたってシリンジにより塩化ホスホリル（２０．７ｍＬ、２２２ｍｍｏｌ、６当量）を加え、室温にて３時間激しく攪拌する。混合物を氷水（１．５Ｌ）中に注ぐことによって反応をクエンチし、全ての氷が溶解するまで攪拌を継続する。濾過により形成した固体を得、水で洗浄し、乾燥を完了させて、標題化合物（１１．４ｇ、９４％）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋３１４．０、３１６．０。

【0030】

あるいは、６−ブロモ−４−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸エチルエステルを以下のように調製し、標題化合物の調製に使用する。ジエチル２−（（（４−ブロモフェニル）アミノ）メチレン）マロネート（２５．６ｇ、７４．８ｍｍｏｌ）を２−メチルテトラヒドロフラン（１０７ｍＬ）に溶解し、ポンプに移す。次いでポンプにより、５７５から７００ｐｓｉの窒素下で２４０℃から２６０℃で１９から２１ｍＬのこの溶液を２５ｍＬ反応器に供給し、試薬溶液の蒸気圧以上に維持する。この温度で６０から１８０分後、得られたスラリーを、１０ｍＬの減圧および冷却領域まで反応器の底付近でディップチューブによりバルブを介して反応器から排出する。最後に、直列した第２のバルブにより、スラリーをインライン圧力フィルタに送る。反応器を空にするためのこの順序はさらに２回繰り返され、その後、残留スラリーを最小体積まで除去することを確実にし、単一プレートフィルタに窒素圧を提供するために上記のように反応器を再充填する。自動化サイクルを繰り返し継続すると、固体が時間と共に同じ単一のプレートフィルタ上で増加する。生産工程が数日間行われる場合、オフラインフィルタが洗浄され、断続的なフロー反応器を停止させずに固体が除去され得るように、少なくとも２つのフィルタが並行して使用される。さらにこの形式で５回のサイクルが実施された後、２−メチルテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）が反応器に送られ、フィルタに移される。この作動様式は断続的な半連続フローまたは連続自動化バッチと呼ばれる場合もある。どちらにしても、連続反応と類似したこの作動様式の態様は、反応温度および圧力が時間と共に変化せず、常に反応条件のままであり、反応器内に流れる試薬および反応器から流れ出る生産物についての加熱および冷却時間が非常に速く、加熱プラス冷却時間を調整可能であり、流入および流出ならびに反応器の外部を加熱／冷却する能力を制御することにより反応容器内の試薬および生産物の残留時間が全てのスケールで同じである。乾燥後、６−ブロモ−４−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸エチルエステルを回収する（４．６６ｇ、２１％）。得られたジエチル２−（（（４−ブロモフェニル）アミノ）メチレン）マロネートが豊富な濾過物を濃縮して、エタノールを除去し、７．８ｇを得、２−メチルテトラヒドロフラン中で再構成する。この物質（４．８ｇ）の一部を反応条件に再び供し、さらなる６−ブロモ−４−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸エチルエステル（０．５６ｇ）を２５％の全収率について回収する。１Ｈ−ＮＭＲ：（３９９．８４ＭＨｚ，ＴＦＡ−ｄ），δ（ｐｐｍ）：１．５２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０４Ｈｚ），４．６７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ），８．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ），８．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ），８．８０（１Ｈ，ｓ），９．３２（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（１００．５４ＭＨｚ，ＴＦＡ−ｄ），δ（ｐｐｍ）：１１．９，６４．７，１０５．３，１２１．０，１２１．２，１２４．９，１２６．９，１３７．９，１４１．１，１４５．０，１６７．２，１７２．４。

【0031】

調製例３
２−（５−ブロモ−３−ピリジル）プロパン−２−オール

【化3】

方法１
３０℃以下の内部温度で、テトラフドロフラン（３５０ｍＬ）中のエチル５−ブロモピリジン−３−カルボキシレート（２２．５ｇ、９８ｍｍｏｌ）の溶液をジエチルエーテル（９８ｍＬ、２９３ｍｍｏｌ、３当量）中の３Ｍ臭化メチルマグネシウムの溶液に加える。反応の完了時に、氷浴中で混合物を冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、ほとんどの固体が溶解するまで攪拌を維持する。水（５００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、有機層を残渣に濃縮する。酢酸エチル：ヘキサン（１：１）の溶媒で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製して、油状物として標題生成物（１９．４ｇ、９２％）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋２１４．９，２１６．９。

【0032】

方法２
１８℃以下の内部温度で、冷却浴中で３０分にわたって、テトラフドロフラン（２．６Ｌ）中のメチル５−ブロモピリジン−３−カルボキシレート（１７３ｇ、８００ｍｍｏｌ）の溶液を、ジエチルエーテル（８００ｍＬ、３．０当量）中の３Ｍ臭化メチルマグネシウムの溶液に滴下して加える。室温にて１時間混合物を攪拌し、次いでそれを０℃に冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）でクエンチする。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｌ）を加え、層を分離する。有機層を得、それをトルエン（１Ｌ）で濃縮して残留水を共沸して、橙色の油状物として標題化合物（１６８ｇ、９７％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：８．６６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），８．５５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｓ，１Ｈ），１．４５（ｓ，６Ｈ）。

【0033】

調製例４
２−［５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−３−ピリジル］プロパン−２−オール

【化4】

１，４−ジオキサン（４２８ｍＬ）中の２−（５−ブロモ−３−ピリジル）プロパン−２−オール（１８．５ｇ、８５．７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（４４ｇ、１７１ｍｍｏｌ、２当量）および酢酸カリウム（２５．２ｇ、２５７ｍｍｏｌ、３当量）の混合物を窒素で十分にパージする。（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（３．５ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を加え、排気し、反応物を２回窒素でパージする。混合物を９０℃で一晩加熱する。冷却し、酢酸エチル（１Ｌ）で希釈し、３０分間超音波処理する。セライト（登録商標）のパッドで濾過し、液体濾過物を硫酸ナトリウムで乾燥させる。濾過後、有機液体を濃縮し、酢酸エチル（１Ｌ）中に残渣を再溶解し、セライト（登録商標）のパッドで再び濾過する。濾過物を濃縮し、残渣をジエチルエーテル（１００ｍＬ）、続いてヘキサン（７００ｍＬ）中に懸濁する。簡単に超音波処理し、濾過して、固体残留物を得、粗固体として標題化合物（１８．５ｇ）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋２６４．０。

【0034】

調製例５
エチル６−ブロモ−４−［［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］アミノ］キノリン−３−カルボキシレート

【化5】

エタノール（５．８４Ｌ）中にエチル−６−ブロモ−４−クロロ−キノリン−３−カルボキシレート（３８９ｇ、１．２４ｍｏｌ）および（２Ｓ）−２−メトキシプロパン−１−アミン、塩酸塩（１７１ｇ、１．３６ｍｏｌ、１．１当量）を懸濁する。ジイソプロピルエチルアミン（４７４ｍＬ）を加え、混合物を５０℃にて一晩加熱する。１６時間後、反応物を室温まで冷却し、真空中で濃縮する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）を残留物に加え、２０分間攪拌する。沈殿物を濾過し、それをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×２５０ｍＬ）で洗浄する。真空中で濾過物を濃縮して、ほぼ定量的収率で標題化合物を得る。その化合物をさらに精製せずに次の工程に使用する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋３６７．０、３６９．０。

【0035】

調製例６
６−ブロモ−４−［［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］アミノ］キノリン−３−カルボン酸

【化6】

室温にて、水酸化ナトリウム（２９６．７ｇ、７．４２ｍｏｌ、６当量）水溶液（４５４ｍＬ）をテトラヒドロフラン（４．５４Ｌ）中のエチル６−ブロモ−４−［［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］アミノ］キノリン−３−カルボキシレート（４５４ｇ、１．２４ｍｏｌ）の溶液に加える。混合物を５０℃にて一晩加熱する。１８時間後、反応物を０℃に冷却し、２３℃以下の温度でｐＨ＝６（約４５０ｍＬ）になるまで、３７％ＨＣｌ水溶液を３０分にわたって滴下して加える。生成した沈殿物を濾紙を用いて濾過し、それを水（２Ｌ）、アセトン（２Ｌ）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）で続いて洗浄する。白色固体を乾燥させて、標題化合物（３５９ｇ、８６％）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋３３８．９，３４０．９。

【0036】

調製例７
８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン

【化7】

６−ブロモ−４−［［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］アミノ］キノリン−３−カルボン酸（５１０ｇ、１．５ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（７．６５Ｌ）に懸濁し、トリエチルアミン（４１９ｍＬ、３ｍｏｌ、２当量）を７０℃にて加える。ジフェニリル酸アジド（３９０ｍＬ、１．８ｍｏｌ、１．２当量）を３０分にわたって滴下して加える。混合物を７０℃（内部温度）で１時間加熱する。１０℃に冷却し、水（５Ｌ）で希釈する。混合物を１時間攪拌し、沈殿物を濾過し、それを水（２×１Ｌ）で洗浄し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×１Ｌ）で洗浄し、次いでそれを乾燥させて、白色固体として標題化合物（４４５ｇ、８８％）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋３３５．９，３３７．９。

【0037】

調製例８
８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン

【化8】

方法１
８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（１０ｇ、３０ｍｍｏｌ）およびテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムブロミド（３ｇ、９．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５０ｍＬ）に懸濁する。２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７５ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）を室温にて加える。ヨードメタン（７．５ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２８℃にて一晩激しく攪拌する。相分離を発生させる。有機物を真空中で濃縮する。残留物をアセトン（５０ｍＬ）で洗浄して、テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムブロミドを除去する。混合物を濾過して、白色粉末として標題化合物（５ｇ、４８％）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋３５０．０，３５２．０。

【0038】

方法２
８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（２８５ｇ、８４７．７ｍｍｏｌ）およびテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムブロミド（８２ｇ、２５４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．８５Ｌ）に懸濁する。２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．７Ｌ、３．４ｍｏｌ）を室温にて加える。硫酸ジメチル（１６０．８ｍＬ、１．７ｍｏｌ）を加え、混合物を３時間激しく攪拌する。相を分離し、有機層を得る。有機層を真空中で濃縮し、水（２．４Ｌ）を用いて３０分間、スラリー状にする。生成した固体沈殿物を濾過し、それを水（２×５００ｍＬ）、ヘキサン（２×５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させる。標題化合物を白色固体（２０７ｇ、７０％）として得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋３５０．０、３５２．０。

【0039】

方法３
８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（５０ｇ、１４９ｍｍｏｌ）およびテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムブロミド（１４．４ｇ、４４．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）に懸濁する。８％の水酸化ナトリウム溶液（６００ｍｍｏｌ）を加える。ヨードメタン（２３．２ｇ、１６３．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２２時間攪拌する。有機相を分離し、水（２５０ｍＬ）で洗浄する。次いで有機相を濃縮し、ジクロロメタンから再結晶し、次いで６５℃以下に乾燥させて標題化合物（４２．７ｇ、８２％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ８．７０（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），７．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，２Ｈｚ），４．３２（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．２８（ｓ，３Ｈ），１．３２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。

【0040】

調製例９
エチル５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリジン−３−カルボキシレート

【化9】

トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（３．９８ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）、トリシクロヘキシルホスフィン（２．４４ｇ、８．７ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（４２．６５ｇ、４３５ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（１７５ｍＬ）中のビス（ピナコラト）ジボロン（３５．８８ｇ、１４１．３ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１５分間、混合物をＮ２で泡立て、次いでそれを８０〜８５℃に加熱する。次いで８０〜８５℃にてジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）中のエチル５−ブロモニコチネート（２５．０ｇ、１０８．８ｍｍｏｌ）を混合物にゆっくり加え、４〜５時間、８０〜８５℃にて、形成した混合物を攪拌する。反応混合物を１５〜３５℃に冷却し、次いでメチルターシャリーブチルエーテル（２５０ｍＬ）および水（２５０ｍＬ）を加える。混合物を珪藻岩で濾過し、有機層および水層を分離する。水層をメチルターシャリーブチルエーテル（２５０ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機層をブライン（１５０ｍＬ）および水（１５０ｍＬ）で洗浄する。有機物を真空下で濃縮し、粗生成物をメチルターシャリーブチルエーテル／ヘプタン（１：６）で再結晶し、次いでそれを５５℃以下で乾燥させて、灰色固体として標題化合物（１８．６７ｇ、６２％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（アセトン−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ１．４０−１．４３（ｍ，１５Ｈ），４．４４（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），８．５７（ｔ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），９．０２（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），９．２２５（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）。

【0041】

調製例１０
エチル５−［１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−２−オキソ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−８−イル］ピリジン−３−カルボキシレート

【化10】

８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（３５ｇ、１００ｍｍｏｌ）、エチル５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリジン−３−カルボキシレート（２９．１ｇ、１０５ｍｍｏｌ）、酢酸エチルナトリウム（２８．７ｇ、３５０ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロリドジクロロメタン（０．８１７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を含有する三ツ口フラスコに、Ｎ２下で１，４−ジオキサン（２００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）を加える。次いで反応混合物を８５℃に加熱し、１０時間、攪拌を継続する。反応混合物を室温で冷却する。混合物をＫｉｅｓｅｌｇｕｈｒ（登録商標）シリカ−チオールで濾過し、触媒を除去する。水（４００ｍＬ）を滴下して加え、固体を沈殿させる。混合物を濾過し、固体を水（４００ｍＬ）で洗浄する。室温にて１時間、酢酸エチル（７０ｍＬ）中で固体を攪拌し、濾過し、酢酸エチル（７０ｍＬ）で洗浄し、６５℃以下で真空下で乾燥させて、標題化合物（３３．６ｇ、８０％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ９．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），９．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），８．７５（ｓ，１Ｈ），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），８．６５（ｔ，１Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．８９（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，１．６Ｈｚ），４．４７（ｑ，２Ｈ），４．３８（ｍ，２Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．６４（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｔ，３Ｈ），１．３７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ）。

【実施例】

【0042】

実施例１
８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン

【化11】

方法１
密閉管中で、８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（０．６００ｇ、１．７ｍｍｏｌ）および２−［５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−３−ピリジル］プロパン−２−オール（０．９ｇ、３．４３ｍｍｏｌｅ）をテトラヒドロフラン（７５ｍＬ）および水（７．５ｍＬ）中に溶解する。混合物を窒素でパージする。フッ化カリウム（４００ｍｇ、６．８９ｍｍｏｌｅ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌｅ）およびトリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスホニウムテトラフルオロボレート（２００ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌｅ）を加える。反応物を窒素中で密閉し、６５〜７０℃にて一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、濾過して、無機残渣を除去する。濾過物を濃縮し、それをジクロロメタン（１２０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で希釈する。有機層を分離し、それを硫酸マグネシウム粉末で乾燥させる。それを真空中で濃縮して、茶色の油状物を得る。ヘキサン中の３０〜６５％の酢酸エチルの溶出溶媒、次いでジクロロメタン中の０〜７％のメタノールを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製する。生成物を含有する画分を濃縮し、ジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）、アセトン（１０ｍＬ）、アセトンおよびジエチルエーテル（各々１０ｍＬ）で順に共沸する。固体残渣を乾燥させて、橙色の粉末として標題化合物（０．３０ｇ、４４％）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋４０７．０。

【0043】

方法２
１，４−ジオキサン（２．６Ｌ）中の２−（５−ブロモ−３−ピリジン）プロパン−２−オール（１００ｇ、４６４ｍｍｏｌ、１．２５当量）、４，４，５，５−テトラメチル−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，３，２−ジオキサボロラン（１４１．４ｇ、５５７ｍｍｏｌ、１．５当量）、および酢酸カリウム（１２７．５ｇ、１．３ｍｏｌ）の懸濁液を室温にて３０分間、窒素でパージする。ジクロロ−（（ビス−ジフェニルホスフィノ）フェロセニル）−パラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン付加物（９ｇ、１１．１４ｍｍｏｌ）を窒素下で加え、混合物を９０℃に加熱する。混合物を３時間攪拌する。反応混合物を８０℃に冷却し、次いで８−ブロモ−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（１３０ｇ、３７１ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１１８ｇ、１．１ｍｏｌ）水溶液（９１０ｍＬ）およびジクロロ−（（ビス−ジフェニルホスフィノ）フェロセニル）−パラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン付加物（９ｇ、１１．１４ｍｍｏｌ）を加える。同じ温度にて１．５時間、混合物を攪拌する。相を分離し、有機層を得て、それを４０℃に冷却し、その後、真空中で濃縮する。１：１：１〜１：１：２０のジクロロメタン／酢酸エチル／メタノールの溶出溶媒混合物勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣（３５０ｇ）を精製する。生成物を含有する画分を得る。濃縮し、４０℃にて１５分間、酢酸エチル（１０Ｌ／ｋｇ）中で残渣をスラリー状にし、濾過し、固体を酢酸エチル（２×１Ｌ／ｋｇ）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×２Ｌ／ｋｇ）で洗浄する。洗浄した固体をメタノール（１０Ｌ／ｋｇ）に溶解し、ＳｉｌｉａＢｏｎｄ（登録商標）チオール（０．４ｇ／ｇ）で処理して、残留金属を除去する。２３℃にて４時間、懸濁液を攪拌し、濾過する。固体をメタノール（１Ｌ／ｋｇ）で洗浄する。全ての濾過物を合わせ、メタノール洗浄し、真空中で濃縮する。固体を溶媒（約１００ｍＬ）中に保持する。物質が溶媒から結晶化する。固体物質を濾過し、１ｍｂａｒ／４０℃にて一晩乾燥させて、白色固体として標題化合物（７７ｇ、５１％）を得る。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋４０７．１．１ＨＮＭＲ（５００．２３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：９．０５（ｓ，１Ｈ），８．９５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．７９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．６９（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄｄ，Ｊ＝１．７，８．８Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｓ，１Ｈ），４．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄｄ，Ｊ＝４．２，１５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８５−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，６Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）。

【0044】

方法３
０℃以下の温度でＮ２保護下で、テトラヒドロフラン（３２０ｍＬ）中のエチル５−［１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−２−オキソ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−８−イル］ピリジン−３−カルボキシレート（３２．０ｇ、７６．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＭｇＢｒ（テトラヒドロフラン／トルエン中に１．４Ｍ、２２１．４ｇ、６．９２×）溶液をゆっくりと加える。Ｎ２保護下で−５〜０℃にて１時間、混合物を攪拌する。２５℃以下に温度を維持しながら、ＮＨ４Ｃｌ溶液（１５％、３２０ｍＬ）をゆっくりと加え、反応をクエンチする。次いで酢酸エチル（３２０ｍＬ）を加える。混合物を２５〜３０℃に加温し、３０分間攪拌する。２層の分離後、テトラヒドロフラン（１６０ｍＬ）で水層を逆抽出する。合わせた有機物をブライン（１９２ｍＬ）で洗浄する。活性炭（１．６ｇ）を有機層に加え、６５〜７５℃にて４〜５時間攪拌する。混合物をＫｉｅｓｅｌｇｕｈｒ（登録商標）シリカ−チオール（１．６ｇ）で濾過する。６５〜７５℃にて２〜３時間、有機層を攪拌し、次いで混合物をＫｉｅｓｅｌｇｕｈｒ（登録商標）シリカ−チオールにより濾過する。有機層を真空下で除去し、酢酸エチル／テトラヒドロフランで再結晶して、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンを淡い黄色の固体（２２．３４ｇ、７２．２％）として得る。

【0045】

三ツ口フラスコに、この方法３において上記のように調製した８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（５０．０ｇ、１２３ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（１５００ｍＬ）を加える。混合物を攪拌し、それを４５〜５５℃に加熱して、絶対溶液を形成する。濾過し、濾過物を４５℃以下で真空下で２．０〜３．０Ｖまで濃縮し、酢酸エチル（５００ｍＬ）を加え、次いで４５℃以下で真空下で７〜８Ｖまで濃縮する。７０〜８０℃にて６〜１０時間、スラリーを攪拌し、次いで２０〜２５℃に冷却し、濾過する。酢酸エチル（１３５〜１４０ｇ）およびエタノール（１３．５〜１４．０ｇ）を残渣に加える。７０〜８０℃にてスラリーを６〜１０時間攪拌し、次いで２０〜２５℃に冷却し、濾過する。真空下で濃縮して、淡黄色の固体として標題化合物（３７．９ｇ、７５．８％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ８．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），８．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），８．７１（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），８．２１（ｔ，２Ｈ），７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．３６（ｑ，２Ｈ），３．８８（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｓ，１Ｈ），１．９５（ｓ，１Ｈ），１．７１（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝０．８Ｈｚ），１．３３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。

【0046】

実施例２
８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、形態Ｉ
方法１
純粋でない遊離塩基（実施例１）を酢酸エチル中でスラリーにし、白色固体で開始して茶色っぽい溶液から沈殿した。固体を排気フード内部に配置したグローブボックス内で濾過し、グローブボックス内で一晩真空中で乾燥させる。生成物を一晩真空下に置く（１１ｇ、６３．１８％収率）。

【0047】

結晶性固体のＸ線粉末回折（ＸＲＤ）パターンを、３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動するＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出計を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ ＥｎｄｅａｖｏｒＸ線粉末回折計で得る。２θにおいて０．００８７°のステップサイズおよび０．５秒／ステップの走査速度で、ならびに０．６ｍｍの発散、５．２８ｍｍの一定散乱防止、および９．５ｍｍの検出器スリットで、試料を２θにおいて４から４０°の間で走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダに充填し、スライドガラスを使用して平滑面を得る。任意の所与に結晶形態について、角ピーク位置がわずかに変化し得ることは結晶学の分野において周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度、試料の変位、または内部標準の存在もしくは非存在の変化に起因してシフトし得る。この場合、２θにおける±０．２のピーク位置の変動は、識別した結晶形態の明確な識別を妨げずにこれらの電位変化を考慮に入れる。結晶形態の確認は、特徴的なピーク（°２θの単位）、典型的にはより顕著なピークの任意の特有の組み合わせに基づいてなされ得る。室温および相対湿度で回収した結晶形態回折パターンは、８．８５および２６．７７°２θにてＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整する。

【0048】

このように、化合物の調製した試料を、以下の表１に記載した回折ピーク（２θ値）を有するとしてＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンにより特徴付ける。具体的には、パターンは、０．２°の回折角についての許容差で、８．５７ならびに９．０６、１５．９３、１８．２９および１８．８７の１つ以上にて生じる特性ピークを含む。

【0049】

【表1】

【0050】

方法２
十分な量の実施例１の遊離塩基をエタノールまたはテトラヒドロフランに溶解して、溶液を生成する。溶液を蒸発させて、標題化合物を得る。

【0051】

このように、標題化合物の調製した試料を、以下の表１に記載した回折ピーク（２θ値）を有するとしてＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンにより特徴付ける。具体的には、パターンは、０．２°の回折角についての許容差で、９．０８、１５．９３、１８．２５および１８．８３からなる群から選択されるピークの１つ以上と併せて８．６０にて生じる特性ピークを含む。

【0052】

【表2】

【0053】

実施例３
８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン一水和物

【化12】

実施例３は、十分な量の水中で２４時間、遊離塩基（実施例２を参照のこと）の無水形態と共に、遊離塩基のメタノレート（ｍｅｔｈａｎｏｌａｔｅ）形態（メタノレートは遊離塩基のメタノール溶液から得られる結晶形態である）の混合物をスラリーにすることにより調製できる。あるいは、遊離塩基（実施例２を参照のこと）の無水形態をアセトン／水（比９５：５、ａｗ＝０．５７）の溶液に懸濁し、一水和物形態を播種することにより、２４時間以内に無水形態Ｉの所望の一水和物への完全な変換が生じる。

【0054】

実施例３のＸ線粉末回折（ＸＲＤ）を得るための条件は実施例２に記載した条件と本質的に同様である。

【0055】

このように、標題化合物の調製した試料を、以下の表３に記載した回折ピーク（２θ値）を有するとしてＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンにより特徴付ける。具体的には、パターンは、０．２°の回折角についての許容差で、６．７５、９．７１、１６．３５、１６．９８および１９．５４からなる群から選択されるピークの１つ以上と併せて１３．５７にてピークを含む。

【0056】

【表3】

【0057】

実施例４
８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンマレート

【化13】

実施例４は、アセトン（２ｍＬ）に遊離塩基（５３．５ｍｇ）を懸濁し、次いでＬ−リンゴ酸（２２ｍｇ）を導入することにより調製できる。固体は透明な溶液に溶解する。白色結晶性固体は溶液から沈殿する。固体を真空濾過し、空気乾燥する。真空オーブン（６５℃）中で一晩、リンゴ酸塩を乾燥させて標題化合物を得る。

【0058】

実施例４のＸ線粉末回折（ＸＲＤ）を得る条件は実施例２に記載した条件と本質的に同様である。

【0059】

このように、標題化合物の調製した試料を、以下の表４に記載した回折ピーク（２θ値）を有するとしてＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンにより特徴付ける。具体的には、パターンは、０．２°の回折角についての許容差で、１０．３３、１２．１６、１５．５７および２０．０８からなる群から選択されるピークの１つ以上と併せて５．３９にてピークを含む。

【0060】

【表4】

【0061】

実施例５
８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンフマレート

【化14】

実施例５は、遊離塩基８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（６０．２ｍｇ）を１−ブタノール（０．５ｍＬ）に加え、次いで２１．９ｍｇのフマル酸を加えることにより調製できる。ヘプタン（５×０．５ｍＬ）を加え、厚い白色スラリーを生成し、９０℃／５００ｒｐｍにて攪拌する。真空濾過し、窒素下で乾燥させる。濾過物から回収している間に固体は損失するが、ＸＲＤには十分である。さらなる結晶性フマル酸塩を、遊離塩基（１０１．０ｍｇ）を１−ブタノール（０．５ｍＬ）に加え、次いで３４ｍｇのフマル酸を加えることにより調製する。ヘプタン（６×０．５ｍＬ）および最初の調製からのフマル酸塩の種晶を加え、９０℃／５００ｒｐｍにて１時間、混合物を攪拌する。真空濾過により固体を回収し、窒素下で固体を乾燥させる。真空オーブン（６５℃）中で一晩、固体をさらに乾燥させて標題化合物を得る。

【0062】

実施例５のＸ線粉末回折（ＸＲＤ）を得る条件は実施例２に記載した条件と本質的に同様である。

【0063】

このように、標題化合物の調製した試料を、以下の表５に記載した回折ピーク（２θ値）を有するとしてＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンにより特徴付ける。具体的には、パターンは、０．２°の回折角についての許容差で、８．５５、１５．４５、１５．７８および２２．５０からなる群から選択されるピークの１つ以上と併せて５．１０にてピークを含む。

【0064】

【表5】

【0065】

ｍＴＯＲ（ＦＲＡＰ１）インビトロ酵素アッセイ
ｍＴＯＲキナーゼに対する化合物ＩＣ５０値を決定するためにｍＴＯＲ ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）キナーゼアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する。これは、ドナー種として長い寿命のテルビウム標識抗体を使用する時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイフォーマットおよびレセプター種として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識４Ｅ−ＢＰ１である。ｍＴＯＲ活性をモニターするためにＴＲ−ＦＲＥＴ比を使用し、ここでタンパク質のリン酸化の増加がＴＲ−ＦＲＥＴ比の増加を生じる。浅いブラック３８４−ウェルＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ中で１２．５マイクロリットルの反応体積を使用してキナーゼ反応を実施する。試薬を加えて、５０ミリモルのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５、１ミリモルのエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、１０ｍＭの塩化マンガン、２ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．４マイクロモルのＧＦＰ−４Ｅ−ＢＰ１（ｍＴＯＲの生理学的基質、緑色蛍光タンパク質との融合物として発現し、精製した４Ｅ−ＢＰ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７０ｎｇ／ミリリットルのｍＴＯＲ（昆虫細胞中で標識し、発現させた組換えヒトｍＴＯＲ、残基１３６０−２５４９、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４％のジメチルスルホキシドおよび化合物の連続希釈（２０，０００から１ｎＭまで１：３希釈）の最終反応条件を得る。酵素および基質を化合物に加え、次いでアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を１０μＭまで加え、反応を開始する。６０分間室温でインキュベートし、次いで４ｎＭのテルビウム標識した抗ホスホ−トレオニン−４６ ４Ｅ−ＢＰ１抗体を含有する１２．５μＬの抗体希釈緩衝液および２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．６７ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン塩酸塩（Ｔｒｉｚｍａ（登録商標））ｐＨ７．５、０．０２％のアジ化ナトリウムおよび０．０１％のノニルフェニルポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０）を加える。室温にて６０分間インキュベートし、３４０ｎｍ波長励起フィルタならびに４９５ｎｍおよび５２０ｍｍ波長の発光フィルタを用いてＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取る。４９５フィルタ（テルビウムに特異的）で測定した信号に対して５２０ｎｍフィルタ（ＧＦＰに特異的）で測定した信号を使用して、ＴＲ−ＦＲＥＴ比を算出する。プレート上の対照に対する反応データから算出する阻害率データを使用して各化合物についてのＩＣ５０値を導く（ＡＴＰを含まないプレート上の対照に対するアッセイデータ点のＴＲ−ＦＲＥＴ比）。ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を使用して、阻害率および１０点化合物濃度データを４パラメータロジスティック式に適合する。

【0066】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、０．１６５μＭ（±０．０９２５、ｎ＝５）の絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がｍＴＯＲの有効な阻害剤であることを示す。

【0067】

ホスホイノシチド３−キナーゼアルファ（ＰＩ３Ｋａ）インビトロ酵素アッセイ
ＰＩ３Ｋａシンチレーション近接アッセイ（ＰＩ３Ｋａ ＳＰＡ）を使用して、ＰＩ３Ｋａキナーゼに対する化合物ＩＣ５０値を決定する。このアッセイは、γ−Ｐ３３−ＡＴＰのホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェート（ＰＩＰ２）への組み込みを測定することにより、化合物阻害剤の存在下で活性ＰＩ３Ｋａを評価する。透明な底のポリスチレンプレートを有する白色の９６ウェルハーフエリア平底中の４０μＬの反応体積でキナーゼ反応を実施する。ＰＩ３Ｋａを加えて、反応を開始する。最終反応条件は、４３．７５ｍＭの２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．０、３０６ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１．７６ｍＭのポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）、１０μＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２．９ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）および１μＣｉ／ウェルのγ−Ｐ３３−アデノシン三リン酸（γ−Ｐ３３−ＡＴＰ）、５．０ｎＭのＰＩ３Ｋａヒト組換え酵素、０．２ｍＭのパルミトイル−オレオイルホスファチジルセリン（ＰＯＰＳ）、０．０４ｍＭのホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、４％のＤＭＳＯおよび連続希釈の化合物（２０，０００〜１ｎＭまで１：３連続希釈）である。ＰＩ３Ｋａを添加した後、室温にて９０分間、インキュベートする。２．５ｍｇ／ｍＬのネオマイシン結合ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮＱ０５０６）および２１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する４０μＬの停止緩衝液を添加することで反応を停止する。１０００回転／分（ＲＰＭ）にて３０分間、プレートを遠心分離し、Ｐ３３について正規化したＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘを用いて放射能を計数する。プレート上の対照に対する反応データ（活性酵素対６２．５ミリモルのＥＤＴＡにより阻害される酵素対照）を使用して算出される阻害率データを使用することによって実施例１についてのＩＣ５０値を導く。阻害率および１０点化合物濃度データを、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を使用して４パラメータロジスティック式に適合する。

【0068】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、０．００６０７μＭ（±０．００３３８、ｎ＝２）の絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がＰＩ３Ｋａの有効な阻害剤であることを示す。

【0069】

ホスホイノシチド３−キナーゼベータ（ＰＩ３Ｋｂ）インビトロ酵素アッセイ
ＰＩ３Ｋベータシンチレーション近接アッセイ（ＰＩ３ＫベータＳＰＡ）を使用して、化合物についてのＰＩ３Ｋｂに対するＩＣ５０値を決定する。このアッセイは、γ−Ｐ３３−ＡＴＰのホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェート（ＰＩＰ２）への組み込みを測定することによって化合物阻害剤の存在下で活性ＰＩ３Ｋベータを評価する。透明な底のポリスチレンプレートを有する白色の９６ウェルハーフエリア平底中の４０μＬの反応体積でキナーゼ反応を実施する。ＰＩ３Ｋベータを加えて反応を開始する。最終反応条件は、４３．７５ｍＭの２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．０、８７．５ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１．７６ｍＭのポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＴＭ Ｘ−１００）、４０μＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１．０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）および１μＣｉ／ウェルのγ−Ｐ３３−アデノシン三リン酸（γ−Ｐ３３−ＡＴＰ）、６．０ｎＭのＰＩ３Ｋベータヒト組換え酵素、０．２ｍＭのパルミトイル−オレオイルホスファチジルセリン（ＰＯＰＳ）、０．０４ｍＭのホスファチジルイノシトール（４，５）ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、４％のＤＭＳＯおよび連続希釈の化合物（２０，０００〜１ｎＭまで１：３希釈）である。ＰＩ３Ｋベータを添加した後、室温にて９０分間、インキュベートする。２．５ｍｇ／ｍＬのネオマイシン結合ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮＱ０５０６）および２１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する４０μＬの停止緩衝液を添加することで反応を停止させる。１０００回転／分（ＲＰＭ）にて３０分間、プレートを遠心分離し、Ｐ３３について正規化したＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘを用いて放射能を計数する。プレート上の対照に対する反応データ（活性酵素対６２．５ミリモルのＥＤＴＡにより阻害した酵素対照）を使用して算出される阻害率データを使用することによって化合物についてのＩＣ５０値を導く。阻害率および１０点化合物濃度データを、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を使用して４パラメータロジスティック式に適合する。

【0070】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、０．０７７６μＭ（±０．０４０１、ｎ＝２）の絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がＰＩ３Ｋｂの有効な阻害剤であることを示す。

【0071】

ホスホイノシチド３−キナーゼデルタ（ＰＩ３Ｋｄ）およびホスホイノシチド３−キナーゼガンマ（ＰＩ３Ｋｇ）インビトロ酵素アッセイ
ＡＤＰの蛍光ベースの免疫学的検定検出のためにＡｄａｐｔａ（登録商標）キナーゼアッセイを使用する。これは、キナーゼＡＤＰ産生をモニターするためにユーロピウム標識抗ＡＤＰ抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＡＦ６４７）標識ＡＤＰトレーサーを使用する時間分解−ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイフォーマットである。ＴＲ−ＦＲＥＴ比を使用して、ＰＩ３ＫデルタまたはＰＩ３Ｋガンマ活性をモニターし、ここで、脂質リン酸化の増加および対応する増加したＡＤＰ産生により、ＴＲ−ＦＲＥＴの減少が生じる。

【0072】

酵素反応：Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、小容量の白色３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）＃３６７４）中の１０マイクロリットルの反応体積を使用してＰＩ３Ｋｄについてのキナーゼ反応を実施する。試薬を加えて、０．４７〜２．６ナノグラムのＰＩ３Ｋデルタ（昆虫細胞中で発現し、昆虫細胞から精製した組換え完全長のヒトＰＩ３Ｋｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および３２．５ミリモルのＨＥＰＥＳ中の５０マイクロモルのＰＩＰ２：ＰＳ、ｐＨ７．５、５０ミリモルの塩化ナトリウム、０．０１５％のＣＨＡＰＳ、１．５ミリモルの塩化マグネシウム、０．５ミリモルのＥＧＴＡ、２５マイクロモルのＡＴＰ、１％のＤＭＳＯおよび連続希釈した化合物（２０，０００から１ナノモルの１：３希釈）の最終反応条件を得る。ＡＴＰを化合物に添加し、次いで基質／キナーゼ混合物を添加して反応を開始する。プレートを３０秒間振盪し、次いで室温にて６０分間インキュベートする。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、小容積の白色３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）＃３６７４）中の１０マイクロリットルの反応体積を使用してＰＩ３Ｋｇについてキナーゼ反応を実施する。試薬を加えて、３．５〜２６ナノグラムのＰＩ３Ｋガンマ（昆虫細胞中で発現し、昆虫細胞から精製した組換え完全長のヒトＰＩ３Ｋｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および３２．５ミリモルのＨＥＰＥＳ中の５０マイクロモルのＰＩＰ２：ＰＳ、ｐＨ７．５、０．５ミリモルのＥＧＴＡ、１．５ミリモルの塩化マグネシウム、２５マイクロモルのＡＴＰ、１％のＤＭＳＯおよび連続希釈した化合物（２０，０００から１ナノモルの１：３希釈）の最終反応条件を得る。ＡＴＰを化合物に加え、次いで基質／キナーゼ混合物を加えて反応を開始する。プレートを３０秒間振盪し、１０００×ｇにて２分遠心分離し、次いで室温にて６０分間インキュベートする。

【0073】

ＡＤＰ検出：５マイクロリットルの検出ミックス（３０ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｎＭのＥｕ抗ＡＤＰ抗体および５〜１００μＭのＡＴＰでの反応のためのＥＣ６０濃度のＡＤＰトレーサー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＰＩ３Ｋデルタおよびガンマ酵素反応に加える。プレートを３０秒間振盪し、１０００×ｇにて２分遠心分離し、次いで室温にて６０分間インキュベートする。３４０ｎｍ波長励起フィルタならびに６６５ｎｍおよび６１５ｎｍ波長の発光フィルタを使用して蛍光プレートリーダーでプレートを読み取る。６１５フィルタ（ユーロピウムに特異的）で測定した信号に対して６６５ｎｍフィルタ（ＡＦ６４７ポリＧＴ発光に特異的）を用いて測定した信号を使用してＴＲ−ＦＲＥＴ比を算出する。ＴＲ−ＦＲＥＴ比を使用して、シグモイド用量反応モデル番号２０５（ＩＤＢＳ製のＸＬｆｉｔ）に適合するＡＴＰ／ＡＤＰ標準曲線への逆算によりＡＤＰ濃度を算出する。プレート上対照に対する反応データ（ＡＴＰを含まないプレート上の対照に対するアッセイデータ点のＡＤＰ濃度）から算出される阻害率データを使用して各化合物についてのＩＣ５０値を導く。ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、阻害率および１０点化合物濃度データをシグモイド用量反応モデル２０５（ＩＤＢＳ製のＸＬｆｉｔ）に適合する。

【0074】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこれらのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、ＰＩ３Ｋｄについて０．０３８０μＭの絶対ＩＣ５０値およびＰＩ３Ｋｇについて０．０２３８μＭの絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がＰＩ３ＫｄおよびＰＩ３Ｋｇの有効な阻害剤であることを示す。

【0075】

ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）インビトロ酵素アッセイ
Ｚ’ＬＹＴＥ（登録商標）キナーゼアッセイフォーマット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、化合物についてのＤＮＡ−ＰＫに対するＩＣ５０値を決定する。これは、タンパク質分解に対するリン酸化対非リン酸化二重標識ペプチド基質（アミノ末端におけるクマリン（Ｃｏｕｍｅｒｉｎ）、カルボキシ末端におけるフルオレセイン）の感受性に基づいた蛍光ベースの共役酵素アッセイフォーマットである。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）比を使用して、ペプチドのリン酸化が、ペプチドがタンパク質分解的切断をすることを防ぎ、基質のＦＲＥＴが維持されるＤＮＡ−ＰＫ活性をモニターする。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、小容積のＮＢＳ、ブラック３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）＃３６７６）中の１０マイクロリットルの反応体積を使用してキナーゼ反応を実施する。試薬を加えて、５０ミリモルのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５、０．０１％のＢＲＩＪ−３５非イオン性界面活性剤、１０ミリモルの塩化マグネシウム、１ミリモルのエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５マイクログラム／ミリリットルの仔ウシ胸腺−ＤＮＡ（ＣＴ ＤＮＡ）、３．８８〜２７．３ナノグラムのＤＮＡ−ＰＫ、２マイクロモルのＳｅｒ／Ｔｈｒ２６標識ペプチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のジメチルスルホキシドおよび連続希釈の化合物（２０，０００から１ナノモルの１：３希釈）の最終反応条件を得る。化合物に酵素および基質を加え、次いで２５．０マイクロモルのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加えて反応を開始する。プレートを３０秒間振盪し、次いで室温にて６０分間インキュベートする。５マイクロリットルの１：１６希釈の展開試薬溶液Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、プレートを３０秒間振盪し、次いで室温にて６０分間インキュベートする。４００ｎｍ波長励起フィルタならびに４４５および５２０ｎｍの発光フィルタを用いてプレートを蛍光プレートリーダーで読み取る。５２０フィルタ（フルオレセインに特異的）で測定した信号に対して４４５ｎｍフィルタ（クマリンに特異的）で測定した信号を使用してＦＲＥＴ比を算出する。プレート上対照に対する反応データから算出される阻害率データ（０％阻害についてＤＭＳＯ対照および１００％阻害についてＡＴＰ反応なし）を使用して化合物についてのＩＣ５０値を導く。ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）を使用して、阻害率および１０点化合物濃度データをシグモイド用量反応モデル（モデル番号２０５）に適合する。

【0076】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、０．００４２４μＭの絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がＤＮＡ−ＰＫの有効な阻害剤であることを示す。

【0077】

Ｕ８７ＭＧ細胞中のリン酸化Ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）、ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）、およびＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）のアルファスクリーンＳｕｒｅＦｉｒｅ検出
ｐ−ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＧＲＡＳ５０Ｋ）、ｐ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＧＲＡ２Ｓ５０Ｋ）、およびｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＧＲＡＳ５０Ｋ）についてアルファスクリーンＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）を使用して、内因性リン酸化ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）、ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）およびＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）のそれぞれの生成に対する実施例１の効果を決定する。この均質アッセイフォーマットは、リン酸化検体の免疫サンドイッチ捕捉およびその後の増幅した信号を生成するために抗体でコーティングしたアルファスクリーンビーズでの検出を使用する。

【0078】

１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ、１００９１−１４１）、１％の非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ、１１１４０−０５０）および１％のピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ、１１３６０−０７０）を補足したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ１１９６５−０９２）からなるＵ８７ＭＧ増殖培地中にＵ８７ＭＧ細胞を維持する。標準的な細胞培養処理を使用して細胞を収集し、次いでＶｉ−Ｃｅｌｌを使用して計数する。Ｃｏｓｔａｒ ＃３５９６の９６ウェルプレートに、増殖培地（５０，０００細胞／ウェル）中の１００μＬのＵ８７ＭＧ細胞をプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートする。

【0079】

アッセイの日に、６％のＤＭＳＯを含有する培地中で希釈した実施例１（２０μＬ／ウェル）で細胞を処理する。３７℃にて１時間インキュベートし、次いで培地を除去し、５０μＬの１×ＳｕｒｅＦｉｒｅ溶解緩衝液（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）キット成分）を各ウェルに加え、穏やかに振盪しながら室温にて１０分間インキュベートする。ｐ−ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）およびｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）アッセイのために、６μＬの溶解物および１０μＬの反応混合物（６０部の反応緩衝液／１０部の活性化緩衝液／１部の各々のドナーおよびアクセプタービーズ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６７６０６１７Ｒ）を３８４ウェルのプロキシプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６００６２８０）に移す。プレートを密封し、室温にて４時間インキュベートする。ｐ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）アッセイのために、４μＬの溶解物および５μＬの反応混合物（４０部の反応緩衝液／１０部の活性化緩衝液／１部のアクセプタービーズ）を３８４ウェルのプロキシプレートに移す。室温にて２時間インキュベートし、次いで２μＬの希釈混合物（２０部の希釈緩衝液／１部のドナービーズ）を各ウェルに加える。プレートを密閉し、室温にてさらに２時間インキュベートする。標準的なアルファスクリーン（登録商標）設定（Ｅｘ６８０ｎｍおよびＥｍ５２０−６２０ｎｍ）を使用してＴｕｒｂｏＭｏｄｕｌｅを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎでプレートを読み取る。プレート上対照に対する反応データから阻害率データを算出する。次いでＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を使用して、１０点化合物濃度データからの阻害率を４パラメータロジスティック式に適合して、実施例１についてのＩＣ５０値を導く。

【0080】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、表６に与えるような絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が、Ｕ８７ＭＧ細胞中のＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲ経路において酵素を阻害することを示す。

【0081】

【表6】

【0082】

細胞増殖アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａから市販されている）を使用して、代謝的に活性な細胞の存在を示す、存在するＡＴＰの定量に基づいて培地中の生存細胞の数を決定することにより実施例１の抗増殖活性を測定する。

【0083】

カラム１はブランク対照として培地のみを使用することを除いて、１００μＬの細胞特異的培地（Ｕ８７ＭＧについてＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および０．１ｍＭの非必須アミノ酸（ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００２）を使用し；ＨＴ１０８０についてイーグルＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００３）を使用し；Ｈ１９７５、Ａ２７８０、ＳＪＳＡ−１および７８６−ＯについてＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００１）を使用し；Ａ２０４についてＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣカタログ番号３０−２００７）を使用する）入りの９６ウェルプレート中に細胞を２０００細胞／ウェルにてプレーティングする。プレートを３７℃および５％ＣＯ２にて一晩インキュベートする。次の日に、ＤＭＳＯ中に１ｍＭにて化合物ストックを調製し、ＤＭＳＯ入りの９６ウェル丸底ポリプロピレンプレート中で連続希釈する。４種の化合物／プレートで、２連で１０種の濃度にて化合物をアッセイする。

【0084】

４μＬのＤＭＳＯ連続希釈物を９６ウェルプレートに移し、１９６μＬの培養培地を加えて、投与のために１０倍ストックを作製する。１１μＬの各々の用量ストックを細胞プレートの対応するウェルに徐々に移し、０．２％のＤＭＳＯ濃度および１１１μＬの最終体積を得る。１１μＬの培地を対照カラム（カラム１２）およびバックグランドカラム（カラム１）に加える。３７℃、５％ＣＯ２にて７２または９６時間（Ｈ１９７５、７８６−Ｏ、ＨＴ１０８０、Ａ２７８０、Ａ２０４およびＳＪＳＡ−１について７２時間を使用し、Ｕ８７ＭＧについて９６時間を使用する）、細胞を化合物と共にインキュベートする。

【0085】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ：Ｇ７５７１）を調製し、インキュベーションが完了した後に１００Ｌを各ウェルに加え、２分間、オービタルシェーカーで混合することにより細胞を均質化し、次いで室温にて１０分間インキュベートして、発光信号を安定化させる。Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ Ｖプレートリーダーを用いて発光生データを記録する。阻害率データを使用して実施例１についてＩＣ５０値を算出する。４パラメータロジスティック曲線を各用量反応に適合する。

【0086】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、表７に与えるように絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が、Ｕ８７ＭＧ、Ｈ１９７５、７８６−Ｏ、Ａ２７８０、ＨＴ−１０８０、Ａ２０４およびＳＪＳＡ−１細胞株の増殖を阻害するのに有用であることを示す。

【0087】

【表7】

【0088】

Ｏｎｃｏｔｅｓｔ腫瘍クローン形成アッセイ
免疫不全ヌードマウスにおける皮膚下で増殖したヒト腫瘍異種移植片のＯｎｃｏｔｅｓｔ（ＧｍｂＨ ｏｆ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、独国）採取を使用して、様々な腫瘍種に対する実施例１による反応を測定する。患者から直接移植し、ヌードマウスで継代した異種移植片は、組織構造および高い程度まで標準的な抗癌剤に対するドナー患者の反応を繰り返す抗癌剤に対する感受性を含む親患者腫瘍の大部分の特徴を保持する。ヌードマウスで増殖するヒト腫瘍異種移植片から直接、腫瘍細胞を調製する。軟寒天中の腫瘍細胞の足場非依存性コロニー形成の阻害を測定する。

【0089】

１３個の異なるヒト腫瘍組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）、すなわち、膀胱癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌（腺、扁平上皮細胞および大型細胞）、乳癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、および腎癌、ならびに黒色腫、ヒト胸膜中皮腫（ｐｌｅｕｒａｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、および肉腫の２〜１０のモデルを含む、表１０に示した患者由来のヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて実施例１を試験し、ｍｄは中分化型であり、ｐｄは低分化型であり、ｕｄは未分化型であり、ｗｄは高分化型である。

【0090】

ヒト腫瘍異種移植片由来の単一細胞懸濁物の調製
固形のヒト腫瘍異種移植片を、胸腺無形成性のヌードマウス（ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕ株）において連続継代で皮下で増殖させ、滅菌条件下で腫瘍を除去し、機械的に分離し、続いてＲＰＭＩ １６４０培地中にＩＶ型コラーゲン（４１Ｕ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（１２５Ｕ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）およびディスパーゼＩＩ（１．０Ｕ／ｍｌ）からなる酵素カクテルと共に３７℃にて４５分間、インキュベートする。細胞を２００μｍおよび５０μｍメッシュサイズの篩に通し、滅菌ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄する。トリパンブルー排除を使用してＮｅｕｂａｕｅｒ−血球計において生存細胞の割合を決定する。

【0091】

ヒト腫瘍異種移植片由来の細胞を用いるコロニー形成アッセイ手順
改変された２層軟寒天アッセイ（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７：４６１−６４３，１９９７）に従って２４ウェルフォーマット中でコロニー形成アッセイを実施する。底の層は、０．２ｍｌ／ウェルのＩＭＤＭ（２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清、０．０１％（ｗ／ｖ）のゲンタマイシンを補足した）および０．７５％（ｗ／ｖ）の寒天からなる。０．８・１０４〜５・１０４個の細胞を、０．４％（ｗ／ｖ）の寒天を補足した０．２ｍＬの同じ培養培地に加え、２４ウェルディッシュ中で底の層上にプレーティングする。０．２ｍＬの培養培地中での連続曝露（薬物オーバーレイ）により試験化合物を適用する。３倍濃度溶液として細胞を播種してから２４時間後に薬物オーバーレイを加える。全てのディッシュにおいて３連で６個の未処理の対照ウェルおよび６種の濃度の薬物処理した群を含む。加湿雰囲気下で３７℃および７．５％ＣＯ２にて２０日までの間、培養物をインキュベートし、倒立顕微鏡を使用してコロニー増殖について厳密にモニターする。この期間内に、インビトロ腫瘍増殖は５０μｍより大きい直径を有するコロニーの形成を導く。最大コロニー形成の時に、自動画像分析システム（ＯＭＮＩＣＯＮ３６００、Ｂｉｏｓｙｓ ＧｍｂＨ）を用いてコロニーを計数する。２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（１ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）の滅菌水溶液を用いて評価の２４時間前に生きているコロニーを染色する。

【0092】

コロニー形成の割合の観点から薬物効果を示す。処理したウェルにおけるコロニーの平均数を、未処理の対照の平均コロニー数と比較する（試験対対照群値、Ｔ／Ｃ−値［％］により相対コロニー数を示す）：

【数1】

【0093】

相対コロニー数に対して化合物濃度をプロットし、絶対ＩＣ５０およびＩＣ７０値、または２点曲線適合によりコロニー形成を５０％（Ｔ／Ｃ＝５０％）および７０％（Ｔ／Ｃ＝３０％）それぞれ阻害するのに必要な薬物濃度を決定する。

【0094】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、表８に与えるような絶対ＩＣ５０値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がこれらの患者由来の細胞株の増殖を阻害するのに有用であることを示す。

【0095】

【表8-1】

【表8-2】

【0096】

Ｅ５４５Ｋｐ１１０ａ白血病モデル
白血病細胞株作製：トランスジェニック胚、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ［ＩｇｈＭｙｃ］２２Ｂｒｉ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）由来の胎生肝細胞を、ウイルス５’ＬＴＲ（長い末端反復）の制御下でヒトｐ１１０α（アミノ酸変化としてＥ５４５Ｋ、ヌクレオチドレベルにおいてＧ１６３３Ａ）の臨床的に単離された活性化突然変異を発現し、ＰＧＫプロモーター（ＭＳＣＶ６ＦＬＡＧ−ｐ１１０αＧ１６３３Ａ ＰＧＫ／ＧＦＰ）の制御下でＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現するレトロウイルスで形質導入して、標的により駆動される白血病細胞を作製する。形質導入した細胞を致死的な放射線を浴びた宿主動物に導入する。形質導入した細胞は、レシピエントの骨髄の中に造血幹細胞を再配置させ、レシピエントの元の骨髄のアブレーションに起因する放射線に誘発される致死からレシピエント動物を救う。後眼窩（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｌｙ）で採取した少量の血液（１０μＬ）中の白血球数を週１回モニタリングすることにより、白血病の進行について救われた主要な動物を観察する。確認された白血病を罹患する主要な放射線を浴びた動物から血液を採取し、白血病細胞株として確立するために二次（放射線を浴びていない）宿主動物に連続継代する。

【0097】

被験動物：白血病レシピエント動物として、８〜１０週齢および２０〜２２ｇの体重のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｉｔｙ、ＩＮ）を使用する。接種前に動物を通常の低脂肪食餌（４．５％）に慣らし、研究期間の間、その食餌を自由に取らせることを継続する。耳パンチにより各群から個々のマウスを識別する。ドナー動物由来の白血病細胞を動物に接種する（０日）。

【0098】

同系白血病モデル：対照の白血病細胞株を以前に接種したドナー動物から、少量の血液（１０μＬ）を後眼窩で採取し、白血球数によって負荷された白血病細胞を測定する。十分に負荷された白血病を罹患する動物から、ドナー血液を採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５００，０００個の白血病細胞／２００μＬで希釈し、０日目に２００μＬ／動物を後眼窩に注射して、白血病を発生させる。ｐ１１０α（Ｅ５４５Ｋ）／ｍｙｃ細胞を接種したマウスを、実施例１での処置について５匹の群およびビヒクルで処置した対照群について１０匹の群に割り当てる。接種後、５日〜１１日に、各群に強制経口投与によりビヒクルのみ；５、１０、２０ｍｇの試験物ＱＤ／キログラム体重（ｍｇ／ｋｇ）で実施例１を毎日投与する。１２日目に動物から少なくとも１０μＬの血液を後眼窩で採取して、白血病細胞アッセイにおいて白血病の進行を評価する。

【0099】

白血病細胞アッセイ：各研究動物から十（１０）μＬの全血を採取し、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＴＱ−Ｐｒｅｐで処理して、赤血球を溶解させ、分析のために残存有核白血球を固定する。即座に固定細胞を分析するか、またはそれらをさらなる分析のために４℃にて暗所で保存する。Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて蛍光抗体細胞分類（ＦＡＣＳ）分析により細胞をアッセイする。各試料中の前方散乱／側方散乱（ＦＳ／ＳＳ）プロットの特定の領域（正常な動物においてほとんど／全く白血病細胞を示さないが、白血病対照動物において有意な白血病細胞を示す領域として規定した）内の白血病細胞を計数する。これらのデータを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ／試料の一定のカットオフの使用により白血病細胞／血液の単位体積として正規化する（均一量のフルオロスフェア（Ｆｌｕｏｒｏｓｈｐｅｒｅ）を各々の最初の血液試料に最初に加え、試料当たりの等しい数は試料当たりの計測した等しい体積と一致する）。

【0100】

試験物：週１回ベースで、実施例１を１％のヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）／０．２５％のポリソルベート８０／０．０５％の消泡剤／精製水と混合し、プローブ超音波発生装置で超音波処理して懸濁する。配合した試験物を４℃にて冷蔵し、使用するまで暗所で保存する（各々の投与前に再懸濁する）。

【0101】

統計的分析：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ’ｓ ＣＸＰソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを表にする。対照群としてビヒクル群を使用してダネット法、１元ＡＮＯＶＡを用いて実施例１の効果の統計的有意性を決定する（ＪＭＰ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。

【0102】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、表９に与えるような％ＴＧＩ値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が、腫瘍（その腫瘍の増殖は、多くのヒトの癌に見出されるホットスポット変異の１つである、突然変異体Ｅ５４５Ｋ ＰＩ３Ｋａにより駆動される）の増殖を阻害することを示す。

【0103】

【表9】

【0104】

異種移植腫瘍モデル
培養中の増殖したヒト膠芽細胞腫細胞Ｕ８７ＭＧおよびヒト腎癌細胞７８６−Ｏを収集し、無胸腺ヌードマウスの腓腹上で皮下に注射する。培養中の増殖したヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５を収集し、ＣＤ−１ｎｕ／ｎｕマウスの腓腹上で皮下に注射する。適切なビヒクル中で試験化合物を調製し、腫瘍が確立した場合（移植後７〜２１日）、経口強制投与により投与する。処置の過程の間に１週間に２回実施した腫瘍体積測定により腫瘍反応を決定する。毒性の一般的な測定として体重を計る。

【0105】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、表１０に与えるような％ＴＧ１値を有することを見出す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が、Ｕ８７ＭＧ、７８６−Ｏ、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５モデルにおいて用量依存性抗腫瘍活性を実証するのに有用であることを示す。

【0106】

【表10】

【0107】

ＰＩ３ＫａおよびｍＴＯＲインビトロ標的阻害の決定
Ｕ８７ＭＧヒト膠芽細胞腫細胞（５×１０６）を０．２ｍＬのマトリゲル中で無胸腺ヌードマウスの脇腹内に皮下で移植する。移植後１０日に、ＴＭＥＤ５０（閾値最小有効量）を決定するために時間経過、単回投与／単一時点、または用量反応プロトコルに従ってマウスに経口投与する。収集時に腫瘍を急速冷凍し、親化合物血漿曝露の決定および用量反応研究の場合、ＴＭＥＣ５０（閾値最小有効濃度）の算出のために血液を採取する。ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ（Ｋｉｍｂｌｅ−Ｋｏｎｔｅｓ）を使用して、５００μＬのＸＹ溶解緩衝液（１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１０μｇ／ｍＬのトリプシン−キモトリプシン阻害剤、１０μｇ／ｍＬのトシルフェニル−アラニルクロロメチルケトン、１０μｇ／ｍＬのアプロチニン、６０ｍＭのベータ−グリセロールホスフェート、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、２．５ｍＭのピロホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのｐ−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエステル、１５ｍＭのパラ−ニトロフェニルホスフェート、５ｍＭのベンズアミジン、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭのフッ化ナトリウム、５０μｇ／ｍＬのフッ化フェニル−メタンスルホニル、１ｍＭの１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５ｍＭのＥＧＴＡ ｐＨ８．０、１μＭのミクロシスチン、１μＭのオカダ酸、および１個のロシュコンプリートプロテアーゼ阻害剤ミニタブレット／１０ｍＬ）中で腫瘍を均質化する。溶解物をアリコートし、即座にアッセイするか、または後の試験のために−８０℃で保存する。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）ＥＬＩＳＡ技術の多重フォーマットを使用し、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲの真空標的阻害中で測定して、ＰＩ３Ｋの下流エフェクターである、ＡＫＴのトレオニン３０８部位のリン酸化；ｍＴＯＲＣ１の下流エフェクターであるｐ７０ Ｓ６Ｋのトレオニン３８９部位およびＳ６ＲＰのセリン２４０／２４４部位におけるリン酸化；ｍＴＯＲＣ２の下流エフェクターである、ＡＫＴのセリン４７３部位のリン酸化に対する効果を評価する。２０μｇの溶解物を、適切な捕捉抗体を予めスポットした９６ウェルプレートを含む炭素電極に加える。ルテニウム標識した検出抗体を使用して対照のタンパク質をプローブする。共反応物ＴＰＡを含有する読み取り緩衝液の存在下で電極上に電流を流し、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ ６０００機器を用いて電気化学発光により生成される光を定量し、記録する。ビヒクル対照群に対する阻害率を算出し、統計的有意性を決定するためにＪＭＰソフトウェアパッケージを使用してＡＮＯＶＡ分析を実施する。

【0108】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、表１１に与えるような活性を有することを見出し、表１１において下線の値は有意性を示す。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物がインビボでＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲを阻害する能力を実証することを示す。

【0109】

【表11】

【0110】

溶解度測定
バイアル内で約１ｍｇの化合物を秤量することによって必要な培地の各々において実施例２の２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、各バイアル中に対応する培地の必要な体積（すなわち０．５ｍＬ）を加える。蓋をしたバイアルに入れ、周囲条件にて一晩（約１６時間）混合物を回転させ、次いで０．２２ｕｍのＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））を使用して濾過し、濾過物のｐＨを測定する（Ｏｒｉｏｎ ７２０Ａ ｐＨメーター）。１００μＬの濾過物をＨＰＬＣバイアルに移すことによって、ＨＰＬＣ分析のための試料を調製し、９００μＬの５０％アセトニトリル／水溶液を加える。ＨＰＬＣ法を使用して溶解度を測定する（０．１％ＴＦＡを含む１５％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡを含む８５％水のＨＰＬＣ移動相；カラムＢｏｎｕｓ ＲＰ、４．６×７５ｍｍ、３．５ｃｍ；２６４ｎｍ ＵＶにおける検出器；カラム温度＝４０℃；流速１．５ｍＬ／分；注入量＝１μＬ）。

【0111】

【表12】

＊ ｐＨ２＝ｐＨ２における５０ｍＭのリン酸緩衝液
ｐＨ４＝ｐＨ４における５０ｍＭのリン酸緩衝液
ｐＨ６＝ｐＨ６における５０ｍＭのリン酸緩衝液
ｐＨ８＝ｐＨ８における５０ｍＭのリン酸緩衝液
ＳＧＦ＝疑似胃酸（Ａｂｕｒｕｂら，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３４７：１６−２２，２００８）。
Ｆｅｄ＝疑似腸液給餌状態（Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｊら，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．，１５（１）：１１−２１，１９９８）。
Ｆａｓｔ＝疑似腸液絶食状態（Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｊら，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．，１５（１）：１１−２１，１９９８）。

【0112】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例２の化合物を試験し、表１２に与えるような溶解度の結果を有することを見出す。これらの結果は、実施例２が、消化管（ＧＩＴ）の生理学的ｐＨより望ましい溶解度を実証することを示す。この物理化学的特性は、ＧＩＴの生理学的ｐＨより様々な溶解度を有する薬物との薬物間相互作用で生じ得るプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）などの複数の医薬で起こり得る癌患者における曝露の変動性を回避するのに役立つ。これは、胃のｐＨの変化（すなわち、ＰＰＩの作用または食事の作用を受けているかまたは受けていない患者）が、溶解度の差に起因して曝露の変動性を生じ得るためである。癌患者が通常、同時に受容する多くの薬物、多くの抗癌剤の狭い治療域ならびに患者の個人間および個人内の大きな変動性のために、潜在的な薬物間相互作用の回避は特に癌において重要である。望ましい溶解度を有する化合物はまた、低い溶解度に起因する有効性に必要とされる全身曝露を増加させるため、または食物作用およびＰＰＩに起因する曝露の変動性を減少させるために使用され得る複雑かつ高価な製剤の必要性を回避する。

【0113】

イヌにおける薬物動態特性
ビーグル犬を医薬品のインビボでの曝露および薬物動態パラメータを決定するために慣用的に使用する。イヌの胃腸の生理はヒトのものと一部の態様において異なるが、薬物吸収を予測し、非線形薬物動態を用いて潜在的な問題を確認することは有用である。

【0114】

イヌにおいて実施例１の薬物動態パラメータを決定するために、オスおよびメスのイヌ（別個の研究において、４匹以下の動物／用量）に、１％のヒドロキシエチルセルロース、０．２５％のポリソルベート８０、精製水懸濁液中の０．０５％の消泡剤（「ＨＥＣ懸濁液」）中の実施例１を強制経口投与により与える。投与量の範囲はＨＥＣ懸濁液中に１から１２ｍｇ／ｋｇの間である。

【0115】

投与から０（投与前）、０．５、１、２、４、８、および２４時間後における各々のイヌ由来の血液試料を、エチレンジアミン四酢酸カリウムを含有する管内に採取する。一部の研究はまた、０．２５時間および１２時間の時点で採取した試料も含む。これらの試料を遠心分離して、血漿を得、その後、分析の前に凍結する。試料をタンパク質沈殿させ、液体クロマトグラフィー／ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ４０００質量分析計を使用する、タンデム質量分析により実施例１の存在について抽出物を分析する。標準曲線は１〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲である。定量の上限以上の血漿濃度を希釈により決定する。実施例１の測定濃度をＷａｔｓｏｎ ｖ．７．４に保存し、有効な実験室情報管理システムを保存のために利用し、電子データを管理し、ＷＡＴＳＯＮソフトウェアを使用した非コンパートメント分析により薬物動態パラメータを算出する。

【0116】

本発明の範囲内の化合物を上記のように実質的にこのアッセイの実施により試験する。例えば、実施例１の化合物を試験し、表１３に与えるように平均ＡＵＣを有することを見出す。実施例１の曲線下面積（ＡＵＣ）値は以下の表に示すように１〜１２ｍｇ／ｋｇの範囲で用量と共に直線的に増加する。個々のＡＵＣ値の線形回帰分析の結果、０．８６の決定係数Ｒ２およびｙ＝１４７４．３ｘ＋４４．３１１の線形方程式が得られる。各用量についての平均ＡＵＣ値の線形回帰分析の結果、０．９６の決定係数Ｒ２およびｙ＝１５４４．７ｘ−７３５．３４の線形方程式が得られる。これらの結果は、本発明の範囲内の化合物が、吸収の飽和が証明されていない、薬理学的に関連する用量範囲にわたってイヌにおいて線形薬物動態特性を有することを示す。これは、経口投与による全身曝露の予測可能な増加を可能にする、薬物開発および臨床投与についての有益な特性である。

【0117】

【表13】