特許 5892648 ＤＤＳカプセル用タンパク質およびそれを用いた薬剤とその調整方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5892648

(24)【登録日】2016年3月4日

(45)【発行日】2016年3月23日

(54)【発明の名称】ＤＤＳカプセル用タンパク質およびそれを用いた薬剤とその調整方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20160310BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20160310BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20160310BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20160310BHJP

   A61K 45/08 20060101ALI20160310BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160310BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160310BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20160310BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20160310BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/47ZNA

   A61K47/42

   A61K9/51

   A61K9/19

   A61K45/08

   A61P35/00

   !C12N15/00 A

   !C12N9/02

   !C12P21/02 C

【請求項の数】8

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2012-27389(P2012-27389)

(22)【出願日】2012年2月10日

(65)【公開番号】特開2013-162760(P2013-162760A)

(43)【公開日】2013年8月22日

【審査請求日】2014年11月12日

(73)【特許権者】

【識別番号】505127721

【氏名又は名称】公立大学法人大阪府立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100118924

【弁理士】

【氏名又は名称】廣幸 正樹

(72)【発明者】

【氏名】乾 隆

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−１２０７９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２０７８３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 福原彩乃（外１０名），第11回日本蛋白質科学会年会 プログラム・要旨集，２０１１年 ５月２７日，pp.109

【文献】 ZHOU,Y et al.，Structure-function analysis of human l-prostaglandin D synthase bound with fatty acid molecules，The FASEB Journal，２０１０年，Vol.24, No.12，pp.4668-4677

【文献】 KUMASAKA,T. et al，Structural Basis of the Catalytic Mechanism Operating in Open-Closed Conformers of Lipocalin Type Pr，Journal of Biological Chemistry，２００９年，Vol.284, No.33，p.22344-22352

【文献】 LIU,J. et al，Effects of removing a conserved disulfide bond on the biological characteristics of rat lipocalin-ty，Biochimie(Paris)，２００８年，Vol.90, No.11-12，p.1637-1646

【文献】 LIU,J. et al，Expression and purification of cysteine mutation isoforms of rat lipocalin-type prostaglandin D synt，Acta Biochimica et Biophysica Sinica，２００８年，Vol.40, No.6，p.489-496

【文献】 SHIMAMOTO,S. et al，NMR solution structure of lipocalin-type prostaglandin D synthase - Evidence for partial overlapping，Journal of Biological Chemistry，２００７年，Vol.282, No.43，p.31373-31379

【文献】 MIYATA,K et al.，Block Catiomer Polyplexes with Regulated Densities of Charge and Disulfide Cross-Linking Directed To Enhance Gene Expression，Journal of the American Chemical Society，２００４年，Vo.126, No.8，pp.2355-2361

【文献】 MATSUMOTO,S et al.，Environment-responsive block copolymer micelles with a disulfide cross-linked core for enhanced siRNA delivery，Biomacromolecules，２００９年，Vol.10, No.1，pp.119-127

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト−リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の活性中心のシステインをアラニン
に置換し酵素活性を失活させ、Ｎ末端にＧＳを結合させたミュータントのＮ末端から３４
番目と９２番目のトリプトファンをシステインに置き換えたことを特徴とするＤＤＳカプ
セル用タンパク質。

【請求項2】

前記ミュータントのＮ末端から数えて２番目と３番目のアミノ酸の間にＮＧＲを挿入し、かつＣ末端にＮＧＲを結合させたことを特徴とする請求項１に記載されたＤＤＳカプセル用タンパク質。

【請求項3】

配列１に示すＤＤＳカプセル用タンパク質。

【請求項4】

配列３に示すＤＤＳカプセル用タンパク質。

【請求項5】

請求項１乃至４のいずれかのＤＤＳカプセル用タンパク質と、前記ＤＤＳカプセル用タンパク質中に組み込まれた薬成分からなる薬剤。

【請求項6】

前記薬剤は凍結乾燥された請求項５に記載された薬剤。

【請求項7】

配列１のアミノ酸配列からなるタンパク質を合成する工程と、
前記タンパク質を還元溶液中で薬成分と混合する工程と、前記還元溶液を酸化する工程と、を含む薬剤の調製方法。

【請求項8】

前記酸化された還元溶液を凍結乾燥する工程をさらに含む請求項７に記載された薬剤の調製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、難水溶性の薬剤を、目的となる生体内の場所や部位、細胞に選択的に運搬する薬剤運搬体に関する。

【背景技術】

【0002】

ゲノム創薬研究により発見された標的受容体へ作用する医薬候補化合物は、総じて分子量が大きく、水に対する溶解度が低い。また、現在使用されている薬剤の中にも疎水性が高く、難水溶性であるものが少なくない。化学修飾法により水溶性は高められるが、薬剤活性が減じられる場合が多い。薬剤活性の高い難水溶性薬剤を効率的に疾患部に輸送できれば、難水溶性薬剤の臨床応用例を拡大し、製薬企業で困難を極めていた薬剤溶解度に対する問題を解決することができる。

【0003】

この課題に対して技術面で鍵を握っているのが、難水溶性薬剤を可溶化し標的まで輸送するとともに、その薬剤を細胞内で効率的に機能発現させることのできるドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）の開発である。

【0004】

このようなＤＤＳのアイデアはすでに開示されているものがある。特許文献１では、標的結合成分と腔形成成分と薬理学的化合物を含む複合体であって、薬理学的化合物が腔形成成分の腔中に存在する複合体が開示されている。ここで開示されている複合体の使い方は、対象が発現するレセプター等の標的に対して、特異的に結合する腔を有するたんぱく質（特にＮＧＦファミリーやインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、バルナーゼ、Ｔ４リゾチーム、ＴＧＦｂ、ＩｇＧ等）を選定し、その腔中に対象に対して薬剤効果を有する薬剤の中から実際に吸蔵させることのできる薬剤を選択する。

【0005】

しかしながら、特許文献１では、神経芽細胞腫を対象とし、対象が過剰に発現する標的をｔｒｋＡレセプターとし、標的結合成分と腔形成成分を有するたんぱく質としてＮＧＦを示してあるものの、それ以上の具体的な開示がなく、ＮＧＦに何をどのように吸蔵させるのかという点については、概念が示されているに過ぎない。

【0006】

これに対して特許文献２は、生体産生物であるリポカリンファミリーが難水性薬物を溶解させＤＤＳとして利用できることを示している。このようなリポカリンファミリーは、生体産物質であるため、毒性や拒絶反応（アレルギー反応等）といった点に対する課題がない。したがって、ＤＤＳに要求される安全性を容易にクリアすることができる。

【0007】

また、特許文献３は、さらに、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素のＮ末端若しくはＣ末端に標的への結合部分を連結した蛋白質を提供している。これによって、標的に対する結合特異性を付与することができるため、さらにＤＤＳへの応用が好適なものとなった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特表２０００−５０７２１０号

【特許文献2】特開２００８−１２０７９３号

【特許文献3】特開２０１１−２０７８３０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

リポカリンファミリーはバレル構造によってポケットを有しており、いわばコップのような形状をしている。ここに、難水溶性の薬剤を収納することができる。しかも、薬剤によっては、複数個の分子単位を収納することができる。しかしながら、バレル構造によって形成されたポケットは、常に開口しており、移送の途中で内在させた薬物がこぼれてしまうおそれがある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、リポカリンファミリーをＤＤＳ用のカプセルとして利用する際に、バレル構造で形成されたポケット中に薬物を収納した後、ポケットの開口をジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）によって閉じることができるようにするものである。すなわち、ＤＤＳ用カプセルに薬剤放出制御機能を付与した。

【0011】

より具体的には、
ヒト−リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の活性中心のシステインをアラニンに置換し酵素活性を失活させ、Ｎ末端にＧＳを結合させたミュータントのＮ末端から３４番目と９２番目のトリプトファンをシステインに置き換えたことを特徴とするＤＤＳカプセル用タンパク質を提供する。

【発明の効果】

【0012】

リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素は、体内産生物質であり、拒絶反応（アレルギー反応等）や毒性といった一般的にＤＤＳが有する課題を容易に乗り越えることができる。また、すでにアミノ酸配列も解析されており、ターゲットに対する標的結合部を含めて組換え合成を行うことで、容易に産生することができる。さらに、本発明は、バレル構造によって形成されるポケットを閉じたり開いたりすることができるようになるため、薬剤運搬のロスが少なく、また、標的部位への的確な薬剤投与も可能と考えられる。

【0013】

このように本発明の薬剤運搬体は、分子選択的認識機能を持ち、がん組織を狙い撃つ「ナノキャリア蛋白質」として医薬品開発分野における新しい方向性を与えることができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】Ｌ−ＰＧＤＳの立体構造を示す図である。

【図2】Ｌ−ＰＧＤＳのミュータントの立体構造を示し、バレル構造の入口の開閉の様子を示す概念図である。

【図3】電気泳動の結果を示す図である。

【図4】Ｌ−ＰＧＤＳのミュータントを精製した際の分画毎の収率を表す図である。

【図5】Ｌ−ＰＧＤＳおよび薬剤を保持させたＬ−ＰＧＤＳの凍結乾燥前後の吸収特性を表す図である。

【図6】Ｌ−ＰＧＤＳおよび薬剤を保持させたＬ−ＰＧＤＳの遠紫外領域の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの測定結果を表す図である。

【図7】薬剤を保持させたＬ−ＰＧＤＳを凍結乾燥させ再度解凍したときの薬効への影響を調べた図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

リポカリンファミリーに属するリポカリン蛋白質は、アミノ酸残基が１４０〜２００個からなり、分子量が約２万程度の蛋白質である。また、アミノ酸配列の相同性が、２０％程度であるにもかかわらず、その構造上の類似性は非常に高いことが知られている。リポカリンファミリーのメンバーとしては、レチノール結合蛋白質、主要尿蛋白質、ビリン結合蛋白質、β−ラクトグロブリン、ロブスタークラストシアニン、臭物質結合蛋白質などがある。

【0016】

これら、リポカリン蛋白質の折りたたみ構造は、連続的に水素結合した８本の逆平行のβストランドからなり、疎水性低分子（リガンド）結合部を囲むようなバレル（樽）型になっている。８本のβストランドをつなぐ７箇所のループは、６箇所が短いヘヤピンで、１箇所がオメガループであり、このオメガループがリガンド結合部の蓋の役割をすると考えられている。また、１本のαヘリックスを有する。すなわち、８本のβストランドからなるβバレル構造と１つのオメガループと、１本のαヘリックスを有する点がこれらリポカリンファミリーの構造上の類似点である。

【0017】

図１にリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）の結晶構造の模式図である。８本のβストランドからなるβバレル構造（１１乃至１８）と１つのαへリックス（１９）と１本のオメガループ（Ｈ２へリックス）（２０）を有している。

【0018】

そもそも、Ｌ−ＰＧＤＳは、シクロオキシゲナーゼの働きによりアラキドン酸から合成されたＰＧＨ_２を基質として、ＰＧＤ_２を合成する酵素である。ＰＧＤ_２は、中枢神経系において、睡眠誘発、体温低下、黄体ホルモン分泌の抑制、痛みや匂いの応答調節などの作用を示し、末梢神経では、肥満細胞からアレルギーのメディエーターとして放出され、血管拡張、気管支収縮、血小板凝集阻害などの作用を示す物質である。

【0019】

そして、Ｌ−ＰＧＤＳはリポカリンファミリーにも属しており、８本のβストランドからなるβバレル構造によって形成されるポケット部分は内側には疎水性アミノ酸が配置された構成になっているので、難水溶性の薬物をこのポケットに収容することにより、水に溶解することができる。このように薬剤運搬が可能なタンパク質をＰＮＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏ Ｃａｐｓｕｌｅ）と呼ぶ。

【0020】

難水溶性の薬剤の水溶可能性については、ポケットの内側のアミノ酸に変異を導入して薬剤毎にポケット内への薬剤の保持特性を調整してもよい。なお、Ｌ−ＰＧＤＳはそもそも酵素であるため、ＤＤＳとして使用する際には、酵素活性を失活させる必要がある。そのためには、Ｎ末端から４５番目のシステイン（活性中心）を、アラニンに置換し、酵素活性を失活させる。

【0021】

本発明のＤＤＳ用タンパク質では、バレル構造で形成されたポケットの入口部分を開閉できるようにさせる。より具体的にはＬ−ＰＧＤＳにおいて、Ｎ末端から３４番目と９２番目のＴｒｐ（トリプトファン）残基をＣｙｓ（システイン）残基に置き換える。Ｃｙｓ残基同士はよく知られているようにジスルフィド結合を形成する。

【0022】

ジスルフィド結合は、システインのチオール基の部分が酸化されることで生じる。また、ジスルフィド結合は、ジチオスレイトールやメルカプトエタノールといった還元剤で切断される。すなわち、バレル構造で形成されたポケット内に薬剤を収納後、酸化雰囲気に曝すことで、ポケットの入口を閉じ、薬剤キャリアーとする。

【0023】

また、細胞中は一般に還元雰囲気であるので、細胞に取り込まれた後は、このジスルフィド結合は切断され、ポケットは開口する。そして、中に収納した薬剤が細胞内で効果を示す。図２には、Ｎ末端から３４番目と９２番目のＴｒｐ（トリプトファン）残基をＣｙｓ（システイン）残基に置き換え、ポケットの入口が開いた状態および閉じた状態のＬ−ＰＧＤＳの予想図を示す。

【0024】

ＤＤＳとしてＬ−ＰＧＤＳを利用する際に課題の１つとなるのは、保存性である。Ｌ−ＰＧＤＳは、タンパク質であるため、比較的容易に品質劣化が進む。また、液中保存では液中の水分によって劣化するおそれが高い。そこで、上記のようにＬ−ＰＧＤＳ中に薬剤を収納した後に、凍結乾燥処理を行う。凍結乾燥はタンパク質を比較的長期に保存させることができることはよく知られている。そこで、薬剤を収納した状態であっても、凍結保存後に効果を示すかどうかを確認した（後述する実施例２参照）。

【0025】

この結果によれば、薬剤を収納した後のＬ−ＰＧＤＳは、凍結乾燥して保存した後も、解凍することで、元の薬剤を収納したＬ−ＰＧＤＳに戻り、また、凍結乾燥する前と同一の薬剤効果を発揮することを確認できた。

【0026】

また、本発明のＤＤＳ用カプセルはすでに知られているように（特許文献３参照）、標的結合部をＮ末端若しくはＣ末端に形成させてもよい。

【0027】

標的結合部については、ターゲットに合わせて設計することができる。例えば、癌細胞の場合は、新生血管内皮細胞に発現する膜蛋白質（ＣＤ１３）に対して特異的に結合するペプチド配列ＮＧＲ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を選択することができる。また、αｖβ３インテグリンを認識するｉｓｏＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ （ｉｓｏＤＧＲ）モチーフを遺伝子組換えによりＬ−ＰＧＤＳのＮ末端、あるいはＣ末端に導入してもよい。

【0028】

また、胃がんの腹膜腫瘍を認識するＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＫＬＰ）−モチーフ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ９７、 １０７５−８１、 ２００６）、転移性がん細胞を認識するＡｓｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ （ＮＶＶＲＱ）モチーフ（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 １４、 ５４９４−５０２、 ２００８）、肝がん細胞を認識するＰｈｅ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ（ＦＱＨＰＳＦＩ）モチーフ（Ｍｏｌ Ｍｅｄ、 １３、 ２４６−５４、 ２００７）等も好適に利用できる。

【0029】

この標的結合部は本体であるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素部分の末端に導入するのが好ましい。また、Ｎ末端であれば、組換え体を作製する際により簡単であるので、より好ましい。

【実施例】

【0030】

（実施例１）
＜ジスルフィド結合を有するＬ−ＰＧＤＳミュータントの作製＞
次に実施例を示して本発明のＤＤＳカプセル用タンパク質の製造法を示す。ジスルフィド結合を有するタンパク質カプセル（Ｐｒｏｔａｉｎ Ｎａｎｏ Ｃａｐｓｕｌｅ：ＰＮＣ）の精製は、大腸菌の形質転換クローンを作製し、大量生成した。形質転換に用いるベクターは、ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−２にリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）の塩基配列を導入したプラスミドを鋳型とし、ダブルプライマーＰＣＲ法を用いて作製した。

【0031】

ジスルフィド結合を有するリポカリオン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）の塩基配列を表１に示す（配列１）。このミュータントは、Ｎ末端およびＣ末端の両方にガンに対する標的結合部であるＮＧＲが付加されている。なお、Ｎ末端には合成の都合上ＧＳが付加される。ここで、３７番目および９５番目のコードはＴｒｐ残基をコードする塩基配列であるＴＧＧからシステインをコードするＴＧＣに置換されている。また、Ｎ末端から４８番目のシステイン（活性中心）はＡｌａ（アラニン）に置き換え酵素活性は失活させるようにした。

【0032】

また、表２には、塩基配列も示す（配列２）。また、３７番目、４８番目、９５番目には四角の枠を記載した。

【0033】

【表1】

【0034】

【表2】

【0035】

また、表３および表４には、標的結合部が付加されていないタイプで、ジスルフィド結合を有するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）のアミノ酸配列と塩基配列を示す。標的結合部をもたないＬ−ＰＧＤＳのミュータントでは、ジスルフィド結合を導入したシステインは、Ｎ末端から３４番目と９２番目であり、酵素活性を失活させるためのアラニンは４５番目である。表３および表４のＮ末端およびＣ末端には、表１及び２で示したＮＧＲ以外の標的結合部を付加することができる。

【0036】

【表3】

【0037】

【表4】

【0038】

この方法では、２本鎖鋳型プラスミドと相補的な変異を含む２種類プライマーを設計し、ＰＣＲを行うことにより、鋳型プラスミドに特異的に変異を導入することができる。Ｌ−ＰＧＤＳの３７番目および９５番目のＴｒｐ残基をコードする塩基配列はＴＧＧであり、この部分をＣｙｓ残基をコードするＴＧＣに置換するためのプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。増幅したＰＣＲ産物のシーケンス解析を行い、Ｔｒｐ３７およびＴｒｐ９５のＣｙｓ残基への置換を確認した。

【0039】

得られたベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌi）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、常法（例えば特許文献２）に従ってＧＳＴ融合タンパク質の発現を誘導しながら培養を行った。Ｌ−ＰＧＤＳは、ＧＳＴと融合した形で産生される。その後大腸菌は０．５ｍＭのＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＷＡＫＯ）を添加した１０倍量のＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭリン酸水素ニナトリウム、１．８ｍＭリン酸水素ニカリウム、１４０ ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ ７．５)中で超音波処理（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＭＹ ＳＥＩＫＯ）により破砕した。

【0040】

大腸菌破砕液をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを充填したカラムに供し、融合タンパク質を吸着させた。そしてＴｈｒｏｍｂｉｎにより目的タンパク質を切断し、溶出液を還元剤であるＤＴＴ存在下においてゲルろ過クロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を精製した。ここで目的タンパク質はＬ−ＰＧＤＳのミュータントであるので、以後ＰＮＣと呼ぶ。

【0041】

精製後のＰＮＣのＳＤＳ ＰＡＧＥ（１５％ Ｗ／Ｖ）分析の結果を図３に示す。左側Ａのレーンはコントロールである。右側Ｂのレーンが生成後のＰＮＣ（Ｌ−ＰＧＤＳのミュータント）である。ＰＮＣの推定分子量である１９ｋＤａ付近に単一のバンドが確認できた。

【0042】

＜ＤＤＳカプセルへの薬剤収納とポケットの開口＞
次に上記の方法で得たＰＮＣの開口部分の開閉について説明する。精製過程におけるゲル濾過クロマトグラフィーの結果を図４に示した。横軸は溶出体積を示し、縦軸は、２８０ｎｍにおける吸収を表す。

【0043】

ＰＮＣ分画ごとに透析によって還元剤ＤＴＴを除去し、ＤＴＮＢ法を用いて遊離型チオールの定量を行った。ＤＴＮＢ法とは、５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＴＮＢ）が、タンパク質のＳＨ基と反応すると５−ｔｈｉｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＴＮＢ）になることを利用して、タンパク質中のＳＨ基を定量する方法である。ＴＮＢは４１２ｎｍの波長で吸収が生じるため容易に定量分析ができる。

【0044】

まず、分画毎の５ μＭ ＰＮＣ溶液（ｐＨ ７．４）に１００％ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを終濃度１０％になるように混合した。氷中にて３０分静置し、遠心分離（１６，０００×ｇ，３０分）によってタンパク質を回収し、沈殿を得た。沈殿に１０％ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを１ ｍｌ加えて遠心分離（１６，０００×ｇ，３０分）を行い、沈殿を得た。

【0045】

その後、６ Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ／５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、撹拌して沈殿を溶解し、室温（２５ ℃）にて１５分静置した。そして、終濃度１００ ｍＭになるようにＤＴＮＢを加えて、室温（２５ ℃）にて１時間静置した。遊離型チオール濃度は、放出されたＴＮＢの吸収波長である４１２ｎｍの吸光度を測定して求めた（ＴＮＢのモル吸光係数ε_４１２ = １３，６００ Ｍ^−１ ｃｍ^−１）。

【0046】

各分画の遊離チオール量を表５に示す。分画１（Ｆ１）においては約８７％のＰＮＣが架橋形成されていない開口状態（ｏｐｅｎｆｏｒｍ：図２（ａ）参照）であることがわかった。

【0047】

【表5】

【0048】

次に、ジスルフィド架橋形成の促進のため、それぞれのＰＮＣ分画を過剰量の酸化型グルタチオン（２０ｍＭ）で処理した。

【0049】

具体的には、各分画の１０ μＭ ＰＮＣ溶液（ｐＨ ７．４）に酸化型グルタチオンを終濃度２０ｍＭとなるように混合し、室温（２５ ℃）にて１２時間静置した。その後、ＤＴＮＢ法による遊離型チオール基の定量を行った。結果を表６に示す。全てのＰＮＣ分画においてジスルフィド架橋が形成されているのが確認された。これは図２（ｂ）のようにＬ−ＰＧＤＳの開口部分がＳ−Ｓ結合で閉じたことを示している。

【0050】

【表6】

【0051】

以上のように本発明に係るＬ−ＰＧＤＳのミュータントは、酸化および還元によって開口部分を開閉することが可能であり、バレル構造で形成された内部に収納した薬剤の保持および放出機能を有したものと言える。

【0052】

（実施例２）
次にＬ−ＰＧＤＳ中に薬剤を収納した状態で、凍結乾燥し、再度解凍しても効果が低下することがないかを確認した。

【0053】

ジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ （ＤＺＰ））は、難水溶性薬剤である。これを直接（コントロール）経口投与した場合、Ｌ−ＰＧＤＳに収納してマウスに経口投与した場合、さらにＬ−ＰＧＤＳに収納して凍結乾燥後、再度解凍させてからマウスに経口投与した場合のそれぞれについて、ペントパルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）誘導性麻酔時間を調べた。ジアゼパムが効いていると、麻酔時間が長くなるので、Ｌ−ＰＧＤＳの有無の場合を比較することで効果を評価することができる。

【0054】

＜凍結乾燥によるＬ−ＰＧＤＳへの影響＞
実験に用いたＬ−ＰＧＤＳは、ジスルフィド架橋ができるようにしたミュータントではない。しかし、開口の有無にかかわらず、Ｌ−ＰＧＤＳで凍結乾燥の影響がなければ、ミュータントにおいても、凍結乾燥による影響はないと考えられる。

【0055】

まず、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に１００μＭのＬ−ＰＧＤＳを用意した。そして、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に３３０μＭのジアゼパム（ＤＺＰ）を収納した１００μＭのＬ−ＰＧＤＳを用意した。これをＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘと呼ぶ。Ｌ−ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘを液体窒素で５時間凍結乾燥した。５時間の凍結乾燥でＬ−ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘは完全に乾燥した。

【0056】

完全に乾燥したＬ−ＰＧＤＳおよびＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘを超純水で溶解し、ｐＨ７．４における吸収スペクトルを測定した。また、２５ ℃、ｐＨ ７．４において、遠紫外領域の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。

【0057】

Ｌ−ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘは、液体窒素によって完全に凍結乾燥させた後、再融解した。再融解したＬ−ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘの吸収スペクトルを測定した。図５にその結果を示す。

【0058】

図５は、横軸は波長であり、縦軸は吸収を表す。グラフ中には４つの曲線が示されている。それぞれＬ−ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳの吸収スペクトルで、凍結乾燥前後において全く一致したので凍結乾燥前と凍結乾燥後の区別がつかないほどであった。

【0059】

また、図６には、ＣＤスペクトルの測定結果を示す。横軸は波長であり、縦軸はモル楕円率θである。図６には、凍結乾燥前と凍結乾燥後のＬ−ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘのＣＤスペクトルが記載されているが、区別がつかないほど４つのサンプルは一致した。

【0060】

これらの結果から、凍結乾燥によるＬ−ＰＧＤＳの構造変化は生じないことが明らかになった。また、凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘのＤＺＰ濃度は凍結乾燥前と一致することが判明した。

【0061】

＜凍結乾燥がＬ−ＰＧＤＳのＤＤＳ能力に及ぼす影響＞
Ｃａｒｂｏｘｙ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ （ＣＭＣ）、ＤＺＰ／ＣＭＣ懸濁液 （５００ μＭ ＤＺＰ）、凍結乾燥前と凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘ （５００ μＭ ＤＺＰ、 ２４０ μＭ Ｌ−ＰＧＤＳ）をマウスに経口投与し（１０ ｍｌ／ｋｇ）、３０分後にｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ（３５ ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。マウスが正向反射を消失してから回復するまでの正向反射消失時間を麻酔時間として測定した。

【0062】

さらに、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘの凍結乾燥による影響を調べるために、凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘをマウスに経口投与し、ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌによる麻酔時間への影響を調べた。図７にその結果を示す。図７は横軸が投与剤の種類である。また縦軸が麻酔時間である。その結果、凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘ投与群は、凍結乾燥前のＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘ投与群と麻酔時間が一致した。

【0063】

以上の結果から、ＤＺＰ／Ｌ−ＰＧＤＳ ｃｏｍｐｌｅｘは凍結乾燥による保存が可能であることが明らかになった。

【産業上の利用可能性】

【0064】

本発明のＰＮＣはＤＤＳに好適に利用することができるほか、酸化若しくは還元による反応の試薬などにも利用することができる。

【符号の説明】

【0065】

１１〜１８ βストランド
１９ αヘリックス
２０ オメガループ（Ｈ２へリックス）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]