特許 5893611 活性剤の送達のための生分解性脂質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5893611

(24)【登録日】2016年3月4日

(45)【発行日】2016年3月23日

(54)【発明の名称】活性剤の送達のための生分解性脂質

(51)【国際特許分類】

   C07C 229/12 20060101AFI20160310BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160310BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20160310BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20160310BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20160310BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160310BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20160310BHJP

   C07J 9/00 20060101ALI20160310BHJP

【ＦＩ】

   C07C229/12

   C12N15/00 A

   C12N15/00 G

   A61K47/18

   A61K31/7088

   A61K48/00

   A61K47/28

   C07J9/00CSP

【請求項の数】27

【全頁数】149

(21)【出願番号】特願2013-513394(P2013-513394)

(86)(22)【出願日】2011年6月3日

(65)【公表番号】特表2013-533224(P2013-533224A)

(43)【公表日】2013年8月22日

(86)【国際出願番号】US2011039164

(87)【国際公開番号】WO2011153493

(87)【国際公開日】20111208

【審査請求日】2014年5月21日

(31)【優先権主張番号】61/489,197

(32)【優先日】2011年5月23日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/351,146

(32)【優先日】2010年6月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511112478

【氏名又は名称】アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100089037

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】ムティアー・マノハラン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン・メイヤー

(72)【発明者】

【氏名】ムトゥサミー・ジャヤラマン

(72)【発明者】

【氏名】松田 成夫

(72)【発明者】

【氏名】ナラヤナンナイール・ケー・ジャヤプラカシュ

(72)【発明者】

【氏名】カラントッタティル・ジー・ラジーヴ

(72)【発明者】

【氏名】アキン・アキンク

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・エー・バイリー

【審査官】 前田 憲彦

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０５４４０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０５４４０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９４／０１９３１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９４／０１８９８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０５７１６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０８６２２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／００１５０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１３８３８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，２０００年，29，p.27-47，第２８−４１頁、図１−４

【文献】 Journal of Controlled Release，２００６年，114，p.100-109，図１−５

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ ２２９／００

Ａ６１Ｋ ３１／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ｃ０７Ｊ ９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の式ＩＡ−１

【化1】

の化合物、またはその塩
（上記の式中、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであるか、
Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、１から２個の窒素原子を有する複素環を形成し、
Ｒの各存在は独立して、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−であり、
Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ_２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであるか、
Ｒ^３およびＲ^４は、それらが直接結合している炭素原子と一体になって、シクロアルキル基を形成し、
Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、または−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、
Ｒ^５の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり、
ａは１、２、３、４、５、または６であり、
ｂは０、１、２、または３であり、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキルであり、
Ｒ^９およびＲ^１０のそれぞれは独立して、１つ以上の生分解性基を有する炭素数１２〜２４のアルキル、炭素数１２〜２４のアルケニル、または炭素数１２〜２４のアルコキシであり、各生分解性基は独立して、上記の炭素数１２〜２４のアルキル基、アルケニル基、またはアルコキシ基に割り込んでいるか、炭素数１２〜２４のアルキル基、アルケニル基、またはアルコキシ基の末端で置換されており（上記生分解性基は、割り込んでいるものは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、または−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−であり、末端のものは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−アルキル、または−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−アルキルである）、
（ｉ）上記の化合物は、下記の部分

【化2】

を含まず、
この式中、−−−−は任意の結合であり、
（ｉｉ）Ｒ^９およびＲ^１０の末端は、アスタリスク（^＊）の付された第３炭素原子から８個以上の原子の鎖分、離れており、
（ｉｉｉ）Ｒ^９およびＲ^１０は、上記生分解性基とアスタリスク（^＊）の付された第３炭素原子との間に少なくとも４つの炭素原子を有する鎖である）。

【請求項2】

請求項１に記載の化合物であって、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−（Ｒ）_ｂ−基が（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−である化合物。

【請求項3】

下記の式ＩＢ

【化3】

の化合物
（上記の式中、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであるか、
Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、１から２個の窒素原子を有する複素環を形成し、
Ｒの各存在は独立して、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−であり、
Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ_２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであるか、
Ｒ^３およびＲ^４は、それらが直接結合している炭素原子と一体になって、シクロアルキル基を形成し、
Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、または−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、
Ｒ^５の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり、
ａは１、２、３、４、５、または６であり、
ｂは０、１、２、または３であり、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキルであり、
Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、または−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−から選択される生分解性基であり、
Ｒ^９およびＲ^１０のそれぞれは独立して、炭素数４〜１２のアルキレンまたは炭素数４〜１２のアルケニレンであり、
Ｒ^１１およびＲ^１２のそれぞれは独立して、アルキルまたはアルケニルであり、
ただし、
Ｒ^９、Ｍ^１、およびＲ^１１が一体になって、少なくとも８個の炭素原子の長さであることと、
Ｒ^１０、Ｍ^２、およびＲ^１２が一体になって、少なくとも８個の炭素原子の長さであることを条件とする）。

【請求項4】

請求項３に記載の化合物であって、Ｍ^１およびＭ^２が−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、Ｒ^１１およびＲ^１２が炭素数４〜１２のアルキレンまたは炭素数４〜１２のアルケニレンである化合物。

【請求項5】

請求項３または４に記載の化合物であって、Ｒ^９、Ｍ^１、およびＲ^１１が一体になって、１２〜２４個の炭素原子の長さである化合物。

【請求項6】

請求項３または４に記載の化合物であって、Ｒ^１０、Ｍ^２、およびＲ^１２が一体になって、１２〜２４個の炭素原子の長さである化合物。

【請求項7】

請求項３〜６のいずれか一項に記載の化合物であって、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−（Ｒ）_ｂ−基が（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−である化合物。

【請求項8】

下記の式ＩＣ

【化4】

の化合物
（上記の式中、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであるか、
Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、１から２個の窒素原子を有する複素環を形成し、
Ｒの各存在は独立して、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−であり、
Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ_２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであるか、
Ｒ^３およびＲ^４は、それらが直接結合している炭素原子と一体になって、シクロアルキル基を形成し、
Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、または−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、
Ｒ^５の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり、
ａは１、２、３、４、５、または６であり、
ｂは０、１、２、または３であり、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキルであり、
Ｒ^９およびＲ^１０のそれぞれは独立して、その末端が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−アルキル、または−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−アルキルから選択される生分解性基で置換されている炭素数１２〜２４のアルキルまたはアルケニルである）。

【請求項9】

請求項８に記載の化合物であって、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−（Ｒ）_ｂ−基が（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−である化合物。

【請求項10】

下記の式

【化5】

から選択される構造を有する化合物、およびこれらの塩から選択した化合物
（上記の式中、
ｍ、ｎ、ｏ、およびｐはそれぞれ個別に１〜２５であり、ただし、
式（ＩＩ）および（ＩＶ）では、ｍおよびｐのいずれも４以上であること、
を条件とする化合物。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物であって、製薬学的に許容可能な塩の形態である化合物。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物であって、カチオン性脂質の形態である化合物。

【請求項13】

中性脂質と、凝集を低減できる脂質と、請求項１２に記載のカチオン性脂質とを含む脂質粒子。

【請求項14】

請求項１３に記載の脂質粒子であって、中性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭから選択され、凝集を低減できる脂質がＰＥＧ脂質であり、ステロールをさらに含む脂質粒子。

【請求項15】

請求項１３および１４のいずれか一項に記載の脂質粒子であって、カチオン性脂質が２０％および６０％のモルパーセントで存在し、中性脂質が５％〜２５％のモルパーセントで存在し、ステロールが２５％〜５５％のモルパーセントで存在し、ＰＥＧ脂質がＰＥＧ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、またはこれらの組み合わせであるとともに、０．５％〜１５％のモルパーセントで存在する脂質粒子。

【請求項16】

請求項１３〜１５のいずれかに記載の脂質粒子であって、活性剤をさらに含む脂質粒子。

【請求項17】

請求項１６に記載の脂質粒子であって、活性剤が、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、およびリボザイムから選択した核酸である脂質粒子。

【請求項18】

請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の脂質粒子であって、インビボ半減期（ｔ_１／２）が３時間未満である脂質粒子。

【請求項19】

請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の脂質粒子であって、インビボ半減期（ｔ_１／２）が、生分解性基を含まない同じカチオン性脂質を含む脂質粒子のインビボ半減期の１０％未満である脂質粒子。

【請求項20】

請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の脂質粒子と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項21】

請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の脂質粒子を含む、細胞内で標的遺伝子の発現を調節するための組成物。

【請求項22】

被検体におけるポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療するための、請求項２０に記載の医薬組成物であって、活性剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択した核酸であり、このｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。

【請求項23】

被検体におけるポリペプチドの過小発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療するための、請求項２０に記載の医薬組成物であって、活性剤が、前記ポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである、医薬組成物。

【請求項24】

被検体において免疫反応を誘発するための、請求項２０に記載の医薬組成物であって、活性剤が免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、医薬組成物。

【請求項25】

請求項２４に記載の医薬組成物であって、標的遺伝子が、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＲＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、ベータカテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サーバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、およびｐ５３腫瘍抑制遺伝子からなる群から選択される、医薬組成物。

【請求項26】

請求項２５に記載の医薬組成物であって、標的遺伝子が１つ以上の突然変異を含む医薬組成物。

【請求項27】

核酸分子を送達するための組成物であって、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の核脂質粒子および核酸を含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本願は、２０１０年６月３日に提出された米国特許出願第６１／３５１，１４６号、および２０１１年５月２３日に提出された米国特許出願第６１／４８９，１９７号の利益を主張するものであり、これらの特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、生分解性脂質と、それを、核酸のような活性剤の送達のために使用することに関する。

【背景技術】

【0003】

治療用核酸としては、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性核酸、アンチセンス、アンタゴｍｉｒ、アンチｍｉｒ、マイクロＲＮＡ模倣体、スーパーｍｉｒ、Ｕ１アダプター、およびアプタマーが挙げられる。これらの核酸は、さまざまな機構を介して作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのケースでは、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）というプロセスを通じて、特異的タンパクの細胞内レベルをダウンレギュレートできる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを細胞質の中に導入すると、これらの二本鎖ＲＮＡコンストラクトは、ＲＩＳＣというタンパクに結合できる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖は、複合体ＲＩＳＣから取り除かれ、結合したｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列に対する相補的配列を有するｍＲＮＡを認識し、それに結合することができる鋳型をＲＩＳＣ内に生じさせる。複合体ＲＩＳＣは、相補的ｍＲＮＡを結合したら、そのｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を遊離させる。ＲＮＡｉは、タンパク合成のためにコードを行う対応するｍＲＮＡの特異的破壊を標的にすることによって、特異的タンパクのダウンレギュレーションをもたらすことができる。

【0004】

ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡコンストラクトは、標的タンパクに対するいずれかのヌクレオチド配列を用いて合成できるので、ＲＮＡｉの治療用途は非常に広範である。これまでのところ、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、インビトロモデル、およびインビボモデルの双方において、標的タンパクを特異的にダウンレギュレートする能力を示している。加えて、ｓｉＲＮＡコンストラクトは現在のところ、臨床研究において評価が行われている。

【0005】

その一方で、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡコンストラクトが現在直面している２つの問題は、第１には血漿中のヌクレアーゼ消化に対する感受性があること、第２には、遊離ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身投与するときに、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡコンストラクトがＲＩＳＣを結合できる細胞内区画に到達する能力が限られていることである。これらの二本鎖コンストラクトは、化学修飾したヌクレオチドリンカー、例えばホスホチオエート基をその分子内に組み込むことによって安定化できる。しかしながら、これらの化学修飾体では、ヌクレアーゼ消化から限定的に保護することしかできず、そのコンストラクトの活性を低下させる場合がある。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞内送達は、ポリマー、カチオン性リポソームのような担体系を用いることによって、または、コンストラクトの化学修飾によって、例えばコレステロール分子の共有結合によって促進できる。しかしながら、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子の効力を向上させるとともに、化学修飾の必要性を低減または排除するためには、送達系の改良が必要とされている。

【0006】

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、ｍＲＮＡのタンパクへの翻訳を阻害できる。アンチセンスコンストラクトのケースでは、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパクｍＲＮＡの配列に対して相補的な配列を有し、ワトソン・クリック型塩基対によってｍＲＮＡに結合できる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げ、および／またはｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅ Ｈ分解を誘発する。そのため、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用（すなわち、特定の疾患に関連するタンパクのダウンレギュレーション）の特異性に対する非常に大きな可能性を有している。これまでのところ、これらの化合物は、炎症性疾患、癌、およびＨＩＶのモデル（Ａｇｒａｗａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３７６−３８７（１９９６）で検討されている）を含むいくつかのインビトロモデルおよびインビボモデルにおいて、有望であることが示されている。アンチセンスは、染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることによって、細胞活性に影響を及ぼすこともできる。いくつかのアンチセンス薬のヒトにおける高度な臨床的評価が現在進められている。これらの薬物の標的としては、ｂｃｌ２およびアポリポタンパクＢ遺伝子、ならびにｍＲＮＡ産物が挙げられる。

【0007】

免疫刺激性核酸としては、デオキシリボ核酸およびリボ核酸が挙げられる。デオキシリボ核酸のケースでは、特定の配列またはモチーフは、哺乳類において免疫刺激を引き起こすことが示されている。これらの配列またはモチーフとしては、ＣｐＧモチーフ、ピリミジンリッチ配列、およびパリンドローム配列が挙げられる。デオキシリボ核酸中のＣｐＧモチーフは、エンドソーム受容体のトール様受容体９（ＴＬＲ−９）によって特異的に認識され、続いて、自然免疫刺激経路および獲得免疫刺激経路の双方を誘発すると考えられている。特定の免疫刺激性リボ核酸配列についても報告されている。これらのＲＮＡ配列は、トール様受容体６および７（ＴＬＲ−６およびＴＬＲ−７）に結合することによって、免疫活性化を誘発すると考えられている。加えて、二本鎖ＲＮＡも、免疫刺激性であると報告されており、ＴＬＲ−３に結合することを介して活性化すると考えられている。

【0008】

治療用核酸の使用に伴う周知の問題の１つは、ホスホジエステルヌクレオチド内結合の安定と、このリンカーのヌクレアーゼに対する感受性に関する。血清にエクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが存在することによって、ホスホジエステルリンカーを有する核酸が急速に消化されるので、治療用核酸の半減期は、血清の存在下、または細胞内において、非常に短くなり得る（Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：３２３−３３８（１９９３）、およびＴｈｉｅｒｒｙ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐ１４７−１６１ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ（Ｅｄｓ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ＲＰ ａｎｄ Ｉｚａｎｔ，ＪＧ；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２））。上記およびその他の既知の問題が理由で、現在開発されている治療用核酸では、天然の核酸に見られる塩基性ホスホジエステルの化学的性質は利用していない。

【0009】

この問題は、血清または細胞内分解を低減する化学修飾によって部分的に克服される。修飾は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはホスホロアミデート結合を用いる）、ヌクレオチド塩基（例えば５−プロピニル−ピリミジン）、または糖（例えば２‘−修飾糖）で試験されてきた（Ｕｈａｌｍａｎｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌ．Ｘ．，ｐｐ６４−８１ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９７））。２’−５’糖結合を用いて安定性を向上させようと試みてきた者もいる（例えば、米国特許第５，５３２，１３０号を参照されたい）。その他の変更も試みられてきた。しかしながら、これらの解決策のいずれも、完全に満足いくものではないことが分かっており、依然として、インビボの遊離治療用核酸には、限られた効能があるに過ぎない。

【0010】

加えて、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関して上述したように、治療用核酸が細胞膜を横断する能力が限られていることの問題（Ｖｌａｓｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：９５−１０８２（１９９４）を参照されたい）と、補体媒介性アナフィラキシー、凝固特性の変化、および血球減少のような全身毒性と関連する問題（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓe Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．４：２０１−２０６（１９９４））が残っている。

【0011】

効能を向上させようと試みるために、研究者達は、化学修飾または未修飾の治療用核酸を送達するために、脂質ベースの担体系も用いてきた。Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．４１：９９−１１９（１９９６）では、著者は、アニオン性（従来の）リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポソーム、融合性リポソーム、およびカチオン性脂質／アンチセンス凝集体を用いることに言及している。同様に、ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソーム中で全身投与されてきており、これらの核酸−脂質粒子は、ヒト以外の霊長類を含む哺乳類において標的タンパクのダウンレギュレーションを向上させることが報告されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４（２００６））。
この進歩にもかかわらず、当該技術分野においては、一般的な治療での使用に適した、改善された脂質−治療用核酸組成物に対するニーズが依然として存在する。これらの組成物は、核酸を高効率に封入し、薬物：脂質の比率が高く、封入核酸を血清中における分解および浄化から保護し、全身送達に適しており、封入核酸の細胞内送達をもたらすのが好ましい。加えて、これらの脂質−核酸粒子は、十分に耐性があり、かつ、有効量の核酸による患者の治療が、患者に対する有意な毒性および／またはリスクを伴わないように、十分な治療指数をもたらす必要がある。疾患の治療を含め、核酸を細胞の中に導入するための組成物、その組成物を作製する方法、および、その組成物を用いる方法を提供する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ａｇｒａｗａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３７６−３８７（１９９６）

【非特許文献2】Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：３２３−３３８（１９９３）

【非特許文献3】Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐ１４７−１６１ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ（Ｅｄｓ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ＲＰ ａｎｄ Ｉｚａｎｔ，ＪＧ；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）

【非特許文献4】Ｕｈａｌｍａｎｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌ．Ｘ．，ｐｐ６４−８１ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９７）

【非特許文献5】Ｖｌａｓｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：９５−１０８２（１９９４）

【非特許文献6】Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓe Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．４：２０１−２０６（１９９４）

【非特許文献7】Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．４１：９９−１１９（１９９６）

【非特許文献8】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４（２００６）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、そのカチオン性脂質の脂質部分（例えば疎水性鎖）の中心部分または遠位部分に位置する１つ以上の生分解性基を有するカチオン性脂質に関する。これらのカチオン性脂質は、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）のような活性剤を送達するための脂質粒子に組み込んでよい。生分解性基（１つまたは複数）をカチオン性脂質に組み込むと、代謝が加速し、身体からカチオン性脂質が除去された後、活性剤が標的区域に送達される。その結果、上記のカチオン性脂質の毒性は、生分解性基を含まない類似のカチオン性脂質よりも実質的に低い。

【0014】

１つの実施形態では、カチオン性脂質は、下記の式

【化1】

の化合物、またはその塩（例えばその製薬学的に許容可能な塩）であり、
上記の式中、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）であり、
Ｒ^１およびＲ^２に関しては、
（ｉ）Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、任意で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であるか、
（ｉｉ）Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、任意で置換されている複素環を形成するか、
（ｉｉｉ）Ｒ^１およびＲ^２のうちの一方は、任意で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり、もう一方は、（ａ）隣接する窒素原子、および（ｂ）その窒素原子に隣接する（Ｒ）_ａ基とともに、４〜１０員の複素環またはヘテロアリール（例えば６員環）を形成し、
Ｒの各存在は独立して、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−であり、
Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ_２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであるか（１つの好ましい実施形態では、Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈまたは炭素数１〜４のアルキルである）、
Ｒ^３およびＲ^４は、それらが直接結合している炭素原子と一体になって、シクロアルキル基を形成し、その際、炭素Ｃ＊に結合している各鎖中の３個以下のＲ基はシクロアルキル（例えばシクロプロピル）であり、
Ｑまでの点線は存在しないか、または結合であり、
Ｑまでの点線が存在しないときには、Ｑは存在しないか、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であるか、
Ｑまでの点線が結合のときには、（ｉ）ｂは０であり、（ｉｉ）Ｑ、およびその点線に隣接する第３炭素（Ｃ＊）は、５〜１０個の環原子を有する置換または非置換の単環または二環式複素環基を形成し（例えば、この複素環基中のヘテロ原子は、ＯおよびＳから選択し、好ましくはＯである）、
Ｑ^１およびＱ^２はそれぞれ独立して、存在しないか、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、または−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−であり、
Ｑ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、Ｈ、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−、アリール、またはコレステロール部分であり、
Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、およびＡ^４の各存在は独立して、−（ＣＲ^５Ｒ^５−ＣＲ^５＝ＣＲ^５）−であり、
Ｒ^５の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり、
Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ独立して、生分解性基（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−）であり、
Ｚは存在しないか、アルキレン、または−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−であり、
Ｚに結合している各−−−−−−は任意の結合で、Ｚが存在しないときには、Ｑ^３およびＱ^４が直接共有結合しないようになっており、
ａは１、２、３、４、５、または６であり、
ｂは０、１、２、または３であり、
ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｉ、ｊ、ｍ、ｎ、ｑ、およびｒはそれぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｇおよびｈはそれぞれ独立して、０、１、または２であり、
ｋおよびｌはそれぞれ独立して０または１であり、ｋおよびｌのうちの少なくとも１つは１であり、
ｏおよびｐはそれぞれ独立して、０、１、または２であり、
（ｉ）上記の化合物は、下記の部分

【化2】

を含まず、
この式中、−−−−は任意の結合であり、
（ｉｉ）Ｑ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、アスタリスク（＊）の付された第３炭素原子から８個以上の原子（例えば１２または１４個以上の原子）の鎖分、離れている。

【0015】

１つの実施形態では、（ｉ）Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、任意で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であるか、（ｉｉ）Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、任意で置換されている複素環を形成する。

【0016】

式（Ｉ）の化合物の好ましい実施形態では、
（ａ）Ｑ^１が生分解性基（例えば−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）であるときには、ｃは少なくとも４であり、
（ｂ）Ｑ^２が生分解性基であるときには、ｄは少なくとも４であり、
（ｃ）Ｑ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、アスタリスク（＊）の付された第３炭素原子から１０個以上の原子（例えば１２または１４個以上の原子）の鎖分、離れている。

【0017】

別の好ましい実施形態では、式（Ｉ）において生分解性基（例えば−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）に結合している炭素原子αまたはβは、１つまたは２つのアルキル基（例えば、−ＣＨ_３置換基のような１つの炭素数１〜４のアルキル基、または、２つの−ＣＨ_３置換基のような２つの炭素数１〜４のアルキル基）で置換されていても、スピロ環基（例えば、炭素数３のシクロアルキルのような炭素数３〜５のシクロアルキル）を有してもよい。例えば、生分解性基に結合している炭素原子αまたはβは独立して、下記から選択できる。

【化3】

（式中、ｎは４〜６である。）

【0018】

１つの実施形態では、Ｍ^１またはＭ^２基、および隣接する可変基（１つまたは複数）は、下記の基を形成する。

【化4】

（式中、ｎは４〜６である。）

【0019】

さらに別の実施形態は、下記の式

【化5】

のカチオン性脂質、またはその塩（例えばその製薬学的に許容可能な塩）であり、上記の式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ、ａ、およびｂは、式（Ｉ）に関しての定義と同じであり、
Ｑは存在しないか、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）であり、
Ｒ^９およびＲ^１０のそれぞれは独立して、１つ以上の生分解性基を有する炭素数１２〜２４のアルキル（例えば炭素数１２〜２０のアルキル）、炭素数１２〜２４のアルケニル（例えば炭素数１２〜２０のアルケニル）、または炭素数１２〜２４のアルコキシ（例えば炭素数１２〜２０のアルコキシ）であり、各生分解性基は独立して、上記の炭素数１２〜２４のアルキル基、アルケニル基、またはアルコキシ基に割り込んでいるか、上記の炭素数１２〜２４のアルキル基、アルケニル基、またはアルコキシ基の末端で置換されており、
（ｉ）上記の化合物は、下記の部分

【化6】

を含まず、
この式中、−−−−は任意の結合であり、
（ｉｉ）Ｒ^９およびＲ^１０の末端は、アスタリスク（＊）の付された第３炭素原子から８個以上の原子（例えば１２または１４個以上の原子）の鎖分、離れている。

【0020】

別の実施形態では、カチオン性脂質は、下記の式

【化7】

の化合物、またはその塩（例えばその製薬学的に許容可能な塩）であり、上記の式中、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）であり、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、任意で置換されている炭素数１〜４のアルキル、炭素数２〜４のアルケニル、炭素数２〜４のアルキニル、炭素数３〜６のシクロアルキル、（炭素数３〜６のシクロアルキル）炭素数１〜４のアルキル、または単環式複素環であるか、
Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、任意で置換されている５または６員の複素環（例えば炭素数５または６の複素環）を形成し、
Ｒの各存在は独立して、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−であり、
Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ_２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであるか（１つの好ましい実施形態では、Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈまたは炭素数１〜４のアルキルである）、
Ｒ^３およびＲ^４は、それらが直接結合している炭素原子と一体になって、炭素数３〜６のシクロアルキル基を形成し、その際、炭素Ｃ＊に結合している各鎖中の３個以下のＲ基は、シクロアルキル（例えばシクロプロピル）であり、
Ｑまでの点線は存在しないか、または結合であり、
Ｑまでの点線が存在しないときには、Ｑは存在しないか、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であるか、
Ｑまでの点線が結合であるときには、ｂは０であり、Ｑ、およびその点線に隣接する第３炭素（Ｃ＊）は、５〜１０個の環原子を有する置換または非置換の単環または二環式複素環基（例えば、この複素環基中のヘテロ原子は、ＯおよびＳから選択し、好ましくはＯである）を形成し、
Ｑ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、Ｈ、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−、アリール、またはコレステロール部分であり、
Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、およびＡ^４の各存在は独立して、−（ＣＲ^５Ｒ^５−ＣＲ^５＝ＣＲ^５）−であり、
Ｒ^５の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり、
Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｚは存在しないか、アルキレン、または−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−であり、
Ｚに結合している各−−−−−−は任意の結合で、Ｚが存在しないときには、Ｑ^３およびＱ^４が直接共有結合しないようになっており、
ａは１、２、３、４、５、または６であり、
ｂは０、１、２、または３であり、
ｄ、ｅ、ｉ、ｊ、ｍ、ｎ、ｑ、およびｒはそれぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｇおよびｈはそれぞれ独立して、０、１、または２であり、
ｄ＋３ｈの和は少なくとも４であり、ｅ＋３ｇの和は少なくとも４であり、
ｋおよびｌはそれぞれ独立して、０または１であり、ｋおよびｌのうちの少なくとも１つは１であり、
ｏおよびｐはそれぞれ独立して、０、１、または２であり、
Ｑ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、アスタリスク（＊）の付された第３炭素原子から８個以上の原子（例えば１２または１４個以上の原子）の鎖分、離れている。

【0021】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のＲ’は存在しないか、水素である。１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）中のＲ’は存在しないか、アルキル（例えばメチル）である。

【0022】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のＲ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、炭素数１〜４のアルキル（例えばメチルまたはエチル）である。

【0023】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のＲの各存在は独立して、−ＣＨ_２−、または−ＣＨ（ＣＨ_３）−である。

【0024】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のＱ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール、またはコレステロール部分である。

【0025】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のＡ^１、Ａ^２、Ａ^３、およびＡ^４の各存在は独立して、−（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ）−である。

【0026】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のＭ^１およびＭ^２はそれぞれ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である。

【0027】

式（ＩＡ−２）の化合物の１つの実施形態では、Ｚは存在せず、各−−−−−−は存在しない（すなわち、Ｑ^３およびＱ^４は直接共有結合していない）。

【0028】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のｅ＋３ｇ＋ｉ＋ｍ＋３ｏ＋ｑの和は、約８〜約２０である。別の実施形態では、式（ＩＡ−２）のｅ＋３ｇ＋ｉ＋ｍ＋３ｏ＋ｑの和は、約１２〜約２０である。

【0029】

１つの実施形態では、式（ＩＡ−２）のｄ＋３ｈ＋ｊ＋ｎ＋３ｐ＋ｒの和は、約８〜約２０である。別の実施形態では、式（ＩＡ−２）のｄ＋３ｈ＋ｊ＋ｎ＋３ｐ＋ｒの和は、約１２〜約２０である。

【0030】

別の実施形態では、カチオン性脂質は、下記の式

【化8】

の化合物であり、
上記の式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ、ａ、ｂ、Ｍ^１、およびＭ^２は、式（Ｉ）に関しての定義と同じであり、
Ｑは存在しないか、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）であり、
Ｒ^９およびＲ^１０のそれぞれは独立して、アルキレンまたはアルケニレンであり、
Ｒ^１１およびＲ^１２のそれぞれは独立して、任意でＣＯＯＲ^１３を末端とするアルキルまたはアルケニルであり、その際、各Ｒ^１３は独立して、アルキル（例えば、メチルまたはエチルのような炭素数１〜４のアルキル）であり、
Ｒ^９、Ｍ^１、およびＲ^１１は一体になって、少なくとも８個の炭素原子の長さ（例えば１２または１４個の炭素原子、またはそれを超える長さ）であり、
Ｒ^１０、Ｍ^２、およびＲ^１２は一体になって、少なくとも８個の炭素原子の長さ（例えば１２または１４個の炭素原子、またはそれを超える長さ）である。

【0031】

式（ＩＢ）の化合物の好ましい実施形態では、Ｒ^９およびＲ^１０はそれぞれ独立して、炭素数４〜１２のアルキレン、または炭素数４〜１２のアルケニレンであり、Ｍ^１およびＭ^２は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、Ｒ^１１およびＲ^１２は、炭素数４〜１２のアルキレン、または炭素数４〜１２のアルケニレンである。１つの実施形態では、Ｒ^９、Ｍ^１、およびＲ^１１は一体になって、１２〜２４個の炭素原子の長さである。別の実施形態では、Ｒ^９、Ｍ^１、およびＲ^１１は一体になって、１４〜１８個の炭素原子の長さである。１つの実施形態では、Ｒ^１０、Ｍ^２、およびＲ^１２は一体になって、１２〜２４個の炭素原子の長さである。別の実施形態では、Ｒ^１０、Ｍ^２、およびＲ^１２は一体になって、１４〜１８個の炭素原子の長さである。

【0032】

Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−（Ｒ）_ｂ−基は、後掲の表１に示されている頭部基を含め、本明細書に記載されている頭部基、およびそれらの塩のいずれであることもできる。１つの好ましい実施形態では、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−（Ｒ）_ｂ−は、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−、または（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（ＣＨ_３）＝Ｎ−Ｏ−である。

【0033】

さらに別の実施形態では、本発明のカチオン性脂質は、下記の式

【化9】

の化合物であり、
上記の式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ、ａ、およびｂは、式（Ｉ）に関しての定義と同じであり、
Ｑは存在しないか、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）であり、
Ｒ^９およびＲ^１０のそれぞれは独立して、その末端が−ＣＯＯＲ^１３のような生分解性基で置換されている炭素数１２〜２４のアルキルまたはアルケニルであり、各Ｒ^１３は独立して、アルキル（好ましくは、メチルまたはエチルのような炭素数１〜４のアルキル）である。

【0034】

式（ＩＣ）の化合物の好ましい実施形態では、Ｒ^９およびＲ^１０はそれぞれ独立して、炭素数１４〜１８のアルキレン、または炭素数１４〜１８のアルケニレンである。別の好ましい実施形態では、上記の生分解性基は−ＣＯＯＲ^１３であり、Ｒ^１３は炭素数１〜４のアルキル（メチルまたはエチルなど）である。

【0035】

Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−（Ｒ）_ｂ−基は、後掲の表１に示されている頭部基を含め、本明細書に記載されている頭部基のいずれであることもできる。１つの好ましい実施形態では、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−（Ｒ）_ｂ−は、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−、または（ＣＨ_３）_２Ｎ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ（ＣＨ_３）＝Ｎ−Ｏ−である。

【0036】

さらに別の実施形態は、下記の式

【化10】

の中間体、またはその塩（例えばその製薬学的に許容可能な塩）であり、
上記の式中、
Ｒ’は存在しないか、水素またはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）であり、
Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、任意で置換されているアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であるか、
Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、任意で置換されている複素環を形成し、
Ｒの各存在は独立して、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−であり、
Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アルコキシ、−ＮＨ_２、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであるか（１つの好ましい実施形態では、Ｒ^３およびＲ^４の各存在は独立してＨまたはアルキルであるか）、
Ｒ^３およびＲ^４は、それらが直接結合している炭素原子と一体になって、シクロアルキル基を形成し、その際、炭素Ｃ＊に結合している各鎖中の３個以下のＲ基は、シクロアルキル（例えばシクロプロピル）であり、
Ｑまでの点線は存在しないか、または結合であり、
Ｑまでの点線が存在しないときには、Ｑは存在しないか、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であるか、
Ｑまでの点線が結合であるときには、ｂは０であり、Ｑ、およびその点線に隣接する第３炭素（Ｃ＊）は、５〜１０個の環原子を有する置換または非置換の単環または二環式複素環基を形成し（例えば、この複素環基中のヘテロ原子は、ＯおよびＳから選択し、好ましくはＯである）、
Ｑ^１およびＱ^２はそれぞれ独立して、存在しないか、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、または−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−であり、
Ｑ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、Ｈ、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−、アリール、−ＯＨ、またはコレステロール部分であり、
Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、およびＡ^４の各存在は独立して、−（ＣＲ^５Ｒ^５−ＣＲ^５＝ＣＲ^５）−であり、
Ｒ^５の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり、
Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ独立して、生分解性基（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−）であり、
Ｚは存在しないか、アルキレン、または−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−であり、
Ｚに結合している各−−−−−−は任意の結合で、Ｚが存在しないときには、Ｑ^３およびＱ^４が直接共有結合しないようになっており、
ａは１、２、３、４、５、または６であり、
ｂは０、１、２、または３であり、
ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｉ、ｊ、ｍ、ｎ、ｑ、およびｒはそれぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｇおよびｈはそれぞれ独立して、０、１、または２であり、
ｋおよびｌはそれぞれ独立して、０または１であり、
ｏおよびｐはそれぞれ独立して、０、１、または２であり、
（ｉ）上記の化合物は、下記の部分

【化11】

を含まず、
この式中、−−−−は任意の結合であり、
（ｉｉ）Ｑ^３およびＱ^４はそれぞれ独立して、アスタリスク（＊）の付された第３炭素原子から８個以上の原子（例えば１２または１４個以上の原子）の鎖分、離れている。

【0037】

さらなる実施形態では、カチオン性脂質は、下記の式ＩＥ

【化12】

の化合物、またはその塩（例えばその製薬学的に許容可能な塩）であり、
上記の式中、
Ｒ^１は、−Ｌ^１ａ−（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）_α−［Ｌ^１ｂ−（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）_β］_γ−Ｌ^１ｃ−Ｒ^１ｃという式を有する炭素数１０〜３０の基であり、この式中、Ｌ^１ａは結合、−ＣＲ^１ａＲ^１ｂ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ^１ｄ−、−Ｓ−、またはこれらの組み合わせであり、
各Ｒ^１ａおよび各Ｒ^１ｂは独立して、Ｈか、ハロか、ヒドロキシか、シアノか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数１〜６のアルキルか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数３〜８のシクロアルキルか、−ＯＲ^１ｃか、−ＮＲ^１ｃＲ^１ｄか、アリールか、ヘテロアリールか、またはヘテロシクリルであり、
各Ｌ^１ｂは独立して、結合、−（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）_１−２−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ^１ｄ−、−Ｓ−、

【化13】

またはこれらの組み合わせであるか、下記の式

【化14】

を有することができ、この式中、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０、１、２、または３であり（ただし、ｊ、ｋ、およびｌの和が少なくとも１、かつ８以下であることを条件とする）、Ｒ^１ｆおよびＲ^１ｇはそれぞれ独立して、Ｒ^１ｂであるか、隣接するＲ^１ｆおよびＲ^１ｇは一体になって、任意で結合であるか、
下記の式

【化15】

を有することができ、この式中、ｊおよびｋはそれぞれ独立して、０、１、２、３、または４であり（ただし、ｊおよびｋの和が少なくとも１であることを条件とする）、Ｒ^１ｆおよびＲ^１ｇはそれぞれ独立して、Ｒ^１ｂであるか、隣接するＲ^１ｆおよびＲ^１ｇは一体になって、任意で結合であるか、
下記の式

【化16】

を有することができ、この式中、−Ａｒ−は、０〜６個の独立したＲ^１ａ基によって任意で置換されている６〜１４員のアリーレン基であるか、
下記の式

【化17】

を有することができ、この式中、−Ｈｅｔ−は、０〜６個の独立したＲ^１ａ基によって任意で置換されている３〜１４員のヘテロシクリレンまたはヘテロアリーレン基であり、
Ｌ^１ｃは、−（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）_１−２−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ^１ｄ−、−Ｓ−、

【化18】

またはこれらの組み合わせであり、
Ｒ^１ｃはＨか、ハロか、ヒドロキシか、シアノか、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、もしくはアリールによって任意で置換されている炭素数１〜６のアルキルか、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、もしくはアリールによって任意で置換されている炭素数３〜８のシクロアルキルか、アリールか、ヘテロアリールか、またはヘテロシクリルであるか、Ｒ^１ｃは、下記の式

【化19】

を有し、
Ｒ^１ｄはＨか、ハロか、ヒドロキシか、シアノか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数１〜６のアルキルか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数３〜８のシクロアルキルか、アリールか、ヘテロアリールか、またはヘテロシクリルであり、
αは０以上６以下であり、
各βは独立して、０以上６以下であり、
γは０以上６以下であり、
Ｒ^２は、−Ｌ^２ａ−（ＣＲ^２ａＲ^２ｂ）_δ−［Ｌ^２ｂ−（ＣＲ^２ａＲ^２ｂ）_ε]_ζ−Ｌ^２ｃ−Ｒ^２ｃという式を有する炭素数１０〜３０の基であり、この式中、Ｌ^２ａは結合、−ＣＲ^２ａＲ^２ｂ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ^２ｄ−、−Ｓ−、またはこれらの組み合わせであり、
各Ｒ^２ａおよび各Ｒ^２ｂは独立して、Ｈか、ハロか、ヒドロキシか、シアノか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数１〜６のアルキルか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数３〜８のシクロアルキルか、−ＯＲ^２ｃか、−ＮＲ^２ｃＲ^２ｄか、アリールか、ヘテロアリールか、またはヘテロシクリルであることができ、
各Ｌ^２ｂは独立して、結合、−（ＣＲ^２ａＲ^２ｂ）_１−２−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ^２ｄ−、−Ｓ−、

【化20】

またはこれらの組み合わせであることができるか、
下記の式

【化21】

を有することができ、この式中、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０、１、２、または３であり（ただし、ｊ、ｋ、およびｌの和が少なくとも１、かつ8以下であることを条件とする）、Ｒ^２ｆおよびＲ^２ｇはそれぞれ独立して、Ｒ^２ｂであるか、隣接するＲ^２ｆおよびＲ^２ｇは一体になって、任意で結合であるか、
下記の式

【化22】

を有することができ、この式中、ｊおよびｋはそれぞれ独立して、０、１、２、３、または４であり（ただし、ｊおよびｋの和が少なくとも１であることを条件とする）、Ｒ^２ｆおよびＲ^２ｇはそれぞれ独立して、Ｒ^２bであるか、隣接するＲ^２ｆおよびＲ^２ｇは一体になって、任意で結合であるか、
下記の式

【化23】

を有することができ、この式中、−Ａｒ−は、０〜６個の独立したＲ^２ａ基によって任意で置換されている６〜１４員のアリーレン基であるか、
下記の式

【化24】

を有することができ、この式中、−Ｈｅｔ−は、０〜６個の独立したＲ^２ａ基によって任意で置換されている３〜１４員のヘテロシクリレンまたはヘテロアリーレン基であり、
Ｌ^２ｃは、−（ＣＲ^２ａＲ^２ｂ）_１−２−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ^２ｄ−、−Ｓ−、

【化25】

またはこれらの組み合わせであり、
Ｒ^２ｃはＨか、ハロか、ヒドロキシか、シアノか、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、もしくはアリールによって任意で置換されている炭素数１〜６のアルキルか、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、もしくはアリールによって任意で置換されている炭素数３〜８のシクロアルキルか、アリールか、ヘテロアリールか、またはヘテロシクリルであるか、Ｒ^２ｃは下記の式

【化26】

を有し、
Ｒ^２ｄはＨか、ハロか、ヒドロキシか、シアノか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数１〜６のアルキルか、ハロ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシによって任意で置換されている炭素数３〜８のシクロアルキルか、アリールか、ヘテロアリールか、またはヘテロシクリルであり、
δは０以上６以下であり、
各εは独立して、０以上６以下であり、
ζは０以上６以下であり、
Ｌ_１はＣ（Ｒ^ａ）、−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｘＣ（Ｒ^ａ）−、またはＰ（Ｑ_２）であり、
Ｒ^ａはＨ、アルキル、アルコキシ、−ＯＨ、−Ｎ（Ｑ）Ｑ、または−ＳＱであり、
Ｌ_２は−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｘ−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｘ−、−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｘ−Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｘ−ＣＲ^５＝ＣＲ^５−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｙ−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｘ−ＣＲ^５＝ＣＲ^５−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｙ−、−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｘ−ＣＲ^５＝ＣＲ^５−（ＣＲ^５Ｒ^６）_ｙ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、Ｓ（Ｏ）、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｑ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）_２、−ＳＳ−、−Ｏ−Ｎ＝、＝Ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、またはヘテロシクリレンであり、
各ｘは独立して、０以上６以下であることができ、
各ｙは独立して、０以上６以下であることができ、
Ｒ^３は下記の式

【化27】

の基であり、
Ｙ_１はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、またはアルキニルであり、Ｙ_１は、０〜６個の独立したＲ_ｎによって任意で置換されており、
Ｙ_２はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、またはアルキニルであり、Ｙ_２は、０〜６個の独立したＲ_ｎによって任意で置換されており、
Ｙ_３は存在しないか、存在する場合には、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、またはアルキニルであり、Ｙ_３は、０〜６個の独立したＲ_ｎによって任意で置換されており、
Ｙ_４は存在しないか、存在する場合には、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、またはアルキニルであり、Ｙ_４は、０〜６個の独立したＲ_ｎによって任意で置換されているか、
Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３のうちのいずれか２つは、それらが結合しているＮ原子と一体になって、０〜６個の独立したＲ_ｎによって任意で置換されている３〜８員の複素環を形成するか、
Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３のすべてが、それらが結合しているＮ原子と一体になって、０〜６個の独立したＲ_ｎによって任意で置換されている二環式の５〜１２員の複素環を形成し、
各Ｒ_ｎは独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであることができ、
Ｌ_３は結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ_７Ｒ_８）_ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、またはこれらのうちのいずれか２つの組み合わせであり、
Ｌ_４は結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ_７Ｒ_８）_ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、またはこれらのうちのいずれか２つの組み合わせであり、
Ｌ_４は結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ_７Ｒ_８）_ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、またはこれらのうちのいずれか２つの組み合わせであり、
Ｒ_７およびＲ_８の各存在は独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであるか、
隣接する炭素原子上の２つのＲ_７基は一体になって、それぞれの炭素原子間で二重結合を形成できるか、
隣接する炭素原子上の２つのＲ_７基、および同じ隣接する炭素原子上の２つのＲ_８基は一体になって、それぞれの炭素原子間で三重結合を形成できるか、
Ｌ_３、Ｌ_４、またはＬ_５のいずれかのＲ_７またはＲ_８置換基は任意で、Ｌ_３、Ｌ_４、またはＬ_５のいずれかのＲ_７またはＲ_８置換基と一体になって、３〜８員のシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基を形成できるか、
Ｙ_１、Ｙ_２、またはＹ_３のいずれか１つは任意で、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＬ_５のいずれかのＲ_７またはＲ_８基、ならびに、それらが結合している原子と一体になって、３〜８員のヘテロシクリル基を形成でき、
各ａは独立して、０、１、２、または３であることができ、
Ｒ_５およびＲ_６の各存在は独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであることができ、
各Ｑは独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
各Ｑ_２は独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）Ｑ、アルキル、またはアルコキシである。

【0038】

いくつかの実施形態では、Ｌ^１は−Ｃ（Ｒ^５Ｒ^６）_ｘＣ（Ｒ_ａ）−であることができるか、Ｌ^１は−ＣＨ_２Ｃ（Ｒ_ａ）−であることができる。Ｌ^２は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−ＳＳ−、−Ｏ−Ｎ＝、または＝Ｎ−Ｏ−であることができる。Ｌ^２は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＳＳ−、または＝Ｎ−Ｏ−であることができる。

【0039】

いくつかの実施形態では、−Ｌ^１ａ−（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）_αは−（ＣＨ_２）_８−であることができる。−Ｌ^２ａ−（ＣＲ^２ａＲ^２ｂ）_δは−（ＣＨ_２）_８−であることができる。Ｌ^１ｂ−（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）_βはＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２、または

【化28】

であることができ、βは１、２、または３である。Ｌ^２ｂ−（ＣＲ^２ａＲ^２ｂ）_εはＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２、または

【化29】

であることができ、εは１、２、または３である。

【0040】

式ＩＥの化合物の１つの実施形態では、その化合物に存在する少なくとも１つのＬ^１ａ、Ｌ^１ｂ、Ｌ^１ｃ、Ｌ^２ａ、Ｌ^２ｂ、またはＬ^２ｃは、エステル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^１ａＲ^１ｂ）Ｃ（Ｏ）−のような生分解性基である。式ＩＥの化合物の別の実施形態では、その化合物に存在する少なくとも１つのＬ^１ａ、Ｌ^１ｂ、およびＬ^１ｃは生分解性基であり、化合物に存在する少なくとも１つのＬ^２ａ、Ｌ^２ｂ、またはＬ^２ｃは生分解性基（上述の生分解性基など）である。式ＩＥの化合物のさらに別の実施形態では、Ｒ^１のαは少なくとも４であり、Ｒ^２のδは少なくとも４であり、化合物に存在する少なくとも１つのＬ^１ａ、Ｌ^１ｂ、およびＬ^１ｃは生分解性基であり、化合物に存在する少なくとも１つのＬ^２ａ、Ｌ^２ｂ、またはＬ^２ｃは生分解性基（上述の生分解性基など）である。別の実施形態では、Ｒ^１および／またはＲ^２の炭素鎖は飽和している。さらに別の実施形態では、Ｒ^１および／またはＲ^２の炭素鎖は、１つまたは２つの二重結合を含む。

【0041】

さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、下記の式ＩＩ〜ＸＸＩＩＩ

【化30】

の化合物から選択した化合物、およびそれらの塩（例えばそれらの製薬学的に許容可能な塩）であり、
上記の式中、
ｍ、ｎ、ｏ、およびｐはそれぞれ個別に１〜２５であり、ただし、
（ｉ）式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（ＶＩ）、および（ＶＩＩ）では、ｍおよびｐがいずれも４以上であること、
（ｉｉ）式（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＸＩ）、および（ＸＸＩＩＩ）では、ｍが４以上であること、
（ｉｉｉ）式（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（ＸＩＩ）、および（ＸＩＩＩ）では、ｐが８以上（例えば１２もしくは１４、またはそれらを超える値）であることを条件とする。

【0042】

別の実施形態では、本発明は、
（ｉ）中心炭素原子と、
（ｉｉ）上記の中心炭素原子に直接結合している窒素含有頭部基と、
（ｉｉｉ）上記の中心炭素原子に直接結合している２つの疎水性テイル（各疎水性テイルは、上記の中心炭素原子に結合している炭素数８以上の脂肪族基（好ましくは炭素数１４以上の脂肪族基）を含み、この脂肪族基の１つまたは両方は、（ａ）生分解性基に割り込まれて、その生分解性基と上記の中心炭素原子との間に、少なくとも４つの炭素原子の鎖が存在するようになっているか、（ｂ）疎水性テイルの末端に、生分解性基を含む）と、
を有するカチオン性脂質またはその塩に関する。例えば、上記の生分解性基は、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、および−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−から選択する。

【0043】

さらに別の実施形態は、本発明のカチオン性脂質を含む脂質粒子である。１つの実施形態では、この脂質粒子は、本明細書に記載されているような式ＩＩ〜ＸＸＩＩＩのいずれかの化合物を含む。別の実施形態では、上記の脂質粒子は、本明細書に記載されているような式Ｉの化合物を含む。別の実施形態では、上記の脂質粒子は、本明細書に記載されているような式ＩＡ−１、ＩＡ−２、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、またはＩＥの化合物を含む。

【0044】

好ましい実施形態では、上記の脂質粒子は、中性脂質と、凝集を低減できる脂質できる脂質と、カチオン性脂質と、任意でステロール（例えばコレステロール）とを含む。好適な中性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭが挙げられるが、これらに限らない。凝集を低減できる好適な脂質としては、ＰＥＧ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、またはこれらの組み合わせのようなＰＥＧ脂質が挙げられるが、これらに限らない。

【0045】

上記の脂質粒子は、活性剤（例えば治療剤）をさらに含んでもよい。この活性剤は、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、またはリボザイムのような核酸であることができる。

【0046】

別の実施形態では、上記の脂質粒子は、本発明のカチオン性脂質と、中性脂質と、ステロールとを含む。上記の脂質粒子は、核酸のような活性剤をさらに含んでもよい。

【0047】

本発明のさらに別の実施形態は、本発明の脂質粒子と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。

【0048】

さらに別の実施形態は、被検体において核酸分子を送達する方法であって、その核酸分子とカチオン性脂質（またはその塩）とを含む脂質粒子を被検体に投与することを含み、上記のカチオン性脂質が、
（ｉ）中心炭素原子と、
（ｉｉ）上記の中心炭素原子に直接結合している窒素含有頭部基と、
（ｉｉｉ）上記の中心炭素原子に直接結合している２つの疎水性テイル（各疎水性テイルは、上記の中心炭素原子に結合している炭素数８以上の脂肪族基（好ましくは炭素数１４以上の脂肪族基）を含み、この脂肪族基の１つまたは両方は、（ａ）生分解性基に割り込まれて、その生分解性基と上記の中心炭素原子との間に、少なくとも４つの炭素原子の鎖が存在するようになっているか、（ｂ）疎水性テイルの末端に、生分解性基を含む）とを有する方法である。

【0049】

１つの実施形態では、上記のカチオン性脂質は、核酸分子が送達されるまで無傷のままであり、送達後、疎水性テイルがインビボで切断される。

【0050】

さらに別の態様は、細胞に本発明の脂質粒子を供給することによって、その細胞内で標的遺伝子の発現を調節する方法である。活性剤は、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、およびリボザイムから選択した核酸であることができる。

【0051】

さらに別の態様は、被検体に本発明の医薬組成物を投与することによって、その被検体におけるポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療する方法であり、その活性剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択した核酸であり、このｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。

【0052】

さらに別の態様は、被検体に本発明の医薬組成物を投与することによって、被検体におけるポリペプチドの過小発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療する方法であり、その活性剤は、上記のポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。

【0053】

さらに別の態様は、被検体に医薬組成物を投与することによって、被検体において免疫反応を誘発する方法であり、その活性剤は免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。

【0054】

さらに別の態様は、上記の組成物または脂質粒子を含む転写剤であり、その組成物または脂質粒子は核酸を含む。この転写剤は、細胞と接触させると、核酸をその細胞に効率的に送達できる。さらに別の態様は、上記の組成物または脂質粒子を得るか、または形成するかして、その組成物または脂質粒子を細胞と接触させることによって、核酸を細胞の内部に送達する方法である。

【0055】

その他の特徴および態様は、本明細書および特許請求の範囲から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】実施例１４に記載されているような脂質粒子中のカチオン性脂質を投与後のマウスの肝臓内のカチオン性脂質（化合物１〜３、および対照脂質）の経時濃度のグラフである。

【図2】実施例１４の化合物１および３の予想代謝経路を示す図である。

【図3】実施例１４に記載されているような脂質粒子中のカチオン性脂質を投与後のマウスの脾臓内のカチオン性脂質（化合物１〜３、および対照脂質）の経時濃度のグラフである。

【図4】実施例１４に記載されているような脂質粒子中のカチオン性脂質を投与後のマウスの血漿中のカチオン性脂質（化合物１〜３、および対照脂質）の経時濃度のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0057】

１つの態様では、本発明は、中性脂質と、凝集を低減できる脂質と、カチオン性脂質と、任意でステロールとを含む脂質粒子に関する。特定の実施形態では、この脂質粒子は、活性剤（例えば治療剤）をさらに含む。これらの脂質、脂質粒子、およびそれらを含む組成物、ならびに、治療剤を送達する目的、遺伝子およびタンパクの発現を調節する目的でそれらを用いることのさまざまな例示的な実施形態について、以下でさらに詳細に説明する。

【0058】

カチオン性脂質
１つの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ〜ＸＸＩＩＩの化合物である。別の実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＩ〜ＸＸＩＩＩのうちの１つの化合物である。１つの実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物である。別の実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＡ−１、ＩＡ−２、ＩＢ、ＩＣ、またはＩＤの化合物である。下記の開示内容は、式Ｉの化合物のさまざまな実施形態を表している。

【0059】

１つの実施形態では、Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ独立して、
−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−である。

【0060】

別の実施形態では、Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ独立して、
−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−である。

【0061】

さらに別の実施形態では、Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ独立して、
−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−である。

【0062】

別の実施形態では、Ｍ^１およびＭ^２はそれぞれ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。

【0063】

１つの実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ個別に、任意で置換されているアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環である。１つの実施形態では、Ｒ^１はアルキルであり、Ｒ^２はアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルである。１つの実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ個別に、アルキル（例えば、メチル、エチル、またはイソプロピルのような炭素数１〜４のアルキル）である。１つの実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２はいずれもメチルである。別の実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合している窒素原子と一体になって、任意で置換されている複素環（例えばＮ−メチルピペラジニル）を形成する。別の実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２のうちの１つは、

【化31】

である（例えば、Ｒ^１は、上記の２つの基のうちの１つであり、Ｒ^２は水素である）。

【0064】

１つの実施形態では、Ｒ’は水素またはアルキルである。別の実施形態では、Ｒ’は水素またはメチルである。１つの実施形態では、Ｒ’は存在しない。１つの実施形態では、Ｒ’は存在しないか、メチルである。

【0065】

Ｒ’が存在しない化合物では、Ｒ’が結合している窒素原子は正電荷を有しており、その化合物も負荷電対イオンを含む。この対イオンは、有機または無機アニオンのようないずれかのアニオンであることができる。アニオンの好適な例としては、トシレート、メタンスルホネート、アセテート、シトレート、マロネート、タートレート、サクシネート、ベンゾエート、アスコルベート、α−ケトグルタレート、α−グリセロフォスフェート、ハロゲン化物（例えばクロリド）、サルフェート、ニトレート、バイカーボネート、およびカーボネートが挙げられるが、これらに限らない。１つの実施形態では、上記の対イオンはハロゲン化物（例えばＣｌ）である。

【0066】

１つの実施形態では、各Ｒは独立して、−（ＣＲ^３Ｒ^４）−であり、このＲ^３およびＲ^４はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）である。例えば、１つの実施形態では、各Ｒは独立して、−（ＣＨＲ^４）−であり、この各Ｒ^４は独立して、Ｈまたはアルキル（例えば炭素数１〜４のアルキル）である。別の実施形態では、各Ｒは独立して、−ＣＨ_２−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−、または−ＣＨ（ｉＰｒ）−（ｉＰｒはイソプロピルである）である。別の実施形態では、各Ｒは−ＣＨ_２−である。

【0067】

別の実施形態では、Ｒ^５は、各ケースにおいて、水素またはメチルである。例えば、Ｒ^５は、各ケースにおいて、水素であることができる。

【0068】

１つの実施形態では、Ｑは存在しないか、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^４）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、または−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−である。１つの実施形態では、Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。

【0069】

１つの実施形態では、Ｑ^１およびＱ^２はそれぞれ独立して、存在しないか、−Ｏ−である。例えば、１つの実施形態では、Ｑ^１およびＱ^２はそれぞれ存在しない。別の実施形態では、Ｑ^１およびＱ^２はそれぞれ−Ｏ−である。

【0070】

１つの実施形態では、Ｑまでの点線は存在せず、ｂは０であり、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−、およびそれに隣接する第３炭素（Ｃ＊）は下記の基

【化32】

を形成し、この式中、ｎは１〜４である（例えば、ｎは２である）。

【0071】

１つの実施形態では、Ｑまでの点線は存在せず、ｂは０であり、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−、およびそれに隣接する第３炭素は下記の基

【化33】

を形成し、この式中、ｎは１〜４であり（例えば、ｎは２である）、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ、ａ、およびｂは、式（Ｉ）に関しての定義と同じである。１つの実施形態では、ａは３である。

【0072】

１つの実施形態では、Ｑまでの点線は存在せず、ｂは０であり、Ｒ’Ｒ^１Ｒ^２Ｎ−（Ｒ）_ａ−Ｑ−、およびそれに隣接する第３炭素は下記の基

【化34】

を形成し、この式中、ｎは１〜４であり（例えば、ｎは２である）、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ、ａ、およびｂは、式（Ｉ）に関しての定義と同じである。１つの実施形態では、ａは０である。例えば、この基は、下記の基

【化35】

であることができる。

【0073】

１つの実施形態では、ｂは０である。別の実施形態では、ａは２、３、または４であり、ｂは０である。例えば、１つの実施形態では、ａは３であり、ｂは０である。別の実施形態では、ａは３であり、ｂは０であり、Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。

【0074】

１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、下記のサブ式

【化36】

のものであり、この式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ^１、Ｒ^２、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ｑ^１、Ｑ^２、Ｑ^３、Ｑ^４、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、およびｒは、本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて定義されているとおりである。

【0075】

式（ＩＦ）の化合物の追加の実施形態では、下記のうちの１つ以上が適用される。
（ｉ）Ｑ^１およびＱ^２は存在しない
（ｉｉ）Ｍ^１およびＭ^２はいずれも−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である
（ｉｉｉ）ｇおよびｈはいずれも１である
（ｉｖ）ｇおよびｈはいずれも０である
（ｖ）ｃおよびｅの和は７である
（ｖｉ）ｄおよびｆの和は７である
（ｖｉｉ）ｃ、ｅ、およびｉの和は７である
（ｖｉｉｉ）ｄ、ｆ、およびｊの和は７である
（ｉｘ）ｉおよびｊはそれぞれ７である
（ｘ）ｋおよびｌはいずれも１である
（ｘｉ）ｍおよびｎはいずれも０である
（ｘｉｉ）ｍおよびｑの和は１であるか、ｍおよびｑの和は２である
（ｘｉｉｉ）ｍおよびｌの和は６である
（ｘｉｖ）ｒおよびｎの和は６である
（ｘｖ）ｐおよびｏはいずれも０である
（ｘｖｉ）ｎおよびｒの和は２であるか、ｎおよびｒの和は１である
（ｘｖｉｉ）Ｑ^３はＨである

【0076】

特定の実施形態では、本発明のカチオン性脂質に存在する生分解性基は、エステル（例えば−Ｃ（Ｏ）Ｏ−もしくは−ＯＣ（Ｏ）−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、オキシム（例えば−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｏ−もしくは−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−）、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−（ＮＲ^５）Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−から選択する。

【0077】

１つの実施形態では、カチオン性脂質の疎水性テイルの１つまたは両方の脂肪族基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む。

【0078】

本発明のカチオン性脂質（式（Ｉ）、ＩＡ−２、ＩＤ、ＩＥ、およびＩＦの化合物を含む）に適したコレステロール部分は、下記の式

【化37】

を有する。

【0079】

追加の実施形態としては、頭部基と、１つ以上の疎水性テイルと、その頭部基と１つ以上のテイルとの間のリンカーとを有するカチオン性脂質が挙げられる。この頭部基は、アミン、例えば、所望のｐＫ_ａを有するアミンを含むことができる。このｐＫ_ａは、カチオン性脂質の構造、特に頭部基の性質、例えば、アニオン性官能基、水素結合ドナー官能基、水素結合アクセプター基、疎水性基（例えば脂肪族基）、親水性基（例えばヒドロキシルもしくはメトキシ）、またはアリール基のような官能基の有無および位置による影響を受け得る。上記の頭部基アミンは、カチオン性アミン、一級、二級、または三級アミンであることができ、上記の頭部基は、１つのアミン基（モノアミン）、２つのアミン基（ジアミン）、３つのアミン基（トリアミン）、または、オリゴアミンまたはポリアミンのように４個以上のアミン基を含むことができる。上記の頭部基は、例えばイミダゾール基、ピリジン基、またはグアニジニウム基など、アミンよりも塩基性の強さが弱い官能基を含むことができる。上記の頭部基は双性イオン性であることができる。他の頭部基も好適である。

【0080】

上記の１つ以上の疎水性テイルは、２つの疎水性鎖を含むことができ、これらの鎖は同じであっても異なっていてもよい。上記のテイルは、脂肪族であることができ、例えば、炭素および水素から構成されていることができる（飽和または不飽和のいずれかであるが、芳香環を有さない）。上記のテイルは脂肪酸テイルであることができる。いくつかのこのような基としては、オクタニル、ノナニル、デシル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、α−リノレイル、ステアリドニル、リノレイル、γ−リノレニル、アラカドニル、およびオレイルが挙げられる。他の疎水性テイルも好適である。

【0081】

上記のリンカーとしては、例えば、グリセリドリンカー、非環式グリセリドアナログリンカー、または環状リンカー（スピロリンカー、二環式リンカー、および多環式リンカーを含む）を挙げることができる。上記のリンカーは、エーテル、エステル、フォスフェート、ホスホネート、ホスホロチオエート、スルホネート、ジスルフィド、アセタール、ケタール、イミン、ヒドラゾン、またはオキシムのような官能基を含むことができる。他のリンカーおよび官能基も好適である。

【0082】

１つの実施形態では、カチオン性脂質はラセミ混合物である。別の実施形態では、カチオン性脂質では、１つのジアステレオマーが多くなっている。例えば、そのようなカチオン性脂質のジアステレオマー過剰率は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％である。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質では、１つの鏡像異性体の方が多くなっている。例えば、そのような脂質の鏡像異性体過剰率は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％である。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質はキラル純であり、例えば単一の光学異性体である。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質では、１つの光学異性体が多くなっている。

【0083】

二重結合（例えば、炭素−炭素二重結合、または炭素−窒素二重結合）が存在する場合、その二重結合の立体配置で異性（すなわちシス／トランス、またはＥ／Ｚの異性）が存在し得る。二重結合の立体配置が化学構造中に示されている場合には、対応する異性体も存在し得ることが分かる。存在する異性体の量は、異性体の相対的安定性、および異性体間の変換に要するエネルギーに応じて変化し得る。したがって、実際上は、単一の立体配置のみに存在する二重結合もあれば、立体配置の非分離性平衡混合物として存在できる二重結合もある（例えば、異性体の相対的安定性が同程度であり、変換のエネルギーが低い場合）。

【0084】

いくつかのケースでは、不飽和二重結合は、不飽和環に置き換えることができる。この不飽和環は、不飽和脂環、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、またはシクロオクチル基であることができる。いくつかのケースでは、この環状基は、多環式基、例えば、二環式基または三環式基であることができる。二環式基は、架橋環であることも、縮合環であることも、スピロ構造を有することもできる。

【0085】

いくつかのケースでは、二重結合部分は、シクロプロピル部分に置き換えることができ、例えば、

【化38】

に置換できる。例えば、下記の部分は、２つの炭素−炭素二重結合を有し、そのそれぞれは独立して、環状部分、例えばシクロプロピル部分に置き換えることができる。したがって、

【化39】

に換わるものとしては、

【化40】

を挙げることができる。

【0086】

さらなる例として、

【化41】

に換わるものとしては、

【化42】

を挙げることができる。

【0087】

さらなる例として、

【化43】

に換わるものとしては、

【化44】

を挙げることができる。

【0088】

さらなる例として、

【化45】

に換わるものとしては、

【化46】

を挙げることができる。

【0089】

カチオン性脂質は１つ以上の生分解性基を含む。この生分解性基は、生物環境内、例えば、生体、器官、組織、細胞、または細胞小器官内で結合破壊反応を起こすことのできる１つ以上の結合を含む。生分解性結合を含む官能基としては、例えば、エステル、ジチオール、およびオキシムが挙げられる。生分解は、被検体に投与したときに、身体からの化合物の浄化に影響を及ぼす要因であり得る。生分解は、細胞ベースのアッセイで測定でき、このアッセイでは、カチオン性脂質を含む調合物を細胞に暴露させ、さまざまな時点でサンプルを採る。その脂質分画を上記の細胞から抽出し、分離して、ＬＣ−ＭＳによって解析できる。ＬＣ−ＭＳデータから、生分解の速度（例えばｔ_１／２の値として）を測定できる。

【0090】

例えば、下記の化合物

【化47】

は、各脂肪族鎖中にエステル結合を含み、生物環境内で、例えば、リパーゼまたはエステラーゼに例えば暴露されると、加水分解を起こし得る。上記の化合物の構造は、当然ながら、その化合物が生分解を起こす速度に影響を及ぼす。したがって、

【化48】

のような関連の化合物は、異なる生分解速度を示すと思われる。加水分解部位で上記の化合物の構造を変化させるほど、生分解速度への影響は大きくなると思われる。加水分解速度に影響を及ぼすことができるとともに、それによって、生分解速度と、被検体の身体からの浄化速度に影響を及ぼすことのできる修飾法の１つは、加水分解反応の脱離基が、二級アルコールではなく一級アルコールを有するようにすることである。

【0091】

例えば、理論に束縛されるものではないが、上記の化合物１および２は、図２に示されているように、代謝され得る。

【0092】

１つの実施形態では、本明細書に記載されている実施形態のうちのいずれかのカチオン性脂質のインビボ半減期（ｔ_１／２）（例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中）は、約３時間未満（約２．５時間未満、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満、約０．５時間未満、または約０．２５時間未満など）である。

【0093】

別の実施形態では、本明細書に記載されている実施形態のうちのいずれかのカチオン性脂質であって、生分解性基（１つまたは複数）を含むカチオン性脂質のインビボ半減期（ｔ_１／２）（例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中）は、生分解性基（１つまたは複数）を含まない同じカチオン性脂質のインビボ半減期の約１０％未満（例えば、約７．５％未満、約５％未満、約２．５％未満）である。

【0094】

いくつかのカチオン性脂質は好都合なことに、頭部基と組み合わせた疎水性基として表すことができる。例えば、下記の化合物

【化49】

は、下記のように、頭部基と疎水性基との組み合わせと考えることができる。

【化50】

【0095】

したがって、いくつかの好適な頭部基としては、下記の表１に示されているものが挙げられる。

【表1】

【0096】

いくつかの好適な疎水性テイル基としては、下記の表２に示されているものが挙げられる。

【表2】

【0097】

別の態様では、本発明は、式Ｉ〜ＸＸＩＩＩのいずれかの化合物を調製する方法に関する。好適な例示的合成法は、下記のスキームＡ〜Ｇに示されている。下記のスキーム中の可変基は、上記の式Ｉ〜ＸＸＩＩＩ中の同じ位置の可変基と同じである。

【0098】

【化51】

スキームＡにおける脂質鎖の長さ、およびリンカーの長さは変更できる。加えて、エステル官能基中のＲ基、および窒素原子上の置換基は、誘導体化できる。

【0099】

【化52】

スキームＢに示されているように、銅を媒介とするカップリングによって、末端官能基Ｒを有する脂質鎖を含むジ−インが得られ、これを還元して、脂質鎖を含むジ−エンを生成できる。リンカーおよび脂質鎖の長さは変更でき、官能置換基（Ｒ、Ｒ^１、Ｒ^２）は誘導体化できる。

【0100】

【化53】

上記の式中、Ｒｘはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、または置換アリールであり、頭部基は、表１に定義されている。

【0101】

スキームＣの頭部基は、本明細書に記載されているいずれの頭部基（例えば表１を参照されたい）であることもできる。

【0102】

【化54】

【0103】

【化55】

【0104】

【化56】

【0105】

【化57】

【0106】

本発明のカチオン性脂質の例としては、下記の表３〜１３に示されているもの、およびそれらの塩（それらの製薬学的に許容可能な塩を含む）が挙げられる。

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【0107】

表１４
下記の化合物は、本発明によるカチオン性脂質の合成において、中間体として用いてよい。

【表14】

【0108】

１つの実施形態では、本発明のカチオン性脂質は、下記の化合物、およびそれらの塩（それらの製薬学的に許容可能な塩を含む）から選択する。

【化58】

【0109】

カチオン性脂質としては、代替的な脂肪酸基、および、アルキル置換基が異なるジアルキルアミノ基を含む（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）その他のジアルキルアミノ基を有するものが挙げられる。Ｒ^１およびＲ^２がいずれも長鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルアルキル基である実施形態では、それらは同じであることも、異なることもできる。一般に、特に、ろ過滅菌の目的で、その複合体の大きさを約０．３マイクロメートル未満にするときには、飽和度の低いアシル鎖を有する脂質（例えばカチオン性脂質）の方が、サイズ調節が容易である。炭素鎖の長さが炭素数１０〜２０の範囲である、不飽和脂肪酸を含むカチオン性脂質が典型的である。その他の足場を用いて、アミノ基（例えば、カチオン性脂質のアミノ基）と、カチオン性脂質の脂肪酸または脂肪アルキル部分を分離することもできる。好適な足場は当業者に知られている。

【0110】

特定の実施形態では、カチオン性脂質は、少なくとも１つのプロトン化可能または脱プロトン化可能基を有し、その脂質が、生理的ｐＨ以下のｐＨ（例えばｐＨ７．４）においては正電荷を有し、第２のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨ以上のｐＨにおいては中性であるようになっている。このような脂質もカチオン性脂質と称される。当然ながら、ｐＨに応じてプロトンを付加または除去することが平衡プロセスであること、および、荷電または中性脂質への言及が、主流をなす種の性質を指すとともに、すべての脂質が、荷電または中性形態で存在する必要は必ずしもないことが分かるであろう。脂質は、１つ超のプロトン化可能または脱プロトン化可能基を有することも、双性イオン性であることもできる。

【0111】

特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質（すなわちカチオン性脂質）では、プロトン化可能基のｐＫ_ａは約４〜約１１の範囲である。典型的には、脂質のｐＫ_ａは約４〜約７であり、例えば、脂質粒子に組み込んだときには約５〜７（約５．５、および６．８）である。このような脂質は、低ｐＨの調合段階ではカチオン性となる一方で、粒子は概して（完全というわけではない）、ｐＨ７．４前後の生理的ｐＨで表面中和されることになる。約４〜７の範囲のｐＫ_ａの利点の１つは、脂質粒子の外面に付随する少なくとも一部の核酸が、生理的ｐＨでその静電相互作用を喪失し、単純な透析によって除去されることになり、その結果、その粒子の浄化に対する感受性が大きく低減される点である。脂質粒子内の脂質のｐＫ_ａの測定は、例えば、Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ ４０，１２７−１４４（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている方法を用いて、蛍光プローブ２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）を用いることによって、行うことができる。

【0112】

特定的な実施形態では、脂質は荷電脂質である。本明細書で使用する場合、「荷電脂質」という用語は、１つまたは２つの脂肪酸アシルまたは脂肪酸アルキル鎖と、四級アミノ頭部基とを有する脂質を含むことを意味する。この四級アミンは、恒久的な正電荷を有する。上記の頭部基は任意で、生理的ｐＨでプロトン化できる一級、二級、または三級アミンのようなイオン化基を含むことができる。四級アミンの存在によって、四級アミンを含まない（例えば、四級アミンが三級アミンに置き換えられている）構造的に類似の化合物中の基のｐＫａに対し、イオン化基のｐＫａを変えることができる。いくつかの実施形態では、荷電脂質は、「アミノ脂質」と称されている。例えば、２００９年１２月７日に提出された米国特許仮出願第６１／２６７，４１９号（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。

【0113】

上で具体的に説明したものに加えて、生理的ｐＨ前後で正味の正電荷を有する１つ以上の追加のカチオン性脂質も、本明細書に記載されている脂質粒子および組成物に含めてもよい。このようなカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）、３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限らない。加えて、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）のようなカチオン性脂質の多数の市販の調製物を用いることができる。特定的な実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。

【0114】

中性脂質
本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、１つ以上の中性脂質も含んでもよい。中性脂質は、存在するときには、生理的ｐＨにおいて非荷電または中性双性イオン性形態のいずれかで存在する多数の脂質種のうちのいずれであることができる。このような脂質としては例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドが挙げられる。本明細書に記載されている粒子中で用いる中性脂質の選択は一般に、例えばリポソームのサイズ、および血流中におけるリポソームの安定性を検討することによって導き出す。好ましくは、中性脂質構成成分は、２つのアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。さまざまな鎖長および飽和度のさまざまなアシル鎖基を有する脂質は入手可能であり、あるいは、周知の技法によって単離または合成してよい。１つの実施形態群では、炭素鎖長が炭素数１０〜２０の範囲である飽和脂肪酸を含む脂質が好ましい。別の実施形態群では、炭素鎖長が炭素数１０〜２０の範囲であるモノまたはジ不飽和脂肪酸を有する脂質を用いる。加えて、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖との混合物を有する脂質を用いることができる。好ましくは、用いる中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、またはいずれかの関連するホスファチジルコリンである。これらの中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、または、セリンおよびイノシトールのような他の頭部基を有するリン脂質から構成されていてもよい。

【0115】

凝集を低減できる脂質
本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、凝集を低減できる脂質も１つ以上含んでよい。形成中に粒子の凝集を低減する脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、およびポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）（米国特許第６，３２０，０１７号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されているものなど）が挙げられる。ＰＥＧ、Ｇｍ１、またはＡＴＴＡのように、非荷電、親水性、立体障害部分を有する他の化合物のうち、調合中に凝集を防ぐ化合物も脂質にカップリングできる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号、および同第５，８８５，６１３号に記載されており、これらの特許のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。典型的には、凝集を低減する目的で選択する脂質構成成分の濃度は、約１〜１５％（脂質のモルパーセント）である。

【0116】

ＰＥＧ部分を脂質ベシクルの表面に固定するさまざまな「アンカリング」脂質部分を有することができるＰＥＧ修飾脂質（または脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の具体例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、米国特許第５，８２０，８７３号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ならびに、ＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。特に好ましいのは、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールである。

【0117】

ＰＥＧまたはＡＴＴＡのような立体的に大きい部分を脂質アンカーにコンジュゲートさせる実施形態では、脂質アンカーの選択は、そのコンジュゲートにおける脂質粒子との結合がどのようなタイプのものであるかに左右される。粒子が、おそらく約数日で、循環血液から浄化されるまでは、ｍＰＥＧ（ｍｗ２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、リポソームと結合したままとなることは周知である。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０のようなその他のコンジュゲートも、同様の滞留能力を有する。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に暴露されると、いくつかのアッセイでは６０分未満のｔ_１／２で、調合物外に急速に交換される。米国特許第５，８２０，８７３号に示されているように、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、および立体障害頭部基のサイズという少なくとも３つの特徴が、交換速度に影響を及ぼす。これらの特徴の好適な変形形態を有する化合物が有用である場合がある。いくつかの治療用途では、ＰＥＧ修飾脂質をインビボで核酸−脂質粒子から急速に喪失させること、すなわち、ＰＥＧ修飾脂質が比較的短い脂質アンカーを有することになるのが好ましい場合がある。別の治療用途では、核酸−脂質粒子が、より長い循環血漿中滞留時間を示すこと、すなわち、ＰＥＧ修飾脂質が、比較的長い脂質アンカーを有することになるのが好ましい場合がある。

【0118】

なお、凝集を防ぐ化合物は、適正に機能することを目的とする脂質のコンジュゲーションを必ずしも必要としない。溶液中の遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡが、凝集を防ぐのに十分である場合もある。調合後、粒子が安定である場合、被検体への投与前に、ＰＥＧまたはＡＴＴＡを透析することができる。

【0119】

脂質粒子
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載されているカチオン性脂質を１つ以上含む脂質粒子に関する。１つの実施形態では、この脂質粒子は、式Ｉ〜ＸＸＩＩＩの１つ以上の化合物を含む。別の実施形態では、脂質粒子は、式ＩＩ〜ＸＸＩＩＩの１つ以上の化合物を含む。別の実施形態では、脂質粒子は、式Ｉの１つ以上の化合物を含む。別の実施形態では、脂質粒子は、式ＩＡ−１、ＩＡ−２、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、またはＩＥの化合物を含む。

【0120】

脂質粒子としてはリポソームが挙げられるが、これらに限らない。本明細書で使用する場合、リポソームは、水性の内部を取り囲む脂質含有膜を有する構造体である。リポソームは１つ以上の脂質膜を有してよい。リポソームは、一層であることも（単層リポソームと称される）、多層であることも（多重膜リポソームと称される）できる。核酸と複合するときには、脂質粒子はリポプレックスであってよく、このリポプレックスは、ＤＮＡ層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層から構成されている。

【0121】

上記の脂質粒子は、１つ以上の追加の脂質、および／またはコレステロールのようなその他の構成要素をさらに含んでもよい。その他の脂質は、脂質の酸化を防ぐ目的、またはリガンドをリポソーム表面に結合させる目的のようなさまざまな目的で、リポソーム組成物に含めてよい。両親媒性、中性、カチオン性、およびアニオン性脂質を含め、多数の脂質のうちのいずれも、リポソームに存在してよい。このような脂質は単独で用いることも、組み合わせて用いることもできる。

【0122】

脂質粒子に存在してもよい追加の構成成分としては、ポリアミドオリゴマー（例えば米国特許第６，３２０，０１７号（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい）、ペプチド、タンパク、洗浄剤、脂質−誘導体（ホスファチジルエタノールアミンにカップリングしているＰＥＧ、およびセラミドにコンジュゲートしているＰＥＧなど）のような二層安定化構成成分（米国特許第５，８８５，６１３号（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい）が挙げられる。

【0123】

１つの実施形態では、脂質粒子は、第２のアミノ脂質またはカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、および、形成中に脂質粒子の凝集を低減する目的で選択した脂質のうちの１つ以上を含む。形成中における脂質粒子の凝集の低減は、形成中に電荷によって誘発される凝集を防ぐ粒子の立体安定化によってもたらすことができる。

【0124】

脂質粒子は２つ以上のカチオン性脂質を含むことができる。これらの脂質は、異なる有益な特性を付与する目的で選択することができる。例えば、アミンｐＫ_ａ、化学的安定性、循環血液における半減期、組織における半減期、組織内への正味蓄積量、または毒性のような特性が異なるカチオン性脂質を脂質粒子中で用いることができる。具体的には、混合脂質粒子の特性が、個々の脂質のうちの単一の脂質粒子の特性よりも望ましくなるように、カチオン性脂質を選択することができる。

【0125】

カチオン性脂質の正味組織蓄積量、および長期毒性（存在する場合）は、所定の調合物において単一のカチオン性脂質を選択する代わりに、カチオン性脂質の混合物を選択することによって、好都合な形で調節できる。このような混合物は、薬物の封入および／または放出の改善も提供することができる。カチオン性脂質の組み合わせは、調合物中の単一のカチオン性脂質と比べると、全身的安定性に影響を及ぼし得る。

【0126】

１つの例では、構造的に類似する一連の化合物は、例えば１ｐＫ_ａ未満の単位、１〜２ｐＫ_ａの単位の範囲、または２ｐＫ_ａを超える単位の範囲に及ぶさまざまなｐＫ_ａ値を有し得る。その群の中では、その範囲の中間のｐＫ_ａは、その範囲の終端の方のｐＫ_ａ値を有する化合物との比較における、有益な特性の増強（効率の向上）、または不利益な特性の低減（例えば毒性の低下）と関係があることが明らかになる場合もある。このようなケースでは、脂質粒子中で併せて用いるものとして、その範囲の上限および下限の方のｐＫ_ａ値を有する２つ（または２つ超）の異なる化合物を選択することができる。このようにして、脂質粒子の正味の特性（例えば、局所ｐＨの関数としての電荷）は、ｐＫ_ａ値範囲の中央の単一の脂質を含む粒子の特性により近づけることができる。構造的に異なるカチオン性脂質（例えば、上記の構造的に類似する一連の化合物の一部ではないもの）も混合脂質粒子中で用いることができる。

【0127】

いくつかのケースでは、２つ以上の異なるカチオン性脂質は、大きく異なるｐＫ_ａ値、例えば３以上のｐＫ_ａ単位分異なる値を有してよい。このケースでは、混合脂質粒子の正味の挙動は、中間のｐＫ_ａを有する単一の脂質粒子の挙動に必ずしも似ることにはならない。むしろ、正味の挙動は、ｐＫ_ａ値の異なる２つの別個のプロトン化可能（または、場合の応じて脱プロトン化可能）部位を有する粒子の挙動となる場合がある。単一の脂質のケースでは、ｐＨがｐＫ_ａ未満からｐＫ_ａ超に動くのに応じて、実際にプロトン化されるプロトン化可能部位の部分は、大幅に変化する（ｐＨがｐＫ_ａ値に等しいときには、プロトン化可能部位の５０％がプロトン化される）。２つ以上の異なるカチオン性脂質が、大幅に異なるｐＫ_ａ値を有し得る（例えば３以上のｐＫ_ａ単位分異なる）とともに、脂質粒子中で組み合わされているときには、その脂質粒子は、ｐＨが変化するのに応じて、非プロトン化状態からプロトン化状態への、よりなだらかな遷移を見せることができる。

【0128】

別の例では、他の検討事項に基づき、２つ以上の脂質を選択してよい。例えば、１つの脂質自体が極めて有効であるが、中程度の毒性である場合、その脂質よりも有効性は低いが、毒性も弱い脂質と組み合わせてよい。いくつかのケースでは、この組み合わせは、中程度の有効性しか有さず、毒性の低減もほんのわずかであると予測される場合でも、高い有効性を保つが、毒性が大きく低減されることもある。

【0129】

この選択は、実験によって割り出すことのできる特徴、例えば、実験結果から数値を割り当てることのできる特徴の測定値によって導き出すことができる。実験によって割り出すことのできる特徴としては、安全性の測定値、効能の測定値、所定の生分子との相互作用の測定、またはｐＫ_ａを挙げることができる。

【0130】

安全性の測定値としては、残存率、ＬＤ_５０、または、組織損傷（例えば肝臓の肝臓酵素、筋肉のＣＰＫ、腎臓のイオンバランス）と関連するバイオマーカー（血清バイオマーカーなど）のレベルを挙げてよい。効能の測定値は、治療剤が効果をもたらしているか、特には、治療剤が所望の効果をもたらしているか、および／または、治療剤がどの程度、所望の効果をもたらしているか、例えば、疾患、障害、またはその他の病態を治療、予防、改善、またはその他の形で好転させているかを示すいずれかの測定値であることができる。効能の測定値は、間接的な測定値であることができ、例えば、治療剤が、細胞レベルで特定の効果をもたらすように意図されている場合、細胞培養物に対するその効果の測定値が、効能の測定値であることができる。所定の生分子との相互作用の測定値としては、特定のタンパクへの結合のＫ_ｄ、または、その特徴の測定値、細胞膜、エンドソーム膜、核膜などの細胞サブ構造体を含む他の脂質との相互作用の度合いまたは程度などを挙げることができる。

【0131】

カチオン性脂質は、作用機構、例えば、どのような状況下で、またはどの程度まで、その脂質が所定の生分子と相互作用するかに基づき選択することができる。例えば、第１のカチオン性脂質は、部分的には、ＡｐｏＥに依存する機構と関連するという理由から選択することができ、第２のカチオン性脂質は、部分的には、ＡｐｏＥと独立した機構と関連するという理由から選択することができる。

【0132】

例えば、脂質粒子は、例えば国際公開第２００９／０８６５５８号、および２００８年１０月９日に提出された米国特許仮出願第６１／１０４，２１９号（これらの特許のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されているカチオン性脂質とそれらのエステルアナログの混合物も含むことができる。別の例では、脂質粒子は、脂質、例えば、２０１０年１月２９日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ１０／２２６１４号に記載されている脂質Ａ、および、２００９年５月５日に提出された米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号に記載されている脂質、例えば式Ｖまたは式ＶＩの脂質の混合物を含むことができる。

【0133】

特定の実施形態では、ある細胞型または組織に特異的な標的化部分を用いて、上記の脂質粒子を標的にするのが望ましい。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク、ビタミン（例えばリボフラビン）、およびモノクローナル抗体のようなさまざまな標的化部分を用いて、脂質粒子を標的にすることは、既に説明されてきている（例えば米国特許第４，９５７，７７３号、および同第４，６０３，０４４号（これらの特許のそれぞはれ、参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい）。この標的化部分は、タンパク全体またはその断片を含むことができる。標的化機構では一般に、標的部分が、標的、例えば細胞表面受容体との相互作用で利用可能であるような形で、脂質粒子の表面上に標的化作用物質を配置する必要がある。例えばＳａｐｒａ，Ｐ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，ＴＭ、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２（２００３）、およびＡｂｒａ，ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１−３，（２００２）に記載されているものを含め、多種多様な標的化作用物質および方法が当該技術分野において知られているとともに、利用可能である。

【0134】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖のような親水性ポリマー鎖の表面コーティングを有する脂質粒子、すなわちリポソームを標的化で用いることが提案されている（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２３７：９９−１０８（１９９５）、ＤｅＦｒｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１８：６１０１−６１０４（１９９６）、Ｂｌｕｍｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１４９：１８０−１８４（１９９３）、Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）、米国特許第５，０１３５５６号、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：２９６−２９９（１９９３）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５３：７１−７４（１９９４）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｉｎ Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｃｈａｐｔｅｒ ９（Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｅｄｓ）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ（１９９５））。１つのアプローチでは、脂質粒子を標的とする、抗体のようなリガンドは、脂質粒子を形成する、脂質の極性頭部基に結合させる。別のアプローチでは、標的化リガンドは、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位端に結合させる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）、Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８８：１１５−１１８（１９９６））。

【0135】

標的作用物質をカップリングする標準的な方法を用いることができる。例えば、標的作用物質の結合のために活性化できるホスファチジルエタノールアミン、または、脂質−誘導体化ブレオマイシンのような誘導体化脂肪親和性化合物を用いることができる。抗体標的リポソームは、例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを用いて構築できる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０）、およびＬｅｏｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８−２４５１（１９９０）を参照されたい）。抗体コンジュゲーションのその他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されており、その教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。標的化部分の例としては、新生物または腫瘍と関連する抗原を含め、細胞構成成分に特異的なその他のタンパクも挙げることができる。標的化部分として用いるタンパクは、共有結合を介してリポソームに結合させることができる（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい）。その他の標的化法としては、ビオチン−アビジン系が挙げられる。

【0136】

いくつかの実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質と融合促進脂質との混合物を含む。脂質粒子は、中性脂質、ステロール、ＰＥＧ修飾脂質、またはこれらの組み合わせをさらに含むことができる。例えば、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質（例えばＤＰＰＣ）、および中性脂質を含むが、ステロール、またはＰＥＧ修飾脂質を含まないことができる。脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、および中性脂質を含むが、ステロールまたはＰＥＧ修飾脂質を含まないことができる。脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、およびＰＥＧ修飾脂質を含むが、ステロールまたは中性脂質を含まないことができる。脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、および中性脂質を含むが、ＰＥＧ修飾脂質を含まないことができる。脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、およびＰＥＧ修飾脂質を含むが、中性脂質を含まないことができる。脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質を含むが、ステロールを含まないことができる。脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、中性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質を含むことができる。

【0137】

１つの例示的な実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質と、融合促進脂質と、中性脂質（カチオン性脂質以外）と、ステロール（例えばコレステロール）と、ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）との混合物を含む。特定の実施形態では、脂質混合物は、カチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質からなるか、本質的にこれらからなる。さらに好ましい実施形態では、脂質粒子は、約２０〜７０％のカチオン性脂質：０．１〜５０％の融合促進脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比の上記脂質混合物を含む。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、０．５〜５０％、１〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、または１５％〜３５％のモル比で存在することができる。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、０．５〜５０％、１〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、または１５％〜３５％のモル比で存在することができる。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、１０〜５０％、２０〜５０％、または３０〜５０％のモル比で存在することができる。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、０．５〜４５％、１〜４０％、１％〜３５％、１％〜３０％、または１％〜２０％のモル比で存在することができる。

【0138】

さらに好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、約２０〜７０％のカチオン性脂質：０．１〜５０％の融合促進脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比の上記脂質混合物からなるか、このような脂質混合物から本質的になる。

【0139】

特定的な実施形態では、脂質モル比（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）は、約４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０、または５２／１３／３０／５であり、この混合物は、０．１〜５０％、０．１〜５０％、０．５〜５０％、１〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、または１５％〜３５％のモル比の融合促進脂質とさらに組み合わされており、換言すると、脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡが４０／１０／４０／１０の混合物は、５０％のモル比の融合促進ペプチドと組み合わされており、得られた脂質粒子の総モル比（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ／融合促進ペプチド）は２０／５／２０／５／５０であることができる。別の実施形態群では、これらの組成物中の中性脂質ＤＳＰＣは、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置き換えられている。

【0140】

本明細書に記載されている脂質粒子は、１つ以上の治療剤をさらに含んでもよい。したがって、脂質粒子および活性剤を含む組成物であって、その活性剤が脂質粒子と結合している組成物を提供する。特定的な実施形態では、この活性剤が治療剤である。特定的な実施形態では、この活性剤は、脂質粒子の水性の内部に封入されている。別の実施形態では、上記の活性剤は、脂質粒子の１つ以上の脂質層内に存在する。別の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の外側または内側の脂質表面に結合している。

【0141】

本明細書で使用する場合、「完全封入」とは、遊離核酸を有意に分解するものである血清またはヌクレアーゼアッセイへの暴露後に、その粒子中の核酸が有意には分解されないことを示す。完全封入系では、遊離核酸の１００％を通常分解するものである処理において、好ましくは２５％未満の粒子核酸が分解され、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の粒子核酸が分解される。あるいは、完全封入は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって判断してもよい。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸染色法である（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）。完全封入は、粒子が血清安定性を有すること、すなわち、インビボ投与しても、粒子が急速には、その粒子の構成成分部分に分解しないことも暗に示す。

【0142】

１つの実施形態では、脂質粒子は、本発明のカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、およびＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態では、脂質粒子はカチオン性脂質をモルベースで約２５％〜約７５％、例えば、モルベースで約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％、または約４０％含む。１つの実施形態では、脂質粒子は中性脂質をモルベースで約０％〜約１５％、例えば、モルベースで約３〜約１２％、約５〜約１０％、約１５％、約１０％、約７．５％、約７．１％、または約０％含む。１つの実施形態では、中性脂質はＤＰＰＣである。１つの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。

【0143】

１つの実施形態では、調合物は、ステロールをモルベースで約５％〜約５０％、例えば、モルベースで約１５〜約４５％、約２０〜約４０％、約４８％、約４０％、約３８．５％、約３５％、約３４．４％、約３１．５％、または約３１％含む。１つの実施形態では、ステロールはコレステロールである。

【0144】

１つの実施形態では、脂質粒子は、ＰＥＧ修飾脂質をモルベースで約０．１％〜約２０％、例えば、モルベースで約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１０％、約５％、約３．５％、約１．５％、約０．５％、または約０．３％含む。１つの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。１つの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである。１つの実施形態では、本発明の脂質粒子は、モルベースで２５〜７５％のカチオン性脂質、０．５〜１５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、および０．５〜２０％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0145】

１つの実施形態では、本発明の脂質粒子は、モルベースで３５〜６５％のカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0146】

１つの実施形態では、本発明の脂質粒子は、モルベースで４５〜６５％のカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、および０．５〜５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。１つの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）である。

【0147】

１つの実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡ比は少なくとも約０．５：１、少なくとも約１：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約１１：１、または少なくとも約３３：１である。１つの実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡ比は約１：１〜約３５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１５：１、または約５：１〜約１３：１である。１つの実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡ比は約０．５：１〜約１２：１である。

【0148】

１つの実施形態では、本発明の脂質粒子はナノ粒子である。追加の実施形態では、本発明の脂質粒子の平均径サイズは約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ（約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば約５０ｎｍ〜約２００ｎｍなど）である。

【0149】

１つの実施形態では、本明細書に記載されている実施形態のうちのいずれかのカチオン性脂質を含む脂質粒子のインビボ半減期（ｔ_１／２）（例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中の半減期）は、約３時間未満（約２．５時間未満、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満、約０．５時間未満、または約０．２５時間未満など）である。

【0150】

別の実施形態では、本明細書に記載されている実施形態のうちのいずれかのカチオン性脂質を含む脂質粒子のインビボ半減期（ｔ_１／２）（例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中の半減期）は、生分解性基（１つまたは複数）を含まない同じカチオン性脂質のインビボ半減期の約１０％未満（例えば約７．５％未満、約５％未満、約２．５％未満）である。

【0151】

追加の構成成分
本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、アポリポタンパクをさらに含むことができる。本明細書で使用する場合、「アポリポタンパク」または「リポタンパク」という用語は、当業者に知られているアポリポタンパク、ならびに、それらの変異体およびそれらの断片と、下記のアポリポタンパクアゴニスト、そのアナログまたは断片を指す。

【0152】

好適なアポリポタンパクとしては、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥ、ならびに、それらの活性多型、アイソフォーム、変異体、突然変異体、および、断片またはトランケート型が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、アポリポタンパクは、チオール含有アポリポタンパクである。「チオール含有アポリポタンパク」とは、少なくとも１つのシステイン残基を含むアポリポタンパク、変異体、断片、またはアイソフォームを指す。最も一般的なチオール含有アポリポタンパクは、１つのシステイン残基を含むＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ）およびＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐ）である（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｙｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２９７：２０６−１３、Ｂｉｅｌｉｃｋｉ ａｎｄ Ｏｄａ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：２０８９−９６）。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＥ２、およびＡｐｏＥ３もチオール含有アポリポタンパクである。単離ＡｐｏＥ、ならびに／または、その活性断片およびポリペプチドアナログは、その、組み換え技術によって作製した形態を含め、米国特許第５，６７２，６８５号、同第５，５２５，４７２号、同第５，４７３，０３９号、同第５，１８２，３６４号、同第５，１７７，１８９号、同第５，１６８，０４５号、同第５，１１６，７３９号（これらの開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＡｐｏＥ３は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ｅ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏ−Ｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）２５６：９０７７−９０８３、およびＲａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｙｐｅｒｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）７９：４６９６−４７００に開示されている。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ００３９６も参照されたい。

【0153】

特定の実施形態では、アポリポタンパクは、その成熟型、そのプレプロアポリポタンパク形態、またはそのプロアポリポタンパク形態であることができる。前駆物質および成熟形態のＡｐｏＡ−Ｉ（Ｄｕｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：１４２４−２９）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（Ｋｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：（３）１６７９−８７、Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１６３２−３５）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１４）：８６３７−４６、Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１５）：９９２９−３５）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（２）：３７３−８３）、およびＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１４）：８９９３−９０００）のホモおよびヘテロダイマー（実現可能な場合）も用いることができる。

【0154】

特定の実施形態では、アポリポタンパクは、そのアポリポタンパクの断片、変異体、またはアイソフォームであることができる。「断片」という用語は、天然アポリポタンパクのアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有するとともに、その断片が、天然アポリポタンパクの活性（脂質結合特性を含む）を保持するいずれかのアポリポタンパクを指す。「変異体」とは、そのアポリポタンパクのアミノ酸配列を置換または変更したものであって、その置換または変更、例えばアミノ酸残基の付加および欠失によって、天然アポリポタンパクの活性（脂質結合特性を含む）が失われないものを意味する。したがって、変異体は、本明細書に示されている天然アポリポタンパクと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパクまたはペプチドであって、１つ以上のアミノ酸残基が化学的に類似のアミノ酸で保存的に置換されたタンパクまたはペプチドを含むことができる。保存的置換の例としては、少なくとも１つの疎水性残基（イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなど）を別の疎水性残基に置換することが挙げられる。同様に、例えば少なくとも１つ親水性残基の置換、例えば、アルギニンおよびリシン間の置換、グルタミンおよびアスパラギン間の置換、ならびに、グリシンおよびセリン間の置換（米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、および同第６，０４６，１６６号を参照されたい）などが保存的置換である。「アイソフォーム」という用語は、同じ機能、より高い機能、または部分的な機能と、類似の配列、同一の配列、または部分的な配列とを有するタンパクを指し、同じ遺伝子の産物であってもなくてもよく、通常は組織特異的である（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１、Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５、Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６、Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１）：４６８−７４、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０、Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２、Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４、Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８、Ｓａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４０（１−３）：１８１−７、Ｗｅｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００（１−３）：４８１−９２、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３３）：２９９１９−２６、Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（２３）：１４８８８−９３、および米国特許第６，３７２，８８６号を参照されたい）。

【0155】

特定の実施形態では、本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、アポリポタンパクのキメラ構造を含む。例えば、アポリポタンパクのキメラ構造は、虚血再灌流保護特性を有するアポリポタンパクドメインと結合している脂質結合能力の高いアポリポタンパクドメインからなることができる。アポリポタンパクのキメラ構造は、１つのアポリポタンパク中に別個の領域を含む構造（すなわち同種構造）であることができ、あるいは、キメラ構造は、異なるアポリポタンパク間の別個の領域を含む構造（すなわち異種構造）であることができる。キメラ構造を含む組成物は、アポリポタンパク変異体であるセグメント、または、特有の特徴（例えば、脂質結合特性、受容体結合特性、酵素特性、酵素活性化特性、抗酸化特性、または酸化還元特性）を有するように設計したセグメントも含むことができる（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１、Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５、Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６、Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１）：４６８−７４、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４、Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０、Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２、Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４、Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９（９）：２２１４−２５、Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ １９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：３２８−３８、Ｔｈｕｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１１）：６０６２−７０、Ｄｙｅｒ １９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２３）：１５０００９−１５、Ｈｉｌｌ １９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４７）：３０９７９−８４を参照されたい）。

【0156】

用いるアポリポタンパクは、組み換えアポリポタンパク、合成アポリポタンパク、半合成アポリポタンパク、または精製アポリポタンパクも含む。アポリポタンパクまたはその等価物を得る方法は、当該技術分野において周知である。例えば、アポリポタンパクは、例えば密度勾配遠心または免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、血漿または天然産物から分離することも、合成的に作製することも、半合成的に作製することも、当業者にとって既知の組み換えＤＮＡ技法を用いて作製することもできる（例えば、Ｍｕｌｕｇｅｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｔｏｍａｔｏｇｒ．７９８（１−２）：８３−９０、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２１（３）：２８４−９１、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２８（８）：９１３−２９、Ｐｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７１１：９７−１０９、米国特許第第５，０５９，５２８号、同第５，８３４，５９６号、同第５，８７６，９６８、および同第５，７２１，１１４号、ならびに、国際公開第８６／０４９２０号、および国際公開第８７／０２０６２号を参照されたい）。

【0157】

アポリポタンパクは、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｍ）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−Ｉ_Ｐ）、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するペプチドおよびペプチドアナログのようなアポリポタンパクアゴニストをさらに含む。例えば、アポリポタンパクは、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、同第６，０４６，１６６、および同第５，８４０，６８８号（これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているもののいずれであることもできる。

【0158】

アポリポタンパクアゴニストペプチドまたはペプチドアナログは、例えば、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、および６，０４６，１６６号に記載されている技法を含め、当該技術分野において既知のペプチド合成のためのいずれかの技法を用いて、合成または製造できる。例えば、このようなペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄが初めて説明した固相合成法（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を用いて調製してよい。その他のペプチド合成法は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｄ Ｅｄ．，（１９７６）、および当業者には容易に入手可能なその他の文献で見ることができる。ポリペプチド合成法の概要は、Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４）で見ることができる。ペプチドは、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，３ｄ Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）に記載されているような溶液法によって合成してもよい。さまざまなペプチド合成で用いるのに適した保護基は、上記の文献とともに、ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）に記載されている。ペプチドは、例えばアポリポタンパクＡ−Ｉの大部分から化学的または酵素的に切断することによって調製してもよい。

【0159】

特定の実施形態では、アポリポタンパクは、アポリポタンパクの混合物であることができる。１つの実施形態では、アポリポタンパクは、同種混合物、すなわち、単一種のアポリポタンパクであることができる。別の実施形態では、アポリポタンパクは、アポリポタンパクの異種混合物、すなわち、２つ以上の異なるアポリポタンパクの混合物であることができる。アポリポタンパクの異種混合物の実施形態は、例えば、動物供給源由来のアポリポタンパクと半合成供給源由来のアポリポタンパクとの混合物を含むことができる。特定の実施形態では、異種混合物は、例えば、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏとの混合物を含むことができる。特定の実施形態では、異種混合物は例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ ＭｉｌａｎｏとＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓとの混合物を含むことができる。本明細書に記載されている方法および組成物で用いるのに適した混合物は、当業者には明らかであろう。

【0160】

アポリポタンパクを天然供給源から得る場合には、植物または動物供給源から得ることができる。アポリポタンパクを動物供給源から得る場合には、アポリポタンパクは、いずれの種に由来するものであることもできる。特定の実施形態では、アポリポタンパクは、動物供給源から得ることができる。特定の実施形態では、アポリポタンパクは、ヒト供給源から得ることができる。好ましい実施形態では、アポリポタンパクは、そのアポリポタンパクの投与対象である個体と同じ種に由来する。

【0161】

本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、脂質混合物のステロール構成成分をさらに含んでよい。ステロールは、存在する場合、リポソーム、脂質ベシクル、または脂質粒子の調製の分野で従来用いられてきたステロールのいずれであることもできる。１つの実施形態では、ステロールはコレステロールである。

【0162】

本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、アニオン性脂質をさらに含んでもよい。脂質粒子で用いるのに適したアニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合したその他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限らない。

【0163】

追加の実施形態では、両親媒性脂質も、本明細書に記載されている脂質粒子および組成物に含まれている。「両親媒性脂質」とは、その脂質材の疎水性部分が疎水性相の中まで配向しており、親水性部分が水相の方に配向しているいずれかの好適な物質を指す。このような化合物としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限らない。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸のようなその他の無リン化合物も用いることができる。加えて、このような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールのようなその他の脂質と容易に混合できる。

【0164】

プログラム可能な融合脂質または融合促進脂質も、本明細書に記載されている脂質粒子および組成物に含めるのに適している。このような脂質粒子は、細胞膜と融合する傾向がほとんどなく、所定のシグナルイベントが生じるまではそのペイロードを送達する。これによって、その脂質粒子は、細胞との融合を始める前に、生体または疾患部位に注入した後、より均一に分配可能となる。上記のシグナルイベントは、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境、または時間の変化であることができる。融合促進脂質は、例えば、上記のような式（Ｉ）の化合物であることができる。いくつかのケースでは、上記のシグナルイベントは、ｐＨの変化、例えば、細胞外環境と細胞内環境との間、または、細胞内環境とエンドソーム環境との間のｐＨ差であることができる。

【0165】

時間がシグナルイベントであるときには、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲートのような融合遅延または「隠蔽（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」構成成分は単に、時間の経過とともに交換されて、脂質粒子膜から出ることができる。脂質粒子が体内で好適に分配されるまでには、融合性となるのに十分な隠蔽作用物質は喪失されている。その他のシグナルイベントにおいては、炎症部位における温度上昇など、疾患部位または標的細胞と関連するシグナルを選択するのが望ましいことがある。

【0166】

活性（治療）剤
本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、１つ以上の活性剤（例えば治療剤）をさらに含んでよい。本明細書で使用する場合、活性剤には、細胞、組織、器官、または被検体に所望の効果を及ぼすことのできるいずれかの分子または化合物が含まれる。このような効果は、例えば、生物学的、生理学的、または美容的効果であってよい。本発明の脂質粒子および組成物を用いて、さまざまな活性剤のいずれかを送達できる。この活性剤は、核酸、ペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、ホルモン、ならびに小分子であることができる。好適な治療剤としては、抗炎症化合物、抗うつ薬、興奮薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、血管新生阻害剤、細胞血管作動薬（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔｓ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬、例えば、抗不整脈剤、血管収縮薬、ホルモン、およびステロイドも挙げられる。本発明の脂質粒子は、アプタマーを送達することもできる。

【0167】

特定の実施形態では、治療剤はオンコロジー薬であり、このオンコロジー薬は、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、抗腫瘍剤などとも称される場合もある。用いてよいオンコロジー薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、aｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静注ブスルファン、経口ブスルファン、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドデタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシドフォスフェート、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ゲムツズマブ−オゾガミシン、ゴセレリンアセテート、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシレート、インターフェロン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、アリトレチノイン、メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロミド、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限らない。用いてよいオンコロジー薬の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシンアナログまたは誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼインヒビター、ならびにカンプトテシンである。

【0168】

好ましい実施形態では、活性剤は、ｓｉＲＮＡのような核酸である。例えば、活性剤は、目的の産物によってコードされる核酸であることができ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、ａＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、一本鎖であるとともに、１７〜２５個のヌクレオチドの長さであるｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、抗原、その断片、タンパク、ペプチド、ワクチン、および小分子、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。１つのより好ましい実施形態では、核酸はオリゴヌクレオチド（例えば１５〜５０個のヌクレオチドの長さ（または、１５〜３０もしくは２０〜３０個のヌクレオチドの長さ））である。ｓｉＲＮＡは、例えば、１６〜３０個のヌクレオチドの長さである二本鎖領域を有することができる。別の実施形態では、核酸は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スーパーｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣体、またはｍｉＲＮＡインヒビターである。スーパーｍｉｒとは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはこれらの両方、あるいは、これらの変性体の一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーであって、ｍｉＲＮＡと実質的に同一のヌクレオチド配列を有するとともに、その標的に対してアンチセンスであるオリゴマーまたはポリマーを指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣する目的で用いることのできる分子群を表す。したがって、「マイクロＲＮＡ模倣体」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入れるとともに、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの供給源から精製することによっては得られない）。

【0169】

脂質−核酸粒子中に存在する核酸は、いずれの形態であることもできる。この核酸は、例えば、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＲＮＡの非限定例としてはｓｉＲＮＡが挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明の脂質粒子は、１つ以上のリガンドにコンジュゲートされている核酸を送達することもできる。

【0170】

医薬組成物
脂質粒子は、特に治療剤と結合させるときには、例えば、投与経路および標準的な薬務に従って選択した製薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、または担体（生理的食塩水またはフォスフェート緩衝液など）をさらに含む医薬組成物として調合してよい。

【0171】

特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の送達のための組成物が説明されている。これらの組成物は、標的タンパクのタンパクレベルおよび／またはｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートするのに有効である。これらの組成物の活性は、調合物にカチオン性脂質が存在すること、および調合物中のカチオン性脂質のモル比の影響を受け得る。

【0172】

特定的な実施形態では、脂質−核酸粒子を含む医薬組成物は、標準的な技法に従って調製するとともに、製薬学的に許容可能な担体をさらに含む。一般に、生理食塩水が製薬学的に許容可能な担体として採用されることになる。その他の好適な担体としては例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシンなど（安定性向上のための糖タンパク、例えばアルブミン、リポタンパク、グロブリンなどを含む）が挙げられる。食塩水またはその他の塩含有担体を含む組成物中では、担体は好ましくは、脂質粒子の形成の後に加える。したがって、脂質−核酸組成物を形成した後に、その組成物を生理食塩水のような製薬学的に許容可能な担体で希釈することができる。

【0173】

得られた医薬調製物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌してよい。続いて、その水溶液を使用状態で包装することも、無菌条件下でろ過し、凍結乾燥し、その凍結乾燥した調合物を投与前に滅菌水溶液と組み合わせることもできる。この組成物は、生理的状態に近づけるために、必要に応じて製薬学的に許容可能な補助剤（ｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤など、例えば、ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリドなど）を含んでもよい。加えて、その脂質懸濁液は、脂質を保管状態におけるフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷から保護する脂質保護剤を含んでもよい。α−トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャー、および、フェリオキサミンのような水溶性鉄特異的キレーターが好適である。

【0174】

医薬製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、非常に様々であることができる。すなわち、約０．０１重量％未満、通常は約０．０５〜５重量％または少なくとも約０．０５〜５重量％から、１０〜３０重量％ほどであることができ、この濃度は、選択した特定的な投与方法に従って、主に流体体積、粘度などによって選択することになる。例えば、上記の濃度は、処置に伴う流体負荷を下げる目的で上昇させてもよい。これは、アテローム動脈硬化性うっ血性心不全または重症高血圧症の患者の場合、特に望ましい場合がある。あるいは、刺激性脂質から構成される複合体は、投与部位の炎症を低減させる目的で、低濃度まで希釈してもよい。１つの実施形態群では、核酸は、結合させた標識を有することになるとともに、（相補的核酸の存在を示すことによって）診断で用いられることになる。このケースでは、投与する複合体の量は、用いる具体的な標識、診断している病状、および臨床医の判断によって決まることになるが、一般には、体重１キログラム当たり約０．０１〜約５０ｍｇ、好ましくは体重１キログラム当たり約０．１〜約５ｍｇとなる。

【0175】

上記のとおり、脂質−治療剤（例えば核酸）粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、ＰＥＧ−セラミド、またはガングリオシドＧ_Ｍ１修飾脂質、または、凝集を防ぐか、または抑えるのに有効なその他の脂質を含んでよい。このような構成成分の追加によって、複合体の凝集が防がれるのみではない。それどころか、循環血液中滞留時間を延長させるとともに、脂質−核酸組成物の標的組織への送達を向上させる手段ももたらす場合もある。

【0176】

脂質−治療剤組成物は、キット形態で提供することもできる。このキットは典型的には、そのキットのさまざまな要素を保持するように仕切られている容器から構成されることになる。このキットは、粒子または医薬組成物を好ましくは脱水形態または濃縮形態で、再水和または希釈、および投与についての説明書とともに含むことになる。特定の実施形態では、上記の粒子は活性剤を含む一方で、別の実施形態では、活性剤を含まない。

【0177】

製造法
カチオン性脂質、そのカチオン性脂質を含む脂質粒子、ならびに、そのカチオン性脂質および／または脂質粒子を含む医薬組成物を作製する方法は、例えば国際公開第２０１０／０５４４０６号、国際公開第２０１０／０５４４０１号、国際公開第２０１０／０５４４０５号、および国際公開第２０１０／０５４３８４号、国際公開第２０１０／０４２８７７号、国際公開第２０１０／１２９７０９号、国際公開第２００９／０８６５５８号、および国際公開第２００８／０４２９７３号（これらの特許のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている。

【0178】

脂質粒子、およびその脂質粒子を含む医薬組成物を作製する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１４２０２５号、同第２００６／００５１４０５号、および同第２００７／００４２０３１号（これらの特許のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる）にも記載されている。加えて、治療剤、例えば核酸と結合されている脂質粒子をを含め、脂質粒子を調製する方法も記載されている。本明細書に記載されている方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝化水溶液と組み合わせて、脂質粒子中に封入された核酸を含む中間体混合物を作製する。１つの実施形態では、封入された核酸は、核酸／脂質比率約３重量％〜約２５重量％、好ましくは５〜１５重量％で存在する。その脂質部分が、好ましくは直径３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの単層ベシクルである脂質封入核酸粒子を得る目的で、上記の中間体混合物を任意でサイズ調節してよい。続いてｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それによって、少なくとも部分的に表面が中和された脂質−封入核酸組成物をもたらす。

【0179】

例えば、１つの実施形態では、１つ以上の脂質（本明細書に記載されている実施形態のうちのいずれかのカチオン性脂質を含む）を有機溶液（例えばエタノール）に溶解させた溶液を調製する。同様に、１つ以上の活性（治療）剤（例えば１種類のｓｉＲＮＡ分子、または２種類のｓｉＲＮＡ分子の１：１モル混合物など）を水性緩衝化（例えばシトレート緩衝液）溶液に溶解させた溶液を調製する。この２つの溶液を混合し、希釈して、ｓｉＲＮＡ脂質粒子のコロイド懸濁液を形成させる。１つの実施形態では、上記のｓｉＲＮＡ脂質粒子の平均粒径は約８０〜９０ｎｍである。さらなる実施形態では、この分散体を０．４５／２マイクロメートルのフィルターに通してろ過し、濃縮し、タンジェンシャルフローろ過によってダイアフィルトレーションにかけてもよい。さらなる実施形態では、得られた生成物の濃度を約２ｍｇ／ｍＬに調節する。さらなる実施形態では、この生成物を滅菌ろ過し、無菌ろ過し、包装する。上記のとおり、これらのカチオン性脂質のいくつかは、アミノ基のｐＫ_ａ未満のｐＨでは帯電しており、アミノ基のｐＫ_ａを超えるｐＨでは実質的に中性であるアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と称され、２つの工程からなるプロセスを用いて、調合物中で用いることができる。第１に、低いｐＨで、滴定可能なカチオン性脂質、およびその他のベシクル構成成分によって、核酸の存在下で、脂質ベシクルを形成できる。この方式では、ベシクルが核酸を被包して取り込む。第２に、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫ_ａを超えるレベルまで、すなわち、生理的ｐＨ以上まで培地のｐＨを上昇させることによって、新たに形成されたベシクルの表面電荷を中和することができる。このプロセスの特に有益な側面としては、いずれの表面吸着した核酸も容易に除去されること、および、中性表面を有する核酸送達ビヒクルが得られることの両方が挙げられる。中性表面を有するリポソームまたは脂質粒子は、循環血液からの急速な浄化を回避するとともに、カチオン性リポソーム調製物と関連する特定の毒性を回避すると思われる。上記のような滴定可能なカチオン性脂質を核酸−脂質粒子の調合で上記のように用いることに関するさらなる詳細は、米国特許第６，２８７，５９１号、および米国特許第６，８５８，２２５号（参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。

【0180】

このようにして形成されるベシクルは、核酸含有量の多い、均一なベシクルサイズの調合物をもたらすこともさらに注目される。加えて、このベシクルのサイズは、約３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜 約９０ｎｍの範囲であってよい。

【0181】

いずれの特定の理論に束縛されるものではないが、非常に高い効率の核酸封入は、低ｐＨでの静電相互作用によるものと考えられる。酸性ｐＨ（例えばｐＨ４．０）では、ベシクル表面は帯電しており、静電相互作用を通じて核酸の一部を結合させる。外部酸性緩衝液を、より中性の緩衝液（例えばｐＨ７．５）に換えると、脂質粒子またはリポソームの表面が中和され、いずれの外部核酸も除去できるようになる。この調合プロセスに関するより詳細な情報は、さまざまな公報（例えば米国特許第６，２８７，５９１号、および米国特許第６，８５８，２２５）に示されている。

【0182】

上記に鑑み、脂質／核酸調合物を調製する方法を説明する。本明細書に記載されている方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝化水溶液と組み合わせて、脂質粒子中に封入された核酸を含む中間体混合物を作製するが、例えば、その際には、封入された核酸は、核酸／脂質比率約１０重量％〜約２０重量％で存在する。その脂質部分が、好ましくは直径３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの単層ベシクルである脂質封入核酸粒子を得る目的で、上記の中間体混合物を任意でサイズ調節してよい。続いてｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それによって、少なくとも部分的に表面が中和された脂質−封入核酸組成物をもたらす。

【0183】

特定の実施形態では、脂質の混合物は、その脂質が、そのｐＫ_ａを下回るｐＨではカチオン性となり、そのｐＫ_ａを上回るｐＨでは中性となるようなｐＫ_ａを有する脂質の中から選択する第１の脂質構成成分と、脂質核酸粒子の形成中に粒子の凝集を防ぐ脂質の中から選択する第２の脂質構成成分という少なくとも２つの脂質構成成分を含む。特定的な実施形態では、アミノ脂質はカチオン性脂質である。

【0184】

核酸−脂質粒子を調製する際には、脂質の混合物は典型的には、脂質を有機溶媒に溶解させた溶液である。続いて、この脂質の混合物を乾燥して、薄膜を形成させることも、凍結乾燥して、粉末を形成させてから、水性緩衝液で水和して、リポソームを形成させることもできる。あるいは、好ましい方法では、脂質混合物をエタノールのような水混和性アルコールに可溶化でき、このエタノール溶液を水性緩衝液に加え、その結果、自然発生的にリポソームが形成される。大半の実施形態では、上記のアルコールは、市販されている形状で用いる。例えば、エタノールは、無水エタノール（１００％）として、または、９５％エタノール（残部は水である）として用いることができる。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号で、より詳細に説明されている。）

【0185】

１つの例示的な実施形態では、脂質の混合物は、アルコール溶媒中のカチオン性脂質、中性脂質（カチオン性脂質以外のもの）、ステロール（例えばコレステロール）、およびＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）の混合物である。好ましい実施形態では、脂質混合物は、アルコール、より好ましくはエタノール中のカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質から本質的になる。さらに好ましい実施形態では、第１の溶液は、約２０〜７０％のカチオン性脂質、５〜４５％の中性脂質、２０〜５５％のコレステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比の上記の脂質混合物からなる。さらに好ましい実施形態では、第１の溶液は、表１〜５に記載されている脂質から選択したカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡの混合物（より好ましくは、約２０〜６０％のカチオン性脂質、５〜２５％のＤＳＰＣ、２５〜５５％のコレステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比）から本質的になる。特定的な実施形態では、脂質のモル比は、おおよそ４０／１０／４０／１０（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡ）、または５２／１３／３０／５（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。別の好ましい実施形態群では、上記の組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置き換えられている。

【0186】

脂質混合物は、核酸を含んでよい緩衝化水溶液と組み合わせる。この緩衝化水溶液は典型的には、緩衝液のｐＨが、脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫ_ａ未満である溶液である。好適な緩衝液の例としては、シトレート、フォスフェート、アセテート、およびＭＥＳが挙げられる。特に好ましい緩衝液はシトレート緩衝液である。好ましい緩衝液は、封入されている核酸の化学的性質に応じて、アニオンが１〜１０００ｍＭの範囲であり、高い負荷レベルを得るには、緩衝液濃度の最適化が重要である場合がある（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号、および米国特許第６，８５８，２２５号（それぞれ、参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい）。あるいは、クロリド、サルフェートなどでｐＨ５〜６に酸性化した純水も有用である場合がある。このケースでは、粒子を透析してエタノールを除去するか、ｐＨを上昇させるか、または生理食塩水のような製薬学的に許容可能な担体と混合すると、粒子膜内外の浸透ポテンシャルを平衡化する５％グルコースまたは別の非イオン性溶質を加えるのが好適である場合がある。緩衝液中の核酸の量はさまざまであることができるが、典型的には約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬとなる。

【0187】

脂質の混合物と、治療用核酸の緩衝化水溶液を組み合わせて、中間体混合物をもたらす。この中間体混合物は典型的には、封入させた核酸を有する脂質粒子の混合物である。加えて、上記の中間体混合物は、脂質粒子表面上の負荷電核酸と正荷電脂質とのイオン引力によって、脂質粒子（リポソームまたは脂質ベシクル）の表面に結合される核酸の一部も含んでよい（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１の脂質構成成分を構成するその他の脂質は、ｐＨが、その脂質上のプロトン化可能基のｐＫ_ａ未満である緩衝液中で正電荷を有する）。好ましい実施形態群では、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、各溶液を組み合わせたときに、得られるアルコール含有率が約２０体積％〜約４５体積％になるように、各溶液の体積を調節する。これらの混合物を組み合わせる方法は、多くの場合、作製する調合物の規模に応じて、さまざまなプロセスのいずれかを含むことができる。例えば、総体積が約１０〜２０ｍＬ以下であるときには、溶液を試験管で組み合わせて、ボルテックスミキサーを用いて攪拌することができる。大規模プロセスは、好適な生成規模のガラス器具で行うことができる。

【0188】

任意により、脂質混合物と治療剤（核酸）の緩衝化水溶液を組み合わせることによって作製した脂質−封入治療剤（例えば核酸）複合体をサイズ調節して、所望のサイズ範囲と、比較的狭い脂質粒径分布を得ることができる。好ましくは、本明細書で提供する組成物は、平均径約７０〜約２００ｎｍ、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍにサイズ調節することになる。リポソームを所望のサイズに調節するためのいくつかの技法が利用可能である。１つのサイズ調節法は、米国特許第４，７３７，３２３号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによってリポソーム懸濁液を超音波処理すると、約０．０５マイクロメートル未満のサイズの小単層ベシクル（ＳＵＶ）まで徐々にサイズが小さくなる。ホモジナイズは、剪断エネルギーに依存して大きなリポソームを小さなリポソームに断片化する別の方法である。典型的なホモジナイズ手順では、選択されたリポソームサイズ、典型的には約０．１〜０．５マイクロメートルが観察されるまで、多重膜層ベシクルを標準的なエマルジョンホモジナイザーに繰り返し循環させる。いずれの方法においても、従来のレーザービームによる粒径測定法によって、粒径分布をモニタリングできる。本明細書における特定の方法では、押出法を用いて、均一なベシクルサイズを得る。

【0189】

リポソーム組成物を細孔のポリカーボネート膜または非対称セラミック膜に通して押し出すことによって、比較的明確なサイズ分布を得られる。典型的には、所望のリポソーム複合体サイズ分布が得られるまで、懸濁液を膜に１回以上循環させる。リポソームは、徐々に細孔の小さくなる膜に通して押し出して、リポソームサイズを徐々に小さくするようにしてもよい。いくつかのケースでは、形成される脂質−核酸組成物は、いずれのサイズ調節もせずに用いることもできる。

【0190】

特定的な実施形態では、製造法は、脂質−核酸組成物の脂質部分の少なくとも一部の表面電荷を中和する工程をさらに含む。この表面電荷を少なくとも部分的に中和することによって、封入されなかった核酸が脂質粒子表面から遊離され、従来の技法を用いて、その核酸を組成物から除去できる。好ましくは、封入されずに表面吸着した核酸を得られた組成物から、緩衝液溶液の交換を通じて除去する。例えば、シトレート緩衝液（ｐＨ約４．０、組成物の形成のために用いる）をＨＥＰＥＳ−緩衝化食塩水（ＨＢＳのｐＨ約 ７．５）溶液に置き換えると、リポソーム表面が中和され、その表面から核酸が放出される。続いて、標準的な方法を用いるクロマトグラフィーによって、放出された核酸を除去してから、用いた脂質のｐＫ_ａを超えるｐＨの緩衝液に換えることができる。

【0191】

任意により、水性緩衝液で水和させて脂質ベシクル（すなわち脂質粒子）を形成し、核酸を加える前に、上記の方法のいずれかを用いて、サイズ調節するができる。上記のとおり、水性緩衝液のｐＨは、アミノ脂質のｐＫ_ａ未満である必要がある。続いて、サイズ調節して予形成した上記のベシクルに、核酸の溶液を加えることができる。このような「予形成」ベシクルに核酸を封入させるには、その混合物は、エタノールのようなアルコールを含む必要がある。エタノールのケースでは、エタノールは、約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する必要がある。加えて、脂質ベシクルの組成と、核酸の性質に応じて、水性緩衝液−エタノール混合物中の予形成ベシクルと核酸との混合物を約２５℃〜約５０℃の温度まで加温する必要がある場合もある。脂質ベシクルの核酸のレベルを所望のものにするために、封入プロセスを最適化するには、エタノール濃度および温度のような変数の操作が必要であることは当業者には明らかであろう。核酸の封入に適した条件の例は、実施例に示されている。予形成ベシクルに核酸を封入したら、外部ｐＨを上昇させて、表面電荷を少なくとも部分的に中和することができる。続いて、封入されずに表面吸着した核酸を上記のように除去することができる。

【0192】

治療法
本明細書に記載されている脂質粒子および組成物は、インビトロおよびインビボの両方で、結合または封入させた治療剤を細胞に送達することを含むさまざまな目的で利用してよい。したがって、疾患または障害の治療を必要とする被検体の疾患または障害を治療する方法は、好適な治療剤と結合している脂質粒子と被検体を接触させることを含むことができる。

【0193】

本明細書に記載されているように、脂質粒子は、例えばｓｉＲＮＡ分子およびプラスミドを含む核酸の送達に特に有用である。このため、脂質粒子および組成物を用いて、標的遺伝子の発現を低減する核酸（例えばｓｉＲＮＡ）、または所望のタンパクの発現を増加させる目的で用いることができる核酸（例えば、所望のタンパクをコードするプラスミド）と結合している脂質粒子と細胞を接触させることによって、インビトロおよびインビボの両方で、標的遺伝子およびタンパクの発現を調節してよい。

【0194】

脂質粒子を用いて、インビトロまたはインビボで、治療剤を細胞に送達してよい。特定的な実施形態では、この治療剤は核酸であり、この核酸は核酸−脂質粒子を用いて、細胞に送達する。脂質粒子、および関連する医薬組成物を用いるさまざまな方法の下記の説明は、核酸−脂質粒子に関する説明によって例示されているが、これらの方法および組成物は、治療剤の送達による治療が有効であると思われるいずれかの疾患または障害の治療を目的とするいずれの治療剤の送達にも容易に適応させることができることを理解されたい。

【0195】

特定の実施形態では、核酸を細胞に導入する方法が説明されている。細胞に導入するのに好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス、およびリボザイムである。これらの方法は、細胞内送達を行うのに十分な期間にわたって、粒子または組成物を細胞と接触させることによって行ってよい。

【0196】

組成物は、ほぼすべての細胞型に吸着できる。吸着すると、核酸−脂質粒子は、その細胞の一部に取り込まれ得るか、脂質を細胞膜と交換し得るか、または、その細胞と融合し得るかのいずれかである。上記の複合体の核酸部分の転移または組み込みは、これらの経路のいずれか１つによって行うことができる。限定されるものではないが、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる粒子のケースでは、その粒子は、エンドソーム膜と相互作用し、その結果、おそらく非二重層相の形成によってエンドソーム膜が不安定化し、その結果、封入核酸が細胞質に導入されると考えられる。同様に、脂質粒子が細胞血漿膜と直接融合するケースでは、融合が起きると、リポソーム膜が細胞膜に統合され、リポソームの内容物が細胞内液と組み合わされる。細胞と脂質−核酸組成物との接触は、インビトロで行うときには、生物学的に適合する培地中で行うことになる。組成物の濃度は、具体的な用途に応じて非常にさまざまであり得るが、一般には約１μモル〜約１０ミリモルである。特定の実施形態では、細胞の脂質−核酸組成物による処理は一般に、生理学的温度（約３７℃）で、約１〜２４時間、好ましくは約２〜８時間の期間で行うことになる。インビトロ用途では、核酸の送達は、植物由来であるか動物由来であるか、脊椎動物であるか脊椎動物でないか、いずれの組織または型であるかを問わず、培養液中で増殖させたいずれかの細胞に対するものであることができる。好ましい実施形態では、細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞となる。

【0197】

１つの実施形態群では、細胞密度が約１０^３〜約１０^５個／ｍＬ、より好ましくは約２×１０^４個／ｍＬの６０〜８０％コンフルエントな播種細胞に、脂質−核酸粒子懸濁液を加える。上記の細胞に加える懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、よ好ましくは約１μｇ／ｍＬである。

【0198】

別の実施形態では、脂質粒子を用いて、核酸を細胞または細胞株（例えば腫瘍細胞株）に送達できる。このような細胞株の非限定例としては、ＨＥＬＡ（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＣＣＬ−２）、ＫＢ（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＣＣＬ−１７）、ＨＥＰ３Ｂ（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＨＢ−８０６４）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＨＴＢ−７７）、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＣＣＬ−２４７）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＨＴＢ−３８）、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＣＲＬ−１４３５）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＣＣＬ−１８５）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎ：ＨＴＢ−２６）が挙げられる。

【0199】

典型的な用途としては、ｓｉＲＮＡを細胞内送達させるための周知の手順を用いて、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングすることが挙げられる。あるいは、用途としては、治療上有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達が含まれる。このようにして、欠損または不存在遺伝子産物を供給することによって、遺伝病に対して治療を提供する（すなわち、デュシェンヌ型ジストロフィーについては、Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４５（３）：６３０−６４３（１９８９）を、嚢胞性線維症については、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１０２−１０３（１９８９）を参照されたい）。組成物の他の用途としては、細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することが挙げられる（Ｂｅｎｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４１：１０２３−１０３３ （１９９２）を参照されたい）。

【0200】

あるいは、組成物は、当業者にとって既知である方法を使用して、インビボで核酸を細胞に送達する目的で用いることもできる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達に関しては、Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３）（参照により本明細書に組み込まれる）に、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を用いて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドを静脈内送達することについて記載されている。Ｈｙｄｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５０−２５６（１９９３）（参照により本明細書に組み込まれる）には、リポソームを用いて、マウスの肺の気道上皮と肺胞に嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を送達することが記載されている。Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１（１９８９）（参照により本明細書に組み込まれる）には、細胞内酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能性原核生物遺伝子によるマウス肺のインビボトランスフェクションが記載されている。したがって、組成物は、感染症の治療に使用することができる。

【0201】

インビボ投与では、医薬組成物は、好ましくは非経口投与、すなわち、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与する。特定的な実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注入によって静脈内投与または腹腔内投与する。１つの例としては、Ｓｔａｄｌｅｒらの米国特許第５，２８６，６３４号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。細胞内核酸送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１０１：５１２−５２７（１９８３）、Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０（１９８８）、Ｎｉｃｏｌａｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．６：２３９−２７１（１９８９）、およびＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８（１９９３）でも論じられている。脂質系治療薬を投与するさらに別の方法は、例えば、Ｒａｈｍａｎらの米国特許第３，９９３，７５４号、Ｓｅａｒｓの米国特許第４，１４５，４１０号、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓらの米国特許第４，２３５，８７１号、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒの米国特許第４，２２４，１７９号、Ｌｅｎｋらの米国特許第 ４，５２２，８０３号、およびＦｏｕｎｔａｉｎらの米国特許第４，５８８，５７８号に記載されている。

【0202】

別の方法では、医薬調製物を標的組織に直接塗布することによって、医薬調製物を標的組織と接触させてもよい。この塗布は、局所的な「開口」または「閉鎖」法によって行ってよい。「局所的」とは、皮膚、中咽頭部、外耳道などのように、環境に暴露されている組織に、医薬調製物を直接塗布することを意味する。「開口」法は、患者の皮膚を切開し、医薬調製物を塗布する下層組織を直接可視化することを含む処置法である。この処置法は一般に、肺に達するようにする開胸術、腹部内臓に達するようにする腹式開腹術、または標的組織に達するようにするその他の直接的な外科的アプローチのような外科的処置によって行う。「閉鎖」法は、内部の標的組織を直接可視化はしないが、皮膚の小さな創傷から器具を挿入することによって到達するようにする侵襲的処置である。例えば、医薬調製物は、針洗浄により腹膜に投与してよい。同様に、本発明の医薬調製物は、脊髄麻酔または脊髄のメトリザマイドイメージングで一般的に実施されるように、腰椎穿刺してから、患者に適切な体位を取らせた状態で、点滴によって髄膜または脊髄に投与してよい。あるいは、本発明の医薬調製物は、内視鏡器具によって投与してもよい。

【0203】

脂質−核酸組成物は、肺に吸入させるエアロゾルで（Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．２９８（４）：２７８−２８１（１９８９）を参照されたい）、または、疾患部位への直接注射によって（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４））投与することもできる。

【0204】

本発明の脂質−治療剤粒子の用量は、治療剤の脂質に対する比率、および、患者の年齢、体重、状態に基づく投薬医師の見解によって決まることになる。

【0205】

１つの実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法が記載されている。これらの方法は一般に、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節できる核酸と結合している脂質粒子と細胞を接触させることを含む。本明細書で使用する場合、「調節する」という用語は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させることを指す。異なる実施形態では、調節は、上昇または増強を意味することも、低下または低減を意味することもできる。標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定する方法は、当該技術分野において既知かつ利用可能であり、その方法としては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫組織化学的技法を用いる方法が挙げられる。特定的な実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルは、適切なコントロール値と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％超上昇するか、または低減される。

【0206】

例えば、ポリペプチドの発現の上昇が望ましい場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってよい。その一方で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の低減が望ましい場合、核酸は、例えば、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、それによって、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を妨害するポリヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡであってよい。あるいは、核酸は、上記のようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであってもよい。

【0207】

特定的な実施形態では、治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現できるプラスミドから選択し、このｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体に特異的に結合して、そのポリペプチドの発現が低減されるようにするポリヌクレオチドを含む。

【0208】

別の実施形態では、核酸は、ポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片をコードして、そのポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片の発現が上昇するようにするプラスミドである。

【0209】

関連する実施形態では、被検体の体内でのポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療する方法は、その被検体に医薬組成物を投与することを含み、この治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現できるプラスミドから選択し、このｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。

【0210】

１つの実施形態では、医薬組成物は、表１〜５に記載されている脂質から選択したカチオン性脂質と、ＤＳＰＣと、コレステロールと、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡとの混合物（例えば約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡというモル比の混合物）からなるか、またはこのような混合物から本質的になる脂質粒子であって、治療用核酸と結合している脂質粒子を含む。特定的な実施形態では、脂質のモル比は、おおよそ４０／１０／４０／１０（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡ）、または５２／１３／３０／５（単位：モル％、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ＤＭＡ）である。別の実施形態群では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置き換えられている。

【0211】

別の関連する実施形態では、被検体におけるポリペプチドの過小発現によって特徴付けられる疾患または障害を治療する方法は、被検体に医薬組成物を投与することを含み、この治療剤は、ポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。

【0212】

被検体の体内で免疫反応を誘発する方法は、被検体に医薬組成物を投与することを含むことができ、この治療剤は免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、上記の免疫反応は、体液性免疫反応または粘膜免疫反応である。

【0213】

さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、ワクチンまたは抗原と併せて被検体に投与する。したがって、ワクチンは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、免疫反応が所望される抗原と結合もしている脂質粒子を含むことができる。特定的な実施形態では、この抗原は腫瘍抗原であるか、例えばウイルス、細菌、または寄生虫のような感染体と関連するものである。

【0214】

さまざまな腫瘍抗原、感染体抗原、およびその他の疾患と関連する抗原は、当該技術分野において周知であり、これらの例は、本明細書で引用されている参考文献に記載されている。好適な抗原の例としては、ポリペプチド抗原およびＤＮＡ抗原がが挙げられるが、これらに限らない。抗原の具体例は、Ａ型肝炎抗原、Ｂ型肝炎抗原、天然痘抗原、ポリオ抗原、炭疽菌抗原、インフルエンザ抗原、チフス抗原、破傷風抗原、麻疹抗原、ロタウイルス抗原、ジフテリア抗原、百日咳抗原、結核抗原、および風疹抗原である。好ましい実施形態では、抗原はＢ型肝炎組み換え抗原である。別の態様では、抗原はＡ型肝炎組み換え抗原である。別の態様では、抗原は腫瘍抗原である。このような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原、およびバーキットリンパ腫と関連する抗原である。さらなる態様では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク腫瘍抗原組み換え抗原である。当業者であれば、用いるのに適する他の抗原を知っているであろう。

【0215】

用いるのに適する腫瘍関連抗原には、単一の腫瘍型を示す場合があったり、いくつかの型の腫瘍に共有されている場合があったり、および／または、正常細胞と比べて腫瘍細胞で排他的に発現されるか、もしくは過剰表現される場合があったりする突然変異分子および非突然変異分子の両方が含まれる。タンパクおよび糖タンパクに加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、およびムチンの発現の腫瘍特異的パターンも説明されている。本主題の癌ワクチンで用いられる例示的な腫瘍関連抗原としては、腫瘍細胞に特有の突然変異または再配列を有する癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、およびその他の遺伝子のタンパク産物、再活性化胚性遺伝子産物、腫瘍胎児抗原、組織特異的（ただし腫瘍特異的ではない）分化抗原、増殖因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来ウイルスタンパク、および多数のその他の自己タンパクが挙げられる。

【0216】

腫瘍関連抗原の具体的な実施形態としては、例えば、Ｒａｓ ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３、およびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク産物、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８、およびベータカテニンのような突然変異抗原と、ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、およびＫＳＡのような過剰発現抗原と、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のような腫瘍胎児抗原と、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ならびに、Ｍａｒｔ １／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、およびＴＲＰ２のようなメラノサイト分化抗原のような自己抗原と、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１、およびＰＳＭ−Ｐ２のような前立腺関連抗原と、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ならびに、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２、およびＳＣＰ１のような他の癌精巣抗原のような再活性化胚性遺伝子産物と、Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２のようなムチンと、ＧＭ２、ＧＤ２、およびＧＤ３のようなガングリオシド、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）およびｇｌｏｂｏ−Ｈのような中性糖脂質および糖タンパクと、Ｔｎ、トンプソン・フリーデンライヒ抗原（ＴＦ）、およびｓＴｎのような糖タンパクとが挙げられる。また、本明細書における腫瘍関連抗原としては、全細胞および腫瘍細胞溶解物、ならびに、その免疫原性部分と、Ｂ細胞リンパ腫に対して用いられる、Ｂリンパ球の単クローン性増殖で発現される免疫グロブリンイディオタイプも挙げられる。

【0217】

病原体としては、哺乳類、より具体的にはヒトに感染する感染体、例えばウイルスが挙げられるが、これらに限らない。感染性ウイルスの例としては、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１のようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される、およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離体、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）、トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）、コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、ＲＳウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）、アレナウイルス科（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）、ビルナウイルス科、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（大半のアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、イリドウイルス科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）、ならびに、未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の原因菌、デルタ肝炎の原因菌（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体であると考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の原因菌（クラスＩ＝内部的に伝染、クラス２＝非経口的に伝染（すなわちＣ型肝炎）、ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限らない。

【0218】

また、グラム陰性菌およびグラム陽性菌は、脊椎動物の抗原としての機能を果たす。このようなグラム陽性菌としては、パスツレラ菌、ブドウ球菌、および連鎖球菌が挙げられるが、これらに限らない。グラム陰性菌としては、大腸菌、シュードモナス菌、およびサルモネラ菌が挙げられるが、これらに限らない。感染性細菌の具体例としては、ヘリコバクターピロリ、ボレリアブルグドルフェリ、レジュネラニューモフィラ、ミコバクテリア（例えば、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、Ｍ．ゴルドネ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ヴィリダンス型）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、連鎖球菌（嫌気性）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター菌、腸球菌、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属菌、豚丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、肺炎杆菌、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、バクテロイデス属菌、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、レプトスピラ属菌、リケッチア属菌、およびイスラエル放線菌が挙げられるが、これらに限らない。

【0219】

病原体の追加の例としては、哺乳類、より具体的にはヒトに感染する感染性真菌が挙げられるが、これらに限らない。感染性真菌の例としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、トラコーマクラミジア、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられるが、これらに限らない。感染性寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、および三日熱マラリア原虫のようなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍが挙げられる。その他の感染性生体（すなわち原生生物）としては、トキソプラスマが挙げられる。

【0220】

１つの実施形態では、本発明の調合物を用いて、ＦＶＩＩ、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、ベータ−カテニン遺伝子、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サーバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３ファミリーメンバーＤＮ−ｐ６３、ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子、ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子、ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子、ｍＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子、ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子、ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子、ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子、ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子、アルファｖ−インテグリン遺伝子、Ｆｌｔ−１受容体遺伝子、チューブリン遺伝子、ヒトパピローマウイルス遺伝子、ヒトパピローマウイルスの複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、ＲＳウイルス遺伝子、ＲＳウイルスの複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルスの複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルスの複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルスの複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの複製に必要な遺伝子、ＪＣウイルス遺伝子、ＪＣウイルスの複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子の複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルスの複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルスの複製に必要な遺伝子、西ナイルウイルス遺伝子、西ナイルウイルスの複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎遺伝子、セントルイス脳炎の複製に必要な遺伝子、ダニ媒介脳炎ウイルス遺伝子、ダニ媒介脳炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子の複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス４０遺伝子、シミアンウイルス４０の複製に必要な遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスの複製に必要な遺伝子、モロニーマウス白血病ウイルス遺伝子、モロニーマウス白血病ウイルスの複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルスの複製に必要な遺伝子、はしかウイルス遺伝子、はしかウイルスの複製に必要な遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスの複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルスの複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルスの複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルスの複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルスの複製に必要な遺伝子、プラスモジウム遺伝子、プラスモジウム遺伝子の複製に必要な遺伝子、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ遺伝子、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓの複製に必要な遺伝子、結核菌遺伝子、結核菌遺伝子の複製に必要な遺伝子、癩菌遺伝子、癩菌の複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌遺伝子、黄色ブドウ球菌の複製に必要な遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、肺炎連鎖球菌の複製に必要な遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌の複製に必要な遺伝子、クラミジア肺炎病原体遺伝子、クラミジア肺炎病原体の複製に必要な遺伝子、肺炎ミコプラズマ遺伝子、肺炎ミコプラズマの複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、ＧＣＳＦ遺伝子、Ｇｒｏ１遺伝子、Ｇｒｏ２遺伝子、Ｇｒｏ３遺伝子、ＰＦ４遺伝子、ＭＩＧ遺伝子、前血小板塩基性タンパク遺伝子、ＭＩＰ−１Ｉ遺伝子、ＭＩＰ−１Ｊ遺伝子、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子、ＭＣＰ−２遺伝子、ＭＣＰ−３遺伝子、ＣＭＢＫＲ１遺伝子、ＣＭＢＫＲ２遺伝子、ＣＭＢＫＲ３遺伝子、ＣＭＢＫＲ５ｖ、ＡＩＦ−１遺伝子、Ｉ−３０９遺伝子、イオンチャネルの構成要素の遺伝子、神経伝達物質受容体の遺伝子、神経伝達物質リガンドの遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、ＨＤ遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＳＣＡ１遺伝子、ＳＣＡ２遺伝子、ＭＪＤ１遺伝子、ＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子、ＳＣＡ７遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ＬＯＨ細胞に見られる対立遺伝子、または多形型遺伝子の１つの対立遺伝子のような（これらに限らない）標的遺伝子をサイレンシングまたは調節できる。

【0221】

別の実施形態では、本発明は、核酸分子を送達する方法であって、核酸分子とカチオン
性脂質とを含む核脂質粒子を投与することを含み、このカチオン性脂質が、
（ｉ）中心炭素原子と、
（ｉｉ）上記の中心原子に直接結合している頭部基と、
（ｉｉｉ）上記の中心炭素原子に直接結合している２つの疎水性テイル（各疎水性テイルは、上記の中心原子に結合している炭素数１４以上の脂肪族基を含み、この脂肪族基は、（ａ）生分解性基に割り込まれて、その生分解性基と上記の中心炭素原子との間に、少なくとも４つの炭素原子の鎖が存在するようになっているか、（ｂ）疎水性テイルの末端に、生分解性基を含み、上記の核酸分子が送達されるまでカチオン性脂質が無傷のままであり、送達後、疎水性テイルがインビボで切断されるようになっている）と、
を有する方法に関する。

【0222】

定義
本明細書で使用する場合、「カチオン性脂質」という用語には、１つまたは２つの脂肪酸または脂肪族鎖と、プロトン化すると、生理的ｐＨでカチオン性脂質を形成できるアミノ頭部基（アルキルアミノまたはジアルキルアミノ基を含む）とを有する脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、「アミノ脂質」と称される。

【0223】

複合体の投与が疾患または障害の有効な治療レジメンである検体または患者は、好ましくはヒトであるが、臨床試験、またはスクリーニング、または活性実験と関連する実験動物を含め、いずれの動物であることもできる。したがって、当業者であれば容易に分かるように、本発明の方法、化合物、および組成物は特に、いずれの動物、特には哺乳類（ヒト、ネコ科またはイヌ科の被検体のような家庭用動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタの被検体（これらに限らない）のような家畜、野生動物（自然にいるものか、動物園にいるものかは問わない）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、およびネコのような研究動物、鶏、七面鳥、および鳴き鳥のような鳥類、すなわち獣医学用途の動物が挙げられるが、これらに限らない）に投与するのに適している。

【0224】

上記の一般式中に示されている化学基の多くは、特定の順番で書かれている（例えば−ＯＣ（Ｏ）−）。別段の指示のない限り、示されている順番でその化学基を一般式に組み込むことが意図されている。例えば、−（Ｒ）_ｉ−（Ｍ^１）_ｋ−（Ｒ）_ｍ−（式中のＭ^１は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、ｋは１である）という形の一般式は、別段の定めのない限り、−（Ｒ）_ｉ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｒ）_ｍ−を指す。化学基が特定の順番で書かれているときには、別段の定めのない限り、逆の順番も考えられることを理解されたい。例えば、−（Ｒ）_ｉ−（Ｍ^１）_ｋ−（Ｒ）_ｍ−（式中のＭ^１は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である）という一般式（すなわち−（Ｒ）_ｉ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（Ｒ）_ｍ−）では、別段の定めのない限り、Ｍ^１が−ＮＨＣ（Ｏ）−である化合物（すなわち−（Ｒ）_ｉ−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｒ）_ｍ−）も考えられる。

【0225】

本明細書で使用する場合、「生分解性基」という用語は、生物環境内、例えば、生体、器官、組織、細胞、または細胞小器官内で、結合破壊反応を起こし得る結合を１つ以上含む基を指す。例えば、生分解性基は、ヒトのような哺乳類の身体によって（例えば加水分解によって）代謝可能であり得る。生分解性結合を含むいくつかの基としては例えば、エステル、ジチオール、およびオキシムが挙げられるが、これらに限らない。生分解性基の非限定例は、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｒ^５）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ^５）−、−Ｃ（Ｏ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）（ＮＲ^５）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳｉ（Ｒ^５）_２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）（ＣＲ^３Ｒ^４）Ｃ（Ｏ）−である。

【0226】

本明細書で使用する場合、「脂肪族」基は、炭素原子が鎖状に結合している非芳香族基であり、飽和または不飽和のいずれかである。

【0227】

「アルキル」および「アルキレン」という用語は、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素部分を指す。１つの実施形態では、アルキル基は直鎖の飽和炭化水素である。別段の定めのない限り、「アルキル」または「アルキレン」基は１〜２４個の炭素原子を含む。代表的な飽和直鎖アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｎ−ヘキシルが挙げられる。代表的な飽和分岐アルキル基としては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびイソペンチルが挙げられる。

【0228】

「アルケニル」という用語は、炭素−炭素二重結合を１つ以上有する直鎖または分岐鎖の炭化水素部分を指す。１つの実施形態では、アルケニル基は、１つ、２つ、または３つの二重結合を含み、さもなければ飽和されている。別段の定めのない限り、「アルケニル」基は２〜２４個の炭素原子を含む。アルケニル基には、シス異性体およびトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分岐アルケニル基としては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、および２，３−ジメチル−２−ブテニルが挙げられる。

【0229】

「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を１つ以上有する直鎖または分岐鎖の炭化水素部分を指す。別段の定めのない限り、「アルキニル」基は２〜２４個の炭素原子を含む。代表的な直鎖および分岐アルキニル基としては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、および３−メチル−１−ブチニルが挙げられる。

【0230】

「アシル」という用語は、水素、アルキル、部分飽和もしくは完全飽和シクロアルキル、部分飽和もしくは完全飽和複素環、アリール、またはヘテロアリールで置換されたカルボニル基を指す。例えば、アシル基としては、（炭素数１〜２０の）アルカノイル（例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、カプロイル、およびｔ−ブチルアセチル）、（炭素数３〜２０の）シクロアルキルカルボニル（例えばシクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、およびシクロヘキシルカルボニル）、複素環式カルボニル（例えばピロリジニルカルボニル、ピロリド−２−オン−５−カルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピペラジニルカルボニル、およびテトラヒドロフラニルカルボニル）、アロイル（例えばベンゾイル）、ならびにヘテロアロイル（例えばチオフェニル−２−カルボニル、チオフェニル−３−カルボニル、フラニル−２−カルボニル、フラニル−３−カルボニル、１Ｈ−ピロイル−２−カルボニル、１Ｈ−ピロイル−３−カルボニル、およびベンゾ［ｂ］チオフェニル−２−カルボニル）のような基が挙げられる。

【0231】

「アリール」という用語は、芳香族の単環式、二環式、または三環式炭化水素環系を指す。別段の定めのない限り、「アリール」基は６〜１４個の炭素原子を含む。アリール部分の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルが挙げられるが、これらに限らない。

【0232】

「シクロアルキル」および「シクロアルキレン」という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルのような飽和単環式または二環式炭化水素部分を指す。別段の定めのない限り、「シクロアルキル」または「シクロアルキレン」基は３〜１０個の炭素原子を含む。

【0233】

「シクロアルキルアルキル」という用語は、アルキル基に結合しているシクロアルキル基であって、そのアルキル基が、その分子の残部に結合している基を指す。

【0234】

「複素環」（または「ヘテロシクリル」）という用語は、飽和または不飽和のいずれかである非芳香族の５〜８員の単環式環系、または７〜１２員の二環式環系、または１１〜１４員の三環式環系であって、単環式の場合には、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択した１〜３個のヘテロ原子を含み、二環式の場合には、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択した１〜６個のヘテロ原子を含み、三環式の場合には、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択した１〜９個のヘテロ原子を含み、上記の窒素および硫黄ヘテロ原子が任意で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が任意で四級化されていてもよい環系を指す。例えば、複素環はシクロアルコキシ基であってよい。複素環は、その複素環中のいずれかのヘテロ原子または炭素原子を介して、その分子の残部に結合していてもよい。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、およびテトラヒドロチオピラニルが挙げられるが、これらに限らない。

【0235】

「ヘテロアリール」という用語は、芳香族の５〜８員の単環式環系、７〜１２員の二環式環系、または１１〜１４員の三環式環系であって、単環式の場合には１〜３個のヘテロ原子を有し、二環式の場合には１〜６個のヘテロ原子を有し、三環式の場合には１〜９個のヘテロ原子を有し、これらのヘテロ原子をＯ、Ｎ、またはＳから選択する環系を指す（例えば、単環式の場合には、炭素原子とＮ、Ｏ、またはＳのうちの１〜３個のヘテロ原子を有し、二環式の場合には、炭素原子とＮ、Ｏ、またはＳのうちの１〜６個のヘテロ原子を有し、三環式の場合には、炭素原子とＮ、Ｏ、またはＳのうちの１〜９個のヘテロ原子を有する）。本明細書に記載されているヘテロアリール基は、１つの共通の炭素−炭素結合を共有する融合環も含んでよい。

【0236】

「置換」という用語は、別段の指示のない限り、所定の構造体中の１つ以上の水素ラジカルを指定の置換基のラジカルと置き換えることを指し、この置換基としては、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、オキソ、チオキシ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環、および脂肪族基が挙げられるが、これらに限らない。上記の置換基は、さらに置換されていてもよいことが分かる。例示的な置換基としては、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、および環状アミノ化合物が挙げられる。

【0237】

「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。

【0238】

「アルキルアミン」という用語は−ＮＨ（アルキル）ラジカルを指し、「ジアルキルアミン」という用語は−Ｎ（アルキル）_２ラジカルを指す。

【0239】

「アルキルフォスフェート」という用語は、−Ｏ−Ｐ（Ｑ’）（Ｑ”）−Ｏ−Ｒ（式中のＱ’およびＱ”はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）_２、任意で置換されているアルキル、またはアルコキシであり、Ｒは、任意で置換されているアルキル、ω−アミノアルキル、またはω−（置換）アミノアルキルである）を指す。

【0240】

「アルキルホスホロチオエート」という用語は、Ｑ’またはＱ”の少なくとも１つがＳであるアルキルフォスフェートを指す。

【0241】

「アルキルホスホネート」という用語は、Ｑ’またはＱ”の少なくとも１つがアルキルであるアルキルフォスフェートを指す。

【0242】

「ヒドロキシアルキル」という用語は、−Ｏ−アルキルラジカルを指す。

【0243】

「アルキル複素環」という用語は、少なくとも１つのメチレンが複素環に置き換えられているアルキルを指す。

【0244】

「ω−アミノアルキル」という用語は、−アルキル−ＮＨ_２ラジカルを指す。「ω−（置換）アミノアルキル」という用語は、Ｎ上のＨのうちの少なくとも１つがアルキルと置き換えられているω−アミノアルキルを指す。

【0245】

「ω−ホスホアルキル」という用語は、−アルキル−Ｏ−Ｐ（Ｑ’）（Ｑ”）−Ｏ−Ｒ（式中のＱ’およびＱ”はそれぞれ独立して、ＯまたはＳであり、Ｒは、任意で置換されているアルキルである）を指す。

【0246】

「ω−チオホスホアルキル」という用語は、Ｑ’またはＱ”の少なくとも１つがＳであるω−ホスホアルキルを指す。

【0247】

本願では、下記の略語を用いる。

【0248】

ＤＳＰＣはジステアロイルホスファチジルコリンである。ＤＰＰＣは１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである。ＰＯＰＣは１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリンである。ＤＯＰＥは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミンである。ＰＥＧ−ＤＭＧは一般には、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−メトキシポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ２０００）を指す。ＴＢＤＰＳＣｌはｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシランである。ＤＭＡＰはジメチルアミノピリジンである。ＮＭＯはＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシドである。ＬｉＨＤＭＳはリチウムビス（トリメチルシリル）アミドである。ＨＭＰＡはヘキサメチルホスホラミドである。ＥＤＣは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。ＤＩＰＥＡはジイソプロピルエチルアミンである。ＤＣＭはジクロロメタンである。ＴＥＡはトリエチルアミンである。ＴＢＡＦはテトラブチルアンモニウムフルオリドである。

【0249】

いくつかの実施形態では、本発明の方法では、保護基を用いる必要がある場合がある。保護基法は、当業者には周知である（例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照されたい）。簡潔に言うと、保護基は、官能基の無用の反応性を低減または排除するいずれかの基である。保護基を官能基に付加して、特定の反応中にその官能基の反応性を隠し、その後、保護基を除去して、元の官能基を暴露させることができる。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」を用いる。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の無用の反応性を低下または排除するいずれかの基である。保護基は、当該技術分野において周知の技法を用いて付加および除去することができる。

【0250】

化合物は、本明細書に記載されている技法、または既知の有機合成法のうちの少なくとも１つによって調製してよい。
実施例

【0251】

実施例１

【化59】

【0252】

化合物２：化合物１（１０．０ｇ、１８．８ミリモル、国際公開第２０１０／０５４４０６号参照）をＣＨ_２Ｃｌ_２（８０ｍＬ）に溶解させた溶液に、トリエチルアミン（７．８６ｍＬ、５６．４ミリモル）、ＤＭＡＰ（４５９ｍｇ、３．７６ミリモル）、およびｔｅｒｔ−ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（９．６２ｍＬ、３７．６ミリモル）を加えた。この反応混合物を２４時間攪拌した。続いて、その混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。ろ過および濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜５％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物２を得た（１２．４ｇ、１６．１ミリモル、８６％、ヘキサンを用いた場合のＲ_ｆ＝０．２４）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ７．６６−７．６８（ｍ、４Ｈ）、７．３３−７．４２（ｍ、６Ｈ）、５．３０−５．３９（ｍ、４Ｈ）、３．６７−３．７２（ｍ、１Ｈ）、１．９７−２．０４（ｍ、８Ｈ）、１．０７−１．４２（ｍ、５２Ｈ）、１．０５（ｓ、９Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）

【0253】

化合物３：化合物２（１２．４ｇ、１６．１ミリモル）をｔｅｒｔ−ブタノール（１００ｍＬ）、ＴＨＦ（３０ｍＬ）、およびＨ_２Ｏ（１０ｍＬ）に溶解させた溶液に、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（４．１５ｇ、３５．４ミリモル）およびオスミウムテトロキシド（４１ｍｇ、０．１６１ｍｇ）を加えた。この反応混合物を１６時間攪拌してから、重硫酸ナトリウムを加えることによってクエンチした。蒸発によって溶媒を除去した後、残渣をＥｔ_２Ｏ（５００ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（３００ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。ろ過および濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１、Ｒ_ｆ＝０．４９）によって精製して、化合物３を得た（１２．７ｇ、１５．１ミリモル、９４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ７．６６−７．６８（ｍ、４Ｈ）、７．３３−７．４３（ｍ、６Ｈ）、３．６７−３．７３（ｍ、１Ｈ）、３．５７−３．６２（ｍ、４Ｈ）、１．８２（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、４Ｈ）、１．１０−１．５１（ｍ、６０Ｈ）、１．０４（ｓ、９Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、６Ｈ）

【0254】

化合物４：化合物３（１２．６ｇ、１５．０ミリモル）を１，４−ジオキサン（２２０ｍＬ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（７０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（５５ｍＬ）、およびＨ_２Ｏ（５５ｍＬ）に溶解させた溶液に、ＮａＩＯ_４（７．７０ｇ、３６．０ミリモル）を加えた。この反応混合物を１６時間、室温で攪拌した。この混合物をＥｔ_２Ｏ（５００ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（３００ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。ろ過および濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１、Ｒ_ｆ＝０．３０）によって精製して、化合物４を得た（７．９８ｇ、１４．５ミリモル、９７％）、Ｃ_３５Ｈ_５４ＮａＯ_３Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）^＋の分子量計算値：５７３．３７４０、実測値：５７３．３

【0255】

化合物７：化合物５（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３，１１４０−１１４５，２００６参照、１．０９ｇ、２．１８ミリモル）をＴＨＦ（２０ｍＬ）およびＨＭＰＡ（４ｍＬ）に溶解させた溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、４．３６ｍＬ、４．３６ミリモル）を−２０℃で加えた。得られた混合物を２０分間、−２０℃で攪拌してから、−７８℃まで冷却した。化合物４（５００ｍｇ、０．９０８ミリモル）をＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。この混合物を攪拌し、一晩で室温まで温めた。ＭＳ解析によって、二酸の形成が示された（化合物６、Ｃ_５３Ｈ_８５Ｏ_５Ｓｉ（Ｍ−Ｈ）⁻の計算値：８２９．６１６６、観察値：８２９．５）。この混合物に、ＮａＨＣＯ_３（１．１０ｇ、１３．１ミリモル）およびジメチルサルフェート（１．２４ｍＬ、１３．１ミリモル）を加え、２時間、室温で攪拌した。飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（５０ｍＬ）を加えることによって、この反応物をクエンチしてから、Ｅｔ_２Ｏ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。ろ過および濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１、Ｒ_ｆ＝０．３５）によって精製して、化合物７を得た（２７０ｍｇ、０．３１４ミリモル、３５％）。Ｃ_５５Ｈ_９０ＮａＯ_５Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）^＋の分子量計算値：８８１．６４５５、実測値：８８１．６４８４

【0256】

化合物８：化合物７（２６５ｍｇ、０．３０８ミリモル）をＴＨＦ（２．５ｍＬ）に溶解させた溶液に、ｎ−ＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、０．５５５ｍＬ、０．５５５ミリモル）を加えた。この反応混合物を１４時間、４５℃で攪拌した。濃縮後、この混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝３：１、Ｒ_ｆ＝０．５２）によって精製して、化合物８を得た（１５５ｍｇ、０．２５０ミリモル、８１％）。Ｃ_３９Ｈ_７２ＮａＯ_５（Ｍ＋Ｎａ）^＋の分子量計算値：６４３．５２７７、実測値６４３．５２７３

【0257】

化合物９：化合物８（１５０ｍｇ、０．２４２ミリモル）および４−（ジメチルアミノ）酪酸ヒドロクロリド（４９ｍｇ、０．２９０ミリモル）をＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）に溶解させた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．１２６ｍＬ、０．７２６ミリモル）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（５６ｍｇ、０．２９０ミリモル）、およびＤＭＡＰ（６ｍｇ、０．０４８４ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で１４時間攪拌した。続いて、この反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の０〜５％ＭｅＯＨ）によって精製して、化合物９を得た（１２１ｍｇ、０．１６５ミリモル、６８％、Ｒ_ｆ＝０．２５（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ＭｅＯＨで展開））。Ｃ_４５Ｈ_８４ＮＯ_６（Ｍ＋Ｈ）^＋の分子量計算値７３４．６２９９、実測値７３４．５

【0258】

化合物１０：化合物９をＣＨ_３ＣＮおよびＣＨＣｌ_３中のＣＨ_３Ｃｌで処理することによって、化合物１０を得ることができる。

【0259】

実施例２

【化60】

【0260】

化合物１２：化合物１１（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，６３６−４６，１９９５参照、１．２５ｇ、２．５８ミリモル）をＴＨＦ（２０ｍＬ）およびＨＭＰＡ（４ｍＬ）に溶解させた溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、２．５８ｍＬ、２．５８ミリモル）を−２０℃で加えた。この混合物を２０分間、−２０℃で攪拌してから、−７８℃まで冷却した。化合物４（５００ｍｇ、０．９０８ミリモル）をＴＨＦ（９ｍＬ）およびＨＭＰＡ（０．９ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。この混合物を攪拌し、一晩で室温まで温めた。Ｈ_２Ｏ（４０ｍＬ）を加えることによって、この反応物をクエンチしてから、Ｅｔ_２Ｏ（１５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。ろ過および濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１、Ｒ_ｆ＝０．３５）によって精製して、化合物１２を得た（１３６ｍｇ、０．１６９ミリモル、１９％）。Ｃ_５１Ｈ_８２ＮａＯ_５Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）^＋の分子量計算値：８２５．５８２９、実測値８２５．５

【0261】

化合物５の代わりに化合物１３を用いて、化合物７に関して記載した手順と同様の手順に従って、化合物１２を得た（１３５ｍｇ、０．１６８ミリモル、４６％）。

【0262】

化合物１５／化合物１６：化合物１２（８００ｍｇ、０．９９６ミリモル）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させた溶液に、ｎ−ＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、５ｍＬ、５．００ミリモル）を加えた。この反応混合物を１６時間、４５℃で攪拌した。濃縮後、この混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物１５（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝３：１、Ｒ_ｆ＝０．４６、３７２ｍｇ、０．６５９ミリモル、６６％）および化合物１６（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９５：５、Ｒ_ｆ＝０．３６、１３５ｍｇ、０．２５１ミリモル、２５％）を得た。化合物１５の分子量（Ｃ_３５Ｈ_６４ＮａＯ_５（Ｍ＋Ｎａ）^＋）計算値：５８７．４６５１、実測値：５８７．４６５２、化合物１６の分子量（Ｃ_３３Ｈ_６１Ｏ_５（Ｍ＋Ｈ）^＋）計算値：５３７．４５１９、実測値：５３７．５

【0263】

化合物１７：化合物１５（１６４ｍｇ、０．２９０ミリモル）および４−（ジメチルアミノ）酪酸ヒドロクロリド（５８ｍｇ、０．３４８ミリモル）をＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）に溶解させた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．１５２ｍＬ、０．８７０ミリモル）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（６７ｍｇ、０．３４８ミリモル）、およびＤＭＡＰ（７ｍｇ、０．０５８ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で１４時間攪拌した。この反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の０〜５％ＭｅＯＨ）によって精製して、化合物１７を得た（１５８ｍｇ、０．２３３ミリモル、８０％、Ｒ_ｆ＝０．２４（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ＭｅＯＨで展開））。Ｃ_４５Ｈ_８４ＮＯ_６（Ｍ＋Ｈ）^＋の分子量計算値：７３４．６２９９、実測値７３４．５

【0264】

化合物１８：化合物１７をＣＨ_３ＣＮおよびＣＨＣｌ_３中のＣＨ_３Ｃｌで処理することによって、化合物１８を得ることができる。．

【0265】

化合物１９：化合物１６（１３０ｍｇ、０．２４２ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解させた溶液に、トリメチルシリルジアゾメタン（２Ｍ Ｅｔ_２Ｏ溶液、０．１５８ｍＬ、０．３１５ミリモル）を加えた。この反応混合物を１４時間攪拌した。蒸発後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝３：１、Ｒ_ｆ＝０．５０）によって精製して、化合物１９を得た（９９ｍｇ、０．１８０ミリモル、７４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ５．２９−５．４０（ｍ、４Ｈ）、４．１２（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、３Ｈ）、３．５５−３．５９（ｍ、１Ｈ）、２．３０（ｄｄ、Ｊ＝１４．７、７．２Ｈｚ、４Ｈ）、１．９８−２．０７（ｍ、８Ｈ）、１．６０−１．６８（ｍ、４Ｈ）、１．２３−１．４３（ｍ、３７Ｈ）

【0266】

化合物２０：化合物１９（９５ｍｇ、０．１６８ミリモル）、および４−（ジメチルアミノ）酪酸ヒドロクロリド（４２ｍｇ、０．２５２ミリモル）をＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ）に溶解させた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．０８８ｍＬ、０．５０４ミリモル）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（４８ｍｇ、０．５０４ミリモル）、およびＤＭＡＰ（４ｍｇ、０．０３４ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で１４時間攪拌した。この反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の０〜５％ＭｅＯＨ）によって精製して、化合物２０を得た（１０３ｍｇ、０．１５５ミリモル、９２％、Ｒ_ｆ＝０．１９（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ＭｅＯＨで展開））。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ５．２９−５．４０（ｍ、４Ｈ）、４．８３−４．８９（ｍ、１Ｈ）、４．１２（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．６７（ｓ、３Ｈ）、２．２８−２．３４（ｍ、８Ｈ）、２．２３（ｓ、６Ｈ）、１．９８−２．０７（ｍ、８Ｈ）、１．７６−１．８３（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．６８（ｍ、４Ｈ）、１．２３−１．５１（ｍ、３５Ｈ）

【0267】

化合物２１：化合物２０をＣＨ_３ＣＮおよびＣＨＣｌ_３中のＣＨ_３Ｃｌで処理することによって、化合物２１を得ることができる。

【0268】

実施例３：ジ−アルデヒド中間体４の代替的な合成法

【化61】

【0269】

ジ−アルデヒド４は、スキーム３に示されているように、１−ブロモ−９−デセンを用いて合成できる。頭部基２７を含むジ−アルデヒドは、例えばウィッティング反応を用いて、末端エステル置換脂質を合成するのに有用であり得る。オゾン分解によってジ−アルデヒド４および頭部基２７を得ることができる。

【0270】

実施例４：化合物８の代替的な合成法

【化62】

化合物８は、スキーム４に示されているように合成することができる。

【0271】

化合物２９：ＮａＨ（油中６０％、８２ｇ、１．７０９６モル）を５００ｍＬの無水ＤＭＦに攪拌懸濁させた液に、滴下漏斗を用いて、化合物２８（２５０ｇ、１．７０９６モル）を１．５ＬのＤＭＦに溶解させた溶液を０℃でゆっくり加えた。この反応混合物を３０分間攪拌してから、ベンジルブロミド（２０８．８６ｍＬ、１．７０９６モル）を窒素雰囲気下でゆっくり加えた。続いて、この反応物を周囲温度まで温め、１０時間攪拌した。続いて、砕いた氷（約２ｋｇ）でこの混合物をクエンチし、エチルアセテート（２×１Ｌ）で抽出した。有機層を水（１Ｌ）で洗浄して無用のＤＭＦを除去し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空で蒸発乾固させた。粗化合物を６０〜１２０のシリカゲルで精製し、ＤＣＭ中の０〜５％ＭｅＯＨで溶出して、化合物２９を黄白色の液体として得た（２２０ｇ、５４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３３−７．２４（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．６３−３．６０（ｍ、２Ｈ）、３．４７−３．４３（ｍ、２Ｈ）、１．６３−１．５１（ｍ、４Ｈ）、１．３９−１．２３（ｍ、８Ｈ）

【0272】

化合物３０：化合物２９（１３３ｇ、０．５６３５モル）を１．５ＬのＤＣＭに溶解させ、この攪拌溶液にＣＢｒ_４（２８０．３５ｇ、０．８４５６モル）を加え、その反応混合物を０℃まで不活性雰囲気下で冷却した。続いて、温度を２０℃未満に保ちながら、ＰＰｈ_３（２５１．０３ｇ、０．９５７１モル）を少しずつ加えた。完全に加えた後、この反応混合物を３時間、室温で攪拌した。反応の完了後、反応混合物から沈殿した固体（ＰＰｈ_３Ｏ）をろ過によって除去し、砕いた氷（約１．５kg）でろ液を希釈し、ＤＣＭ（３×７５０ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空下で蒸留した。ヘキサン中の０〜５％エチルアセテートを溶出系として用いて、得られた粗化合物を６０〜１２０メッシュのシリカゲルカラムでクロマトグラフィーにかけて、化合物３０を黄白色の液体として得た（１５０ｇ、８９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３３−７．２５（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．４７−３．４１（ｍ、２Ｈ）、３．４１−３．３７（ｍ、２Ｈ）、１．８６−１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．６２−１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．４２−１．２９（ｍ、８Ｈ）

【0273】

化合物３１：新たに活性化した削り状Ｍｇ（２４．０８ｇ、１．００３モル）に、２００ｍＬの無水ＴＨＦを加えてから、この混合物に少量のヨウ素を不活性雰囲気下で加えた。発熱反応を制御しながら、化合物３０（１５０ｇ、０．５０１６モル）を１Ｌの乾燥ＴＨＦに入れた溶液をゆっくり加えた。続いて、この反応物を１時間加熱還流してから、室温まで冷却した。続いて、メチルフォーメート（６０．２４ｇ、１．００３３モル）をゆっくり加え、その反応を２時間継続させた。完了後、１０％ＨＣｌ、続いて水（１Ｌ）をゆっくり加えることによって、その反応物をクエンチし、エチルアセテート（３×１Ｌ）で抽出した。有機層を５リットルのビーカーに取り、５００ｍＬのメタノールで希釈し、０℃まで冷却した。この溶液に、過剰のＮａＢＨ_４（約５当量）を少しずつ加え、ＨＣｌを加えても切断されなかったフォーメートエステルを加水分解させるようにした。得られた溶液を１時間攪拌してから、揮発性物質を真空下で除去した。残渣を水（１Ｌ）中に取り、１０％ＨＣｌ溶液によって酸性化した（ｐＨ４）。続いて、この生成物をエチルアセテート（３×１Ｌ）で抽出した。続いて、有機相をロータリーエバポレーターで乾燥および抽出濃縮して、所望の化合物３１を固体として得た（５７ｇ、２４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３５−７．３２（ｍ、８Ｈ）、７．２９−７．２４（ｍ、２Ｈ）、４．４９（ｓ、４Ｈ）、３．５６（ｍ、１Ｈ）、３．４６−３．４３（ｍ、４Ｈ）、１．６３−１．５６（ｍ、４Ｈ）、１．４４−１．３４（ｍ、２８Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１３８．５６、１２８．２１、１２７．４９、１２７．３４、７２．７２、７１．７６、７０．３７、３７．３７、２９．６４、２９．５６、２９．４７、２９．３３、２６．０７、２５．５４

【0274】

化合物３２：化合物３１（５６ｇ、０．１１９６モル）を７００ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解させ、０℃まで冷却した。ＴＢＳＣｌ（３６．０６ｇ、０．２３９６モル）をゆっくり加えてから、イミダゾール（３２．５５ｇ、０．４７８６モル）を不活性雰囲気下で加えた。続いて、この反応物を室温で１８時間攪拌した。完了したら、その反応物を氷（約１ｋｇ）でクエンチし、エチルアセテート（３×５００ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で洗浄して酸性不純物を除去し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で蒸発させて粗化合物を得て、この粗化合物をシリカゲル（６０〜１２０メッシュ）によって精製し、０〜１０％エチルアセテートヘキサンで溶出して、化合物３２を黄色っぽい油として得た（６０ｇ、８２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３３−７．２４（ｍ、１０Ｈ）、４．４９（ｓ、４Ｈ）、３．６０−３．５７（ｍ、１Ｈ）、３．４６−３．４３（ｍ、４Ｈ）、１．６１−１．５４（ｍ、４Ｈ）、１．４１−１．２６（ｍ、２８Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０２（ｓ、６Ｈ）

【0275】

化合物３３：化合物３２（６０ｇ、０．１０３０モル）を５００ｍＬのエチルアセテートに溶解させ、Ｎ_２で２０分間脱気した。パラジウム炭素（Ｐｄ１０重量％）（１２g）を加え、その反応物を水素雰囲気下で１８時間攪拌した。完了後、その混合物をセライト床でろ過し、エチルアセテートで洗浄した。このろ液を真空下で蒸発させて、次の合成手順で用いるのに十分な純度である化合物３３を得た（１９ｇ、４６％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝３．６４−３．５８（ｍ、５Ｈ）、１．５９（ｂｒ、２Ｈ）、１．５７−１．５１（ｍ、４Ｈ）、１．３８−１．２２（ｍ、２８Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０２（ｓ、６Ｈ）

【0276】

化合物３４：化合物３３（８．２ｇ、０．０１９９モル）を１００ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶解させ、０℃まで冷却した。ＴＥＡ（２２．１４ｍＬ、０．１５９２モル）を不活性雰囲気下で加えた。この混合物を５分間攪拌後、メシルクロリド（４．６ｍＬ、０．０５９モル）を滴下し、その反応物をさらに３時間攪拌した。反応の完了後、その混合物を氷（約２００g）でクエンチし、ＤＣＭ（３×７５ｍＬ）で抽出した。有機層を無水ナトリウムサルフェートで乾燥し、蒸発させ、粗化合物を得て、ヘキサン中の０〜３０％エチルアセテートを溶出系として用いて、この粗化合物を６０〜１２０メッシュのシリカゲルカラムで精製して、化合物３４を黄白色の液体として得た（８．２ｇ、７３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝４．２２−４．１９（ｍ、４Ｈ）、３．６０−３．５８（ｍ、１Ｈ）、２．９９（ｓ、６Ｈ）、１．７５−１．６９（ｍ、４Ｈ）、１．３８−１．２８（ｍ、２８Ｈ）、０．８６（ｓ、９Ｈ）、０．０２（ｓ、６Ｈ）

【0277】

化合物３５：化合物３４（８．２ｇ、０．０１４６モル）を４００ｍＬの乾燥エーテルに溶解させた溶液に、ＭｇＢｒ_２Ｅｔ_２Ｏ（２２．７４ｇ、０．０８８１７モル）を０℃で窒素雰囲気下にて少しずつ加えた。加え終わった後、この反応混合物を２８時間加熱還流した。反応の完了後、この反応で形成された無機物質をろ過によって除去した。このろ液を蒸発させ、ヘキサン中の０〜３％エチルアセテートを溶出系として用いて、得られた粗化合物を６０〜１２０メッシュのシリカゲルカラムで精製して、化合物３５を無色の液体として得た（６．６ｇ、８５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝３．６１−３．５８（ｍ、１Ｈ）、３．４１−３．３７（ｔ、４Ｈ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．８７−１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．４２−１〜２５（ｍ、２４Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０１２（ｓ、６Ｈ）

【0278】

化合物３６：エチニルトリメチルシラン（５．３ｍＬ、０．０３７８モル）を６０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液を−７８℃まで冷却し、ヘキサン中の１．４Ｍ ｎ−ＢｕＬｉ（２３ｍＬ、０．０３４０５モル）を不活性雰囲気下でゆっくり加えた。この反応物を１０分間攪拌してから、ＨＭＰＡ（２．３ｇ、０．０１３２４モル）を加え、続いて、得られた混合物を２時間、０℃で攪拌してから、−７８℃まで冷却した。これに、化合物３５（５ｇ、０．００９４モル）を６０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液をゆっくり加え、加え終わった後に、その反応物を室温まで温め、１８時間置いた。反応の進行を^１Ｈ ＮＭＲによってモニタリングした。完了後、この反応混合物を０℃まで冷却し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液（５０ｍＬ）に続いて水（２００ｍＬ）を慎重に加えることによってクエンチした。水相をヘキサン（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を乾燥し、溶媒を真空下で除去して、化合物３６を得た（５ｇ、９４％）（化合物３６は、さらなる精製なしに使用した）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝３．６２−３．５６（ｍ、１Ｈ）、２．２１−２．１７（ｍ、４Ｈ）、１．４９−１．４７（ｍ、４Ｈ）、１．３７−１．２６（ｍ、２４Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．１３（ｓ、１８Ｈ）、０．０２１（ｓ、６Ｈ）

【0279】

化合物３７：化合物３６（５ｇ、０．００８８モル）を５０ｍＬメタノールに攪拌溶解させた液に、Ｋ_２ＣＯ_３（６．１ｇ、０．０４４モル）を一度に加えてから、得られた混合物を１８時間、周囲温度で攪拌した。続いて、揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、その粗混合物を１００ｍＬの水で希釈し、ヘキサン（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空下で蒸発させて、化合物３７を得た（３．５ｇ、９７％）（化合物３７は、さらなる精製なしに使用した）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝３．６０−３．５８（ｍ、１Ｈ）、２．１９−２．１４（ｍ、４Ｈ）、１．９３−１．９２（ｍ、２Ｈ）、１．５４−１．４９（ｍ、４Ｈ）、１．３７−１．２７（ｍ、２４Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０２（ｓ、６Ｈ）

【0280】

化合物３９：化合物３７（２．５ｇ、０．００５９８モル）を２５ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解させ、−４０℃まで冷却した。ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン１２．９ｍＬ中１．４Ｍ、０．０１７９４モル）をゆっくり加え、１０分間隔を置いた後に、ＨＭＰＡ（２５ｍＬ）をゆっくり加えた。得られた混合物を窒素雰囲気下で３０分間、−４０℃に保った。続いて、冷却した反応混合物に、化合物３８（３．５ｇ、１．０１１９６モル）を２５ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液を滴下した。得られた混合物を室温まで２時間かけて温めてから、室温で１８時間攪拌した。続いて、飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液（約５０ｍＬ）を加えることによって、混合物をクエンチし、その生成物をエチルアセテート（３×５０ｍＬ）で抽出した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、ジクロロメタン中の０〜３％エチルアセテートを溶出系として用いて、得られた粗生成物を（１００〜２００メッシュの）シリカゲルカラムによって精製して、化合物３９を黄色油として得た（０．９ｇ、１８％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝４．５６−４．５５（ｍ、２Ｈ）、３．８７−３．８３（ｍ、２Ｈ）、３．７４−３．６８（ｍ、２Ｈ）、３．５９−３．５７（ｍ、１Ｈ）、３．４９−３．４６（ｍ、２Ｈ）、３．３９−３．３３（ｍ、２Ｈ）、２．１３−２．１０（ｍ、８Ｈ）、１．８７−１．７５（ｍ、２Ｈ）、１．７４−１．６６（ｍ、２Ｈ）、１．５７−１．４２（ｍ、２０Ｈ）、１．４０−１．１９（ｍ、４０Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０２（ｓ、６Ｈ）

【0281】

化合物４０：化合物３９（５０４ｍｇ、０．５９８ミリモル）を１０ｍＬの乾燥エーテルに溶解させた溶液に、ＭｇＢＲ_２Ｅｔ_２Ｏ（９２６ｍｇ、３．５９ミリモル）を加えた。この反応混合物を１４時間攪拌してから、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えることによってクエンチした。この生成物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物４０を得た（３０７ｍｇ、０．４５５ミリモル、７６％、Ｒ_ｆ＝０．３６（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１で展開））。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ３．５９−３．６６（ｍ、５Ｈ）、２．１４（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、８Ｈ）、１．２１−１．５９（ｍ、５２Ｈ）、０．８８（ｓ、９Ｈ）、０．０３（ｓ、６Ｈ）

【0282】

化合物４１：化合物４０（１８０ｍｇ、０．２６７ミリモル）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に攪拌溶解させた液に、ピリジニウムジクロメート（６０３ｍｇ、１．６０ミリモル）を加えた。この反応混合物を４８時間攪拌した。水（２０ｍＬ）で希釈後、この混合物をＥｔ_２Ｏ（３×４０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物４１を得た（５３ｍｇ、０．０７５ミリモル、２８％、Ｒ_ｆ＝０．２５（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝９５：４．５：０．５で展開））。Ｃ_４３Ｈ_７７Ｏ_５Ｓｉ（Ｍ−Ｈ）⁻の分子量計算値：７０１．５５４０、実測値：７０１．５。この化合物は、ＴＥＭＰＯ酸化によって合成することができる。

【0283】

化合物４２：化合物１９に関して記載した手順と同様の手順によって化合物４２を得た（２３ｍｇ、０．０３２ミリモル、化合物４０から２１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ３．６７（ｓ、６Ｈ）、３．５９−３．６２（ｍ、１Ｈ）、２．３０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、４Ｈ）、２．１３（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、８Ｈ）、１．２７−１．６４（ｍ、４８Ｈ）、０．８８（ｓ、９Ｈ）、０．０３（ｓ、６Ｈ）

【0284】

Ｐ−２ニッケル条件を用いる還元によって、化合物４３を得ることができ、続いて、ＴＢＡＦによる脱保護によって、化合物８を得ることができる。

【0285】

実施例５：化合物８の代替的な合成法

【化63】

化合物８は、スキーム５に示されているように合成することができる。ブロミド５１をグリニャール試薬に変換してから、エチルフォーメートとカップリングさせて、化合物５２を得ることができる。続いて酸処理、酸化、および還元を行うことによって、化合物８を得ることができる。

【0286】

実施例６：化合物８の代替的な合成法

【化64】

化合物８は、スキーム６に示されているように合成することができる。化合物５８、６０、または６２のいずれかのブロミドをエチルフォーメートと反応させて、末端官能化ジオレフィン鎖を生成させることができる。続いて、標準的な化学反応を用いて、このジオレフィン鎖化合物から化合物８を調製することができる。

【0287】

実施例７
スキーム７：

【化65】

８−ベンジルオキシ−オクタン−１−オール（２）の合成：
ＮａＨ（油中６０％、８２ｇ、１．７０９６モル）を５００ｍＬの無水ＤＭＦに攪拌懸濁させた液に、滴下漏斗を用いて、化合物１（２５０ｇ、１．７０９６モル）を１．５ＬのＤＭＦに溶解させた溶液を０℃でゆっくり加えた。この反応混合物を３０分間攪拌してから、ベンジルブロミド（２０８．８６ｍＬ、１．７０９６モル）を窒素雰囲気下でゆっくり加えた。続いて、この反応物を周囲温度まで温め、１０時間攪拌した。反応の完了後、混合物を、砕いた氷（約２ｋｇ）でクエンチし、エチルアセテート（２×１Ｌ）で抽出した。有機層を水（１Ｌ）で洗浄して無用のＤＭＦを除去し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空下で蒸発乾固した。この粗化合物を６０〜１２０のシリカゲルで精製し、ＤＣＭ中の０〜５％ＭｅＯＨで溶出して、化合物２を黄白色の液体として得た（２２０ｇ、５４％）。Ｈ^１ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３３−７．２４（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．６３−３．６０（ｍ、２Ｈ）、３．４７−３．４３（ｍ、２Ｈ）、１．６３−１．５１（ｍ、４Ｈ）、１．３９−１．２３（ｍ、８Ｈ）

【0288】

（８−ブロモ−オクチルオキシメチル）−ベンゼン（３）の合成：化合物２（１３３ｇ、０．５６３５モル）を１．５ＬのＤＣＭに溶解させ、この攪拌溶液にＣＢｒ_４（２８０．３５ｇ、０．８４５６モル）を加え、その反応混合物を０℃まで不活性雰囲気下で冷却した。続いて、温度を２０℃未満に保ちながら、ＰＰｈ_３（２５１．０３ｇ、０．９５７１モル）を少しずつ加え、加え終わった後、その反応混合物を３時間、室温で攪拌した。反応の完了後、この反応混合物から沈殿した固体（ＰＰｈ_３Ｏ）をろ過によって単離し、このろ液を、砕いた氷（約１．５ｋｇ）で希釈し、ＤＣＭ（３×７５０ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空下で蒸留した。ヘキサン中の０〜５％エチルアセテートを溶出系として用いて、得られた粗化合物を６０〜１２０メッシュのシリカゲルカラムでマトグラフィーにかけて、化合物３を黄白色の液体として得た（１５０ｇ、８９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３３−７．２５（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．４７−３．４１（ｍ、２Ｈ）、３．４１−３．３７（ｍ、２Ｈ）、１．８６−１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．６２−１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．４２−１．２９（ｍ、８Ｈ）

【0289】

１，１７−ビス−ベンジルオキシ−ヘプタデカン−９−オール（４）の合成：
新たに活性化した削り状Ｍｇ（２４．０８ｇ、１．００３モル）を２００ｍＬの無水ＴＨＦに加えてから、その混合物に少量のヨウ素を不活性雰囲気下で加えた。グリニャール形成の開始後、発熱反応を制御しながら、化合物３（１５０ｇ、０．５０１６モル）を１Ｌの乾燥ＴＨＦに溶解させた溶液をゆっくり加えた。加え終わった後、その反応物を１時間加熱還流してから、室温まで冷却した。続いて、メチルフォーメート（６０．２４ｇ、１．００３３モル）をゆっくり加え、反応を２時間継続させた。完了後、１０％ＨＣｌに続いて水（１Ｌ）をゆっくり加えることによって、その反応物をクエンチし、エチルアセテート（３×１Ｌ）で抽出した。有機層を５リットルのビーカーに取り、５００ｍＬのメタノールで希釈し、０℃まで冷却した。この溶液に、過剰のＮａＢＨ_４（約５当量）を少しずつ加えて、ＨＣｌを加えても切断されなかったフォーメートエステルを加水分解させるようにした。得られた溶液を１時間攪拌してから、揮発性物質を真空下で除去した。残渣を水（１Ｌ）中に取り、１０％ＨＣｌ溶液によって酸性化した（Ｐ^Ｈ４）。続いて、この生成物をエチルアセテート（３×１Ｌ）で抽出した。続いて、有機相をロータリーエバポレーターで乾燥および濃縮して、化合物４を固体として得た（５７ｇ、２４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３５−７．３２（ｍ、８Ｈ）、７．２９−７．２４（ｍ、２Ｈ）、４．４９（ｓ、４Ｈ）、３．５６（ｍ、１Ｈ）、３．４６−３．４３（ｍ、４Ｈ）、１．６３−１．５６（ｍ、４Ｈ）、１．４４−１．３４（ｍ、２８Ｈ）。Ｃ^１３ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１３８．５６、１２８．２１、１２７．４９、１２７．３４、７２．７２、７１．７６、７０．３７、３７．３７、２９．６４、２９．５６、２９．４７、２９．３３、２６．０７、２５．５４

【0290】

［９−ベンジルオキシ−１−（８−ベンジルオキシ−オクチル）−ノニルオキシ]−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシラン（５）の合成：
化合物４（５６ｇ、０．１１９６モル）を７００ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させ、０℃まで冷却した。ＴＢＭＳ−Ｃｌ（３６．０６ｇ、０．２３９６モル）をゆっくり加えてから、イミダゾール（３２．５５ｇ、０．４７８６モル）を不活性雰囲気下で加えた。続いて、この反応物を室温で１８時間攪拌してから、氷（約１ｋｇ）でクエンチした。この生成物をエチルアセテート（３×５００ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で洗浄して酸性不純物を除去し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で蒸発させ粗化合物を得て、この粗化合物をシリカゲル（６０〜１２０メッシュ）によって精製し、０〜１０％エチルアセテートヘキサンで溶出して、化合物５を黄色っぽい油として得た（６０ｇ、８２％）。Ｈ^１ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．３３−７．２４（ｍ、１０Ｈ）、４．４９（ｓ、４Ｈ）、３．６０−３．５７（ｍ、１Ｈ）、３．４６−３．４３（ｍ、４Ｈ）、１．６１−１．５４（ｍ、４Ｈ）、１．４１−１．２６（ｍ、２８Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０２（ｓ、６Ｈ）

【0291】

９−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ヘプタデカン−１，１７−ジオール（６）の合成：
化合物５（６０ｇ、０．１０３０モル）を５００ｍＬのエチルアセテートに溶解させ、Ｎ_２で２０分間脱気した。パラジウム炭素（Ｐｄ１０重量％）（１２g）を加え、反応物を水素雰囲気下で１８時間攪拌した。完了後、この混合物をセライト床でろ過し、エチルアセテートで洗浄した。ろ液を真空下で蒸発させた。このようにして得られた化合物６（１９ｇ、４６％）は、次の反応を行うのに十分な純度であった。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝３．６４−３．５８（ｍ、５Ｈ）、１．５９（ｂｒ、２Ｈ）、１．５７−１．５１（ｍ、４Ｈ）、１．３８−１．２２（ｍ、２８Ｈ）、０．８７（ｓ、９Ｈ）、０．０２（ｓ、６Ｈ）

【0292】

９−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−ヘプタデカン二酸（７）の合成：
化合物６（２ｇ、０．００４９モル）を無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に攪拌溶解させた液に、ピリジニウムジクロメート（２．７ｇ、０．００７４モル）を０℃にて不活性雰囲気下で加えた。続いて、この反応混合物を１０〜１５分間かけて室温まで温め、２４時間置いた。続いて、この反応物を水（１００ｍＬ）で希釈した。ＤＣＭ（３×４０ｍＬ）を用いて水相を抽出した。有機相をブライン（１×２５ｍＬ）で洗浄し、真空下で濃縮し粗酸を得て、続いて、ヘキサン系中の０〜３０％エチルアセテートを用いて、この酸を（１００〜２００メッシュの）シリカゲルカラムによって精製した。純粋な生成物（化合物７）を黄白色の油として得た（０．７ｇ、３３％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝３．６１−３．５６（ｍ、１Ｈ）、２．３５−２．３２（ｍ、４Ｈ）、１．６４−１．５９（ｍ、４Ｈ）、１．４０−１．１９（ｍ、２４Ｈ）、０．８６（ｓ、９Ｈ）、０．０１７（ｓ、６Ｈ）、ＬＣ−ＭＳ[Ｍ＋Ｈ]−４３１．００、ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）純度−９６．９４％

【0293】

ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（８）の合成
二酸７（０．４２ｇ、０．９７ミリモル）を２０ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、これに、シス−２−ノネン−１−オール（０．３５ｇ、２．４４ミリモル）を加えてから、ヒューニッヒ塩基（０．６８ｇ、４．９ミリモル）およびＤＭＡＰ（１２ｍｇ）を加えた。この混合物に、ＥＤＣＩ（０．４７ｇ、２．４４ミリモル）を加え、その反応混合物を室温にて一晩攪拌した。続いて、この反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（４０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３（５０ｍＬ）、水（６０ｍＬ）、およびブライン（６０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空で除去した。このようにして得た粗生成物をＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｒｆの精製系（４０ｇシリカゲル、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の０〜１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、純粋な生成物８を無色の油として得た（０．３５ｇ、５３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ ^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ５．６４（ｄｔ、Ｊ＝１０．９、７．４Ｈｚ、２Ｈ）、５．５８−５．４３（ｍ、２Ｈ）、４．６１（d、Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、３．７１−３．４８（ｍ、１Ｈ）、２．３０（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、４Ｈ）、２．２０−１．９８（ｍ、４Ｈ）、１．７１−１．５３（ｍ、４Ｈ）、１．３１（ｄｄｄ、Ｊ＝８．３、７．０、３．７Ｈｚ、３４Ｈ）、１．０７−０．６８（ｍ、１４Ｈ）、０．０２（ｓ、５Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１７８．１８、１３９．８１、１２７．７８、８１．７３、８１．４２、８１．１０、７６．７２、６４．５９、４１．５２、４１．３２、３８．７６、３６．０９、３４．１０、３３．９３、３３．８０、３３．７０、３３．５９、３３．５５、３３．２６、３１．９５、３０．３４、２９．６９、２９．５８、２９．３９、２７．０１、２２．５６、１８．４８、０．０１

【0294】

ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−ヒドロキシヘプタデカンジオエート（９）の合成
シリル保護ジエステル８（０．３ｇ、０．４４ミリモル）をＴＢＡＦの１Ｍ ＴＨＦ溶液（６ｍＬ）に溶解させ、この溶液を４０℃で２日間置いた。この反応混合物を水（６０ｍＬ）で希釈し、エーテル（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、このようにして得た粗生成物をカラムによって精製して、純粋な生成物を単離した（０．０９７ｇ、３９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ５．６４（ｄｔ、Ｊ＝１０．９、７．４Ｈｚ、２Ｈ）、５．５２（ｄｔ、Ｊ＝１１．０、６．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．６１（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、３．５７（ｓ、１Ｈ）、２．３０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、４Ｈ）、２．０９（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ）、１．７５−１．５３（ｍ、４Ｈ）、１．５３−１．０６（ｍ、３６Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、 ６Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１７３．９８、１３５．６４、１２３．５７、７７．５４、７７．２２、７６．９１、７２．１４、６０．４１、３７．６９、３４．５４、３１．８９、２９．７０、２９．６０、２９．４４、２９．２９、２９．０７、２７．７６、２５．８０、２５．１５、２２．８２、１４．２９

【0295】

ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエートの合成
アルコール９（０．０８３ｇ、０．１４７ミリモル）を２０ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、これに、ジメチルアミノ酪酸ヒドロクロリド（０．０３０ｇ、０．１７６ミリモル）を加えてから、ヒューニッヒ塩基（０．０４５ｇ、０．４４ミリモル）およびＤＭＡＰ（２ｍｇ）を加えた。この混合物に、ＥＤＣＩ（０．０３４ｇ、０．１７６ミリモル）を加え、その反応混合物を室温にて一晩攪拌し、ＴＬＣ（シリカゲル、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ＭｅＯＨ）によって、出発物質のアルコールが完全に消失したことが示された。この反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（４０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３（５０ｍＬ）、水（６０ｍＬ）、およびブライン（６０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空で除去した。このようにして得られた粗生成物をＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｒｆの精製系（４０ｇシリカゲル、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の０〜１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、純粋な生成物を無色の油として単離した（０．０６２ｇ、６２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ５．７４−５．５８（ｍ、２Ｈ）、５．５１（ｄｔｔ、Ｊ＝９．７、６．８、１．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．９５−４．７５（ｍ、１Ｈ）、４．６１（d、Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、２．３５−２．２４（ｍ、８Ｈ）、２．２２（d、Ｊ＝７．９Ｈｚ、６Ｈ）、２．０９（ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、４Ｈ）、１．８３−１．７２（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｄｄ、Ｊ＝１４．４、７．２Ｈｚ、４Ｈ）、１．４９（d、Ｊ＝５．７Ｈｚ、４Ｈ）、１．４１−１．１３（ｍ、３０Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、６Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ１７３．７２、１７３．３６、１３５．４０、１２３．３５、７４．１２、６０．１８、５８．９５、４５．４６、３４．３０、３４．１１、３２．４５、３１．６７、２９．３８、２９．３５、２９．１７、２９．０７、２８．８４、２７．５３、２５．２８、２４．９３、２３．１６、２２．５９、１４．０６、Ｃ_４１Ｈ_７５ＮＯ_６（ＭＨ^＋）の分子量計算値：６７８．０４、実測値：６７８．５

【0296】

実施例８
本発明の化合物１の合成には、下記のさらに短いルートを用いてもよい。市販の９−ブロモノン−１−エン１０をマグネシウムで処理して、対応するグリニャール試薬を形成させ、この試薬をエチルフォーメートと反応させ、対応する付加体１１を得て、この付加体をブロモブチリルクロリドで処理して、ブロモエステル１２を得た。このブロモエステル１２をＲｕＯ_４で処理して、二酸１３を得た。このブロモ二酸１３をジメチルアミンで処理して、アミノ二酸１４を得た。このアミノ二酸１４をアルコール１５とカップリングして、目的の生成物を良好な収量で得た。
スキーム８

【化66】

【0297】

ノナデカ−１，１８−ジエン−１０−オール（１１）の合成
火力乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコに、新たに活性化した削り状Ｍｇ（９ｇ）を加え、そのフラスコにマグネチックスターバー、滴下漏斗、および還流冷却器を取り付けた。この装置を脱気し、アルゴン置換し、シリンジを介して１００ｍＬの無水エーテルをフラスコに加えた。ブロミド３（５１．３ｇ、２５０ミリモル）を無水エーテル（１００ｍＬ）に溶解させ、上記の滴下漏斗に加えた。勢いよく攪拌しながら、このエーテル溶液約５ｍＬを上記の削り状Ｍｇに加えた。発熱反応が確認され（グリニャール試薬の形成の確認／促進を行うために、５ｍｇのヨウ素を加え、急速な脱色が確認され、グリニャール試薬の形成が確認された）、エーテルの還流を開始した。フラスコを水中で冷やすことによって、穏やかな還流下で反応を維持しながら、ブロミド溶液の残りを滴下した。加え終わった後に、その反応混合物を３５℃に１時間保ってから、氷浴で冷やした。エチルフォーメート（９ｇ、１２１ミリモル）を無水エーテル（１００ｍＬ）に溶解させ、上記の滴下漏斗に移し、攪拌しながら上記の反応混合物に滴下した。発熱反応が観察され、上記の反応混合物の還流を開始した。反応の開始後、フォーメートのエーテル溶液の残りを液流として素早く加え、その反応混合物をさらに１時間、周囲温度で攪拌した。１０ｍＬのアセトンに続いて、氷冷水（６０ｍＬ）を滴下することによって、上記の反応物をクエンチした。溶液が均一になるまで、上記の反応混合物をＨ_２ＳＯ_４水溶液（１０体積％、３００ｍＬ）で処理し、層を分離した。水相をエーテル（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせたエーテル層を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濃縮し粗生成物を得て、この粗生成物をカラム（シリカゲル、ヘキサン中の０〜１０％エーテル）クロマトグラフィーによって精製した。この生成画分を蒸発させて、純粋な生成物１１を白色固体として得た（３０．６ｇ、９０％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ７．２６（ｓ、１Ｈ）、５．８１（ｄｄｔ、Ｊ＝１６．９、１０．２、６．７Ｈｚ、８Ｈ）、５．０４−４．８８（ｍ、１６Ｈ）、３．５７（ｄｄ、Ｊ＝７．６、３．３Ｈｚ、４Ｈ）、２．０４（ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１６Ｈ）、１．５９（ｓ、１Ｈ）、１．４５（d、Ｊ＝７．５Ｈｚ、８Ｈ）、１．４３−１．１２（ｍ、９４Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ｃｄｃｌ_３）δ１３９．４０、１１４．３３、７７．５４、７７．２２、７６．９０、７２．２１、３７．７０、３４．００、２９．８６、２９．６７、２９．２９、２９．１２、２５．８５

【0298】

ノナデカ−１，１８−ジエン−１０−イル４−ブロモブタノエート（１２）の合成
アルコール１１（５．６ｇ、２０モル）を無水ＤＣＭ（３００ｍＬ）に溶解させた溶液に、ブロモブチルクロリド（２０ミリモル）を０℃にて不活性雰囲気下でゆっくり慎重に加えた。この反応混合物を室温まで温め、２０時間攪拌し、ＴＬＣ（シリカゲル、ヘキサン中の１０％エチルアセテート）によってモニタリングした。反応が完了したら、混合物を水（４００ｍＬ）で希釈し、有機層を分離した。続いて、有機相をＮａＨＣＯ_３飽和溶液（１×４００ｍＬ）に続いてブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で濃縮した。続いて、粗生成物をシリカゲル（１００〜２００メッシュ）カラムによって精製し、ヘキサン中の２〜３％エチルアセテート溶液で溶出して、６ｇ（９０％）の所望の生成物１２を無色の液体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ５．８０（ｄｄｔ、Ｊ＝１６．９、１０．２、６．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．０５−４．８１（ｍ、５Ｈ）、３．４６（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．４８（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．１７（p、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．１１−１．９３（ｍ、４Ｈ）、１．６５−１．４４（ｍ、４Ｈ）、１．４３−１．１７（ｍ、１９Ｈ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ｃｄｃｌ_３）δ１７２．５１、１３９．３７、１１４．３５、７７．５４、７７．２３、７６．９１、７４．８６、３４．３１、３３．９９、３３．０１、３２．９６、２９．６５、２９．５６、２９．２４、２９．０９、２８．１１、２５．５２．

【0299】

９−（（４−ブロモブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（１３）の合成
ブロモエステル１２（１２．１ｇ、２８．２ミリモル）のジクロロメタン（３００ｍＬ）およびアセトニトリル（３００ｍＬ）溶液に、ＲｕＣｌ_３（１．１６ｇ、５モル％）を加え、その混合物を１０℃まで冷却し、水（４００ｍＬ）中のナトリウムメタペリオデート（６０ｇ）を滴下した。これを１０℃で２０時間攪拌した。この反応混合物を水で希釈した。その層を分離し、有機層に、飽和ブライン溶液を攪拌しながら加え、続いて、脱色（濃緑色から黄白色への脱色）のために、３％ナトリウムスルフィド溶液を滴下した。層を分離し、有機層をナトリウムサルフェートで乾燥し、減圧で蒸発させ、純粋な生成物を得た。Ｃ_２０Ｈ_３５ＢｒＯ_７の分子量計算値：４６７．３９、実測値：４６５．４（Ｍ−２Ｈ）

【0300】

９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（１４）の合成
ジメチルアミンの２Ｍ ＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）に、ブロモ酸１３（２ミリモル）を溶解させ、これに、１ｇの無水Ｋ_２ＣＯ_３を加え、この混合物を耐圧瓶中で５０℃にて一晩加熱した。ＴＬＣによって、反応の完了が示された。この反応混合物を酢酸で酸性化し、水（１００ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（２×６０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮乾燥し、そのままの状態で次の反応で用いた。Ｃ_２３Ｈ_４３ＮＯ_６の分子量計算値：４２９．５９、実測値：４３０．６（ＭＨ）^＋

【0301】

ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエートの合成
化合物８の合成に関して記載したように、二酸１４を対応するジエステルに変換したところ、解析データとスペクトルデータは、上記の生成物のデータと整合していた。

【0302】

実施例９
別のアプローチでは、本発明の化合物１の合成には、下記の合成アプローチを用いる。
スキーム９

【化67】

【0303】

実施例１０：本発明のカチオン性脂質由来のリポソームを用いたＦＶＩＩのインビボ評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マサチューセッツ州のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）に、食塩水または所望の調合物中のｓｉＲＮＡのいずれかを尾静脈注射によって、０．０１ｍＬ／ｇの体積で接種する。投与後さまざまな時点に、イソフルレン吸入によってマウスに麻酔し、眼窩後部採血によって血液を血清分離管中に採取した。発色アッセイ（オハイオ州ＤｉａＰｈａｒｍａ ＧｒｏｕｐのＣｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ、または、オハイオ州Ａｎｉａｒａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、サンプルにおいて、第ＶＩＩ因子タンパクの血清レベルを測定する。食塩水で処理したマウスから採取した血清を用いて、検量線を作成した。肝臓中ｍＲＮＡレベルを評価する実験では、投与後のさまざまな時点で、マウスを殺処分し、肝臓を回収し、液体窒素で急速冷凍する。冷凍した肝臓組織は粉砕する。組織溶解物を調製し、分岐ＤＮＡアッセイ（カリフォルニア州のＰａｎｏｍｉｃｓのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ）を用いて、第ＶＩＩ因子およびａｐｏＢの肝臓中ｍＲＮＡレベルを測定する。

【0304】

実施例１１：インビボのげっ歯類第ＶＩＩ因子サイレンシングモデルによる、さまざまなカチオン性脂質を含む脂質粒子調合物の効能の測定
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）（凝固カスケードにおける顕著なタンパク）は肝臓（肝細胞）で合成され、血漿に分泌される。血漿中のＦＶＩＩレベルは、簡単なプレートベースの比色アッセイによって測定することができる。したがって、ＦＶＩＩは、肝細胞由来タンパクのｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションを割り出すとともに、核酸脂質粒子およびｓｉＲＮＡ（表１９に示されているｓｉＲＮＡなど）の血漿中濃度および組織分布をモニタリングするための利便的なモデルの代表的なものである。

【表15】

【0305】

本明細書に記載されているカチオン性脂質を用いて、国際公開第２０１０／０８８５３７号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されているように、インライン混合法を用いて、ＡＤ−１６６１の二本鎖を含むリポソームを調合する。脂質粒子は、５０％のカチオン性脂質／１０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％のコレステロール／１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧ（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール、平均ＰＥＧ分子量：２０００）というモル比を用いて調合する。

【0306】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マサチューセッツ州のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）に、尾静脈注射によって、食塩水、または調合したｓｉＲＮＡのいずれかを接種する。投与後のさまざまな時点に、眼窩後部採血によって血清サンプルを採取する。発色アッセイ（オハイオ州のＡｎｉａｒａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ）を用いて、サンプルにおいて、第ＶＩＩ因子タンパクの血清レベルを測定する。第ＶＩＩ因子の肝臓中ｍＲＮＡレベルを測定するために、マウスを殺処分し、肝臓を回収し、液体窒素で急速冷凍した。冷凍した組織から組織溶解物を調製し、分岐ＤＮＡアッセイ（カリフォルニア州のＰａｎｏｍｉｃｓのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ）を用いて、第ＶＩＩ因子の肝臓中ｍＲＮＡレベルを定量化する。

【0307】

ＦＶＩＩ活性は、ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡで処理したマウスで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの静脈内（ボラス）注射後４８時間の時点に評価する。血清または組織中のタンパクレベルを測定するための市販のキットをメーカーの指示に従ってマイクロプレート規模で用いて、ＦＶＩＩを測定する。ＦＶＩＩの減少は、未処理のコントロールマウスを対照として測定し、その結果は、残存ＦＶＩＩの割合（％）として表す。それぞれの新規リポソーム組成物のスクリーニングでは、２つの投与レベル（０．０５および０．００５ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を用いる。

【0308】

実施例１２：予形成ベシクルを用いる、ｓｉＲＮＡの調合
予形成ベシクル法を用いて、カチオン性脂質含有粒子を作製する。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ−脂質をそれぞれ４０／１０／４０／１０というモル比で、エタノールに可溶化する。この脂質混合物を混合しながら水性緩衝液（５０ｍＭシトレート、ｐＨ４）に加え、最終的なエタノール濃度がが３０％（体積／体積）、最終的な脂質濃度が６．１ｍｇ／ｍＬになるようにし、室温で２分間平衡化してから押し出す。ベシクルの直径（Ｎｉｃｏｍｐ解析によって割り出す）が７０〜９０ｎｍになるまで、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて、２２℃で、ポアサイズ８０ｎｍのフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を２枚積み重ねたものに水和脂質を通して押し出す。このためには一般に、１〜３回通す必要がある。小ベシクルを形成しないいくつかのカチオン性脂質混合物では、その脂質混合物を低ｐＨ緩衝液（５０ｍＭシトレート、ｐＨ３）で水和させて、ＤＳＰＣ頭部基上のフォスフェート基をプロトン化することによって、安定的な７０〜９０ｎｍのベシクルの形成を助ける。

【0309】

ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ（５０ｍＭシトレートに可溶化したもの、３０％エタノールを含むｐＨ４の水溶液）を混合しながら、３５℃に予め平衡化したベシクルに、約５ｍＬ／分の速度で加える。最終的な標的ｓｉＲＮＡ／脂質比０．０６（ｗｔ／ｗｔ）になったら、その混合物をさらに３０分間、３５℃でインキュベートして、ベシクルの再構成とＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡの封入を行う。続いて、エタノールを除去し、透析、またはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションにかけるかのいずれかによって、外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と置き換える。サイズ排除スピンカラムまたはイオン交換スピンカラムを用いて、非封入ｓｉＲＮＡの除去後、封入ｓｉＲＮＡの脂質に対する最終的な比率を割り出す。

【0310】

実施例１３：脂質調合物の効能のインビボ測定
最初に、雌７〜９週齢、１５〜２５gの雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスで、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、および５．０ｍｇ／ｋｇ（処理グループ当たり３匹のマウス）にて、試験調合物のＦＶＩＩノックダウンを評価する。すべての調査には、フォスフェート緩衝化食塩水（ＰＢＳ、コントロールグループ）またはベンチマーク調合物のいずれかを接種したマウスが含まれている。調合物は、試験直前に、ＰＢＳ中における適切な濃度まで希釈する。マウスの体重を測定し、適切な投与量を計算する（体重１ｇ当たり１０μｌ）。試験およびベンチマーク調合物、ならびにＰＢＳ（コントロールマウス用）を外側尾静脈によって静脈内投与する。２４時間後、ケタミン／キシラジンの腹腔内注射によってマウスに麻酔し、心臓穿刺によって、血清分離管（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）に５００〜７００μｌの血液を採取する。血液を２，０００×ｇで１０分間、１５℃で遠心分離し、血清を回収し、解析まで−７０℃で保管する。血清サンプルを３７℃で３０分間解凍し、ＰＢＳで希釈し、９６ウェルのアッセイプレートに分注する。発色アッセイ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄのＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩキット）をメーカーの指示に従って用いて、第ＶＩＩ因子レベルを評価し、４０５ｎｍ波長フィルターを備えたマイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。血漿中ＦＶＩＩレベルを定量化し、コントロールマウスから採取した血清のプールサンプルから作成した検量線を用いて、ＥＤ_５０（コントロールマウスのＦＶＩＩレベルと比べて、血漿中ＦＶＩＩレベルを５０％低下させる投与量）を計算する。高レベルのＦＶＩＩノックダウン（ＥＤ_５０＜＜０．１ｍｇ／ｋｇ）を示した当該調合物を、さらに低い投与量範囲の別個の実験で再試験して、効力を確認するとともに、ＥＤ_５０レベルを定める。

【0311】

実施例１４：マウスにおける脂質プロファイルと組織浄化を割り出すための調査
本発明によるカチオン性脂質の、マウスにおける脂質プロファイルと組織浄化を割り出す目的で調査を行った。

【0312】

雄マウス（Ｃ５７ＢＬ、２０〜３０ｇ）を４つのグループに分け、下記の表２０に示されているように、本発明の化合物１、２、もしくは３、または対照脂質のいずれかを（静脈内）投与した。

【表16】

【化68】

【0313】

マウスは絶食させなかった。投与後０．１７時間、８時間、２４時間、７２時間、１６８時間、３３６時間、および６７２時間に、血液、肝臓、および脾臓のサンプル（グループ当たりタイムポイントごとに２つのサンプル）を回収した。

【0314】

図１は、グループＩ〜ＩＶのそれぞれのマウスの経時肝臓中脂質濃度を示している。肝臓中薬物動態データを下記の表２１に示す。

【表17】

【0315】

化合物１および３の予想代謝経路が図２に示されている。これらの代謝産物の濃度は、肝臓で測定した。その結果は下記の表２２に示されている。２４時間後のすべての測定値は、（投与後７２時間、１６８時間、３３６時間、および６７２時間の測定値を含め、）定量化レベルを下回っていた（ＢＬＱ）。

【表18】

【0316】

図３は、グループＩ〜ＩＶのそれぞれのマウスの経時脾臓中脂質濃度を示している。脾臓中薬物動態データを下記の表２３に示す。

【表19】

【0317】

脾臓中の化合物１〜３の代謝産物の濃度を測定し、その結果は下記の表２４に示されている。

【表20】

【0318】

図４は、グループＩ〜ＩＶのそれぞれのマウスの経時血漿中脂質濃度を示している。血漿中薬物動態データを下記の表２５に示す。

【表21】

【0319】

血漿中の化合物１〜３の代謝産物の濃度を測定し、その結果は下記の表２６に示されている。２４時間後のすべての測定値は、（投与後７２時間、１６８時間、３３６時間、および６７２時間の測定値を含め、）定量化レベルを下回っていた（ＢＬＱ）。

【表22】

【0320】

図１、３、および４、ならびに表２２、２４、および２６から分かるように、本発明の化合物１、２、および３は、対照脂質と比べると、組織浄化性と活性が大幅に向上している。

【0321】

上記の詳述に鑑み、実施形態に対して上記およびその他の変更を行うことができる。一般に、下記の特許請求の範囲では、用いられている用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示されている具体的な実施形態に限定するものと解釈すべきではなく、本発明の特許請求に付与されるすべての範囲の均等物とともに、考え得るあらゆる実施形態を含むものと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】