特許 5896612 細胞足場材

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5896612

(24)【登録日】2016年3月11日

(45)【発行日】2016年3月30日

(54)【発明の名称】細胞足場材

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/00 20060101AFI20160317BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/00 F

【請求項の数】3

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2011-59899(P2011-59899)

(22)【出願日】2011年3月17日

(65)【公開番号】特開2012-192105(P2012-192105A)

(43)【公開日】2012年10月11日

【審査請求日】2014年1月21日

(73)【特許権者】

【識別番号】000106324

【氏名又は名称】サンスター株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】興村 祐介

(72)【発明者】

【氏名】喜多 一吉

(72)【発明者】

【氏名】花木 尚幸

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５１７７３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３６８４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２３６４５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０６３８２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−２１１４７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５１４５５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１３６６５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１０２６０６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ １５／００−３３／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

不織布を含む細胞足場材であって、
該不織布の平均ポアサイズが７．５〜１０μｍであり、
該不織布を構成する繊維がポリ乳酸及び／又はポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体からなる繊維であり、
該繊維の平均繊維径が１〜３μｍである、
細胞足場材。

【請求項2】

骨芽細胞増殖用である、請求項１に記載の細胞足場材。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の細胞足場材を含む骨再生用材料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細胞足場材に関する。より詳しくは、本発明は特定の不織布を含む細胞足場材に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、再生医療に関する様々な研究が行われている。細胞を増殖することにより、身体組織を再生させる研究も、再生医療研究の一分野として、研究が活発に行われている。細胞を増殖し、身体組織を再生させ、医療に応用するためには、効率よく細胞を増殖させ、所望の形状及び／又は機能を有する組織を製造することが求められる。このような所望の組織を製造するため、細胞が増殖する際に足場となる材料（細胞足場材）が用いられることが多い。例えば、皮膚の再生においては、特に生体適合性材料を細胞足場材として用い、損傷した皮膚の代わりに細胞を増殖させて製造した皮膚を移植するといった医療が行われている。

【0003】

このような細胞足場材としては、例えば、特許文献１において、約１．２〜４．０μｍの平均直径を有するグリコリド含有繊維を含む足場が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】ＷＯ２００７／１３２１８６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、従来品に比べ、さらに効率のよい細胞増殖を可能とする、細胞足場材を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、驚くべき事に、不織布を含む細胞足場材であって、該不織布の平均ポアサイズが約６〜５０μｍであり、該不織布を構成する繊維が生体適合性繊維であり、該繊維の平均繊維径が約０．１〜３μｍである、細胞足場材であれば、非常に効率よく細胞を増殖させることが可能であることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の細胞足場材及び骨再生用材料を包含する。
項１．
不織布を含む細胞足場材であって、
該不織布の平均ポアサイズが６〜５０μｍであり、
該不織布を構成する繊維が生体適合性繊維であり、
該繊維の平均繊維径が０．１〜３μｍである、
細胞足場材。
項２．
生体適合性繊維が、生体適合性ポリマーを含んでなる繊維である、項１に記載の細胞足場材。
項３．
生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、キチン、コラーゲン、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒアルロン酸、セリシン、セルロース、デキストラン、及びプルランからなる群より選択される少なくとも１種である、項２に記載の細胞足場材。
項４．
生体適合性繊維がポリ乳酸からなる繊維である、項１〜３のいずれかに記載の細胞足場材。
項５．
骨芽細胞増殖用である、項１〜４のいずれかに記載の細胞足場材。
項６．
項１〜５のいずれかに記載の細胞足場材を含む骨再生用材料。

【発明の効果】

【0007】

本発明の細胞足場材は、非常に細胞（特に骨芽細胞）の増殖効率が高い（細胞増殖能が高い）ため、組織再生のために好ましく用いることができる。特に、骨再生用材料として好適に用いることができる。具体的には、外的要因（例えば事故）により骨が損傷した場合や、内的要因（例えば骨粗鬆症、歯周病）により骨が少なく又は無くなった場合に、本発明の不織布を含む細胞足場材を適用することで、（具体的には、患部に埋めたり貼付したり等することで）早期の骨の再生を達成することができる。また、人工皮膚や人工骨等の人工組織製造の際に足場として用いることもできる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】エレクトロスピニング法による不織布の製造方法の簡単な概要を示す。

【図2】各不織布を用いた際の細胞増殖性評価（DNA量比較）の結果を示す。具体的には、培養5時間後、3日目、8日目での評価サンプル中に存在する細胞を溶解させ、得られたＤＮＡ量を蛍光強度で比較した結果を示す。（n=3）

【図3】各不織布を通過した細胞（シャーレ底面の細胞）の数を、細胞溶解液中のDNA量を蛍光強度で比較した結果を示す。（n=2）

【図4a】不織布Ａを用いて細胞を培養した後、ギムザ染色を行った結果を示す。

【図4b】不織布Ｂを用いて細胞を培養した後、ギムザ染色を行った結果を示す。

【図4c】不織布Ｃを用いて細胞を培養した後、ギムザ染色を行った結果を示す。

【図4d】不織布Ｄを用いて細胞を培養した後、ギムザ染色を行った結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。なお、「質量」は「重量」と読み替えてもよい。

【0010】

本発明は、不織布を含む細胞足場材に係る。該不織布の平均ポアサイズは約６〜５０μｍであり、該不織布を構成する繊維は生体適合性繊維であり、該繊維の平均繊維径は約０．１〜３μｍである。

【0011】

本発明の細胞足場材は、種々の細胞を増殖させるために用いることができる。本発明の効果が発揮される限度において、細胞の種類は特に制限されないが、動物（特に哺乳動物）由来の細胞が好ましく、また、結合組織由来の細胞が好ましい。具体的には、骨芽細胞、繊維芽細胞、幹細胞等が例示され、より具体的には、骨芽細胞、歯根膜繊維芽細胞、歯肉繊維芽細胞、セメント芽細胞、間葉系幹細胞等が例示される。

【0012】

該不織布を構成する繊維は、生体適合性繊維である。生体適合性繊維とは、生体適合性ポリマーを含んでなる繊維をいう。生体適合性ポリマーの含有率は、９０質量％以上が好ましく、９５質量％以上がより好ましく、実質的に１００％であることが（即ち、生体適合性ポリマーからなる生体適合性繊維が）さらに好ましい。

【0013】

生体適合性ポリマーとは、生体に接着させた場合又は埋め込んだ場合に、異物反応が無い若しくは小さい（長期間にわたって生体に悪影響も強い刺激も与えず、本来の機能を果たしながら生体と平和共存できる）ポリマーをいう。生体吸収性ポリマーや生体分解性ポリマーが例示できる。

【0014】

より具体的には、生体適合性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリヘキサメチレンカーボネート、ポリアリレート、ポリビニルイソシアネート、ポリブチルイソシアネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリノルマルプロピルメタクリレート、ポリノルマルブチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルノルマルプロピルエーテル、ポリビニルイソプロピルエーテル、ポリビニルノルマルブチルエーテル、ポリビニルイソブチルエーテル、ポリビニルターシャリーブチルエーテル、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンクロリド、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾル）、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリビニルメチルケトン、ポリメチルイソプロペニルケトン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリシクロペンテンオキシド、ポリスチレンサルホン、テフロン（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリウレタン、ポリイミド、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン（超高分子量ポリエチレン含む）、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン（ポリビニリデンジフルオライド）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン並びにこれらの共重合体等の合成ポリマー、再生セルロース、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、フィブロイン、天然ゴム等の生体高分子とその誘導体が例示される。また、キチン、ゼラチン、コラーゲン、ポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアルギニン）、ヒアルロン酸、セリシン、デキストラン、プルラン等も例示される。

【0015】

これらのうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリブチレンアジペート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート及びポリシアノアクリレート、並びにこれらの共重合体などの脂肪族ポリエステル、ポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネートなどの脂肪族ポリカーボネートを好ましい例として挙げることができ、更に好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンが挙げられる。なかでもポリ乳酸が特に好ましい。生体適合性ポリマーは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0016】

なお、本発明の効果を損なわない範囲で、他のポリマーや化合物を併用（例えばポリマー共重合体、ポリマーブレンド、リン脂質、その他化合物等、及びこれらの混合物）してもよい。

【0017】

該不織布を構成する繊維の平均繊維径は、約０．１〜３μｍであり、好ましくは約０．３〜２．９μｍ、より好ましくは約０．５〜２．８μｍ、さらに好ましくは約１〜２．５μｍである。なお、ここでの繊維径は繊維の直径をいう。また、当該平均繊維径は、該不織布の電子顕微鏡撮影映像から各繊維の直径を測定し、ランダムに選択した５０本の繊維径から算出した平均値をいう。

【0018】

また、該不織布の平均ポアサイズ（細孔径）は、約６〜５０μｍであり、好ましくは約６．５〜４０μｍであり、より好ましくは約７〜３０μｍであり、さらに好ましくは約７〜２０μｍであり、よりさらに好ましくは約７．５〜１０μｍである。なお、ここでの不織布の平均ポアサイズは、プロピレン，１，１，２，３，３，３酸化ヘキサフッ素（商品名「Ｇａｌｗｉｃｋ」）を用いたハーフドライ法（ＡＳＴＭ Ｅ１２９４−８９）により測定して求められる値をいう。当該測定にはcapillary flow porometer（Porous Materials Inc、CFP-1200-AEL）を用いることができる。

【0019】

該不織布の空隙率は、約９４〜９７％であることが好ましい。当該空隙率は、次の式により求めることができる。なお、原料として用いる生体適合性ポリマーの密度は、気体置換法（ＪＩＳ Ｒ１６２０；アルゴンガスを用いた測定方法）により求めた値を用いる。

【0020】

空隙率（％）＝〔１−｛見かけ密度（ｇ／ｃｍ^３）／原料の密度（ｇ／ｃｍ^３）｝〕×１００

【0021】

ここで、見かけ密度（ｇ／ｃｍ^３）は、次の式により求めた値である。
見かけ密度（ｇ／ｃｍ^３）＝｛サンプル重量（ｇ）／サンプル体積（ｃｍ^３）｝

【0022】

サンプルとは、該不織布の一部である。具体的には、該不織布を長方形に切断（約４ｃｍ^２程度）したものである。なお、該サンプルの重量がサンプル重量であり、該サンプルの縦、横、及び厚みを測定し、縦、横、厚みの長さを乗じて求めた体積がサンプル体積である。該サンプルの厚みは、切断面を撮影した電子顕微鏡画像から測定した値である。電子顕微鏡として、例えば株式会社日立ハイテクノロジー、Ｓ−３２００Ｎ，Ｓ−３０００Ｎを用い得る。また、原料の密度とは、不織布の原料の密度をいう。例えば、不織布を構成する繊維が、ポリ乳酸からなる繊維である場合は、ポリ乳酸の密度をいう。

【0023】

本発明の細胞足場材に含まれる不織布は、エレクトロスピニング法により製造することができる。エレクトロスピニング法は、不織布を製造する手法の一つとして周知の方法である。具体的には、ポリマー（及び、必要に応じて分散補助剤）を揮発性溶媒（例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール、又はこれらの混合溶液等）に溶解した溶液を、電極間で形成された静電場中に吐出し、溶液を電極（アース電極）に向けて曵糸することにより、繊維状物質を製造する方法である。エレクトロスピニング法のごく簡単な概要を図１に示す。なお、図１は例示である。公知のエレクトロスピニング法であり、本発明の不織布を製造できる方法であれば、本発明に用いることができる。図１を簡単に説明する。高電圧を、シリンジ（先端にノズル装着）中のポリマー溶解溶液に付加すると、ポリマー溶液のドロップが鋭い円錐となる。そして、さらに電圧が増すと、溶液はアース電極（例えば銅、アルミ等）に向かって飛ぶ（噴霧される）ことになり、アース電極上で薄い繊維の膜（即ち不織布）を形成する。つまり、図１では、アース電極がコレクターを兼ねる。

【0024】

本発明において、エレクトロスピニング法に使用する生体適合性ポリマー溶解溶液中の生体適合性ポリマーの濃度は、適宜設定できるが、通常１〜３０質量％程度、好ましくは２〜２５質量％程度、より好ましくは３〜２０質量％程度である。

【0025】

また、電極間の距離（図１ではシリンジとアース電極間の距離）は、帯電量、ノズル寸法、紡糸液流量、紡糸液濃度等に依存しており、適宜設定することができるが、例えば印加電圧が１０ｋＶ程度のときには５〜５０ｃｍ程度が好ましく、１０〜３０ｃｍ程度がより好ましい。また、印加される静電気電位は、通常３〜１００ｋＶ程度、好ましくは５〜５０ｋＶ程度、さらに好ましくは５〜３０ｋＶ程度である。

【0026】

本発明の不織布を含む細胞足場材は、上述した特定の平均ポアサイズ、並びに特定の繊維及び平均繊維径を有する不織布を含むことにより、非常に良好な細胞増殖効率を達成することができる。

【0027】

本発明の細胞足場材は、特に、骨再生用材料として用いるのに適している。よって、本発明は、上記の細胞足場材を含む骨再生材料も包含する。外的要因（例えば事故）により骨が損傷した場合や、内的要因（例えば骨粗鬆症、歯周病）により骨が少なく又は無くなった場合に、本発明の細胞足場材を適用することで、（具体的には、患部に埋めたり貼付したりすることで）骨の早期再生を達成することができる。

【0028】

制限はされないが、本発明の細胞足場材は、特にインプラント治療における歯槽骨の再生のために好ましく用いることができる。例えばＧＢＲ法（骨再生誘導法：guided bone regeneration）において、歯槽骨が不足している部分（患部）に詰めて骨再生を促進させるために用いることができるし、ＧＢＲ膜の代わりに用いることもできる。

【0029】

またさらに、本発明の細胞足場材は、骨再生用材料として用い得ることから、例えば以下に記載する治療、術式又は用途に用いることができる。
＜歯周組織再生、口腔外科領域＞
骨縁下欠損、クラスII根分岐部病変、退縮型欠損、裂開型欠損における組織再生誘導法；顎堤の骨造成術、歯槽提増大術、インプラント周囲の骨造成術における骨再生誘導法；顎堤形成術；上顎洞底挙上術におけるサイナスリフト法；抜歯窩の保存におけるソケットプリザベーション法；鼻腔底挙上術；骨延長手術、骨壊死部分の掻爬後の骨充填、骨組織のがん病巣掻爬後の骨充填、外傷による骨折の治療のための骨充填における骨再建術；ブリッジ下の歯肉増大、歯肉退縮への根面被服、歯間乳頭再建、その他歯肉増大など審美目的での施術、等
＜整形外科領域＞
骨延長手術；骨壊死部分の掻爬後、骨組織のがん病巣掻爬後、外傷による骨折の治療、脊椎圧迫骨折、偽関節治療における骨再建術；骨延長手術：骨粗鬆症の治療における薬効成分のキャリアー材としての使用、等
＜皮膚再生用途＞
やけど、挫傷、褥瘡、切り傷等の治療、人工皮膚の製造など
＜口腔粘膜再生用途＞
口腔炎、口腔内の傷、白板症等の治療など

【実施例】

【0030】

以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、実験に際して当該技術分野の教科書等（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (3 Vol. Set) ；Cold Spring Harbor Laboratory Press）を適宜参照してもよい。
不織布の製造
ポリ乳酸（フナコシ、Ｐｏｌｙ （Ｌ−Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ） 重量平均分子量３００，０００）を、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）：ジクロロメタン（ＤＭ）＝８：２の混合溶液に溶解し、表１に示す各ポリ乳酸溶液を１０ｇずつ調製した。調製したポリ乳酸溶液をシリンジ（Ｈｅｎｋｅ ＳＡＳＳ ＷＯＬＦ、５ｍＬ）に充填し、針（テルモ、ノンベベル針２１Ｇ１．１／２）をシリンジに装着して、エレクトロスピニング装置にセットした。シリンジからターゲットとなるアースとの距離を１０ｃｍとし、印加電圧１０ｋＶにて、アースに向けポリ乳酸を噴霧し（噴霧量０．６μＬ／sec、噴霧時間３時間）、各不織布を作成した。表１の通り、ポリ乳酸溶液濃度を変えて各不織布（不織布Ａ〜Ｄ）を作成した。

【0031】

【表1】

【0032】

不織布の物性評価
以下の手順により、上記４種の不織布（不織布Ａ〜Ｄ）の厚み、見かけ密度、空隙率（％）、ポアサイズ及び各不織布を構成する繊維の繊維径を測定した。
＜厚み、見かけ密度、空隙率＞
各不織布をそれぞれ長方形に切断（約４ｃｍ^２程度）し、測定サンプルとした。当該測定サンプルの重量を測定した。さらに当該測定サンプルの縦及び横の長さをノギスで測定した。また、当該測定サンプルの厚みを、当該サンプルの切断面の電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジー、Ｓ−３２００Ｎ，Ｓ−３０００Ｎ）画像から求めた。そして、縦、横、厚みの長さを乗じて体積（ｃｍ^３）を求めた。なお、厚みは、２０箇所の測定値の平均値を用いた。

【0033】

サンプル重量と体積から、かさ密度を次の式により求めた。

【0034】

見かけ密度（ｇ／ｃｍ^３）＝サンプル重量（ｇ）／サンプル体積（ｃｍ^３）

【0035】

さらに、求めた見かけ密度値から、次の式により空隙率を求めた。なお、次式の“原料密度”は、用いたポリ乳酸の密度（JIS R1620で測定）であり、具体的には１．２６ｇ／ｃｍ^３である。

【0036】

空隙率（％）＝｛１−（見かけ密度／原料密度）｝×１００

【0037】

＜平均ポアサイズ＞
各不織布を直径2.5cmにカットし、プロピレン，１，１，２，３，３，３酸化ヘキサフッ素（商品名「Ｇａｌｗｉｃｋ」）に浸した。そして、ポアサイズをcapillary flow porometer（Porous Materials Inc、CFP-1200-AEL）を用いてハーフドライ法（ＡＳＴＭ Ｅ１２９４−８９）により測定した。

【0038】

＜平均繊維径＞
走査型電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジー、Ｓ−３４００Ｎ）を用いて各不織布断面を撮影し、５００倍の電顕撮影映像からＩｍａｇｅ Ｊ（ｖｅｒ．１．４３ｕ）（ＮＩＨ開発の画像処理ソフトフェア）により繊維径を測定した。繊維５０本の繊維径の平均値を、各不織布の平均繊維径とした。

【0039】

以上の物性評価の結果を表２に示す。

【0040】

【表2】

【0041】

不織布の細胞増殖性評価
＜細胞培養＞
各評価サンプル（上記不織布Ａ〜Ｄ）を、４８穴シャーレ（住友ベークライト（株）、ＳＵＭＩＬＯＮ、ＭＳ−８０４８０）の底面と同じ大きさにカットし、４８穴シャーレの底に設置した。評価サンプルをペニシリンカップ（ステンレス管）で押さえ、１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地（抗生物質とグルタミン酸を加えた１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地、以下１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地）を５００μＬ加え湿らせた。プレート遠心機にて５ｍｉｎ遠心した（２５００ｒｐｍ、室温）。減圧脱気し、５ｍｉｎ遠心（２５００ｒｐｍ、室温）した。さらに２００μＬの１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で、１ｈｒ以上インキュベートした。培地を５００μＬ吸い取り廃棄した。事前に培養したＭＧ−６３（由来：ヒト骨肉腫、ヒューマンサイエンス研究資源バンク、Ｌｏｔ．０５２６２００４）を１．６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地に懸濁し、１００μＬずつ各ｗｅｌｌに播種した（１．６×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。５時間放置した後、２００μＬの１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ培地を加え、培養を開始した。培養５時間後、３日後、８日後のサンプルを細胞増殖性評価に使用した。細胞浸潤性評価には、５時間後のサンプルを取り出したシャーレを用いた。

【0042】

＜細胞増殖性評価＞
既定の日数培養した細胞が付着した各評価サンプルを取り出し、それぞれＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の入ったシャーレに加えた。ＰＢＳを含んだ状態の重量を測定し、乾燥重量とＰＢＳを含んだ状態の評価サンプル重量から吸水量（ＰＢＳを含んだ状態の評価サンプル重量から、評価サンプルの実験に供される前の乾燥重量（シャーレ底面と同じ大きさにカットした時点で測定）を減じた量）を求めた。

【0043】

サンプルの吸水量とＴＥ緩衝液（Tris/Tris-HCl 10 mM、 EDTA 1mM）を合わせた溶液量が７００μＬとなるようにＴＥ緩衝液を各シャーレに加えた。２回凍結融解（−８０℃で凍結させ、室温で融解させる操作を２回繰り返した）を行い、その後超音波処理を３０分行って、細胞を破砕した。ＴＥ緩衝液中にＤＮＡを溶出させた１００μＬの細胞溶解液（凍結融解及び超音波処理を行って得た細胞破砕液）を９６穴蛍光測定用プレート（Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ、ｃａｔ．１３７１０１）に加え測定サンプルとした。

【0044】

ピコグリーン（インビトロジェン）をＴＥ緩衝液で希釈（１００μＬを２０ｍＬに希釈）し、測定サンプルに１００μＬ加え、５分間、室温でインキュベートした。蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ｇｅｍｉｎ ＸＰＳ）を用い、励起光４８０ｎｍ・測定波長５２０ｎｍで、蛍光強度を測定した。ピコグリーンは、２本鎖ＤＮＡ特異的染色剤であるため、得られた蛍光強度はＤＮＡ量（ひいては細胞数）を反映する。そして、ＤＮＡ量は細胞増殖量を反映する。従って、得られた蛍光強度は、細胞増殖量を反映する。結果を図２に示す。

【0045】

＜細胞浸潤性（通過性）評価＞
細胞の浸潤性の評価として、培養５時間後の不織布を取り出した後のシャーレに付着する細胞数をＤＮＡの蛍光強度として定量した。具体的には、次のようにして行った。すなわち、不織布を取り出した後のシャーレを５００μＬのＰＢＳにて洗浄した。５０μＬの０．２５％ＥＤＴＡ−トリプシン液（0.25%トリプシン、１mM EDTA）を加え、細胞をシャーレより剥がした。得られた細胞にＰＢＳ１５０μＬとＴＥ緩衝液を５００μＬとを加え細胞回収液とした。２回凍結融解（−８０℃で凍結させ、室温で融解させる操作を２回繰り返した）を行い、その後超音波処理を３０分行って、細胞を破砕した。ＴＥ緩衝液中にＤＮＡを溶出させた１００μＬの細胞溶解液（凍結融解及び超音波処理を行って得た細胞破砕液）を９６穴蛍光測定用プレート（Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ、ｃａｔ．１３７１０１）に加え、５分間室温でインキュベートして測定サンプルとした。

【0046】

ピコグリーン（インビトロジェン）をＴＥ緩衝液で希釈（１００μＬを２０ｍＬに希釈）し、測定サンプルに１００μＬ加え、５分間、室温でインキュベートした。蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ｇｅｍｉｎ ＸＰＳ）を用い、励起光４８０ｎｍ・測定波長５２０ｎｍで、蛍光強度を測定した。結果を図３に示す。

【0047】

また、さらに、以下のようにしてギムザ染色を行うことによっても、細胞の浸潤性を検討した。

【0048】

各評価サンプル（不織布Ａ〜Ｄ）を４８穴シャーレ（住友ベークライト（株）、ＳＵＭＩＬＯＮ、ＭＳ−８０４８０）の底面と同じ大きさにカットし、４８穴シャーレの底に置いた。評価サンプルの上にペニシリンカップ（ステンレス管）を置き、１０％ＦＢＳ／Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ（抗生物質とアスコルビン酸を加えた１０％ＦＢＳ／Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ、以下１０％ＦＢＳ／Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ）を６００μＬ加えた。プレート遠心機にて５ｍｉｎ遠心した（２５００ｒｐｍ、室温）。減圧脱気し、さらに５ｍｉｎ遠心（２５００ｒｐｍ、室温）した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で、１ｈｒ以上インキュベートした。培地を２００μＬ吸い取り廃棄した。事前に培養した正常ヒト骨芽細胞（ＬＯＮＺＡ社、Ｌｏｔ．６Ｆ４３６０）を１．１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ／Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、１５０μＬずつ各ｗｅｌｌに播種した（１．６５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。播種翌日のサンプルに対し、ギムザ染色を行った。

【0049】

ギムザ染色は、具体的には次のように行った。培養後、培養上清を捨て、６００μＬのＰＢＳにて洗浄した（２回）。１０％中性ホルムアミド６００ｍＬを用いた３０分固定した。固定したサンプルをＰＢＳで洗浄した（３回）。４％ギムザ染色液／ＰＢＳ（ｐＨ６．４）を６００μＬ加え、３０分間染色した。ギムザ液を廃棄し、蒸留水８００μＬで洗浄した（３回）。サンプルを乾燥しデジタルマイクロスコープ（（株）キーエンス、ＶＨＸ−５００Ｆ）にて観察した。結果を図４に示す。

【0050】

以上の結果から、細胞の湿潤性は平均ポアサイズが大きい程向上することがわかった（図３及び図４）。しかし、細胞の増殖性については、ポアサイズが大きいほど良好な訳ではなく、平均ポアサイズが６〜５０μｍ程度、平均繊維径が０．１〜３μｍ程度の特定の不織布が好ましいことがわかった（図２）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】