特許 5902174 抗癌性抽出物及び化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5902174

(24)【登録日】2016年3月18日

(45)【発行日】2016年4月13日

(54)【発明の名称】抗癌性抽出物及び化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 311/62 20060101AFI20160331BHJP

   A61K 31/353 20060101ALI20160331BHJP

   A61K 36/41 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160331BHJP

【ＦＩ】

   C07D311/62

   A61K31/353

   A61K36/41

   A61P35/00

【請求項の数】8

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2013-530555(P2013-530555)

(86)(22)【出願日】2011年9月30日

(65)【公表番号】特表2013-544766(P2013-544766A)

(43)【公表日】2013年12月19日

(86)【国際出願番号】CN2011080480

(87)【国際公開番号】WO2012041256

(87)【国際公開日】20120405

【審査請求日】2013年7月12日

(31)【優先権主張番号】61/388,180

(32)【優先日】2010年9月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509069917

【氏名又は名称】ナショナル ヤン−ミン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ホアン・チ−イン

【審査官】 鶴見 秀紀

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−１４５８２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Chen,Shu-Ju et al，In vitro Antioxidant and Antiproliferative Activity of the Stem Extracts from Graptopetalum paraguayense，American Journal of Chinese Medicine ，２００８年，36(2)，pp.369-383

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ３１１／６２

Ａ６１Ｋ ３１／３５３

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式（Ｉ）の構造を備え、

【化1】

式中、Ｒのうち１つがＨ、またはプロシアニジン（ＰＣ）単位であり、その他がＯＨまたはプロデルフィニジン（ＰＤ）単位であり、ｎが２１〜３８までの数字であり、ＰＣ単位：ＰＤ単位が１：２０以下であることを特徴とする、化合物。

【請求項2】

グラプトペタルム属、イワベンケイ属、エケベリア属から構成される群より選択された植物由来であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

オボロヅキまたはイワベンケイ由来であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

治療に有効な量の請求項１の化合物と、製薬上許容できる担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。

【請求項5】

抗癌活性を有することを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

癌の予防または治療に用いる医薬組成物であって、治療有効量の請求項１の化合物と、製薬上許容できる担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。

【請求項7】

前記癌が肝臓癌である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記肝臓癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は植物から抽出された抗癌活性を備えた新規抽出物及び新規化合物に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
オボロヅキ（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ Ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ、ＧＰ）は漢方薬草の一種であり、健康にさまざまな有益性がある。古い中国の処方によると、ＧＰは肝臓病の緩和、血圧の抑制、肌の美白、痛み及び感染の緩和、炎症の抑制、脳機能の改善など有益な効果を多く備えているとされている。

【0003】

研究において、ＧＰの葉の抽出物がチロシナーゼ及びアンジオテンシン変換酵素の活性を抑制し、体外試験において遊離基を除去できることが示されている（Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｊ ｅｔ ａｌ．、Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ Ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ Ｅ． Ｗａｌｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １００：１０３２〜１０３６、２００７；Ｃｈｕｎｇ， Ｙ−Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ Ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ Ｅ． Ｗａｌｔｈｅｒ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９１：４１９〜４２４、２００５；Ｈｕａｎｇ，Ｋ−Ｆ ｅｔ ａｌ．、Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ Ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ Ｅ． Ｗａｌｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｎ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８９：５８３〜５８７、２００５．）。ＧＰの水及び５０％エタノール、９５％エタノール茎抽出物には抗酸化活性があることが分かり、これら抽出物のヒトＨＣＣ細胞株（ＨｅｐＧ２）の増殖に対する抑制作用について分析が行われた（Ｃｈｅｎ， ＳＪ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ Ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ． Ａｍ Ｊ Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ ３６：３６９〜３８３、２００８）。体内試験の研究ではＧＰの葉抽出物がミクログリア活性、酸化ストレス、ｉＮＯＳ発現を抑制し、虚血性脳障害を軽減することが示された（Ｋａｏ，ＴＫ ｅｔ ａｌ．、Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ Ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ Ｅ． Ｗａｌｔｈｅｒ ｌｅａｆ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒａｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ ３８：４９５〜５１６、２０１０．）。

【0004】

Ｈｓｕにより２００４年に出願され、２００８年に登録された米国特許第７３６４７５８号において、体内及び体外試験でオボロヅキからのエタノール抽出物には抗肝繊維症と抗炎症の効果があることが開示されている。その後２００８年に出願され、２００９年に登録されたその一部継続出願である米国特許第７５８８７７６号では、オボロヅキの水溶性画分が炎症、脂肪変性、繊維症など肝臓病または肝疾患の治療に効果があることが示された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

発明の概要
本発明は植物、特にグラプトペタルム属（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ ｓｐ．）の植物から単離された新規抽出物及びその画分、新規化合物に関するものである。また本発明は、新規抽出物または新規化合物を使用した癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療向けの新たな方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一側面によれば、本発明はグラプトペタルム属（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ ｓｐ．）、イワベンケイ属（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｓｐ．）、エケベリア属（Ｅｃｈｅｖｅｒｉａ ｓｐ．）から構成される群より選択された植物からジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で抽出された、抗癌活性を備えた抽出物を提供する。本発明は予期せずしてＤＭＳＯ抽出物に抗癌活性があることを発見した。

【0007】

本発明の一実施形態において、前記植物はオボロヅキ（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ）またはイワベンケイ（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ）である。本発明の一実施例において、前記抽出物は植物を３０％ＤＭＳＯで抽出して得られる。

【0008】

別の一側面によれば、本発明はグラプトペタルム属（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ ｓｐ．）、イワベンケイ属（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｓｐ．）、エケベリア属（Ｅｃｈｅｖｅｒｉａ ｓｐ．）から構成される群より選択された植物、特にオボロヅキまたはイワベンケイから得た豊富な抗癌成分を含む画分を提供する。この画分はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で前記植物を抽出した後、クロマトグラフィーで単離して、細胞毒性作用と、癌細胞中のＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０の発現を下方制御する効果を備えたＨＨ−Ｆ３と呼ばれる画分を得ることで調製される。

【0009】

本発明の一実施形態において、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムがクロマトグラフィーカラムに使用される。本発明によると、本発明による前記画分は高い細胞毒性作用を備え、Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞中におけるＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０の発現の下方制御に有効である。

【0010】

ＨＨ−Ｆ３画分の機構解明において、ＨＨ−Ｆ３画分がＨＣＣのアポトーシスを誘発したことが分かった。つまり、ＨＨ−Ｆ３画分には癌細胞、特にＨＣＣの治療効果があることが示された。

【0011】

さらに別の一側面によれば、本発明は以下の式（Ｉ）の構造を備え、

【化1】

式中、Ｒのうち１つがＨ、またはプロシアニジン（ＰＣ）であり、その他がＯＨまたはプロデルフィニジン（ＰＤ）単位であり、ｎが２１〜３８までの数字であり、ＰＣ単位：ＰＤ単位＜１：２０である、化合物を提供する。前記プロシアニジン（ＰＣ）単位の構造が、

【化2】

であり、前記プロデルフィニジン（ＰＤ）の構造が、

【化3】

である。

【0012】

本発明によると、前記式（Ｉ）の化合物は、グラプトペタルム属（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ ｓｐ．）、イワベンケイ属（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｓｐ．）、またはエケベリア属（Ｅｃｈｅｖｅｒｉａ ｓｐ．）から構成される群より選択された植物から単離することができる。本発明の一実施形態において、前記化合物はオボロヅキまたはイワベンケイの画分から精製される。式（Ｉ）の化合物は３，４，５−トリヒドロキシベンジル部分が豊富で、抗癌活性を備えていることが分かった。

【0013】

さらに別の一側面によれば、本発明は本発明の抽出物、画分、または化合物、及び製薬上許容できる担体を含む組成物または医薬組成物を提供する。さらに、前記医薬組成物は肝臓癌、特にＨＣＣなどの癌の予防または治療において有効な抗癌活性を備えている。

【0014】

さらに別の一側面によれば、本発明は癌、特にＨＣＣの治療用薬剤の調製における、本発明の抽出物、画分、または式（Ｉ）で表される化合物の使用を提供する。

【0015】

さらに別の一側面によれば、本発明は、本発明の抽出物、画分、または化合物の治療に有効な量を必要とする患者に投与することを含む、癌の予防または治療方法を提供する。本発明の一実施例において、前記癌はＨＣＣである。

【0016】

図面の簡単な説明
本発明の上述の概要と、以下に述べる詳細な説明は、付属の図面と共に参照することでより良く理解されるであろう。本発明を例示する目的のため、図面には現時点で好ましい実施形態が示されている。ただし、本発明は図面に示される実施形態に限定されないと理解されるべきである。

【0017】

図面において：

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１はクロマトグラムと溶出勾配曲線をそれぞれ線Ｘと線Ｙで示した、本発明によるＨＨ−Ｆ３画分のＨＰＬＣフィンガープリントである。

【0019】

【図2】図２は本発明によるＨＨ−Ｆ３画分の細胞毒性増加効果を示す図である。そのうち、図２（Ａ）はＨｕｈ７における効果、図２（Ｂ）はＭａｈｌａｖｕ細胞における効果を異なる溶剤から調製された他の抽出物と比較して示す。そのうちＨｕｈ７細胞（Ａ）とＭａｈｌａｖｕ細胞（Ｂ）は水、アセトン、メタノール、１００％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、１００％ＤＭＳＯ、３０％ＤＭＳＯから調製されたＧＰ抽出物で、１００、１５０、２５０、５００、７５０、１０００、１５００μｇ／ｍｌの濃度において７２時間処理された後、細胞のＭＴＴ試験が行われた。これら抽出物の調製のうち、３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物が７２時間の時点でＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞において最も顕著な細胞生存率の抑制効果を示した。

【0020】

【図3】図３はＨＳＣ−Ｔ６（Ａ）、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞（（Ｂ）と（Ｃ））における間期とＭ期中の複数の有糸分裂調節因子分解減少における、本発明によるＨＨ−Ｆ３画分の効果を示す図である。そのうち（Ａ）ＨＳＣ−Ｔ６細胞は３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物で処理され、細胞溶解物に抗Ｆｌｊ１０５４０及び抗Ａｕｒｋｂ抗体でイムノブロット試験が行われた。（Ｂ）ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞は、多様な濃度の３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物で処理され、細胞溶解物に抗ＦＬＪ１０５４０、抗ＡＵＲＫＡ、抗ＡＵＲＫＢ抗体でイムノブロット試験が行われた。（Ｃ）ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞は７５ｎｇ／ｍｌのノコダゾール（ＮＯＣ）で１６〜１８時間処理された。同調剤（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）での前処理後、７５０μｇ／ｍｌの３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物またはビヒクル対照（３０％ＤＭＳＯ）でさらに３時間処理され、抗ＦＬＪ１０５４０、抗ＡＵＲＫＡ、抗ＡＵＲＫＢ抗体を使用してウェスタンブロットが行われた。重要点は次のとおりである。（１）ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０は間期細胞と比較して有糸分裂期細胞で高い発現を示した。（２）間期と中期におけるＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０のタンパク質発現レベルが３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物での処理後、いずれも抑制された。

【0021】

【図4】図４はＨＣＣ細胞株：Ｈｕｈ７細胞（Ａ）及びＨｅｐＧ２とＨｕｈ７細胞（Ｂ）における、本発明によるＨＨ−Ｆ３画分のＡＵＲＫＡタンパク質発現抑制効果を示す図である。そのうち（Ａ）Ｈｕｈ７細胞は、水、アセトン、メタノール、１００％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、１００％ＤＭＳＯ、３０％ＤＭＳＯから調製されたＧＰ抽出物で、５００μｇ／ｍｌの濃度において４８時間処理された。３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物による処理後、ＡＵＲＫＡ発現レベルが抑制された。（Ｂ）ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞においてＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０の発現レベルは水及びＢｕＯＨ画分によって抑制されなかった。

【0022】

【図5】図５は２つのＨＣＣ細胞株：Ｈｕｈ７細胞（Ａ）とＭａｈｌａｖｕ細胞（Ｂ）において、本発明によるＨＨ−Ｆ３画分の細胞毒性発生における時間依存的及び剤量依存的反応を示す図である。そのうちＨｕｈ７細胞（Ａ）とＭａｈｌａｖｕ細胞（Ｂ）は３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物で、０、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌの濃度において２４、４８、７２時間処理された後、ＭＴＴ試験が行われた。Ｈｕｈ７細胞及びＭａｈｌａｖｕ細胞において３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物によって引き起こされた成長抑制のＩＣ_５０値はそれぞれ４８時間で約５００μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌであった。

【0023】

【図6】図６はＨＣＣ細胞株におけるＡＵＲＫＡタンパク質発現に対するＧＰの異なる精製画分の効果を示す図である。図６（Ａ）はＧＰ抽出物と本発明によるＨＨ−Ｆ３画分の精製方式を示す。図６（Ｂ）は３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物、ＨＨ−Ｆ１、ＨＨ−Ｆ２、ＨＨ−Ｆ３、ＨＨ−Ｆ４で３時間処理されたＨｅｐＧ２細胞を示す。ＨｅｐＧ２細胞においてＨＨ−Ｆ１、ＨＨ−Ｆ２、ＨＨ−Ｆ４画分での処理でＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢ発現レベルは抑制されなかった。図６（Ｃ）は３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物とＨＨ−Ｆ３画分での処理後にＡＵＲＫＡの発現が抑制されたことを示す。図６（Ｄ）はＨＨ−Ｆ３ａ画分での処理後にＡＵＲＫＡの発現が抑制されたことを示す。

【0024】

【図7】図７はＨｕｈ７細胞（Ａ、Ｅ）、Ｍａｈｌａｖｕ細胞（Ｂ、Ｆ）、ＰＬＣ５細胞（Ｃ、Ｇ）、ＨＳＣ−Ｔ６細胞（Ｄ）の細胞生存率における本発明によるＨＨ−Ｆ３画分の抑制効果を示す図である。ここで、Ｈｕｈ７（Ａ、Ｅ）、Ｍａｈｌａｖｕ（Ｂ、Ｆ）、ＰＬＣ５（Ｃ、Ｇ）、ＨＳＣ−Ｔ６（Ｄ）細胞がＨＨ−Ｆ３画分で５、２５、５０、７５μｇ／ｍｌの濃度において２４、４８、７２時間処理された後、ＭＴＴ試験（Ａ〜Ｄ）とトリパンブルー試験（Ｅ〜Ｆ）が行われた。Ｈｕｈ７、Ｍａｈｌａｖｕ、ＰＬＣ５、ＨＳＣ−Ｔ６細胞においてＨＨ−Ｆ３画分での処理により引き起こされた細胞生存率抑制のＩＣ_５０値はそれぞれ７２時間で約５０、３７．５、７５、２０μｇ／ｍｌであった。

【0025】

【図8】図８はＨＣＣ細胞株と活性肝星状細胞においてＨＨ−Ｆ３画分がＡＵＲＫＡとＦＬＪ１０５４０を下方制御することを示す図である。図８（Ａ）はＨｕｈ７、Ｍａｈｌａｖｕ、ＰＬＣ５細胞がＨＨ−Ｆ３画分で２５、５０または７５μｇ／ｍｌの濃度において３時間処理され、抗ＦＬＪ１０５４０と抗ＡＵＲＫＡ抗体でのイムノブロット解析によると、ＡＵＲＫＡとＦＬＪ１０５４０両方の発現が濃度依存的に下方制御されたことを示す。図８（Ｂ）はＨＳＣ−Ｔ６細胞がＨＨ−Ｆ３画分で５、１５、５０μｇ／ｍｌの濃度において３時間処理され、Ｆｌｊ１０５４０発現が濃度依存的に下方制御されたことを示す。

【0026】

【図9】図９はＨＣＣ細胞株においてアポトーシスを引き起こすＨＨ−Ｆ３画分の効果を示す図である。ここでＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞がＨＨ−Ｆ３で５、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度において４８時間処理された。図９（Ａ）は細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーにより分析したＤＮＡ含量を示す。ｓｕｂ−Ｇ１細胞群の増加はＨＨ−Ｆ３画分がＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞のアポトーシスまたは壊死を誘発することを示している（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１）。図９（Ｂ）と図９（Ｃ）は、ＨＨ−Ｆ３画分での２４時間と４８時間（Ｂ）、及び４８時間（Ｃ）の処理後、抗開裂カスパーゼ−３及び開裂ＰＡＲＰ（Ｂ）及び抗ＦＡＳ、抗Ｂｃｌ−２、抗Ｂｃｌ−ｘＬ（Ｃ）について細胞可溶化物のイムノブロット解析を行った。結果、開裂カスパーゼ−３、開裂ＰＡＲＰ、ＦＡＳの発現レベルが増加し、一方Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬが減少したことから、細胞にアポトーシスが起こったことが示された。

【0027】

【図10】図１０はＨＣＣ細胞株でのミトコンドリア膜電位の減少とＲＯＳ産生の増加におけるＨＨ−Ｆ３画分の効果を示す。図１０（Ａ）と図１０（Ｂ）はＪＣ−１ミトコンドリア膜電位試験を使用してＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞のミトコンドリア膜電位（ΔΨ）を解析し、細胞のΔΨがＨＨ−Ｆ３画分で５、１０、１５、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度において４８時間（ｎ＝２）処理した後、減少したことを示している（ＲＦＵ＝ΔΨ）。図１０（Ｃ）と図１０（Ｄ）は、ハイドロエチジン（ＨＥ）染色によって測定した細胞内超酸化物（Ｏ_２⁻）レベルが、５、１０、１５、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度における４８時間のＨＨ−Ｆ３画分処理後に対照のＨＣＣ細胞（ＤＭＳＯで処理されたＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞）と比較して大幅に減少したことを示している。図１０（Ｅ）と図１０（Ｆ）は、ＤＣＦＨで測定した細胞内過酸化物のレベルが、５、１０、１５、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度における４８時間のＨＨ−Ｆ３画分処理後に対照のＨＣＣ細胞（ＤＭＳＯで処理されたＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞）と比較して増加したことを示している。ＨＨ−Ｆ３画分での処理後、Ｈｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞において細胞内過酸化物と超酸化物の産生が剤量依存的に増加したことが分かった。

【0028】

【図11】図１１はＨｕｈ７細胞でのＡＫＴ−Ｓｅｒ^４７３リン酸化抑制とＰＴＥＮタンパク質発現の活性化におけるＨＨ−Ｆ３画分の効果を示す図である。抗ＦＬＪ１０５４０、抗ＡＵＲＫＡ、抗ＡＫＴ−Ｓｅｒ^４７３、抗ＰＴＥＮ抗体でのイムノブロット解析によると、２５、５０、または７５μｇ／ｍｌの濃度においてＨＨ−Ｆ３画分で４８時間処理した後、ＡＵＲＫＡ、ＦＬＪ１０５４０、ＡＫＴ−Ｓｅｒ^４７３が発現が下方制御され、一方ＰＴＥＮが濃度依存的に上方制御された。

【0029】

【図12】図１２は硬変した肝臓と腫瘍量におけるヒドロキシプロリン含量の減少に関するＧＰ抽出物と本発明によるＨＨ−Ｆ３画分の効果を示す。ここで動物は４群に分けられ、材料及び方法で説明するように、水道水のみ（正常群）またはＤＥＮ溶液（他群）が供給された。図１２（Ａ）は肝硬変動物における胆汁流量（肝機能を測定するために記録された）の減少を示している（＊Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。図１２（Ｂ）は、肝硬変動物における脾臓肥大を示しており、ここでは脾臓重量と体重（ＢＷ）が測定され、脾臓重量／ＢＷとして表されている。ＤＥＮ群の脾臓重量／ＢＷ比は正常群より大幅に高く、脾腫が肝硬変に関連する門脈圧亢進症に起因するものであることを示しており（Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）、一方で高用量群の脾臓重量／ＢＷ比のみがＤＥＮ群（Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）よりも大幅に低かった。図１２（Ｃ）は、硬変した肝臓におけるコラーゲン含量の増加を示しており、ここで肝硬変は肝臓のヒドロキシプロリン含量のレベルを測定することで判定され、高用量群、ＨＨ−Ｆ３群と対照群を比較したとき大幅な減少が観察された。図１２（Ｄ）はＤＥＮにより誘発されたα−ＳＭＡの発現を示している。ＤＥＮ処理の過程において各群からの肝臓試料のホルマリン／パラフィン切片を抗α−ＳＭＡ抗体で染色し、デジタルカメラシステムにより１０倍視野下で最も濃い染色区域を観察してα−ＳＭＡ（＋）区域の割合を判定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、ＡＮＯＶＡ）。図１２（Ｅ）はＤＥＮにより誘発された酸化ストレスを示す。ＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｌｕｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）は超酸化物に曝露されると不溶性の青色ホルマザン誘導体に還元される染色剤であり、青色沈殿物は組織中の超酸化物の存在を示す組織学的マーカーとして光学顕微鏡検査により判別でき、材料及び方法で説明するように、１０倍視野下で最も濃い染色区域を観察してＮＢＴ（＋）集合密度を判定した。図１２（Ｆ）は腫瘍量の測定を示しており、ここでは犠牲死させた動物から取得した肝臓を５ｍｍの切片にスライスし、直径が３ｍｍより大きい可視の腫瘍結節すべての数をカウントして大きさを測定した。腫瘍量は結節の体積合計で表されている（＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＤＥＮ群と比較）。図（Ｇ）は化学物質誘発ＨＣＣと肝硬変の外観図であり、ここで飲用水中にＤＥＮを添加して９週間経口投与したマウスの肝臓には、硬変した肝臓内に複数の肝臓腫瘍が発生し、これら動物には表面の肉芽形成と境界に起伏のある複数の肝臓腫瘍の形成が観察された。

【0030】

【図13】図１３はＨＣＣ細胞株の細胞生存抑制と、ＡＵＲＫＡタンパク質発現の下方制御におけるイワベンケイ抽出物の効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

発明の説明
異なる定義がなされていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。

【0032】

本明細書において使用される「ある」、「その」等の単数形には、文脈上明らかに単数である場合を除いて、複数の指示対象も含まれる。即ち、例えば「（ある）試料（ａ ｓａｍｐｌｅ）」と言う場合には、こうした試料及び当業者に公知のその等価物が複数ある場合も含まれる。

【0033】

本発明は、グラプトペタルム属、イワベンケイ属、またはエケベリア属から構成される群より選択された植物をＤＭＳＯで抽出して調製した新規抽出物（ＧＰ抽出物という）を提供する。本発明は予期せずしてＧＰ抽出物に抗癌活性があることを発見した。

【0034】

本発明によると、前記抽出物はこの技術において一般的に用いられる、または標準的な方法を用い、前記植物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で抽出して調製することができる。本発明の一実施例において、植物の葉を磨砕・凍結乾燥して粉末状とし、ＤＭＳＯ、好ましくは３０％のＤＭＳＯとボルテックスで撹拌（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）した。ＤＭＳＯでの抽出前にメタノール（ＭｅＯＨ）での抽出が含まれてもよい。

【0035】

「グラプトペタルム属（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ）」という用語は、グラプトペタル属のあらゆる植物、その一部あるいは複数の部分を指す。２つ以上のグラプトペタル属の種、またはその一部の組み合わせも含まれる。グラプトペタルム属は好ましくはオボロヅキ（Ｇｒａｐｔｏｐｅｔａｌｕｍ ｐａｒａｇｕａｙｅｎｓｅ）である。

【0036】

本明細書で使用する「イワベンケイ属（Ｒｈｏｄｉｏｌａ）」という用語は、イワベンケイ属のあらゆる植物、その一部あるいは複数の部分を指す。２つ以上のイワベンケイ属の種、またはその一部の組み合わせも含まれる。イワベンケイ属は好ましくはイワベンケイ（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ）である。

【0037】

本明細書で使用する「エケベリア属（Ｅｃｈｅｖｅｒｉａ）」という用語は、エケベリア属のあらゆる植物、その一部あるいは複数の部分を指す。２つ以上のエケベリア属の種、またはその一部の組み合わせも含まれる。エケベリア属は好ましくは養老（Ｅｃｈｅｖｅｒｉａ ｐｅａｃｏｃｋｉｉ）である。

【0038】

本発明の好ましい一実施例において、前記植物はオボロヅキまたはイワベンケイである。

【0039】

本明細書で使用する「抽出物」という用語は、抽出される物質を溶媒に浸漬するか、または溶媒と混合して得られた溶液を指す。本発明において、抽出物はＤＭＳＯ抽出物である。

【0040】

本発明は、豊富な抗癌成分を含むグラプトペタルム属、イワベンケイ属、エケベリア属から構成される群より選択される植物からの画分も提供する。前記画分はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で前記植物を抽出し、その後クロマトグラフィーで単離してＨＨ−Ｆ３と呼ばれる画分を得ることで調製される。本発明の一実施例において、前記植物はオボロヅキまたはイワベンケイである。前記画分はＤＭＳＯで前記植物を抽出し、クロマトグラフィーで単離して、ＨＨ−Ｆ３と呼ばれる画分が得られる。本発明の一実施例において、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムがクロマトグラフィーに使用される。前記画分は細胞毒性を生じる効果と、癌細胞、特にＨｕｈ７細胞やＨｅｐＧ２細胞などのＨＣＣ細胞株においてＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０の発現を下方制御する効果を有することが分かった。ＨＨ−Ｆ３画分の機構解明を行い、それによるとＨＨ−Ｆ３画分がＨＣＣのアポトーシスを誘発したことが示された。したがって、ＨＨ−Ｆ３画分は癌、特にＨＣＣなど肝臓癌の予防または治療用の治療剤となり得る。

【0041】

本発明の一実施例により、ＨＨ−Ｆ３画分から透析によってＨＨ−Ｆ３ａと呼ばれる細画分が取得された。その後、ＨＨ−Ｆ３ａ画分から既知のプロアントシアニジン化合物とは異なる活性化合物が単離された。取得された前記化合物は、３，４，５−トリヒドロキシベンジル部分において豊富にプロアントシアニジン（プロアントシアニジン）を含有する。前記化合物は次の式（Ｉ）の構造で示される。

【化4】

式中、Ｒのうち１つがＨ、またはプロシアニジン（ＰＣ）単位であり、その他がＯＨまたはプロデルフィニジン（ＰＤ）単位であり、ｎが２１〜３８までの数字であり、ＰＣ単位：ＰＤ単位＜１：２０である。前記プロシアニジン（ＰＣ）単位の構造が、

【化5】

であり、前記プロデルフィニジン（ＰＤ）の構造が、

【化6】

である。

【0042】

したがって、本発明は抗癌活性を有することが実証されている式（Ｉ）の化合物を提供する。本発明の一実施例において、式（Ｉ）の前記化合物は、グラプトペタルム属、イワベンケイ属またはエケベリア属の植物からＤＭＳＯでＤＭＳＯ抽出物を抽出して取得することができる。ウェスタンブロットによるＡＵＲＫＡの下方制御の解析を使用してＤＭＳＯ抽出物を選択し、透析と更なる精製により「ＨＨ−Ｆ３ａ」と呼ばれる細画分を得る。

【0043】

本発明は、治療有効量の本発明の抽出物、画分または式（Ｉ）の化合物と、製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物を提供する。

【0044】

本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、治療の意図する目的を達するに足る薬剤の量を指す。例えば、ＨＣＣの治療に有効なグラプトペタルム属の量は、ＨＣＣ細胞を殺すに足る量である。特定の薬剤の治療に有効な量は、薬剤の性質、投与経路、薬剤を受け入れる動物の種及び大きさ、投与の目的などの要因によって異なる。個別案における治療に有効な量は、本発明の開示及び分野において確立された方法に基づき当業者が経験的に判断することができる。
本発明の医薬組成物は、非経口または経口投与を含むがこれらに限定されない、適切な経路で投与することができる。非経口投与向けの医薬組成物には、溶液、懸濁液、乳剤、及び使用直前に溶媒に溶解または懸濁される固形注射用組成物が含まれる。注射剤は１つ以上の活性成分を希釈剤で溶解、懸濁、または乳化させて調製することができる。前記希釈剤の例としては、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、アルコール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、前記注射剤は安定剤、可溶化剤、懸濁剤、乳化剤、緩和剤、緩衝化剤、保存料などを含むことができる。前記注射剤は最終製剤手順において滅菌されるか、または滅菌手順によって調製される。本発明の医薬組成物は、例えば凍結乾燥により、滅菌固形製剤として調製することもでき、滅菌後、または使用直前に滅菌注射用水またはその他滅菌希釈剤に溶解させて使用することができる。

【0045】

本発明によると、前記組成物は経口経路で投与してもよく、その場合前記組成物は固形または液体の形態とすることができる。固形組成物は錠剤、丸剤、カプセル剤、分散性粉末剤、顆粒剤などを含む。また、前記経口組成物は口腔に付着されるうがい薬及び舌下錠も含む。カプセル剤は硬質カプセルと軟質カプセルを含む。経口用途のこれら固形組成物において、１つ以上の活性化合物が単独で、または希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤と混合して従来の製剤に調製される。必要時、そのような製剤はコーティング剤で剤皮を施すか、２層以上のコーティング層で剤皮を施すことができる。一方、経口投与向けの液体組成物は、薬学的に許容可能な水溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル剤などを含む。そのような組成物において、一般的な希釈剤（精製水、エタノール、それらの混合物など）中で１つ以上の活性化合物が溶解、懸濁または乳化される。そのような希釈剤のほか、前記組成物は湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、甘味剤、香味剤、香料、保存料、緩衝化剤などなどを含むこともできる。

【0046】

実施例中で本発明の抽出物、画分または化合物、あるいはその医薬組成物がＨＣＣ細胞においてアポトーシスを引き起こしたことが確認されており、それらが抗癌活性を備え、癌、特にＨＣＣの予防または治療に用いることができることが示唆されている。また一方で、線維症、特に肝線維症の治療に有効であることが示唆されている。

【0047】

したがって、本発明は癌、特にＨＣＣの治療用薬剤の調製における、本発明の抽出物、画分、または式（Ｉ）で表される化合物の使用を提供する。また、本発明は、必要とする患者に、治療に有効な量の本発明の抽出物、画分または化合物を投与することを含む、癌または線維症、特にＨＣＣ及び肝線維症の予防または治療方法を提供する。

【0048】

以下の実施例は、本発明を例示しているが、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。

【実施例】

【0049】

実施例

【0050】

実施例１：ＧＰまたはイワベンケイからの抽出及び精製

【0051】

オボロヅキ（ＧＰという）の葉を磨砕し、−２０℃で凍結乾燥して粉末とした後、抽出の前に防湿室内において２５℃で保管した。最初に、１．５ｇのＧＰ粉末を１０ｍｌの１００％メタノール（ＭｅＯＨ）と共に５分間ボルテックスで撹拌し、その後１５００ｇで５分間遠心分離した。上清を除去した後、１０ｍｌのＨ_２Ｏ、１００％アセトン、１００％メタノール、１００％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、１００％ＤＭＳＯ、３０％ＤＭＳＯを各ペレットに添加して各抽出物の再懸濁を行った。懸濁物を５分間ボルテックスで撹拌して混合し、１５００ｇで５分間、２回遠心分離した後、再度９３００ｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍフィルタを使用して層流により室温でろ過した。３０％ＤＭＳＯの上清は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにより４つの画分（Ｆ１〜Ｆ４）に分画されるか、−２０℃で１５０ｍｇ／ｍｌの原液（３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物という）として保管された。ＧＰ抽出物またはＨＨ−Ｆ３画分は、活性化合物を取得するため、透析膜（ＭＷＣＯ １２−１４，０００）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）により水に対して透析された。ウェスタンブロットによるＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０のタンパク質レベル解析を使用してＨＨ−Ｆ３画分と呼ばれる活性分子を解析した。加えて、ＨＨ−Ｆ３画分をさらにＨＰＬＣと^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより解析し、活性分子の構造を識別した。

【0052】

同様に、イワベンケイ（ＲＳという）植物を凍結乾燥して粉末とした後、抽出の前に防湿室内において２５℃で保管した。１．５ｇのＲＳ粉末を１０ｍｌのＨ_２Ｏに溶解させ、１５００ｇで５分間遠心分離した後、０．４５μｍフィルタを使用して層流により室温でろ過した。試料は１５０ｍｇ／ｍｌの原液として−２０℃で保管された。

【0053】

本発明のＨＨ−Ｆ３画分の化学分析によると、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける大量の芳香族シグナルから、その主要成分がポリフェノール化合物であることが識別された。ＨＨ−Ｆ３画分中の主要な化合物は、凍結乾燥後のその特有のピンク色と、部分的に分銀色の金属様の光沢という特徴から、タンニンであることが識別された。濃縮タンニン定量の比色分析法（ＯＤ_５００でのモニタリング時標準としてカテキンを使用）によって判定されたＨＨ−Ｆ３画分のタンニン総含量は約６８％であった。ＨＨ−Ｆ３画分のＨＰＬＣフィンガープリント（図１）によると、化合物の２群（Ａ群とＢ群）はＨＨ−Ｆ３画分において異なる分子量の範囲を有することが示され、かつＢ群では１つの主成分と１つの微量成分が検出された。プロアントシアニジンに富んだ高分子量の画分、ＨＨ−Ｆ３ａ（出発原料ＨＨ−Ｆ３の量と比較して収率７１．９％）が透析を使用してＨＨ−Ｆ３画分から調製された。簡単に説明すると、ＨＨ−Ｆ３（１１２．１ｍｇ）を透析膜（ＭＷＣＯ １２−１４，０００）により水に対して透析し、内膜画分（ＨＨ−Ｆ３Ａ、８０．６ｍｇ）と外膜画分（７．４ｍｇ）を得た。この画分が活性化合物を含み、これはウェスタンブロットによるＡＵＲＫＡの消失を測定することで判定された（図６Ｄ）。ＨＨ−Ｆ３ａのプロアントシアニジン画分の主要骨格はプロアントシアニジンポリマーであると判定され（以下を参照）、平均分子量（ｍＭＷ）、平均重合度（ｍＤＰ）、ＰＣ：ＰＤ率及び立体化学（シス：トランス）を含むその生理化学的特性を表１に示す。ｍＭＷとｍＤＰは、分解された末端と伸長したモノマーの比率を分析することで判定される。さらに、調製手順を簡潔にするため、ＧＰ抽出物を水に対して直接透析する別の方法（方法ＩＩ）が実施され、方法ＩＩにより調製された化合物の生理化学的データも表１に示す。表１に示された生理化学的特性によると、方法ＩＩにより調製された画分は方法Ｉ（ＨＨ−Ｆ３ａの調製に使用した方法）によるそれと同じであることが示唆されている。

【化7】

ＨＨ−Ｆ３ａの予測構造：プロデルフィニジン比率が高い（＞９５％）重合性プロアントシアニジン（２１＜ｎ＜３８）。

【表1】

【0054】

ＧＰ由来の重合性化合物はこれまで報告されていないため、別の貴重なイワベンケイ属（Ｃｒａｓｓｕｌａｃｅｏｕｓ）の薬草、イワベンケイ（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ）（ゴールデンルート）由来のポリフェノール化合物がＨＨ−Ｆ３ａの構造識別の参照化合物として使用される。イワベンケイは重合性プロアントシアニジン（ＰＡＣ）を有することが報告されている。ＨＨ−Ｆ３ａ画分における主要化合物の構造はイワベンケイのプロアントシアニジン化合物と非常に類似している（表２参照）が、プロシアニジン単位（ＰＣ単位）に対するシグナルはマイナー（＜５％）で、これは^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（δ_Ｃ １１４ｐｐｍ、Ｂ環Ｃ−２’及びＣ−５’）では検出不能であった。さらに、ＰＡＣ化合物はヴィティスヴェニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）など多くの一般的なブドウ品種でよく見受けられる。したがって、ヴィティスヴェニフェラ由来のＰＡＣも比較に用いられる。表２にイワベンケイとヴィティスヴェニフェラ（一般的なブドウ品種）由来のプロアントシアニジンポリマーの生理化学的特性を示す。表２のデータと比較して、ＨＨ−Ｆ３ａ画分のプロアントシアニジン化合物は、ＰＤ対ＰＣの比率が２．５倍以内、イワベンケイのｍＤＰとｍＭＷの３．０倍、ヴィティスヴェニフェラのｍＤＰの３０〜８０倍、ｍＭＷの１．１〜４．９倍、３−Ｏ−ガロイル％の４．７〜４１．３倍それぞれ高かった。知り得る限りにおいて、ＧＰ由来のプロアントシアニジン化合物が単離されたことはなく、同じ生理化学的特性を持つプロアントシアニジン化合物はこれまで報告されていない。この証拠は、ＨＨ−Ｆ３ａ画分中のプロアントシアニジン化合物が新規化合物であることを示唆しており、それは３，４，５−トリヒドロキシベンジル部分（ＰＤ単位のＢ環と没食子酸を含む）に富んでおり、イワベンケイにおいて見られるものと非常に類似しているが、ブドウの皮と種に見られるものよりずっと高い。

【表2】

【0055】

実施例３：実施例の効果

【0056】

１．生存試験

【0057】

細胞を２４ウェルプレートに植え（４，０００〜５，０００細胞／ウェル）、一夜培養した後、３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物またはＨＨ−Ｆ３画分で０、２４、４８、または７２時間処理した。処理後、細胞を１ｘＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４）で軽く３回洗浄し、その後０．５μｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）で２時間培養した。培地を除去し、濃い青色の結晶を室温で１０分間１００％ＤＭＳＯに溶解させた。ＥＬＩＳＡリーダーにより５７０ｎｍでＯＤ値を測定した。

【0058】

２．ウェスタンブロット

【0059】

すべての試料を９５℃で１０分間加熱することにより変性させ、８％または１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により濃縮ゲルと分離ゲルそれぞれ８０Ｖと１００Ｖで分離させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ転写システムを使用してタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。タンパク質の転写後、膜をポンソーＳで染色し、タンパク質転写の効率と均一性を確認した。室温において３０分間５％無脂肪脱脂粉乳（ＢＤ）で膜をブロックした後、一次抗体と４℃で一夜培養した。その後１ｘトリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）で３回（各回１０分間）膜を洗浄し、膜を二次抗体と２時間培養した後、１ｘＴＢＳＴで３回（各回１０分間）膜を洗浄した。ＨＲＰ基質過酸化物溶液／ルミノール試薬（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ^ＴＭウエスタン化学発光基質、ミリポア；１：１の割合で混合）を添加して二次抗体のシグナルを可視化し、富士フイルムＬＡＳ４０００ルミノイメージアナライザーで検出した。

【0060】

３．細胞計数

【0061】

細胞を１２ウェルプレートに（１０，０００〜３０，０００細胞／ウェル）一夜植えた後、ＨＨ−Ｆ３画分で０、２４、４８、または７２時間処理した。細胞をトリプシン処理してから０．４％トリパンブルーと混合した後、カウントした。

【0062】

４．細胞周期解析及びフローサイトメトリー

【0063】

細胞をトリプシン処理して１ｘＰＢＳで３回洗浄した後、８００ｇで５分間遠心分離した。続いて、ＰＢＳに溶解した７０％エタノールに細胞を再懸濁し、−２０℃で１６時間以上維持した。８００ｇで５分間遠心分離した後、１００μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む冷ＰＢＳに細胞ペレットを２０分間再懸濁した。その後細胞を２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０〜３０分間染色し、ＤＮＡ含量をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定してＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。

【0064】

５．ミトコンドリア膜電位試験

【0065】

Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社より購入したヨウ化５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾールカルボシアニン（ＪＣ−１）を使用してミトコンドリア膜電位の解析を行った。培養した細胞を７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルブラックプレートに植え、一夜培養した後、ＨＨ−Ｆ３画分有りまたは無しで４８時間処理した。ＪＣ−１染色溶液を各ウェルに添加して３７℃の暗所において１５〜３０分間軽く混合した。プレートを室温において４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。その後、各ウェルにＪＣ−１アッセイ緩衝液を添加してから、室温において４００ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去した。最後に、各ウェルにＪＣ−１アッセイ緩衝液を添加して蛍光プレートリーダーを使用し、解析した。

【0066】

６．ＲＯＳレベルの測定

【0067】

超酸化物ラジカル（Ｏ_２⁻）の細胞内産生をハイドロエチジン蛍光色素（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ， Ｉｎｃ．）で評価した。細胞はＨＨ−Ｆ３画分有りまたは無しで４８時間処理された。ハイドロエチジン（１０μｍ）を各ウェルに添加して３７℃の暗所において３０〜６０分間軽く混合した。細胞の蛍光を波長５２０ｎｍ（励起）と６１０ｎｍ（蛍光）でモニタリングした。

【0068】

細胞内過酸化物レベルはジクロロフルオレセイン（ＤＣＦＨ）ジアセタート（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で判定した。ＨＨ−Ｆ３画分での４８時間の処理後、培地をアスピレーションして細胞をＰＢＳで２回洗浄した。続いて、３７℃の暗所において無血清培地で細胞をＤＣＦＨと最終濃度２０μＭで３０〜６０分間培養した。細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、２００μｌの培地に保持した。細胞の蛍光を波長４８５ｎｍ（励起）と５２８ｎｍ（蛍光）でモニタリングした。

【0069】

７．動物及び試験環境

【0070】

試験期間開始時点で６週齢の雄ウィスター系白（Ｗｉｓｔａｒ ａｌｂｉｎｏ）ラット（１５０〜１８０ｇ）１２０匹が使用された。研究期間中、動物はすべて標準食物と水を自由摂食し、疾病誘発の７日前に順化した。

【0071】

試験方法

【0072】

ラットは正常群（Ｎ＝１０）、ジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）群（Ｎ＝３０）、低用量ＧＰ群（Ｎ＝３０）、高用量ＧＰ群（Ｎ＝３０）に無作為に分割された。さらに追加の５匹のラットをＨＨ−Ｆ３処理群として含めた。正常群を除くすべての群において、ラットは毎日唯一の飲用水源として１００ｐｐｍ（ｖ／ｖ）のＤＥＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）水溶液を６３日間飲用し、６４日目からさらに１４日間水道水を供給した。ＤＥＮ溶液は毎週調製され、それまでの用量に対する反応としての動物の体重増減に基づき個別の用量で調製された。４２日目以降目に見える肝臓腫瘍が記録され、６３日目以降には肝線維症が観察された。試験期間中、動物は毎週体重測定を行って体重の増加を計算し、水消費量も毎週計測された。低用量群のラットには１匹当たり０．６ｇ、高用量群のラットには１匹当たり１．８ｇの凍結乾燥したＧＰ粉末がそれぞれ４２日目から３週間にわたって毎日与えられた。

【0073】

採取手順及び肝臓の形態学的評価

【0074】

すべての動物は８４日目に安楽死された。動物は一夜の絶食後、ＣＯ_２吸入によって犠牲死された。ラットの犠牲死後、体、肝臓、脾臓の重量を測定し、正中開腹による解剖の後、器官の状況が記録された。迅速にすべての肝葉を採取し、各時間点で肝臓表面の状態、肝臓病巣、持続性結節（ＰＮ）、または癌の進行具合を徹底的に検査した。その後、肝臓を５ｍｍの切片にカットした。すべての肝臓表面上及び５ｍｍの切片内の肉眼で確認できる結節をカウントし、その数量と大きさを判定した。

【0075】

腫瘍量の評価

【0076】

ＤＥＮが与えられた動物における腫瘍形成の過程を確立するため、すべての肝葉が迅速に採取され、かつすべての肝臓表面上及び５ｍｍの切片内の肉眼で確認できる結節をカウントし、その数量と大きさを判定した。腫瘍量は各動物の直径が３ｍｍを超える全腫瘍結節の体積合計を計算し、群を比較することで判定された。

【0077】

胆汁流速

【0078】

動物を犠牲死させる前に８０ｍｇ／ｋｇのケタミンによる深麻酔後、胆汁流速が測定された。胆汁流速の測定には、総胆管内にＰＥ１０シリコンチューブを配置してから、計算用ポリエチレンチューブに接続した。チューブ内の胆汁流量を５分間隔で測定した。

【0079】

組織病理学的評価

【0080】

血液排出後、腫瘍を含む約５ｍｍ厚の組織片を各肝葉から取り出した。５μｍ厚の切片を切り出してヘマトキシリン・エオジンで染色し、公開されている診断基準を使用して組織病理学的分析を行った。

【0081】

α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）免疫組織化学染色

【0082】

肝臓試料をホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した後、５μｍの切片を切り出した。切片は脱パラフィン処理と再水和後、０．０３％の過酸化水素で１０分間処理し、内在性ペルオキシダーゼ活性を失活させた。続いてＰＢＳで２回洗浄した後、切片をマウス抗ヒトα−ＳＭＡモノクローナル抗体（１：５０希釈、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク）と室温で１時間培養した。α−ＳＭＡ染色のため、切片を洗浄し、二次抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧ（１：２００希釈）と室温でさらに１時間培養した。切片は同様に形成された。染色後、切片をヘマトキシリンで対比染色して顕微鏡で検査した。デジタルカメラシステムＨＣ−２５００（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ）、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐバージョン５．０Ｊ、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓバージョン３．０．１Ｊを使用してα−ＳＭＡ陽性区域（肝臓切片のｍｍ^２／ｃｍ^２）の割合を測定した。

【0083】

肝臓中のヒドロキシプロリン含量試験

【0084】

肝臓試料の重量を計測し、２０ｍｇの冷凍試料を２０ｍｌの６Ｎ ＨＣｌ中で加水分解して慎重に磨砕した。さらに、１ｍｇの組織に６Ｎ ＨＣｌを加え、総量を３０ｍｌとした。ＨＣｌ中で磨砕された組織を１２０℃で１６時間加水分解した。しばらく氷の上で冷却した後、８０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去して新しいチューブに入れ替えた。蒸発で失われた体積を水で補充した。等しい体積の６Ｎ ＮａＯＨを加えて混合し、リトマス紙を使用して溶液をｐＨ４〜９に調整した。４０μｌの中和後の試料溶液を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、５ｍｌの７％クロラミンＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０ｍｌの酢酸／クエン酸緩衝液を含む溶液を使用して酸化した。その後、１５０ｍｌのエールリッヒ試薬を添加した。最終混合物を６０℃で３５分間培養した後、室温でさらに１０分間培養し、その後５６０ｎｍで吸光値を測定した。１００、８０、６０、４０、２０、０ｍｇ／ｍｌの標準４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する標準溶液を同様に処理した。この範囲（ｒ＝０．９９）で標準曲線は線形であった。肝臓ヒドロキシプロリンレベルの値はヒドロキシプロリン（ｍｇ）／肝湿重量（ｇ）として表された。すべての試験は３回繰り返して実施された。

【0085】

酸化ストレスの免疫細胞化学分析

【0086】

ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）潅流法を使用して肝臓におけるデノボＲＯＳ産生部位を特定した。ＮＢＴ潅流肝臓を取り除き、亜鉛／ホルマリン溶液中で固定し、ホルマザン沈殿物の組織検査を行った。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ７．０．１画像ソフトウェア分析を使用して青色ＮＢＴ沈殿物の密度を判定した。

【0087】

結果

【0088】

Ｈｕｈ７細胞及びＭａｈｌａｖｕ細胞における異なるＧＰ調製物の効果

【0089】

ＧＰの潜在的生物活性を試験するため、水抽出物、ブタノール抽出物、アセトン抽出物、メタノール抽出物、１００％エタノール抽出物、７０％エタノール抽出物、５０％エタノール抽出物、１００％ＤＭＳＯ抽出物、３０％ＤＭＳＯ抽出物を含む抽出物の異なる調製物を調製し、ヒトＨＣＣ細胞の処理に使用した。図１に示すように、ＧＰ抽出物の異なる調製物によって生じた成長抑制効果を剤量依存的方法で評価した。ＭＴＴ試験結果によると、３０％ＤＭＳＯ抽出物がＨｕｈ７細胞（図２Ａ）とＭａｈｌａｖｕ（図２Ｂ）細胞の生存性を大幅に抑制することが示された。

【0090】

ＧＰが間期と有糸分裂中の両方で活性化した肝星細胞とＨＣＣ細胞株におけるＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０タンパク質発現レベルを低下させた

【0091】

ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０は癌遺伝子であり、ＨＣＣ中で過剰に発現される。このため、ＧＰ抽出物の異なる調製物がヒトＨＣＣ細胞株中のこれら癌タンパクを抑制するかを試験した。結果、ＧＰ抽出物（方法の段落で説明されるように、１００％メタノールから取得した後、３０％ＤＭＳＯで抽出、ここでは３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物という）が、活性化された肝星細胞（ＨＳＣ−Ｔ６）においてＦｌｊ１０５４０とＡｕｒｋｂのタンパク質発現レベルを抑制し（図３Ａ）、かつＨＣＣ細胞（ＨｅｐＧ２とＨｕｈ７）におけるＦＬＪ１０５４０、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢのタンパク質発現レベルが抑制された（図３Ｂ）ことが分かった。ＡＵＲＫＡとＦＬＪ１０５４０両方の発現レベルは間期より中期の間より高い。次に、ＧＰがＨＣＣ細胞において有糸分裂中にこれら２つのタンパク質の発現を抑制するかを調査した。Ｈｕｈ７細胞とＨｅｐＧ２細胞を５０〜７５μｇ／ｍｌのノコダゾールで１８時間処理し、続いてノコダゾールを洗浄せずに３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物で３時間処理した。これまでの発見と同様に、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０が有糸分裂中高い発現を示した。ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＦＬＪ１０５４０のタンパク質発現レベルは間期と中期の両方の間減少した（図３Ｃ）が、ＰＩＮ１、ＨＵＲＰ、ＰＬＫを含め検査した他の有糸分裂タンパク質において大幅な変化は観察されなかった（データは未提示）。

【0092】

３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物（ＨＨ−Ｆ３画分）のみＨＣＣ細胞株におけるＡＵＲＫＡタンパク質発現を抑制したが、異なる溶剤から調製されたその他抽出物は抑制しなかった

【0093】

ヒトＨＣＣ Ｈｕｈ７細胞を５００μｇ／ｍｌのＧＰ抽出物の異なる調製物で４８時間処理した。３０％ＤＭＳＯ抽出物はこれら細胞においてＡＵＲＫＡのタンパク質発現レベルを大幅に抑制した（図４Ａ）。対照的に、水またはブタノールから得たＧＰ抽出物は、３時間の処理後、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＵＲＫＡまたはＡＵＲＫＢのタンパク質発現レベルを抑制しなかった（図４Ｂ）。ＡＵＲＫＡとＦＬＪ１０５４０はＨＣＣにおいて過剰発現されるため、ＧＰがＨＣＣ細胞の成長に影響を有するかを検査した。その結果、３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物が５０％の細胞生存率抑制濃度（ＩＣ_５０）でＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞の細胞毒性を引き起こすことが分かり、ＩＣ_５０値はそれぞれ４８時間の処理後約５００μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌであった（図５）。

【0094】

ＨＨ−Ｆ３がＨＣＣ細胞株におけるＡＵＲＫＡタンパク質発現を抑制した

【0095】

３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物が活性化された肝星細胞と肝癌細胞においてＡＵＲＫＡ及びＦＬＪ１０５４０のタンパク質発現レベルを抑制し（図２）、ＧＰ中の活性分子を生成するためにこの試験を使用できることが示唆された。Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムを使用して、３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物から４画分を取得した（図６Ａ）。３時間の処理後ウェスタンブロットで分析したところ第３画分（ＨＨ−Ｆ３という）のみＨｅｐＧ２細胞においてＡＵＲＫＡとＡＵＲＫＢの発現を抑制したが、一方でその他の画分（ＨＨ−Ｆ１、ＨＨ−Ｆ２、ＨＨ−Ｆ４）はＡＵＲＫＡとＡＵＲＫＢタンパク質発現を抑制しなかった（図６Ｂ）。総合すると、３０％ＤＭＳＯから調製されたＧＰ抽出物とＨＨ−Ｆ３画分は、３時間の処理後ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＵＲＫＡとＡＵＲＫＢのタンパク質発現レベルを抑制した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。さらに、ＨＨ−Ｆ３画分から透析を使用してＨＨ−Ｆ３ａと呼ばれる活性細画分を（出発原料ＨＨ−Ｆ３と比較して７１．９％の収率で）取得した。このＨＨ−Ｆ３ａ画分には、（ＨＨ−Ｆ３ｂ画分にはないが）活性化合物が含有され、これはウェスタンブロットによりＡＵＲＫＡの消失を測定することで判定された（図６Ｄ）。

【0096】

ＨＨ−Ｆ３画分はＨＳＣ−Ｔ６細胞とＨＣＣ細胞株において細胞生存率を減少する

【0097】

細胞生存率におけるＨＨ−Ｆ３画分の効果を調査するため、Ｈｕｈ７、Ｍａｈｌａｖｕ、ＰＬＣ５、ＨＳＣ−Ｔ６細胞を濃度５、２５、５０、７５、１００μｇ／ｍｌのＨＨ−Ｆ３画分で２４、４８、７２時間処理した。ＭＴＴ試験での検査によると、これら試験細胞タイプの生存率は、ＨＨ−Ｆ３処理の結果抑制された。Ｈｕｈ７、Ｍａｈｌａｖｕ、ＰＬＣ５、ＨＳＣ−Ｔ６細胞におけるＨＨ−Ｆ３画分での処理のＩＣ_５０値は７２時間でそれぞれ約５０、３７．５、７５、２０μｇ／ｍｌであった（図７Ａ〜図７Ｄ）。この発見をさらに確認するため、細胞生存率をＨｕｈ７、Ｍａｈｌａｖｕ、ＰＬＣ５細胞のトリパンブルー染色で検査した。ＨＨ−Ｆ３画分処理の２４、４８、７２時間後、濃度５、２５、５０、７５、１００μｇ／ｍｌで、時間及び剤量依存的な細胞生存率の減少が示された（図７Ｅ〜図７Ｇ）。総合すると、３０％ＤＭＳＯ ＧＰ抽出物とＨＨ−Ｆ３画分のいずれもＨＣＣ細胞株と活性肝星状細胞の細胞生存率を抑制することができる。

【0098】

次に、Ｈｕｈ７、Ｍａｈｌａｖｕ、ＰＬＣ５、ＨＳＣ−Ｔ６細胞を２５、５０、７５μｇ／ｍｌのＨＨ−Ｆ３画分で３時間処理した。ＨＨ−Ｆ３画分は試験した３つすべてのＨＣＣ細胞株とＨＳＣ−Ｔ６細胞において、ＡＵＲＫＡ及びＦＬＪ１０５４０の両方の発現を抑制した（図８Ａと図８Ｂ）。このＨＨ−Ｆ３画分の抑制効果が転写レベルで発生したのか否かを調査するため、ＦＬＪ１０５４０とオーロラキナーゼファミリー（ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＡＵＲＫＣ）の遺伝子発現レベルの変化を検査した。ＨｅｐＧ２細胞を５０μｇ／ｍｌのＨＨ−Ｆ３画分で６時間処理した後、マイクロアレイ（Ｕ１３３Ａチップ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で遺伝子発現レベルを解析し、ウェスタンブロットでタンパク質レベルを解析した。対照群と比較して、ＨＨ−Ｆ３画分での処理後、タンパク質レベルが低下したにも関わらず、前述の特定の遺伝子発現レベルにおいて変化はなかった（データ未提示）。このため、ＨＨ−Ｆ３画分は恐らく転写レベルではなくタンパク質レベルでＨＣＣ細胞の成長を調整すると考えられる。

【0099】

ＨＨ−Ｆ３画分がＨＣＣ細胞株においてアポトーシスによる細胞死をもたらす
ＨＣＣ細胞の細胞周期プロファイルにおけるＨＨ−Ｆ３画分の効果について、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用し、抽出物を解析した。Ｈｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞を５、２５、５０μｇ／ｍｌのＨＨ−Ｆ３で４８時間処理した。図８Ａに示すように、ＨＨ−Ｆ３画分はＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞の細胞周期進行を阻害した。５０μｇ／ｍｌのＨＨ−Ｆ３画分による４８時間の処理後、Ｈｕｈ７のｓｕｂ−Ｇ１細胞群の増加は２２％であり、Ｍａｈｌａｖｕ細胞では２６％であった。ＨＨ−Ｆ３画分はＭａｈｌａｖｕ細胞においてＨｕｈ７細胞よりも大きなｓｕｂ−Ｇ１細胞群の増加を生み出しており、これは前述した細胞毒性効果（図９Ａ）と一致している。次にＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞におけるＨＨ−Ｆ３画分のアポトーシス細胞死誘発能力を検査した。濃度５、２５、５０μｇ／ｍｌでの２４時間と４８時間の処理後、開裂カスパーゼ−３と開裂ＰＡＲＰのタンパク質発現レベルは剤量依存的に増加した。同じ濃度下で、ＨＨ−Ｆ３画分もアポトーシス分子ＦＡＳの上方制御と、ＢＣＬ２及びＢＣＬ−ＸＬの下方制御を生じた（図９Ｃ）。これらのデータは、ＨＨ−Ｆ３画分がカスパーゼ依存的なアポトーシス細胞死を誘発することを示している（図９Ｂ）。

【0100】

ＨＨ−Ｆ３画分がＨＣＣ細胞株においてミトコンドリア膜電位を減少させ、ＲＯＳを増加させる

【0101】

活性酸素（ＲＯＳ）とミトコンドリアは、生理的条件及び病理学的条件のいずれにおいてもアポトーシス誘導において重要な役割を果たす。次にＨＨ−Ｆ３画分が外因性経路または内因性経路を介してアポトーシスを引き起こすかを調査した。内因性経路の指標の１つであるミトコンドリア膜電位がＨＣＣ細胞で変化されるかを試験した。Ｈｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞を５、２５、５０μｇ／ｍｌのＨＨ−Ｆ３画分で処理し、４８時間の処理後細胞のミトコンドリア膜電位を検査した。対照群と比較して、アポトーシス細胞の数が増加した。これは、ＨＨ−Ｆ３画分での処理後膜電位がＨｕｈ７細胞とＭａｈｌａｖｕ細胞で減少したミトコンドリア膜電位（ΔΨ）の結果（図１０Ａ）と一致している。

【0102】

いくつかの報告において、ＲＯＳはΔΨの損失後のみ産生されることが示されている。ＲＯＳは超酸化物陰イオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルを含み、これらすべてが酸素から派生している。ＲＯＳは光合成と酸素呼吸中の電子伝達プロセスの結果として産生され、正常な細胞機能に必要な生理濃度で、細胞内シグナリングと酸化還元調節に関与する。過剰なレベルのＲＯＳは酸化ストレスを引き起こし、これは脂質、タンパク質及びＤＮＡの酸化を引き起こすため、細胞にとって潜在的に有害である。ＨＨ−Ｆ３画分でＨＣＣ細胞を刺激することでＲＯＳの産生に変化が生じるか否かを試験した。Ｏ_２⁻の細胞内産生をハイドロエチジン蛍光色素で評価し、細胞内過酸化物のレベルをＤＣＦＨジアセタートで判定した。ＨＨ−Ｆ３画分で細胞を処理した後、ＨＣＣ細胞における細胞内過酸化物（図１０Ｃと図１０Ｄ）及び超酸化物（図１０Ｅと図１０Ｆ）の細胞産生が増加した。これは、ＨＨ−Ｆ３画分が内在性経路を介してアポトーシスを引き起こすことを示唆している。

【0103】

ＨＨ−Ｆ３画分がＡｋｔのリン酸化を減少させ、ＰＴＥＮの発現を増強する

【0104】

例えばＡＫＴ経路など一部の細胞増殖経路はアポトーシスの抑制とＨＣＣにおける異常に関連がある。ＨＨ−Ｆ３がＨＣＣ細胞に細胞毒性を引き起こしたため、ＨＨ−Ｆ３がＨＣＣ細胞における細胞増殖経路に影響するかを調査した。Ｈｕｈ７細胞を５、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度のＨＨ−Ｆ３で４８時間それぞれ処理した。Ｈｕｈ７細胞では、ＨＨ−Ｆ３の処理下でＡＫＴのＳｅｒ^４７３リン酸化が下方制御されたが、トータルのＡＫＴタンパク質は影響されなかった（図１１）。興味深いことに、ＨＨ−Ｆ３はＰＩ３ｋ／ＡＫＴ依存シグナリング負の調節因子であるホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）のタンパク質レベルを活性化した。これらの結果は、ＨＨ−Ｆ３が細胞増殖のＡＫＴシグナル伝達経路を調節し、細胞アポトーシスを誘発する可能性を示唆している。

【0105】

ＧＰ抽出物が肝硬変動物の胆汁排出を増加させた

【0106】

肝臓機能を反映する胆汁流速の測定（図１２Ａ）、肝硬変に関連する門脈圧亢進症の指標である脾臓重量／体重の比率の定量化（図１２Ｂ）、及びＤＥＮにより誘発されるα−ＳＭＡ発現の解析（図１２Ｄ）によって肝硬変も評価した。すべてのデータが高用量ＧＰによる処理後、肝硬変の状態の改善を示し、胆汁流量の増加、脾臓サイズの減少、α−ＳＭＡ（＋）区域の割合の大幅な減少を示した。

【0107】

ＧＰ抽出物とＨＨ−Ｆ３が硬変した肝臓におけるヒドロキシプロリン含量を減少した

【0108】

肝臓のヒドロキシプロリン含量レベルを測定することで肝線維症を判定した。ＤＥＮ誘発動物においてヒドロキシプロリンレベルの大幅な増加が観察された（１４３±３０μｇ／ｇ）。対照的に、低用量ＧＰ、高用量ＧＰまたはＨＨ−Ｆ３での処理後、ヒドロキシプロリン含量はそれぞれ９８±１８μｇ／ｇ（Ｐ＜０．０５ＤＥＮ群と比較）、７０±１０μｇ／ｇ（Ｐ＜０．０５）、７２±８．２μｇ／ｇ（Ｐ＜０．０５）であった（図１２Ｃ）。

【0109】

ＧＰ抽出物とＨＨ−Ｆ３が酸化ストレスを減少した

【0110】

ＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｌｕｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）は超酸化物に曝露されると不溶性の青色ホルマザン誘導体に還元される染色剤であり、青色沈殿物は組織中の超酸化物の存在を示す組織学的マーカーとして光学顕微鏡検査により判別できる。１０倍視野下で最も濃い染色区域を観察してＮＢＴ（＋）集合密度を判定した。ＤＥＮ誘発動物においてＮＢＴ（＋）集合の大幅な増加が観察された（２３±３）。対照的に、低用量ＧＰ、高用量ＧＰまたはＨＨ−Ｆ３での処理後、ＮＢＴ（＋）集合密度はそれぞれ１３±４（Ｐ＜０．０５ＤＥＮ群と比較）、４．２±０．６（Ｐ＜０．００５）、６．２±２．１（Ｐ＜０．０５）であった（図１２Ｅ）。これらの結果は、ＤＥＮによって誘発される酸化ストレスがＧＰ抽出物とＨＨ−Ｆ３の処理によって減少される可能性を示唆している。

【0111】

ＧＰ抽出物とＨＨ−Ｆ３が腫瘍量を減少した

【0112】

犠牲死させた動物から取得した肝臓を５ｍｍの切片にスライスした。直径３ｍｍを超える目に見える腫瘍結節すべての数をカウントし、大きさを測定した。腫瘍量は腫瘍結節の体積合計で表されている。目に見える腫瘍がＤＥＮ誘発動物において観察された（腫瘍量２３５０±９０５ｍｍ^３）。対照的に、低用量ＧＰ、高用量ＧＰまたはＨＨ−Ｆ３での処理後、肝臓における腫瘍量はそれぞれ１１０±１０５ｍｍ^３（Ｐ＜０．００５ＤＥＮ群と比較）、２３±３１ｍｍ^３（Ｐ＜０．００５）、８６±１２（Ｐ＜０．０５）であった（図１２Ｆ）。肝臓の代表的な写真にはラットの硬変した肝臓に複数の肝臓腫瘍が見られた。これらの動物では表面の肉芽形成と境界に起伏のある複数の肝臓腫瘍の形成が観察され、低用量ＧＰ、高用量ＧＰまたはＨＨ−Ｆ３での処理後、目に見える腫瘍の数と起伏のある肝臓表面が改善された。

【0113】

イワベンケイ抽出物の試験も実施し、それらがＨＣＣ細胞株の細胞生存率を抑制し、ＡＵＲＫＡタンパク質発現を下方制御することが分かった（図１３）。

【0114】

本発明が属する技術分野における当業者が、更なる例示の必要なく、ここにおける説明に基づいて本発明をその最大限の範囲で利用することができると確信される。したがって、提示した説明及び請求の範囲は本発明の範囲を限定するものではなく、例示を目的としたものであると理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】