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特許5902371非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出するための細胞及び方法

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5902371

(24)【登録日】2016年3月18日

(45)【発行日】2016年4月13日

(54)【発明の名称】非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出するための細胞及び方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20160331BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20160331BHJP

C12N 7/00 20060101ALI20160331BHJP

C12N 7/01 20060101ALI20160331BHJP

C12N 7/04 20060101ALI20160331BHJP

【ＦＩ】

C12N15/00 AZNA

C12N5/10

C12N7/00

C12N7/01

C12N7/04

【請求項の数】11

【全頁数】116

(21)【出願番号】特願2009-542273(P2009-542273)

(86)(22)【出願日】2007年12月21日

(65)【公表番号】特表2010-512779(P2010-512779A)

(43)【公表日】2010年4月30日

(86)【国際出願番号】IB2007004444

(87)【国際公開番号】WO2008078198

(87)【国際公開日】20080703

【審査請求日】2010年7月1日

【審判番号】不服2014-16701(P2014-16701/J1)

【審判請求日】2014年8月22日

(31)【優先権主張番号】06292025.1

(32)【優先日】2006年12月22日

(33)【優先権主張国】EP

【微生物の受託番号】CNCM I-3618

【微生物の受託番号】CNCM I-3662

【微生物の受託番号】CNCM I-2883

【微生物の受託番号】CNCM I-2884

【微生物の受託番号】CNCM I-2885

【微生物の受託番号】CNCM I-2886

【微生物の受託番号】CNCM I-2887

【微生物の受託番号】CNCM I-2888

【微生物の受託番号】CNCM I-2889

【微生物の受託番号】CNCM I-3033

【微生物の受託番号】CNCM I-3034

【微生物の受託番号】CNCM I-3035

【微生物の受託番号】CNCM I-3036

【微生物の受託番号】CNCM I-3037

【微生物の受託番号】CNCM I-3038

【微生物の受託番号】CNCM I-3054

【微生物の受託番号】CNCM I-3055

【微生物の受託番号】CNCM I-3056

【微生物の受託番号】CNCM I-3057

【微生物の受託番号】CNCM I-3058

【微生物の受託番号】CNCM I-3440

【微生物の受託番号】CNCM I-3441

【微生物の受託番号】CNCM I-3442

【微生物の受託番号】CNCM I-3700

【微生物の受託番号】CNCM I-3701

【微生物の受託番号】CNCM I-3702

【微生物の受託番号】CNCM I-3703

【微生物の受託番号】CNCM I-3881

(73)【特許権者】

【識別番号】591282984

【氏名又は名称】アンスティテュパストゥール

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＰＡＳＴＥＵＲ

(73)【特許権者】

【識別番号】501089863

【氏名又は名称】サントルナシオナルドゥラルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス）

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村和広

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島勝

(72)【発明者】

【氏名】タンジー，フレデリック

(72)【発明者】

【氏名】シャルノー，ピエール

(72)【発明者】

【氏名】ジャコブ，イブ

【合議体】

【審判長】鈴木恵理子

【審判官】高堀栄二

【審判官】飯室里美

(56)【参考文献】

【文献】特表２００３−５１１０８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第９７／０６２７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／１１１２２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／０５６７８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００４−５０３２３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／１０８２４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】ＥＭＢＯＪ．，１９９５，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．２３，ｐ．５７７３−５７８４

【文献】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，Ｖｏｌ．７７，Ｎｏ．２１，ｐ．１１５４６−１１５５４

【文献】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１年，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐ．４３８−４４８

【文献】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１年，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５，ｐ．４４６−４５０

【文献】ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，２００５年，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２３，ｐ．１６６７−１６７８

【文献】実験医学，１９９４年，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１５，ｐ．４７−５１

【文献】ウイルス，２００２年，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．２，ｐ．２２５−２３１

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-15/90

C12N5/00-5/10

C12N7/00-7/04

ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

2006年6月14日にCNCMに寄託番号I-3618として寄託された293-T7-NP細胞株の細胞。

【請求項2】

2006年8月4日にCNCMに寄託番号I-3662として寄託された293-nlsT7-NP MV細胞株の細胞。

【請求項3】

感染性麻疹ウイルスを作出する方法であって、
ａ．2006年6月14日にCNCMに寄託番号I-3618として寄託された293-T7-NP細胞株の細胞を、麻疹ウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンにより、及び麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含む発現ベクターにより組換える工程、
ｂ．麻疹ウイルスの複製及び作出を維持するのにコンピテントな細胞上に、前記組換細胞を移送する工程、並びに
ｃ．工程ｂの共培養物から、感染性麻疹ウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。

【請求項4】

感染性麻疹ウイルスを作出する方法であって、
ａ．2006年8月4日にCNCMに寄託番号I-3662として寄託された293-nlsT7-NP MV細胞株の細胞を、麻疹ウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンとにより、及び麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含む発現ベクターにより組換える工程、
ｂ．麻疹ウイルスの複製及び作出を維持するのにコンピテントな細胞上に、前記組換細胞を移送する工程、並びに
ｃ．工程ｂの共培養物から、感染性麻疹ウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。

【請求項5】

前記工程ｂ．のコンピテント細胞が、ベロ（アフリカミドリザル腎）細胞、CEF（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞又はMRC5細胞である、請求項３又は４記載の方法。

【請求項6】

前記麻疹ウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンのヌクレオチド配列が、許容部位で、少なくとも１種の異種核酸の挿入により修飾されている、請求項３又は４記載の方法。

【請求項7】

前記異種核酸が、エピトープ又はポリエピトープをコードする、請求項６記載の方法。

【請求項8】

前記麻疹ウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンが、弱毒化MVウイルスに由来する、請求項３又は４記載の方法。

【請求項9】

前記非分節型マイナス鎖cDNAクローンが、MV Schwarz株に由来する、請求項８記載の方法。

【請求項10】

ヘルパー株化細胞としての、請求項１又は２記載の細胞の使用。

【請求項11】

感染性麻疹ウイルスを作出するための、請求項１又は２記載の細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クローニングされたデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）から、特に麻疹ウイルスから、とりわけ弱毒化された株、例えばワクチン接種に関して承認されたものから、特に弱毒化Ｓｃｈｗａｒｚ麻疹ウイルス及び様々な異種配列を発現する組換えＳｃｈｗａｒｚ麻疹系ウイルスから、非分節型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス（ＮＮＶ又はモノネガウイルス目）を作出するための組換細胞及び方法に関する。かかる救出ウイルスを増幅すれば、麻疹に対する、及び／又は、発現された異種ペプチド又はタンパク質に対する、免疫感作のためのワクチンとして使用することができる。

【背景技術】

【0002】

生存弱毒化ＲＮＡウイルスは、非常に効率的なワクチンを製造する。中でも麻疹ワクチンは、何億もの小児に使用され、有効性及び安全性が証明されている。このワクチンは１、２回の注射後に、生涯免疫を誘導する。このワクチンは殆どの国で、安価で容易に大規模製造される。かかる利点から、麻疹ウイルス、特に弱毒化ワクチン株は、小児を、状況によっては成人群を、麻疹及び／又は他の感染性病理、特にＡＩＤＳ（レトロウイルス）疾患、フラビウイルス疾患又はコロナウイルス（ＳＡＲＳ）疾患等のウイルス病理に対して免役感作するための、良好な候補ベクターとなっている。

【0003】

生存弱毒化麻疹ウイルスは、１９６０年代からワクチンとして使用され、最も有効かつ安全なヒト用ワクチンの１種である。ワクチン接種キャンペーンは、開発途上国において麻疹を制御するのに非常に有効である。しかし、開発途上国における不適切なワクチン配布のために、麻疹は依然、およそ４５００万人が感染し、かつ年間７００，０００名の小児が死亡する原因となっている。従ってＷＨＯは、今後１０〜２０年間にわたるグローバルワクチン接種計画に力を入れている(C.D.C., 2005)。このＷＨＯのキャンペーンを活用することにより、麻疹ワクチン由来ワクチンベクターの使用は、世界の一部地域において、安全かつ有効な新規の多価、特に二価小児用ワクチンによる、麻疹及び他の感染症に対する小児の同時免疫感作を可能にしている。

【0004】

麻疹ウイルス（ＭＶ）はパラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属する、マイナス極性非分節型ＲＮＡゲノム（１５，８９４ｂｐ）を有するエンベロープ型ウイルスである。免疫系に強力な特異反応を誘導し、再感染に対する生涯記憶防御を確立するので、麻疹への罹患を一回のみに抑えることが可能となる。かかる防御は、抗体産生及び細胞傷害性ＣＤ８⁺ Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の記憶の両方に基づく。病原株は造血系を強力に破壊し(Arnebomら、1983；Kimら、2002；Okadaら、2000)、その結果として一過性免疫抑制を生じる。これが、開発途上国における麻疹感染由来死の殆どの原因となっている。初代株とは対照的に、弱毒化株は免疫抑制を誘導しない(Okadaら、2001)。

【0005】

麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株は、１９５４年に、初代ヒト細胞の培養により単離された(Endersら、1954)。ニワトリ胚線維芽細胞への適応(adaptation)は、ニワトリ胚線維芽細胞における引き続きの継代により更に弱毒化されたワクチン種を作製した(Schwarzら、1962)。Ｓｃｈｗａｒｚ株及びＭｏｒａｔｅｎ株は、同じヌクレオチド配列を有し(Parksら、2001a；Parksら、2001b)、これらは最も頻用される麻疹ワクチンを構成している。１回又は２回の注射によるワクチン接種は、生涯免疫を誘導する(Griffinら、2001；Hillemanら、2002)。ＣＤ８細胞及び抗体の持続は、ワクチン接種後最長２５年間示されている(Ovsyannikovaら、2003)。麻疹ワクチンは、ほとんどの国において大規模に容易に製造され、少ない経費で入手可能である。このウイルスゲノムの弱毒化は、複数の変異の有利な組合せの結果である。従ってこのワクチンは、非常に安定しており、かつワクチン株の復帰変異は、これまで認められていない(Hillemanら、2002)。加えて本ウイルスは、細胞質においてのみ複製し、宿主ゲノムの染色体への組込みのリスクを排除する。これらの特徴は、弱毒化された生麻疹ワクチンを、多価ワクチンベクターの開発のための優れた候補としている。この目的のために、ＥｄｍｏｎｓｔｏｎＢＭＶ株アンチゲノムに対応する感染性ｃＤＮＡは、クローニングされ、かつ対応するウイルスの作出を可能にする逆遺伝学技術が確立された(Radeckeら、1995)。

【0006】

本発明者らは先に、世界中で最も一般的に使用される麻疹ワクチンであるＳｃｈｗａｒｚＭＶを用い、ベクターを開発した(Combredetら、2003)。このベクターは、様々な遺伝子又は大きい遺伝子の組合せを１２回よりも多い継代にわたり安定して発現することができる。４，０００〜５，０００の追加ヌクレオチドを含み、ゲノムの追加の３０％を提示する組換えＭＶベクターが作出された。これらのウイルスは、標準ＭＶと同等の力価で、細胞培養において産生される。１２回継代後及び増幅因子１０²⁰で、９６％よりも多い感染細胞は、これらの追加遺伝子の発現を継続した。この著しく安定した発現は、モノネガウイルス目の他のメンバーについても認められ（Schnellら、1996）、これは正二十面体カプシドを伴うウイルスとは対照的に、これらの螺旋状ヌクレオキャプシドウイルスによるゲノムのサイズに対する幾何学的制約が恐らくが存在しないためであろう。更にＭＶは、免疫系細胞（マクロファージ及び樹状細胞）に感染し、その結果このカーゴ抗原をほとんどの有効な抗原提示細胞へ直接送達し、これはワクチンベクターの大きな利点である。最後に、ＭＶゲノムは小さく、従ってベクターに対する反応が導入遺伝子に対する反応を圧倒することは避けられる。

【0007】

弱毒化された株の安全性及び有効性は最終的にそのゲノム配列によって左右されるという仮定を基に、本発明者らは、忠実度を維持する最適な手順によるＳｃｈｗａｒｚワクチンの産業的調製から精製されたウイルス粒子由来のＳｃｈｗａｒｚ／Ｍｏｒａｔｅｎ麻疹ウイルスのアンチゲノムに対応する感染性ｃＤＮＡをクローニングした(Combredetら、2003)。逆遺伝学システムの産出量を最適化するために、このアンチゲノムウイルスｃＤＮＡを、最適有効性に必要とされる追加のＧＧＧモチーフを伴うＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に配置した。このウイルスＲＮＡの正確な切断を可能にするために、ハンマーヘッド型リボザイムを、ＧＧＧモチーフと第一のウイルスヌクレオチドの間に挿入し、並びにデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムを、最後のウイルスヌクレオチドの下流に配置した。得られるｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗプラスミドは、ヒトヘルパー細胞のトランスフェクションを基にした先に説明された逆遺伝学システムを使用し、対応するウイルスを作出することが可能であった(Radeckeら、1995)。非認可細胞(noncertified cell)への本組換えワクチンの適応を防止するために、ｃＤＮＡでトランスフェクションされたヘルパー細胞は、その中でウイルスが最初に選択されかつその中で現在作出される細胞である、ニワトリ胚線維芽細胞と共存培養された。組換えウイルスの数回の継代後、そのゲノム全体の配列は、当初の配列と同一であることがわかった(Combredetら、2003)。ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗプラスミドからレスキューされたウイルスの免疫原性は、トランスジェニックマウスにおいて評価され、かつ産業的に製造されたＳｃｈｗａｒｚワクチンと比較された。ワクチン接種されたマカクザルは全て、抗−ＭＶ抗体及び特異的細胞反応を呈した。本ｃＤＮＡから作出されたＳｃｈｗａｒｚウイルスと当初のワクチンの間で、差異は認められず、このことは、このクローニングされたウイルスは、非経口ワクチンと同じ免疫原性を有することを示している(Combredetら、2003)。この分子クローンは、接種用ストックに左右されないＳｃｈｗａｒｚ麻疹ワクチンの製造を可能にする。

【0008】

本ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗプラスミドは、ゲノムの異なる位置への追加転写ユニット（ＡＴＵ）の導入により、外来遺伝子の発現のために修飾される。これらのＡＴＵは、例えば、ウイルスゲノムの遺伝子間のＮ−Ｐ領域のコピー（転写に必要なシス作用性配列を含む）内に挿入された、マルチクローニングサイトカセットである。増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子が、このカセットに挿入された。ＡＴＵは、ふたつの位置（Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間及びＨ遺伝子とＬ遺伝子の間）で、ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗプラスミドに導入された。この追加配列とは関わりなく、アンチゲノムヌクレオチドの合計数は、ウイルス複製を最適化する「６ヌクレオチドルール」を満たすために６の倍数として維持されなければならない(Calainら、1993)。ＧＦＰ導入遺伝子は、全ての感染された細胞型において発現され、このことは本組換えＳｃｈｗａｒｚ麻疹ウイルスはベクターとして働くことを確認する。このベクターは、現在世界的に使用されている承認された弱毒化生ワクチン株を基にした組合せワクチンのデザインを可能にする。この研究は、国際出願WO 2004/000876の目的であり、この出願は参照により本明細書に組み入れられる。

【0009】

そのようなＭＶ系生存組換えワクチンの大規模使用は、それらが安定して増殖する可能性、及び認定細胞（例えば初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）又はヒト二倍体ＭＲＣ５）の良好な力価に左右される。これらの細胞は通常、高力価で作出するアフリカミドリザルベロ（Vero）細胞などの実験用株化細胞と比べ、中等度の力価でＭＶを作出する。従って最初の種は、比較的高力価で得られなければならない。この最初の種は、逆遺伝学によりｃＤＮＡから作出される。

【0010】

プラス鎖ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスは、好適な細胞におけるそれらの操作された感染性ｃＤＮＡ又はＤＮＡのトランスフェクション後、インビトロにおいて容易に得ることができるが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、それらのｃＤＮＡから逆遺伝学により直接レスキューすることができない。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムは、感染サイクルをインビトロにおいて開始することができず、その理由は、これはタンパク質を直接コードしていないからである。転写及び複製は両方とも、ウイルスゲノムをキャプシド被包している核タンパク質に含まれた転写酵素−ポリメラーゼ酵素複合体（ＲＮＰ複合体）を必要とする。従ってｃＤＮＡからの組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスの作製は、ＲＮＡ及びタンパク質の個別の成分からの活性ＲＮＰの再構成に関連している(Fields B.N.ら、-Lippincott Raven publishers 1996, p.1953-1977)。

【0011】

最近１５年間にわたる多数の研究室での注目に値する一連の研究によって、ほぼ全てのマイナス鎖ＲＮＡウイルスをそのｃＤＮＡから救済するための種々のシステムの確立が可能となった(総説についてはConzelmann参照)。分節型ゲノムを有するウイルスとは対照的に、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルス（モノネガウイルス目）のＲＮＰは、しっかりと構成され、かつ該核タンパク質（Ｎ）に加え、その集成体及びポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）及びウイルスＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）を含む。最初の感染性モノネガウイルス目である狂犬病ラブドウイルスは、１９９４年にｃＤＮＡから回収された(Schnellら、1994)。この方法は、その正確な３’末端がデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムにより作出された完全長ＲＮＡと一緒の、狂犬病ウイルスＮ、Ｐ及びＬタンパク質の細胞内発現に関連した。このウイルスのゲノム（マイナス鎖）ではなくアンチゲノム（プラス鎖）に相当する転写物を使用し、完全長ＲＮＡ中のＮ、Ｐ及びＬ配列の存在により生じるアンチセンスの問題を回避した。このシステムにおいて、必須のヘルパータンパク質は、必要なＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドのＴ７−特異的転写を駆動するために、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする複製−コンピテントなワクシニアベクターにより提供された。同様のシステムは、感染性狂犬病ウイルス(Schnellら、1994；Itoら、2001)、ＶＳＶ(Lawsonら、1995；Whelanら、1995)、更にはパラミクソウイルス科センダイウイルス(Garcinら、1995；Katoら、1996；Leyrerら、1998；Fujiiら、2002)、ＨＰ１Ｖ−３(Hoffman及びBanerjee、1997)及び麻疹ウイルス(Takedaら、2000；Fujiiら、2002)の回収を可能にした。

【0012】

レスキューされたウイルスがヘルパーウイルスから分離されることを必要とする複製コンピテントなワクシニアの使用を避けるために、いくつかの非−複製ヘルパーウイルスが、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスをレスキューするためのヘルパータンパク質を提供するように適合された。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する高度に弱毒化された修飾されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）が、肺炎ウイルスＲＳＶ(Collinsら、1995)、ルブラウイルスＳＶ５(Heら、1997)、ＨＰＩＶ−３(Durbinら、1997)、牛疫ウイルス(Baron及びBarrett、1997)、及び麻疹ウイルス(Schneiderら、1997)、ムンプスウイルス(Clarkeら、2000)、ＣＤＶ(Gassenら、2000)、ＨＰＩＶ−２(Kawanoら、2001)、及びＢＰＩＶ−３(Schmidtら、2000)の回収のために使用されている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換え鶏痘ウイルスは、トリパラミクソウイルス科ＮＤＶ(Peetersら、1999)及びキメラ牛疫ウイルス(Dasら、2000)の回収に使用されている。

【0013】

感染性又は欠損性のウイルスベクターによる夾雑を伴わないモノネガウイルス目をレスキューするために、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する株化細胞が作出された。この場合、細胞質におけるＲＮＡ−キャッピング活性が存在しない場合には、タンパク質発現は、コード領域の上流に位置した脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳを用いて実現された。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ並びに麻疹ウイルスタンパク質Ｎ及びＰを発現するヒト胎児腎株化細胞（２９３−３−４６）は、麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎワクチン株を回収するために確立された(Radeckeら、1995)。このウイルスは、ＭＶアンチゲノムＲＮＡ及びＬｍＲＮＡを特定するプラスミドのトランスフェクション後にレスキューされた。これらの細胞におけるレスキュー効率は、最初は非常に低く、トランスフェクションされた培養物の熱ショック処理及びトランスフェクションされた細胞のベロ細胞上での追加の共存培養により増大したことが示された(Parksら、1999)。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現し（ＢＳＲＴ７／５）かつベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）を基にした別の株化細胞を、ＢＲＳＶ(Buchholzら、2000)、狂犬病ウイルス(Finke及びConzelmann、1999)、ＶＳＶ(Hartyら、2001)、ＮＤＶ(Romer-Oberdorferら、1999)、及びエボラウイルス(Volchkovら、2001)の回収に使用した。

【0014】

本発明者らは、ＳｃｈｗａｒｚワクチンＭＶベクターをレスキューするために、２９３−３−４６株化細胞を使用している(Combredetら、2003)。しかし本発明者らは、トランスフェクションされた細胞における熱ショック法(Parksら、1999)及びそれらのベロ細胞又はＣＥＦ細胞上での共存培養を使用したとしても、そのレスキューは、かなり再生不可能でありかつ収量が依然非常に低いか、又は大きい追加配列を含む一部の組換え体については不可能でさえあることを経験した。その効率は、それらの継代数に左右されることが認められたので、このことはヘルパー細胞の不安定性に起因していた。これらの細胞は、ＣＭＶプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子の制御下にＭＶＮ遺伝子及びＰ遺伝子並びにＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を各々コードしているｐＳＣ６−Ｎ、ｐＳＣ６−Ｐ及びｐＳＣ６−Ｔ７−ＮＥＯによりトランスフェクションされた２９３細胞のゲネチシン−耐性クローンの選択により作出される(Radeckeら、1995)。それらの活性の安定性は、ゲネチシン（Ｇ−４１８）下でのそれらの連続選択、並びにトランスフェクション及びレスキュー実験時の抗生物質の除去により左右される。外来ＤＮＡの染色体ＤＮＡへの不正な(illicit)プラスミド-ベースの組換え時に、プラスミドにより形成された鎖状体は組換えられ、かつゲネチシン選択は、非常に少数の個々のコピーのみを維持する。このことは、数回の継代後の２９３−３−４６細胞により認められた効率の低下を説明することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

従って当該技術分野において、いずれか他のヘルパーウイルス、例えばワクシニアウイルスなどによる夾雑を伴わずに、任意に修飾されたｃＤＮＡから、組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再現性及び高い効率でレスキューすることができるヘルパー株化細胞を作出する新規な方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明は、少なくともＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞に関する。特定の実施態様によれば、本発明の細胞は、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する。

【0017】

本発明の細胞は、組換細胞であり、これはこれらの細胞は、その細胞のゲノム配列の、異種配列、すなわち異なる細胞もしくは生物に起源をもつ配列による組換えを生じる目的にかなうインビトロ遺伝子操作の結果であることを意味する。組換細胞は、単離された細胞から出発し、調製され、出発細胞のものとは異なる遺伝子及び／又は表現型の特徴を有し、かつ少なくともＲＮＡポリメラーゼ、１種又は数種の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質及びＰタンパク質の安定した発現又は産生も提供する。本発明の細胞は、ヒトの体の外部の生成物として請求される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】プラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｔ７（Ａ）、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ｎｌｓＴ７（Ｂ）、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ（Ｃ）、及びＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐ（Ｄ）の概略を示す。ψ：パッケージングプサイモチーフ；ＲＲＥ：Ｒｅｖ−反応性エレメント；ｃＰＰＴ：セントラルポリプリントラクト；ＣＴＳ：セントラル終結配列；ＣＭＶｉｅ：サイトメガロウイルス極初期プロモーター；ΔＵ３：Ｕ３部分の欠失。

【0019】

【図2】異なる細胞溶解液中のＭＶのＮ及びＰタンパク質の発現を示すウェスタンブロット；（Ａ）形質導入されない２９３Ｔ、ふたつの異なる継代（１７及び１９）の先に説明された２９３−３−４６株化細胞、レンチウイルスベクターによる形質導入後作出された２９３ｎｌｓＴ７−ＮＰ及び２９３Ｔ７−ＮＰ細胞集団；（Ｂ）ＭＶ感染ベロ細胞、ふたつの異なる継代（１７及び２７）の２９３−３−４６株化細胞、８種の２９３Ｔ７−ＮＰ細胞クローン；（Ｃ）ＭＶ感染ベロ細胞、２９３−３−４６株化細胞（継代１７）、８種の２９３ｎｌｓＴ７−ＮＰ細胞クローン、非感染ベロ細胞。ブロットは、抗−ＭＶＮＰ抗体（１／５００）及びＨＲＰ抗−マウスＩｇ二次抗体（１／１０００）でプロービングした。

【発明を実施するための形態】

【0020】

配列の簡単な説明
様々なレトロウイルスＤＮＡフラップのヌクレオチド配列を、異なるウイルスで定義する：ＣＡＥＶ（配列番号１）、ＥＩＡＶ（配列番号２）、ＶＩＳＮＡ（配列番号３）、ＳＩＶＡＧＭ（配列番号４）、ＨＩＶ−２ＲＯＤ（配列番号５）、ＨＩＶ−１ＬＡＩ（配列番号６）、及びＨＩＶ−１（配列番号７）。ＭＶウイルスのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ｎｌｓＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、並びにＮ、Ｐ及びＬタンパク質のヌクレオチド配列は、各々、配列番号８、１０、１２、１４、及び１６に定義し、更にそれらの各々の対応するタンパク質配列を、配列番号９、１１、１３、１５及び１７に定義した。ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗプラスミド（ＣＮＣＭＩ−２８８９）の完全ヌクレオチド配列は、配列番号１８に定義した。ｐＥＭＣ−ＬＳｃｈｗプラスミド（ＣＮＣＭ１−３８８１）の完全ヌクレオチド配列は、配列番号１９に定義した。

【0021】

表現「安定した産生」とは、有利なことに細胞が生存している限りは、細胞が、約６５と等しいか又はこれを超える多くの細胞分裂にわたり、少なくともＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質を発現又は産生することを意味する。本発明の特定の実施態様に従い、組換細胞は、少なくともこれら３種のタンパク質、すなわち少なくともＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質をやがては継続して発現又は産生する。本発明の特定の実施態様に従い、これら３種のタンパク質の完全性、すなわちアミノ酸の一次配列は維持され、発現又は産生されたこれらのタンパク質は常に同じであることを確実にする。

【0022】

ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の安定した産生は、これらのタンパク質のコード配列を保持する（１又は２以上の）プラスミドの細胞内の存在とは無関係である。従って例えプラスミドがインビトロ又はエクスビボ細胞操作の特定の工程で使用されるとしても、これら３種の又は少なくとも３種のタンパク質を安定して産生する得られた組換細胞は、最早プラスミドを含まない。タンパク質発現が（１又は２以上の）プラスミドにより駆動される組換細胞とは対照的に、この方法において、発現は該プラスミドとは無関係である。

【0023】

本発明の特定の実施態様によれば、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の安定した発現は、抗生物質などの薬物の存在を必要とせず、すなわち安定した発現は、選択圧を必要としない。従ってこの安定した産生は、生存のための（１又は２以上の）プラスミドの強制的な存在を必要とせず、該プラスミドは（１又は２以上の）タンパク質を発現するためのコード配列を有する。

【0024】

本発明の別の特徴は、少なくともこれら３種のタンパク質の各々、すなわち少なくともＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質は、経時的に同様のレベルで産生又は発現されることである。本明細書において使用される「同様のレベル」とは、細胞寿命の期間中、例え細胞分裂後であっても、これら３種のタンパク質の各々の発現が安定していることを意味し、発現レベルの変動は、細胞寿命の異なる時点で算出された平均発現と比べ、約３０％を超えず、特に約２０％を超えず、好ましくは約１０％を超えない。

【0025】

本発明の細胞により発現又は作出されたＲＮＡポリメラーゼは、レスキューシステムにおける、ｃＤＮＡクローン由来の非分節型マイナスセンス一本鎖ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の合成に適している、任意のポリメラーゼである。このポリメラーゼの性質は本質的に、レスキューシステム（同じくクローニングされたｃＤＮＡ由来のマイナス−センスＲＮＡウイルスの逆遺伝学、又はデノボ合成と称される）において使用される、非分節型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンに位置したＲＮＡプロモーターポリメラーゼ配列の性質により左右される。例として本ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、又はその核型（ｎｌｓＴ７）である。

【0026】

「Ｎタンパク質」及び「Ｐタンパク質」の表現は、各々、非分節型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）を意味する。Ｎ及び／又はＰタンパク質が由来することができる非分節型マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスの科、亜科、属又は種の例は、表Ｉに列記されている。

【0027】

特定の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮ及びＰタンパク質は、同じウイルスに由来するか、同じウイルス株に由来又は異なるウイルス株に由来するかのいずれかである。別の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮ及びＰタンパク質は、異なる非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。

【0028】

【表1】

【0029】

特定の実施態様によれば、Ｎ及びＰタンパク質は、モノネガウイルス、好ましくはパラミクソウイルス科ウイルス、好ましくはパラミクソウイルス亜科ウイルス、最も好ましくはモルビリウイルス科ウイルスに由来する。モルビリウイルスの例は、麻疹ウイルス（ＭＶ）、特に弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株、特にＳｃｈｗａｒｚＭＶ株又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（Ｅｄ）株又はこれらの株に由来する誘導体である。ワクチンのために承認された株は、FDA(米国食品医薬品局)により、実験室データ及び臨床データの厳密な検証後の安全性、有効性、品質及び再現性に規定を有するものとして定義されている(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)。

【0030】

本出願において、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに言及する度に、特に本明細書に列記された特定のウイルス、特に麻疹ウイルス、特にＳｃｈｗａｒｚ株に適用することが可能である。

【0031】

「それらの機能誘導体」の表現は、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＮタンパク質及び／又はＰタンパク質の断片を含んでなる、任意の機能変種をいい、但し該機能誘導体は、クローニングされたｃＤＮＡからの非分節型マイナス−センスＲＮＡウイルスの作出を可能にするレスキューシステムにおいて、ウイルスゲノムの転写及び複製において機能する少なくともリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）としての、それらが由来するタンパク質の活性を維持していることを条件とする。

【0032】

機能変種は、下記の特徴の少なくとも１種を有する、該機能変種タンパク質をコードする核酸により定義される：
−機能変種をコードする核酸は、高ストリンジェンシー条件で、野生型（参照）ＲＮＡポリメラーゼ又は同定された非分節型マイナス鎖ＲＮＡ株もしくはウイルスのＮタンパク質及びＰタンパク質をコードする核酸とハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件は、Sambrookらにより、「Molecular Cloning: a laboratory manual」(1989)において定義されている。これらの高ストリンジェンシー条件は、以下を包含する：ニトロセルロースフィルター用の予備洗浄液５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の使用、５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、４２℃のハイブリダイゼーション条件、並びに６８℃、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの洗浄条件。プロトコールは、当業者に公知である。更に当業者は、温度及び洗浄液の塩濃度は、実験の制約に従い必要に応じて調節することができることを認めるであろう；
−機能変種をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質又はＰタンパク質をコードする未変性の核酸と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％又は更には９９％の類似性を示し、該類似性は、両方の配列の全長にわたり算出される；
−機能変種をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質又はＰタンパク質をコードする未変性の核酸と、少なくとも１個のヌクレオチド置換、好ましくは１、２、３、４又は５個の置換により異なり、任意に保存的置換（アミノ酸配列を変更しない（１又は２以上の）ヌクレオチド置換）は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失又は付加、好ましくは１、２、３、４又は５個のヌクレオチドの欠失又は付加により異なる。
断片は、本出願において、その断片が、本明細書において開示された少なくともリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）として、それが誘導されるタンパク質全体と同じ活性を有する限りは、完全長ＲＮＡポリメラーゼの、Ｎタンパク質の又はＰタンパク質の一部として定義される。特定の実施態様によれば、この断片は、完全長タンパク質の少なくとも７０％、特定すると８０％、より特定すると９０％又は更には９５％を表す。

【0033】

従って、ここでＲＮＡポリメラーゼ、ＮもしくはＰタンパク質又はそれらのコード配列を説明し、その説明は本明細書において定義されたそれらの機能誘導体に同様に適用される。

【0034】

特定の実施態様に従い、本発明の組換細胞は、そのゲノム内に組み込まれた、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含む。任意に、前述の３種のタンパク質をコードする核酸は、これらの各々又は少なくとも１種が、（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下にある。「ゲノムに組込まれた」の表現は、（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下の核酸の少なくとも１種のコピーが、該細胞が該核酸によりコードされたタンパク質を安定して発現することができる条件下で、組換細胞のゲノム内に配置されていることを意味する。特定の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、そのゲノムに組込まれた、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを更に含む。

【0035】

「少なくとも１種のコピー」は、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＮタンパク質及び／又はＰタンパク質及び／又はＬタンパク質をコードする核酸は、これらの各タンパク質に必要とされる発現レベルに応じて、１種又は数種のコピーで、好ましくは正確に又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０種のコピー又はそれよりも多くで、存在してよいことを意味する。

【0036】

本発明の特定の実施態様によれば、本発明の細胞は、細胞ゲノムに組込まれたＤＮＡフラップの少なくとも１種のコピーも含む。ＤＮＡフラップは、レトロウイルス、特にレンチウイルスの、又はふたつの必須領域、すなわちｃＰＰＴ（セントラルポリプリントラクト）及びＣＴＳ（シス−作用性終結領域）領域を含むレトロウイルス様起源のヌクレオチド配列であり、ここでｃＰＰＴ領域及びＣＴＳ領域は、それらを含むＤＮＡの複製時に、３本鎖ＤＮＡ構造を誘導する(先にZennouら、2000；及び、出願WO 99/55892及びWO 01/27300において定義されている)。特定の実施態様によれば、ＤＮＡフラップは、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及び恐らくＬタンパク質をコードする核酸の転写を可能にする内部プロモーターの直ぐ上流に挿入される。ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ−ＣＴＳ）は、本発明のレトロウイルス由来ベクターに機能性配向で挿入され、すなわち、ｃＰＰＴ領域は、ＣＴＳ領域に関して５’側である（ＬＴＲに相当するベクターの５’側部分は、プライマー結合部位（ＰＢＳ）を含み、その領域に相当するベクターの３’側部分は、３’ＰＰＴを含む）。

【0037】

本発明に適したＤＮＡフラップは、レトロウイルスから、特にレンチウイルス又はレトロウイルス−様生物体、例えばレトロトランスポゾンから得られるか、合成的に調製されるか（化学合成）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などにより、任意のレトロウイルスから、特にレンチウイルス核酸からのＤＮＡフラップの増幅により調製することができる。本ＤＮＡフラップは、レトロウイルス、特にレンチウイルス、特にヒトレトロウイルス又はレンチウイルス、及び特定するとＨＩＶレトロウイルス、ＣＡＥＶ（ヤギ関節炎脳炎ウイルス）、ＥＩＡＶ（ウマ感染性貧血症ウイルス）、ＶＩＳＮＡウイルス、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）又はＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）から得ることができる。より好ましい実施態様によれば、本ＤＮＡフラップは、ＨＩＶレトロウイルス、例えばＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２ウイルスから、又はこれら２つの形の任意の異なる単離株から得ることができる。

【0038】

好ましいＤＮＡフラップは、配列番号１から７に定義された配列を含んでなるか又はこれらの配列からなる。その天然の（ウイルスゲノム）ヌクレオチドの状況(context)から単離された、すなわちレンチウイルス中に天然に含まれるｐｏｌ遺伝子から単離されたＤＮＡフラップが使用されることは、注目に値する。従って本発明において、ｐｏｌ遺伝子の不要な５’及び３’部分が欠失され、かつ異なる起源の配列で組換えられたＤＮＡフラップが使用される。特定の実施態様に従い、ＤＮＡフラップは、約９０〜約１５０個のヌクレオチド、特に約１００〜約１４０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。

【0039】

本発明は、そのゲノムの、（１）ＤＮＡフラップ、及びＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、（２）ＤＮＡフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、並びに（３）ＤＮＡフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクターによる組換えにより得ることができる細胞にも関する。先に示された定義は、これらの細胞に適用される。

【0040】

本発明は、そのゲノムの、（１）ＤＮＡフラップ、及びＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、（２）ＤＮＡフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、（３）ＤＮＡフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、並びに（４）ＤＮＡフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクターによる組換えにより得られた細胞にも関する。先に示された定義は、これらの細胞に適用される。

【0041】

本発明は、そのゲノムの、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及びＤＮＡフラップを含んでなる発現ベクターによる組換えにより得ることができる細胞を包含している。先に示された定義は、これらの細胞に適用される。特定の実施態様によれば、発現ベクターは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを更に含む。

【0042】

本発明は、先に説明されたようなＤＮＡフラップ及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのレスキューに必要なタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を含んでなる、発現レトロウイルス由来ベクターにも関する。本発明の特定のベクターに関して、核酸は、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする。

【0043】

用語「ゲノム」は、その細胞への存在は、選択圧に左右されない、すなわち細胞へのその存在が永久であるか及び／又は環境条件に左右されない任意の核酸分子をいう。用語「ゲノム」は、プラスミドを包含していない。主に用語「ゲノム」は、細胞質に存在する核酸分子に対し、細胞核に存在する核酸分子（核ゲノム）をいい、かつ例えば染色体を包含している。特定の実施態様によれば、用語「ゲノム」は、細胞小器官、例えばミトコンドリア（ミトコンドリアゲノム）又は葉緑体（葉緑体ゲノム）などのような特定の細胞コンパートメント内に存在する核酸分子も含む。特定の実施態様によれば、ゲノムは真核細胞に由来する。

【0044】

レトロウイルス由来ベクター、特にレンチウイルス−由来ベクター及びより特定するとＨＩＶ−１−由来ベクターは、レトロ転写に必要なエレメント、特に以下に例示されるように一部欠失、特にＵ３領域の欠失を含む変異された可能性があるＬＴＲ及び有利なことにＤＮＡフラップを含むウイルスゲノムである。これらのＬＴＲ領域及びＤＮＡフラップ領域は、レトロウイルス由来の発現ベクターにおける、レトロウイルスの、特にレンチウイルス起源の唯一の配列であってよい。いかなる場合であっても、レトロウイルス由来ベクターは、完全長レンチウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の実施態様によれば、レトロウイルス由来ベクターは、ＤＮＡフラップ及び本明細書に説明されたような非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのレスキューに必要なタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸、更には対応するウイルスゲノムのＬＴＲを含むか又はこれらからなる。

【0045】

本発明の発現ベクターは、ＤＮＡフラップ及びＲＮＡポリメラーゼ又はそれらの機能部分をコードする核酸を含む。このようなベクターは、ＤＮＡフラップ（ＴＲＩＰ）、Ｕ３ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター並びにＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含んでなる、ＨＩＶ−１発現ベクターである、２００６年１２月１４日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３７０２により寄託されたプラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｔ７、特に配列番号８の配列を有するもの、又は、ＤＮＡフラップ（ＴＲＩＰ）、Ｕ３ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター並びにＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含んでなる、ＨＩＶ−１発現ベクターである、２００６年１２月１４日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３７０３により寄託されたプラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ｎｌｓＴ７、特に配列番号１０の配列を有するものである。

【0046】

本発明の発現ベクターは、ＤＮＡフラップ及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸を含む。このようなベクターは、ＤＮＡフラップ（ＴＲＩＰ）、Ｕ３ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター並びにＭＶＳｃｈｗａｒｚのＮタンパク質をコードする核酸を含んでなる、ＨＩＶ−１発現ベクターである、２００６年１２月１４日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３７００により寄託されたプラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ、特に配列番号１２の配列を有するものである。

【0047】

本発明の発現ベクターは、ＤＮＡフラップ及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸を含む。このようなベクターは、ＤＮＡフラップ（ＴＲＩＰ）、Ｕ３ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター並びにＭＶＳｃｈｗａｒｚのＰタンパク質をコードする核酸を含んでなる、ＨＩＶ−１発現ベクターである、２００６年１２月１４日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３７０１により寄託されたプラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐ、特に配列番号１４の配列を有するものである。

【0048】

別の本発明の発現ベクターは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質をコードする核酸を含む。このようなベクターは、２００７年１２月１８日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３８８１により寄託されたプラスミドｐＥＭＣ−ＬＳｃｈｗであることができる。Ｌタンパク質をコードする核酸の特定のひとつは、配列番号１９を有するものである。

【0049】

先に引用されたベクターＣＮＣＭＩ−３７００から３７０３は全て、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地で、３７℃で振盪培養された、大腸菌（ＪＭ１０９）株に含まれる。

【0050】

本発明は、本明細書において言及された寄託されたプラスミドに挿入されたポリヌクレオチドに含まれたヌクレオチド断片の各々又はいずれかに関し、特に本開示に従い挿入をデザインするのに適した各々又はいずれかの領域に関する。これは、本発明のプラスミドの構築のための、これらの断片の使用にも関する。

【0051】

前記４種のプラスミドは、本発明の組換細胞を得るために細胞の組換えにおいて使用することができるベクターの例である。しかしこれらの例は、本発明の限定を構成するものではなく；従って先に説明されたように、Ｎ及びＰタンパク質（又はそれらの機能誘導体）は、任意の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来することができ、Ｔ７ポリメラーゼは任意のＲＮＡポリメラーゼであることができ、ＣＭＶプロモーターは任意のプロモーターであることができ、ＴＲＩＰＤＮＡフラップは任意のＤＮＡフラップであることができ、かつＨＩＶ−１発現ベクターは任意のベクター及び特に任意のウイルスベクターであることができる。

【0052】

本発明の他の発現ベクターは、ＤＮＡフラップ及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質をコードする核酸を含むか、又はＤＮＡフラップ並びにＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質及び任意に非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質をコードする核酸（１又は２以上の）を含む。

【0053】

用語「発現ベクター」は、本ベクターは、明白に言及されたエレメントに加え、関心対象のタンパク質をコードする核酸（１又は２以上の）の発現を駆動するために必要な全てのエレメント（発現調節エレメント）、特に転写調節エレメントを含むことを示す。「転写調節エレメント」は、ゲノムに組込まれた核酸（１又は２以上の）の転写の調節に関連した任意のＤＮＡ領域を定義し、例えばＣＭＶ、ＥＦ１αもしくはｍＰＧＫ（マウスホスホグリセリン酸キナーゼ）のようなプロモーター、より一般的にはレトロウイルス、特にレンチウイルスベクターの挿入に適した任意のプロモーター、エンハンサーもしくはシス−作用性調節エレメントを包含している。これらのエレメント及び特にプロモーターは、組換細胞の性質に応じて選択される。求められる発現レベル又は組換えられた細胞に応じた好適なプロモーターの決定は、当業者の知識の一部で行われる。組換細胞が関心対象のタンパク質をコードするいくつかの異種核酸（ポリヌクレオチドとも称される）を含む場合、該（１又は２以上の）転写調節エレメントは、それらの核酸全てについて独自であるか、もしくはそれらの一部により共有されるか、又は対照的に各核酸は、特定の転写調節エレメントと会合されることは注目に値する。後者の場合、いくつかの転写調節エレメントは、類似しているか又は異なってよい。

【0054】

組換え工程において使用される全てのベクターにおけるＤＮＡフラップの存在は、ＤＮＡフラップ位置でのＤＮＡ三重鎖構造（三本鎖）の形成につながり（三重鎖構造はＣＴＳドメインを含むｃＰＰＴドメインとＣＴＳドメインの間の領域からなる）、ＤＮＡフラップを有する核酸の細胞の核への（核膜孔を通じた）移行、更にはこの細胞のゲノムへの組込みを可能にする。本ＤＮＡフラップは、ベクター核内移行のシス−決定因子として作用する。第一の態様において、ＤＮＡフラップの存在は、核酸（１又は２以上の）の非分裂細胞への組換え及び組込みに関する大きな関心であり、その理由は細胞分裂（及び膜崩壊）の非存在下で、移行（及び従って核酸の細胞ゲノムへの組込み）は、残効性としてのみ同定され；従って、このＤＮＡフラップを含むベクターは、非分裂細胞の形質導入を可能にする非複製的レトロウイルスベクターである。第二の態様において、ＤＮＡフラップの存在は、その中にＤＮＡフラップを含む核酸が組込まれている細胞の割合をかなり改善することにより、核酸の分裂細胞への組換え及び組込みに関する大きな関心でもある。本明細書において説明されるような、発現ベクターにおけるＤＮＡフラップ配列の挿入は、ベクターＤＮＡの核移行を刺激することにより、インビトロ及びインビボにおける遺伝子導入を強力に増大する(Sirvenら、2001；Zennouら、2001)。ＤＮＡフラップ配列を含むＨＩＶベクター（ＴＲＩＰベクター）は、初代Ｂ細胞及びＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞などを、ＤＮＡフラップを欠いている他のＨＩＶベクターよりも１０倍高い効率で、形質導入することができる。細胞の８０〜９０％の形質導入は、慣習的に得ることができる。

【0055】

ＤＮＡフラップ及び少なくとも３種の関心対象のタンパク質をコードする核酸（１又は２以上の）を含むベクター（１又は２以上の）による組換え、並びにゲノム内のこれらの核酸の組込み後に、この組換細胞は、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質を安定して産生する。

【0056】

本発明の組換細胞を得るために使用される本発明の発現ベクターは、ウイルスベクター、特にウイルス発現ベクター、例えばレトロウイルス由来の、特にレンチウイルス−由来ベクター、例えばＨＩＶ−、ＦＩＶ−又はＳＩＶ−由来ベクターである。より特定すると、レンチウイルス−由来ベクターは、ヒトレンチウイルス−由来ベクター、例えばＨＩＶ発現ベクター、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２−由来ベクターである。好ましい実施態様によれば、ウイルスベクターは、先に説明されたようなＤＮＡフラップ及び関心対象の少なくとも３種のタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を含むＨＩＶ発現ベクターである。ＨＩＶベクターは、その中で実質的に全てのコードウイルス配列が、導入された配列により置換されている、古典的置換レトロウイルスベクターである。従ってＨＩＶベクターは、ふたつのＨＩＶＬＴＲ又は変異されたＬＴＲの間に含まれ、かつＤＮＡフラップの制御下の異種核酸（１又は２以上の）のみ発現する。その結果これらのベクターは、最大５〜６ｋｂを有する巨大なポリヌクレオチドを収容することができる。本発明の特定の実施態様は、先に説明されたようなＨＩＶ発現ウイルスであり、最も特定するとＨＩＶ−１発現ベクターであり、ここでＨＩＶ−１ＬＴＲは、Ｕ３ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されている（ΔＵ３）。この特定の欠失は、そのベクターに含まれた核酸（１又は２以上の）の発現を、特にプロモーターと会合された場合に、増加することが先に示されている。

【0057】

特定の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、プラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｔ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ及びＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐによるか、又はプラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ｎｌｓＴ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ及びＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐのいずれかによる、そのゲノムの組換えにより入手可能である。

【0058】

本発明の細胞は、原核細胞又は真核細胞、特に動物細胞又は植物細胞、より特定するとヒト細胞もしくは非ヒト哺乳類細胞などの哺乳類細胞であることができる。特定の実施態様によれば、細胞は、そのゲノムの組換え前に、初代培養物又は株化細胞のいずれかから単離される。本発明の細胞は、分裂細胞又は非細胞であってよい。本発明の組換細胞を提供するために組換えることができる細胞の例として、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎）細胞があり、この株化細胞２９３は、ＡＴＣＣに寄託番号ＣＲＬ−１５７３により寄託されている。特定の実施態様によれば、ヒト細胞は、生殖細胞及び／又は胚性幹細胞ではない。

【0059】

本発明の組換細胞は、２００６年６月１４日にＣＮＣＭ（パリ、仏国）に寄託番号Ｉ−３６１８により寄託された２９３−Ｔ７−ＮＰ株化細胞、すなわちプラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｔ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ及びＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐにより組換えられたＨＥＫ−２９３細胞であることができる。別の本発明の組換細胞の例は、２００６年８月４日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３６６２により寄託された２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰＭＶ株化細胞、すなわちプラスミドＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ｎｌｓＴ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ及びＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐにより組換えられたＨＥＫ−２９３細胞であることができる。

【0060】

更なる本発明の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含む発現ベクターにより、更に組換えられる。このＬタンパク質の発現は、一過性であり、かつＤＮＡフラップを含まないプラスミドにより駆動されるか、又は対照的に安定しており、かつ先に定義されたようなＤＮＡフラップを含むベクターにより駆動されてよい。Ｌタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを有するプラスミド又はベクターによる組換えは、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の（１又は２以上の）コード配列を含む（１又は２以上の）ベクターにより同時に又は引き続き組換えられてよい。

【0061】

従って本発明は、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質、又はそれらの機能誘導体を安定して産生し、かつ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質を安定してもしくは安定せずに産生する細胞も説明する。

【0062】

本Ｌタンパク質は、表Ｉに提示された任意の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。特定の実施態様によれば、Ｌタンパク質は、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質と同じ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来し、特に同じウイルス株に由来する。別の実施態様によれば、Ｌタンパク質は、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質とは異なる非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。

【0063】

特定の実施態様によれば、Ｌタンパク質は、パラミクソウイルス科ウイルス、好ましくはパラミクソウイルス亜科ウイルス、最も好ましくはモルビリウイルスのウイルスに由来する。モルビリウイルスの例は、麻疹ウイルス（ＭＶ）、特に弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株であり、特にＳｃｈｗａｒｚＭＶ株、又は更にはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（Ｅｄ）株である。特定のＬタンパク質は、ＭＶウイルスのもの（配列番号１６）、又はｐＥＭＣ−ＬＳｃｈｗプラスミドに挿入された配列及び特に配列番号１９のヌクレオチド１４２５と７９７６の間に認められる配列によりコードされたものである。

【0064】

特定の実施態様によれば、Ｌタンパク質の配列は、野生型Ｌタンパク質に関して修飾されてはならず、かつ宿主細胞においてＮ及びＰタンパク質並びにＴ７ポリメラーゼによりトランスに相補される(transcomplement)場合に、機能性である、すなわち粒子又はウイルスを作出することが可能でなければならない。Ｌタンパク質を有するクローンの効果的機能性を決定する試験は、コンピテント細胞を、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及びＴ７（又はｎｌｓＴ７）ポリメラーゼをコードする（１又は２以上の）ベクター、試験されるＬタンパク質をコードするベクター、並びにリーダー、プロモーター、レポーター遺伝子（ＧＦＰなど）及びトレーラーを含むミニゲノムによりトランスフェクションすることにより実行される。このＬクローンの機能性は、レポーター遺伝子を発現している粒子の作出により明らかにされる。

【0065】

本発明は、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの非分節型マイナス鎖ｃＤＮＡクローン、すなわち本ウイルスゲノムのアンチゲノムＲＮＡ（＋）鎖により更に組換えられた、本明細書の細胞も説明する。本発明の分子のヌクレオチド配列の説明に使用される「ｃＤＮＡ」は、当初、該分子は、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの、特に麻疹ウイルスのウイルス粒子のゲノム（−）ＲＮＡゲノム、及び最も好ましくは非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルス粒子の完全長ゲノム（−）ＲＮＡゲノムの逆転写により得られるという事実にのみに関する。このことは、本ｃＤＮＡクローンの調製に使用される方法に関する限定とみなされてはならない。従って本発明は、「ｃＤＮＡ」の表現の中に、それが先に定義されたヌクレオチド配列を有することを条件として、各ＤＮＡを包含している。従ってＤＮＡ又はプラスミドを含む精製された核酸は、該核酸、特にＤＮＡが前述の定義を満たすことを条件として、本発明のｃＤＮＡの意味に包含される。

【0066】

特定の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンは、該ウイルス配列の上流に、転写調節エレメントを含む。好ましい実施態様によれば、これらのエレメントは、先に説明されたＮ、Ｐ及び／又はＬタンパク質を含む発現ベクター（１又は２以上の）に位置したもの（１又は２以上の）と同じである。より好ましい実施態様によれば、このエレメントは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。

【0067】

ある実施態様によれば、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンは、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質及び／又はＬタンパク質と同じ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来、特に同じウイルス株に由来する。別の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンは、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質及び／又はＬタンパク質とは異なる非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。

【0068】

特定の実施態様によれば、ｃＤＮＡクローンは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばパラミクソウイルス科ウイルス、好ましくはパラミクソウイルス亜科ウイルス、最も好ましくはモルビリウイルスのウイルスに由来する。モルビリウイルスの例は、麻疹ウイルス（ＭＶ）、特に弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株であり、特にＳｃｈｗａｒｚＭＶ株又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（Ｅｄ）株である。更に非分節型マイナス鎖ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、以下に定義されるように、野生型株又はウイルスと比べ修飾されてよい。

【0069】

本発明は、細胞が、本明細書を通じて定義されたものであるような該細胞培養物、特にＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞培養物にも関する。別の実施態様によれば、本発明は、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質、又はそれらの機能誘導体を安定して産生し、かつ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質又はそれらの機能誘導体を安定して又は一過性に産生する、細胞培養物にも関する。

【0070】

ある実施態様によれば、組換えられた細胞培養物は、初代培養物、すなわち動物（任意に非ヒト）又は植物から直接得られた細胞又は組織から調製された培養物である。別の実施態様によれば、組換えられた細胞培養物は、株化細胞、すなわち初代培養物の最初の継代培養から、又は該細胞の引き続きの連続継代から得られた細胞の集団である。

【0071】

別の態様において、本発明は、本発明の細胞を使用し、感染性組換え非分節型マイナス鎖ウイルスを作出する様々な方法にも関する。

【0072】

感染性組換え非分節型マイナス鎖ウイルスを作出する第一の方法は：
ａ．ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンにより、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターにより組換える工程、
ｂ．非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製及び作出を維持するのにコンピテントな細胞上に、該組換細胞又は組換細胞培養物を移送する工程、並びに
ｃ．工程ｂの共培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収する工程：を含んでなる。

【0073】

本発明の第二の方法は、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出する方法であり：
ａ．ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンにより、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターにより組換える工程、並びに
ｂ．該組換細胞又は組換細胞培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収する工程：を含んでなる又はからなる。

【0074】

本明細書において使用される「組換え」は、例えばベクターの形の下での、少なくとも１種のポリヌクレオチドの細胞への導入を意味し、該ポリヌクレオチドは、細胞ゲノム（先に定義されたような）に組込まれる（全体又は一部が）か、又は組込まれない。特定の実施態様に従い、組換えは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンである第一のポリヌクレオチドで得ることができ、その定義、性質及び任意の修飾は、本明細書において別所記載されている。組換えは、同じく又は代わりに、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードするベクターであるポリヌクレオチドを導入することを包含することができ、その定義、性質及び発現の安定性は、本明細書において別所記載されている。

【0075】

これらの方法において、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物は、本明細書に定義された細胞又は本明細書に定義された細胞培養物であり、すなわち、先に定義された１種又は複数のポリヌクレオチドの導入により修飾されている程度（ｅｘｔｅｎｔ）までの組換細胞でもある。特定の本発明の実施態様によれば、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ及びＰタンパク質を安定して産生する細胞又は細胞培養物は、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質を産生しないか、又は非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質を安定して産生せず、例えばその一過性の発現又は産生が可能である。

【0076】

本明細書において使用される「移送」は、組換細胞の、異なる細胞型上の、特に異なる細胞型の単層上の配置をいう。これらのうち後者の細胞は、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製及び作出の両方、すなわち細胞内の感染性ウイルスの形成及び可能性のあるこれらの感染性ウイルスの細胞外への放出の各々を維持するためにコンピテントである。この移送は、本発明の組換細胞の、前文で定義されたようなコンピテント細胞との共培養を生じる。前記移送は、組換細胞が効率的にウイルス産生する培養でない、すなわちその感染性ウイルスはこれらの組換細胞から効率的に回収することができない場合の、追加の、すなわち任意の工程であってよい。この工程は、本発明の組換細胞の、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローン、及び任意に非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターによる更なる組換え後に導入される。

【0077】

本発明の特定の実施態様によれば、通常容易に組換えられるそれらの能力について選択される組換細胞は、組換え感染性ウイルスの維持及び作出において十分に効率的でないので、導入工程が必要である。該実施態様によれば、先に定義した方法の工程ａの細胞又は細胞培養物は、本発明の組換細胞又は組換細胞の培養物、特に例えば２００６年６月１４日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３６１８により寄託された２９３−Ｔ７−ＮＰ株化細胞、又は２００６年８月４日にＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−３６６２により寄託された２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰＭＶ株化細胞などの、組換えＨＥＫ−２９３細胞である。

【0078】

非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製及び作出を維持するためにコンピテントである細胞は、本発明の組換細胞と共存培養することができるが、必ずしも同じ界、門、綱、目、科、属又は種の細胞ではない、任意の細胞型であることができる。コンピテント細胞の例は、ベロ（アフリカミドリザル腎）細胞又はＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞である。ＣＥＦ細胞は、EARL Morizeau (8 rue Moulin, 28190 Dangers, 仏国)から入手できるような受精した鶏卵から、任意の他の生産者の受精した鶏卵から、又はＭＲＣ５細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１；肺線維芽細胞）から調製することができる。

【0079】

本発明の別の実施態様によれば、導入工程は不要であり、従って実行されない。このことは、実行が容易であり、常法よりも迅速かつ安価であり、かつ夾雑を伴わない組換え感染性ウイルスの回収が可能である、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出する方法を提供するための、本発明の利点のひとつである。これは、下記の特徴を有する本発明の組換細胞により実現することができる：
−ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生すること、
−それから感染性組換えウイルスを、望ましくないウイルス及び／又は他の細胞型による夾雑を伴わずに、効率的に回収すること。

【0080】

本明細書において使用される「感染性組換えウイルスの回収」とは、それにより該細胞により先に作出された感染性ウイルスが、該細胞から放出され、かつ培養された細胞から単離される任意の手段をいう。この回収は、他の細胞型（１又は２以上の）の関与を伴わずに、感染性組換えウイルスが本発明の組換細胞から回収される場合には、「直接」であると称される。対照的に、感染性組換えウイルスが、本発明の組換細胞以外の別の細胞型から回収される場合には、この回収は「間接的」と称される。先に言及したように、本発明は、最初に感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの直接回収を報告する。

【0081】

特定の本発明の方法において、組換え工程は、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターで組換える工程を含まない。この場合、本発明の組換細胞は、Ｌタンパク質を発現するそれらの能力について選択され、かつ特にＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターで予め組換えられ、このＬタンパク質をコードする核酸は、該細胞ゲノムに組込まれるか又は組込まれない。

【0082】

適当な場合、アクセサリータンパク質（非−Ｐ、非−Ｌもしくは非−Ｎタンパク質、又は非−ＲＮＡポリメラーゼ）を有するベクターが、本発明の方法において任意に使用されてよく、特にこれらのタンパク質を欠失したゲノム又はｃＤＮＡクローンが使用される場合である。このようなアクセサリータンパク質は、Ｃタンパク質、Ｖタンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、Ｍタンパク質、Ｍ２タンパク質及び／又はＳＨタンパク質である。これらのアクセサリータンパク質のコード配列を有するベクター（１又は２以上の）は、任意に先に定義されたｃＤＮＡフラップを含んでよい。

【0083】

本発明の組換細胞におけるＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の産生の安定性は、下記の当該技術分野において先に説明された方法のいくつかの利点につながる：
−本発明の方法は必ずしも導入工程を含まない；
−本方法は、Parksらの論文(1999)に報告されたような熱ショック工程を含まない。実際この工程は、ウイルスのＮ及びＰタンパク質、更にはＲＮＡポリメラーゼの合成の効率を改善することが示されており、このタンパク質は、プラスミド上に有された核酸から合成される。しかし本発明において、本核酸は、細胞ゲノムへ組込まれ、かつこれらのタンパク質の発現は、安定し、及び／又は新たにキャプシド形成を始めるのに適したレベルであることが示されている。
−本方法は、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の産生は安定しており、かつプラスミド由来のそれらの発現に左右されないので、大量の感染性ウイルスを生じる。従って１０⁶個の組換細胞中の約１００〜４００個が、組換え後に感染性ウイルスを伝達する（レスキュー事象の数）。これは、Radeckeらの方法(1995)により得られた１０⁶個のトランスフェクションされた細胞の中の１〜６個よりも概して優れている。本方法の特定の実施態様によれば、１０⁶個の組換細胞に関するレスキュー事象の数は、２０個超、５０個超、１００個超、２００個超、３００個超、４００個超、又は５００個超である。

【0084】

最後に、本発明の別の利点は、組換えることができ、かつ本発明を実行するために使用される多種多様な細胞である。実際本組換細胞は、任意の真核細胞、特に非ヒト細胞又はヒト細胞のいずれかの哺乳類細胞であることができる。特定の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、ヒト線維芽細胞、特にＭＲＣ５株化細胞（ヒト肺線維芽細胞）である。本発明は特に、分裂しない細胞に有用である。

【0085】

本発明に従い、ＲＮＡウイルスの非分節型マイナス鎖のｃＤＮＡクローンは、ＭＶウイルス、特に弱毒化されたウイルス、特定すると弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株、例えばＳｃｈｗａｒｚＭＶ株に由来する。ｃＤＮＡクローンは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの完全長アンチゲノムをコードするＤＮＡ配列である。

【0086】

本発明の特定の実施態様によれば、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質に加えｃＤＮＡクローンは、同じウイルスに由来し、これは、表Ｉの任意のウイルス、特に先に明らかにされたＭＶウイルス、例えば麻疹ウイルスのＳｃｈｗａｒｚＭＶ株であることができる。ＥｄｍｏｎｓｔｏｎＢ．株及びＳｃｈｗａｒｚ株のヌクレオチド配列は、WO 98/13505に開示されている。非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質並びにｃＤＮＡクローンの性質とは無関係に、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。特定のｃＤＮＡ配列は、配列番号１８に定義されたようなＳｃｈｗａｒｚ株のｃＤＮＡの配列である。このようなｃＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの制御下で、麻疹ウイルス、Ｓｃｈｗａｒｚワクチン株の完全配列を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである、ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗから得ることができる。そのサイズは１８９６７ｎｔである。

【0087】

あるいは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンは、表Ｉの任意のウイルスに由来する。それからｃＤＮＡクローンが由来する特定の組換え麻疹ウイルスは、Ｓｃｈｗａｒｚ株であり、特に承認されたワクチンＳｃｈｗａｒｚ株、例えばAventis Pasteur(仏国)から入手可能な商標Rouvaxで製造されているものである。

【0088】

「弱毒化された株」とは、本明細書において、同じ宿主において非病原性であるか又は親株よりも病原性が低いが、宿主へ投与した場合に免疫原性及び恐らくはアジュバント活性を維持している株、すなわち免疫優性のＴ及びＢ細胞エピトープ並びに恐らくはＴ細胞共刺激タンパク質又はサイトカインＩＬ−１２の誘導のようなアジュバント活性を保存している株として定義される。特定の実施態様によれば、弱毒化された株は、「認可されたワクチン株」、すなわちワクチン製品の市販承認を交付する国又は地域の保健当局によりワクチン製造における使用が認可された株（法的指定）である。従って「承認されたワクチン株」は、安全で、安定しておりかつ有効な保護（免疫原性及びアジュバント活性）を提供することができることが示されている。株の安定性は、同じ認可された株化細胞上での多くの継代後に、株の特性が、実質的に変化せずに保持されることを評価することにより、測定される。

【0089】

本明細書において使用される「由来する」とは、そのヌクレオチド配列が、野生型ウイルス又は株のひとつと比べて修飾されている任意のｃＤＮＡクローンを意味する。この修飾は、ウイルス又は株のタンパク質のヌクレオチド配列中の及び特にコード配列中の、少なくとも１個の置換、欠失又は挿入であってよい。別の実施態様によれば、ヌクレオチド配列は、少なくとも１個の異種核酸（１又は２以上の）、すなわち少なくとも１個の核酸（１又は２以上の）が挿入されたウイルスもしくは株において天然には存在しない配列の、又は麻疹ウイルスの抗原に由来しない配列の挿入により修飾される。更にｃＤＮＡクローンは、野生型ウイルスゲノムの（１又は２以上の）部分の欠失、又は異種核酸の挿入により修飾されてよい。

【0090】

好ましい実施態様によれば、１種又は数種の異種核酸からなる、或いはかかる異種核酸を含む、この誘導ｃＤＮＡクローンは、いわゆる６ルールに合致することが指摘される。従って、この誘導ｃＤＮＡクローンは、多六量体長、すなわち６の倍数である。この必要要件は、パラミクソウイルス科、特定すると麻疹ウイルスに由来したｃＤＮＡクローンについて特に達成される。当業者に公知のように、一部の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、この規則に従わない。

【0091】

挿入によって感染性組換え非分節型マイナス鎖ウイルスの作出が妨害されない限りは（許容部位）、ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に任意の異種核酸を挿入することができる。特定の実施態様によれば、未変性のウイルスゲノムの挿入又は欠失は、６の倍数であるポリヌクレオチドを提供する。従って、例えゲノム長が６の倍数でなくとも、この修飾は、６又は６の倍数個の欠失及び／又は挿入からなる。

【0092】

従って、（１又は２以上の）異種核酸配列は、そ（れら）の起源である（１又は２以上の）細菌又は寄生体生物、特に（１又は２以上の）病原性生物、例えばウイルス、特にレトロウイルス、フラビウイルスもしくはコロナウイルスなどに対し、決定された宿主において体液性及び／又は細胞性免疫応答（ＣＴＬ又はＣＤ４反応など）を誘発することができる１種又は数種のペプチドをコードすることができる。従ってそのようなペプチドのアミノ酸配列は、抗原の少なくとも１種のエピトープ、特に保存されたエピトープを含むものであり、そのエピトープは、天然に抗原上に露出されているか、又は抗原の変異もしくは修飾もしくは組合せの結果として得られるかもしくは露出される。ｃＤＮＡクローンに挿入することができる異種核酸は、レトロウイルス、例えばヒトレトロウイルス、特にレンチウイルス、特定するとＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２、フラビウイルスもしくはコロナウイルスのエンベロープ、例えばエンベロープもしくはキャプシド抗原を含んでなる、特にウイルスの構造抗原（それらの抗原性断片又は該抗原もしくは断片の誘導体を含む）をコードする。特にそのような抗原は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２を含むＡＩＤＳウイルスのエンベロープに、ＨＩＶのキャプシドに、又は黄熱病ウイルスのエンベロープに、又は西ナイルウイルスのエンベロープに、又はデング熱ウイルス（ＤＶ）のエンベロープに、又は日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のエンベロープに、又はＳＡＲＳ−関連コロナウイルスのエンベロープに特別に由来する。しかし有利なことにその他のレトロウイルス又はコロナウイルス抗原が、該レトロウイルスもしくはフラビウイルスに対する抗体を誘発することが可能であるか、及び／又はレトロウイルスもしくはフラビウイルスに対する中和抗体の作出を誘発することが可能である組換え麻疹ウイルスを誘導するために使用されてよい。別の実施態様によれば、異種核酸配列によりコードされた又は包囲されたペプチドは、腫瘍抗原又は癌細胞の細胞表面に特異的に発現された抗原である。本発明の別の実施態様に従い、これらの配列は、代わりに又は加えて、レトロウイルス又はフラビウイルスに対する細胞性免疫応答も誘発するマルチエピトープ又は抗原をコードする。

【0093】

有利なことに、本発明の方法により作出された組換え麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスに対する体液性及び／又は細胞性免疫応答も誘発することができる。しかしこの反応は必須ではなく、但し先に明らかにされたエピトープ又はマルチエピトープもしくは抗原に対する免疫応答が実際に得られることを条件とする。

【0094】

本発明の好ましい実施態様によれば、異種核酸は、ＨＩＶレトロウイルス由来のタンパク質、特にＨＩＶのエンベロープ抗原、及び特別にはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２のエンベロープタンパク質もしくは糖タンパク質由来のペプチドをコードする。これに関して関心対象の抗原は、特別にＨＩＶ−１のｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇｐ４１又はＨＩＶ−１のｇｐ１４０、ＧＡＧもしくはＴＡＴである。本発明の特定の実施態様によれば、異種アミノ酸配列は、組換えＨＩＶ−１のｇｐ１６０、ｇｐ１２０又はＨＩＶ−１のｇｐ１４０、ＧＡＧもしくはＴＡＴに由来する。

【0095】

別の実施態様によれば、ｇｐ１２０（又はｇｐ１６０）抗原のＶ１、Ｖ２及び／又はＶ３ループは、保存されたエピトープが得られた組換えｇｐ１２０抗原上に露出されるような方式で、個別に、又は組合せて、欠失又は一部欠失されている。ＨＩＶ−１のｇｐ１２０（又はｇｐ１６０）抗原のＶ１、Ｖ２及びＶ３ループは、特に「Fields virology」(Fields B.N.ら、Lippincott Raven publishers 1996, p.1953-1977)に明らかにされている。

【0096】

別の実施態様によれば、異種核酸は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０（又はｇｐ１６０）抗原に由来しているペプチドをコードしており、ここでｇｐ１２０（又はｇｐ１６０）抗原のＶ１、Ｖ２及び／又はＶ３ループは、保存されたエピトープが得られた組換えｇｐ１２０（又はｇｐ１６０）抗原上に露出されるそのような方式で、個別に、又は組合せて、置換又は一部置換されている。

【0097】

別の実施態様によれば、異種核酸は、ＨＩＶ−１のエンベロープ抗原に由来するペプチド、特にＶ１及びＶ２ループが欠失されかつＶ３ループが配列ＡＡＥＬＤＫＷＡＳＡＡにより置換されているような方式でｇｐ１２０抗原に由来するペプチドをコードする。

【0098】

別の実施態様によれば、異種核酸は、ｇｐ１６０ΔＶ３、ｇｐ１６０ΔＶ１Ｖ２、ｇｐ１６０ΔＶ１Ｖ２Ｖ３、ｇｐ１４０ΔＶ３、ｇｐ１４０ΔＶ１Ｖ２、ｇｐ１４０ΔＶ１Ｖ２Ｖ３であるペプチドをコードする。

【0099】

ＨＩＶ、ＷＮＶ、ＹＦＶ、ＤＶ又はＪＥＶ由来のエピトープを含む好ましいｃＤＮＡクローンは、表ＩＩに定義されたベクターであり、これらはＣＮＣＭ(Collection Nationale de Culture de Microorganismes-Institut Pasteur-パリ、仏国)に寄託され、かつその特徴は以下に示されている。

【0100】

【表2】

【0101】

Ｉ−２８８３（ｐＭＶ２（ＥｄＢ）ｇｐ１６０［Δ］Ｖ３ＨＩＶ８９．６Ｐ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のＡＴＵに挿入されたウイルスＳＶＩＨ株８９．６Ｐのｇｐ１６０ΔＶ３＋ＥＬＤＫＷＡＳの遺伝子を含んでなる、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、２１２６４ｎｔである。

【0102】

Ｉ−２８８４（ｐＭＶ２（ＥｄＢ）ｇｐ１６０ＨＩＶ８９．６Ｐ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のＡＴＵに挿入されたウイルスＳＶＩＨ株８９．６Ｐのｇｐ１６０の遺伝子を含んでなる、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、２１６５８ｎｔである。

【0103】

Ｉ−２８８５（ｐＭＶ２（ＥｄＢ）ｇｐ１４０ＨＩＶ８９．６Ｐ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のＡＴＵに挿入されたウイルスＳＶＩＨ株８９．６Ｐのｇｐ１４０の遺伝子を含んでなる、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、２１０９４ｎｔである。

【0104】

Ｉ−２８８６（ｐＭＶ３（ＥｄＢ）ｇｐ１４０［Δ］Ｖ３ＨＩＶ８９．６Ｐ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のＡＴＵに挿入されたウイルスＳＶＩＨ株８９．６Ｐのｇｐ１４０ΔＶ３（ＥＬＤＫＷＡＳ）の遺伝子を含んでなる、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、２１０５８ｎｔである。

【0105】

Ｉ−２８８７（ｐＭＶ２（ＥｄＢ）−ＮＳ１ＹＦＶ１７Ｄ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のＡＴＵに挿入された黄熱病ウイルス（ＹＦＶ１７Ｄ）のＮＳ１遺伝子を含んでなる、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、２０１６３ｎｔである。

【0106】

Ｉ−２８８８（ｐＭＶ２（ＥｄＢ）−ＥｎｖＹＦＶ１７Ｄ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のＡＴＵに挿入された黄熱病ウイルス（ＹＦＶ１７Ｄ）の遺伝子Ｅｎｖを含んでなる、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、２０５０５ヌクレオチドである。

【0107】

Ｉ−３０３３（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−Ｅｓ（ＷＮＶ））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入された、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）の分泌型エンベロープ（Ｅ）の遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0108】

Ｉ−３０３４（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−ＧＦＰｂｉｓ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入された、ＧＦＰの遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0109】

Ｉ−３０３５（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−ｐ１７ｐ２４［Δ］ｍｙｒ（ＨＩＶＢ））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入された、ＨＩＶＢウイルスのｐ１７ｐ２４Δｍｙｒタンパク質をコードする遺伝子であるｇａｇ遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0110】

Ｉ−３０３６（ｐＴＭＶＳｃｈｗ３−Ｔａｔ（ＨＩＶ８９−６ｐ））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入された、ウイルス株８９．６Ｐの遺伝子であるＴａｔ遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0111】

Ｉ−３０３７（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ３−ＧＦＰ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつ１個のヌクレオチドの欠失を有する、ＡＴＵに挿入された遺伝子であるＧＦＰ遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0112】

Ｉ−３０３８（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−Ｅｓ）（ＹＦＶ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入された熱病ウイルス（ＹＦＶ）の分泌型タンパク質の遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0113】

Ｉ−３０５４（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−ｇｐ１４０［Δ］Ｖ１Ｖ２Ｖ３（ＨＩＶ８９−６））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入されたｇｐ１４０［Δ］Ｖ１Ｖ２（ＨＩＶ８９−６）をコードする遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0114】

Ｉ−３０５５（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−ｇｐ１４０［Δ］Ｖ３（ＨＩＶ８９−６））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入されたｇｐ１４［Δ］Ｖ３（ＨＩＶ８９−６）をコードする遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0115】

Ｉ−３０５６（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−ｇｐ１６０［Δ］Ｖ１Ｖ２Ｖ３（ＨＩＶ８９−６））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入されたｇｐ１６０［Δ］Ｖ１Ｖ２Ｖ３（ＨＩＶ８９−６）をコードする遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0116】

Ｉ−３０５７（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−ｇｐ１６０［Δ］Ｖ１Ｖ２（ＨＩＶ８９−６））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入されたｇｐ１６０［Δ］Ｖ１Ｖ２（ＨＩＶ８９−６）をコードする遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0117】

Ｉ−３０５８（ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ２−ＧａｇＳＩＶ２３９ｐ１７−ｐ２４［Δ］ｍｙｒ−３−ｇｐ１４０（ＨＩＶ８９−６））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列を含み、かつＡＴＵに挿入されたＧａｇＳＩＶ２３９ｐ１７−ｐ２４［Δ］ｍｙｒ−３−ｇｐ１４０（ＨＩＶ８９−６）をコードする遺伝子を発現している、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドである。

【0118】

Ｉ−３４４０（ｐＴＭ−ＭｖＳｃｈｗ２−［ＥＤＩＩＩ＋Ｍ^1-40］ＷＮＶ（ＩＳ−９８−ＳＴ１））は、麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列及びＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に位置した追加の発現ユニットを含み、かつこのユニットは、膜タンパク質Ｍの配列１−４０に融合された西ナイルウイルス（ＷＮＶ）（ＷＮＶＩＳ−９８−ＳＴ１）のエンベロープタンパク質由来のドメインＩＩＩのヌクレオチド配列を含んでなる、ＰＴＭ由来のプラスミドである。

【0119】

Ｉ−３４４２（ｐＴＭ−ＭｖＳｃｈｗ２−［ＥＤＩＩＩ＋ＡｐｏｐｔｏＭ］ＤＶ１（ＦＧＡ８９））は、麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列及びＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に位置した追加の発現ユニットを含み、かつこのユニットは、膜タンパク質Ｍのアポトーシス配列に融合されたデング−１ウイルス（ＦＧＡ８９株）のエンベロープタンパク質由来のドメインＩＩＩのヌクレオチド配列を含んでなる、ＰＴＭ由来のプラスミドである。

【0120】

Ｉ−３４４１（ｐＴＭ−ＭｖＳｃｈｗ２−［ＥＤＩＩＩ］ＪＥＶ（Ｎａｋａｙａｍａ））は、麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのｃＤＮＡ配列及びＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に位置した追加の発現ユニットを含み、かつこのユニットは、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）Ｎａｋａｙａｍａ株のエンベロープタンパク質由来のドメインＩＩＩのヌクレオチド配列を含んでなる、ＰＴＭ由来のプラスミドである。

【0121】

特定の実施態様によれば、本異種核酸は、エンベロープ（Ｅｎｖ）、ＮＳ１タンパク質又はそれらの免疫原性変異体から選択された、黄熱病ウイルスの抗原に由来するペプチドをコードする。本発明の組換え麻疹ウイルスベクター内に存在する異種ＤＮＡ配列が黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に由来する場合、これは好都合なことにAventis Pasteurにより商標Stamaril（登録商標）で市販されているＹＦＶ１７Ｄ２０４の中から選択される。

【0122】

別の特定の実施態様によれば、本異種核酸は、エンベロープ（Ｅ）、プレ膜（ｐｒｅＭ）又はそれらの免疫原性変異体から選択された、西ナイルウイルスの抗原に由来するペプチドをコードする。本発明の組換え麻疹ウイルスベクター内に存在する異種ＤＮＡ配列が西ナイルウイルス（ＷＮＶ）に由来する場合、これは好都合なことに神経毒株ＩＳ９８−ＳＴ１の中から選択される。

【0123】

本異種核酸は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードするものでもよい。

【0124】

本発明の別の利点は、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローン、長い異種核酸又は多数の異種核酸を挿入する可能性である。従って、本ｃＤＮＡクローンは、その総配列は少なくとも５ｋｂである異種核酸の１種又は複数の挿入により修飾されてよい。

【0125】

本発明は、本開示に従い、本明細書において言及された寄託されたプラスミド中に挿入されたポリヌクレオチドに含まれた各々及び任意のヌクレオチド断片に、特に挿入をデザインするのに適した各々及び任意の領域に関する。これは、本発明のプラスミドの構築のためのこれらの断片の使用にも関する。

【0126】

本発明は、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体のタンパク質の３種又は少なくとも３種を安定して発現する組換細胞を作出する方法にも関し、これは：
ａ．細胞を、少なくとも：
−ＤＮＡフラップ、及びＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター、
−ＤＮＡフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター、
−ＤＮＡフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター
で組換える工程：並びに
ｂ．少なくともＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞を選択する工程：
もしくは
ａ．細胞を、少なくとも：
−プロモーターの制御下で、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
−プロモーターの制御下で、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
−プロモーターの制御下で、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及び
−ＤＮＡフラップ
を含む発現ベクターで組換える工程：並びに
ｂ．少なくともＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞を選択する工程：
のいずれか含んでなるか、或いはこれらからなる。

【0127】

本発明の特定の実施態様によれば、組換細胞を作出する本方法は、前記方法の工程ａにおいて得られた組換細胞を、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）又はそれらの機能誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターにより組換える工程、並びに少なくともＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生し、かつ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのラージタンパク質（Ｌ）又はそれらの機能誘導体を産生する細胞を選択する工程を更に含む。

【0128】

本発明は、ヘルパー細胞としての、特に感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの作出におけるヘルパー細胞としての、本明細書に説明されたような、本発明の組換細胞の使用にも関する。

【0129】

既定の本発明の更なる実施態様及び特徴は、以下の実施例及び図面から明らかである。

【実施例】

【0130】

本発明を更に以下の実施例により説明するが、これは「特許請求の範囲」に説明された本発明の範囲を限定するものではない。

【0131】

細胞及びウイルス
ベロ（アフリカミドリザル腎）細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、単層として増殖した。ヒト腎２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞は、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭにおいて増殖した。ヒト二倍体ＭＲＣ５細胞は、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭにおいて、単層として増殖した。トリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、以下のように調製した：受精した鶏卵(Morizeau、Dangers, 仏国)を、３８℃で９日間インキュベーションした。胚を、無菌条件下で収集した。頭部、四肢及び内臓を除去し、胚を細断し、次に５〜１０分間、３７℃でトリプシン処理した（トリプシン／ＥＤＴＡ２．５ｇ／Ｌ）。濾過（７０μｍ）及びＤＭＥＭ高グルコース／１０％ＦＣＳ中で数回の洗浄後、細胞を播種し（５〜７×１０⁶個細胞／ペトリ皿）、３７℃で一晩インキュベーションし、その後ウイルス感染に使用した。

【0132】

プラスミド構築
Gateway（登録商標）組換えシステム(Invitrogen)を使用する追加配列の容易な組換えを可能にするために、Gateway（登録商標）カセット(attb1/attb2 Seq)を、ＳｍａＩ消化により直線としたＨＩＶ−１−ＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＢＳＸプラスミドベクター(Zennouら、2000)へライゲーションすることにより導入した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、PfuTurbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)及びGateway（登録商標）組換え配列（下線）を含む下記プライマーを使用するＰＣＲにより、ｐＡＲ−１１７３プラスミド(Brookhaven National Laboratory, ref)から増幅した。

【0133】

AttB1-T7Pol : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGG
AATTCTCTGACATCGAACTGGCT-3'
AttB2-retourT7Pol : 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCAC
GCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'

【0134】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの核型（ｎｌｓＴ７）も、核局在化シグナル（太字）及びＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え配列（下線）を含む下記プライマーを使用し、ｐＡＲ−３２８８プラスミド(Brookhaven National Laboratory, ref)から増幅した。

【0135】

AttBl-SV40nls : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG
GCACCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'
AttB2-retourT7Pol: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCACG
CGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'

【0136】

同じ方法を使用し、ＳｃｈｗａｒｚＭＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を、完全長感染性ＳｃｈｗａｒｚＭＶアンチゲノムを含むｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗプラスミドから、ＰＣＲにより増幅した(Combredetら、2003)。Gateway（登録商標）組換え配列(下線)を含む下記プライマーを使用した。

【0137】

AttB1-N : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCCACAC
TTTTAAGGAGCTTAGCA-3'
AttB2-N : 5'-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGTACTAGTCTAG
AAGATTTCTGTCATTGTA-3'
AttB1-P : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCAGAAG
AGCAGGCACGCCAT-3'
AttB2-P: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACTACTTCAT
TATTATCTTCATCAGCATCTGGTGGA-3'

【0138】

次にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ｎｌｓＴ７ＲＮＡポリメラーゼ並びにＭＶＮ及びＰタンパク質をコードする様々なＰＣＲ断片を、ｐＤＯＮＲ（商標）２０７エントリープラスミド(Invitrogen)へ導入し、かつGateway（登録商標）組換えシステム(Invitrogen)を使用し、修飾されたＨＩＶ−１−ＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＢＳＸプラスミドで組換えた。得られた様々な組換えベクタープラスミド（ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｔ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ｎｌｓＴ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ及びＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐ）を、完全に配列決定した。これらのベクターは、２００６年１２月１４日にＣＮＣＭへ、それぞれ、寄託番号Ｉ−３７０２、Ｉ−３７０３、Ｉ−３７００及びＩ−３７０１で寄託した。

【0139】

ＳｃｈｗａｒｚＭＶ由来のラージポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質を発現しているプラスミドｐＥＭＣ−ＬＳｃｈｗを、Radeckeらの論文(1995)に説明されたものと同様の様式で構築した。ＳｃｈｗａｒｚＬ遺伝子の６５５２ヌクレオチド長の配列を、ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗプラスミドから得(Combredetら、2003)、Radeckeらの論文(1995)において先に説明されたｐＥＭＣ−Ｌａプラスミドに、古典的クローニング手順を用い挿入した。このプラスミドは、２００７年１２月１８日にＣＮＣＭへ、寄託番号Ｉ−３８８１で寄託した。

【0140】

ベクター粒子の作出
ベクター粒子は、Zennouらの論文(2000)に説明されたような、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｔ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ｎｌｓＴ７、ＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｎ、又はＨＩＶ−１−ＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−Ｐベクタープラスミド、ＨＩＶ−１ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を発現しているキャプシド形成プラスミド、並びにＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を発現しているプラスミド（ｐＨＣＭＶ−Ｇ）のいずれかによる、リン酸カルシウム法を用いる、ＨＥＫ−２９３細胞の同時トランスフェクションにより作出した。超遠心により濃縮されたベクター粒子ストック中のＧａｇｐ２４抗原の量は、HIV-1 p24 ELISA(Perkin Elmer LifeSciences)を用いて決定した。

【0141】

株化細胞２９３−Ｔ７−ＭＶの作製
細胞（ＨＥＫ−２９３）は、ＴＲＩＰ−Ｔ７及びＴＲＩＰ−ｎｌｓＴ７レンチウイルスベクターによる形質導入の１日前に、３５ｍｍウェルに播種した。ベクター（５００ｎｇ／ｍｌｐ２４）を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭに添加した。８日間、毎日細胞に同量のベクターを、繰り返し添加した。細胞を、２日おきに拡大した。各継代後に、細胞のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ活性を決定した。３５ｍｍ細胞培養物を、リン酸カルシウム法を用い、ｐＥＭＣ−Ｌｕｃ５μｇでトランスフェクションし、トランスフェクション後１日目に収集した透明化された細胞溶解液の１／２０中のルシフェラーゼ活性を、ルミノメーターで測定した。ルシフェラーゼ活性は、追加の形質導入の度に増大し、かつ７回目と８回目の形質導入の間は最大に留まった。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現の細胞傷害性の非存在は、トリパンブルー排除法を用いる細胞生存度の定量及び非形質導入細胞との比較により、各形質導入後、明らかになった。８工程の形質導入の後、細胞質型（２９３−Ｔ７）又は核型（２９３−ｎｌｓＴ７）のいずれかの、非常に高いＴ７ＲＮＡポリメラーゼ活性を伴うふたつの細胞集団を作出した。

【0142】

その後これらふたつの細胞集団（２９３−Ｔ７及び２９３−ｎｌｓＴ７）を、ＴＲＩＰ−Ｎ及びＴＲＩＰ−Ｐベクターにより同時に共形質導入した。ベクター（ＴＲＩＰＮ：３９０ｎｇ／ｍｌｐ２４及びＴＲＩＰＰ：３３０ｎｇ／ｍｌｐ２４）を、３５ｍｍウェル中に播種した細胞に添加した。１０日間の間に、同量の両方のベクターを、毎日細胞に繰り返し添加した。細胞を、２日おきに拡大した。１０回形質導入した後、ＭＶのＮ及びＰタンパク質の発現を、３５ｍｍウェルの総溶解液の１／２０を使用するウェスタンブロットにより、全細胞集団について分析した。両タンパク質の発現は、感染したベロ細胞の類似数のものと同等であった（図２）。次に形質導入した細胞を、限定希釈によりクローニングした。細胞を、９６−ウェルプレートに、１／３細胞／ウェルの希釈で播種した。２週間後、最初のクローンを選択した。２９３−Ｔ７−ＮＰ及び２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ細胞の各々約１００クローンを、２４−ウェルプレートに、その後３５ｍｍウェルに拡大した。ＭＶのＮ及びＰタンパク質の発現を、２０クローンについて、３５ｍｍウェルの総溶解液の１／２０を使用するウェスタンブロットにより分析した。両タンパク質の発現は、感染したベロ細胞の類似数のものと同等であった（図２）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ活性を、先に説明したように、各クローンについて測定した。非常に高いルシフェラーゼ活性並びに同等レベルのＭＶＮ及びＰ発現を伴う多くのクローンを選択した。以下に列記したクローンを、増幅し、かつＤＭＥＭ／３０％ＦＣＳ／１０％ＤＭＳＯ中で−１８０℃で、１０⁷個細胞／ｍｌの密度で凍結した：２９３−Ｔ７−ＮＰ１、２９３−Ｔ７−ＮＰ３、２９３−Ｔ７−ＮＰ５、２９３−Ｔ７−ＮＰ７、２９３−Ｔ７−ＮＰ８、２９３−Ｔ７−ＮＰ１０、２９３−Ｔ７−ＮＰ１３、２９３−Ｔ７−ＮＰ１４、２９３−Ｔ７−ＮＰ２０、２９３−Ｔ７−ＮＰ２８、２９３−Ｔ７−ＮＰ３１、２９３−Ｔ７−ＮＰ３３、２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ１、２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ５、２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ６、２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ１３、２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ１４、２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ１５、２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ３０及び２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ４０。

【0143】

２９３−Ｔ７−ＮＰ及び２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰヘルパー細胞を使用するＳｃｈｗａｒｚＭＶのレスキュー
作出された異なるヘルパー２９３−Ｔ７−ＮＰ及び２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰ細胞クローンのｃＤＮＡ由来のＭＶを効率的にレスキューする能力を評価するために、本発明者らは、プラスミドｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ−ｅＧＦＰ(Combredetら、2003)を使用し、緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現している組換えＳｃｈｗａｒｚＭＶをレスキューした。本発明者らは、先に説明されたものと同様のシステムを使用した(Radeckeら、1995；Parksら、1999；Combredetら、2003)。ヘルパー細胞２９３−Ｔ７−ＮＰ又は２９３−ｎｌｓＴ７−ＮＰは、ｐＴＭ−ＭＶＳｃｈｗ−ｅＧＦＰ（５μｇ）及びＳｃｈｗａｒｚＭＶポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子を発現しているプラスミドｐＥＭＣ−ＬＳｃｈｗ（２０〜１００ｎｇ）による、リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションした。３７℃で一晩インキュベーションした後、トランスフェクション培地を、新鮮な培地と交換し、細胞を４３℃で３時間熱ショック処理し、その後３７℃（２２）に戻した。３７℃で２日間インキュベーションした後、トランスフェクションされた細胞を、単層のベロ、ＣＥＦ又はＭＲＣ５細胞上に移し、ＣＥＦに関して３２℃でインキュベーションした以外は、１０ｃｍの皿において３７℃でインキュベーションした。蛍光細胞が、ベロ、ＣＥＦ又はＭＲＣ５細胞上での２〜３日の共培養後、直ちに出現した。感染した細胞は、増殖巣において(in focuses)迅速に拡大した。本組換えウイルスは、ベロ細胞において高度にシンシチウムであり、かつＣＥＦ及びＭＲＣ５細胞において非シンシチウムであった。単独のシンシチウム又は感染性増殖巣は、ベロ、ＣＥＦ又はＭＲＣ５細胞の３５ｍｍウェルに移し、その後新鮮な細胞を添加することにより、より大きい皿へ拡大した。感染細胞を掻き取り、細胞及び培地を凍結−融解し、遠心分離し、細胞デブリを除去することにより、ウイルスを、感染の５日後にＣＥＦ又はＭＲＣ５細胞から、及びシンシチウムが培養物の８０〜９０％に関与した時（通常２日後）にベロ細胞から収穫した。このようなウイルス作出は、ＴＣＩＤ₅₀力価決定法を用いて、力価決定した。簡単に述べると、ベロ細胞を、９６−ウェルプレート（７５００個細胞／ウェル）に播種し、かつＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ中のウイルス試料の連続１：１０希釈により感染した。３７℃で７日間インキュベーションした後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、かつ試験単位の５０％感染を生じたウイルス希釈物を決定した。組織培養感染量（ＴＣＩＤ₅₀）として説明される５０％エンドポイントは、Ｋａｒｂｅｒ法（３）により計算した。ベロ細胞上でレスキュー及び増殖された組換えウイルスは、力価１０⁷〜ｌ０⁸ ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌを有し、ＣＥＦ又はＭＲＣ５細胞上でレスキュー及び増殖されたウイルスは、より低い力価１０⁴〜１０⁶ ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌを有した。

【0144】

本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ並びに麻疹ＳｃｈｗａｒｚＮ及びＰタンパク質を発現している、組換えベクター、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−ＴＲＩＰレンチウイルスベクターを構築及び作出する技術を提供する。これらのベクターを使用し、ほぼ全ての細胞、特にヒトもしくは哺乳類の細胞で、高レベルでインビトロにおいて効率的に形質導入することができる。このような細胞は、完全長感染性ウイルスアンチゲノムｃＤＮＡによるか又は先に説明された修飾されたｃＤＮＡクローンによるトランスフェクション後に、新規の組換え麻疹ウイルスを作出することができる、ヘルパー細胞／トランスに相補する細胞として使用することができる。

【0145】

本発明は、ワクシニアウイルスなどの他のヘルパーウイルスの夾雑を伴うことなく、任意に修飾されたｃＤＮＡから、麻疹ウイルスなどの任意の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスをレスキューすることを可能にする。レンチウイルスベクターの高い形質導入効率のために、本方法は、ヘルパータンパク質を非常に高いレベルで発現する細胞の作出を可能にする。外来ＤＮＡの染色体ＤＮＡへのレトロウイルス−ベースの組換え、特にレンチウイルス−ベースの組換えは、不正なプラスミド−ベースの組換えと比較して真であるので、この方法により作出されたヘルパー細胞は、非常に安定しており、かつ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスをｃＤＮＡからレスキューするそれらの高い効率は、複数回の連続継代後に維持される。

【0146】

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【受託番号】

【0147】

【表3】