特許 5902617 カチオン性脂質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5902617

(24)【登録日】2016年3月18日

(45)【発行日】2016年4月13日

(54)【発明の名称】カチオン性脂質

(51)【国際特許分類】

   C07C 217/28 20060101AFI20160331BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20160331BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20160331BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20160331BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20160331BHJP

   C07D 207/12 20060101ALI20160331BHJP

   C12N 15/00 20060101ALN20160331BHJP

【ＦＩ】

   C07C217/28CSP

   A61K47/22ZNA

   A61K47/18

   A61K9/127

   A61K48/00

   A61P35/00

   A61P29/00

   C07D207/12

   !C12N15/00

【請求項の数】14

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2012-512924(P2012-512924)

(86)(22)【出願日】2011年4月28日

(86)【国際出願番号】JP2011060459

(87)【国際公開番号】WO2011136369

(87)【国際公開日】20111103

【審査請求日】2014年4月24日

(31)【優先権主張番号】特願2010-209938(P2010-209938)

(32)【優先日】2010年9月17日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2010-132712(P2010-132712)

(32)【優先日】2010年6月10日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2010-104159(P2010-104159)

(32)【優先日】2010年4月28日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000001029

【氏名又は名称】協和発酵キリン株式会社

(72)【発明者】

【氏名】窪山 剛之

(72)【発明者】

【氏名】江良 公宏

(72)【発明者】

【氏名】直井 智幸

【審査官】 前田 憲彦

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０４２８７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１３２１３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０５４４０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０５４４０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０００１０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１３６３６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−２８２６０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２５４８７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５０８６４２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ ２１７／００

Ａ６１Ｋ ９／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ｃ０７Ｄ ２０７／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式(I)

【化1】

(式中、R¹およびR²は(Z)-ヘキサデセニルであり、
点線は、単結合であり、
mは1であり、aおよびbは0であり、X¹およびX²は水素原子であり、X⁴はメチレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは0であり、X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、X¹およびX²は水素原子であり、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、または
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は水素原子であり、L¹およびL²は-O-である)で表されるカチオン性脂質。

【請求項2】

X¹およびX²が、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成する請求項1記載のカチオン性脂質。

【請求項3】

L³が単結合であり、R³が水素原子またはメチルである請求項1または2記載のカチオン性脂質。

【請求項4】

R¹およびR²が(Z)-ヘキサデカ-6-エニルまたは(Z)-ヘキサデカ-9-エニルである請求項1〜3のいずれかに記載のカチオン性脂質。

【請求項5】

aおよびbが、ともに0または1である請求項1〜3のいずれかに記載のカチオン性脂質。

【請求項6】

X⁴がメチレンまたはエチレンである請求項1〜5のいずれかに記載のカチオン性脂質。

【請求項7】

請求項1〜6のいずれかに記載のカチオン性脂質および核酸を含有する医薬組成物。

【請求項8】

請求項1〜6のいずれかに記載のカチオン性脂質と核酸との複合粒子、または該カチオン性脂質に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと核酸との複合粒子を含有する医薬組成物。

【請求項9】

請求項1〜6のいずれかに記載のカチオン性脂質と核酸との複合粒子、または該カチオン性脂質に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと核酸との複合粒子および該複合粒子を封入する脂質二重膜から構成された脂質微粒子を含有する医薬組成物。

【請求項10】

核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である請求項7〜9のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項11】

標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である請求項10記載の医薬組成物。

【請求項12】

組成物が、静脈内投与用である請求項10記載の医薬組成物。

【請求項13】

請求項12に記載の医薬組成物を含む、癌または炎症疾患の治療剤。

【請求項14】

組成物が、静脈内投与用である請求項13記載の癌または炎症疾患の治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸を、例えば、細胞内等に導入することを容易にする新規なカチオン性脂質および該カチオン性脂質を含有する新規な組成物等に関する。

【背景技術】

【0002】

カチオン性脂質とは、一般に一つまたは複数の炭化水素基を含む脂質親和性領域と、少なくとも一つのプラスに帯電した極性ヘッドグループを含む親水性領域を有する両親媒性分子である。カチオン性脂質と核酸等の巨大分子が、総荷電としてプラスに帯電する複合体を形成することにより、核酸等の巨大分子が細胞の原形質膜を通過して細胞質に入りやすくなるため、カチオン性脂質は有用である。インビトロおよびインビボにおいて行うことのできるこのプロセスは、トランスフェクションとして知られている。
典型的には、カチオン性脂質は、単独で用いられるかまたはリン脂質などの中性脂質と組み合わされる。カチオン性脂質と中性脂質とを組み合わせることは、整列した脂質二重層を含む小胞を容易に形成できることから有用であることが知られている。カチオン性脂質が単独でまたは中性脂質と組み合わされて形成する小胞、またはリポソームは、表面に多数のプラス荷電を有し、この荷電により、ポリヌクレオチドまたはマイナスに帯電したたんぱく質などの他のアニオン分子と複合体を形成できる。ポリヌクレオチド／カチオン性脂質／中性脂質複合体の表面上の残りの総カチオン荷電により、細胞膜表面の主にマイナスの電荷と強い相互反応を起こすことが可能である。
多くの異なる種類のカチオン性脂質が、トランスフェクションに使用するために合成されており、現在市販されている。このようなカチオン性脂質には、例えば、Lipofectin、Lipofectin ACE、Lipofect AMINE、Transfeactam、DOTAP等がある。
特許文献1中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)等は、当初に開発されたカチオン性脂質のひとつである。DOTMA等は、分子にカチオン部位を与える、第四級窒素を有するプロパナミニウム基、および分子のプロピルバックボーンにエーテル結合する一対の高級炭化水素により特徴付けられる。第四級窒素は、メチル基などの比較的短鎖のアルキル鎖で三置換されている。構造上類似のカチオン性脂質、N-(2,3-ジ-(9-(Z)-オクタデセノイルオキシ))-プロパ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)は、エーテル結合したアルキル基ではなく、アシル基を含む。
特許文献2および3中で開示される、例えば、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)等は、分子にカチオン部位を与える、第四級窒素を有するプロパナミニウム基、および分子のプロピルバックボーンにエーテル結合する一対の高級炭化水素により特徴付けられ、さらに第四級窒素は、メチル基などの比較的短鎖のアルキル鎖とヒドロキシアルキルで三置換されていることにより特徴付けられる。
また、特許文献4中には、例えば、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)等が開示されている。DLinDMA等は、より柔軟なカチオン性脂質を開発すること、それによりリポソーム等の膜流動性を高めることを目的に、構造上類似のカチオン性脂質であるDOTAPおよびDOTMAの高級アルキル基を、不飽和部位を少なくとも2ヵ所含む高級アルキル基としたことにより特徴付けられる。また、特許文献5中には、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)等が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開昭61-161246号公報(米国特許5049386号明細書)

【特許文献2】国際公開第91/16024号パンフレット

【特許文献3】国際公開第97/019675号パンフレット

【特許文献4】国際公開第2005/121348号パンフレット

【特許文献5】国際公開第2009/086558号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、核酸を、例えば、細胞内等に導入することを容易にする新規なカチオン性脂質および該カチオン性脂質を含有する新規な組成物等を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は以下の(1)〜(25)に関する。
(1) 式(I)

【0006】

【化1】

(式中、R¹およびR²は同一もしくは異なって(Z)-ペンタデケニル、(Z)-ヘキサデケニルもしくは(Z)-ヘプタデケニルであるか、またはR¹およびR²が一緒になってジ((Z)-テトラデケニル)メチレン、ジ((Z)-ペンタデケニル)メチレンもしくはジ((Z)-ヘキサデケニル)メチレンを形成し、
点線は、単結合であるか、または存在せず、
点線が単結合である場合には、
mは1であり、aおよびbは0であり、X¹およびX²は水素原子であり、X⁴はメチレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは0であり、X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、X¹およびX²は水素原子であり、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は水素原子であり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が-CO-または-CO-O-であり、R³はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、または
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、Yは製薬上許容し得る陰イオンであり、L³は単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
点線が存在しない場合には、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は水素原子であり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、X³およびYは存在せず、L³が-CO-または-CO-O-であり、R³はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、または
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は隣接する窒素原子、L³およびR³と一緒になってピロリジン、ピペリジンを形成し、X³およびYは存在せず、L¹およびL²は-O-である)で表されるカチオン性脂質。
(2) X¹およびX²が、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成する前記(1)記載のカチオン性脂質。
(3) L³が単結合であり、R³が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²が-O-である前記または(2)記載のカチオン性脂質。
(4) L³が-CO-または-CO-O-であり、R³がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルであり、L¹およびL²が同一の-CO-O-または-O-CO-である前記(1)または(2)記載のカチオン性脂質。
(5) X³が存在しないか、メチルである前記(1)〜(4)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(6) L¹およびL²が-O-または-O-CO-であり、R¹およびR²が(Z)-ヘキサデカ-6-エニルまたは(Z)-ヘキサデカ-9-エニルである前記(1)〜(5)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(7) L¹およびL²が-CO-O-であり、R¹およびR²が(Z)-ペンタデカ-5-エニルまたは(Z)-ペンタデカ-8-エニルである前記前記(1)〜(5)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(8) 式(IA)

【0007】

【化2】

(式中、R¹およびR²は同一もしくは異なってテトラデシル、(Z)-テトラデケニル、ペンタデシル、ヘキサデシルもしくはヘプタデシルであるか、またはR¹およびR²が一緒になってジ(トリデシル)メチレン、ジ((Z)-トリデケニル)メチレン、ジ(テトラデシル)メチレン、ジ(ペンタデシル)メチレンもしくはジ(ヘキサデシル)メチレンを形成し、
mは、1または2であり、
点線は、単結合であり、
X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X⁴はアルキレンであり、
X³およびYは存在せず、
L³が単結合であり、
R³は水素原子、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、
R³が水素原子の場合には、
aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
R³がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
aおよびbは0であり、L¹およびL²は-O-であるか、または
aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表されるカチオン性脂質。
(9) aおよびbが、ともに0または1である前記(1)〜(8)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(10) X⁴がメチレンまたはエチレンである前記(1)〜(9)のいずれかに記載のカチオン性脂質。
(11) 前記(1)〜(10)のいずれかに記載のカチオン性脂質および核酸を含有する組成物。
(12) 前記(1)〜(10)のいずれかに記載のカチオン性脂質と核酸との複合粒子、または該カチオン性脂質に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと核酸との複合粒子を含有する組成物。
(13) 前記(1)〜(10)のいずれかに記載のカチオン性脂質と核酸との複合粒子、または該カチオン性脂質に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと核酸との複合粒子および該複合粒子を封入する脂質二重膜から構成されたリポソームを含有する組成物。
(14) 核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である前記(11)〜(13)のいずれかに記載の組成物。
(15) 標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である前記(14)記載の組成物。
(16) 前記(11)〜(15)のいずれかに記載の組成物を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
(17) 細胞が、ほ乳類の腫瘍または炎症部位にある細胞である前記(16)記載の方法。
(18) 細胞が、ほ乳類の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である前記(16)または(17)記載の方法。
(19) 細胞内に導入する方法が、静脈内投与する方法である前記(17)または(18)記載の方法。
(20) 前記(15)に記載の組成物を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法。
(21) 投与する方法が、静脈内投与である前記(20)記載の方法。
(22) 前記(14)に記載の組成物を含む、該組成物を哺乳動物に投与して、疾患の治療に用いるための医薬。
(23) 投与する方法が、静脈内投与である前記(22)記載の医薬。
(24) 前記(15)に記載の組成物を含む、該組成物を哺乳動物に投与して、癌または炎症疾患の治療に用いるための癌または炎症疾患の治療剤。
(25) 投与する方法が、静脈内投与である前記(24)記載の癌または炎症疾患の治療剤。

【発明の効果】

【0008】

本発明の新規なカチオン性脂質および核酸を含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、該核酸を例えば、細胞内等に容易に導入することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実施例13〜18で得られた製剤をヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞内に導入後の、標的遺伝子のmRNAの発現率を示す。縦軸は陰性対照を1とした場合の標的遺伝子のmRNAの発現率を表し、横軸は核酸濃度(nM)、使用したカチオン性脂質の化合物番号および実施例番号を示す。

【図2】図1と同様に実施例19〜24で得られた製剤を細胞内に導入後の、標的遺伝子のmRNAの発現率を示す。

【図3】図1と同様に比較例1〜6で得られた製剤を細胞内に導入後の、標的遺伝子のmRNAの発現率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明のカチオン性脂質は、式(I)

【0011】

【化3】

(式中、R¹およびR²は同一もしくは異なって(Z)-ペンタデケニル、(Z)-ヘキサデケニルもしくは(Z)-ヘプタデケニルであるか、またはR¹およびR²が一緒になってジ((Z)-テトラデケニル)メチレン、ジ((Z)-ペンタデケニル)メチレンもしくはジ((Z)-ヘキサデケニル)メチレンを形成し、
点線は、単結合であるか、または存在せず、
点線が単結合である場合には、
mは1であり、aおよびbは0であり、X¹およびX²は水素原子であり、X⁴はメチレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは0であり、X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、X¹およびX²は水素原子であり、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は水素原子であり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴アルキレンであり、X³およびYは存在せず、L³が-CO-または-CO-O-であり、R³はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、または
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴はアルキレンであり、X³が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、Yは製薬上許容し得る陰イオンであり、L³は単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
点線が存在しない場合には、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L¹およびL²は-O-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、X³およびYは存在せず、L³が単結合であり、R³は水素原子であり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、X³およびYは存在せず、L³が-CO-または-CO-O-であり、R³はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、または
mは1または2であり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、X⁴は隣接する窒素原子、L³およびR³と一緒になってピロリジン、ピペリジンを形成し、X³およびYは存在せず、L¹およびL²は-O-である)、または
式(IA)

【0012】

【化4】

(式中、R¹およびR²は同一もしくは異なってテトラデシル、(Z)-テトラデケニル、ペンタデシル、ヘキサデシルもしくはヘプタデシルであるか、またはR¹およびR²が一緒になってジ(トリデシル)メチレン、ジ((Z)-トリデケニル)メチレン、ジ(テトラデシル)メチレン、ジ(ペンタデシル)メチレンもしくはジ(ヘキサデシル)メチレンを形成し、
mは、1または2であり、
点線は、単結合であり、
X¹およびX²は一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X⁴はアルキレンであり、
X³およびYは存在せず、
L³が単結合であり、
R³は水素原子、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、
R³が水素原子の場合には、
aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
R³がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
aおよびbは0であり、L¹およびL²は-O-であるか、または
aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、L¹およびL²は同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表される。

以下、式(I)および式(IA)で表される化合物をそれぞれ化合物(I)および化合物(IA)ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。

【0013】

(Z)-テトラデケニル、(Z)-ペンタデケニル、(Z)-ヘキサデケニルおよび(Z)-ヘプタデケニル、ならびにジ((Z)-トリデケニル)メチレン、ジ((Z)-テトラデケニル)メチレン、ジ((Z)-ペンタデケニル)メチレンおよびジ((Z)-ヘキサデケニル)メチレンの(Z)-トリデケニル、(Z)-テトラデケニル、(Z)-ペンタデケニルおよび(Z)-ヘキサデケニルは、2重結合の位置がどこにあるものでもよいが、好ましくは(Z)-トリデカ-5-エニル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-テトラデカ-6-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-5-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-11-エニルおよび(Z)-ヘプタデカ-8-エニルがあげられる。

【0014】

アルキレンとしては、例えばメチレン、エチレン、プロピレン等があげられる。

【0015】

炭素数1〜6のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロブチル、シクロプロピルメチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル等があげられ、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、tert-ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等があげられ、さらに好ましくはメチル、エチル、プロピル等があげられる。

【0016】

炭素数3〜6のアルケニルとしては、例えばアリル、1-プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等があげられ、好ましくはアリル等があげられる。

【0017】

置換された炭素数1〜6のアルキルにおけるアルキル部分および置換された炭素数3〜6のアルケニルにおけるアルケニル部分としては、それぞれ前記炭素数1〜6のアルキルおよび炭素数3〜6のアルケニルから置換位置の水素原子を除いたものと同義である。

【0018】

製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオンなどの無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオンなどの有機酸イオン等があげられる。

【0019】

本発明において、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルおよびモルホリン-3-イルは、それぞれ、環中の窒素原子上の水素原子が、メチルまたはエチルに変換されたものを包含する。

【0020】

モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノとしては、それぞれ1および同一もしくは異なって2つの、炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)で置換されたアミノであればよく、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、ペンチルアミノ、ヘキシルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、メチルプロピルアミノ、ブチルメチルアミノ、メチルペンチルアミノ、ヘキシルメチルアミノ、アミノエチルアミノ、アミノプロピルアミノ、(アミノエチル)メチルアミノ、ビス(アミノエチル)アミノ等があげられ、好ましくはメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、アミノプロピルアミノ、ビス(アミノエチル)アミノ等があげられる。
本発明において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれ、窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位して、アンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを形成していてもよく、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを包含する。

【0021】

トリアルキルアンモニオとしては、同一または異なって3つの、炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)で置換されたアンモニオであればよく、例えばトリメチルアンモニオ、エチルジメチルアンモニオ、ジエチルメチルアンモニオ、トリエチルアンモニオ、トリプロピルアンモニオ、トリブチルアンモニオ、トリペンチルアンモニオ、トリヘキシルアンモニオ、トリス(アミノエチル)アンモニオ、(アミノエチル)ジメチルアンモニオ、ビス(アミノエチル)メチルアンモニオ等があげられ、好ましくはトリメチルアンモニオ、トリエチルアンモニオ、トリス(アミノエチル)アンモニオ、(アミノエチル)ジメチルアンモニオ、ビス(アミノエチル)メチルアンモニオ等があげられる。
本発明において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位したアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオ、ならびにトリアルキルアンモニオは、製薬上許容し得る陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよい。

【0022】

アルコキシとしては、炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)で置換されたヒドロキシであればよく、例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、アミノエトキシ、メチルアミノエトキシ等があげられ、好ましくはメトキシ、エトキシ、アミノエトキシ、メチルアミノエトキシ等があげられる。

【0023】

モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルとしては、それぞれ1つおよび同一もしくは異なって2つの、炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキル(前記と同義)で置換されたカルバモイルであればよく、例えばメチルカルバモイル、エチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、ブチルカルバモイル、ペンチルカルバモイル、ヘキシルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル、メチルプロピルカルバモイル、ブチルメチルカルバモイル、メチルペンチルカルバモイル、ヘキシルメチルカルバモイル、アミノエチルカルバモイル、アミノプロピルカルバモイル、(アミノエチル)メチルカルバモイル、ビス(アミノエチル)カルバモイル等があげられ、好ましくはメチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル等があげられる。

【0024】

また、L¹およびL²は、同一の-O-、-CO-O-または-O-CO-であることがより好ましい。
また、L¹およびL²の少なくとも1つが-O-または-O-CO-である場合には、-O-または-O-CO-に結合するR¹およびR²は同一もしくは異なって、(Z)-ヘキサデカ-6-エニルまたは(Z)-ヘキサデカ-9-エニルであることがより好ましい。

【0025】

また、L¹およびL²の少なくとも1つが-CO-O-である場合には、-CO-O-に結合するR¹およびR²は同一もしくは異なって(Z)-ペンタデカ-5-エニルまたは(Z)-ペンタデカ-8-エニルであることがより好ましい。
なお、いずれの場合も、R¹およびR²は、同一であるか、またはR¹およびR²が一緒になって、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル部分が同一であるジアルキルメチレン、ジアルケニルメチレンもしくはジアルキニルメチレンを形成することがさらに好ましい。

【0026】

また、aおよびbは、同時に0または1であることがより好ましい。
なお、aおよびbが、同時に1である場合には、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成することがより好ましい。

【0027】

また、X¹およびX²は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成することがより好ましい。なお、X¹およびX²が、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成する場合には、R³が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがより好ましく、水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがさらに好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、アミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-カルバモイルエチル等が最も好ましい。
また、X¹およびX²が、一緒になって単結合を形成する場合に、L³が-CO-または-CO-O-、好ましくは-CO-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R³がアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル等がさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチルであることが最も好ましい。
また、X¹およびX²が、一緒になって単結合を形成する場合に、aおよびbは、同一または異なって1〜3、好ましくは1であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合に、L¹およびL²が同一の-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であり、R³がメチルであることも、本発明のさらに好ましい形態の1つである。
また、X¹およびX²が、一緒になって単結合を形成する場合に、X³が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニル、好ましくはメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである、この場合、L¹およびL²は同一の-CO-O-または-O-CO-であることがさらに好ましく、-CO-O-であることが最も好ましい。

【0028】

なお、X¹およびX²が、水素原子である場合には、R³が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがより好ましく、水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがさらに好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、アミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1-アミノ-2-ヒドロキシエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-カルバモイルエチル等が最も好ましい。
また、X¹およびX²が、水素原子である場合には、aおよびbは、同時に0であることがより好ましい。

【0029】

また、L³は単結合であることがより好ましい。なお、L³が単結合の場合には、L¹およびL²は-O-であることがより好ましい。
また、L³が単結合の場合には、R³は水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル、アミノメチル、2-アミノエチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、2-カルバモイルエチル、2-ジメチルカルバモイルエチル、1-メチルピペリジン-4-イル等がさらに好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-アミノエチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-カルバモイルエチル等がさらに好ましく、いずれの場合も、L¹およびL²は-O-であることが最も好ましい。
なお、X³が存在せず、Yも存在せず、L³が単結合で、R³が水素原子の場合には、L¹およびL²が同一の-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。

【0030】

なお、L³が-CO-または-CO-O-の場合には、L¹およびL²は同一の-CO-O-または-O-CO-であることがより好ましい。
また、L³が-CO-または-CO-O-の場合には、R³はピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルであることがより好ましく、R³はアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル、(N,N-ジメチルアミノ)メチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、1-アミノ-2-ヒドロキシエチル等がさらに好ましく、R³はアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル等がさらに好ましい。
L³が-CO-または-CO-O-の場合に、R³がアミノメチル、1-ヒドロキシ-2-アミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチルであり、L¹およびL²は同一の-O-であることも、本発明のさらに好ましい形態の1つである。

【0031】

また、X³は存在しないか、メチルであることがより好ましい。
また、bが0の場合には、X⁴はアルキレンを形成することが好ましい。

【0032】

次に化合物(I)の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis,third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)などに記載の方法]などを用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入などの反応工程の順序を変えることもできる。

【0033】

製造法1
化合物(I)のうち、L¹およびL²が-O-であり、L³は単結合であり、X³およびYは存在しない、化合物(Ia)は以下の方法によって製造することができる。

【0034】

【化5】

(式中、R¹、R²、R³、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義であり、Zは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシ等の脱離基を表す)

【0035】

工程1および2
化合物(IIb)は、化合物(IIa)と化合物(IIIa)を溶媒中、室温と150℃の間の温度で、1〜30当量の塩基存在下、5分間から100時間処理し、単離することにより製造することができる。さらに、化合物(Ia)は、化合物(IIb)と化合物(IIIb)を溶媒中、室温と150℃の間の温度で、1〜30当量の塩基存在下、5分間から100時間処理し、単離することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばトルエン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独または混合して用いることができる。
塩基としては、例えば水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウム tert-ブトキシド、カリウム tert-ブトキシド等があげられる。

【0036】

化合物(IIa)は、市販品または公知の方法(例えば、“ケミカル＆ファーマシューティカル・ブレチン(Chem. Pharm. Bull)”, 1991年, 第39巻, p.2219)、国際公開第2006/10036号パンフレット)もしくはそれに準じた方法または参考例に記載の方法で得ることができる。
化合物(IIIa)および化合物(IIIb)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R¹とR²が同一の場合の化合物(Ia)は、工程1において、2当量以上の化合物(IIIa)を用いることで得ることができる。

【0037】

製造法2
化合物(I)のうち、L¹およびL²が-CO-O-であり、L³は単結合であり、X³およびYは存在しない、化合物(Ib)は以下の方法によって製造することができる。

【0038】

【化6】

(式中、R¹、R²、R³、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義である)

【0039】

工程3および4
化合物(IIc)は、化合物(IIa)と化合物(IVa)を溶媒中、-20℃と150℃の間の温度で、1〜30当量の縮合剤の存在下、5分間から100時間処理し、単離することにより製造することができる。さらに、化合物(Ib)は、化合物(IIc)と化合物(IVb)を溶媒中、-20℃と150℃の間の温度で、1〜30当量の縮合剤の存在下、5分間から100時間処理し、単離することにより製造することができる。工程3および4において、0.01〜30当量の添加剤および／または1当量〜大過剰量の塩基を加え、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独または混合して用いることができる。
縮合剤としては、例えば1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスファート、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート、ヨウ化 2-クロロ-1-メチルピリジニウム等があげられる。
添加剤としては、例えば1-ヒドロキシベンズトリアゾール、4-ジメチルアミノピリジン等があげられる。
塩基としては、例えば酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等があげられる。

【0040】

化合物(IVa)および化合物(IVb)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座16 有機化合物の合成IV」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R¹とR²が同一の場合の化合物(Ib)は、工程3において、2当量以上の化合物(IVa)を用いることで得ることができる。

【0041】

製造法3
化合物(I)のうち、L¹およびL²が-O-CO-であり、L³は単結合であり、X³およびYは存在しない、化合物(Ic)は以下の方法によって製造することができる。

【0042】

【化7】

(式中、R¹、R²、R³、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義である)

【0043】

工程5および6
化合物(IIe)は、化合物(IId)と化合物(Va)を溶媒中、-20℃と150℃の間の温度で、1〜30当量の縮合剤の存在下、5分間から100時間処理し、単離することにより製造することができる。さらに、化合物(Ic)は、化合物(IIe)と化合物(Vb)を溶媒中、-20℃と150℃の間の温度で、1〜30当量の縮合剤の存在下、5分間から100時間処理し、単離することにより製造することができる。工程5および6において、0.01〜30当量の添加剤および／または1当量〜大過剰量の塩基を加え、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独または混合して用いることができる。
縮合剤としては、製造法2と同じものがあげられる。
添加剤としては、例えば1-ヒドロキシベンズトリアゾール、4-ジメチルアミノピリジン等があげられる。
塩基としては、例えば酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等があげられる。

【0044】

化合物(IId)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座16 有機化合物の合成IV」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(Va)および化合物(Vb)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R¹とR²が同一の場合の化合物(Ic)は、工程5において、2当量以上の化合物(Va)を用いることで得ることができる。

【0045】

製造法4
化合物(I)のうち、L³は単結合であり、R³は水素原子であり、X³およびYが存在しない、化合物(Id)は以下の方法によって製造することができる。

【0046】

【化8】

(式中、R¹、R²、L¹、L²、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義である)

【0047】

工程7
化合物(Id)は、化合物(VI)とクロロぎ酸1-クロロエチルを不活性溶媒中で、-20℃と230 ℃の間の温度で、5分間から100時間処理し、続いて1〜大過剰量のアルコールを加えて-20℃と230 ℃の間の温度で、5分間から100時間処理することにより製造することができる。
不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
アルコールとしては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。

【0048】

化合物(VI)は、製造法1、製造法2または製造法3の方法に準じた方法で得ることができる。

【0049】

製造法5
化合物(I)のうち、L³は単結合であり、R³は-CHR^AR^B(R^AおよびR^Bは同一または異なって水素原子、炭素数1〜5のアルキル、炭素数3〜5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜5のアルキルもしくは炭素数3〜5のアルケニルであるか、または隣接する炭素原子と一緒になってピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イルもしくはピペリジン-4-イルを形成し、R^AおよびR^Bがともに水素原子である場合を除き、R^AおよびR^Bのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1〜5であり、R^AおよびR^Bのいずれかがピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該R^AおよびR^Bのもう一方は水素原子、炭素数1〜5のアルキル、炭素数3〜5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜5のアルキルもしくは炭素数3〜5のアルケニルであり、R^AおよびR^Bが置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2または3である)であり、X³およびYが存在しない、化合物(Ie)は以下の方法によって製造することができる。

【0050】

【化9】

(式中、R¹、R²、R^A、R^B、L¹、L²、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義である)

【0051】

工程8
化合物(Ie)は、化合物(Id)を好ましくは1〜10当量の化合物(VII)と、溶媒中、好ましくは1〜大過剰量の還元剤および必要により好ましくは1〜10当量の酸の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
還元剤としては、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
酸としては、例えば塩酸、酢酸等があげられる。

【0052】

化合物(VII)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座15 有機化合物の合成III」、第5版、p.1、丸善(2005年)、第5版実験化学講座15 有機化合物の合成III」、第5版、p.153、丸善(2005年))もしくはそれに準じて得ることができる。

【0053】

製造法6
化合物(I)のうち、L³が単結合で、X³およびYが存在しない、化合物(If)は以下の方法によって製造することができる。

【0054】

【化10】

(式中、R¹、R²、R³、L¹、L²、X¹、X²、X⁴、a、b、m、点線およびZはそれぞれ前記と同義である)

【0055】

工程9
化合物(If)は、化合物(Id)を、化合物(VIII)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および／または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等があげられる。
添加剤としては、例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化テトラn-ブチルアンモニウム等があげられる。

【0056】

化合物(VIII)は、市販品として得られるか、または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じて得ることができる。

【0057】

製造法7
化合物(I)のうち、L³が-CO-で、X³およびYが存在しない、化合物(Ig)は以下の方法によって製造することができる。

【0058】

【化11】

(式中、R¹、R²、R³、L¹、L²、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義である)

【0059】

工程10
化合物(Ig)は、化合物(Id)と化合物(IX)とを溶媒中で、-20℃と150℃の間の温度で、1当量〜大過剰量の縮合剤で5分間から100時間処理することにより製造することができる。このとき、必要により好ましくは0.01〜10当量の添加剤の存在下、および／または必要により好ましくは1〜大過剰量の塩基を加え、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
縮合剤、添加剤および塩基としては、それぞれ製造法2と同じものがあげられる。

【0060】

化合物(IX)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座16 有機化合物の合成IV」、第5版、p.1、丸善(2005年))もしくはそれに準じて得ることができる。

【0061】

製造法8
化合物(I)のうち、L³が-CO-O-で、X³およびYが存在しない、化合物(Ih)は以下の方法によって製造することができる。

【0062】

【化12】

(式中、R¹、R²、R³、L¹、L²、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義である)

【0063】

工程11
化合物(Ih)は、化合物(Id)を、化合物(X)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および／または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および添加剤としては、製造法2と同じものがあげられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等があげられる。

【0064】

化合物(X)は、市販品または公知の方法(例えば、“ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(J.Am.Chem.Soc.)”,1981年,第103巻,p.4194-4199)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。

【0065】

製造法9
化合物(I)のうち、L³は単結合であり、R³は-CH₂-C(OH)R^CR^D(R^CおよびR^Dは同一または異なって水素原子、炭素数1〜4のアルキル、炭素数3〜4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜4のアルキルもしくは炭素数3〜4のアルケニルであり、R^CおよびR^Dがともに水素原子である場合を除き、R^CおよびR^Dのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1〜4であり、R^CおよびR^Dのいずれかがピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該R^CおよびR^Dのもう一方は水素原子、炭素数1〜4のアルキル、炭素数3〜4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは1つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜4のアルキルもしくは炭素数3〜4のアルケニルであり、R^CおよびR^Dが置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2である)であり、X³およびYが存在しない、化合物(Ii)は以下の方法によって製造することができる。

【0066】

【化13】

(式中、R¹、R²、R^C、R^D、L¹、L²、X¹、X²、X⁴、a、b、mおよび点線はそれぞれ前記と同義である)

【0067】

工程12
化合物(Ii)は、化合物(Id)と化合物(XI)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230 ℃の間の温度で、5分間から100時間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。

【0068】

化合物(XI)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座17 有機化合物の合成V」、第5版、p.186、丸善(2005年))もしくはそれに準じて得ることができる。

【0069】

製造法10
化合物(I)のうち、L³が単結合であり、X³が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、Yが製薬上許容し得る陰イオンである化合物(Ij)は以下の方法によって製造することができる。

【0070】

【化14】

(式中、R¹、R²、R³、L¹、L²、X¹、X²、X³、X⁴、Y、a、b、m、点線およびZはそれぞれ前記と同義である)

【0071】

工程13および14
化合物(Ij-A)は、化合物(If)と化合物(XII)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230 ℃の間の温度で、5分間から100時間処理することにより製造することができる。化合物(Ij)は、化合物(Ij-A)をY型の陰イオン交換樹脂で処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。

【0072】

化合物(XII)は、市販品または公知の方法(例えば、第5版実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じて得ることができる。
また、ZとYが同一の場合には、工程14を省略することにより(Ij)を製造することができる。

【0073】

化合物(I)におけるR¹、R²またはR³に含まれる官能基の変換は、公知の方法[例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ 第2版(Comprehensive Organic Transformations 2nd edition)、R.C.ラロック(Larock)著、Vch Verlagsgesellschaft Mbh(1999年)等に記載の方法]でまたはそれらに準じて行うこともできる。
上記各製造法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
化合物(IA)は、上記化合物(I)の製造法と同様に製造することにより得ることができる。

【0074】

化合物(I)において、構造中の窒素原子上の孤立電子対に水素イオンが配位してもよく、該窒素原子は、製薬上許容し得る陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよく、化合物(I)には、該窒素原子上に孤立電子対に水素イオンが配位した化合物も包含する。なお、本発明において、X³が存在しない場合とは、水素イオンが配位している場合も包含する。 化合物(I)および(IA)の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、化合物(I)および(IA)は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
化合物(I)および(IA)中の各原子の一部またはすべては、それぞれ対応する同位体原子で置き換わっていてもよく、化合物(I)および(IA)には、これら同位体原子で置き換わった化合物も包含する。例えば、化合物(I)および(IA)中の水素原子の一部またはすべては、原子量2の水素原子(重水素原子)であってもよい。
化合物(I)および(IA)中の各原子の一部またはすべてが、それぞれ対応する同位体原子で置き換わった化合物は、市販のビルディングブロックを用いて、上記各製造法と同様な方法で製造することができる。また、化合物(I)および(IA)中の水素原子の一部またはすべてが重水素原子で置き換わった化合物は、例えば、1)過酸化重水素を用い、塩基性条件下にカルボン酸などを重水素化する方法(米国特許第3849458号明細書参照)、2)イリジウム錯体を触媒として用い、重水を重水素源として用いてアルコール、カルボン酸などを重水素化する方法[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J.Am.Chem.Soc.), Vol.124,No.10,2092(2002)参照]、3)パラジウムカーボンを触媒として用い、重水素源として重水素ガスのみを用いて脂肪酸を重水素化する方法[リピッズ(LIPIDS),Vol.9,No.11, 913(1974)参照]、4)白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウムなどの金属を触媒として用い、重水または重水および重水素ガスを重水素源として用いてアクリル酸、アクリル酸メチル、メタクリル酸、メタクリル酸メチルなどを重水素化する方法(特公平5-19536号公報、特開昭61-277648号公報および特開昭61-275241号公報参照)、5)パラジウム、ニッケル、銅または亜クロム酸銅などの触媒を用い、重水を重水素源として用いて、アクリル酸、メタクリル酸メチルなどを重水素化する方法(特開昭63-198638号公報参照)などを用いて合成することもできる。

【0075】

本発明によって得られる化合物(I)および(IA)の具体例を表1〜3に示す。ただし、本発明の化合物はこれらに限定されるものではない。

【0076】

【表1】

【0077】

【表2】

【0078】

【表3】

【0079】

また、本発明で用いられる核酸としては、ヌクレオチドおよび/または該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であれば、いかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体があげられる。また、ヌクレオチドおよび/または該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明の核酸に含まれる。なお、本発明において、RNA中のウリジンUと、DNAにおいてはチミンTとは、それぞれ読み替えることができる。

【0080】

ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。

【0081】

糖部修飾ヌクレオチドの修飾基としては、例えば、2’-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-アルケニル、2’-置換アルケニル、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-S-アルキル、2’-S-置換アルキル、2’-S-アルケニル、2’-S-置換アルケニル、2’-アミノ、2’-NH-アルキル、2’-NH-置換アルキル、2’-NH-アルケニル、2’-NH-置換アルケニル、2’-SO-アルキル、2’-SO-置換アルキル、2’-カルボキシ、2’-CO-アルキル、2’-CO-置換アルキル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル、2’-SiH₂-アルキル、2’-SiH₂-置換アルキル、2’-ONO₂、2’-NO₂、2’-N₃、2’-アミノ酸残基(アミノ酸のカルボン酸から水酸基が除去されたもの)、2’-O-アミノ酸残基(前記アミノ酸残基と同義)があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)]等もあげられる。また、2’位の修飾基が4’位の炭素原子に架橋した構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、およびエチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]等も本発明における2’位において修飾基で置換されたリボースに含まれる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキルが好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチルがもっとも好ましい。
また、糖部修飾ヌクレオチドの修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当する大きさのものがより好ましい。

【0082】

糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるアルキルは、本発明のカチオン性脂質における炭素数1〜6のアルキルと同義である。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるアルケニルは、本発明のカチオン性脂質における炭素数3〜6のアルケニルと同義である。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、例えば脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)、イミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルの置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキレンオキシ(該ジアルキルアミノアルキレンオキシの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義であり、アルキレン部分は前記アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等があげられ、置換数は好ましくは1〜3である。

【0083】

リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくは炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基等の保護基で保護されたものがあげられる。
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を付加したものもあげられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
また、ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。

【0084】

本発明で用いられる核酸としては、好ましくは標的遺伝子の発現を抑制する核酸があげられ、より好ましくはRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸があげられる。

【0085】

本発明で用いられる標的遺伝子としては、mRNAを産生して発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、腫瘍または炎症に関連する遺伝子が好ましく、例えば血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、以下VEGFと略す)、血管内皮増殖因子受容体(vascular endothelial growth factor receptor、以下VEGFRと略す)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子(Kruppel-like factor、以下KLFと略す)、Ets転写因子、核因子、低酸素誘導因子等のタンパク質をコードする遺伝子等があげられ、具体的にはVEGF遺伝子、VEGFR遺伝子、線維芽細胞増殖因子遺伝子、線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子、血小板由来増殖因子遺伝子、血小板由来増殖因子受容体遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子、KLF遺伝子、Ets転写因子遺伝子、核因子遺伝子、低酸素誘導因子遺伝子等が挙げられる。

【0086】

また、本発明で用いられる標的遺伝子としては、例えば、肝臓、肺、腎臓または脾臓において発現する遺伝子が好ましく、例えば前記の腫瘍または炎症に関連する遺伝子、B型肝炎ウイルスゲノム、C型肝炎ウイルスゲノム、アポリポタンパク質(APO)、ヒドロキシメチルグルタリル(HMG)CoA還元酵素、ケキシン 9 型セリンプロテアーゼ(PCSK9)、第12因子、グルカゴン受容体、グルココルチコイド受容体、ロイコトリエン受容体、トロンボキサンA2受容体、ヒスタミンH1受容体、炭酸脱水酵素、アンギオテンシン変換酵素、レニン、p53、チロシンホスファターゼ(PTP)、ナトリウム依存性グルコース輸送担体、腫瘍壊死因子、インターロイキン等のタンパク質をコードする遺伝子等があげられる。

【0087】

標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えば蛋白質等をコードする遺伝子(標的遺伝子)のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含み、かつ標的遺伝子の発現を抑制する核酸であれば、例えばsiRNA(short interference RNA)、miRNA(micro RNA)等の二本鎖核酸、shRNA(short hairpin RNA)等の、アンチセンス核酸、リボザイム一本鎖核酸等、いずれの核酸を用いてもよいが、二本鎖核酸が好適に用いられる。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸といい、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸ともいう。センス鎖核酸は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのもの等、アンチセンス鎖核酸と対合して二重鎖形成部ができる核酸をいう。
二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部を構成する塩基対は、通常15〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、15〜21塩基対がさらに好ましく、15〜19塩基対が特に好ましい。

【0088】

二重鎖形成部のアンチセンス鎖核酸としては、標的遺伝子のmRNAの一部配列からなる核酸、または該核酸において1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸が好適に用いられる。二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸長は、通常15〜30塩基からなるが、15〜29塩基が好ましく、15〜27塩基がより好ましく、15〜25塩基がさらに好ましく、17〜23塩基が特に好ましく、19〜21塩基が最も好ましい。
二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方の核酸は、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加の核酸を有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜4塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAと一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一致する配列を用いてもよい。さらに、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により前記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号パンフレット)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない二本鎖核酸などを用いることもできる。

【0089】

また、前記の二本鎖核酸がsiRNAである場合、アンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って少なくとも1〜17番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する17塩基の配列と相補的な塩基の配列であり、好ましくは、該アンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って1〜19番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する19塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、1〜21番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する21塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、1〜25番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する25塩基の配列と相補的な塩基の配列である。

【0090】

さらに、本発明で用いられる核酸がsiRNAである場合、好ましくは該核酸中の糖の10〜70%、より好ましくは15〜60%、さらに好ましくは20〜50%が、2’位において修飾基で置換されたリボースである。本発明におけるリボースの2’位において修飾基で置換されたとは、2’位の水酸基が修飾基に置換されているものを意味し、リボースの2’位の水酸基と立体配置が同じであっても異なっていてもよいが、好ましくはリボースの2’位の水酸基と立体配置が同じである。2’位において修飾基で置換されたリボースは、糖部修飾ヌクレオチドにおける2’-修飾ヌクレオチドに包含され、2’位において修飾基で置換されたリボースの修飾基は、2’-修飾ヌクレオチドの修飾基と同義である。

【0091】

本発明で用いられる核酸には、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。

【0092】

また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の5’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ5’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。

【0093】

一本鎖の核酸としては、標的遺伝子の連続する15〜27塩基、好ましくは15〜25塩基、より好ましくは15〜23塩基、さらに好ましくは15〜21塩基、特に好ましくは15〜19塩基からなる配列の相補配列からなる核酸、または該核酸において1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつ標的蛋白質の発現抑制活性を有する核酸であればいずれでもよいが、15〜30塩基以下、好ましくは15〜29塩基、より好ましくは15〜27塩基、さらに好ましくは15〜25塩基、特に好ましくは15〜23塩基の一本鎖核酸が好適に用いられる。
一本鎖核酸として、上記の二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を、スペーサー配列を介して連結してしたものを用いてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドとしては6〜12塩基の一本鎖核酸分子が好ましく、その5’末端側の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの配列からなる核酸があげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれるアンチセンス鎖およびセンス鎖の順番はどちらが5’側になってもよい。該一本鎖核酸としては、ステムループ構造によって二重鎖形成部を有するshRNA等の一本鎖核酸であることが好ましい。shRNA等の一本鎖核酸は、通常50〜70塩基長である。
リボヌクレアーゼ等の作用により、上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、70塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、さらに好ましくは30塩基長以下の核酸を用いてもよい。

【0094】

なお、本発明で用いられる核酸は、既知のRNAまたはDNA合成法およびRNAまたはDNA修飾法を用いて製造すればよい。例えば北海道システムサイエンス株式会社等に化学合成を依頼して得ることができる。

【0095】

本発明の組成物としては、例えば本発明のカチオン性脂質と核酸との複合粒子、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと核酸との複合粒子を含有する組成物、該複合粒子および該複合粒子を封入する脂質膜から構成された脂質微粒子等があげられる。該脂質微粒子としては、該複合粒子および該複合粒子を封入する脂質二重膜から構成されたリポソームを含有する組成物等があげられる。該複合粒子としては、核酸と脂質二重層からなる膜との複合体、核酸とリポソームとの複合体、核酸とミセルとの複合体等があげられ、好ましくは核酸とミセルとの複合体または核酸とリポソームとの複合体があげられる。

【0096】

本発明における組成物は、公知の製造方法またはそれに準じて製造することができ、いかなる製造方法で製造されたものであってよい。例えば、組成物の1つであるリポソームの製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム(Bangham)らのリポソーム調製法[“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)”,1965年,第13巻,p.238-252参照]、エタノール注入法[“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)”,1975年,第66巻,p.621-634参照]、フレンチプレス法[“エフイービーエス・レターズ(FEBS Lett.)”,1979年,第99巻,p.210-214参照]、凍結融解法[“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch.Biochem.Biophys.)”,1981年,第212巻,p.186-194参照]、逆相蒸発法[“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”,1978年,第75巻, p.4194-4198参照]またはpH勾配法(例えば特許第2572554号公報、特許第2659136号公報等参照)等があげられる。リポソームの製造の際にリポソームを分散させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインまたはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖または塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒を留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームを製造することができる。

【0097】

また、本発明の組成物は、例えば、本発明のカチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いで核酸の水溶液とメタノールを加えて混合してカチオン性脂質/核酸の複合体を形成させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理して製造する方法(特表2002-508765号公報参照)や、核酸を、酸性の電解質水溶液に溶解し、脂質(エタノール中)を加え、エタノール濃度を20v/v%まで下げて前記核酸内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにpHを上げて透析してリポソーム表面に付着した核酸を除去して製造する方法(特表2002-501511号公報およびバイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta),2001年,第1510巻,p.152-166参照)等によって製造することができる。
本発明の組成物のうち、本発明のカチオン性脂質と核酸との複合粒子、または本発明のカチオン性脂質に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと核酸との複合粒子および該複合粒子を封入した脂質二重膜から構成されたリポソームは、例えば、国際公開第02/28367号パンフレットおよび国際公開第2006/080118号パンフレット参照等に記載の製造方法に従って製造することができる。

【0098】

中性脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイドまたはステロール等があげられるがこれらに限定されない。

【0099】

中性脂質におけるリン脂質としては、例えばホスファチジルコリン(具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)等)、ホスファチジルエタノールアミン(具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、16-0-モノメチルPE、16-0-ジメチルPE、18-1-トランスPE、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、1 -ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)等)、グリセロリン脂質(具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、リゾホスファチジルコリン等)、スフィンゴリン脂質(具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等)、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン(具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等)または水素添加リン脂質(具体的には水素添加大豆ホスファチジルコリン等)等の天然または合成のリン脂質があげられる。

【0100】

中性脂質におけるグリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリドまたはグリコシルジグリセリド等があげられる。

【0101】

中性脂質におけるスフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等があげられる。

【0102】

中性脂質におけるスフィンゴイドとしては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシンまたはそれらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガンまたはスフィンゴシン等の-NH₂を-NHCO(CH₂)_xCH₃(式中、xは0〜18の整数であり、中でも6、12または18が好ましい)に変換したもの等があげられる。

【0103】

中性脂質におけるステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロールまたは3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)等があげられる。

【0104】

高分子としては、例えばタンパク質、アルブミン、デキストラン、ポリフェクト(polyfect)、キトサン、デキストラン硫酸、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸またはポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の高分子またはそれらの塩の1以上からなるミセルがあげられる。

【0105】

ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩または亜鉛塩等があげられる。アンモニウム塩としては、例えばアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩またはクエン酸塩等の有機酸塩があげられる。有機アミン付加塩としては、例えばモルホリンまたはピペリジン等の付加塩があげられる。アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリジン等の付加塩があげられる。

【0106】

また、本発明における組成物は、例えば糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤等を含有することができる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、複合粒子に含有されてもよく、複合粒子外に加えて用いてもよい。

【0107】

糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤としては、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があげられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、分子の一部が組成物の他の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもち、他の部分が組成物の製造時の溶媒と例えば親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつ、2面性をもつ物質であるのが好ましい。

【0108】

糖、ペプチドまたは核酸の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、または例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等の核酸と、前記組成物の定義の中であげた中性脂質もしくは本発明のカチオン性脂質または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられる。

【0109】

また、糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば前記組成物の定義の中であげたグリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等も含まれる。

【0110】

水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、前記組成物の定義の中であげた中性脂質もしくは本発明のカチオン性脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。

【0111】

ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質(具体的にはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン(より具体的には1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DSPE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DMPE)等)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、クレモフォアイーエル(CREMOPHOR EL)等)、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類(具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等)またはポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。

【0112】

ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質(具体的にはポリグリセリン-ホスファチジルエタノールアミン等)またはポリグリセリン脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質があげられる。

【0113】

界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(具体的にはポリソルベート80等)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール(具体的にはプルロニックF68等)、ソルビタン脂肪酸エステル(具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等)、ポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等)、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。

【0114】

また、本発明における組成物がリポソームである場合、例えば高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソーム等の組成物の表面改質も任意に行うことができる[ラジック(D.D.Lasic)、マーティン(F.Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照]。表面改質に使用し得る高分子としては、例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチンまたはヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート80、プルロニックF68、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコールまたはPEG-DSPE等があげられる。リポソーム等の組成物の表面改質によって、組成物に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させることができる。

【0115】

本発明における組成物の平均粒子径は、所望により自由に選択できるが、下記する組成物径とするのが好ましい。リポソームの平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム(MLV)を機械的に粉砕(具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用)する方法[ミュラー(R.H.Muller)、ベニタ(S.Benita)、ボーム(B.Bohm)編著,“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”,ドイツ,サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト(Scientific Publishers Stuttgart),1998年,p.267-294参照]等があげられる。

【0116】

また、組成物である、例えば脂質集合体、リポソーム、高分子ミセル等から選ばれる2つ以上を組み合わせた複合体の製造方法は、例えば水中で脂質、高分子等を混合するだけでもよく、所望によりさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、前記複合体の製造は例えばアセトンまたはエーテル等の種々の溶媒中で行うことも可能である。

【0117】

本発明における組成物の大きさは、平均粒子径が約10nm〜1000nmであるのが好ましく、約30nm〜300nmであるのがよりに好ましく、約50nm〜200nmであるのがさらに好ましい。

【0118】

本発明の組成物を、ほ乳類の細胞に投与することで、本発明の組成物中の核酸を細胞内に導入することができる。
インビトロで本発明の組成物を、ほ乳類の細胞に投与する方法は、インビトロにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。

【0119】

インビボで本発明の組成物を、ほ乳類の細胞に投与する方法は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。例えば、本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば癌または炎症の生じた臓器または部位へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の核酸を導入することができる。癌または炎症の生じた臓器または部位としては、特に限定されないが、例えば胃、大腸、肝臓、肺、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、皮膚、血管、眼球等があげられる。また、本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば血管、肝臓、肺、脾臓および/または腎臓へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の核酸を導入することができる。肝臓、肺、脾臓および/または腎臓の細胞は、正常細胞、癌もしくは炎症に関連した細胞またはその他の疾患に関連した細胞のいずれでもよい。
本発明の組成物中の核酸が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であれば、インビボでほ乳類の細胞内に、遺伝子の発現を抑制するRNA等を導入することができ、遺伝子等の発現の抑制ができる。投与対象は、人であることが好ましい。
また、本発明の組成物における標的遺伝子が、例えば腫瘍または炎症に関連する遺伝子であれば、本発明の組成物を、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤、好ましくは固形癌または血管もしくは血管近傍の炎症の治療剤または予防剤として使用することができる。具体的には、本発明の組成物における標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子等であれば、血管平滑筋の増殖や血管新生等を抑制できるので、本発明の組成物を、例えば血管平滑筋の増殖や血管新生を伴う癌または炎症疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。
即ち、本発明は、上記説明した本発明の組成物を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、癌または炎症疾患に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の組成物は、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤に関するインビボのスクリーニング系においてピーオーシー[POC(Proof of concept)]取得のツールとして使用することもできる。

【0120】

本発明の組成物は、例えば血液成分等の生体成分(例えば血液、消化管等)中での前記核酸の安定化、副作用の低減または標的遺伝子の発現部位を含む組織または臓器への薬剤集積性の増大等を目的とする製剤としても使用できる。

【0121】

本発明の組成物を、医薬品の癌または炎症疾患等の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内等の非経口投与または経口投与をあげることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路などによって異なるが、例えば核酸に換算した1日投与量が約0.1μg〜1000mgとなるように投与すればよい。

【0122】

静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、上述の方法により調製した組成物の分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液を凍結乾燥して使用する、および／または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、前記の組成物の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。

【0123】

次に、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。
なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(¹H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によって交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。

【0124】

参考例1 (3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン(化合物VI-1)
(3R,4R)-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジオール(ダイバーキン(Diverchim S.A.)社製、146 mg, 0.753 mmol)をテトラヒドロフラン(5 mL)に溶解させ、氷冷下水素化ナトリウム(油性, 60%, 241 mg, 6.03 mmol)を加えた後、加熱還流下30分間撹拌した。反応混合物に(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(ニューチェック・プレップ(Nu-Chek Prep,Inc)社製、600 mg, 1.88 mmol)のテトラヒドロフラン(5 mL)溶液を滴下し、加熱還流下4時間撹拌した。室温まで冷却後、反応を水で停止させた。得られた混合物に飽和食塩水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を併せ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜98/2)で精製することにより化合物VI-1(231 mg, 48.0 %)を得た。
ESI-MS m/z: 639(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.28-1.37(m, 36H), 1.50-1.60(m, 4H), 2.01(q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.50(dd, J = 9.8, 4.6 Hz, 2H), 2.85(dd, J = 9.8, 5.9 Hz, 2H), 3.34-3.47(m, 4H), 3.59(q, J = 12.6 Hz, 2H), 3.83(t, J = 4.6 Hz, 2H), 5.29-5.40(m, 4H), 7.20-7.34(m, 5H).

【0125】

参考例2 (trans-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジイル)ジメタノール
WO2009027820を参考にして合成したtrans-ジエチル 1-ベンジルピロリジン-3,4-ジカルボキシレート(830 mg, 2.72 mmol)をテトラヒドロフラン(THF)(24 mL)に溶解させ、0℃で水素化アルミニウムリチウム(206 mg, 5.44 mmol)を加え、室温で1.3時間撹拌した。反応混合物に硫酸ナトリウム十水和物、クロロホルム、セライトを加え、室温でさらに撹拌した。無水硫酸マグネシウムを加えた後ろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。ヘキサンを加え固体をろ取することで(trans-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジイル)ジメタノール(565 mg, 93.9%)を得た。
ESI-MS m/z: 222(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 2.17-2.28(m, 2H), 2.35(dd, J = 9.0, 5.1 Hz, 2H), 2.77(dd, J = 9.0, 7.1 Hz, 2H), 3.56-3.68(m, 6H), 7.22-7.34(m, 5H).

【0126】

参考例3 trans-1-ベンジル-3,4-ビス(((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)メチル)ピロリジン
水素化ナトリウム(油性, 60%, 217 mg, 5.42 mmol)のトルエン(6 mL)懸濁液に、参考例2で得られた(trans-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジイル)ジメタノール(150 mg, 0.678 mmol)のトルエン(4.2 mL)溶液を撹拌しながらゆっくりと添加した後、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、540 mg, 1.70 mmol)のトルエン(1.8 mL)溶液を滴下した。得られた混合物を加熱還流下4.5時間撹拌した。室温まで冷却後、反応を飽和塩化アンモニウム水溶液で停止させた。得られた混合物に飽和食塩水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を併せ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜97/3)で精製することにより、trans-1-ベンジル-3,4-ビス(((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)メチル)ピロリジン(372 mg, 82.3%)を得た。
ESI-MS m/z: 667(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.28-1.35(m, 36H), 1.49-1.57(m, 4H), 1.95-2.10(m, 10H), 2.37(dd, J = 9.2, 5.5 Hz, 2H), 2.67(dd, J = 9.2, 7.0 Hz, 2H), 3.31-3.44(m, 8H), 3.57(dd, J = 18.1, 13.0 Hz, 2H), 5.29-5.40(m, 4H), 7.19-7.32(m, 5H).

【0127】

参考例4 N-ベンジルジエタノールアミン
ジエタノールアミン(1.80 g, 17.1 mmol)のクロロホルム(46 mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(2.99 mL, 17.1 mmol)とベンジル ブロミド(1.36 mL, 11.4 mmol)を添加し、加熱還流下5時間撹拌した。反応溶液を水、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、エバポレートした。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール/クロロホルム=0/100〜12/88)で精製することによりN-ベンジルジエタノールアミン(1.77 g, 79.4%)を得た。
ESI-MS m/z: 196(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 2.29(br s, 2H), 2.73(t, J = 5.3 Hz, 4H), 3.63(t, J = 5.3 Hz, 4H), 3.71(s, 2H), 7.24-7.37(m, 5H).

【0128】

参考例5 N-ベンジル-N,N-ビス(2-((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)エチル)アミン
参考例3と同様の方法で、参考例4で得られたN-ベンジルジエタノールアミン(277 mg, 1.42 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.13 g, 3.55 mmol)を用い、N-ベンジル-N,N-ビス(2-((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)エチル)アミン(739 mg, 81.4%)を得た。
ESI-MS m/z: 641(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.28-1.35(m, 36H), 1.49-1.58(m, 4H), 2.01(q, J = 5.5 Hz, 8H), 2.74(t, J = 6.2 Hz, 4H), 3.37(t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.50(t, J = 6.2 Hz, 4H), 3.71(s, 2H), 5.29-5.40(m, 4H), 7.19-7.35(m, 5H).

【0129】

参考例6 (3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス(テトラデシルオキシ)ピロリジン
(3R,4R)-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジオール(Diverchim S.A.社製、150 mg, 0.776 mmol)をジメチルスルホキシド(4 mL)に溶解させ、水酸化カリウム(348 mg, 6.21 mmol)を加え、100℃で15分間撹拌した。反応溶液にテトラデシル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、568 mg, 1.94 mmol)のジメチルスルホキシド(4 mL)溶液を加え、100℃で4時間撹拌した。室温まで冷却後、水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム100%)で精製することにより(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス(テトラデシルオキシ)ピロリジン(449 mg, 98.6 %)を得た。
ESI-MS m/z: 587(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.25-1.33(m, 44H), 1.51-1.60(m, 4H), 2.50(dd, J = 9.9, 4.7 Hz, 2H), 2.85(dd, J = 9.9, 6.0 Hz, 2H), 3.35-3.47(m, 4H), 3.59(q, J = 12.8 Hz, 2H), 3.83(t, J = 4.7 Hz, 2H), 7.21-7.33(m, 5H).

【0130】

参考例7 (3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((Z)-テトラデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン
参考例3と同様の方法で、(3R,4R)-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジオール(Diverchim S.A.社製、80.0 mg, 0.414 mmol)および(Z)-テトラデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、301 mg, 1.04 mmol)を用い、(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((Z)-テトラデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン(119 mg, 49.5%)を得た。
ESI-MS m/z: 583(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.89(t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.28-1.37(m, 28H), 1.51-1.60(m, 4H), 1.98-2.05(m, 8H), 2.50(dd, J = 9.8, 4.6 Hz, 2H), 2.85(dd, J = 9.8, 6.0 Hz, 2H), 3.35-3.47(m, 4H), 3.59(q, J = 12.6 Hz, 2H), 3.83(t, J = 4.6 Hz, 2H), 5.29-5.40(m, 4H), 7.21-7.34(m, 5H).

【0131】

参考例8 (3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス(ヘキサデシルオキシ)ピロリジン
参考例6と同様の方法で、(3R,4R)-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジオール(Diverchim S.A.社製、100 mg, 0.517 mmol)およびヘキサデシル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、415 mg, 1.29 mmol)を用い、(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス(ヘキサデシルオキシ)ピロリジン(324 mg, 97.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 643(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.25-1.33(m, 52H), 1.50-1.58(m, 4H), 2.50(dd, J = 9.9, 4.8 Hz, 2H), 2.85(dd, J = 9.9, 6.0 Hz, 2H), 3.35-3.47(m, 4H), 3.59(q, J = 12.8 Hz, 2H), 3.83(t, J = 4.8 Hz, 2H), 7.20-7.33(m, 5H).

【実施例1】

【0132】

(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン(化合物1)
参考例1で得られた化合物VI-1(208 mg, 0.326 mmol)を1,2-ジクロロエタン(4 mL)に溶解させ、クロロぎ酸1-クロロエチル(東京化成工業社製、0.107 mL, 0.978 mmol)を加え130℃で1時間撹拌した。反応溶液にメタノール(4 mL)を加え、130℃でさらに1時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜92/8)で精製した。得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することで化合物1(160 mg, 89.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 549(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27-1.36(m, 34H), 1.50-1.59(m, 4H), 1.82(br s, 3H), 2.01(q, J = 6.2 Hz, 8H), 2.84(dd, J = 12.5, 3.0 Hz, 2H), 3.10(dd, J = 12.5, 5.0 Hz, 2H), 3.43(t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.77(dd, J = 5.0, 3.0 Hz, 2H), 5.29-5.40(m, 4H).

【実施例2】

【0133】

(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-1-メチルピロリジン(化合物2)
実施例1で得られた化合物1(107 mg, 0.195 mmol)を1,2-ジクロロエタン(1.5 mL)、メタノール(1.5 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド(0.145 mL, 1.95 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(アクロスオーガニクス(Acros Organics)社製, 207 mg, 0.976 mmol)を加え室温で1時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜96/4)で精製することで化合物2(107 mg, 97.4 %)を得た。
ESI-MS m/z: 563(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.27-1.38(m, 34H), 1.52-1.62(m, 4H), 1.67(br s, 2H), 2.01(q, J = 6.1 Hz, 8H), 2.32(s, 3H), 2.47(dd, J = 9.8, 4.4 Hz, 2H), 2.83(dd, J = 9.8, 5.8 Hz, 2H), 3.36-3.49(m, 4H), 3.81(t, J = 4.4 Hz, 2H), 5.29-5.41(m, 4H).

【実施例3】

【0134】

N-メチル-N,N-ビス(2-((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)エチル)アミン(化合物3)
水素化ナトリウム(油性, 60%, 222 mg, 5.55 mmol)のトルエン(2 mL)懸濁液に、N-メチルジエタノールアミン(東京化成工業社製、82.6 mg, 0.693 mmol)のトルエン(2 mL)溶液を撹拌しながらゆっくりと添加した後、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、530 mg, 1.66 mmol)のトルエン(2 mL)溶液を滴下した。得られた混合物を加熱還流下2時間撹拌した。室温まで冷却後、反応を水で停止させた。得られた混合物に飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜98/2)で精製することにより化合物3(199 mg, 50.9%)を得た。
ESI-MS m/z: 565(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.29(br s, 36H), 1.51-1.56(m, 4H), 1.97-2.04(m, 8H), 2.33(s, 3H), 2.64(t, J = 6.1 Hz, 4H), 3.41(t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.52(t, J = 6.1 Hz, 4H), 5.28-5.40(m, 4H).

【実施例4】

【0135】

2,3-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-N,N-ジメチルプロパン-1-アミン(化合物4)
実施例3と同様の方法で、3-(ジメチルアミノ)プロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、178 mg, 1.49 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.19 g, 3.74 mmol)を用い化合物4(714 mg, 84.6 %)を得た。
ESI-MS m/z: 565(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27-1.35(m, 34H), 1.51-1.62(m, 6H), 2.01(q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.26(s, 6H), 2.32-2.45(m, 2H), 3.41-3.63(m, 7H), 5.29-5.40(m, 4H).

【実施例5】

【0136】

N,N-ジエチル-2,3-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)プロパン-1-アミン(化合物5)
実施例3と同様の方法で、3-(ジエチルアミノ)プロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、209 mg, 1.42 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.13 g, 3.55 mmol)を用い化合物5(545 mg, 64.9 %)を得た。
ESI-MS m/z: 593(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.01(t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 34H), 1.51-1.61(m, 6H), 2.01(q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.43-2.64(m, 6H), 3.39-3.62(m, 7H), 5.29-5.40(m, 4H).

【実施例6】

【0137】

1-(2,3-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)プロピル)ピロリジン(化合物6)
実施例3と同様の方法で、3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、210 mg, 1.44 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.15 g, 3.61 mmol)を用い化合物6(654 mg, 76.8 %)を得た。
ESI-MS m/z: 591(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 34H), 1.51-1.60(m, 4H), 1.62-1.66(m, 2H), 1.72-1.77(m, 4H), 2.01(q, J = 6.3 Hz, 8H), 2.44-2.69(m, 6H), 3.41-3.64(m, 7H), 5.29-5.40(m, 4H).

【実施例7】

【0138】

trans-3,4-ビス(((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)メチル)ピロリジン(化合物7)
実施例1と同様の方法で、参考例3で得られたtrans-1-ベンジル-3,4-ビス(((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)メチル)ピロリジン(335 mg, 0.503 mmol)を用い、化合物7(260 mg, 89.7%)を得た。
ESI-MS m/z: 577(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.29-1.35(m, 36H), 1.50-1.59(m, 4H), 1.96-2.07(m, 10H), 2.70(dd, J = 11.1, 5.7 Hz, 2H), 3.06(dd, J = 11.1, 7.3 Hz, 2H), 3.28-3.46(m, 8H), 5.30-5.40(m, 4H).

【実施例8】

【0139】

trans-3,4-ビス(((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)メチル)-1-メチルピロリジン(化合物8)
実施例7で得られた化合物7(175 mg, 0.304 mmol)を1,2-ジクロロエタン(3 mL)、メタノール(3 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド(0.226 mL, 3.04 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(アクロスオーガニクス(Acros Organics)社製、322 mg, 1.52 mmol)を加え室温で1時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜93/7)で精製することで、化合物8(174 mg, 97.1%)を得た。
ESI-MS m/z: 591(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 36H), 1.50-1.59(m, 4H), 1.98-2.11(m, 10H), 2.33(s, 3H), 2.39(dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), 2.67(dd, J = 9.2, 7.3 Hz, 2H), 3.31-3.45(m, 8H), 5.30-5.40(m, 4H).

【実施例9】

【0140】

ビス(2-((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)エチル)アミン(化合物9)
実施例1と同様の方法で、参考例5で得られたN-ベンジル-N,N-ビス(2-((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)エチル)アミン(700 mg, 1.09 mmol)を用い、化合物9(516 mg, 85.9%)を得た。
ESI-MS m/z: 550(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 36H), 1.52-1.63(m, 4H), 2.01(q, J = 5.5 Hz, 8H), 2.80(t, J = 5.3 Hz, 4H), 3.42(t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.53(t, J = 5.3 Hz, 4H), 5.30-5.40(m, 4H).

【実施例10】

【0141】

(3R,4R)-3,4-ビス(テトラデシルオキシ)ピロリジン(化合物10)
実施例1と同様の方法で、参考例6で得られる(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス(テトラデシルオキシ)ピロリジン(454 mg, 0.775 mmol)を用い、化合物10(331 mg, 86.1 %)を得た。
ESI-MS m/z: 497(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.34(m, 41H), 1.50-1.59(m, 4H), 1.66(br s, 4H), 2.82(dd, J = 12.6, 3.0 Hz, 2H), 3.09(dd, J = 12.6, 5.0 Hz, 2H), 3.40-3.46(m, 4H), 3.76(dd, J = 5.0, 3.0 Hz, 2H).

【実施例11】

【0142】

(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-テトラデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン(化合物11)
実施例1と同様の方法で、参考例7で得られた(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス((Z)-テトラデカ-9-エニルオキシ)ピロリジン(100 mg, 0.172 mmol)を用い、化合物11(71.4 mg, 84.0%)を得た。
ESI-MS m/z: 492(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.87-0.92(m, 6H), 1.29-1.35(m, 26H), 1.50-1.59(m, 4H), 1.64(br s, 3H), 2.02(q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.82(dd, J = 12.5, 2.9 Hz, 2H), 3.09(dd, J = 12.5, 4.9 Hz, 2H), 3.37-3.49(m, 4H), 3.76(dd, J = 4.9, 2.9 Hz, 2H), 5.30-5.40(m, 4H).

【実施例12】

【0143】

(3R,4R)-3,4-ビス(ヘキサデシルオキシ)ピロリジン(化合物12)
実施例1と同様の方法で、参考例8で得られた(3R,4R)-1-ベンジル-3,4-ビス(ヘキサデシルオキシ)ピロリジン(288 mg, 0.449 mmol)を用い、化合物12(210 mg, 84.8%)を得た。
ESI-MS m/z: 553(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.34(m, 50H), 1.50-1.59(m, 4H), 1.66-1.68(m, 3H), 2.82(dd, J = 12.5, 3.0 Hz, 2H), 3.09(dd, J = 12.5, 5.0 Hz, 2H), 3.43(td, J = 6.6, 0.7 Hz, 4H), 3.76(dd, J = 5.0, 3.0 Hz, 2H).

【0144】

化合物13〜17は、実施例1〜12または参考例9〜13と同様の方法で得ることができ、化合物14〜17は、国際公開第2009/086558号パンフレットと同様の方法でも得ることができる。

【0145】

参考例9 2,3-ビス(ヘキサデシルオキシ)-N,N-ジメチルプロパン-1-アミン(化合物A-1)
3-(ジメチルアミノ)プロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、110 mg, 0.923 mmol)をジメチルスルホキシド(12 mL)に溶解させ、水酸化カリウム(414 mg, 7.38 mmol)を加え、100℃で15分間撹拌した。溶液へヘキサデシル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.18 g, 3.69 mmol)を加え、100℃で5時間撹拌した。室温まで冷却後、水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =100/0〜0/100)で精製することにより化合物A-1(28.5 mg, 5.44 %)を得た。
ESI-MS m/z: 569(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.33(m, 46H), 1.52-1.62(m, 10H), 2.28(s, 6H), 2.41(br s, 2H), 3.41-3.63(m, 7H).

【0146】

参考例10 3-(ジメチルアミノ)プロパン-1,2-ジイル ジ((Z)-ヘキサデカ-9-エノアート)(化合物A-2)
3-(ジメチルアミノ)プロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、106 mg, 0.893 mmol)をジクロロメタン(10 mL)に溶解させ、(Z)-9-ヘキサデセン酸(東京化成工業社製、0.556 mL, 1.97 mmol)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド(394 mg, 2.06 mmol)、N,N-ジメチルアミノピリジン(27 mg, 0.223 mmol)を加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜97/3)で精製することにより化合物A-2(495 mg, 93.5 %)を得た。
ESI-MS m/z: 593(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 32H), 1.56-1.66(m, 4H), 2.01(q, J = 5.3 Hz, 8H), 2.26-2.33(m, 10H), 2.44(dd, J = 6.4, 4.1 Hz, 2H), 4.09(dd, J = 12.1, 6.4 Hz, 1H), 4.36(dd, J = 12.1, 3.1 Hz, 1H), 5.15-5.23(m, 1H), 5.28-5.41(m, 4H).

【0147】

参考例11 1-(2,3-ビス(ヘキサデシルオキシ)プロピル)ピロリジン(化合物A-3)
参考例9と同様の方法で、3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、150 mg, 1.03 mmol)およびヘキサデシル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、1.33 g, 4.13 mmol)を用い化合物A-3(52.3 mg, 8.52 %)を得た。
ESI-MS m/z: 595(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.34(m, 50H), 1.51-1.61(m, 4H), 1.75-1.85(m, 6H), 2.48-2.74(m, 6H), 3.41-3.63(m, 7H).

【0148】

参考例12 3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-1,2-ジイル ジ((Z)-ヘキサデカ-9-エノアート)(化合物A-4)
参考例10と同様の方法で、3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、52 mg, 0.357 mmol)および(Z)-9-ヘキサデセン酸(東京化成工業社製、0.222 mL, 0.786 mmol)を用い化合物A-4(201 mg, 91.0 %)を得た。
ESI-MS m/z: 619(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 32H), 1.56-1.64(m, 4H), 1.71-1.76(m, 4H), 2.01(q, J = 6.5 Hz, 8H), 2.30(td, J = 7.5, 2.0 Hz, 4H), 2.50-2.55(m, 4H), 2.63(dd, J = 6.5, 2.0 Hz, 2H), 4.10(dd, J = 11.8, 6.5 Hz, 1H), 4.38(dd, J = 11.8, 3.1 Hz, 1H), 5.16-5.25(m, 1H), 5.28-5.40(m, 4H).

【0149】

参考例13 4-(2,3-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)プロピル)モルホリン(化合物A-5)
実施例10と同様の方法で、3-モルホリノプロパン-1,2-ジオール(東京化成工業社製、101 mg, 0.628 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製、500 mg, 1.57 mmol)を用い化合物A-5(65.0 mg, 17.1 %)を得た。
ESI-MS m/z: 607(M + H)⁺; ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88(t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.35(m, 36H), 1.52-1.59(m, 4H), 2.01(q, J = 6.3 Hz, 8H), 2.45-2.52(m, 6H), 3.41-3.71(m, 11H), 5.29-5.40(m, 4H).

【0150】

次に、本発明の組成物について、実施例および試験例により、具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。
以下の実施例13〜24において用いた核酸は、センス鎖[5'-GmUCAmUCACACmUGAAmUACCAAmU-3'(mが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)]と、アンチセンス鎖[5'-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3'(5’末端をリン酸化してある)]の塩基配列からなる、アポリポプロテインB(Apolipoprotein-B、以下apo-bと表す) 遺伝子の発現を抑制する抗APO-B siRNAであり、センス鎖およびアンチセンス鎖それぞれをニッポンイージーティー社、または北海道システムサイエンス社から入手し、アニーリングさせることにより調製した(以下apo-b siRNAという)。

【実施例13】

【0151】

化合物1/1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)(PEG-DMPE、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(アヴァンチ・ポーラーリピッド(Avanti Polar Lipids)社製)=8.947/1.059/5.708/13.697 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜の構成成分の溶液を調製した。一方、apo-b siRNA/蒸留水(24 mg/mL)をTris-EDTA緩衝液(200 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA、インヴィトロジェン(Invitrogen)製)および、20 mMクエン酸緩衝液(pH5.0)で希釈し、1.5 mg/mLのapo-b siRNA水溶液(2 mM Tris-EDTA緩衝液, pH5.0)を調製した。
得られた脂質溶液を37℃に加温した後、100 μLを製剤調製用の容器に移し、得られたapo-b siRNA水溶液100 μLを攪拌下で加えた。得られた脂質核酸混合懸濁液200 μLに、20 mM クエン酸緩衝液(300 mM NaCl含有, pH6.0)200 μLを攪拌下で加え、さらにダルベッコリン酸バッファー(DPBS、インビトロジェン(Invitrogen)製)662 μLを滴下してsiRNA濃度を10 μMとし、製剤を得た。
粒子径測定装置(マルバーン(Zetasizer Nano ZS)社製)で製剤中のリポソームの平均粒子径を測定したところ、140.3 nmであった。

【実施例14】

【0152】

化合物1を化合物2にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は139.3 nmであった。

【実施例15】

【0153】

化合物1を化合物3にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は126.5 nmであった。

【実施例16】

【0154】

化合物1を化合物4にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は120.6 nmであった。

【実施例17】

【0155】

化合物1を化合物5にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は120.5 nmであった。

【実施例18】

【0156】

化合物1を化合物6にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は116.1 nmであった。

【実施例19】

【0157】

化合物1を化合物7にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は143.5 nmであった。

【実施例20】

【0158】

化合物1を化合物8にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は123.9 nmであった。

【実施例21】

【0159】

化合物1を化合物9にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は130.6 nmであった。

【実施例22】

【0160】

化合物1を化合物10にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は154.2nmであった。

【実施例23】

【0161】

化合物1を化合物11にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は133.8 nmであった。

【実施例24】

【0162】

化合物1を化合物12にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は157.2nmであった。

【0163】

比較例1
化合物1を、参考例9の化合物A-1にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は153.0 nmであった。

【0164】

比較例2
化合物1を、参考例10の化合物A-2にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は134.9 nmであった。

【0165】

比較例3
化合物1を、参考例11の化合物A-3にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は136.6 nmであった。

【0166】

比較例4
化合物1を、参考例12の化合物A-4にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は145.2 nmであった。

【0167】

比較例5
化合物1を、参考例13の化合物A-5にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は135.0 nmであった。

【0168】

比較例6
化合物1を、参考例1の化合物VI-1にした以外、実施例13と同様にして製剤を得た。該製剤中のリポソームの平均粒子径は132.0 nmであった。

【0169】

比較例で用いた化合物A-1〜5および化合物VI-1の構造式を表4に示す。

【0170】

【表4】

【0171】

試験例1
実施例13〜24および比較例1〜6で得られた各製剤を、それぞれ以下の方法により、ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞(HB-8065)に導入した。
核酸の最終濃度が3-100nMとなるように、オプティメム(Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各製剤を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、1.25%ウシ胎仔血清(FBS、SAFCバイオサイエンス(SAFC Biosciences)社、12203C)を含むMEMに懸濁させたHepG2細胞を、細胞数6250/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO₂条件下で培養することで、各製剤をHepG2細胞内に導入した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO₂インキュベーター内で24時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、GIBCO社、14190)で洗浄し、Cells-to-Ct Kit(アプライドバイオサイエンス(ABI)社、AM1728)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
得られたcDNAを鋳型とし、ユニバーサルプローブライブラリ(Universal Probe Library、ロシュ アプライドサイエンス(Roche Applied Science)社、04683633001)をプローブとして、ABI7900HT Fast(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、apo-b遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、apo-bのmRNAの準定量値を算出した。また、陰性対照の群における、apo-bのmRNA量およびgapdhのmRNA増幅量を同様にそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、apo-bのmRNAの準定量値を算出した。
算出されたapo-bのmRNAの準定量値を、陰性対照におけるapo-bのmRNAの準定量値を1として求めたapo-bのmRNAの発現率の結果を、実施例13〜24については図1および2に、比較例1〜6については図3に示す。なお、縦軸は陰性対照を1とした場合の標的遺伝子のmRNAの発現率を表し、横軸は核酸濃度(nM)、使用したカチオン性脂質の化合物番号および実施例番号を示す。

【0172】

図1および2から明らかなように、実施例13〜24で得られた製剤(apo-b遺伝子の発現を抑制する抗APO-B siRNAと、化合物1〜12のそれぞれとを含有する組成物)を、ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞内に導入後の、apo-b遺伝子のmRNAの発現率は抑制されている。一方、図3から明らかなように、比較例1〜6で得られた製剤(apo-b遺伝子の発現を抑制する抗APO-B siRNAと、化合物A-1〜5およびVI-1のそれぞれとを含有する組成物)は、ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞内に導入後の、apo-b遺伝子のmRNAの発現率は抑制されていない。
よって、本発明の組成物は、核酸を細胞内等に導入することができ、本発明のカチオン性脂質は、細胞内に導入することを容易にする新規なカチオン性脂質であることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0173】

本発明の新規なカチオン性脂質および核酸を含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、該核酸を例えば、細胞内等に容易に導入することができる。

【配列表フリーテキスト】

【0174】

配列番号1-siRNA センス鎖
配列番号2-siRNA アンチセンス鎖
配列番号2-5'-リン酸化アデノシン(5'-phosphorylated Adenosine)

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]