特許 5903045 アデノウイルスに基づくベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5903045

(24)【登録日】2016年3月18日

(45)【発行日】2016年4月13日

(54)【発明の名称】アデノウイルスに基づくベクター

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/235 20060101AFI20160331BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20160331BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20160331BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20160331BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160331BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/235

   A61K39/145

   A61P31/16

   A61P31/18

   A61P31/12

   A61P33/06

   A61P31/06

   A61K39/21

   A61K39/12

   !C12N15/00 AZNA

【請求項の数】13

【全頁数】88

(21)【出願番号】特願2012-523098(P2012-523098)

(86)(22)【出願日】2010年7月30日

(65)【公表番号】特表2013-501001(P2013-501001A)

(43)【公表日】2013年1月10日

(86)【国際出願番号】US2010043951

(87)【国際公開番号】WO2011014794

(87)【国際公開日】20110203

【審査請求日】2013年7月29日

(31)【優先権主張番号】61/230,617

(32)【優先日】2009年7月31日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512024244

【氏名又は名称】パックスバックス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】メイオール ティモシー ピー．

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンダー ジェフ

【審査官】 光本 美奈子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０１１５４５６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５１２７８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／０７２７０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０６０８３７１６（ＵＳ，Ａ）

【文献】 Virology, vol.177, p.452-461 (1990)

【文献】 PLoS ONE, vol.7, no.2, e31177 (2012)

【文献】 Lancet Infect Dis, vol.13, p.238-250 (2013)

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００〜３９／４４

Ａ６１Ｐ １／００〜４３／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、該アデノウイルスベクターが、複製能力を有し、かつＥ３の部分欠失を有し、該第１の異種配列が、該Ｅ３の部分欠失を含有する位置に組み込まれており、ここで、該アデノウイルスベクターは、Ａｄ４に由来し、該Ｅ３の部分欠失が、Ｅ３ ２４．８ｋ、Ｅ３ ６．３ｋ、およびＥ３ ２９．７ｋの欠失である、前記ワクチン。

【請求項2】

前記第１の異種配列の発現が、アデノウイルス主要後期プロモーターの制御下にある、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

前記第１の異種配列が、アデノウイルススプライスアクセプターに機能的に結合している、請求項１に記載のワクチン。

【請求項4】

前記第１の異種配列が、アデノウイルスポリＡシグナル配列に機能的に結合している、請求項１に記載のワクチン。

【請求項5】

前記第１の異種配列が、感染性病原体の免疫原性タンパク質をコードし、該感染性病原体が、ウイルス、細菌、原生生物、および真菌からなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項6】

前記感染性病原体が、インフルエンザ、ヒト免疫不全症ウイルス、またはヒトパピローマウイルスである、請求項５に記載のワクチン。

【請求項7】

前記第１の異種配列が、インフルエンザヘマグルチニン、インフルエンザノイラミニダーゼ、インフルエンザＭ２、Ｍ２ｅの多量体、ＨＴＬエピトープの多量体、またはＣＴＬエピトープの多量体をコードする、請求項１に記載のワクチン。

【請求項8】

経口、鼻腔内、舌下、膀胱内、直腸内、または膣内投与のために製剤化される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項9】

ワクチンの単回用量が、約１０^３〜約１０^１３個のアデノウイルス粒子を含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項10】

対象にワクチンを投与することを含む、対象において感染性病原体に対する免疫応答を誘発する方法において使用するための、請求項１に記載のワクチン。

【請求項11】

前記感染性病原体が、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、バチルス、マラリア原虫、マイコバクテリア、または赤痢菌である、請求項１０に記載の方法において使用するためのワクチン。

【請求項12】

前記対象が、前記感染性病原体によって誘発された感染症を有する、請求項１０に記載の方法において使用するためのワクチン。

【請求項13】

前記アデノウイルスポリＡシグナル配列が、Ａｄ５ Ｅ３ポリＡシグナル配列である、請求項４記載のワクチン。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年７月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／２３０，６１７号の恩典を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み入れられる。

【0002】

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照により、その全体が本明細書に組み入れられる：コンピュータ可読形式の配列リスト（ファイル名：ＰＡＸＶ＿００４＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、登録日：２０１０年７月３０日、ファイルサイズ６２キロバイト）。

【背景技術】

【0003】

アデノウイルスは、感染性物質として、基本的研究の対象として、そして遺伝子療法およびワクチンにおけるそれらの可能性のある使用のために広く研究されてきた。ヒトアデノウイルスは４９種の血清型が同定されており、核酸の比較、ファイバータンパク質の特徴、および生物学的特性に基づいて６つの亜属（Ａ〜Ｆ）に分類される。例えば、グループＡは血清型１２および３１を含み、グループＢは血清型３および７を含み、グループＣは血清型２および５を含み、グループＤは血清型８および３０を含み、グループＥは血清型４を含み、グループＦは血清型４０および４１を含む。

【0004】

一般的構造の観点では、今日まで調査された全てのアデノウイルスは、エンベロープを持たない、直径約８０ナノメートルの規則的な正二十面体である。アデノウイルスは、コアタンパク質と複合化し、かつアデノウイルスのカプシドによって取り囲まれた、直鎖二本鎖ＤＮＡを含有する。個々のウイルス粒子は、ＳＤＳゲル上でのサイズの大きいものから順にローマ数字（ＩＩ〜ＸＩＩ）で表される約１１種の異なるタンパク質を含有する。

【0005】

カプシドは、７つの構造タンパク質からなる：ＩＩ（ヘキソン）、ＩＩＩ（ペントン）、ＩＩＩａ、ＩＶ（ファイバー）、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＩＸ。カプシドは２５２個のカプソメアを含み、そのうちの２４０個がヘキソンカプソメアであり、１２個がペントンカプソメアである。ヘキソンタンパク質の三量体であるヘキソンカプソメアは、カプシドのタンパク質の約７５％を構成する。ペントンタンパク質の五量体であるペントンカプソメアは、ウイルス粒子の１２個の頂点の各々に位置する。各ペントンカプソメアは、６つの隣接するヘキソンカプソメアおよびファイバーに結合している。ファイバー（通常はファイバータンパク質の三量体）は、ペントンカプソメアから突出する。ヘキソンタンパク質、またそれより少ない程度ではあるが、ファイバータンパク質は、アデノウイルスの主な抗原決定基を含み、また血清型特異性を決定する。

【0006】

研究者は、中和抗体が誘導されるタンパク質の領域を特定する試みにおいて、異なるアデノウイルス血清型のカプシドタンパク質の構造を、とりわけヘキソンタンパク質において、調査および比較してきた。中和抗体が作られるヘキソンタンパク質の主な領域は、ヘキソンカプソメアの基部から外向きに突出するループ１および２（すなわち、それぞれ、ＬＩまたはｌ１、およびＬＩＩまたはｌ２）にあると考えられる。異なるアデノウイルスのヘキソンタンパク質からのループ１および２の分析により、血清型間でヘキソンタンパク質が大きく異なる位置に対応する７つの異なる超可変領域（ＨＶＲ１〜ＨＶＲ７）の存在が明らかになった。

【0007】

アデノウイルスのウイルス粒子のコアは、直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムおよび関連するタンパク質Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ（ｍｕ）、ＩＶａ２、ならびに末端タンパク質（ＴＰ）を含有する。異なるアデノウイルスゲノム機構は保存され、タイミング機能を有すると提案されており、ゲノムの末端が最初に転写される（最初期遺伝子Ｅ１およびＥ４は、直鎖ゲノムの反対の末端に位置する）。Ｅ１およびＥ４の初期転写は、ゲノムの中心領域の開放を引き起こし、その中心領域の転写を可能にする。

【0008】

アデノウイルスゲノムは、典型的には、８つのＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写単位からなる：５つの初期単位Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ〜Ｅ２Ｂ、Ｅ３、およびＥ４；２つの後初期単位ＩＸおよびＩＶａ２；ならびに主要後期転写単位。主要後期転写単位は、選択的スプライシング部位の使用に基づいてＬ１〜Ｌ５領域にさらに細分化される。転写単位は、同様の機能のタンパク質を発現することが多い。例えば、Ｅ１Ａ単位は、細胞感染時の転写活性化およびＳ期誘導を司る２つのタンパク質をコードし、Ｅ１Ｂ転写単位は、細胞アポトーシスを阻害する２つのタンパク質をコードし、Ｅ３転写単位は、免疫応答の回避に関与し、主要後期転写単位は、カプシドのアセンブリに必要な構造タンパク質をコードする。

【0009】

遺伝子療法およびワクチン接種の目的のために、組換えアデノウイルスベクターは、異種の遺伝子および抗原をコードおよび発現するように設計されてきた。この状況下で、血清型Ａｄ２およびＡｄ５が最も広範囲に使用されてきた。異種配列は、ヘキソン、ペントン、およびファイバー等の種々の構造タンパク質の初期転写単位およびコード領域を含むアデノウイルスゲノムに挿入されてきた。多くの場合、アデノウイルスゲノムにおける（例えば、Ｅ１領域における）欠失は、一般的に、ヒト対象への投与により安全であると考えられている複製欠損アデノウイルスベクターを作製するために使用されてきた。そのような広範囲にわたる研究および開発にもかかわらず、当該技術分野において、例えば、感染症のためのワクチンとして好適な、新しい組換えアデノウイルスベクターの必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0010】

本発明は、有効なワクチンとして用いることのできる組換えアデノウイルスベクターを対象とする。本発明は、異種配列を高レベルで発現する新規組換えアデノウイルスベクターの開発に一部基づいている。本発明はまた、宿主の免疫応答を向上させ、既存の中和抗体を回避するように設計される新規組換えアデノウイルスベクターの開発に一部基づいている。本発明はまた、抗原特異的および／または汎用インフルエンザワクチンとして使用される新規組換えアデノウイルスベクターの開発に一部基づいている。

【0011】

したがって、一態様において、本発明は、第１の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンを提供し、該アデノウイルスベクターは、複製能力を有し、かつＥ３の部分欠失を有する。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ２０、Ａｄ２１、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２８、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、Ａｄ４９、またはＡｄ５０アデノウイルスに由来する。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス、例えば、Ａｄ Ｃ１、Ａｄ Ｃ３、Ａｄ Ｃ６、Ａｄ Ｃ７、またはＡｄ６８に由来する。特定の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３の部分欠失を含有する位置に組み込まれる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスの転写配列および／もしくは転写制御配列の制御下にあるか、またはそれに機能的に結合している。例えば、第１の異種配列は、アデノウイルスの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、アデノウイルスのトリパータイトリーダー（ＴＰＬ）配列、アデノウイルスのスプライスアクセプター配列、および／もしくはアデノウイルスのポリアデニル化シグナル配列の制御下にあってもよいか、またはそれに機能的に結合していてもよい。特定の実施形態において、第１の異種配列は、非アデノウイルスの転写配列および／もしくは転写制御配列（エンハンサー、プロモーター、イントロン配列等）、ならびに／またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）等、もしくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のリーダー配列、またはそのような要素の任意の組み合わせを含むか、ならびに／またはその制御下にある。特定の実施形態において、第１の異種配列は、発現を増加するように修飾される。例えば、第１の異種配列は、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含むようにコドン最適化および／または修飾されてもよい。特定の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）等の感染性病原体由来の免疫原性ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、第１の異種配列は、感染性病原体由来の少なくとも２つの別個のポリペプチドおよび／または免疫原性エピトープの多量体をコードする。

【0012】

別の態様において、本発明は、第１の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンを提供し、該アデノウイルスベクターは、複製能力を有し、かつＥ３の全欠失を有する。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ２０、Ａｄ２１、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２８、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、Ａｄ４９、またはＡｄ５０アデノウイルスに由来する。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス、例えば、Ａｄ Ｃ１、Ａｄ Ｃ３、Ａｄ Ｃ６、Ａｄ Ｃ７、またはＡｄ６８に由来する。特定の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３の全欠失を含有する位置に組み込まれる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスの転写配列および／もしくは転写制御配列の制御下にあるか、またはそれに機能的に結合している。例えば、第１の異種配列は、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、アデノウイルストリパータイトリーダー（ＴＰＬ）配列、アデノウイルススプライスアクセプター配列、および／もしくはアデノウイルスポリアデニル化シグナル配列の制御下にあってもよいか、またはそれに機能的に結合していてもよい。特定の実施形態において、第１の異種配列は、非アデノウイルスの転写配列および／もしくは転写制御配列（エンハンサー、プロモーター、イントロン配列等）、ならびに／またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）等、もしくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のリーダー配列、またはそのような要素の任意の組み合わせを含むか、ならびに／またはその制御下にある。特定の実施形態において、第１の異種配列は、発現を増加するように修飾される。例えば、第１の異種配列は、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含むようにコドン最適化および／または修飾されてもよい。特定の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、バチルス、赤痢菌、マイコバクテリウム、マラリア原虫等の感染性病原体由来の免疫原性ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、第１の異種配列は、感染性病原体由来の少なくとも２つの別個のポリペプチドおよび／または免疫原性エピトープの多量体をコードする。

【0013】

別の態様において、本発明は、第１の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチン提供し、該アデノウイルスベクターは、複製能力を有し、該第１の異種配列の発現は、アデノウイルスの転写配列および／または転写制御配列の制御下にある。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ２０、Ａｄ２１、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２８、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、Ａｄ４９、またはＡｄ５０アデノウイルスに由来する。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス、例えば、Ａｄ Ｃ１、Ａｄ Ｃ３、Ａｄ Ｃ６、Ａｄ Ｃ７、またはＡｄ６８に由来する。特定の実施形態において、アデノウイルスは、Ｅ３の全欠失または部分欠失を有する。特定の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３の全欠失または部分欠失を含有する位置に組み込まれる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスＭＬＰの制御下にあるか、またはそれに機能的に結合している。特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスＭＬＰおよびアデノウイルスＴＰＬ配列の制御下にあるか、またはそれに機能的に結合している。特定の実施形態において、第１の異種配列は、さらに、アデノウイルススプライスアクセプター配列および／もしくはアデノウイルスポリアデニル化シグナル配列の制御下にあるか、またはそれに機能的に結合している。特定の実施形態において、第１の異種配列は、発現を増加するように修飾される。例えば、第１の異種配列は、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含むようにコドン最適化および／または修飾されてもよい。特定の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、デング熱ウイルス、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス、赤痢菌、マイコバクテリウム、マラリア原虫等の感染性病原体由来の免疫原性ポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、第１の異種配列は、感染性病原体由来の少なくとも２つの別個のポリペプチドおよび／または免疫原性エピトープの多量体をコードする。

【0014】

別の態様において、本発明は、第１の異種配列および第２の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンを提供し、該第２の異種配列はアデノウイルスのヘキソン領域に組み込まれ、該第１の異種配列はアデノウイルスの非ヘキソン領域に組み込まれ、該アデノウイルスベクターは複製能力を有する。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ２０、Ａｄ２１、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２８、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、Ａｄ４９、またはＡｄ５０アデノウイルスに由来する。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス、例えば、Ａｄ Ｃ１、Ａｄ Ｃ３、Ａｄ Ｃ６、Ａｄ Ｃ７、またはＡｄ６８に由来する。特定の実施形態において、アデノウイルスは、Ｅ３の全欠失または部分欠失を有する。特定の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３の全欠失または部分欠失を含有する位置に組み込まれる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスの転写配列および／もしくは転写制御配列の制御下にあるか、またはそれに機能的に結合している。例えば、第１の異種配列は、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、アデノウイルストリパータイトリーダー（ＴＰＬ）配列、アデノウイルススプライスアクセプター配列、および／もしくはアデノウイルスポリアデニル化シグナル配列の制御下にあってもよいか、またはそれに機能的に結合していてもよい。

【0015】

特定の実施形態において、第２の異種配列は、ヘキソン領域の１つまたは複数の超可変領域に組み込まれる。例えば、第２の異種配列は、ヘキソンのＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ４、もしくはＨＶＲ５配列、またはそれらの組み合わせに組み込まれてもよい。特定の実施形態において、第２の異種配列は、ウイルスの膜タンパク質の部分（例えば、膜内在性タンパク質または表在性膜タンパク質）をコードする。例えば、第２の異種配列は、保存されたウイルス膜タンパク質の細胞外部分をコードすることができる。特定の実施形態において、第２の異種配列は、インフルエンザＭ２タンパク質、インフルエンザマトリックスタンパク質、インフルエンザＮＰタンパク質の部分、または異なる血清型を有するアデノウイルスのヘキソン超可変領域をコードする。特定の実施形態において、第２の異種配列は、ウイルスの膜タンパク質またはその断片等の２つ以上のタンパク質のコピーをコードする。

【0016】

特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、１つまたは複数の追加の異種配列を含み、各追加の異種配列は、ヘキソン領域に組み込まれ、第２の異種配列とは異なる。例えば、追加の異種配列は、異なる血清型を有するアデノウイルスの超可変領域の全てであってもよい。

【0017】

別の態様において、本発明は、第２の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンを提供し、該第２の異種配列は、ウイルスの膜タンパク質の領域をコードし、かつアデノウイルスベクターのヘキソン領域に組み込まれる。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ２０、Ａｄ２１、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２８、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、Ａｄ４９、またはＡｄ５０アデノウイルスに由来する。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス、例えば、Ａｄ Ｃ１、Ａｄ Ｃ３、Ａｄ Ｃ６、Ａｄ Ｃ７、またはＡｄ６８に由来する。特定の実施形態において、第２の異種配列は、内因性アデノウイルス配列に接している。他の実施形態において、第２の異種配列は、スペーサーに接している。特定の実施形態において、スペーサーは、ペプチド配列「ＬＧＳ」をコードする。特定の実施形態において、第２の異種配列は、インフルエンザウイルスに由来する。例えば、第２の異種配列は、インフルエンザＭ２、インフルエンザマトリックス、もしくはインフルエンザＮＰポリペプチド、またはその断片をコードすることができる。

【0018】

さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載される組換えアデノウイルスベクターに基づくワクチンを使用するワクチン接種の方法を提供する。特定の実施形態において、ワクチン接種は、インフルエンザ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、デング熱ウイルス、連鎖球菌、バチルス、赤痢菌、マイコバクテリウム、またはマラリア原虫のためである。
[本発明1001]
第1の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、該アデノウイルスベクターが、複製能力を有し、かつＥ3の部分欠失を有し、該第1の異種配列が、該Ｅ3の部分欠失を含有する位置に組み込まれている、前記ワクチン。
[本発明1002]
前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ2、Ａｄ3、Ａｄ4、Ａｄ5、Ａｄ6、Ａｄ7、Ａｄ11、Ａｄ20、Ａｄ21、Ａｄ22、Ａｄ23、Ａｄ24、Ａｄ25、Ａｄ26、Ａｄ28、Ａｄ34、Ａｄ35、Ａｄ40、Ａｄ41、Ａｄ48、Ａｄ49、またはＡｄ50に由来する、本発明1001のワクチン。
[本発明1003]
前記アデノウイルスベクターが、チンパンジー血清型Ａｄ Ｃ1、Ａｄ Ｃ3、Ａｄ Ｃ6、Ａｄ Ｃ7、またはＡｄ68に由来する、本発明1001のワクチン。
[本発明1004]
前記Ｅ3の部分欠失が、Ｅ3領域内に少なくとも1つ、2つ、または3つのオープンリーディングフレームの欠失を含む、本発明1001のワクチン。
[本発明1005]
前記Ｅ3の部分欠失が、未知の機能を有する少なくとも1つ、2つ、または3つのオープンリーディングフレームの欠失を含む、本発明1001のワクチン。
[本発明1006]
前記Ｅ3の部分欠失が、Ａｄ5のＡＤＰ領域に対応する領域の欠失を含む、本発明1001のワクチン。
[本発明1007]
前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ4に由来し、前記Ｅ3の部分欠失が、Ｅ3 24．8ｋ、Ｅ3 6．3ｋ、およびＥ3 29．7ｋの欠失を含む、本発明1001のワクチン。
[本発明1008]
前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ7に由来し、前記Ｅ3の部分欠失が、Ｅ3 20．1ｋ、Ｅ3 20．6ｋ、およびＥ3 7．7ｋの欠失を含む、本発明1001のワクチン。
[本発明1009]
前記第1の異種配列の発現が、アデノウイルスプロモーターの制御下にある、本発明1001のワクチン。
[本発明1010]
前記第1の異種配列の発現が、内因性アデノウイルスプロモーターの制御下にある、本発明1009のワクチン。
[本発明1011]
前記第1の異種配列の発現が、内因性主要後期プロモーターおよびトリパータイトリーダーの制御下にある、本発明1010のワクチン。
[本発明1012]
前記第1の異種配列の発現が、非アデノウイルスプロモーターの制御下にある、本発明1001のワクチン。
[本発明1013]
前記第1の異種配列の発現が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある、本発明1012のワクチン。
[本発明1014]
前記第1の異種配列の発現が、ＣＭＶプロモーターおよびアデノウイルストリパータイトリーダーの制御下にある、本発明1012のワクチン。
[本発明1015]
前記第1の異種配列が、アデノウイルススプライスアクセプターに機能的に結合している、本発明1001のワクチン。
[本発明1016]
前記第1の異種配列が、天然Ｅ3 24．8ｋスプライスアクセプターに機能的に結合している、本発明1015のワクチン。
[本発明1017]
前記第1の異種配列が、アデノウイルスポリＡシグナル配列に機能的に結合している、本発明1001のワクチン。
[本発明1018]
前記第1の異種配列が、Ａｄ5 Ｅ3ポリＡシグナル配列に機能的に結合している、本発明1017のワクチン。
[本発明1019]
前記第1の異種配列が、感染性病原体の免疫原性タンパク質をコードする、本発明1001のワクチン。
[本発明1020]
前記感染性病原体が、ウイルス、細菌、原生生物、および真菌からなる群から選択される、本発明1019のワクチン。
[本発明1021]
前記感染性病原体が、インフルエンザ、ヒト免疫不全症ウイルス、またはヒトパピローマウイルスである、本発明1020のワクチン。
[本発明1022]
前記感染性病原体が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）である、本発明1020のワクチン。
[本発明1023]
前記第1の異種配列が、インフルエンザヘマグルチニン、インフルエンザノイラミニダーゼ、インフルエンザＭ2、Ｍ2ｅの多量体、ＨＴＬエピトープの多量体、またはＣＴＬエピトープの多量体をコードする、本発明1001のワクチン。
[本発明1024]
前記第1の異種配列が、感染性病原体の免疫原性タンパク質をコードする第1のＯＲＦと、感染性病原体からのエピトープの多量体をコードする第2のＯＲＦとを含む、本発明1001のワクチン。
[本発明1025]
第1の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、該アデノウイルスベクターが複製能力を有し、該第1の異種配列の発現がアデノウイルスプロモーターの制御下にある、前記ワクチン。
[本発明1026]
前記アデノウイルスプロモーターが、内因性アデノウイルスプロモーターである、本発明1025のワクチン。
[本発明1027]
前記第1の異種配列が、内因性主要後期プロモーターおよびトリパータイトリーダーの制御下にある、本発明1025のワクチン。
[本発明1028]
前記アデノウイルスベクターが、Ｅ3の全欠失または部分欠失を含み、前記第1の異種配列が、該Ｅ3の全欠失または部分欠失を含有する位置に組み込まれている、本発明1025のワクチン。
[本発明1029]
第1の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、該アデノウイルスベクターが、Ａｄ2、Ａｄ3、Ａｄ4、Ａｄ5、Ａｄ6、Ａｄ7、Ａｄ11、Ａｄ20、Ａｄ21、Ａｄ22、Ａｄ23、Ａｄ24、Ａｄ25、Ａｄ26、Ａｄ28、Ａｄ34、Ａｄ35、Ａｄ40、Ａｄ41、Ａｄ48、Ａｄ49、Ａｄ50、Ａｄ Ｃ1、Ａｄ Ｃ3、Ａｄ Ｃ6、Ａｄ Ｃ7、またはＡｄ68に由来し、複製能力を有し、かつＥ3の全欠失を有する、前記ワクチン。
[本発明1030]
第1の異種配列および第2の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、該第2の異種配列が、アデノウイルスのヘキソン領域に組み込まれており、該第1の異種配列が、アデノウイルスの非ヘキソン領域に組み込まれており、該アデノウイルスベクターが、複製能力を有する、前記ワクチン。
[本発明1031]
前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ2、Ａｄ3、Ａｄ4、Ａｄ5、Ａｄ6、Ａｄ7、Ａｄ11、Ａｄ20、Ａｄ21、Ａｄ22、Ａｄ23、Ａｄ24、Ａｄ25、Ａｄ26、Ａｄ28、Ａｄ34、Ａｄ35、Ａｄ40、Ａｄ41、Ａｄ48、Ａｄ49、またはＡｄ50に由来する、本発明1030のワクチン。
[本発明1032]
前記アデノウイルスベクターが、チンパンジー血清型Ａｄ Ｃ1、Ａｄ Ｃ3、Ａｄ Ｃ6、Ａｄ Ｃ7、またはＡｄ68に由来する、本発明1030のワクチン。
[本発明1033]
前記アデノウイルスベクターが、Ｅ3の部分欠失を含み、前記第1の異種配列が、該Ｅ3の部分欠失を含有する位置に組み込まれている、本発明1030のワクチン。
[本発明1034]
前記第1の異種配列の発現が、アデノウイルスプロモーターの制御下にある、本発明1030のワクチン。
[本発明1035]
前記第1の異種配列の発現が、内因性アデノウイルスプロモーターの制御下にある、本発明1030のワクチン。
[本発明1036]
前記第2の異種配列が、前記アデノウイルスベクターのヘキソン領域に組み込まれている、本発明1030のワクチン。
[本発明1037]
前記第2の異種配列が、ＨＶＲ1、ＨＶＲ2、ＨＶＲ4、またはＨＶＲ5に組み込まれている、本発明1030のワクチン。
[本発明1038]
前記第2の異種配列が、ウイルスの膜タンパク質の領域をコードする、本発明1030のワクチン。
[本発明1039]
前記第2の異種配列が、保存されたウイルス膜タンパク質の細胞外部分をコードする、本発明1030のワクチン。
[本発明1040]
前記第2の異種配列が、インフルエンザＭ2タンパク質の領域、インフルエンザマトリックスＣＴＬ、インフルエンザＮＰエピトープ、別の血清型のアデノウイルスからの1つもしくは複数のＨＶＲ、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1030のワクチン。
[本発明1041]
前記第2の異種配列が、インフルエンザＭ2のＭ2ｅの1つまたは複数のコピーをコードする、本発明1030のワクチン。
[本発明1042]
前記第2の異種配列が、インフルエンザＭ2のＭ2ｅの1つまたは複数のコピーをコードし、各Ｍ2コピーが、異なるＨＶＲに組み込まれており、該Ｍ2ｅの1つまたは複数のコピーが、ＨＶＲ1、ＨＶＲ2、ＨＶＲ4、ＨＶＲ5、またはそれらの組み合わせに組み込まれている、本発明1030のワクチン。
[本発明1043]
前記第2の異種配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：318（Ｈ5 Ｍ2ｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：321（Ｈ7 Ｍ2ｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：327（Ｈ9 Ｍ2ｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：312（ヒトＭ2ｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：337（ＮＰ）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336（マトリックスＣＴＬ）の配列を含む、本発明1030のワクチン。
[本発明1044]
第2の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、該第2の異種配列が、ウイルスの膜タンパク質の領域をコードし、かつ内因性アデノウイルス配列に隣接し、該第2の異種配列が、該アデノウイルスベクターのヘキソン領域に組み込まれている、前記ワクチン。
[本発明1045]
前記第2の異種配列が、インフルエンザＭ2タンパク質の領域、インフルエンザマトリックスＣＴＬ、インフルエンザＮＰエピトープ、別の血清型のアデノウイルスからの1つもしくは複数のＨＶＲ、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1044のワクチン。
[本発明1046]
前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ2、Ａｄ3、Ａｄ4、Ａｄ5、Ａｄ6、Ａｄ7、Ａｄ11、Ａｄ20、Ａｄ21、Ａｄ22、Ａｄ23、Ａｄ24、Ａｄ25、Ａｄ26、Ａｄ28、Ａｄ34、Ａｄ35、Ａｄ40、Ａｄ41、Ａｄ48、Ａｄ49、またはＡｄ50に由来する、本発明1044のワクチン。
[本発明1047]
前記アデノウイルスベクターが、チンパンジー血清型Ａｄ Ｃ1、Ａｄ Ｃ3、Ａｄ Ｃ6、Ａｄ Ｃ7、またはＡｄ68に由来する、本発明1044のワクチン。
[本発明1048]
第2の異種配列を含むアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、該第2の異種配列が、スペーサー配列に接しているウイルスの膜タンパク質の領域をコードし、該第2の異種配列が、該アデノウイルスベクターのヘキソン領域に組み込まれている、前記ワクチン。
[本発明1049]
前記スペーサー配列が、「ＬＧＳ」ペプチドをコードする、本発明1048のワクチン。
[本発明1050]
前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ2、Ａｄ3、Ａｄ4、Ａｄ5、Ａｄ6、Ａｄ7、Ａｄ11、Ａｄ20、Ａｄ21、Ａｄ22、Ａｄ23、Ａｄ24、Ａｄ25、Ａｄ26、Ａｄ28、Ａｄ34、Ａｄ35、Ａｄ40、Ａｄ41、Ａｄ48、Ａｄ49、またはＡｄ50に由来する、本発明1048のワクチン。
[本発明1051]
前記アデノウイルスベクターが、チンパンジー血清型Ａｄ Ｃ1、Ａｄ Ｃ3、Ａｄ Ｃ6、Ａｄ Ｃ7、またはＡｄ68に由来する、本発明1048のワクチン。
[本発明1052]
経口、鼻腔内、舌下、膀胱内、直腸内、膣内投与のために製剤化される、本発明1001、1025、1029、1030、1044、または1048のワクチン。
[本発明1053]
許容可能な担体をさらに含む、本発明1001、1025、1029、1030、1044、または1048のワクチン。
[本発明1054]
単回用量が、約10³〜約10¹³個のアデノウイルス粒子を含む、本発明1001、1025、1029、1030、1044、または1048のワクチンの投薬単位。
[本発明1055]
本発明1001、1025、1029、1030、1044、または1048のワクチンを対象に投与することを含む、対象において感染性病原体に対する免疫応答を誘発する方法。
[本発明1056]
前記ワクチンの1回または複数回の用量が前記対象に投与される、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記感染性病原体が、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、バチルス、マラリア原虫、マイコバクテリア、または赤痢菌である、本発明1055の方法。
[本発明1058]
前記対象が、前記感染性病原体によって誘発された感染症を有する、本発明1055の方法。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、ｐＰＶ−Ａｄ４ｖａｘ組換えアデノウイルスベクターの生成に関与する種々のクローニングステップの図である。

【図2】図２は、種々のオープンリーディングフレームの位置、例示的なＥ３の部分欠失および全欠失のエンドポイント、ならびに領域において異種配列を挿入することができる代表的な位置を示す、Ａｄ４のＥ３領域の図である。

【図3】図３は、アデノウイルスゲノムにおける種々の転写単位の位置を示す図である。

【図4】４つの異なるＡｄ４ Ｈ５−ＨＡウイルスに感染させたＡ５４９細胞のヘマグルチニン発現のウエスタンブロットによる検出。Ａ５４９細胞（６ウェルプレートで５０〜７０％コンフルエント）を２．５×１０^７ｖｐ／ｍＬの各ウイルスに感染させ、ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃でインキュベートした。２４時間または４８時間後のいずれかに全細胞ライセートを調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ニトロセルロースに移し、抗体でブロットをプローブし、ＨＡ、βアクチン、およびαチューブリンを図示するように検出した。マーカーレーンおよび対照（どちらも未感染および無関係の組換えウイルスである）もまた同定された。非最適化ＣＭＶウイルスであるＰＸＶＸ０１１３が大幅により低いレベルのＨＡを発現したことを除いて、全ての組換えウイルスがＨＡを強く発現した。

【図5】図５は、ウエスタンブロット分析によって検出された、本発明の２つの異なるアデノウイルスベクターからのインフルエンザＨＡタンパク質の発現を示す。ＰＸＶＸ０１０１ベクターは、Ｅ３の部分欠失と、ＨＡをコードする異種配列とを含有し、異種配列はＥ３の部分欠失に挿入され、かつ内因性ＭＬＰの制御下にある。ＰＸＶＸ０１１１ベクターは、Ｅ３の全欠失と、ＨＡをコードする異種配列とを含有し、異種配列は、Ｅ３欠失の近位に挿入され、かつＣＭＶプロモーターを含む。

【図6】図６は、ＰＸＶＸ０１０１に感染させたＡ５４９細胞のＨ３ ＨＡ抗原およびアデノウイルスタンパク質についてのリアルタイムＰＣＲ分析によるｍＲＮＡ発現を示す。

【図7】図７は、Ａ５４９細胞をＰＸＶＸ０１０１およびＰＸＶＸ０１１１に感染させた、ＦＡＣＳアッセイにおけるＨＡの表面発現を示す。

【図8A】本発明のアデノウイルスベクターの生成を調べるために使用することができるワンステップ増殖アッセイを説明するフローチャートを示す。

【図8B】３つの異なる細胞株におけるＰＸＶＸ０１０１およびＰＸＶＸ０１１１についてのワンステップ増殖アッセイの結果を示す。

【図9A】インフルエンザウイルスに感染させたＡ５４９細胞上の赤血球の凝集を示す。

【図9B】ＰＶＸＶ０１０１に感染させたＡ５４９細胞上の赤血球の凝集を示す。

【図10】図１０は、キメラヘキソンコード配列を作製するために使用することができるヘキソン配列の作製に関与する種々のクローニングステップの図である。

【図11】図１１は、キメラ配列を構築するために使用されるヘキソンコード配列におけるヘキソンＨＶＲ１〜６領域の位置の図である。

【図12】図１２は、ヘキソンＨＶＲ配列を置換するために使用することができる種々のインフルエンザのエピトープ配列を表す。Ｈ５ Ｍ２ｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３９〜３４１）、Ｈ７ Ｍ２ｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４２〜３４３）、Ｈ９ Ｍ２ｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４４〜３４５）、ヒトＭ２ｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４６〜３４７）、ＮＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４８〜３４９）、マトリックスＣＴＬ５８〜６６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５０〜３５１）。

【図13】図１３は、一連のキメラＡｄ４のヘキソンコンストラクトを表し、どのＨＶＲを、インフルエンザＭ２、マトリックス、および／もしくはＮＰ配列、または他のＡｄ７ ヘキソンＨＶＲ配列で置換することができるかを示す。

【図14】図１４は、ＰＸＶＸ０１０３およびＰＸＶＸ０１１６組換えアデノウイルスによって誘発された、マウスにおけるＨＡ特異的抗体応答を表す。

【図15】Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎベクター設計の略図（ＰＸＶＸ０１０３）。多塩基ドメインを除去したＨ５ ＨＡの天然コード配列は、Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１１９４／２００４インフルエンザウイルスに由来し、Ａｄ４ウイルスのＥ３遺伝子領域に挿入した。ＨＡ導入遺伝子を収容するようにＡｄ４ウイルスのＥ３ ２４．８Ｋ、Ｅ３ ６．８Ｋ、およびＥ３ ２９．７Ｋ遺伝子を欠失させ、ＨＡ導入遺伝子の発現を駆動するためにＥ３ ２４．８Ｋのスプライスアクセプター部位を保持した。Ａｄ５に由来するＥ３Ａポリアデニル化シグナル配列をＨＡコード配列の下流に配置した。

【図16】（Ａ）Ｈ５ ＨＡの細胞表面発現を示すＰＸＶＸ０１０３の性質決定。マウス抗トリＨ５モノクローナル抗体（クローン１９Ｃ１１、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌ）を用いた表面染色の前に、（図示するような）異なるレベルのＰＸＶＸ０１０３に１×１０^６のＡ５４９細胞を４８時間感染させることにより、ＨＡ（Ｈ５−Ｖｔｎ）の表面発現を確認した。検出には、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ二次抗体を用いた。Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ感染細胞（線）と比較するための対照としてＡｄ４野生型（影付きの領域）を使用した。Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎの量を増加することによる右側への有意な推移は、細胞が細胞表面上で強いレベルのＨ５タンパク質を発現していることを示唆する。（Ｂ）（Ａ）でフローサイトメトリーに使用した同じ試料のウエスタン分析

【図17】ウイルスに感染した感染Ａ５４９細胞の赤血球ロゼット形成によって示されるように、ＰＸＶＸ０１０３から発現された組換えＨＡ（Ｖｔｎ）は機能的である。（Ａ）ＰＸＶＸ０１０３または（Ｂ）Ａｄ４野生型に２４時間感染させ、洗浄し、次いで、ヒトドナー赤血球（ＲＢＣ）の存在下でインキュベートしたＡ５４９細胞の代表的な写真。Ａ５４９細胞表面（大きな細胞）上のウイルス発現ＨＡとＲＢＣ（小さな細胞）の表面上に見られるＮ−アセチルノイラミン酸（細胞に見られる優勢なシアル酸）との間の相互作用の徴候としてのロゼットを白い矢印で示す。これは、ＨＡが正しく折り畳まれている場合にのみ生じる。

【図18】種々のヒト細胞株におけるＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）ウイルスの増殖は、Ａｄ４野生型ウイルスに比べて減弱化される。いくつかのヒト細胞株において、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルスの増殖をＡｄ４野生型ウイルスの増殖と比較した：Ａ５４９（肺癌：Ａ）、Ｈ１２９９（肺癌：Ｂ）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌：Ｃ）、ＨｕＴｕ８０（十二指腸腺癌：Ｄ）、およびＭＲＣ−５（胚性肺線維芽細胞：Ｅ）。

【図19】Ａｄ４野生型による免疫後のＡｄ４特異的中和抗体力価（Ａ）およびＡｄ４特異的細胞性免疫（Ｂ）。マウス１匹当たり１×１０^９ｖｐのＡｄ４野生型ウイルスを用いてマウスを鼻腔内免疫し、ベクターに対する既存の免疫を確立した。免疫から４週間後、１０匹の個別のマウスを出血させ、Ａｄ４特異的中和抗体力価を決定した（Ａ）。２匹のマウスを屠殺し、脾細胞をプールし、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによるアッセイでＡｄ４野生型ウイルス特異的細胞性免疫を決定した（Ｂ）。

【図20】Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンで誘発したＨＡＩ抗体力価（Ａ）およびＨＡ特異的細胞性免疫応答（Ｂ）は、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンによる免疫およびＨ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジ後に増強された。マウスのグループをＡｄ４野生型ウイルスで免疫（前処理）して既存の免疫を確立した。その後、マウス１匹当たり１×１０^９、１×１０^８、１×１０^７、および１×１０^６ｖｐＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンの用量漸増法を用いて、前処理したマウスおよび未処理のマウスを鼻腔内免疫し、ワクチンによる免疫から６週間後、およびＨ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジから５日後に再び出血させてＨＡＩ抗体力価を決定した。グループから３匹のマウスを出血させ、血清をプールしてＨＡＩ抗体力価を決定した（Ａ）。Ｈ５Ｎ１によるチャレンジの前および後の同時点に２匹のマウスも屠殺し、脾細胞をプールして、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いた評価により４つのＨ５ ＨＡ（Ｖｔｎ）由来の１５ｍｅｒペプチドに特異的なＨ５ ＨＡ特異的細胞性免疫を決定した（Ｂ）。Ａｄ４野生型ウイルスで前処理し、Ｈ５Ｎ１リアソータントウイルスをチャレンジしたマウスは、インフルエンザウイルスによるチャレンジから５日後に、検出可能なＨＡＩ抗体力価およびＨ５ＨＡ特異的細胞応答を示さなかった。

【図21】より高い用量のＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンで免疫したマウスは、体重が減少せず（Ａ）、致死的なＨ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジを生き抜き（Ｂ）、肺におけるＨ５Ｎ１リアソータントウイルスの減少を示した（Ｃ）。マウスのグループをＡｄ４野生型ウイルスで免疫して既存の免疫を確立した。その後、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンの用量漸増法を用いてマウスを鼻腔内免疫した。Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンによる免疫から６週間後、致死量のＨ５Ｎ１リアソータントウイルスをマウスにチャレンジした。マウスの体重を毎日評価し（Ａ）、マウスの生存を１４日の期間にわたって評価し（Ｂ）、Ｈ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジから５日後、マウスのサブセットから肺を回収して、インフルエンザ特異的なウイルス力価を非免疫マウスに対するウイルス力価の減少の割合（％）として表して決定した（Ｃ）。

【図22】Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）は、複数の投与経路で送達されたとき、ウサギにおいてＨ５ ＨＡ導入遺伝子に対する免疫応答を誘発した。最初の免疫から１４日後（Ａ）または４３日後（２回目の免疫から１４日後を意味する）（Ｂ）のいずれかに収集した血液試料のＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡのデータをエンドポイント決定により分析し、その分析結果を表（Ｃ）に示す。

【図23】Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）インフルエンザワクチンは、舌下、膣内、および直腸内経路で送達されると、マウスにおいて有意なＨ５ ＨＡ特異的抗体応答を誘発する。舌下（Ａ）、膣内（Ｂ）、または直腸内（Ｃ）投与経路による、組換えＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルス粒子を用いた２回目の免疫から２〜４週間後に収集した血液試料のＥＬＩＳＡアッセイを行った。

【図24】ｒＡｄ４ベクターに感染させたＡ５４９細胞に由来する可溶性（ＰＡ）および細胞性（ＰＡ＋ＧＰＩ）の両方の組換えＰＡのウエスタン分析による証明。ｒＡｄ４−ＰＡに感染させたＡ５４９細胞の全細胞ライセート（左パネル）または細胞培養上清（右パネル）をウエスタンブロットで分析し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。抗ＰＡマウスモノクローナル抗体でニトロセルロース膜をプローブした。陽性対照として並行して使用した市販の組換えＰＡ（ｒＰＡ）を参照して組換えタンパク質の発現の確認を行った。Ａ５４９およびＡｄ４野生型ウイルス（Ａｄ４ ＷＴ）に感染させたＡ５４９は陰性対照を表し、ｒＰＡに対する特異性を示す。総タンパク質レベルを用いた相対的な量としてタンパク質レベルを表す。

【図25】Ａｄ４−ＰＡに感染したＡ５４９細胞上で検出されたｒＰＡの細胞表面発現。Ａ５４９細胞をＭＯＩ１００で感染させ、培養の２４時間後、ＦＡＣＳ分析によりＰＡ特異的モノクローナル抗体を用いてＰＡの細胞表面発現を測定した。グループの各々の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を右側に示す。

【図26】ＰＸＶＸ０２１２およびＰＸＶＸ０２１４組換えＡｄ４−ＰＡアデノウイルスは、２つのヒト細胞株においてＡｄ４野生型と比較して増殖の減弱化を示す。Ａ５４９（肺癌）およびＭＲＣ−５（胚性肺線維芽細胞、二倍体）細胞のいずれかのｒＡｄ４−ＰＡウイルス感染後、ｒＡｄ４レベルの経時変化をＴＣＩＤ_５０により測定した。最小感染価レベルを参照として細胞バーストサイズを計算し（Ａ５４９は１時間、ＭＲＣ−５は２４時間）、感染における相違を補正した。

【図27】ｒＡｄ４に感染させたＡ５４９の細胞ライセートは致死毒素によるチャレンジからマウスを防御する。５×１０^８ウイルス粒子のＡｄ４野生型（Ａｄ４ ＷＴ）、組換えＡｄ４−ＰＡ、または組換えＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩに感染させた５×１０^６細胞と同等の全細胞ライセートの腹腔内注射（ＩＰ）により、マウス（動物６匹／グループ）を免疫した。陽性対照として、１０μｇのｒＰＡを皮下に（Ｓ．Ｃ．）投与した。免疫から５週間後、致死毒素（１２０μｇのＰＡと６０μｇの（ＬＦ）の組み合わせ）をマウスの静脈内にチャレンジし、毎日監視した。

【図28】ｒＡｄ４−ＰＡに感染させたＡ５４９細胞ライセートのＩＰ送達後にｒＰＡに対する抗体応答が検出された。組換えＡｄ４−ＰＡアデノウイルスに感染させたＡ５４９細胞の全細胞ライセートで腹腔免疫したマウスから得た血清において抗体応答を測定した。ＥＬＩＳＡ（左パネル）およびインビトロでのマウスマクロファージに基づく毒素中和アッセイ（右パネル）の両方により、免疫から２１日後に抗体応答を測定した。動物６匹／グループからＥＣ_５０を計算した。

【図29】精製したｒＡｄ４ ＰＡウイルスを用いたマウスの鼻腔内免疫後に行った致死的チャレンジ実験の略図。０日目に５つの異なる抗原のうちの１つでマウスを免疫した（ｎ＝２５／グループ）。野生型Ａｄ４ウイルスを陰性対照に用いて、動物１匹当たり５０〜６２．５μＬのＰＢＳ中１×１０^１０ウイルス粒子（ｖｐ）としてｒＡｄ４ウイルスを鼻腔内に（Ｉ．Ｎ．）投与した。皮下注射された陽性対照である最終容量１００μＬのＰＢＳは、１０μｇの組換え防御抗原（ｒＰＡ）を単独で、または水酸化アルミニウムゲル（Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ ＨＰＡ）１ｍｇに吸収させたｒＰＡ１０μｇのいずれかを含有した。免疫から２７日後に、マウス２匹／グループからプールした脾細胞において細胞性免疫（ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴ）を測定した。毒素による１回目のチャレンジ（免疫から２０日後、ｎ＝１０／グループ）で生き残ったマウスを５４日目に細胞性免疫についてアッセイした。免疫から１４日後および４０日後に、同じ９匹の動物／グループ（５グループ）をＥＬＩＳＡおよび毒素中和アッセイの両方のために出血させた。免疫から４６日後に、１グループ当たり合計１０匹のマウスにも、致死毒素（１２０μｇのＰＡと６０μｇの致死因子の組み合わせ）をチャレンジした。チャレンジから３０日間生存を監視した。

【図30】精製したＡｄ４−ＰＡおよびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩウイルスを用いた鼻腔内免疫から１４日後および４０日後に、血清中の抗体応答を測定した。ＥＬＩＳＡにより分析した抗ＰＡ ＩｇＧ反応を左パネルに示し、インビトロでのマウスマクロファージに基づく毒素中和アッセイにより測定した毒素中和抗体（ＴＮＡ）を右パネルに示す。試料の段階希釈のデータに合致するＳ字形の用量反応曲線を用いてＥＣ_５０を計算した。

【図31】生存曲線は、ｒＡｄ４−ＰＡウイルスで免疫した場合に、マウスが致死毒素によるチャレンジから防御されたことを示す。０日目に５つの異なる免疫原（ｒＰＡ、ｒＰＡ＋アラム、Ａｄ４野生型、Ａｄ４−ＰＡ、およびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩ）のうちの１つでマウス（ｎ＝１０／グループ）を免疫し、免疫から２０日後および４６日後に致死毒素（全容量１００μＬのＰＢＳ中の６０μｇのＰＡおよび３０μｇのＬＦ）をチャレンジした。生存を３０日間監視した。左パネルは、免疫から２０日後のチャレンジの後の生存率を示す。右パネルは、免疫から４６日後のチャレンジの後の生存率を示す。

【図32】ｒＡｄ４−ＰＡウイルスによるマウスの免疫は、致死毒素によるチャレンジ後に検出される細胞媒介性免疫応答を誘発する。免疫から２７日後に、０日目に５つの異なる免疫原（ｒＰＡ、ｒＰＡ＋アラム、Ａｄ４野生型、Ａｄ４−ＰＡ、およびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩ）のうちの１つで免疫したマウス（マウス２匹／グループ）からプールした脾細胞において細胞媒介性免疫応答（ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴ）を測定した。１回目のチャレンジで生き残ったマウス（免疫から２０日後、ｎ＝１０／グループ）を５４日目（チャレンジから３４日後）に細胞性免疫応答についてアッセイした。左パネル：ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されたＴｈ１応答。右パネル：ＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されたＴｈ２応答。

【図33】Ａｄ４−ＣＭＶ−ＨＴＬ２４（ＰＸＶＸ０１０９）の５２．５Ｋポリペプチドの発現。（Ａ）各々がＧＰＧＰＧスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５３）によって分離された、２４個のインフルエンザヘルパーエピトープを含有するＨＴＬ２４ポリペプチド遺伝子の略図。（Ｂ）Ｅ３領域の全欠失を含み、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＨＴＬ２４の発現を伴う、組換えＡｄ４ウイルス（ＰＸＶＸ０１０９）に感染させたＡ５４９細胞の細胞ライセートのウエスタンブロット分析。陽性対照として、Ａ５４９細胞をＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様）インフルエンザ（ＮＹＭＣ Ｘ−１７５Ｃリアソータント、ＮＩＢＳＣ）に感染させた。５２．５ｋＤａで移動するバンドによって示されるように、ＰＶＸＶ０１０９組換えアデノウイルスはＨＴＬ２４ポリペプチドを十分に発現する。

【発明を実施するための形態】

【0020】

詳細な説明
本明細書で用いられる場合、以下の用語は以下の意味を有するものとする。

【0021】

「アデノウイルスベクター」という用語は、野生型、変異体、および／または組換えアデノウイルスゲノム、ならびにそのようなゲノムを含むアデノウイルスを指す。アデノウイルスベクターは、いかなるアデノウイルス血清型、およびそれらの組み合わせ（すなわち、ハイブリッドゲノム）のゲノムの全てまたは一部も含むことができる。

【0022】

「感染性病原体」という用語は、ヒトに感染することが可能であり、健康の悪化を引き起こす、および／または免疫応答の引き金となる、あらゆる作用物質を指す。特定の実施形態において、感染性病原体は、インフルエンザウイルス、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト内因性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ−Ｋ））、ヒト内因性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ−Ｋ）、パピローマウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎、ポリオウイルス）、ヘパドナウイル（例えば、Ｂ型肝炎）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス）、トガウイルス（例えば、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）ウイルス、西部ウマ脳炎（ＷＥＥ）ウイルス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、サイトメガロウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス、肺炎ウイルス、細気管支炎ウイルス、風邪ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス）、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、カリシウイルス（例えば、ノロウイルス）、またはレオウイルス（例えば、ロタウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１および２型）等のウイルスである。

【0023】

他の実施形態において、感染性病原体は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、または他の種類の細菌等の原核生物である。そのような原核生物は、限定されないが、バチルス（例えば、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、マイコバクテリウム（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌｅｐｒａｅ））、赤痢菌（例えば、ソンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ））、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）（例えば、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、メチシリン耐性、多剤耐性、またはオキサシリン耐性の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、連鎖球菌（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ））、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ））、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｕｍ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ））、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えば、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ））、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）（例えば、セパシア菌群（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ））、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）（例えば、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））、ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、ＥＴＥＣ、ＥＨＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＩＥＣ、およびＥＡＥＣ等の毒素原性、腸管出血性、または志賀毒素産生大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）））を含む。

【0024】

さらに他の実施形態において、感染性病原体は真核生物である。真核生物の例として、限定されないが、マラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、下痢性マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｄｉａｒｒｈｅａ）等の原生生物、ならびにカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）（例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ））、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）（例えば、ニューモシスチス肺炎菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ））、およびコクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）（例えば、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ））等の真菌が挙げられる。

【0025】

「癌」という用語は、特定の細胞集団の増殖における異常な増加によって特徴付けられる医学的状態を指す。癌性細胞は、例えば、皮膚、筋肉、肺、心臓、肝臓、腎臓、神経組織等を含む、いかなる組織または器官にも由来し得る。特定の実施形態において、癌は良性（例えば、良性腫瘍）である。他の実施形態において、癌は悪性（例えば、悪性腫瘍）である。特定の実施形態において、癌は転移性である（すなわち、癌細胞が、それらの元の場所から別の組織または器官へと移動することができる）。

【0026】

本明細書全体にわたり、必要に応じて、さらなる用語が定義されるものとする。

【0027】

本発明は、組換えアデノウイルスワクチンを対象とする。本発明は、異種配列を高レベルで発現する新規組換えアデノウイルスベクターの開発に一部基づいている。本発明はまた、宿主の免疫応答を向上させ、かつ既存の中和抗体を回避するように設計される新規組換えアデノウイルスベクターの開発にも一部基づいている。本発明はまた、抗原特異的および／または普遍的なインフルエンザワクチンとして使用される新規組換えアデノウイルスベクターの開発にも一部基づいている。

【0028】

したがって、一態様において、本発明は、第１の異種配列を含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書で用いられる場合、「異種配列」は、アデノウイルスベクターに組み込まれると、アデノウイルス配列と核酸配列との非自然発生型の並置を作製する核酸配列である。典型的には、異種配列は、非アデノウイルスを起源とする核酸配列を含む。例えば、異種配列は、完全に、ほとんど、または部分的に非アデノウイルス（例えば、アデノウイルスおよび非アデノウイルス配列のモザイク）起源であってもよい。しかしながら、いくつかの場合において、異種配列は、完全にアデノウイルス起源であってもよく、例えば、ある種類のアデノウイルスに由来するアデノウイルス配列が、異なる種類のアデノウイルスから作製されたアデノウイルスベクターに組み込まれてもよい。例えば、ある種類のアデノウイルスに由来するヘキソンまたはファイバータンパク質をコードするアデノウイルス配列は、異なる血清型に由来するファイバータンパク質を有する組換えアデノウイルスならびに／またはキメラヘキソンおよびファイバータンパク質を有するアデノウイルスを生成するために、異なる種類のアデノウイルスから作製されたアデノウイルスベクターに組み込まれてもよい。第１の異種配列を含むアデノウイルスベクターは、例えば、感染性病原体または癌性細胞に対するワクチンとして有用であり得る。したがって、第１の異種配列は、感染性病原体由来の抗原をコードすることができる。代替として、第１の異種配列は、癌性細胞と関連する抗原をコードすることができる。

【0029】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、感染性病原体によって生成されるタンパク質の全てまたは一部をコードする。タンパク質またはその断片（例えば、切断生成物、構造ドメイン、二次構造の単位（複数可）、Ｂ細胞エピトープ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープ等）は、感染性病原体の表面上に位置していてもよい。例えば、タンパク質またはその断片は、高度に抗原性であってもよく、細胞標的に関与してもよく、かつ／または細胞内移行に関与してもよい。代替として、タンパク質またはその断片（例えば、切断生成物、構造ドメイン、二次構造の単位（複数可）、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープ等）は、感染性病原体の内部に位置していてもよい。例えば、タンパク質またはその断片は、細胞内タンパク質、エンベロープウイルスのカプシドまたはコアタンパク質、非エンベロープウイルスのコアタンパク質等であってもよい。

【0030】

特定の実施形態において、エピトープ、構造ドメイン、二次構造の単位は、進化的に保存される。本明細書で用いられる場合、「進化的に保存される」という用語は、多様な一連の特定の感染性病原体株の間で、配列が少なくとも約５０％保存されることを意味する。ウイルスに関して、多様な一連の株は、感染することが可能であり、それによってワクチンの標的集団において疾患もしくは疾病を引き起こす、同定された各細分類（例えば、血清型）に由来する少なくとも１つの分離株か、またはそのような株における既知の多様性を包含する代表的な数の感染性分離株を含む。例えば、特定の実施形態において、多様な一連のインフルエンザ株は、Ｈ１Ｎ１株（例えば、Ａ／Ｗｉｌｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈ／３３、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ Ｋｏｒｅａ／Ｓ１０／２００４、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８、Ａ／Ｐｕｒｅｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０８／２００９、Ａ／Ｔｅｘａｓ／０４／２００９、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ／１８７８９／０２、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｌｂｅｒｔａ／１３０／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｌｂｅｒｔａ／２００１、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｔｅｓ ｄ'Ａｒｍｏｒ／１４８２／９９、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｂｅｔｚｉｇ／２／２００１、および／またはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｇｅｒｍａｎｙ／３／９１）、Ｈ３Ｎ２株（例えば、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９）、Ｈ２Ｎ２株（例えば、Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０、Ａ／Ｃａｎａｄａ／７２０／０５、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＮＹ／６７５０／７８、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｐｏｔｓｄａｍ／１７７−４／８３、および／またはＡ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／９５／２００１）、Ｎ３Ｎ２株（例えば、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６６、Ａ／Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ／０３／２００４、Ａ／Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ／１２９／２００５、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／０１−ｌｉｋｅ、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ｓ９／２００３、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｔｅｘａｓ／４１９９−２／９８、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｈｉｏ／３１３０５３／２００４、および／またはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１２３４４／０３）、Ｈ５Ｎ１株（例えば、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／２／０３、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｕｎａｎ／１１４／０５、Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４、Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／ＤＴ−０３６／２００５、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２３２１／２００７、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／３３００−ＮＡＭＲＵ３／２００８、Ａ／ｇｒｅｂｅ／Ｎｏｖｏｓｉｂｉｒｓｋ／２９／２００５、Ａ／Ｂａｒ−ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｍｏｎｄｏｌｉａ／１／０５、Ａ／ｃａｔ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／ＫＵ−０２／０４、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１３／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１７４／０４、および／またはＡ／ＨＫ／１５９／９７）、Ｈ６Ｎ１株（例えば、Ａ／ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９）、Ｈ６Ｎ２株（例えば、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０１３９／２００１、および／またはＡ／ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ／Ｓｗｅｄｅｎ／３／２０００）、Ｈ６Ｎ９株（例えば、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ２１７／９７）、Ｈ７Ｎ１株（例えば、Ａ／ＦＰＶ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４）、Ｈ７Ｎ３株（例えば、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ／０４、および／またはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２２０１５８／２００２）、Ｈ７Ｎ７株（例えば、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／１／２００３、Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／０３、Ａ／ＦＰＶ／Ｄｏｂｓｏｎ／２７、および／またはＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＦＰＶ／Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ）、Ｈ９Ｎ２株（例えば、Ａ／ｓｈｏｒｅｂｉｒｄ／Ｄｅｌａｗａｒｅ／９／９６、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｋｏｒｅａ／Ｓ４５２／２００４、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｙ４３９／９７、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９、Ａ／ＨＫ／２１０８／２００３、Ａ／ｑｕａｉｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ１／９７、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｙ２８０／９７、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ ＨＫ／ＦＹ２３／０３、および／またはＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ ＨＫ／Ｇ９／９７）、ならびにインフルエンザＢ型株（例えば、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）を含む、ヒト、ブタ、および／またはトリの疾患と関連する代表的な株を含む。特定の実施形態において、多様な一連のインフルエンザ株は、前述の株の全て、ならびにヒト、ブタ、またはトリにおける疾患と関連していることが分かっているさらなるインフルエンザ株を含む。細菌、原生生物、真菌等の細胞の病原体については、多様な一連の株は、感染することが可能であり、それによってワクチンの標的集団において疾患もしくは疾病を引き起こす、各種からの少なくとも１つの分離株か、またはそのような株における既知の多様性を包含する代表的な数の感染性分離株を含む。特定の実施形態において、エピトープおよび／または構造モチーフは、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上保存される。

【0031】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、感染性病原体によって生成されるタンパク質に存在する複数のエピトープ（例えば、Ｂ細胞、ＣＴＬ、もしくはＨＴＬエピトープ）および／または構造モチーフ（例えば、タンパク質ドメイン、もしくは二次構造の単位）をコードする。特定の実施形態において、複数のエピトープおよび／または構造モチーフのうちの１つまたは複数が進化的に保存される。特定の実施形態において、第１の異種配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上のエピトープおよび／または構造モチーフをコードする。複数のエピトープおよび／または構造モチーフは、単一のタンパク質または複数のタンパク質に由来してもよい。特定の実施形態において、複数のエピトープおよび／または構造モチーフは、単一のエピトープまたは構造モチーフの多量体からなるか、またはそれを含む。他の実施形態において、複数のエピトープおよび／または構造モチーフは、異なるエピトープおよび／または構造モチーフの多量体を含む。例えば、多量体は、単一のタンパク質からの２つ以上のエピトープおよび／もしくは構造モチーフ、または２つ以上のタンパク質の各々からの１つもしくは複数のエピトープおよび／もしくは構造モチーフを含むことができる。本明細書で用いられる場合、「多量体」は、単一のより大きなポリペプチドを形成するように一緒に結合された一連の別々のポリペプチドを含むタンパク質配列である。特定の実施形態において、リンカー配列が、多量体の隣接した別々のポリペプチドを接続するために使用される。当業者は、多量体におけるリンカーとして作用することができる短いペプチド配列を容易に同定することができる。

【0032】

特定の実施形態において、複数のエピトープは複数のＨＴＬエピトープを含み、各ＨＴＬエピトープはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む。本明細書で用いられる場合、「ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド」は、ＨＬＡクラスＩＩ分子にＩＣ_５０＜１０００ｎＭで結合するペプチドである。一般的に、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、約６〜約２５アミノ酸長、または約１３〜約２１アミノ酸長である。特定の実施形態において、上記複数のＨＴＬエピトープのうちの１つまたは複数は、以下からなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１００１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３３３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４４７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５−０２０２。特定の実施形態において、上記複数のＨＴＬエピトープのうちの１つまたは複数は、例えば、Ｄｏｙｔｃｈｉｎｏｖａ ａｎｄ Ｆｌｏｗｅｒ（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：７０８５および／またはＳｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３３６３に記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ９スーパータイプ変異体からなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む。特定の実施形態において、上記複数のＨＴＬエピトープのうちの１つまたは複数は、複数（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む。複数のＨＬＡクラスＩＩ分子は、例えば、以下からなる群から選択されてもよい：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１００１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３３３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４４７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５−０２０２。特定の実施形態において、上記複数のＨＴＬエピトープのうちの１つまたは複数は、例えば、Ｄｏｙｔｃｈｉｎｏｖａ ａｎｄ Ｆｌｏｗｅｒ（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：７０８５および／またはＳｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３３６３に記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ９スーパータイプ変異体からなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む。特定の実施形態において、複数のＨＴＬエピトープは、以下からなる群の各ＨＬＡクラスＩＩ分子に集団的に結合するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１００１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３３３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４４７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０２１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５−０２０２。特定の実施形態において、上記複数のＨＴＬエピトープのうちの１つまたは複数は、例えば、Ｄｏｙｔｃｈｉｎｏｖａ ａｎｄ Ｆｌｏｗｅｒ（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：７０８５および／またはＳｏｕｔｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３３６３に記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ９スーパータイプ変異体からなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む。

【0033】

特定の実施形態において、複数のエピトープは複数のＣＴＬエピトープを含み、各ＣＴＬエピトープはＨＬＡクラスＩ結合ペプチドを含む。本明細書で用いられる場合、「ＨＬＡクラスＩ結合ペプチド」は、ＨＬＡクラスＩＩ分子にＩＣ_５０＜５００ｎＭで結合するペプチドである。一般的に、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、約８〜約１３アミノ酸長、または約８、９、１０、もしくは１１アミノ酸長である。特定の実施形態において、上記複数のＣＴＬエピトープのうちの１つまたは複数は、例えば、Ｓｉｄｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１に記載されるように、ＨＬＡ−Ａ０１、ＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ０３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ０７、ＨＬＡ−Ｂ０８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−Ｂ６２およびＨＬＡ−Ｂ４４スーパータイプ変異体からなる群から選択されるＨＬＡクラスＩ分子に結合するＨＬＡクラスＩ結合ペプチドを含む。特定の実施形態において、上記複数のＣＴＬエピトープのうちの１つまたは複数は、複数（例えば、少なくとも２、３、４、５、または６）のＨＬＡクラスＩ分子に結合するＨＬＡクラスＩ結合ペプチドを含む。例えば、ＣＴＬエピトープは、以下に結合することができる：複数のＨＬＡ−Ａ０１スーパータイプ変異体（例えば、Ａ＊０１０１、Ａ＊２６０１、Ａ＊２６０２、Ａ＊２６０３、Ａ＊２９０２、Ａ＊３００１、Ａ＊３００２、Ａ＊３００３、Ａ＊３００４、およびＡ＊３２０１からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ａ０２スーパータイプ変異体（例えば、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊０２１４、Ａ＊０２１７、Ａ＊６８０２、およびＡ＊６９０１からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ａ０３スーパータイプ変異体（例えば、Ａ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１、Ａ＊６６０１、Ａ＊６８０１、およびＡ＊７４０１からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ａ２４スーパータイプ変異体（例えば、Ａ＊２３０１、Ａ＊２４０２、およびＡ＊２９０２からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ｂ０７スーパータイプ変異体（例えば、Ｂ＊０７０２、Ｂ＊０７０３、Ｂ＊０７０５、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊４２０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５１０２、Ｂ＊５１０３、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１、Ｂ＊５５０２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、およびＢ＊７８０１からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ｂ０８スーパータイプ変異体（例えば、Ｂ＊０８０１およびＢ＊０８０２からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ｂ２７スーパータイプ変異体（例えば、Ｂ＊１４０２、Ｂ＊１５０３、Ｂ＊１５０９、Ｂ＊１５１０、Ｂ＊１５１８、Ｂ＊２７０２、Ｂ＊２７０３、Ｂ＊２７０４、Ｂ＊２７０５、Ｂ＊２７０６、Ｂ＊２７０７、Ｂ＊２７０９、Ｂ＊３８０１、Ｂ＊３９０１、Ｂ＊３９０２、Ｂ＊３９０９、Ｂ＊４８０１、およびＢ＊７３０１からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ｂ４４スーパータイプ変異体（例えば、Ｂ＊１８０１、Ｂ＊３７０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０２、Ｂ＊４４０３、およびＢ＊４５０１からなる群から選択される）；複数のＨＬＡ−Ｂ５８スーパータイプ変異体（例えば、Ｂ＊１５１６、Ｂ＊１５１７、Ｂ＊５７０１、Ｂ＊５７０２、Ｂ＊５８０１、およびＢ＊５８０２からなる群から選択される）；または複数のＨＬＡ−Ｂ６２スーパータイプ変異体（例えば、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０２、Ｂ＊１５１２、Ｂ＊１５１３、Ｂ＊４６０１、およびＢ＊５２０１からなる群から選択される）。特定の実施形態において、複数のＣＴＬエピトープは、ＨＬＡ−Ａ０１、ＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ０３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ０７、ＨＬＡ−Ｂ０８、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−Ｂ６２およびＨＬＡ−Ｂ４４スーパータイプのうちの各々に由来する、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ分子に集団的に結合するＨＬＡクラスＩ結合ペプチドを含む。

【0034】

ヒト試験は、細胞性免疫応答がインフルエンザ感染の制御に関与することを示している。例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３０９（１）：１３；Ｓｏｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ １５１（１）：８１を参照のこと。細胞性免疫応答の防御効果は、高齢者（例えば、Ａｌｍａｎｚａｒ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｗｉｅｎ．Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ １５７／５−６：１１６，ＭｃＥｌｈａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：６３３３を参照）、そして小さい子供（例えば、Ｆｏｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（７）：１０４２）において特に意義があり得る。特定されたエピトープに特異的な免疫原性を評価するために、ヒトドナー末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびペプチドを用いてリコール反応を行うことができる。エピトープ特異的リコール反応は以前のインフルエンザウイルス感染の結果であり、そのようなＴ細胞の存在は、エピトープが自然に産生され、したがって、ワクチン組み入れのための優良な選択となることを示唆すると想定することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列によってコードされるＣＴＬまたはＨＴＬエピトープは、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でバックグラウンド応答の少なくとも２倍は高い、例えば３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、２５００、３０００、またはそれ以上の、ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答（具体的には、１×１０^６細胞当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ））を生じる能力を有する。選択されたＣＴＬまたはＨＴＬペプチドは、二通りに検査することができる：（１）エクスビボで直接ＰＢＭＣを解凍し、培地中で５日間休ませ、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより応答を測定する、および（２）ペプチドを用いた培養ステップにしたがって感度を増加させる。示されたエピトープからの有意な応答は、バックグラウンド応答の平均＋（２．０×標準偏差）を超える応答として定義することができる。この方法のためにはバックグラウンド応答を決定することが非常に重要である。バックグラウンド応答は、ドナーが曝露されていない病原体（ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよび熱帯熱マラリア原虫等）由来のスーパータイプＣＴＬおよびＨＴＬ結合ペプチドを用いて決定することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列によってコードされるＣＴＬまたはＨＴＬエピトープは、進化的に保存され、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でバックグラウンド応答の少なくとも２倍は高い、例えば、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、２５００、３０００、またはそれ以上の、ヒトＩＦＮ−γを生じる能力を有する。特定の実施形態において、第１の異種配列によってコードされるＣＴＬまたはＨＴＬエピトープは、進化的に保存され、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でバックグラウンド応答の少なくとも２倍は高い、例えば、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、２５００、３０００、またはそれ以上の、ヒトＩＦＮ−γを生じる能力を有し、それぞれ、ＨＬＡクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子に対する縮重結合（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す（すなわち、１つより多くに結合する）。ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープがＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合してヒトＩＦＮ−γ応答を生じる能力を検査するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、２００７年５月１８日に出願されたＷＯ２００８／０５４５４０号（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００７年７月２３日に出願されたＷＯ２００８／０３９２６７号（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、およびＡｓｓａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：１２２４１に記載されており、これら各々の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

【0035】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする。好適なインフルエンザ抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ２等の表面抗原、またはその断片（例えば、１つまたは複数のＨＴＬまたはＣＴＬエピトープ）であってもよい。他の好適なインフルエンザ抗原は、Ｍ１、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２、またはその断片（例えば、１つまたは複数のＨＴＬまたはＣＴＬエピトープ）を含む。

【0036】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＨＡタンパク質、またはその部分、例えば、外側部分（すなわち、インフルエンザウイルスの外部表面上に位置する部分）、ＨＡ１断片、ＨＡ２断片、または１つまたは複数のエピトープ（例えば、Ｂ細胞、ＨＴＬ、もしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分、断片、またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトドナーＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＨＡのＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１２）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表２に示す群から選択される１つまたは複数のＨＡのＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２〜６７）をコードする。

【0037】

（表１）

ａ）保存率（％）は、５１のインフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２等）からの配列分析に基づく。
ｂ）結合した対立遺伝子の数は、ペプチドによって結合されたＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１からなる群からのＨＬＡクラスＩＩ分子の数を意味する。
ｃ）リコールは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でバックグラウンド応答よりも２倍より高いＩＦＮ−γ応答を示したヒトドナーの数を意味する。

【0038】

（表２）

ａ）結合した対立遺伝子の数は、ペプチドによって結合された特定のＨＬＡスーパータイプからのＨＬＡクラスＩ分子の数を意味する。ＨＬＡ−Ａ１についてはＡ＊１０１、Ａ＊２６０１、Ａ＊２９０２、およびＡ＊３００２を検査し、ＨＬＡ−Ａ２についてはＡ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６、およびＡ＊６８０２を検査し、ＨＬＡ−Ａ３についてはＡ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１を検査し、ＨＬＡ−Ａ２４についてはＡ＊２３０１、Ａ＊２４０２、Ａ＊２９０２、およびＡ＊３００２を検査し、ＨＬＡ−Ｂ７についてはＢ＊０７０２、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１、およびＢ＊５４０１を検査し、ＨＬＡ−Ｂ４４についてはＢ＊１８０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４４０３、およびＢ＊４５０１を検査した。

【0039】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＮＡタンパク質またはその部分、例えば、外側部分（すなわち、インフルエンザウイルスの外部表面上に位置する部分）、断片、またはエピトープ（例えば、１つもしくは複数のＢ細胞、ＨＴＬ、もしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分、断片、またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の１つまたは複数のコピーをコードする（表１を参照）。他の実施形態において、第１の異種配列は、表３に示す群から選択される１つまたは複数のＮＡのＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６〜１０９）をコードする。

【0040】

（表３）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0041】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＭ２タンパク質、またはその部分、例えば、外側部分（すなわち、Ｍ２ｅ、インフルエンザウイルスの外部表面上に位置する部分）、断片、またはエピトープ（例えば、１つもしくは複数のＢ細胞、ＨＴＬ、もしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分、断片、またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。例えば、特定の実施形態において、外側のＭ２部分は、表４に示す配列を有する。第１の異種配列は、２つ以上のＭ２断片または部分（例えば、表４に示す単一のＭ２ｅ配列の２つ以上の反復、または表４に示す２つ以上のＭ２ｅ配列）のコンカテマーをコードすることができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２７、またはそれらの任意の組み合わせを含む反復配列（例えば、４つ全部の配列のうちの少なくとも１つのコピー）をコードする。特定の実施形態において、Ｍ２のエピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析のペプチド再刺激でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の１つまたは複数のコピーをコードする（表１を参照）。他の実施形態において、第１の異種配列は、表５に示す群から選択される１つまたは複数のＭ２のＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０〜８５）をコードする。

【0042】

（表４）

【0043】

（表５）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0044】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＭ１タンパク質、またはその部分、例えば、エピトープ（例えば、１つもしくは複数のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＭ１のＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３〜１７）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表６に示す群から選択される１つまたは複数のＭ１のＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８〜７９）をコードする。

【0045】

（表６）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0046】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＮＰタンパク質、またはその部分、例えば、エピトープ（例えば、１つもしくは複数のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＮＰのＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０〜２６）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表７に示す群から選択される１つまたは複数のＮＰのＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０〜１３９）をコードする。さらに他の実施形態において、第１の異種配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７（すなわち、ＬＥＬＲＳＲＹＷＡＩＲＴＲＳＧＧＮＴＮＱＱＲＡＳ）のＮＰ配列の１つまたは複数のコピーをコードする。

【0047】

（表７）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0048】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＮＳ１タンパク質、またはその部分、例えば、エピトープ（例えば、１つもしくは複数のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＮＳ１のＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７〜２９）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表８に示す群から選択される１つまたは複数のＮＳ１のＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１５２）をコードする。

【0049】

（表８）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0050】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＮＳ２タンパク質、またはその部分、例えば、エピトープ（例えば、１つもしくは複数のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＮＳ２のＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０〜３３）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表９に示す群から選択される１つまたは複数のＮＳ２のＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３〜１６３）をコードする。

【0051】

（表９）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0052】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＰＡタンパク質、またはその部分、例えば、エピトープ（例えば、１つもしくは複数のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＰＡのＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜４０）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表１０に示す群から選択される１つまたは複数のＰＡのＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４〜２０５）をコードする。

【0053】

（表１０）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0054】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＰＢ１タンパク質、またはその部分、例えば、エピトープ（例えば、１つもしくは複数のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＰＢ１のＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１〜５４）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表１１に示す群から選択される１つまたは複数のＰＢ１のＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６〜２６４）をコードする。

【0055】

（表１１）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0056】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長インフルエンザのＰＢ２タンパク質、またはその部分、例えば、エピトープ（例えば、１つもしくは複数のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）をコードする。特定の実施形態において、部分またはエピトープは、進化的に保存された配列に由来する。特定の実施形態において、エピトープは、それぞれ、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する縮重結合を示す、および／または、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析でヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）応答を生じる能力を有する、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。上で論じたように、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープは、単一のＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープが反復している、ならびに／または複数のＨＴＬおよび／もしくはＣＴＬエピトープが一緒に結合している、コンカテマーを形成することができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に示す群から選択される１つまたは複数のＰＢ２のＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５〜６１）をコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、表１２に示す群から選択される１つまたは複数のＰＢ２のＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５〜３０９）をコードする。

【0057】

（表１２）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。

【0058】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１に列挙される複数のＨＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜６１）をコードし、複数のＨＴＬエピトープは、複数のインフルエンザタンパク質由来のエピトープを含む。コードされた配列は、例えば、異なるインフルエンザタンパク質由来のＨＴＬエピトープの多量体をコードすることができる。特定の実施形態において、複数のＨＴＬエピトープは、配列の保存率、結合したＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の数および種類（例えば、幅広いＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に対する結合を確実にするため）、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析のＩＦＮ−γ応答、またはそれらの組み合わせに一部基づいて選択される。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１３に列挙される群から選択される１つまたは複数のＨＴＬエピトープをコードする。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１３に列挙される全てのＨＴＬエピトープの多量体をコードする。

【0059】

（表１３）

ａ）表１の脚注（ａ）を参照のこと。
ｂ）表１の脚注（ｂ）を参照のこと。
ｃ）表１の脚注（ｃ）を参照のこと。

【0060】

他の実施形態において、第１の異種配列は、表２〜３および５〜１２に列挙される複数のＣＴＬエピトープ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２〜３０９）をコードし、複数のＣＴＬエピトープは、複数のインフルエンザタンパク質由来のエピトープを含む。コードされた配列は、例えば、異なるインフルエンザタンパク質由来のＣＴＬエピトープの多量体をコードすることができる。特定の実施形態において、複数のＣＴＬエピトープは、配列の保存率、結合したＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の数および種類（例えば、幅広いＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対する結合を確実にするため）、ヒトＰＢＭＣを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイ分析のＩＦＮ−γ応答、またはそれらの組み合わせに一部基づいて選択される。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１４に列挙される群から選択される１つまたは複数のＣＴＬエピトープをコードする。特定の実施形態において、第１の異種配列は、表１４に列挙される全てのＣＴＬエピトープの多量体をコードする。

【0061】

（表１４）

ａ）表２の脚注（ａ）を参照のこと。
ｂ）Ａｓｓａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：１２２４１

【0062】

第１の異種配列は、本明細書に開示されるいかなる感染性病原体由来の免疫原性タンパク質または抗原もコードすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、第１の異種配列は、ウイルス、細菌、原生生物、および／または真菌由来の免疫原性タンパク質をコードする。一実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、チクングニアウイルス、および／またはデング熱ウイルス由来の免疫原性タンパク質をコードする。別の実施形態において、第１の異種配列は、バチルス（例えば、バチルス・アントラシス）、マイコバクテリウム（例えば、結核菌、らい菌）、赤痢菌（例えば、ソンネ菌、志賀赤痢菌、シゲラ・フレックスネリ）、連鎖球菌、および／または大腸菌（例えば、毒素原性、腸管出血性、または志賀毒素産生大腸菌）由来の免疫原性タンパク質をコードする。別の実施形態において、第１の異種配列は、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、および／または腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）由来の免疫原性タンパク質をコードする。さらに別の実施形態において、第１の異種配列は、バークホルデリア（例えば、セパシア菌群）、シュードモナス（例えば、緑膿菌）、クロストリジウム（例えば、ボツリヌス菌、破傷風菌、クロストリジウム・ディフィシル）、ブドウ球菌（例えば、メチシリン耐性、多剤耐性、またはオキサシリン耐性の黄色ブドウ球菌）、腸球菌（例えば、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ））、連鎖球菌（例えば、肺炎連鎖球菌、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア）、および／またはビブリオ（例えば、コレラ菌）由来の免疫原性タンパク質をコードする。別の実施形態において、第１の異種配列は、カンピロバクター（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ）、ボルデテラ（例えば、百日咳菌）、クラミジア（例えば、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマティス）、コリネバクテリウム（例えば、ジフテリア菌）、レジオネラ（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ）、リステリア（例えば、リステリア・モノサイトゲネス）、ナイセリア（例えば、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス）、サルモネラ（例えば、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・チフィムリウム）、エルシニア（例えば、ペスト菌）、ヘモフィルス（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ）、ヘリコバクター（例えば、ヘリコバクター・ピロリ）、コクシエラ（例えば、Ｑ熱コクシエラ）、および／またはフランシセラ（例えば、野兎病菌）由来の免疫原性タンパク質をコードする。特定の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、バチルス・アントラシス、マラリア原虫、および／または赤痢菌由来の免疫原性タンパク質をコードする。さらに他の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザ、ＨＩＶ、および／またはバチルス・アントラシス由来の免疫原性タンパク質をコードする。

【0063】

第１の異種配列によってコードされるインフルエンザ抗原は、現在存在するかまたは後に単離されるいかなるインフルエンザ株、例えば、１９１８年のスペイン風邪（Ｈ１Ｎ１）、１９５７年のアジア風邪（Ｈ２Ｎ２）、１９６８年のホンコン風邪（Ｈ３Ｎ２）、１９９７年のホンコン風邪（Ｈ５Ｎ１）、２００４年のベトナム風邪（Ｈ５Ｎ１）、２００９年のブタインフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）に関連する株に由来してもよい。したがって、例えば、ＨＡ抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、またはＢのＨＡ抗原であってもよく、ＮＡ抗原は、例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９のＮＡ抗原であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＡ抗原は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、またはＢのＨＡ抗原であってもよい。本発明の異種配列の基礎となり得るインフルエンザ株の非限定的な例として、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｌｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／１４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０８／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４１１４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１６６９／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｎａｄａ−ＡＢ／ＲＶ１５３２／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／４７／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｂｅｒｌｉｎ／３／６４（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｔｏｋｙｏ／３／６７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ａｌｂａｎｙ／１／７６（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１７７４／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／５５／２００４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６（Ｈ５Ｎ１）クレード４、Ａ／ＨＫ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＨＫ／４８３／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）クレード１、Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）クレード１、Ａ／ｄｕｃｋ／ＮＣＶＤ１／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／ＮＣＶＤ−２１／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）クレード２．１、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／６５−５９６／０６（Ｈ５Ｎ１）クレード２．２、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｎｄｉａ／ＮＩＶ３３４８７／２００６（Ｈ５Ｎ１）クレード２．２、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）クレード２．２、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／９０２７８２／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２３２１／２００７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／３３００−ＮＡＭＲＵ３／２００８（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｃｈｉｎａ／ＧＤ０１／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｏｍｍｏｎ ｍａｇｐｉｅ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／５０５２５／０７（Ｈ５Ｎ１）クレード２．３．２、Ａ／Ｊａｐａｎｅｓｅ ｗｈｉｔｅ−ｅｙｅ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０３８／２００６（Ｈ５Ｎ１）クレード２．３．４、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／ＮＣＶＤ−１５／２００７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／２３３５／２０００（Ｈ７Ｎ１）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／９９（Ｈ７Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／２１２１１−２／０５（Ｈ７Ｎ２）、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１０７／０３（Ｈ７Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ／ＧＳＣヒトＢ／０４（Ｈ７Ｎ３）、Ａ／Ｃａｎａｄａ／ｒｖ５０４／０４（Ｈ７Ｎ３）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ／ＣＮ−６／０４（Ｈ７Ｎ３）、Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｓａｎ Ｐａｕｌｏ／４／７６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｓｅａｌ／Ｍａｓｓ／１／１９８０（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／１９８５（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２５８６／２００３（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／ＨＫＷＦ１９７１／２００７（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／１／９４（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｑｕａｉｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ１／１９９７（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｋｏｒｅａ／ＫＢＮＰ−００２８／２０００（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＣＳＷ１５３／２００３（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎｔｏｕ／６７８１／２００５（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｊｉａｎｇｓｕ／Ｌ１／２００４（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／２１０８／２００３（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈｉｒａｚ／ＡＩＶ−ＩＲ００４／２００７（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｉｂｏ／Ｌ２／２００８（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｅｎａｎ／Ｌ１／２００８（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ａｖｉａｎ／Ｉｓｒａｅｌ／３１３／２００８（Ｈ９Ｎ２）およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８が挙げられる。さらなるインフルエンザ株は、当業者によって容易に同定され得る。例えば、ＷＯ２００８／０５４５４０号の表１は、これまでに単離された異なるインフルエンザ株の大規模なリストを提供しており、また国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトも同様である。

【0064】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザウイルスＨ１、Ｈ３、Ｈ５、またはＢから選択されるインフルエンザＨＡ抗原をコードする。ＨＡ抗原は、いくつかの実施形態において、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／２３２１／２００７、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／３３００−ＮＡＭＲＵ３／２００８、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９、またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８からなる群から選択される株のうちの１つまたは複数に由来してもよい。いくつかの実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザのＮＰまたはＭ１抗原をコードする。一実施形態において、ＮＰまたはＭ１抗原は、インフルエンザ株Ａ／Ｔｅｘａｓ／０４／２００９またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０８／２００９に由来する。

【0065】

他の実施形態において、第１の異種配列は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来の抗原をコードする。ＨＰＶは、いかなる既知のまたは後に発見される株であってもよい（例えば、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−４５等）。一実施形態において、第１の異種配列は、ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８株由来の抗原をコードする。特定の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、全長Ｌ１タンパク質またはその断片等の表面抗原である（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／もしくはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。一実施形態において、第１の異種配列は、完全にまたは部分的にコドン最適化された全長Ｌ１タンパク質をコードする。他の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、全長Ｌ２またはその断片である（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。他の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、Ｌ１ハイブリッドポリペプチドまたはＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドである。例えば、ある特定の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、Ｌ２ポリペプチドの断片を含むＬ１ポリペプチドである（例えば、Ｌ２の断片がＬ１ポリペプチドのループに挿入されてもよい）。さらに他の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、全長Ｅ６もしくはＥ７タンパク質、またはその断片である（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／もしくはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。さらに他の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、Ｌ１、Ｌ２および／またはＥ６ならびにＥ７タンパク質を含む融合タンパク質である。例えば、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ抗原は、Ｅ７タンパク質に融合されたＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む融合タンパク質である。他の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、Ｅ６タンパク質に融合されたＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む融合タンパク質である。

【0066】

他の実施形態において、第１の異種配列は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）由来の抗原をコードする。ＨＩＶは、いかなる既知のまたは後に発見される株であってもよい（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２等）。特定の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、全長Ｅｎｖタンパク質（例えば、ｇｐ１６０）あるいはその断片またはオリゴマー（例えば、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）等の表面抗原である。他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、全長カプシドタンパク質（ｐ２４）、マトリックスタンパク質（ｐ１７）、またはその断片であるである（例えば、進化的に保存されたエピトープおよび／もしくはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。他の実施形態において、ＨＩＶ抗原はＴａｔ（例えば、ｐ１６もしくはｐ１４）、Ｒｅｖ（ｐ１９）、Ｖｉｆ（ｐ２３）、Ｖｐｒ（ｐ１４）、Ｎｅｆ（ｐ２７）、Ｖｐｕ（ｐ１６）、またはＧａｇタンパク質である。ＨＩＶ抗原は、全長のまたはそうでなければ、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープ等のいかなるＨＩＶタンパク質であってもよく、いかなる進化的に保存された配列であってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原配列は、異種の三量体形成ドメイン（例えば、ＧＣＮ４等の酵母のＧＣＮ、およびバクテリオファージＴ４のフィブリチンＦＴモチーフ由来）または翻訳後修飾のための特定のシグナル配列、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー部位を含有するように遺伝子操作されてもよい。例えば、一実施形態において、ｇｐ１４０またはｇｐ１２０等のＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＧＰＩアンカー部位を含有するように修飾されてもよい。別の実施形態において、ＨＩＶのｇｐ１４０配列は、異種のＧＣＮ三量体形成ドメインおよび／またはＧＰＩアンカー部位を含有するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態において、ＧＣＮ三量体形成ドメインまたはＧＰＩアンカー部位は、ＨＩＶエンベロープタンパク質配列のカルボキシル末端（例えば、ＨＩＶのｇｐ１４０配列）に融合される。

【0067】

他の実施形態において、第１の異種配列は、バチルス菌の抗原をコードする。バチルスは、多数の病原体種のうちのいずれでもあってもよく（例えば、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）等）、そのような種のいかなる既知のまたは後に発見される分離株であってもよい。特定の実施形態において、バチルス抗原は、細胞膜に存在するタンパク質またはその断片等の表面抗原である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／もしくはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。他の実施形態において、バチルス抗原は、細胞内タンパク質またはその断片である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。特定の実施形態において、バチルス抗原は、宿主細胞内移行と関連する。例えば、抗原は、標的細胞結合タンパク質（例えば、防御抗原（ＰｒＡｇもしくはＰＡ））、メタロペプチダーゼ（例えば、致死因子（ＬＦ））、アデニル酸シクラーゼ（例えば、浮腫因子（ＥＦ））、またはその断片（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／もしくはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）であってもよい。いくつかの実施形態において、バチルス抗原は、サーモリシン切断部位を欠失するように、またはＧＰＩアンカーを含有するように修飾されてもよい。一実施形態において、第１の異種配列は、防御抗原、または、サーモリシン切断部位を除去するように、もしくはＧＰＩアンカーを含有するように修飾された防御抗原をコードする。

【0068】

他の実施形態において、第１の異種配列は、赤痢菌由来の抗原をコードする。赤痢菌は、多数の病原体種のうちのいずれでもあってもよく（例えば、ソンネ菌、志賀赤痢菌、シゲラ・フレックスネリ等）、そのような種のいかなる既知のまたは後に発見される分離株であってもよい。特定の実施形態において、赤痢菌抗原は、細胞膜に存在するかまたは関連するタンパク質（例えば、膜内在性タンパク質もしくは表在性膜タンパク質）、あるいはその断片等の表面抗原である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。例えば、抗原は、Ｋａｒｐ株ｐ５６等の外膜タンパク質であってもよい。他の実施形態において、赤痢菌抗原は、細胞内タンパク質またはその断片である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。特定の実施形態において、赤痢菌抗原は、侵入タンパク質であるＩｐａＢ、ＩｐａＣ、またはＩｐａＤタンパク質等の宿主細胞内移行と関連する。別の実施形態において、赤痢菌抗原は、ＩｃｓＰおよび／またはＳｉｇＡポリペプチドを含む汎用抗原である。

【0069】

他の実施形態において、第１の異種配列は、マイコバクテリウム由来の抗原をコードする。マイコバクテリウムは、多数の病原体種のうちのいずれでもあってもよく（例えば、結核菌、らい菌、Ｍ．レプロマトーシス（Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）等）、そのような種のいかなる既知のまたは後に発見される分離株であってもよい。特定の実施形態において、マイコバクテリウム抗原は、細胞膜に存在するかまたは関連するタンパク質（例えば、膜内在性タンパク質もしくは表在性膜タンパク質）、あるいはその断片等の表面抗原である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。他の実施形態において、マイコバクテリウム抗原は、細胞内タンパク質またはその断片である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。特定の実施形態において、マイコバクテリウム抗原は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＨｓｐＸ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0070】

他の実施形態において、第１の異種配列は、マラリア原虫由来の抗原をコードする。マラリア原虫は、多数の病原体種のうちのいずれでもあってもよく（例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫）、そのような種のいかなる既知のまたは後に発見される分離株であってもよい。特定の実施形態において、マラリア原虫抗原は、細胞膜に存在するかまたは関連するタンパク質（例えば、膜内在性タンパク質もしくは表在性膜タンパク質）、あるいはその断片等の表面抗原である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。他の実施形態において、マラリア原虫抗原は、細胞内タンパク質またはその断片である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。特定の実施形態において、マラリア原虫抗原は、ＣＳ、ＣＳＰ（未切断）、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２（Ｃ末端ｐ４２）、ＬＳＡ１、ＥＢＡ−１７５、ＡＭＡ１、ＦＭＰ１、Ｐｆｓ４８／４５、およびＭＳＰ３からなる群から選択される。

【0071】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、肺炎連鎖球菌（例えば、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ））由来の抗原をコードする。特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌抗原は、細胞膜に存在するかまたは関連するタンパク質（例えば、膜内在性タンパク質もしくは表在性膜タンパク質）、あるいはその断片等の表面抗原である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。他の実施形態において、肺炎連鎖球菌抗原は、細胞内タンパク質またはその断片である（例えば、進化的に保存されたエピトープ、および／またはＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）。特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌抗原は、肺炎球菌表面タンパク質（例えば、ＰｓｐＡ、ＰｓｐＣ）、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ノイラミニダーゼ酵素（例えば、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ）、自己溶菌酵素Ａ（ＬｙｔＡ）、肺炎球菌−ヒスチジン三連構造タンパク質、ＰｉａＡ、ＰｉｕＡ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ＦＢＡ）、アドヘシンＡ、ニューモリソイド（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｏｉｄ）からなる群から選択される。

【0072】

さらに他の実施形態において、第１の異種配列は、表面抗原、内部タンパク質、毒素、侵入関連タンパク質、プロテアーゼもしくは他の酵素、熱ショックタンパク質、またはいかなる他の感染性病原体由来の他の抗原もコードする。例えば、表面抗原は、百日咳菌、クラミジア・ニューモニエ（例えば、膜タンパク質Ｄ、外膜タンパク質）、クラミジア・トラコマティス（例えば、膜タンパク質Ｄ、外膜タンパク質）、レジオネラ・ニューモフィラ、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性、多剤耐性、およびオキサシリン耐性株を含む）（例えば、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ）、肺炎連鎖球菌（例えば、ＰｓＰＡ）、ストレプトコッカス・エルジノーサ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（例えば、鞭毛Ａｇ、ポリン）、化膿性連鎖球菌（例えば、Ｍタンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質Ｓｆｂ１）、ストレプトコッカス・アガラクチア、腸管出血性大腸菌（例えば、インチミン、ＦｉｍＨアドへシン）、ヘモフィルス・インフルエンザ（例えば、Ｐｉｌｉ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６）、カンジダ（例えば、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ）、コクシジオイデス・イミチス（例えば、Ａｇ２）、緑膿菌（例えば、鞭毛抗原、ポリン）、ラウス肉腫ウイルス（例えば、Ｆタンパク質、Ｇタンパク質）、ヒト内因性レトロウイルスＫ（例えば、メラノーマ抗原ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ）、ヘルペスウイルス（例えば、糖タンパク質Ｄ２）、デング熱ウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４エンベロープタンパク質、四価４ｘＥＤＩＩＩドメインタンパク質）等からなる群から選択される感染性病原体に由来してもよい。毒素は、カンピロバクター・ジェジュニの不安定毒素、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡおよびＢ、化膿性連鎖球菌由来の発熱性外毒素および外毒素、コレラ菌のトキシンＢ、腸管出血性大腸菌の志賀毒素（例えば、Ｓｔｘ−１、Ｓｔｘ−２）、緑膿菌由来の外毒素Ａ等からなる群から選択されてもよい。プロテアーゼおよび他の酵素は、クラミジアの分泌プロテアーゼ因子、肺炎連鎖球菌のニューモリシン、自己溶菌酵素、またはノイラミニダーゼ、化膿性連鎖球菌由来のシステインプロテアーゼまたはＣ５ａペプチダーゼ、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ、コクシジオイデス・イミチスのウレアーゼ、ヒストプラズマ・カプスラーツムのＨｉｓ−６２、Ｈ抗原、およびｈｓｐ７０等からなる群から選択されてもよい。

【0073】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、癌細胞によって生成されるタンパク質の全部または一部をコードする。タンパク質またはその断片（例えば、切断生成物、構造ドメイン、二次構造の単位（複数可）、Ｂ細胞エピトープ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープ等）は、癌細胞の表面上に位置していてもよい。例えば、タンパク質またはその断片は、高度に抗原性であってもよく、かつ／または癌細胞のためのマーカー（例えば、癌細胞特異的マーカーまたは癌細胞上で高度に濃縮された抗原）であってもよい。代替として、タンパク質またはその断片（例えば、切断生成物、構造ドメイン、二次構造の単位（複数可）、ＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ等）は、癌細胞の内部に位置していてもよい。例えば、タンパク質またはその断片は、細胞質タンパク質、核タンパク質等であってもよい。

【0074】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、少なくとも１つの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、少なくとも１つの完全なＯＲＦは、アデノウイルスベクターによって感染された宿主細胞中で発現されることができる個別のポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、第１の異種配列は２つ以上の完全なＯＲＦを含み、それらの各々が、アデノウイルスベクターによって感染された宿主細胞中で発現されることができる個別のポリペプチドをコードする。上述のように、個別のポリペプチドのうちの１つまたは複数は、全長タンパク質またはその断片であってもよい。同様に、上述のように、個別のポリペプチドのうちの１つまたは複数は、タンパク質ドメインの多量体、構造モチーフ、またはエピトープ（例えば、Ｂ細胞、ＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ）であってもよい。例えば、特定の実施形態において、第１の異種配列は、全長タンパク質（例えば、インフルエンザＨＡ）をコードする第１のＯＲＦと、タンパク質ドメインの多量体、構造モチーフ、またはエピトープ（例えば、表４から選択される１つもしくは複数のインフルエンザＭ２配列の多量体、１つもしくは複数のインフルエンザＢ細胞エピトープの多量体、表１もしくは表１３から選択される１つもしくは複数のインフルエンザＨＴＬエピトープの多量体、または表２〜３および５〜１２もしくは表１４から選択される１つもしくは複数のインフルエンザＣＴＬエピトープの多量体等）をコードする第２のＯＲＦとを含む。

【0075】

したがって、いくつかの実施形態において、第１の異種配列は、融合タンパク質をコードする。融合タンパク質は、同じ感染性病原体または異なる感染性病原体由来の抗原性タンパク質または全長タンパク質の１つまたは複数のエピトープまたはその断片を含むことができる。例えば、一実施形態において、融合タンパク質は、ＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質に融合された上述のようなＨＰＶのＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｅ７タンパク質に融合されたＨＰＶ−１６（例えば、ＨＰＶ−１６のＬ２断片がＬ１ループに挿入された全長ＨＰＶ−１６のＬ１タンパク質）に由来するＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、Ｅ６タンパク質に融合されたＨＰＶ−１８（例えば、ＨＰＶ−１８のＬ２断片がＬ１ループに挿入された全長ＨＰＶ−１８のＬ１タンパク質）に由来するＬ１／Ｌ２ハイブリッドポリペプチドを含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、一緒に融合されたインフルエンザＨＡおよびＮＡタンパク質（例えば、本明細書に記載されるようなインフルエンザＨＡまたはＮＡタンパク質の中和エピトープ）に由来する免疫原性断片を含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、全長インフルエンザのＮＡタンパク質に融合された本明細書に記載されるようなインフルエンザＨＡタンパク質の１つまたは複数の中和エピトープを含む。さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載されるような種々のエピトープの多量体であってもよい。例えば、融合タンパク質は、各エピトープがリンカー配列によって接続された、ＨＴＬエピトープの多量体であってもよい（代表的な多量体については実施例１３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、第１の異種配列によってコードされる融合タンパク質は、感染性病原体の２つ以上の種または血清型由来の抗原を含む。例えば、融合タンパク質は、デング熱ウイルスの４つの血清型１〜４のうちの各々に由来するエンベロープタンパク質のＥＤＩＩＩドメインを含んでもよい。

【0076】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦは並列に配向される（例えば、頭−尾結合）。特定の関連実施形態において、第１の異種配列は、第１のＯＲＦの終止コドンの３'および第２のＯＲＦの開始コドンの５'に位置する内部リボソーム侵入部位配列（ＩＲＥＳ）をさらに含み、それによって、第１および第２のＯＲＦによってコードされたポリペプチドが単一のｍＲＮＡ転写物から翻訳されることを可能にする。当業者は、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞において機能的である好適なＩＲＥＳ配列、そして、第２のＯＲＦの十分な翻訳を確実にするためには、そのような配列がどのように配置されるべきかを容易に特定することができる。

【0077】

特定の関連実施形態において、第１の異種配列は、２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦは並列に配向され（例えば、頭−尾結合）、第１のＯＲＦの終止コドンの３'および第２のＯＲＦの開始コドンの５'に位置するスプライスアクセプターをさらに含み、それによって第１および第２のＯＲＦによってコードされたポリペプチドが、単一のｍＲＮＡ転写物から、または２つの別個のｍＲＮＡ転写物として、翻訳されることを可能にする。当業者は、スプライシング要素を特定し、それらを正しい様式で組み込むことができる。スプライシングアクセプターは、所望の結果に応じて、コンセンサス配列（ＳＶ４０スプライシング部位等）または非コンセンサス配列（Ａｄ５のＡＤＰスプライスアクセプター等）のいずれかであってもよい。例えば、アデノウイルス主要後期転写単位において、感染後期に非定型ポリピリミジントラクトを有する３'スプライシング部位が好ましい。例えば、Ｍｕｈｌｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９（１１）：７３２４を参照のこと。

【0078】

特定の関連実施形態において、第１の異種配列は、２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦは並列に配向され（例えば、頭−尾結合）、第１のＯＲＦの３'末端（終止コドンが除去された）と第２のＯＲＦの開始コドンのフレームの５'との間のフレームに位置する２Ａスキッピング要素（リボソーム内自己プロセシング）をさらに含み、それによって第１および第２のＯＲＦによってコードされたポリペプチドが、Ａ２要素の位置で結合するペプチドを「スキップする」単一のペプチドとして単一のｍＲＮＡ転写物から翻訳されることを可能にし、そうすることで２つのポリペプチドを産生する。当業者は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびピコルナウイルスに由来するような２Ａスキッピング要素を特定し、２つのＯＲＦが単一の連続したペプチドを形成するようにそれらを整列させることができる。

【0079】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、２つの完全なＯＲＦを含み、第１および第２のＯＲＦは末端同士の結合で配向される。例えば、第１のＯＲＦの３'末端が、第２のＯＲＦの３'末端と隣接していてもよい。代替として、第１のＯＲＦの５'末端が、第２のＯＲＦの５'末端と隣接していてもよい。

【0080】

一般的に、第１の異種配列は、転写エンハンサーおよび／またはプロモーターならびにポリアデニル化配列を最小限含有する転写単位の一部である。特定の実施形態において、転写単位は、１つもしくは複数のイントロン、１つもしくは複数のスプライシングエンハンサー、リーダー配列、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＲＮＡの安定性および／もしくはプロセシングを増加させる１つもしくは複数の要素、またはそれらの組み合わせをさらに含む。

【0081】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスの転写および／もしくは翻訳制御配列の制御下にあるか、またはそれに機能的に結合している。この文脈で用いられる場合、「制御下にある」および「機能的に結合している」とは、異種配列に含有されるＯＲＦの転写および／または翻訳が制御配列によって影響を受けることを意味する。したがって、例えば、ＯＲＦの転写および／または翻訳が、アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列の結果として増加され得る。特定の実施形態において、「機能的に結合している」とは、制御配列と異種配列とが互いに極めて近接していることを意味する。例えば、特定の実施形態において、異種配列に機能的に結合しているアデノウイルスの制御配列は、異種配列の一方の末端から約１００ｂｐ以内、約１００〜約２００ｂｐ、約２００〜約３００ｂｐ、約３００〜約４００ｂｐ、または約４００〜約５００ｂｐに位置する。

【0082】

本明細書で用いられる場合、「アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列」は、アデノウイルスに由来する転写および／または翻訳の調節に関与する核酸配列である。そのような配列は、これらに限定されないが、アデノウイルスプロモーター（例えば、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）または主要後期転写単位（ＭＬＴＵ）内のプロモーター）、アデノウイルス転写エンハンサー、アデノウイルススプライスアクセプター部位（例えば、Ａｄ４のＥ３ ２４．８ｋ ＯＲＦのＭＬＰ駆動転写のための天然スプライスアクセプター部位、またはＡｄ５のＡＤＰスプライスアクセプター配列）、アデノウイルスのスプライシングエンハンサー、アデノウイルスのリーダー配列（例えば、トリパータイトリーダー（ＴＰＬ）配列）、ＲＮＡの安定性および／またはプロセシングを増加させるアデノウイルスの要素（例えば、シス作用性のＲＮＡ核外輸送要素）、ならびにアデノウイルスポリＡシグナル配列（例えば、Ａｄ５ Ｅ３Ａポリアデニル化シグナル配列）を含む。アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列は、いかなるアデノウイルス株に由来してもよい。したがって、本発明のアデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ４ベクター）は、異なるアデノウイルス株（すなわち、Ａｄ４以外の株）に由来するアデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列を含むことができる。アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列は、野生型配列（すなわち、自然発生型アデノウイルスに見られる配列）またはその変異配列を有することができる。アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列は、当該技術分野において記載されている。例えば、アデノウイルスＴＰＬ配列は米国特許出願第２００６／０１１５４５６号に記載され、エンハンサーはＭａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３（６）：６０２に記載され、ポリアデニル化配列はＢｈａｔおよびＷｏｌｄ（１９８６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７（３）：１１５５において考察されている。さらなるアデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列は、当業者によって同定され得る。

【0083】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスＭＬＰの下にある（すなわち、その制御下にある）。本明細書で用いられる場合、「主要後期プロモーター（ＭＬＰ）」は、主要後期転写単位（ＭＬＴＵ）プロモーターと交換可能に使用される。他の実施形態において、第１の異種配列はアデノウイルスＭＬＰおよびアデノウイルスＴＰＬの下にある。他の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスＭＬＰの下にあり、アデノウイルススプライスアクセプター配列に機能的に結合している。さらに他の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスＭＬＰおよびアデノウイルスＴＬＰの下にあり、アデノウイルススプライスアクセプター配列に機能的に結合している。特定の実施形態において、アデノウイルススプライスアクセプター配列は、非コンセンサス配列である。理論に束縛されることを意図するわけではないが、非コンセンサスのスプライスアクセプターは、アデノウイルスＭＬＰと合わせて用いられると、コンセンサスのスプライスアクセプターよりも良好に作用すると考えられる。上述した実施形態のいずれにおいても、第１の異種配列は、アデノウイルスポリＡシグナル配列にさらに機能的に結合していてもよい。

【0084】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、内因性アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列の下にある（すなわち、その制御下にある）。本明細書で用いられる場合、「内因性」アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列は、アデノウイルスベクター本来の、組換え技術によって新しい位置に導入または移動されていない、転写および／または翻訳の調節に関与する核酸配列である。例えば、その配列の位置が組換え技術によって修飾されていない限り、Ａｄ４アデノウイルスベクターに存在するいかなるＡｄ４転写および／または翻訳制御配列も、Ａｄ４アデノウイルスベクターに対して内因性である。

【0085】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、外因性の転写および／または翻訳制御配列を含む。本明細書で用いられる場合、「外因性の」転写および／または翻訳制御配列は、その野生型構成から取り出され、異種配列内の新しい構成内に配置された、非アデノウイルスの転写および／もしくは翻訳制御配列、またはアデノウイルスの転写および／もしくは翻訳制御配列のいずれかを指す。外因性の転写および／または翻訳制御配列の例として、これらに限定されないが、哺乳動物細胞において機能的なプロモーター（例えば、恒常的プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等）、哺乳動物細胞において機能的なエンハンサー配列（例えば、ＣＭＶまたはＲＳＶエンハンサー配列）、スプライシングシグナル、スプライシングエンハンサー、リーダー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ＲＮＡの安定性および／またはプロセシングを増加させる配列（例えば、シス作用性のＲＮＡ核外輸送要素、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節要素（ＷＰＲＥ））、ポリＡシグナル配列（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）またはＳＶ４０ポリＡシグナル配列）等が挙げられる。種々の好適な転写および／または翻訳制御配列が、従来技術において記載されている。好適なＣＭＶプロモーターは、例えば、米国特許出願第２００６／０１１５４５６号に記載されている。ＷＰＲＥ要素は、例えば、Ｄｏｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（６）：５０８５に記載されている。ＷＰＲＥ要素は、ＯＲＦメッセージ内、典型的には、遺伝子の３'末端と５'ポリアデニル化配列の間に位置しなければならない。理論に束縛されることを意図するわけではないが、ＷＰＲＥは、核からのｍＲＮＡの移行の効率を増加することによって、また、ＲＮＡの翻訳および安定性を増加させることによって機能すると考えられる。Ｋｏｚａｋ配列もまた、例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １５（２０），８１２５−４８（１９８７）に記載されている。

【0086】

好適な転写および／または翻訳制御配列は、アデノウイルスであろうとまたはそうでなかろうと、自然発生配列およびそのような配列の修飾形態を含む。そのような修飾形態は、転写および／もしくは翻訳制御配列と関連する望ましい活性を増強するように、または内因性アデノウイルスの転写および／もしくは翻訳制御配列と関連する望ましくない活性を減少させるかまたは排除するように設計された、１つまたは複数の塩基の変化（例えば、欠失、挿入、置換）を含むことができる。

【0087】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、複数の転写または翻訳制御配列を含む。例えば、第１の異種配列は、適切な細胞（例えば、ヒト細胞）がアデノウイルスベクターに感染したときに、第１の異種配列におけるＯＲＦの発現を確実にするのに十分な転写または翻訳制御配列を含むことができる。特定の実施形態において、第１の異種配列は、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）およびアデノウイルスＴＰＬ配列を含む。他の実施形態において、第１の異種配列は、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、アデノウイルスＴＰＬ、およびアデノウイルスポリＡシグナル配列（例えば、Ａｄ５ Ｅ３ＡポリＡシグナル配列）を含む。上述した実施形態のうちのいずれに関しても、第１の異種配列は、Ｋｏｚａｋ配列をさらに含むことができる。

【0088】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、２つ以上のＯＲＦの各々のための１つまたは複数の転写または翻訳制御配列を含む。例えば、第１の異種配列は、２つ以上のＯＲＦの各々の発現を確実にするのに十分な転写または翻訳制御配列を含むことができる。したがって、特定の実施形態において、第１の異種配列は、２つのＯＲＦの各々のためのプロモーターおよびポリＡシグナル配列を含む。第１の異種配列は、ＯＲＦの各々のためのアデノウイルスＴＰＬおよび／またはＫｏｚａｋ配列をさらに含むことができる。代替として、特定の実施形態において、第１の異種配列は、１つのＯＲＦの発現を確実にするのに十分な転写または翻訳制御配列（例えば、プロモーターおよび／もしくはエンハンサーおよびポリＡシグナル配列）を含むことができ、内因性アデノウイルスの転写または翻訳制御配列の制御下にあるか、あるいはそれに機能的に結合している第２のＯＲＦを含む。

【0089】

特定の実施形態において、第１の異種配列は、少なくとも１つのＯＲＦの発現および／または翻訳を増加させるかまたは最大化するように最適化されている。例えば、特定の実施形態において、第１の異種配列の１つのＯＲＦは、（例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞における発現のために）コドン最適化されている。一実施形態において、第１の異種配列は、コドン最適化されており、ＣＭＶプロモーター等の非アデノウイルスプロモーターの制御下にある。他の実施形態において、ＯＲＦに機能的に結合したＫｏｚａｋ配列は、例えば、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を作製するように最適化された第１の異種配列である。さらに他の実施形態において、第１の異種配列は、エキソンのスプライシングサイレンサーまたはインスレーター配列等の可能性のある阻害配列（例えば、クロマチンを整列させ、プロモーターおよび／またはエンハンサーの長期にわたる影響を阻止するよう機能する配列）を除去するように最適化されている。コドン最適化および他の種類の配列最適化は、当該技術分野においてルーチンであり、当業者は、そのような最適化をどのように行うかを容易に理解するであろう。

【0090】

第１の異種配列がＭＬＰプロモーターの制御下にあるいくつかの実施形態において、第１の異種配列はコドン最適化されていない、すなわち、第１の異種配列は感染性病原体からの天然配列である。例えば、一実施形態において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスＭＬＰプロモーターの制御下でコドン最適化されていない第１の異種配列を含み、アデノウイルスベクターは、複製能力を有し、かつＥ３の部分欠失を有する。別の実施形態において、アデノウイルスベクターはＡｄ４に由来する。

【0091】

第１の異種配列は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ３、およびＬ５領域、またはＥ４−ＩＴＲ境界を含む、アデノウイルスベクターの様々な異なる位置に挿入されてもよい。特定の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ１、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｌ３、もしくはＬ５領域、またはＥ４−ＩＴＲ境界に挿入される。他の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３領域、Ｌ３領域、またはＥ４−ＩＴＲ境界に挿入される。さらに他の実施形態において、第１の異種配列はＥ３領域に挿入される。特定の実施形態において、好適なＥ３領域の挿入部位は、Ｅ３ＢポリＡシグナル配列の下流に位置する。特定の実施形態において、好適なＬ３領域の挿入部位は、Ｌ３ ２３ｋプロテアーゼ遺伝子（例えば、Ａｄ５ベクターの２３ｋプロテアーゼ遺伝子、またはいずれか他のアデノウイルスベクターの同等の配列）の下流に位置する。アデノウイルスの領域または境界における正確な挿入部位は、第１の異種配列が１つまたは複数の内因性アデノウイルスの転写および／または翻訳制御配列の制御下にあるか、またはそれに機能的に結合するように選択することができる。代替として、またはそれに加えて、正確な挿入部位は、結果として生じる組換えアデノウイルスベクターが哺乳動物（例えばヒト）細胞において複製する能力に与えるいかなる影響も最小限に抑えるように選択され得る。

【0092】

本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムに欠失を含むことができる。そのような欠失は、例えば、異種配列（例えば、第１の異種配列）の挿入のための空間を提供することが可能であり、結果として生じる組換えアデノウイルスベクターが哺乳動物（例えばヒト）細胞において複製する能力に対して挿入が与えるいかなる影響も最小限に抑えるのに役立ち得る。アデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ３、およびＬ５領域、またはＥ４−ＩＴＲ境界を含む様々な異なる位置で欠失させることができる。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｌ３、もしくはＬ５領域、またはＥ４−ＩＴＲ境界を欠失している。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ３領域、Ｌ３領域、またはＥ４−ＩＴＲ境界を欠失している。さらに他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ３領域を欠失している。特定の実施形態において、第１の異種配列は、上述した欠失のうちのいずれかに挿入されるか、またはその近位にある。例えば、第１の異種配列は、Ｅ３の部分欠失に挿入されてもよいか、またはＥ３の全欠失の近位にあってもよい。

【0093】

特定の実施形態において、アデノウイルスベクターにおける欠失は、１つまたは複数のオープンリーディングフレームを欠失させる。例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のオープンリーディングフレームを欠失させてもよい。オープンリーディングフレームは、既知または未知のいずれかの機能を有する。特定の実施形態において、欠失はＥ３領域にあり、Ｅ３領域における１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＯＲＦ（例えば、未知の機能を有するＥ３のＯＲＦ）の欠失を含む。Ｅ３領域における欠失は、部分欠失であってもよい。代替として、Ｅ３領域における欠失は、全欠失であってもよい。図２は、Ａｄ４のＥ３領域における例示的な部分欠失または全欠失を示す。例示的なＡｄ４のＥ３の部分欠失は、２４．８ｋ、６．３ｋ、および２９．７ｋ ＯＲＦ（これらは全て現在既知の機能を有さない）を除去し、Ａｄ４のＥ３の全欠失は、２３．３ｋ、１９ｋ、２４．８ｋ、６．３ｋ、２９．７ｋ、１０．４ｋ、１４．５ｋ、および１４．７ｋ ＯＲＦを除去する。ある代替のＥ３の部分欠失は、２４．８ｋ、６．３ｋ、２９．７ｋ、１０．４ｋ、１４．５ｋ、および１４．７ｋ ＯＲＦを除去する。

【0094】

したがって、特定の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ３ ２４．８ｋ、６．３ｋ、および２９．７ｋ ＯＲＦのうちの１つまたは複数（例えば、全部）の欠失を含むＡｄ４ベクターである。関連実施形態において、アデノウイルスベクターは、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５９４２５４の約２８，４４６〜約３０，２２６のヌクレオチドに対応する欠失を含むＡｄ４ベクターである。他の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ３領域に欠失を含むが、２３．３ｋ、１９ｋ、２４．８ｋ、６．３ｋ、２９．７ｋ、１０．４ｋ、１４．５ｋ、および１４．７ｋからなる群から選択される１つまたは複数のＥ３のＯＲＦを保持するＡｄ４ベクターである（例えば、２３．３ｋおよび１９ｋ ＯＲＦが保持されてもよいか、１０．４ｋ、１４．５ｋ、および１４．７ｋ ＯＲＦが保持されてもよいか、または２３．３ｋ、１９ｋ、１０．４ｋ、１４．５ｋ、および１４．７ｋ ＯＲＦが保持されてもよい）。関連実施形態において、アデノウイルスベクターは、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５９４２５４の約２８，４４６〜約３１，２８２、または約１７，３５６〜約３０，２２６のヌクレオチドに対応する欠失を含むＡｄ４ベクターである。さらに他の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、２３．３ｋ、１９ｋ、２４．８ｋ、６．３ｋ、２９．７ｋ、１０．４ｋ、１４．５ｋ、および１４．７ｋからなる群のＥ３ ＯＲＦを１つも保持しないＡｄ４ベクターである。特定の関連実施形態において、アデノウイルスベクターは、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５９４２５４の約２７，３５６〜約３１，２８２のヌクレオチドに対応する欠失を含むＡｄ４ベクターである。

【0095】

特定の実施形態において、たとえＯＲＦを含む核酸配列の一部がアデノウイルスベクター中に存在し続ける場合であっても（すなわち、たとえＯＲＦが部分的にのみ欠失している場合であっても）、ＯＲＦは欠失していると考えられる。特定の実施形態において、部分的に欠失したＯＲＦからの発現は、ＯＲＦの配列をさらに操作することによって排除することができる。例えば、特定の実施形態において、ＯＲＦの開始コドンが排除されてもよい。特定の実施形態において、Ａｄ４のＥ３領域の部分欠失または全欠失は、Ｅ３ ２３．３ｋ ＯＲＦの部分欠失をもたらす。特定の実施形態において、部分的に欠失したＥ３ ２３．３ｋ ＯＲＦを有するＡｄ４ベクターは、Ｅ３ ２３．３ｋ ＯＲＦの開始コドンを除去する変異（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５９４２５４の２７２７９位置に存在するＡＴＧコドンにおける変異）をさらに含む。

【0096】

さらに他の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、Ａｄ５ゲノムのＡＤＰ領域（例えば、Ａｄ５のＥ３ ｐｇ１９ｋ ＯＲＦとＡｄ５のＥ３ ＲＩＤ−α ＯＲＦの間の領域）に対応するＥ３領域に部分欠失を含むことができる。例えば、図２に示すＡｄ４のＥ３の部分欠失は、Ａｄ５のＥ３領域からのＡＤＰ領域の欠失に対応する。同様に、Ａｄ７のＥ３ １８．３ｋ ＯＲＦとＡｄ７のＥ３ １０．３ｋ ＯＲＦの間の領域（すなわち、Ａｄ７のＥ３ ２０．１ｋ、２０．６ｋ、および７．７ｋ ＯＲＦを包含する領域）は、Ａｄ５のＥ３領域からのＡＤＰ領域に対応する。当業者は、Ａｄ４またはＡｄ７以外の血清型から、アデノウイルスベクターのどの領域がＡｄ５のＡＤＰ領域に対応するかを容易に決定することができる。

【0097】

第１の異種配列は、アデノウイルスベクターにおける欠失（例えば、上述したような欠失）に挿入され得る。代替として、第１の異種配列は、欠失（例えば、上述したような欠失）に近位の位置でアデノウイルスベクターに挿入され得る。例えば、特定の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３の部分欠失（例えば、Ａｄ４ベクターにおけるＥ３の部分欠失）に挿入される。他の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３の全欠失（例えば、Ａｄ４ベクターにおけるＥ３の全欠失）に挿入される。さらに他の実施形態において、第１の異種配列は、Ｅ３の部分欠失または全欠失に近位の領域（例えば、Ｅ３ＢポリＡシグナル配列とＬ５ファイバー遺伝子またはＵエキソン等の下流配列との間）に挿入される。特定の実施形態において、第１の異種配列は、内因性プロモーター（例えば、ＬＴＰ）の制御下となるようにＥ３の部分欠失に挿入される。特定の実施形態において、第１の異種配列は、外因性プロモーターと、任意で他の転写または翻訳制御配列とを含み、かつＥ３の部分欠失または全欠失に挿入される。特定の実施形態において、第１の異種配列は、アデノウイルスタンパク質をコードするＯＲＦに組み込まれない。この文脈で用いられる場合、「組み込まれる」という用語は、結果として生じる配列がキメラタンパク質をコードし、キメラタンパク質の一部がアデノウイルスのＯＲＦによってコードされ、キメラタンパク質の一部が異種配列によってコードされるように、異種配列がアデノウイルスのＯＲＦに組み込まれることを意味する。

【0098】

いくつかの実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスプロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下で第１の異種配列を含み、第１の異種配列は、インフルエンザ、バチルス、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、赤痢菌、マイコバクテリウム、連鎖球菌、またはマラリア原虫由来の抗原をコードする。一実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザ由来のＨ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｈ５ ＨＡ、またはＢ ＨＡ抗原をコードする。別の実施形態において、第１の異種配列は、バチルス・アントラシス由来の防御抗原または修飾された防御抗原をコードする。別の実施形態において、第１の異種配列は、ＨＩＶ由来のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０）、修飾されたエンベロープタンパク質、またはｇａｇタンパク質をコードする。さらに別の実施形態において、第１の異種配列は、ＨＰＶ（ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８を含む）由来のＬ１タンパク質、Ｌ２タンパク質、Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質、またはそれらの融合体をコードする。さらに別の実施形態において、第１の異種配列は、マラリア原虫由来のＣＳＰ、Ｐｆｓ４８／４５、ＭＳＰ１、ＭＳＰ（Ｃ末端、ｐ４２）、またはＬＳＡ１をコードする。いくつかの実施形態において、第１の異種配列は、マイコバクテリウム由来のＡｇ８５、ＥＳＡＴ、ＨｓｐＸ、またはそれらの組み合わせをコードする。他の実施形態において、第１の異種配列は、赤痢菌由来のＰＳＳＰ、ｒ５６Ｋａｒｐタンパク質、または侵入タンパク質（例えば、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、またはＩｐａＤタンパク質）をコードする。さらなる実施形態において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルストリパータイトリーダー配列をさらに含むことができる。例えば、第１の異種配列は、アデノウイルスＭＬＰおよびトリパータイトリーダーの制御下にあってもよく、第１の異種配列は、インフルエンザ、バチルス、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、赤痢菌、マイコバクテリウム、連鎖球菌、またはマラリア原虫由来の抗原をコードする。

【0099】

他の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、非アデノウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲプロモーター、βアクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーター）の制御下で第１の異種配列を含み、第１の異種配列は、インフルエンザ、バチルス、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、赤痢菌、マイコバクテリウム、連鎖球菌、またはマラリア原虫由来の抗原をコードする。例えば、一実施形態において、第１の異種配列は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、インフルエンザ、バチルス、またはＨＩＶ由来の抗原をコードする。ある特定の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザ、バチルス、またはＨＩＶ由来のコドン最適化配列である。別の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザ、バチルス、またはＨＩＶ由来の天然配列である。別の実施形態において、第１の異種配列は、インフルエンザ由来のＨ１ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｈ５ ＨＡ、Ｂ ＨＡ、ＮＰ、またはＭ１抗原をコードする。別の実施形態において、第１の異種配列は、バチルス・アントラシス由来の防御抗原または修飾された防御抗原をコードする。さらに別の実施形態において、第１の異種配列は、ＨＩＶ由来のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０）、修飾されたエンベロープタンパク質、またはｇａｇタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルストリパータイトリーダー配列をさらに含むことができる。例えば、第１の異種配列は、ＣＭＶプロモーターおよびアデノウイルストリパータイトリーダーの制御下にあってもよく、第１の異種配列は、インフルエンザ、バチルス、ＨＩＶ、ＨＰＶ、トガウイルス（例えば、デング熱ウイルス）、赤痢菌、マイコバクテリウム、連鎖球菌、またはマラリア原虫由来の抗原をコードする。

【0100】

特定の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、第２の異種配列を含む。したがって、特定の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、第１の異種配列および第２の異種配列の両方を含む。代替として、本発明のアデノウイルスベクターは、第１の異種配列の代わりに第２の異種配列を含むことができる。

【0101】

第２の異種配列は、第１の異種配列について上述したような構造を有することができ、上述のいかなる様式でアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。したがって、特定の実施形態において、第２の異種配列は、全長抗原またはその断片（例えば、ドメイン、二次構造の単位（複数可）、保存されたエピトープ、Ｂ細胞、ＨＴＬもしくはＣＴＬエピトープ、またはそれらの組み合わせ）をコードすることができる。いくつかの実施形態において、第２の異種配列は、サイトカイン、または成長因子、または免疫系を刺激する他のタンパク質等の治療タンパク質をコードする。例えば、一実施形態において、第２の異種配列は、白血球を刺激する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、第１の異種配列は、感染性病原体由来の抗原をコードし、第２の異種配列は治療タンパク質をコードする。ある特定の実施形態において、第１の異種配列はインフルエンザ抗原（例えば、Ｈ１ ＨＡ， Ｈ３ ＨＡ， Ｈ５ ＨＡ、またはＢ ＨＡ抗原）をコードし、第２の異種配列は白血球を刺激するタンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする。特定の実施形態において、第２の異種配列は、（例えば、第１および第２の異種配列が互いに近位に位置するように）第１の異種配列と同じアデノウイルスベクターの領域に挿入される。他の実施形態において、第１および第２の異種配列は、アデノウイルスベクターの異なる領域に挿入される。

【0102】

第２の異種配列はまた、アデノウイルスのＯＲＦに組み込まれてもよい。特定の実施形態において、アデノウイルスのＯＲＦは、アデノウイルスの構造タンパク質（例えば、ヘキソンタンパク質またはファイバータンパク質等のカプシドタンパク質）をコードする。したがって、特定の実施形態において、第２の異種配列はアデノウイルスのヘキソンＯＲＦに組み込まれ、結果として生じるヘキソンＯＲＦと異種配列との融合物が、キメラヘキソンタンパク質をコードする。他の実施形態において、第２の異種配列はアデノウイルスのファイバーＯＲＦに組み込まれ、結果として生じるファイバーＯＲＦと異種配列との融合物が、キメラファイバータンパク質をコードする。一般的に、本発明のキメラヘキソンまたはキメラファイバータンパク質は、ヘキソンまたはファイバー機能を保持する（例えば、ヘキソンカプソメアまたはファイバーを形成し、カプシドの形成に寄与する）一方で、得られたアデノウイルスの表面の新しい抗原を提示する。本発明の組換えアデノウイルスの表面の新しい抗原の提示は、アデノウイルスに基づくワクチンの有効性を減少させ得る、一般的な集団における既存のアデノウイルスの免疫に伴う問題を回避するのに役立つため、有利である。また、組換えアデノウイルスの表面上の感染性病原体に由来する抗原の提示は、ワクチンを接種する対象の免疫系に対して非常に多様な感染性病原体抗原を提示することにより、本発明のアデノウイルスに基づくワクチンによって刺激される免疫応答を拡大することができる。

【0103】

いくつかの実施形態において、第２の異種配列は、異なるアデノウイルス血清型由来のファイバータンパク質をコードし、第２の異種配列は、アデノウイルスの天然ファイバータンパク質をコードする配列に取って代わる。したがって、結果として生じる組換えアデノウイルスは、別のアデノウイルス血清型に由来するファイバーを発現する。例えば、一実施形態において、Ａｄ５アデノウイルスは、Ａｄ４、Ａｄ７、Ａｄ２等のアデノウイルスに由来するファイバータンパク質を発現する。

【0104】

したがって、特定の実施形態において、第２の異種配列は、アデノウイルスの構造タンパク質（例えば、ヘキソンまたはタンパク質等のカプシドタンパク質）のＯＲＦに組み込まれ、第２の異種配列は、感染性病原体由来の抗原をコードする。感染性病原体およびその抗原は、上述の通りであり得る。特定の実施形態において、抗原は、Ｍ２等のインフルエンザ表面タンパク質に由来する（例えば、Ｍ２の外部ドメイン、断片、またはエピトープ）。特定の実施形態において、Ｍ２抗原は、表４に列挙されるＭ２ペプチド配列のセット（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２、３１８、３２１、または３２７）から選択される。特定の実施形態において、第２の異種配列は、表４に列挙されるＭ２ペプチド配列のうちの１つより多くをコードする。例えば、第２の異種配列は、Ｈ１、Ｈ２、および／またはＨ３インフルエンザ株由来の少なくとも２つのＭ２配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２〜３１７からなる群から選択される少なくとも２つの配列）、Ｈ５インフルエンザ株（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８〜３２０からなる群から選択される少なくとも２つの配列）、Ｈ７インフルエンザ株（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１〜３２６からなる群から選択される少なくとも２つの配列）、またはＨ９インフルエンザ株（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２７〜３３５からなる群から選択される少なくとも２つの配列）をコードすることができる。代替として、第２の異種配列は、複数の異なるインフルエンザ血清型由来のＭ２配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８〜３２０からなる群から選択される少なくとも１つの配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１〜３２６からなる群から選択される少なくとも１つの配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２７〜３３５からなる群から選択される少なくとも１つの配列、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２〜３１７からなる群から選択される少なくとも１つの配列）をコードすることができる。他の実施形態において、第２の異種配列は、インフルエンザマトリックス配列（例えば、ＧＡＡＡＧＩＬＧＦＶＦＴＬＮＡＡ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３６）またはインフルエンザＮＰ配列（例えば、ＬＥＬＲＳＲＹＷＡＩＲＴＲＳＧＧＮＴＮＱＱＲＡＳ−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７）の１つまたは複数のコピーをコードすることができる。さらに他の実施形態において、インフルエンザ抗原は、ＨＴＬまたはＣＴＬエピトープである。例えば、第２の異種配列は、表１もしくは１３から選択される１つもしくは複数のＨＴＬエピトープ、または、表２〜３および５〜１２もしくは表１４から選択される１つもしくは複数のＣＴＬエピトープをコードすることができる。

【0105】

他の実施形態において、第２の異種配列は、（例えば、ヒト集団における）既存の免疫が有意ではないアデノウイルス血清型に由来するアデノウイルスのヘキソンタンパク質の１つまたは複数の部分をコードする。例えば、ヒト集団において、アデノウイルス血清型Ａｄ３５に対する既存の免疫はほとんど存在しない。例えば、Ｖｏｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（１５）：８２６３を参照のこと。既存の免疫がほとんど存在しない他のアデノウイルス血清型は、例えば、Ａｄ１１、Ａｄ３４、Ａｄ４３、Ａｄ４８、Ａｄ５０、Ａｄ２６、Ａｄ２８、Ａｄ４５、およびＡｄ４９を含む。やや高めではあるが、それでも低いレベルの既存の免疫を有するアデノウイルス血清型は、例えば、Ａｄ２２、Ａｄ２４、Ａｄ３６、Ａｄ３７、Ａｄ３８、Ａｄ４６、Ａｄ４７、およびＡｄ１０を含む。したがって、本発明のアデノウイルスに基づくワクチンは、例えば、組換えアデノウイルスがＡｄ４およびＡｄ３５の配列に関してキメラであるヘキソンタンパク質をコードするように、血清型Ａｄ４に由来してもよく、かつＡｄ３５ヘキソンタンパク質由来の１つまたは複数の断片をコードする第２の異種配列を含むことができる。代替として、本発明のアデノウイルスに基づくワクチンは、例えば、組換えアデノウイルスがＡｄ２５およびＡｄ６８の配列に関してキメラであるヘキソンタンパク質をコードするように、血清型Ａｄ２５に由来してもよく、かつＡｄ６８のヘキソンタンパク質由来の１つまたは複数の断片をコードする第２の異種配列を含むことができる。当然、既存の免疫についての考慮は疾患の標的集団に依存し、特定のアデノウイルス血清型が標的集団における既存の免疫と関連するかどうかは標的集団に依存する。当業者はこの問題を容易に評価し、それに応じて第２の異種配列に対して適切なヘキソン配列を選択することができる。ヘキソン等のアデノウイルス構造タンパク質への異種配列の組み込みは、例えば、米国特許第６，１２７，５２５号に記載されている。

【0106】

特定の実施形態において、第２の異種配列は、超可変領域（ＨＶＲ）をコードするヘキソンのＯＲＦの部分に組み込まれる。例えば、第２の異種配列は、挿入物として、またはヘキソンＨＶＲをコードするＯＲＦの全部もしくは部分を置換するように、組み込まれてもよい。いかなるヘキソンＨＶＲも、この様式で変更または置換することができる。特定の実施形態において、第２の異種配列は、ヘキソンＨＶＲ５コード領域に組み込まれる（および、任意でそれを置換する）。他の実施形態において、第２の異種配列は、ヘキソンＨＶＲ１、ＨＶＲ２、またはＨＶＲ４コード領域に組み込まれる（および、任意でそれを置換する）。どのＨＶＲを変更するかの選択は、異なるＨＶＲの相対的な多様性に基づき得る。例えば、Ａｄ５のＨＶＲ５は、Ａｄ５のヘキソンＨＶＲについて最も大きな多様性を有する。さらに他の実施形態において、１つより多くのヘキソンＨＶＲが挿入または置換を有することができる。したがって、特定の実施形態において、第２の異種配列はヘキソンコード領域のキメラ断片をコードし、ＨＶＲコード領域のうちの少なくとも２つが、挿入を有するか、または置換されている。上述のように、第２の異種配列は、感染性病原体および／または他のアデノウイルス血清型由来の抗原をコードすることができる。したがって、ヘキソンＨＶＲのうちの１つまたは複数が、感染性病原体由来の抗原の挿入を含有していてもよいか、またはそのような抗原もしくは別のアデノウイルス血清型由来のＨＶＲによって置換されてもよい。特定の実施形態において、ヘキソンＨＶＲのうちの１つまたは複数が、挿入もしくは抗原を含有していてもよいか、またはそのような抗原によって置換されてもよく、他のヘキソンＨＶＲのうちの１つまたは複数が、別のアデノウイルス血清型（例えば、標的集団において既存の免疫がほとんど存在しない血清型）由来のＨＶＲによって置換されてもよい。本発明のアデノウイルスベクターに使用することができるキメラのヘキソンコンストラクトの略図を図１３に示す。

【0107】

当業者はヘキソンＨＶＲの境界を容易に特定することができる。ヘキソンＨＶＲは、例えば、Ａｄ５のヘキソンについて特定されている。例えば、米国特許第６，１２７，５２５号を参照のこと。したがって、他の血清型に由来するヘキソンタンパク質のＡｄ５のヘキソンとのアラインメントを、そのような他の血清型においてヘキソンＨＶＲを特定するために用いることができる。代替として、多様な一連のアデノウイルス血清型に由来するヘキソンタンパク質のアラインメントを、ＨＶＲの境界を特定するために用いることができる。Ａｄ４に関して、例えば、ＨＶＲの境界は、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５９４２５４のＬ５ヘキソン配列の１３６〜１７２（ＨＶＲ１）、１９２〜２０８（ＨＶＲ２）、２２７〜２３５（ＨＶＲ３）、２６８〜２７８（ＨＶＲ４）、３００〜３０５（ＨＶＲ５）、３２９〜３３４（ＨＶＲ６）、および４４２〜４８０（ＨＶＲ７〜９）アミノ酸残基に対応する。

【0108】

単一のヘキソンＨＶＲに挿入することができる配列の量は、特定のＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２等）およびＨＶＲの長さに依存する。一般的に、挿入は、ＨＶＲのポリペプチド配列（ＨＶＲ配列が置換されている場合）と、さらに０〜７５、１〜７０、２〜６５、３〜６０、４〜５５、または５〜５０アミノ酸を足した長さに対応するポリペプチド配列をコードすることができる。ヘキソンＨＶＲの挿入は、例えば、Ａｄ５に関して、Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：９８に記載されている。

【0109】

感染性病原体由来の抗原をコードする配列は、ヘキソン配列と抗原配列とが互いに隣接するようにヘキソンＨＶＲを置換することができる。この文脈において用いられる場合、「隣接した」という用語は、ヘキソン配列と抗原配列とを接続するリンカー配列が存在しない、ヘキソンコード配列と抗原コード配列との間のインフレーム融合を指す。代替として、リンカー配列を、ヘキソン配列と抗原配列とを接続するために使用してもよい。特定の実施形態において、リンカー配列は、トリペプチド「ＬＧＳ」をコードする配列である。リンカー配列は、例えば、図１２に示すように、抗原配列の最初および末端に含まれてもよい。理論に束縛されることを意図するわけではないが、ＬＧＳリンカー配列は、構造上の柔軟性を提供し、結果として生じるヘキソン融合タンパク質の安定性を向上させ、かつ／またはヘキソンタンパク質配列と異種配列によってコードされたタンパク質配列との間の接合部の免疫原性を減少させると考えられる。他の実施形態において、リンカー配列は、ペプチド配列「ＧＡＡＡ」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５２）または「ＮＡＡ」をコードする。そのようなリンカー配列は、例えば、異種配列によってコードされるタンパク質のＮ末端上のＧＡＡＡ配列およびＣ末端上の「ＮＡＡ」配列と組み合わせて使用されてもよい。他の適切なリンカー配列が、当業者によって特定され得る。

【0110】

特定の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、第３の異種配列を含む。したがって、特定の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、第１、第２、および第３の異種配列を含む。代替として、本発明のアデノウイルスベクターは、第２および第３の異種配列を含むことができる。第３の異種配列は、第１の異種配列または第２の異種配列について上述したような構造を有することができ、上述のいかなる様式でアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。

【0111】

本発明のアデノウイルスベクターは、現在既知であるかまたは後に発見されるいかなるアデノウイルス血清型または分離株に由来してもよい。例えば、特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、血清型Ａｄ４に由来する。他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、血清型Ａｄ７に由来する。さらに他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、血清型Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ２０、Ａｄ２１、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２８、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、Ａｄ４９、またはＡｄ５０に由来する。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルスに由来する。例えば、いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ Ｃ１、Ａｄ Ｃ３、Ａｄ Ｃ６、Ａｄ Ｃ７、またはＡｄ６８に由来する。

【0112】

本発明のアデノウイルスベクターは、ベクターが由来する野生型アデノウイルスの対応するサイズ（すなわち、ゲノムサイズ）とは異なるサイズであってもよい。しかしながら、一般的に、サイズにおける大幅な変動は、欠損したアデノウイルス複製と関連する。例えば、アデノウイルスゲノムの大部分を欠失させることは、適切なウイルスの複製および機能に必要なゲノム領域の除去につながる可能性がある。それに替えて、大きな挿入を加えることは、アデノウイルスのカプシドに効率的に収容されるには大き過ぎるゲノムをもたらすため、同様に適切なウイルスの複製および機能の妨げとなる。したがって、特定の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、ベクターが由来する野生型アデノウイルスゲノムの長さの約９５％〜約１１０％、約９７％〜約１０５％、約９９％〜約１０３％、約９９．５％〜約１０２％、または約１００％〜約１０１％の長さを有する。他の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、約３４，０００ｂｐ〜約３８，０００ｂｐ、約３４，５００ｂｐ〜約３７，５００ｂｐ、約３５，０００ｂｐ〜約３７，０００ｂｐ、約３５，５００ｂｐ〜約３６，５００ｂｐ、約３５，７５０ｂｐ〜約３６，２５０ｂｐ、または約３６，０００ｂｐの長さを有する。

【0113】

導入された特定の変更（例えば、異種配列の数および種類、欠失の数および種類等）にかかわらず、本発明のアデノウイルスベクターは典型的には複製能力を有する。「複製能力を有する」という用語は、アデノウイルスベクターが対象内で複製する能力を指す。特定の実施形態において、本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターは、ヒト対象において複製することができる。他の実施形態において、本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターは、哺乳動物対象（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、ライオン、トラ、ゾウ、サイ、カバ、キリン、シマウマ、サル、類人猿等の動物園の動物、またはイヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、マウス等のペット）において複製することができる。特定の実施形態において、本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターのインビトロでの（例えば、細胞培養において測定される）バーストサイズは、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、７５００、１０ｋ、１５ｋ、２０ｋ、２５ｋ、３０ｋ、３５ｋ、４０ｋ、４５ｋ、５０ｋ、７５ｋ、１００ｋ、１５０ｋ、２００ｋ、３００ｋ、４００ｋ、またはそれ以上である。他の実施形態において、本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターのインビボでの（例えば、対象における）バーストサイズは、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、７５００、１０ｋ、１５ｋ、２０ｋ、２５ｋ、３０ｋ、３５ｋ、４０ｋ、４５ｋ、５０ｋ、７５ｋ、１００ｋ、１５０ｋ、２００ｋ、３００ｋ、４００ｋ、またはそれ以上である。特定の実施形態において、本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターは、対象において免疫応答（例えば、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または両方）を刺激することができる。特定の実施形態において、免疫応答は、アデノウイルスベクターに挿入されたかまたは組み込まれた異種配列によってコードされるエピトープに対する測定可能な応答（例えば、測定可能な体液性免疫応答もしくは細胞性免疫応答、またはそれらの組み合わせ）を含む。本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターは、標的対象におけるアデノウイルスに対する既存の免疫と関連する問題を克服するのに特に有用である。例えば、特定の実施形態において、同じ抗原を発現する複製不全アデノウイルスベクターの用量と比較してより低い用量の本明細書に記載されるような異種の抗原を発現する複製能力を有するアデノウイルスベクターを用いて、アデノウイルスに対する既存の免疫を有する対象において異種の抗原に対する効果的な免疫応答を誘発することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターの有効量は、複製不全アデノウイルスベクターの有効量よりも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍低い。

【0114】

組換えアデノウイルスベクターを構築、遺伝的操作、および増殖するための技術を、以下に記載する実施例に開示する。また、例えば、ＷＯ２００８／０１０８６４号、米国特許出願第２００６／０１１５４５６号、および米国特許第６，１２７，５２５を参照のこと（それらの内容は、参照により本明細書に組み入れられる）。

【0115】

別の態様において、本発明は、１つまたは複数の本発明のアデノウイルスベクターを含むワクチンを提供する。本明細書で用いられる場合、「ワクチン」という用語は、本発明のアデノウイルスベクターおよび担体を含む組成物を指す。特定の実施形態において、アデノウイルスベクターはウイルスである。他の実施形態において、アデノウイルスベクターはゲノム単独であり、アデノウイルスカプシドを含まない。特定の実施形態において、担体はアジュバントである。そのようなアジュバントの例として、限定されないが、塩、例えば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム、および水酸化アルミニウム；天然ポリマー、例えば、藻類グルカン（例えば、βグルカン）、キトサン、またはイヌリン結晶；合成ポリマー、例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド−コ−グリコリド、またはメチルアクリレートポリマー；ミセル形成カチオン性もしくは非イオン性のブロックコポリマーまたは界面活性物質、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｌ１２１、１２２もしくは１２３、Ｔｗｅｅｎ８０、またはＮＰ−４０；脂肪酸、脂質、または脂質およびタンパク質に基づく小胞、例えば、リポソーム、プロテオリポソーム、ＩＳＣＯＭ、およびコクリエート構造；ならびに合成油または天然油および水溶液からなる界面活性物質で安定化させたエマルションが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のワクチンは、対象に投与されると、対象において免疫応答（例えば、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または両方）を刺激することができる。特定の実施形態において、免疫応答は、ワクチンのアデノウイルスベクターに挿入されるかまたは組み込まれる異種配列によってコードされたエピトープに対する測定可能な応答（例えば、測定可能な体液性もしくは細胞性免疫応答、またはそれらの組み合わせ）を含む。特定の実施形態において、本発明のワクチンは、感染性病原体または癌に対する防御を提供することが可能である。例えば、特定の実施形態において、ワクチンは、（例えば、異種配列によってコードされた）１つまたは複数の抗原に対する免疫応答を刺激することができ、ワクチンを投与されている対象が、後にそのような抗原に遭遇したときに、それまでにワクチンを投与されていなかった場合の免疫応答よりも強い免疫応答を有する。いくつかの実施形態において、本発明のワクチンは、アデノウイルスに対する既存の免疫を有する対象において、感染性病原体または癌に対する防御を提供することができる。他の実施形態において、本発明のワクチンは、病原体感染もしくは癌を寛解させること、および／または病原体感染もしくは癌の少なくも１つの症状を軽減させることができる。例えば、一実施形態において、本発明のワクチンは、病原体感染もしくは癌の症状および／または合併症が、そのような感染または癌に罹患している対象において緩和、軽減、または改善されるように、異種配列によってコードされる１つまたは複数の抗原に対する治療的免疫応答を誘発する。

【0116】

ワクチンのために使用されるアデノウイルスベクターは、当該技術分野で周知の技術に従って哺乳動物に投与するために調製および製剤化することができる。経口投与のための製剤は、所定量の本発明の組換えアデノウイルスベクターを含有するカプセルまたは錠剤；溶液、例えば、水、生理食塩水、オレンジジュース等の摂取可能な希釈物に溶解された有効量の薬物；適切な液体中の懸濁液；および好適なエマルションからなってもよい。

【0117】

本発明のアデノウイルスベクターは、上気道を迂回して腸におけるウイルス複製を可能にするために、前述のように、例えば、経口投与のための腸溶コーティングされたカプセルとして製剤化されてもよい。例えば、Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６７３−６７６，１９９２、Ｈｏｒｗｉｔｚ，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．２１４９−２１７１，１９９６、Ｔａｋａｆｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１４０：４８−５３，１９７９、およびＴｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１２４：１５５−１６０，１９７１を参照のこと。代替として、アデノウイルスベクターは、滅菌食塩水等の従来の溶液中に製剤化されてもよく、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を組み込むことができる。医薬組成物は、他の活性物質をさらに含むことができる。

【0118】

特定の実施形態において、本発明の製剤は、薬学的に許容される担体中にアデノウイルスベクター（例えば、ウイルス）を含む緩衝液を含む。緩衝食塩水、水等の様々な担体を使用することができる。そのような溶液は、一般的に滅菌されており、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌できるか、または滅菌濾過することができる。組成物は、生理的条件に近づくために必要とされる、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤等の薬学的に許容される補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等）を含有してもよい。

【0119】

薬学的に許容される担体は、例えば、組成物を安定させるように、あるいはウイルスおよび／もしくは医薬組成物の吸収を増加または減少させるように作用する、生理学的に許容される化合物を含有することができる。生理学的に許容される化合物には、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストラン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸もしくはグルタチオン、キレート化剤、低分子量タンパク質、同時投与される任意の物質のクリアランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤、または他の安定剤および／もしくは緩衝剤が含まれ得る。組成物を安定させるため、または吸収を増加もしくは減少させるために、界面活性剤も使用することができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば、アデノウイルス調製物の投与経路、および同時投与される任意の物質の特定の生理化学的特徴に依存することを認識するであろう。

【0120】

アデノウイルスベクターはまた、脂質製剤中で投与されてもよく、より具体的には、リポソームとともに複合化されるか、または脂質／核酸複合体に複合化されるか、またはリポソーム中にカプセル化されるかのいずれかであってもよい。本発明のベクターはまた、吸入によって投与されるように、単独で、または他の好適な構成成分と組み合わされて、エアロゾル製剤中に作製されてもよい。ワクチンはまた、鼻腔を介した投与のために製剤化されてもよい。担体が個体である経鼻投与に好適な製剤は、例えば、約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗粉末を含み、鼻から吸い込む様式で、すなわち、鼻に近づけて保持した粉末の容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される。担体が液体である好適な製剤は、例えば、経鼻スプレー、点鼻薬として、またはネブライザーによるエアロゾル投与によって投与するための液体であり、活性成分の水性溶液または油性溶液を含む。いくつかの実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、例えば、直腸内または膣内投与のための座剤として製剤化されてもよい。

【0121】

ワクチンは、単回用量中に約１０^３〜約１０^１３（例えば、約１０^３〜約１０^４、約１０^４〜約１０^５、約１０^５〜約１０^６、約１０^６〜約１０^７、約１０^７〜約１０^８、約１０^８〜約１０^９、約１０^９〜約１０^１０、約１０^１０〜約１０^１１、約１０^１１〜約１０^１２、約１０^１２〜約１０^１３）の組換えアデノウイルスを含む単位投与量を有することができる。投与量は、投与経路に基づいて変化し得る。例えば、舌下または鼻腔内投与のために製剤化されるワクチンは、経口投与のために製剤化されるワクチンよりも低い単回投与当たりの投与量のアデノウイルスを含有し得る。当業者は、過度の実験を行わずして、感染または癌の種類、および使用される投与経路に応じて、特定の患者のために適切な投与量を決定することができる。

【0122】

別の態様において、対象に本発明のワクチンを投与することを含む、対象において本明細書に記載されるいずれかの感染性病原体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、感染性病原体に感染する危険性のある対象に十分な量の本発明のワクチンを投与することを含む、対象に感染性病原体に対するワクチンを接種する方法を提供する。別の実施形態において、対象は、感染性病原体によって誘発された感染を有する。したがって、例えば、一実施形態において、本発明は、感染性病原体によって誘発された感染を経験している対象において治療的免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ワクチンの投与後に、対象において感染の１つまたは複数の症状または合併症が軽減されるかまたは緩和される。本発明のワクチンは、ヒトまたは動物対象にワクチン接種をするために使用されてもよい。

【0123】

本発明のワクチンは、単独で投与され得るか、または他の免疫学的な抗原性のワクチンもしくは治療的組成物と同時投与もしくは順次投与されてもよい。そのような組成物は、免疫応答を増強または拡大するための他の物質、例えば、所定の時間間隔で投与されてもよいか、または持続的に投与されてもよいＩＬ−２もしくは他のサイトカインを含むことができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９７ Ａｐｒ．２４；３３６（１７）：１２６０−１；およびＳｍｉｔｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｓｃｉ Ａｍ．１９９７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１３７−４０を参照）。ワクチンまたはベクターはまた、他のワクチンまたはベクターとともに投与されてもよい。例えば、本発明のアデノウイルスは、異なる血清型のアデノウイルスの投与の前または後のいずれかに投与されてもよい。アデノウイルス調製物はまた、例えば、さらなるワクチン剤を用いるワクチンレジメンにおける初回刺激のために使用されてもよい。

【0124】

アデノウイルス製剤は、全身的に、領域的に、または局所的に送達することができる。領域的投与は、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜下等の特定の解剖学的空間内、または特定の器官への投与を指す。局所的投与は、腫瘤への腫瘍内注射、皮下注射、筋肉内注射等の、限られた、または取り囲まれた解剖学的空間内への組成物の投与を指す。当業者は、局所的投与または領域的投与が、ウイルス調製物を循環器系に進入させ得ることも理解するであろう。典型的な送達経路は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下経路を含む。他の経路は、口腔粘膜（例えば、扁桃腺）への投与を含む経口投与、鼻腔内、舌下、膀胱内（例えば、膀胱の内側）、直腸内、および膣内経路を含む。アデノウイルスの送達のために、しばしば吸入による投与を行うことができる。エアロゾル製剤は、例えば、ジクロロジフルオロ−メタン、窒素等の、加圧された薬学的に許容される噴霧剤中に入れられてもよい。それらはまた、ネブライザーまたは噴霧器等の非加圧調製物のための薬物として製剤化されてもよい。典型的には、そのような投与は、上述のような水性の薬理学的に許容される緩衝剤中でなされる。肺への投与は、例えば気管支鏡を用いて行うこともできる。

【0125】

本発明のワクチンは、例えば、予防ワクチンまたは治療レジメン、および投与経路等、目的の用途に応じて様々な単位剤形で投与することができる。治療的使用に関しては、各患者の特定の状態または疾患、および一般的な健康状態が投与レジメンに影響する。薬学的に許容される賦形剤中のアデノウイルスの濃度は、例えば、１用量当たり約１０^３〜約１０^１３ウイルス粒子、１用量当たり約１０^４〜約１０^１１ウイルス粒子、１用量当たり約１０^６〜約１０^１０ウイルス粒子、１用量当たり約１０^７〜約１０^９ウイルス粒子、または１用量当たり約１０^９〜約１０^１１ウイルス粒子であってもよい。他の実施形態において、薬学的に許容される賦形剤中のアデノウイルスの濃度は、例えば、１用量当たり約１０^３〜約１０^９、約１０^４〜約１０^８、または約１０^５〜約１０^７感染単位であってもよい。

【0126】

本発明の複製能力を有するアデノウイルスベクターは、典型的には、インビボで投与される複製欠損アデノウイルス組換え体によってコードされた導入遺伝子の同等の発現レベルを達成するために必要とされるであろう用量よりも大分低い用量で投与される。複製能力を有するアデノウイルスベクターは、様々な投与量で投与することができる（例えば、米国特許第４，９２０，２０９号；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１２２：２３９−２４８，１９７０；Ｔｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１５５−１６０，１９７１；Ｔａｋａｆｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１４０：４８−５３，１９７９；Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１０：６７３−６７６，１９９２を参照）。例えば、１０^４〜１０^９の５０％組織培養感染量（またはプラーク形成単位）が投与されてもよい。典型的には、複製能力を有するアデノウイルスの経口投与量は、約１０^７の５０％組織培養感染量または１０^７プラーク形成単位である。いくつかの実施形態において、複製能力を有するアデノウイルスの経口投与量は、約１０^１１プラーク形成単位である。アデノウイルス組換え体の典型的な鼻腔内投与は、約１０^３〜約１０^５プラーク形成単位の投与量であることが多い。ウイルスの正確な濃度、製剤の量、および投与頻度は、インビボのレベル、例えば、初回投与後のインサイツでの導入遺伝子発現およびベクターの保持率等に応じて、調節することもできる。

【0127】

ウイルスの量および濃度、ならびに所与の用量の処方、または「治療的に有効な」用量は、臨床医によって決定されてもよい。ワクチンの治療的に有効な用量は、ウイルスベクターに含まれる異種の核酸によってコードされるタンパク質（複数可）に対する免疫応答を刺激するアデノウイルスの量である。投薬スケジュール、すなわち投与レジメンは、例えば、患者の一般的な健康状態、身体的状態、年齢等の様々な要因に依存する。最新技術により、臨床医が、それぞれ個別の患者のための投薬レジメンを決定することが可能である。アデノウイルスは、ヒトワクチンのために何年も安全に使用されている。例えば、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｊａｇ−Ａｈｍａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，５７：２６７，１９８６；Ｂａｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：３８６１，１９８５；ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１７８３２を参照のこと。これらの具体例はまた、本発明の方法を実践する際に投薬レジメンを決定するための指標として用いられ得る。

【0128】

単回または複数回投与のアデノウイルス製剤が、予防用または治療用のワクチンとして投与されてもよい。一実施形態において、防御的または治療的免疫応答を誘発または増強するために、複数回用量（例えば、２回以上、３回以上、４回以上、または５回以上の用量）が対象に投与される。２回以上の用量は、例えば、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月間隔等の定期的な間隔で間を開けられてもよい。

【0129】

さらに別の態様において、本発明はまた、本発明のベクター、ベクターシステム、またはワクチンを含むキットを提供する。キットはまた、例えば、本発明のアデノウイルスを増殖させるための細胞を含んでもよい。キットはまた、そのキットを使用してアデノウイルスを作製するための方法を教示する説明書を含んでもよく、またワクチンのために、投与の適応症、投与の経路および方法等のための指示を含んでもよい。

【0130】

以下の実施例は、本発明の種々の態様を具体的に示すものである。当然、実施例は、本発明の特定の実施形態のみを例示しているに過ぎず、本明細書の最後に添付する特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。

【実施例】

【0131】

実施例１：組換えアデノウイルスベクターの構築
大腸菌の相同組換えを用いて組換えアデノウイルスベクターを迅速かつ確実に生成した。一例として、軍隊用のＡｄ４錠剤（ロット番号４９５８２２１、Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｓ、米国政府認可番号３）から野生型Ａｄ４ウイルスのＤＮＡを単離し、相同組換えにより大腸菌での複製が可能な細菌プラスミドにクローニングした。得られたベクターをｐＰＶ−Ａｄ４ｖａｘと名付けた。

【0132】

野生型Ａｄ４の左アームの合成遺伝子を合成し、合成断片を細菌プラスミドに挿入することによって、ｐＰＶ−Ａｄ４ｖａｘベクターのための出発コンストラクトを作製した。得られたプラスミドをｐＰＶ−Ａｄ４ Ｌｅｆｔ Ａｒｍ ＴＭと名付けた。Ａｄ４合成遺伝子断片の３'末端に付加されたＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩポリリンカーは、後のＡｄ４の右アーム断片の挿入を可能にするように提供された。図１を参照のこと。軍隊用のＡｄ４錠剤から単離したＡｄ４ゲノムＤＮＡから高正確性ＰＣＲによりＡｄ４の右アーム断片を作製し、次いでＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩポリリンカー部位にクローニングした。ｐＰＶ−Ａｄ４ ＲＨＴ＆ＬＦＴ Ａｒｍ ＴＭと名付けた得られたプラスミドは、独特なＸｂａＩ、ＣｌａＩ、およびＳｐｅＩ制限部位によって分離したＡｄ４の左アームおよび右アームの断片を含む。図１を参照のこと。ＸｂａＩおよびＳｐｅＩによる直線化、ならびに脱リン酸化後、野生型Ａｄ４ゲノムＤＮＡとともに、直線化したｐＰＶ−Ａｄ４ ＲＨＴ＆ＬＦＴ ａｒｍ ＴＭベクターを組換え能力を有する細菌ＢＪ１５８３に同時導入した。クローンは、ＴＯＰ１０細胞を再形質転換する前に、制限酵素の消化によりスクリーニングした。配列決定により、ｐＰＶ−Ａｄ４ｐａｘの最終確認を行った。

【0133】

シャトルプラスミドを用いて、Ａｄ４ゲノムの異種配列および修飾をｐＰＶ−Ａｄ４ｐａｘベクターに導入した。シャトルプラスミドは、シャトルベクターとｐＰＶ−Ａｄ４ｖａｘとの間の相同組換えを可能にするために、野生型Ａｄ４の十分なＤＮＡに接した異種配列を含有するように遺伝子操作した。異種配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）をコードする遺伝子を含んでいた。ＨＡ Ｂｂｎ（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＥＵ１９９３６６−「インフルエンザＡウイルス（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２））セグメント４ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子、完全ｃｄｓ」）、ＨＡ ＶＴ／１２０３（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＥＦ５４１４０３−Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））およびＨＡ ＶＴ／１１９４（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＥＦ５４１４０２−Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１））から別個の全長ＨＡ遺伝子を人工的に合成した。シャトルプラスミドとｐＰＶ−Ａｄ４ｐａｘとの間の相同組換えにより、所望の修飾を含有する組換えアデノウイルスベクターを生成した。複数酵素による制限分析およびＤＮＡ配列決定により、組換えアデノウイルスベクターが何であるかを確認した。

【0134】

実施例２：アデノウイルスＭＬＴＵの制御下で異種配列を発現する組換えアデノウイルスベクター
異種配列に対応し、アデノウイルス主要後期転写単位（ＭＬＴＵ）を介してそれらの発現を支持するために、Ａｄ４ゲノムのＥ３領域の部分欠失を生じさせた。部分欠失は、１７８０塩基対からなり、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５９４２５４のヌクレオチド位置２８４４６〜３０２２６に位置していた。部分欠失は、Ｅ３領域の既知の機能を保存する一方で、未知の機能を持つ３つのオープンリーディングフレーム（Ｅ３ ２４．８ｋ、Ｅ３ ６．３ｋ、およびＥ３ ２９．７ｋ）を除去するように設計した。図２を参照のこと。欠失した領域はＡｄ５のＡＤＰ領域に類似するが、Ａｄ４はＡＤＰ様遺伝子をコードしない。

【0135】

異種配列が、ＭＬＰによって駆動される発現のための天然Ｅ３ ２４．８ｋスプライスアクセプターに機能的に結合するように、異種配列をＥ３の部分欠失にクローニングすることにより、種々の異種配列（例えば、ＨＡ Ｂｂｎ、ＨＡ ＶＴ／１１９４、またはＧＦＰ）の発現を内因性アデノウイルスＭＬＴＵに関連付けた。天然Ｅ３ ２４．８ｋスプライスアクセプターはコンセンサスに近いため、配列は修飾を必要としない。翻訳の開始を最も強く促進するために、異種配列のＡＴＧ開始コドン直前の配列をコンセンサスＫｏｚａｋ配列に最適化した。得られた組換えウイルスベクターにおいて、ウイルス複製の初期段階で、内因性Ｅ３プロモーターによる初期の低レベル発現がいくらか起こり得るが、感染細胞内でＤＮＡ複製が開始してＭＬＰが活性化すると、発現は著しく増強される。初期と後期のＥ３遺伝子産物の境界をより良く画定するために、２９ｂｐのＡｄ５ Ｅ３ＡポリＡシグナル配列を含むＤＮＡの小片を異種配列の下流に組み込んだ。Ａｄ５ Ｅ３ＡポリＡ配列と潜在的に類似する配列は、Ａｄ４のさらに下流に見ることができ、初期段階の転写を制御し、異種配列の発現を最大化するのに役立つ可能性がある。

【0136】

ＭＴＬＵによって駆動される異種配列の発現を特徴とする異なる組換えアデノウイルスベクターを表１５に列挙する。Ａｄ４−ＨＡ−Ｂｂｎベクターに関しては、以下に示すように、ゲノムサイズが野生型Ａｄ４の軍隊用株よりも２２塩基対だけ小さい。
ａ）−１７８０ｂｐ Ｅ３領域の部分欠失（ＡＹ５９４２５４のｎｔ２８４４６〜３０２２６）
ｂ）＋１０ｂｐ コンセンサスＫｏｚａｋ配列の５'付加
ｃ）＋１７０１ｂｐ 全長ＨＡ遺伝子（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２））
ｄ）＋１８ｂｐ 残りのポリリンカー
ｅ）＋２９ｂｐ Ａｄ５ Ｅ３ＡポリＡシグナル配列

【0137】

（表１５）インフルエンザ抗原を発現する組換えアデノウイルスベクター

^１天然配列またはコドン最適化配列のいずれかを示す遺伝子に関する記述。

【0138】

実施例３：外因性プロモーターの制御下で異種配列を発現する組換えアデノウイルスベクター
ＣＭＶプロモーター、Ａｄ４トリパータイトリーダー配列、ポリリンカー、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル配列からなる発現カセットのポリリンカーに目的の異種配列を組み込んだ、別の一連の組換えアデノウイルスベクターを作製した。得られた発現カセットをＥ３の全欠失または部分欠失のいずれかを含有するＡｄ４ベクターに組み込んだ。Ｅ３の部分欠失については、実施例２で説明した通りである。３９２６塩基対からなるＥ３の全欠失は、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５９４２５４のヌクレオチド位置２７，３５６〜３１，２８２に位置し、部分的にのみ欠失した変異を２３．３ｋ ＯＲＦのＡＴＧ開始コドンにさらに含んでいた。図２を参照のこと。Ｅ３欠失の種類にかかわらず、Ｅ３ポリＡシグナル配列とＬ５ファイバー遺伝子の間のＡｄ４ベクターに発現カセットを挿入した。図２を参照のこと。

【0139】

ＣＭＶによって駆動される異種配列の発現を特徴とする異なる組換えアデノウイルスベクターを表１５に列挙する。「最適化」とは、抗原配列のコドン最適化を意味する。

【0140】

実施例４：組換えアデノウイルスの生成
組換えアデノウイルスゲノムに対応する直鎖ＤＮＡ断片を用いてＡ５４９（ＭＣＢ）細胞をトランスフェクトすることにより、組換えアデノウイルスを作製した。外来性細菌のプラスミド配列を全て除去するために、直鎖ＤＮＡ断片を切断した。Ａ５４９細胞に細胞変性効果が観察されてから（典型的には７〜１０日後）ウイルスを回収し、より高い収率のために連続継代を行った。ウイルスの本質が正確であることを確実にするために、改良したＨｉｒｔプロトコルを用いてウイルスのＤＮＡを単離し、ＰＣＲ、制限消化、ならびに異種挿入断片およびフランキング領域の配列決定によって分析した。配列は、異種挿入断片およびフランキング領域がヌクレオチドレベルで正確であることが確認された。

【0141】

実施例５：組換えアデノウイルスからの異種配列の発現
組換えアデノウイルスに感染させたＡ５４９細胞を異種配列の発現について分析した。図４は、４つの異なる組換えＡｄ４Ｈ５ＨＡアデノウイルスからのＨＡの発現を示す：内因性ＭＬＰプロモーターの制御下にあるＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＰＶＸＶ０１０３）からのＨ５ＨＡ；ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＰＶＸＶ０１１３）からのＨ５ＨＡ；Ｅ３を全て欠失した、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＰＶＸＶ０１１４）からのＨ５ＨＡ；Ｅ３の部分的に欠失した、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＰＶＸＶ０１２４）からのＨ５ＨＡ。図５は、アデノウイルスベクターＰＸＶＸ０１０１の内因性ＭＬＰおよびアデノウイルスベクターＰＸＶＸ０１１１のＣＭＶプロモーターからのＨＡの発現を示す。リアルタイムＰＣＲ分析により、アデノウイルスベクターＰＸＶＸ０１０１からのＨ３ ＨＡの発現レベルが、遠位にあるアデノウイルスのファイバータンパク質と同様であることが確認された。図６を参照のこと。図７のＦＡＣＳの結果に示すように、これらのコンストラクトを用いた感染から２日後、Ａ５４９細胞の表面にＨＡ抗原が提示された。これらの結果と一致して、ＰＶＸＶ０１０１に感染させたＡ５４９細胞は赤血球とともに凝集することが示された。図９Ａおよび９Ｂを参照のこと。ワンステップ増殖アッセイ（図８Ａ）を用いたところ、ＰＸＶＸ０１０１およびＰＸＶＸ０１１１は、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、およびＨｕＴｕ８０細胞において野生型に近い増殖を示した（図８Ｂ）。

【0142】

実施例６：Ａｄ４ヘキソンのＨＶＲへのインフルエンザ由来抗原の組み込み
図１０は、ヘキソン修飾ベクターを作製するための１つのストラテジーを表す。このストラテジーは、Ａｄ４ヘキソン配列へのサイレント変異の組み込みに依存して、ＨＶＲ領域１〜６を含有するＤＮＡ断片を単一ステップで置換することができる。このストラテジーは、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩクローニング部位の両方をＡｄ４ヘキソンコード領域に組み込む。次いで、合成遺伝子の合成によって各ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ断片が産生される。図１１は、ＨＶＲ領域に対する制限部位の位置を示す。また、必要に応じて、ＸｈｏＩ部位および内因性ＢｓｔＸＩ部位を用いてＨＶＲ７またはＨＶＲ７−９を置換することができる。異なるインフルエンザウイルスのＭ２ｅ配列の周囲に一連のエピトープを設計した（図１２）。配列は、インフルエンザのＨ５、Ｈ７、およびＨ９株由来のＭ２タンパク質にコンセンサスを提供する。ヒトＭ２Ｅは、Ｈ１およびＨ３ Ｍ２ｅのコンセンサス配列を表す。スペーサー配列は、組み込まれた配列を最適な免疫応答の様式で配置するために含まれる。配列は、抗体がエピトープ間の境界まで産生されるのを防ぐように設計される。図１３は、作製することのできる一連の１７ヘキソン修飾を示す。

【0143】

実施例７：Ａ５４９細胞由来のＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ精製ウイルスは、マウスにおいてＨＡ特異的抗体を誘導する
表１６に示すように、精製したＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ ＰＸＶＸ０１０３およびＰＸＶＸ０１１６ウイルスの免疫原性をマウスにおいて検査した。野生型Ａｄ４ウイルス（陰性対照）およびＨ５ ＨＡタンパク質（陽性対照）を対照とした。

【0144】

Ａ５４９細胞をＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ ＰＸＶＸ０１０３（ＭＬＴＵプロモーター）およびＰＸＶＸ０１１６（ＣＭＶプロモーター）ウイルスに感染させた。その後、ウイルスを単離し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。免疫原性試験の各グループにつき、６〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６×Ｂａｌｂ／ｃ Ｆ１マウス６匹を使用した。１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８ｖｐ／マウスの用量漸増法を用いて、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与経路でマウスを０日目に１回免疫し（初回刺激）、次いで１４日目に再び免疫した（追加免疫）。１０日後および２７日後に、後眼窩から出血させて０．２ｍＬの血液を採取し、ＨＡエンドポイントＥＬＩＳＡおよび血球凝集抑制（ＨＡＩ）により血清抗体力価を決定した。

【0145】

簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡアッセイのために、高結合能９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１．５μｇ／ｍｌ（５×１０^９粒子／ｍｌ）のアデノウイルスまたは５μｇ／ｍｌの精製したＨＡタンパク質（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡで２時間ブロックした。プレートに血清の段階希釈液を加えて２時間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、ＨＲＰ結合二次抗体を用いて抗原特異的血清抗体を検出した。ＨＲＰ基質試薬でプレートを発色させ、酸で停止し、ＰｏｌａｒＳｔａｒプレートリーダー上で吸光度を４５０ｎｍで測定した。エンドポイントＥＬＩＳＡ力価を、平均バックグラウンドを３標準偏差上回る読み取り値が得られる最大希釈率の逆数として表す。ＨＡＩ力価の場合、血清の段階希釈液を一定用量（４ＨＡＵ）のインフルエンザウイルスまたはＨＡタンパク質と反応させ、続いてニワトリ赤血球を加えた。中和抗体の存在下では、ウイルスが赤血球を凝集させる能力が阻害される。抗体のＨＡＩ力価は、凝集を阻害することができる血清の最終希釈率の逆数である。

【0146】

（表１６）免疫原、用量、経路

ａ）Ｈ５−Ｖｔｎ（Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１１９４／２００４株由来のヘマグルチニン（ＨＡ））
ｂ）ＭＬＴＵプロモーターによって駆動されるＨＡ導入遺伝子を含むＰＸＶＸ０１０３−Ａｄ４
ｃ）ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＨＡ導入遺伝子を含むＰＸＶＸ０１１６−Ａｄ４ベクター

【0147】

図１４Ａ、ＢおよびＣに示すように、１回および２回の免疫後、それぞれ、約２．５×１０^４および７×１０^４のＥＬＩＳＡにより測定したときに、高用量（１×１０^１０ｖｐ）の精製したＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）ウイルスで免疫したマウスが、強いＨＡ特異的抗体力価を示した。より低い用量のウイルス（１×１０^９ｖｐ）を用いた１回および２回の免疫接種後に、それぞれ、約２．５×１０^３および２×１０^４という、低めではあるものの有意なＨＡ特異的反応も誘発された。使用した最も低いウイルス用量（１×１０^８ｖｐ）では、２回の免疫後に抗体エンドポイント力価８×１０^３という有意な反応が観察された。ＣＭＶによってＨ５導入遺伝子が駆動されると（ＰＸＶＸ０１１６）、約３倍高い抗体応答が誘発された。予想した通り、ＨＡ導入遺伝子を含有しない野生型Ａｄ４精製ウイルス（１×１０^１０ｖｐ）で免疫したマウスは、検出可能なＨＡ特異的抗体応答を誘発しなかった。２回の免疫後、Ｈ５タンパク質は、約７×１０^４というＨＡ抗体エンドポイント反応を誘発した。ＨＡＩ力価に関しては、１×１０^１０ｖｐの精製したＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）ウイルスで免疫したマウスが、１回および２回の免疫後、それぞれ、１：２０および１：４０という有意なＨＡＩ抗体力価を示した。２回の免疫後、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）が、１×１０^９ｖｐというより低い用量で１：２０の有意なＨＡＩ反応を誘発した。野生型Ａｄ４ウイルスにはＨＡ特異的反応は検出されなかった。この場合も同様に、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１１６）が約４倍高いＨＡＩ力価を誘導した。精製したＨ５タンパク質は、２回目の免疫後、１：４０の有意な反応を誘発した。これらの結果は、測定可能なＨＡＩ抗体力価を誘導するために、精製したＨ５タンパク質の免疫を２回必要とした、感染細胞を用いた試験と一致するものであった。

【0148】

精製したＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルスを用いたこれらの免疫原性試験は、マウスにおけるウイルス複製がないにもかかわらず、ウイルスがインビボで細胞に進入し、Ｈ５特異的抗体応答を誘発するのに十分な導入遺伝子が発現されることを示す。

【0149】

実施例８：マウスにおけるアデノウイルス血清型４インフルエンザＨ５ヘマグルチニンワクチンの評価
アデノウイルス血清型４Ｈ５ＨＡワクチンの設計
実施例７に記載したＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）組換えアデノウイルスを、マウスモデルにおけるワクチンとしての安全性、免疫原性、および有効性について評価した。図１５に表すように、Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１１９４／２００４ Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス由来のＨＡ遺伝子を収容するように欠失させたＡｄ４ウイルスのＥ３ ２４．８Ｋ、６．８Ｋ、および２９．７Ｋ遺伝子を用いてＡｄ４Ｈ５ＨＡワクチンを構築した。ＨＡ導入遺伝子の発現を駆動するために、Ｅ３ ２４．８Ｋ遺伝子のスプライスアクセプター部位を保持した。多塩基切断部位を除去してＨＡの天然コード配列を用いた。Ａｄ５に由来するＥ３Ａポリアデニル化シグナル配列をＨＡコード配列の下流に配置した。ＤＮＡの直接配列決定により、ＨＡ導入遺伝子および接しているベクター配列の完全性を確認した。正しい組換えを特定し、単離してから、適切な制限酵素で消化して外来性細菌のプラスミド配列を除去したが、ＨＡ導入遺伝子をコードする完全な組換えＡｄ４ゲノムＤＮＡは保持した。

【0150】

性質決定のためのウイルスを生成するために、この直鎖Ａｄ４Ｈ５ＨＡのＤＮＡ配列による哺乳動物Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）のトランスフェクションを行った。トランスフェクションの１日前に、ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）／１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中、６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の各ウェルに３×１０^５のＡ５４９細胞を播種し、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中３７℃でプレートをインキュベートした。翌日、細胞は５０〜９０％コンフルエントとなり、その後、製造者（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の指示通りに、１ウェル当たり８μＬのＦｕｇｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬を用いて、１ウェル当たり２μｇの直線化したＡｄ４Ｈ５ＨＡのＤＮＡでトランスフェクトした。細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されてから（通常はトランスフェクションから７〜１０日後）、１６ｃｍの細胞スクレーパー（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を用いて感染細胞を取り出すことによって、６つのウェルのうち少なくとも３つからウイルスを回収し、その後、３回の凍結融解サイクルで細胞を破壊した（液体窒素および３７℃の水浴）。４℃、１，８００ｇで１０分間遠心分離にかけてライセートを清澄化し、ツーステップウイルス拡張手順のために約６ｍＬの上清を収集した。最終容量１５ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを含む７５ｃｍ^２フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、上清３ｍＬを用いて懸濁液中１．５×１０^６のＡ５４９細胞を感染させた。ＣＰＥが観察されてから３〜７日以内に、１６ｃｍの細胞スクレーパーを用いて細胞を除去し、凍結融解および清澄化手順に供してウイルス上清を得た。

【0151】

Ａｄ４Ｈ５ＨＡ組換えウイルスからのＨＡの発現を評価するために、インビトロのフローサイトメトリーによりＨＡタンパク質の発現を評価した。Ａｄ４Ｈ５ＨＡウイルス粒子（ｖｐ）の用量漸増法を用いてＡ５４９細胞を感染させ、４８時間後に一次Ｈ５特異的抗体および二次ＰＥ標識抗体を用いて分析した。図１６Ａに示すように、Ａｄ４Ｈ５ＨＡワクチンに感染させたＡ５４９細胞は、用量依存的な様式でＨＡタンパク質を発現した。使用した最も高いワクチン用量に対応する検出されたＨＡタンパク質の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は約３４．０であり、それと比較して、陰性対照として用いたＡｄ４野生型に感染した細胞では約２．０のＭＦＩが検出された。

【0152】

Ａｄ４Ｈ５ＨＡ組換えウイルスによるＨＡタンパク質の誘導をインビトロで確認し、Ａ５４９細胞における１５回の連続継代後の安定した発現を確実にするために、ウエスタンブロット分析を用いた。Ａｄ４Ｈ５ＨＡ組換えウイルスに感染したＡ５４９細胞を収集し、全細胞抽出物を調製した。種々の量の感染細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースに移した。Ｈ５ＨＡ特異的抗血清でＨＡタンパク質を検出する一方で、抗βアクチン抗体をタンパク質のローディング対照として使用した。図１６Ｂに示すように、Ａｄ４Ｈ５ＨＡ組換えウイルスに感染した細胞ライセート（２．５および５％）に由来するＨＡタンパク質は、精製した組換え（ｒ）Ｈ５タンパク質陽性対照（１００および２００ｎｇ）と比較して、適切なサイズである８０ｋＤａで検出された。陰性対照である未感染Ａ５４９細胞（２．５および５％）に由来するタンパク質を用いたところ、ＨＡ特異的タンパク質は検出されなかった。Ａｄ４Ｈ５ＨＡに感染したＡ５４９細胞ライセートにおいて、切断されたＨＡ０に対応するＨＡ１およびＨＡ２断片のわずかなバンドも観察された。ウエスタン分析により、Ａ５４９細胞における１５継代後であっても、Ａｄ４Ｈ５ＨＡ組換えウイルスがＨ５ＨＡを安定して発現したことも確認された。これらの結果と一致して、ＰＶＸＶ０１０３に感染させたＡ５４９細胞は、赤血球とともに凝集することが示された。図１７を参照のこと。

【0153】

ワクチンとしてのＡｄ４Ｈ５ＨＡ組換えアデノウイルスの有効性
組換えウイルスの安全性を検討するために、Ａ５４９、Ｈ１２９９、ＨｅｐＧ２、ＨｕＴｕ ８０、およびＭＲＣ−５のいくつかのヒト細胞株において、Ａｄ４Ｈ５ＨＡウイルスの増殖をＡｄ４野生型ウイルスと比較した。Ａｄ５ウイルスは拡散アッセイ法によって評価することができるが、Ａｄ４は同様の様式では挙動せず、またインビトロでは容易に溶解しない。したがって、増殖動態を評価するために従来のワンステップ増殖アッセイを用いた（図８Ａを参照）。Ａｄ４Ｈ５ＨＡウイルスの増殖は、Ａｄ４野生型ウイルスと比べて同様かまたは減弱であった。図１８を参照のこと。具体的には、感染後４８および７２時間の時点で評価したとき、細胞溶解後に測定した感染粒子は、検査した５つの細胞株のうち４つにおいてＡｄ４野生型ウイルスがＡｄ４Ｈ５ＨＡウイルスよりも１．１〜２．３倍多かった（図１８）。５つめの細胞株Ｈ１２９９に関しては、測定したＡｄ４野生型の感染粒子は、Ａｄ４Ｈ５ＨＡと比べて、４８および７２時間の時点で、それぞれ７〜６．５倍高かった。いかなる場合においても、Ａｄ４Ｈ５ＨＡベクターの増殖はＡｄ４野生型ウイルスよりも高くなかった。

【0154】

免疫原性および有効性評価プロセスの最初の段階は、ワクチンの効力に与える影響を評価するためにＡｄ４野生型ウイルスに対する既存の免疫を確立することであった。したがって、１×１０^９ｖｐのＡｄ４野生型ウイルスでマウスを鼻腔内免疫し、１ヵ月後にＡｄ４特異的中和抗体力価および細胞性免疫を決定した。免疫した１０匹のマウスから抗血清を採取したところ、測定されたＡｄ４特異的中和抗体力価は、それぞれ８６６および５６９の算術幾何平均で、１３３〜３１４０の範囲であった（図１９Ａ）。有意なＡｄ４特異的細胞性免疫もまた誘発された。２匹のマウスからの未精製脾細胞をプールし、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いた。熱処理により不活性化したＡｄ４野生型ウイルスを用いてインキュベーションしたところ、Ａｄ４野生型で免疫したマウスからは１×１０^６の脾細胞当たり１４０個のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）が検出されたのに対し、非免疫マウスからの脾細胞を用いた場合、１８個のＩＦＮ−γＳＦＣが検出された（図１９Ｂ）。これらのマウスおよび既存のＡｄ４野生型免疫を持たない未処理マウスを、Ａｄ４Ｈ５ＨＡワクチンによる免疫のためにその後使用した。

【0155】

Ａｄ４Ｈ５ＨＡワクチンの単回免疫から６週後、有意な血球凝集抑制（ＨＡＩ）抗体力価が測定された。図２０Ａに示すように、用量反応が観察された：１０^９ｖｐ（４０ＨＡＩ）、１０^８ｖｐ（２０ＨＡＩ）、および１０^７ｖｐ（１０ＨＡＩ）。最も低いワクチン用量である１０^６ｖｐは免疫原性ではなかった。Ａｄ４野生型の既存の免疫がワクチンの効力に与える影響が見られ、それによって１０^９ｖｐの用量ではＨＡＩ抗体力価２０が測定されたが、より低い用量は免疫原性ではなかった。Ｈ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジ後、ＨＡ１反応は典型的には１回の希釈で高くなり、例えば、１０^９ｖｐのワクチン用量で４０〜８０および２０〜４０であった。この場合も同様に、最も低いワクチン用量である１０^６ｖｐは免疫原性ではなかった。比較のための陰性および陽性対照として、それぞれ、１×１０^１０ｖｐのＡｄ４野生型ウイルスおよび１５μｇの組換えＨ５ＨＡタンパク質でマウスを免疫した。予想した通り、Ａｄ４野生型ウイルスは、検出可能なＨＡＩ抗体力価反応を誘発しなかった。組換えタンパク質は、１０および２０ＨＡＩ抗体力価のインフルエンザによるチャレンジの前および後に、それぞれＨＡＩ抗体力価反応を誘発した。

【0156】

ワクチンによるＨ５ＨＡ特異的細胞性免疫の誘発を、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４ＨＡタンパク質に由来する４つの１５ｍｅｒペプチドのプールに特異的に評価した（図２０Ｂ）。プール中のペプチドは、ＨＡ．１５６、配列ＫＳＳＦＦＲＮＶＶＷＬＩＫＫＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ＨＡ．２４１、配列ＲＭＥＦＦＷＴＩＬＫＰＮＤＡＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；ＨＡ．３２５、配列ＮＲＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰＱＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、およびＨＡ．５２９、配列ＩＹＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３８）からなっていた。１０^７、１０^８、および１０^９ｖｐの用量のＡｄ４Ｈ５ＨＡワクチンでマウスを免疫すると、８０個を超えるＳＦＣのＩＦＮ−γ応答が測定された。既存のＡｄ４野生型免疫もまたワクチンによる細胞性免疫の誘発に影響を与え、用量１０^９ｖｐのＡｄ４Ｈ５ＨＡワクチンのみが免疫原性であり、約１００個のＩＦＮ−γＳＦＣを誘導した。Ｈ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジから５日後に細胞応答が増強された。既存のＡｄ４野生型免疫の存在下または非存在下において、１０^７、１０^８および１０^９ｖｐの用量のＡｄ４Ｈ５ＨＡワクチンが、３００〜６００個のＩＦＮ−γＳＦＣを誘導した。既存のＡｄ４野生型免疫ならびに１０^７および１０^８ｖｐのワクチン用量の場合、ＳＦＣ５０個未満という最小のＩＦＮ−γ応答がＳＦＣ５００個を超えて増強されることから、たとえより低いワクチン用量であっても細胞応答を刺激したことが示唆されることに留意されたい。全ての場合において、１０^６ｖｐの用量は免疫原性ではなかった。比較対照として、１５μｇの組換えＨ５ＨＡタンパク質で免疫したマウスが、Ｈ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジの前および後に、８０および６８０個のＩＦＮ−γＳＦＣを誘導した。Ａｄ４野生型ウイルスのみで免疫し、その後にＨ５Ｎ１リアソータントウイルスをチャレンジしたマウスには、ウイルスチャレンジから５日後に有意なＨＡ特異的細胞応答は検出されなかった。

【0157】

致死的なＨ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジ後の体重減少、生存率、および肺のインフルエンザウイルス力価の減少は、ワクチン用量依存性であった。Ｈ５Ｎ１リアソータントによるチャレンジから１４日間、動物の体重を測定した（図２１Ａ）。動物が２日連続して元の体重の２０％以上の減少を記録した場合、それらを安楽死させた。典型的には、チャレンジから６〜１２日後に動物を屠殺する必要があった。Ａｄ４野生型ウイルスによる前処理を行わなかった動物には、１０^７、１０^８、および１０^９ｖｐのワクチン用量で、体重減少は全く観察されないか、またはほとんど観察されなかった。Ａｄ４野生型で前処理した場合は、１０^９ｖｐの高いワクチン用量のみが体重減少を阻止した。１０^８ｖｐのワクチン用量（最大平均６％の体重減少）および１０^７ｖｐのクチン用量（最大平均１７％の体重減少）のＡｄ４野生型で動物を前処理した場合には、より低いワクチン用量でより深刻な体重減少が記録された。１０^６ｖｐのワクチン用量を投与された動物では、深刻な体重減少は阻止されなかった。組換えＨ５ＨＡタンパク質で免疫したマウスには体重の減少が見られなかったのに対し、Ａｄ４野生型で免疫したマウスは疾患に陥った。

【0158】

致死的なＨ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジ後のマウスの生存を図２１Ｂに示す。１０^８および１０^９ｖｐのワクチンを投与されたマウスのグループは完全に防御され、マウス１０匹のうち１０匹が生き残った。ベクターに対する既存の免疫を確立するためのＡｄ４野生型を用いたマウスの前処理は、これらの用量では動物の生存に影響を及ぼさなかった。しかしながら、１０^７および１０^６ｖｐというより低いワクチン用量では、ワクチンはそれ程効果的ではなかった。Ａｄ４野生型ウイルスに対する既存の免疫は１０^７ｖｐのワクチン用量に影響を及ぼし、Ａｄ４野生型特異的免疫の存在下において１０匹のマウスのうち３匹のみが生き残ったのに対し、Ａｄ４野生型ウイルスでマウスを前処理しなかった場合は、１０匹のマウスのうち１０匹が生き残った。最も低いワクチン用量である１０^６ｖｐは、防御性ではなかった。Ａｄ４野生型ウイルスによる免疫は動物を防御せず、１０匹のうち生き残ったのは０匹であった。組換えＨ５ＨＡタンパク質を用いたマウスの免疫は、マウスを完全に防御し、１０匹のうち１０匹が生き残った。

【0159】

最後に、有効性の尺度として、Ｈ５Ｎ１リアソータントウイルスによるチャレンジから５日後に、各グループを代表する２匹のマウスから肺を採取し、インフルエンザウイルス力価を評価した（図２１Ｃ）。１０^７、１０^８、および１０^９ｖｐのより高いＡｄ４Ｈ５ＨＡワクチン用量で、８５％を超えるインフルエンザウイルス力価の減少が観察された。例外として、動物グループをＡｄ４野生型で前処理した場合、１０^７ｖｐのワクチン用量がインフルエンザウイルス力価を約４０％減少させたことから、既存のＡｄ４野生型免疫がワクチンの効力に与える影響が示唆される。１０^６ｖｐのワクチン用量または１０^１０ｖｐのＡｄ４野生型陰性対照で免疫した場合、インフルエンザウイルス力価の減少は観察されなかった。組換えＨ５ＨＡタンパク質で免疫したマウスもまた、肺において８５％を超えるチャレンジウイルスの減少を示した。

【0160】

要約すると、Ａｄ４Ｈ５ＨＡワクチンによるＨ５ＨＡ特異的な体液性免疫および細胞性免疫の誘発は、ワクチンの有効性を一般的に予測した。Ａｄ４野生型ベクターに対する既存の免疫は、免疫原性および有効性のどちらにも影響を及ぼさなかったが、より低いワクチン用量で影響がより顕著であったことから、Ａｄベクターに対する既存の免疫は、より高いワクチン用量を使用することによって克服され得ることが示唆される。

【0161】

実施例９：Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）は、複数経路で送達されたときに、哺乳動物のＨ５ ＨＡ導入遺伝子に対する免疫応答を誘発した
組換えＡｄ４−Ｈ５アデノウイルスが種々の投与経路で送達されたときに免疫応答を誘発する際の有効性を評価するために、４つの投与経路のうちの１つを用いて、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）ウイルス粒子を含む異なる製剤でウサギを免疫した。Ａｄ４−Ｈ５−ＶｔｎウイルスワクチンをＭＲＣ−５細胞中で増殖させ、動物試験において使用するために陰イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過によって精製した。原薬（ＢＤＳ）および腸溶コーティングされたカプセルをＰａｘＶａｘで生成し、さらなるＢＤＳをＮｉｒｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）での噴霧乾燥粉末の生成に使用した。種々の製剤の構成成分を以下に記載する。
液状ＢＤＳ： ５×１０^１０のＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルス粒子、ショ糖、塩化マグネシウム六水和物、リン酸カリウム、グリセリン
噴霧乾燥粉末： ５×１０^１０のＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルス粒子、マルトデキストリン、βシクロデキストリン、ショ糖、塩化マグネシウム六水和物、リン酸カリウム、グリセリン、ｔｗｅｅｎ ８０
腸溶コーティングされた噴霧乾燥粉末： ５×１０^１０のＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルス粒子、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ５５、マルトデキストリン、βシクロデキストリン、ショ糖、塩化マグネシウム六水和物、リン酸カリウム、グリセリン、ｔｗｅｅｎ ８０
腸溶コーティングされたカプセル： １×１０^１０のＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ ウイルス粒子（１カプセル当たり）、ＡｃｒｙｌＥＺＥ Ｗｈｉｔｅ、ＨＰＭＣカプセル、マルトデキストリン、βシクロデキストリン、ショ糖、塩化マグネシウム六水和物、リン酸カリウム、グリセリン、ｔｗｅｅｎ ８０

【0162】

上記の異なるＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチン製剤を用いて、ニュージーランド白ウサギの成獣オスを５×１０^１０ｖｐで免疫した（１グループ当たり３匹）：原薬（ＢＤＳ）、腸溶コーティングされた（Ｅ．Ｃ．）および腸溶コーティングされていない（非Ｅ．Ｃ．）粉末、ならびに腸溶コーティングされたカプセル（１×１０^１０ｖｐ／カプセルを５カプセル）。動物は、３０日開けて２回免疫した。以下の複数の投与経路を使用した：筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）、舌下（Ｓ．Ｌ．）、または経口経管栄養（Ｏ．Ｇ．）。２回目の免疫から２週間後、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイのためにウサギを出血させた。例外として、Ｉ．Ｎ．で送達されたＢＤＳについて示されるデータは、１回のみの免疫から２週間後に採取した抗血清からのものである。

【0163】

ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬの精製したｒＨＡタンパク質（ｅＥｎｚｙｍｅ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベーションしてから、洗浄し、１０％ヤギ血清を含むＰＢＳで２時間ブロックした。プールした各血清から３倍段階希釈シリーズを作製し、２時間のインキュベーションの前にプレートに加えた。徹底的に洗浄した後、ＨＲＰ結合二次抗体を用いて抗原特異的血清抗体を検出した。ＨＲＰ基質試薬でプレートを発色させ、酸で停止し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。エンドポイント力価を、平均バックグラウンドを３標準偏差上回る読み取り値が得られる最大希釈率の逆数として表す。結果は、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンが種々の経路で送達されたときに、ウサギにおいて免疫原性であったことを示す（図２２）。

【0164】

別の一連の実験において、組換えＡｄ４−Ｈ５アデノウイルスが舌下、膣内、および直腸内投与経路で送達されたときに免疫応答を誘発する際の有効性を調べた。舌下、膣内、または直腸内投与により、マウスをＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎ（ＰＸＶＸ０１０３）ウイルス粒子で免疫した。舌下投与のために、原薬（ＢＤＳ）製剤緩衝液７μＬ中の１×１０^１０のＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルス粒子を舌下に配置し、典型的には１分の回復時間の間容量を維持し、麻酔下のマウスを０日目に免疫し（初回刺激）、４３日目に増強した（追加免疫）。膣内投与のために、免疫の５日前に２．５ｍｇのＤｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａを皮下投与して膣壁を薄くした。最初に綿棒で粘液を除去し、次いでＢＤＳ製剤緩衝液（容量２０μＬ）中の１×１０^１０ｖｐのＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎを膣内に投与することにより、麻酔下のマウスを０日目に膣内免疫し（初回刺激）、１４日目に増強した（追加免疫）。マウスを麻酔下で１０分間仰臥位のまま維持した。直腸内投与のために、ＢＤＳ製剤緩衝液２０μＬ中の１×１０^１０ｖｐのＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎを直腸内に投与することにより、麻酔下のマウスを０日目に直腸内免疫し（初回刺激）、１４日目に増強した（追加免疫）。マウスを麻酔下で１０分間仰臥位のまま維持した。全てのマウスはイソフルランを用いて麻酔し、免疫の前夜に食餌を除くことにより絶食させた。

【0165】

２回目の免疫（例えば、追加免疫）から２〜４週間後にマウスを出血させ、組換えＨ５（Ａ／ＶＮ／１２０３／０４）を用いて上述のようにＥＬＩＳＡを行った。結果は、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎインフルエンザワクチン（ＰＸＶＸ０１０３）は、舌下、膣内、および直腸内投与経路で送達されると、マウスにおいて有意なＨ５ＨＡ特異的抗体応答を誘発することを示す。図２３を参照のこと。

【0166】

実施例１０：Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンの第Ｉ相臨床安全性試験
第Ｉ相二重盲検プラセボ対照用量漸増試験を開始した。１０^７、１０^８、１０^９、および１０^１０ウイルス粒子（ｖｐ）の４つの投与量のコホートを連続的に登録した。各コホートは、約２４人のワクチンレシピエントおよび８人のプラセボレシピエント、ならびに全員の家庭内接触者（ＨＨＣ）から構成される。各投与量のコホートにおいて、ワクチンまたはプラセボのレシピエントは、５６日開けて（０日目、５６日目、および１１２日目）３回のワクチン接種を受ける。免疫機能の測定は、ＨＡＩおよびマイクロ中和試験によるＨ５ ＨＡに対する抗体；Ａｄ４中和抗体；鼻腔、直腸、および膣内分泌物におけるＨＡおよびＡｄ４に対するＩｇＧおよびＩｇＡの評価；ならびにＨＡおよびＡｄ４に対するＣＭＩ応答を含む。ＰＣＲ、そして直腸および咽頭スワブならびに血液の培養から、Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンウイルスの複製および排泄を評価する。ベースラインのＡｄ４中和抗体力価による層別化によって免疫学的およびウイルス学的パラメータを分析する。現在、１３２人のワクチン／プラセボレシピエントおよび６７人のＨＨＣが登録されている。コホート１〜３には３つ全ての用量を投与し、コホート４には最初の用量を投与した。現在、コホート４は用量２を投与されており、コホート５（１０^１１ｖｐ）の登録が進行中である。

【0167】

主要な安全性パラメータは、反応源性、深刻なまたは重度の有害事象、および臨床安全性検査の異常値である。これらはＤＭＣによる５回のレビューの前に毎回正式に評価されており、また「リアルタイム」で継続的に評価される。最も最近のＤＭＣによるレビューでは、コホート１、２、および３からの３回全ての投薬後、そして、コホート４からの最初の投与後の安全性データが検討された。安全性についての懸念または用量制限毒性は認められなかった。有意な検査異常値または深刻なもしくは重度の有害事象は見られなかった。反応源性は、概ね軽度から中程度のままであった。ワクチン接種から７日後および／または１４日後に、ＰＣＲによって監視したワクチンウイルスの排出が直腸スワブに検出された。ワクチンウイルスの全身または呼吸器への伝播の証拠は見られなかった。ワクチン接種を受けた１人の対象（直腸スワブおよび血液はＰＣＲ陰性であった）からのＰＣＲ陽性咽頭スワブの例を除いて、全ての咽頭スワブおよび血液検体はＡｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎウイルスについて陰性であった。このワクチン接種を受けた対象は、完全に無症状のままであった。これらのデータに基づいて、ＤＭＣは、コホート４に用量２を投与すること、およびコホート５を登録することを承認した。試験中の異なる時点におけるコホートの各々についてのベースラインＡｄ４抗体の状態を表１７に示す。

【0168】

（表１７）Ａｄ４−Ｈ５−Ｖｔｎワクチンの第Ｉ相臨床安全性試験

^＊コホート１には統計的異常があったため、Ａｄ４陽性患者数が少ない。

【0169】

実施例１１：炭疽菌抗原を発現する組換えアデノウイルスの構築および評価
実施例１〜３に記載したのと同様の方法を用いて、バチルス・アントラシス由来の防御抗原（ＰＡ）を発現するＥ３領域の全欠失または部分欠失を含む組換えＡｄ４ウイルスを作製した。ＰＡ導入遺伝子の修飾は、ヒト細胞における発現の最適化のためのコドン修飾、細胞表面発現のためのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの付加、およびサーモリシン切断部位を除去するための２つのフェニルアラニンの欠失を含んだ。ヒトＣＭＶまたは天然ＭＬＴＵプロモーターによって導入遺伝子の発現を駆動した。ＭＴＬＵによって駆動されるかまたはＣＭＶによって駆動される異種配列の発現を特色とする異なる組換えアデノウイルスベクターを表１８に列挙する。

【0170】

（表１８）炭疽菌抗原を発現する組換えアデノウイルスベクター

ＦＤＥ３＝Ｅ３ １２．１ｋを除くＥ３領域の全欠失、ＰＤＥ＝Ｅ３領域の部分欠失

【0171】

２．５×１０^７の組換えＡｄ４−ＰＡアデノウイルスに感染させたＡ５４９細胞（５×１０^５）を防御抗原の発現について分析した。収集する前に細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。各試料からの全細胞ライセート（図２４、左パネル）または細胞培養上清（図２４、右パネル）のいずれかをウエスタンブロットで分析し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。抗ＰＡマウスモノクローナル抗体でニトロセルロース膜をプローブした。陽性対照として並行して使用した市販の組換えＰＡを参照して組換えタンパク質の発現の確認を行った。Ａ５４９およびＡｄ４野生型に感染したＡ５４９は陰性対照を意味し、ｒＰＡに対する特異性を示す。総タンパク質レベルでの相対的な量としてタンパク質レベルを表す。図２４を参照のこと。

【0172】

図２５に示したＦＡＣＳ分析によって示されるように、これらのコンストラクトを用いた感染から１日後、Ａ５４９細胞の表面にＰＡ抗原が提示された。１細胞当たりの発現レベルの指標である蛍光強度の測定値を表す平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、グループの各々について示す。ワンステップ増殖アッセイを用いて、Ａ５４９（肺癌）およびＭＲＣ−５（胚性肺線維芽細胞、二倍体）細胞中のＰＸＶＸ０２１２およびＰＸＶＸ０２１４組換えアデノウイルスの増殖動態を評価した（図８Ａを参照）。Ａ５４９またはＭＲＣ−５細胞のいずれかのｒＡｄ４−ＰＡウイルス感染後、ｒＡｄ４レベルの経時変化をＴＣＩＤ_５０により測定した。最小感染価レベルを参照として細胞バーストサイズを計算し（Ａ５４９は１時間、ＭＲＣ−５は２４時間）、感染における相違を補正した。バーストサイズから、ＰＸＶＸ０２１２およびＰＸＶＸ０２１４の両方がＡｄ４野生型と比較して増殖率の減少を示すこと、そして１細胞当たりのより低い収率をもたらすことが確認された。図２６を参照のこと。

【0173】

実施例１２：炭疽菌によるチャレンジに対する防御ワクチンとしてのＡｄ４−ＰＡ組換えアデノウイルスの有効性
バチルス・アントラシス由来の防御抗原（ＰＡ）を発現する組換えアデノウイルスが、炭疽菌によるチャレンジに対して防御免疫応答を誘発することができるかどうかを決定するために、実施例１１に記載した組換えアデノウイルスベクターのうちの１つに感染させた細胞の全細胞ライセートでマウスを免疫した。具体的には、５×１０^８ウイルス粒子のＡｄ４野生型（Ａｄ４ ＷＴ）、Ａｄ４−ＰＡ（ＰＸＶＸ０２１２）、またはＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩ（ＰＸＶＸ０２１４）に感染させた５×１０^６のＡ５４９細胞と同等の全細胞ライセートの腹腔内注射により、マウス（動物６匹／グループ）を免疫した。陽性対照として、１０μｇの組換え防御抗原（ｒＰＡ）を皮下投与（Ｓ．Ｃ．）した。免疫から５週間後、マウスの静脈内に致死毒素（１２０μｇのＰＡと６０μｇの致死因子（ＬＦ）の組み合わせ）をチャレンジし、毎日監視した。実験の結果を図２７に示す。Ａｄ４−ＰＡ−ＧＰＩ細胞ライセートは、致死毒素によるチャレンジからマウスを完全に防御した。

【0174】

ＩＰ免疫から２１日後に採取した血清から、免疫したマウスにおける抗体応答を測定した。ＥＬＩＳＡ（図２８、左パネル）およびインビトロでのマクロファージに基づく毒素中和アッセイ（図２８、右パネル）の両方により抗体応答を分析した。動物６匹／グループからＥＣ_５０を計算した。組換えアデノウイルスに感染させたＡ５４９細胞の全細胞ライセートによる免疫から３週間後に、ＰＡ特異的ＩｇＧ反応が検出可能であった。

【0175】

別の一連の実験において、精製した組換えアデノウイルスが防御免疫応答を誘発する際の有効性を調べた。図２９の略図に示すように、０日目に５つの異なる抗原（Ａｄ４野生型、Ａｄ４−ＣＭＶ−ＰＡ（ＰＸＶＸ０２１２）、Ａｄ４−ＣＭＶ−ＰＡ−ＧＰＩ（ＰＸＶＸ０２１４）、ｒＰＡおよびｒＰＡ＋アラム）のうちの１つでマウス（ｎ＝２５／グループ）を免疫した。動物１匹当たり５０〜６２．５μＬのＰＢＳ中１×１０^１０ウイルス粒子（ｖｐ）としてｒＡｄ４ウイルスを鼻腔内投与（Ｉ．Ｎ．）した。野生型Ａｄ４ウイルスを陰性対照とした。最終容量１００μＬのＰＢＳ中にて皮下注射された陽性対照は、１０μｇの組換え防御抗原（ｒＰＡ）を単独で、または水酸化アルミニウムゲル（Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ ＨＰＡ）１ｍｇに吸収させたｒＰＡ１０μｇのいずれかを含有していた。免疫から２７日後に、マウス２匹／グループからプールした脾細胞において細胞媒介性免疫応答（ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴ）を測定した。毒素による１回目のチャレンジ（免疫から２０日後、ｎ＝１０／グループ）で生き残ったマウスを５４日目に細胞性免疫応答についてアッセイした。免疫から１４日後および４０日後に、同じ９匹の動物／グループ（５グループ）をＥＬＩＳＡおよび毒素中和アッセイの両方のために出血させた。免疫から４６日後に、出血させた９匹のマウスからの７匹のマウスを含む、１グループ当たり合計１０匹のマウスにも、致死毒素（１２０μｇのＰＡと６０μｇの致死因子（ＬＦ）の組み合わせ）をチャレンジした。チャレンジから３０日間生存を監視した。

【0176】

精製したＡｄ４−ＰＡおよびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩウイルスを用いた鼻腔内免疫から１４日後および４０日後に、血清中の抗体応答を測定した（図２９を参照）。ＥＬＩＳＡにより抗ＰＡ ＩｇＧ反応を分析（図３０、左パネル）する一方で、インビトロでのマウスマクロファージに基づく毒素中和アッセイにより毒素中和抗体（ＴＮＡ）を測定した（図３０、右パネル）。試料の段階希釈のデータに合致するＳ字形の用量反応曲線を用いてＥＣ_５０を計算した。免疫から１４日後、最小の抗ＰＡ ＩｇＧ反応のみが観察され、測定可能なＴＮＡ反応は観察されなかった（図３０）。免疫から４０日後、ｒＰＡまたはアラムを含むｒＰＡと比較して、Ａｄ４−ＰＡ（ＰＸＶＸ０２１２）およびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩ（ＰＸＶＸ０２１４）の両方に有意な抗ＰＡ ＩｇＧおよびＴＮＡ反応が観察された（図３０）。両方の組換えＰＡアデノウイルス（Ａｄ４−ＰＡおよびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩウイルス）が同程度の免疫応答を誘発した。

【0177】

０日目に、図２９に示すような５つの異なる免疫原（ｎ＝１０／グループ）のうちの１つでマウスを免疫し、免疫から２０日後および４６日後に致死毒素（全容量１００μＬのＰＢＳ中の６０μｇのＰＡおよび３０μｇのＬＦ）をチャレンジした。生存を３０日間監視した。結果を図３１に示す。免疫から２０日後のチャレンジ後、ｒＰＡ−アラムで免疫したマウスに８０％の生存率が観察されたのに対し、Ａｄ４−ＰＡおよびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩで免疫したグループは、それぞれ、５０％および２０％の生存率であった（図３１、左パネル）。Ａｄ４野生型で免疫したグループでは１匹のマウスが生き残り、ｒＰＡで免疫したグループでは１匹も生き残らなかった。免疫から４６日後のチャレンジ後、ｒＰＡ＋アラムおよびＡｄ４−ＰＡで免疫したグループで１００％の生存率が観察されたのに対し、Ａｄ４−ＰＡ−ＧＰＩおよびｒＰＡで免疫したグループでは、それぞれ、９０％および３０％の生存率が観察された（図３１、右パネル）。Ａｄ４野生型で処理したグループでは１匹も生き残らなかった。この結果は、致死毒性によるチャレンジにおいて、２つのＡｄ４−ＰＡベクターウイルスが、免疫から２０日後に部分的な防御を付与し、免疫から４６日後に完全な防御を付与することを示唆している。Ａｄ４−ＰＡまたはＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩ組換えアデノウイルスによって与えられた防御に統計的相違は見られなかった。

【0178】

図２９に示すように、免疫から２７日後に、５つの異なる抗原のうちの１つで免疫したマウス（マウス２匹／グループ）からプールした脾細胞において細胞媒介性免疫応答（ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴ）を測定した。毒素による１回目のチャレンジ（免疫から２０日後、ｎ＝１０／グループ）で生き残ったマウスを５４日目（チャレンジから３４日後）に細胞性免疫応答についてアッセイした。組換えＡｄ４−ＰＡおよびＡｄ４−ＰＡ−ＧＰＩ両方のアデノウイルスが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４応答によって示されるＰＡに対するＴｈ１およびＴｈ２応答を誘発した（図３２）。

【0179】

要約すると、この実施例に記載した実験の結果は、防御抗原を発現する組換えアデノウイルスが、マウスにおいて体液性免疫および細胞媒介性免疫の両方を誘発し、致死的な炭疽菌によるチャレンジに対する防御を提供することを示すものである。

【0180】

実施例１３：組換えアデノウイルスからの複数のＨＴＬエピトープポリペプチドの発現
各々がＧＰＧＰＧスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５３）によって分離された、２４個のインフルエンザヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープを含有する合成インフルエンザ抗原配列を設計した。図３３Ａを参照のこと。実施例３に記載したのと同様の方法を用いて、ＣＭＶプロモーターの制御下でこのＨＴＬ２４ポリペプチドを発現するＥ３領域の全欠失を含む組換えＡｄ４ウイルス（ＰＸＶＸ０１０９）を作製した。トランスフェクション後、Ａ５４９細胞をＰＸＶＸ０１０９に感染させて、２つの同一のプラスミドクローン（１５−４および１９−１）からウイルスを作製した。９０％を超える細胞変性効果（ＣＰＥ）で感染細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤を含有する１×１０^６細胞／１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液で細胞ライセートを調製した。陽性対照として、Ａ５４９細胞をＡ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７様）インフルエンザ（ＮＹＭＣ Ｘ−１７５Ｃリアソータント、ＮＩＢＳＣ）に感染させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、その後ブロッティング膜に移した後、抗ＨＡタグモノクロナール抗体およびＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体でタンパク質を検出した。ローディング対照として、抗βアクチンウサギポリクローナル抗体およびＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を用いて、平行して行う膜をプローブした。化学発光（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりタンパク質のバンドを可視化した。図３３Ｂのウエスタンブロット分析の結果に示されるように、組換えＡｄ４アデノウイルスは、高レベルのＨＴＬ２４ポリペプチドを発現した。

【0181】

本明細書で考察および引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。開示される発明は、異なり得るものであって、記載される特定の方法論、プロトコル、および材料に限定されるものではないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。開示される発明は、異なり得るものであって、記載される特定の方法論、プロトコル、および材料に限定されるものではないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0182】

当業者は、ルーチン実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を理解するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]