特許 5904518 免疫寛容誘導剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5904518

(24)【登録日】2016年3月25日

(45)【発行日】2016年4月13日

(54)【発明の名称】免疫寛容誘導剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/197 20060101AFI20160331BHJP

   A61K 33/26 20060101ALI20160331BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160331BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160331BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20160331BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/197

   A61K33/26

   A61K45/00

   A61P37/02

   A61P37/06

   A61P37/08

   A61P17/00

   A61P43/00 121

   C12N5/0784

【請求項の数】15

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-524635(P2014-524635)

(86)(22)【出願日】2013年7月3日

(86)【国際出願番号】JP2013004130

(87)【国際公開番号】WO2014010206

(87)【国際公開日】20140116

【審査請求日】2014年12月10日

(31)【優先権主張番号】特願2012-157374(P2012-157374)

(32)【優先日】2012年7月13日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】508123858

【氏名又は名称】ＳＢＩファーマ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】510136312

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立成育医療研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100188352

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 一弘

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100177714

【弁理士】

【氏名又は名称】藤本 昌平

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100198074

【弁理士】

【氏名又は名称】山村 昭裕

(72)【発明者】

【氏名】田中 徹

(72)【発明者】

【氏名】中島 元夫

(72)【発明者】

【氏名】安部 史紀

(72)【発明者】

【氏名】芳賀 直実

(72)【発明者】

【氏名】高橋 究

(72)【発明者】

【氏名】伊東 秀典

(72)【発明者】

【氏名】梨井 康

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１４５３４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−０１６７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０５０１７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特許第４５４７１７４（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２０１１／０４８７６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１０５３９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５０８８６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０６９９６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Dermatology，２００７年，34(5)，p.320-327

【文献】 Immunopharmacology，１９９８年，40(3)，p.231-240

【文献】 British Journal of Dermatology，２０１１年，165(3)，p.513-519

【文献】 化学と生物，２０１０年，48(6)，p.389-394

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

ＷＰＩ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する、光照射せずに免疫寛容誘導するための免疫寛容誘導剤。

【化1】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）

【請求項2】

式（Ｉ）におけるＲ^１及びＲ^２が、水素原子であることを特徴とする請求項１記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項3】

さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項4】

鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項３記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項5】

鉄化合物が、クエン酸第一鉄ナトリウムであることを特徴とする請求項３記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項6】

制御性樹状細胞の誘導に適用することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項7】

アレルギー性疾患に適用することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項8】

アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎であることを特徴とする請求項７記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項9】

自己免疫疾患に適用することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項10】

自己免疫疾患が強皮症であることを特徴とする請求項９記載の免疫寛容誘導剤。

【請求項11】

請求項１〜５のいずれか記載の免疫寛容誘導剤及びＧＭ−ＣＳＦで、骨髄から採取した細胞を光照射せずにインビトロ処理することを特徴とする制御性樹状細胞を誘導する方法。

【請求項12】

ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；

【化2】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
を含む、光照射せずに免疫寛容誘導するためのキット。

【請求項13】

ａ）請求項１〜５のいずれか記載の免疫寛容誘導剤；
ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ；
を含む光照射せずに制御性樹状細胞をインビトロで誘導するためのキット。

【請求項14】

ａ）請求項１〜５のいずれか記載の免疫寛容誘導剤；
ｂ）自己免疫疾患治療薬；
を含む自己免疫疾患予防・治療剤。

【請求項15】

ａ）請求項１〜５のいずれか記載の免疫寛容誘導剤；
ｂ）鉄化合物；
ｃ）自己免疫疾患治療薬；
を含む自己免疫疾患予防・治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫寛容誘導剤に関し、さらに詳しくは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はそれらの塩を含む、制御性樹状細胞の誘導、アレルギー性疾患、自己免疫疾患等に適用される免疫寛容誘導剤に関する。本発明の免疫寛容誘導剤は、制御性樹状細胞の誘導に加えて、アレルギー性疾患、自己免疫疾患などの不必要な免疫反応が原因となる疾患の治療あるいは予防に有用である。

【背景技術】

【0002】

免疫寛容とは、免疫系が抗原となりうるものを攻撃しない状態を指す。自己の抗原に対しては通常免疫応答が起こらないという「自己寛容」と、非自己抗原であっても一定の投与条件によって誘導される「獲得寛容」がある。非自己抗原においては制御性Ｔ細胞による能動的な抑制が関与していると考えられている。免疫寛容が要求される疾患、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患などは、非自己あるいは自己に対する免疫学的無反応性が崩壊する現象として捕らえることができる。

【0003】

樹状細胞は樹状突起を有する系統マーカー陰性ＭＨＣクラスII陽性の抗原提示細胞であり、造血幹細胞よりミエロイド系やリンパ球系分化経路を経て未熟樹状細胞へ分化し，さらに成熟樹状細胞となるが、樹状細胞は分化系列や成熟段階の異なる多様なサブセットとして、末梢非リンパ組織やリンパ組織に広く存在している。定常状態（非炎症状態）では未熟樹状細胞が大部分を占め、弱い抗原刺激と共刺激を与えうる抗原提示を介してナイーブＴ細胞にクローン除去や不活性化を誘導するとともに免疫抑制能をもつ種々の制御性Ｔ細胞を誘導増幅する。従って、未熟樹状細胞はこれらＴ細胞機能制御機構が関与する免疫寛容の誘導を介して免疫学的恒常性の維持に重要な役割を担っているといわれている。一方、微生物，ウイルス，異物等の外来抗原に侵襲された炎症状態では、これらを捕食した未熟樹状細胞は炎症刺激によって成熟樹状細胞へ分化する。成熟樹状細胞は最も強力な抗原提示細胞として、ナイーブＴ細胞に抗原刺激と共刺激を与え、抗原特異的エフェクターＴ細胞を分化誘導して免疫応答を誘導する。また、炎症状態においても強力な免疫寛容誘導能を示す抗原提示細胞として、制御性樹状細胞（寛容原性樹状細胞と呼ばれることもある）が知られている。

【0004】

制御性樹状細胞については、ヒト樹状細胞又はその前駆細胞をインビトロで少なくともＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを含むサイトカイン類と共に培養し、ヒト免疫制御性樹状細胞を誘導する方法、該方法により得られたヒト免疫制御性樹状細胞、並びに該ヒト免疫制御性樹状細胞を含む医薬組成物（特許文献１参照）や、単離された樹状細胞を、該樹状細胞を感染させるのに十分な量の呼吸器多核体ウイルスと、以下の細胞表面ＣＤ８０^ｈｉｇｈ、ＣＤ８６^ｈｉｇｈ、ＣＤ４０^ｈｉｇｈ及びＣＤ８３^ｌｏｗの細胞表面発現を引き起こす条件下でインキュベートするステップを含む寛容原性樹状細胞を作製する方法（特許文献２参照）や、制御性樹状細胞を含む、炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患（敗血症等）の予防又は治療剤、ＩＬ−１０産生促進剤、アポトーシス抑制剤等（特許文献３参照）に関する技術が知られている。

【0005】

ＡＬＡは、動物や植物や菌類に広く存在するテトラピロール生合成経路の中間体として知られており、通常５−アミノレブリン酸合成酵素により、スクシニルＣｏＡとグリシンとから生合成される。ＡＬＡを用いた光線力学的療法又は光動力学的治療（以下「ＡＬＡ−ＰＤＴ」ともいう）も開発され、侵襲性が低くＱＯＬが保たれる治療法として注目されており、ＡＬＡ等を用いた腫瘍診断・治療剤等が報告されている。また、ＡＬＡは、成人病、がん、男性不妊 の予防改善剤や治療剤として有用であることも知られている（例えば、特許文献４〜６参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００４−２９８１８１号公報

【特許文献2】特表２０１１−５２２８３７号公報

【特許文献3】特開２００６−２９０７６１号公報

【特許文献4】国際公開ＷＯ２０１０／０５０１７９

【特許文献5】特開２０１１−１６７５３号公報

【特許文献6】国際公開ＷＯ２００９／１３９１５６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、安全かつ従来の薬剤とは作用メカニズムの異なる、免疫疾患の治療に応用可能な制御性樹状細胞の誘導剤の他、アレルギー性疾患の予防・治療剤や自己免疫疾患の予防・治療剤等の免疫寛容誘導剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者等は、ＡＬＡの医療への応用に関して様々な検討を続けてきたが、ＡＬＡ単独又はＡＬＡ類と鉄イオン供給源であるクエン酸第一鉄ナトリウム（ＳＦＣ）等の鉄化合物とを含有する組成物が、制御性樹状細胞の誘導作用や、アレルギー性疾患予防・治療作用や、及び自己免疫疾患予防・治療作用を有することを見いだした。

【0009】

また、鉄化合物はＡＬＡと協働して、制御性樹状細胞の誘導作用、アレルギー性疾患予防・治療作用、及び自己免疫疾患予防・治療作用を増強するものであることも見いだした。鉄化合物が十分存在する場合や、鉄化合物を別途摂取する場合は、ＡＬＡ単独の投与で問題がない場合がある。ミネラルの中でも鉄は赤身の肉の摂取量が諸外国に比べて少ない日本人では不足がちである。このため日本人での実施例の一部は同時に添加しているが、貯蔵鉄が十分な人を対象とする場合は必要ない。また、ＡＬＡはポルフィリンに代謝され光照射でＰＤＴ、ＰＤＤ活性を示すことが広く知られているが、本発明の制御性樹状細胞の誘導方法、アレルギー性疾患の予防・治療方法や自己免疫疾患の予防・治療方法には光を必要としない。

【0010】

本発明者らは、さらに投与方法や投与量に関して鋭意検討を重ね、ＡＬＡ類単独、又はＡＬＡ類と鉄化合物とを有効成分とする免疫寛容誘導剤を確立し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち本発明は、以下の通りである。
［１］下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する免疫寛容誘導剤。

【化1】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
［２］Ｒ^１及びＲ^２が、水素原子であることを特徴とする上記［１］記載の免疫寛容誘導剤。
［３］さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする上記［１］又は［２］記載の免疫寛容誘導剤。
［４］鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記［３］記載の免疫寛容誘導剤。
［５］鉄化合物が、クエン酸第一鉄ナトリウムであることを特徴とする上記［３］記載の免疫寛容誘導剤。
［６］制御性樹状細胞の誘導に適用することを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤。
［７］アレルギー性疾患に適用することを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤。
［８］アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎であることを特徴とする上記［７］記載の免疫寛容誘導剤。
［９］自己免疫疾患に適用することを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤。
［１０］自己免疫疾患が強皮症であることを特徴とする上記［９］記載の免疫寛容誘導剤。
［１１］上記［１］〜［１０］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤を対象に投与することを特徴とする免疫寛容の誘導方法。
［１２］上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤を対象に投与することを特徴とする制御性樹状細胞の誘導方法。
［１３］上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤及びＧＭ−ＣＳＦで、骨髄から採取した細胞をインビトロ処理することを特徴とする制御性樹状細胞を誘導する方法。
［１４］上記［１２］又は［１３］記載の方法で誘導された単離された制御性樹状細胞。
［１５］上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤を対象に投与することを特徴とするアレルギー性疾患の予防及び／又は治療方法。
［１６］上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤を対象に投与することを特徴とする自己免疫疾患の予防及び／又は治療方法。
［１７］ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；

【化2】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
を含む免疫寛容誘導キット。
［１８］ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；

【化3】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
を同時又は前後して対象に投与することを特徴とする免疫寛容の誘導方法。
［１９］ａ）上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤；
ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ；
を含む制御性樹状細胞をインビトロで誘導するためのキット。
［２０］ａ）上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤；
ｂ）アレルギー性疾患治療薬；
を含むアレルギー性疾患予防・治療剤の組合せ。
［２１］ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；

【化4】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
ｃ）アレルギー性疾患治療薬；
を含むアレルギー性疾患予防・治療剤の組合せ。
［２２］ａ）上記［１］〜［５］のいずれか記載の免疫寛容誘導剤；
ｂ）自己免疫疾患治療薬；
を含む自己免疫疾患予防・治療剤の組合せ。
［２３］ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；

【化5】

（式中、Ｒ^１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ^２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
ｂ）鉄化合物；
ｃ）自己免疫疾患治療薬；
を含む自己免疫疾患予防・治療剤の組合せ。

【0012】

これら発明の他の態様として以下のものを例示することができる。
［２４］式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する制御性樹状細胞の誘導剤。
［２５］さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする上記［２４］記載の制御性樹状細胞の誘導剤。
［２６］上記［２４］又は［２５］記載の制御性樹状細胞の誘導剤を対象に投与することを特徴とする制御性樹状細胞の誘導方法。
［２７］制御性樹状細胞の誘導に用いるための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩。
［２８］制御性樹状細胞の誘導に用いるための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物を含有する組成物。
［２９］制御性樹状細胞の誘導剤を調製するための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の使用。
［３０］制御性樹状細胞の誘導剤を調製するための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩及び鉄化合物の使用。
［３１］式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有するアレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤。
［３２］さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする上記［３１］記載のアレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤。
［３３］上記［３１］又は［３２］記載のアレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤を対象に投与することを特徴とするアレルギー性疾患の予防及び／又は治療方法。
［３４］アレルギー性疾患の予防及び／又は治療に用いるための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩。
［３５］アレルギー性疾患の予防及び／又は治療に用いるための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物を含有する組成物。
［３６］アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤を調製するための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の使用。
［３７］アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤を調製するための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩及び鉄化合物の使用。
［３８］式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を含有する自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤。
［３９］さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする上記［３８］記載の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤。
［４０］上記［３８］又は［３９］記載の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤を対象に投与することを特徴とする自己免疫疾患の予防及び／又は治療方法。
［４１］自己免疫疾患の予防及び／又は治療に用いるための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩。
［４２］自己免疫疾患の予防及び／又は治療に用いるための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物を含有する組成物。
［４３］自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤を調製するための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の使用。
［４４］自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤を調製するための式（Ｉ）で示される化合物又はその塩及び鉄化合物の使用。

【発明の効果】

【0013】

本発明の免疫寛容誘導剤によると、免疫疾患の治療に応用可能な制御性樹状細胞を誘導することができる。また、本発明の免疫寛容誘導剤によると、アレルギー性疾患の予防・治療や自己免疫疾患の予防・治療を行うことができる。本発明の免疫寛容誘導剤は、従来の免疫抑制剤等と作用メカニズムが異なるため、既存薬と併用することでより効果を高めることも期待される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】樹状細胞特異的な表面マーカーの発現結果を示す図である。

【図2】樹状細胞特異的な免疫関連遺伝子の発現結果を示す図である。

【図3】骨髄から採取した細胞へのＡＬＡの添加により誘導された樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡ）によるエフェクターＴ細胞増殖能阻害効果の結果を示す図である。

【図4】ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡによる制御性Ｔ細胞の誘導能の結果を示す図である。

【図5】ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡによるエフェクターＴ細胞増殖能阻害効果の結果を示す図である。

【図6】ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡ単体による制御性Ｔ細胞の誘導能の結果を示す図である。

【図7】アトピーモデルマウスに対する本発明の免疫寛容誘導剤の症状改善効果を示す図である。

【図8】アトピーモデルマウスに対する本発明の免疫寛容誘導剤の症状改善効果を示す写真である。

【図9】強皮症病態モデルマウスへのＡＬＡ投与による体重及び生存期間への影響を示す図である。

【図10】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの外見を示す写真である。

【図11】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの耳のＨＥ染色切片の観察結果を示す図である。

【図12】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの耳のマッソン染色切片の観察結果を示す図である。

【図13】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの皮膚のＨＥ染色切片の観察結果を示す図である。

【図14】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの皮膚のマッソン染色切片の観察結果を示す図である。

【図15】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの腎臓・皮質周辺のＨＥ染色切片の観察結果を示す図である。

【図16】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの腎臓・皮質周辺のマッソン染色切片の観察結果を示す図である。

【図17】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの腎臓・髄質周辺のＨＥ染色切片の観察結果を示す図である。

【図18】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの腎臓・髄質周辺のマッソン染色切片の観察結果を示す図である。

【図19】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの肝臓のＨＥ染色切片の観察結果を示す図である。

【図20】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの肝臓のマッソン染色切片の観察結果を示す図である。

【図21】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの肺のＨＥ染色切片の観察結果を示す図である。

【図22】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの肺のマッソン染色切片の観察結果を示す図である。

【図23】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの皮膚におけるマーカー遺伝子の発現結果を示す図である。

【図24】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの脾臓におけるマーカー遺伝子の発現結果を示す図である。

【図25】ＡＬＡ投与による強皮症病態モデルマウスの腎臓におけるマーカー遺伝子の発現結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明において「免疫寛容の誘導」とは、ＡＬＡ類又はＡＬＡ類と鉄化合物によって誘導される特定の抗原に対する免疫反応の抑制状態、すなわち、免疫反応レベルの減少、免疫反応の発生又は進行の遅れ、及び／又は免疫反応によるリスクの減少を誘導することをいい、本発明の免疫寛容誘導剤としては、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩（以下、これらを総称して「ＡＬＡ類」ということもある）を有効成分として含むものであれば特に制限されないが、ＡＬＡ類に加えて鉄化合物を含有するものが好ましい。上記本発明の免疫寛容誘導剤、特にＡＬＡ類と鉄化合物を含有する免疫寛容誘導剤を、ヒトの他、家畜・家禽類やペットなどの対象に投与することにより、免疫寛容の誘導や制御性樹状細胞の誘導の他、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療や、自己免疫疾患の予防及び／又は治療を行うことができる。なお、本発明の免疫寛容誘導剤や免疫寛容誘導キットを、制御性樹状細胞の誘導に適用する場合に「制御性樹状細胞誘導剤」や「制御性樹状細胞をインビトロで誘導するためのキット」、アレルギー性疾患に適用する場合に「アレルギー性疾患予防及び／又は治療剤」や「アレルギー性疾患予防及び／又は治療キット」、自己免疫疾患に適用する場合に「自己免疫疾患予防及び／又は治療剤」や「自己免疫疾患予防及び／又は治療キット」と、それぞれいうこともある。

【0016】

本発明の免疫寛容誘導キットとしては、ＡＬＡ類と鉄化合物とを有効成分として個別の薬剤として含み、免疫寛容を誘導するという用途に用いられるキットであれば特に制限されず、かかる免疫寛容誘導キットを用いると、ヒトの他、家畜・家禽類やペットなどの対象における、免疫寛容の誘導や、制御性樹状細胞の誘導や、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療や、自己免疫疾患の予防及び／又は治療を行うことができる。

【0017】

本発明において「制御性樹状細胞」とは、ＡＬＡ類又はＡＬＡ類と鉄化合物によって誘導される、組織障害を起こし得るＴ細胞の活性を抑制する働きのある制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞）の誘導能を有する免疫寛容にかかわる樹状細胞のサブセットであれば特に限定されず、治療の対象となる患者由来の細胞であってもよいし、患者以外の由来の細胞であってもよいが、患者由来の細胞が好ましい。本発明の制御性樹状細胞は、例えば、免疫寛容誘導剤及びＧＭ−ＣＳＦで、骨髄から採取した細胞をインビトロ処理することにより誘導・単離することができる。

【0018】

本発明の制御性樹状細胞をインビトロで誘導するためのキットとしては、上記本発明の免疫寛容誘導剤とＧＭ−ＣＳＦを含み、通常、制御性樹状細胞をインビトロで誘導するために用いる旨の添付文書が添えられている。

【0019】

上記アレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、花粉症、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、蕁麻疹等を挙げることができる。例えば、アトピー性皮膚炎モデルマウスを用いる後述の実施例５記載の実験により、本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤がアトピー性皮膚炎の治療に有効であることを確認することができる。本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤は、特にＡＬＡ類と鉄化合物を含む物が通常用いられる 。

【0020】

上記自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、Good-pasture症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交換性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群等を挙げることができる。例えば、強皮症モデルマウスを用いる実験により、本発明の自己免疫疾患予防及び／又は治療剤が強皮症の治療に有効であることを確認することができる。

【0021】

本発明のアレルギー性疾患予防・治療剤の組合せとしては、上記本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤と、アレルギー性疾患治療薬の組合せや、ＡＬＡ類と鉄化合物とアレルギー性疾患治療薬との組合せであれば特に制限されず、これらの組合せを投与することにより、アレルギー性疾患を予防及び／又は治療することができる。上記アレルギー性疾患治療薬としては、トラニラスト、フマル酸クレマスチン、塩酸シプロヘプタジン、ジフェンヒドラミン、メトジラミン、クレミゾール、メトキシフェナミンなどの医薬品を挙げることができる。本発明のアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤やアレルギー性疾患予防及び／又は治療キットは、既存のアレルギー性疾患治療薬とは作用メカニズムが異なるため、本発明のアレルギー性疾患予防・治療剤の組合せを用いると、相加的な、場合によっては相乗的な効果が期待できる。

【0022】

本発明の自己免疫疾患の予防・治療剤の組合せとしては、上記本発明の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤と、自己免疫疾患治療薬の組合せや、ＡＬＡ類と鉄化合物と自己免疫疾患治療薬との組合せであれば特に制限されず、これらの組合せを投与することにより、自己免疫疾患を予防及び／又は治療することができる。上記自己免疫疾患治療薬としてはコルチコステロイド、シクロホスファミド、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、抗サイトカインモノクローナル抗体、インターフェロンβ、コポリマー１、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ロイフロナミド、プレドニゾン、ＴＮＦαアンタゴニスト、エタネルセプト、インフリキシマブなどの医薬品を挙げることができる。本発明の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤や自己免疫疾患の予防及び／又は治療キットは、既存の自己免疫疾患治療薬とは作用メカニズムが異なるため、本発明の自己免疫疾患の予防・治療剤の組合せを用いると、相加的な、場合によっては相乗的な効果が期待できる。

【0023】

本発明の免疫寛容誘導剤の有効成分として用いられる化合物としては、式（Ｉ）で示される化合物又はその塩（以下、これらを総称して「ＡＬＡ類」ということもある）として例示することができる。δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるＡＬＡは、式（Ｉ）のＲ^１及びＲ^２が共に水素原子の場合であり、アミノ酸の１種である。ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ^１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ^２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である、ＡＬＡ以外の化合物を挙げることができる。

【0024】

上記ＡＬＡ類の中でも式（Ｉ）のＲ^１及びＲ^２が共に水素原子の場合であるＡＬＡ又はその塩を好適に例示することができる。ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるアミノ酸の１種である。また、ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ^１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ^２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である、ＡＬＡ以外の化合物を挙げることができる。

【0025】

式（Ｉ）におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。

【0026】

式（Ｉ）におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。

【0027】

式（Ｉ）におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。

【0028】

式（Ｉ）におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。

【0029】

式（Ｉ）におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。

【0030】

上記ＡＬＡ誘導体としては、Ｒ^１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物や、上記Ｒ^２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が好ましく、上記Ｒ^１とＲ^２の組合せが、ホルミルとメチル、アセチルとメチル、プロピオニルとメチル、ブチリルとメチル、ホルミルとエチル、アセチルとエチル、プロピオニルとエチル、ブチリルとエチルの組合せなどを好適に例示することができる。

【0031】

ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）のＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、投与する形態に応じて、溶解性を上げるための各種の塩、エステル、または生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することができる。例えば、ＡＬＡ及びその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。

【0032】

以上のＡＬＡ類のうち、望ましいものは、ＡＬＡ、及びＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩であり、ＡＬＡ塩酸塩やＡＬＡリン酸塩を特に好適に例示することができる。

【0033】

上記ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。

【0034】

上記鉄化合物としては、有機塩でも無機塩でもよく、無機塩としては、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄を挙げることができ、有機塩としては、カルボン酸塩、例えばヒドロキシカルボン酸塩である、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム等のクエン酸塩や、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム等の有機酸塩や、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、硫化グリシン鉄を挙げることができるが、中でもクエン酸第一鉄ナトリウムやクエン酸鉄ナトリウムが好ましい。

【0035】

上記鉄化合物は、それぞれ単独でも、２種以上を混合しても用いてもよい。鉄化合物の投与量としては、ＡＬＡ類の投与量（ＡＬＡ換算）に対してモル比で０．０１〜１００倍であればよく、０．０５倍〜１０倍が望ましく、０．１倍〜８倍がより望ましい。

【0036】

本発明の免疫寛容の誘導方法、制御性樹状細胞の誘導方法、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療方法、並びに、自己免疫疾患の予防及び／又は治療方法においては、ＡＬＡ類及び鉄化合物を併用投与することが好ましい。特に、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療方法においては、ＡＬＡ類及び鉄化合物を併用投与することが好ましい。これらの場合、ＡＬＡ類と鉄化合物とを含む組成物として、あるいは、それぞれ単独で同時又は前後して投与することができる。それぞれ単独で投与する場合は同時に投与することが好ましいが、それぞれ単独で前後して投与する場合は、ＡＬＡ類と鉄化合物との投与が相加的効果、好ましくは相乗的効果を奏することができるように投与することが好ましい。

【0037】

本発明の免疫寛容誘導剤、制御性樹状細胞の誘導剤、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤、並びに、これらのキットの各成分の投与経路としては、舌下投与も含む経口投与、あるいは、点鼻投与、吸入投与、点滴を含む静脈内投与、パップ剤等による経皮投与、座薬、又は経鼻胃管、経鼻腸管、胃漏チューブ若しくは腸漏チューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができるが、経口投与が好ましい。

【0038】

本発明の免疫寛容誘導剤、制御性樹状細胞の誘導剤、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤、並びに、これらのキットの各成分の剤型としては、上記投与経路に応じて適宜決定することができるが、注射剤、点鼻剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、パップ剤、座剤等を挙げることができる。本発明の免疫寛容誘導剤や、免疫寛容誘導キットの各成分は医薬用途の他、錠剤やカプセル剤のサプリメントの形態で投与することもできる。また特に、嚥下することが困難な高齢者や乳幼児等には、口中において速やかな崩壊性を示す崩壊錠の形態や、経鼻胃管投与に適した液剤の形態が好ましい。

【0039】

本発明の免疫寛容誘導剤、制御性樹状細胞の誘導剤、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤、並びに、これらのキットを調製するために、必要に応じて、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等を添加することができ、具体的には、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。なお、本発明の移植臓器生着促進剤を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要があり、アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐこともできる。

【0040】

本発明の免疫寛容誘導剤、制御性樹状細胞の誘導剤、アレルギー性疾患の予防及び／又は治療剤、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤、並びに、これらのキットは、前記のように、ヒトの他、家畜・家禽類やペットなど獣医分野でも使用することができる。かかる免疫寛容誘導剤等の投与の量・頻度・期間としては、対象がヒトの場合、年齢、体重、症状等により異なるが、ＡＬＡ類の投与量としては、ＡＬＡモル換算で、成人一人あたり、０．１〜１２ｍｍｏｌ／日、好ましくは０．２〜９ｍｍｏｌ／日、より好ましくは０．３〜６ｍｍｏｌ／日、さらに好ましくは、０．３５ｍｍｏｌ／日〜４ｍｍｏｌ／日 を挙げることができ、投与頻度としては、一日単回〜複数回の投与又は点滴等による連続的投与を例示することができる。投与期間は、当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することもできる。

【0041】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

【実施例1】

【0042】

ＡＬＡとＳＦＣを用いて樹状細胞（ＤＣ）を作製し、実際に作製した細胞が制御性Ｔ細胞を誘導し、かつ制御性Ｔ細胞から分泌される炎症抑制性サイトカインであるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）とＩＬ−１０より誘導した制御性ＤＣと同等の機能を有しているか評価した。

【0043】

［骨髄から採取した細胞へのＡＬＡの添加による樹状細胞の誘導］
Ａ／Ｊ（Ｈ２−Ｋ^Ｋ）マウス８週齢から骨髄を採取し、溶血処理により赤血球を除去したのち、培養皿に播種した。ＲＰＭＩをベースとする培地（以降ＲＰＭＩ培地と記載する）にて培養し、二日目よりサイトカインＧＭ−ＣＳＦ１０ｎｇ／ｍｌと同時にＡＬＡ塩酸塩１００μＭ、ＳＦＣ５０μＭを投与し、３日間培養した。培地を新鮮なＲＰＭＩ培地（ＧＭ−ＣＳＦ１０ｎｇ／ｍｌ、ＡＬＡ塩酸塩１００μＭ、ＳＦＣ５０μＭを含む）に交換し、さらに３日間培養した細胞を回収した。この培養法によって得られた細胞を、以降ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡと呼ぶ。

【0044】

［対照群となる成熟樹状細胞様細胞（ＢＭ−ＤＣｃｏｎ）および寛容原性樹状細胞様細胞（ＢＭ−ＤＣｒｅｇ）の誘導］
対照群として、骨髄細胞から誘導したＢＭ−ＤＣｃｏｎ（成熟樹状細胞同様、免疫反応を惹起するエフェクターＴ細胞活性化能力をもつことが既知）、および骨髄細胞から誘導したＢＭ−ＤＣｒｅｇ（制御性樹状細胞同様、免疫反応を抑制する制御性Ｔ細胞活性化能力をもつことが既知）を作製した。ＢＭ−ＤＣｃｏｎは、上記同様の手法により培養皿に播種した細胞に対し、ＲＰＭＩ培地とともに５日間ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加して培養した。その後、同じ組成の新鮮な培地に、新たにリポ多糖（ＬＰＳ）抗原を１μｇ／ｍｌ加え、さらに二日間培養した。なお、理由は、樹状細胞が成熟するためには、抗原となる物質が存在する必要があるためＬＰＳを投与した。ＢＭ−ＤＣｒｅｇは、上記同様の手法により培養皿に播種した細胞に対し、ＲＰＭＩ培地とともに７日間、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びＴＧＦ−β（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し培養した。

【0045】

［得られた細胞が樹状細胞であるかどうかの検討］
前提として、上記３つの手法で得られたＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡ、ＢＭ−ＤＣｃｏｎ、ＢＭ−ＤＣｒｅｇが樹状細胞であることを検討した。すなわち、フローサイトメーターを用いて樹状細胞マーカーＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃの二つで染色し、双方陽性である細胞（すなわち樹状細胞）の数を比較した。結果を図１（最左列）に示す。その結果、いずれの群も大多数がＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ双方陽性であり、樹状細胞へと誘導されていることがわかった。次に、この作製した樹状細胞の機能について検討した。

【実施例2】

【0046】

［樹状細胞特異的な表面マーカーの発現］
ＡＬＡ添加により誘導された樹状細胞が、成熟樹状細胞としての特徴をもっているか、寛容原性樹状細胞としての特徴を持っているかどうか、樹状細胞特異的な表面マーカーの発現を調べた。すなわち、成熟樹状細胞マーカーであるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、Ｉ−Ａ．Ｉ−Ｅ（ＭＨＣクラスII）の発現について、フローサイトメーターを用いて解析した。結果を図１（右の４列）に示す。その結果、既に知られているように、ＢＭ−ＤＣｃｏｎは成熟樹状細胞マーカーが発現しているが、ＢＭ−ＤＣｒｅｇはそれに比べ発現が低下していることがわかった。それに対しＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡは、各成熟樹状細胞マーカー発現がＢＭ−ＤＣｒｅｇと同程度に低かった。すなわち、ＡＬＡ添加によりＢＭ−ＤＣｒｅｇと酷似した樹状細胞が作製できたことを示唆している。

【実施例3】

【0047】

［免疫関連遺伝子の発現］
ＡＬＡ添加により誘導された樹状細胞が、成熟樹状細胞と似た遺伝子発現をしているか、寛容原性樹状細胞と似た遺伝子発現をしているかを調べた。すなわち、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡ、ＢＭ−ＤＣｃｏｎ、ＢＭ−ＤＣｒｅｇからｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより免疫誘導、免疫抑制にかかわる遺伝子の発現を調べた。結果を図２に示す。その結果、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡは成熟樹状細胞マーカーであるＣＤ４０の発現が低い、ＴＧＦ−βの発現が高いなど、多くの遺伝子発現においてＢＭ−ＤＣｒｅｇと類似した遺伝子発現の傾向を示した。一方、ＨＯ−１等の遺伝子においてはＢＭ−ＤＣｃｏｎと類似した遺伝子発現を示した。すなわち、ＢＭ−ＤＣｒｅｇとＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡの性質は完全に一致はしていないが、類似していることが示された。

【実施例4】

【0048】

［ＭＬＲ法による、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡの免疫寛容能の検討］
ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡが、ＢＭ−ＤＣｒｅｇ同様のＴ細胞活性化の抑制、すなわち制御性Ｔ細胞の誘導によりエフェクターＴ細胞増殖を阻害するという免疫寛容を誘導するかどうかについてＭＬＲ（Mixed Lymphocyte Reaction）法により検討した。生体内では、抗原となる異物を認識した成熟樹状細胞はその抗原をＴ細胞に提示する。それを認識したＴ細胞は爆発的に増殖する。インビトロでも、Ｔ細胞と成熟ＤＣを抗原とともに混合培養するとＴ細胞の増殖が見られるため、この増殖率を計測することで成熟ＤＣの活性を計測するのがＭＬＲ法である。また、異系統の成熟ＤＣとＴ細胞を混合すると、抗原なしでも増殖が見られることも知られている。

【0049】

（ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡによるエフェクターＴ細胞増殖能阻害効果の検討）
成熟樹状細胞の機能であるエフェクターＴ細胞増殖を誘導する能力が、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡの存在により抑制できるかどうかＭＬＲ法により検討した。Ｂ６系統マウスの脾臓からナイロンファイバーカラムを用いＴ細胞を分離し、Molecular Probes社のViolet Cell Proliferation Kitで紫に染色した。そのうち２×１０^５cells/wellをＡ／ＪマウスのＢＭ−ＤＣｃｏｎ（成熟樹状細胞の代替として用いる）を１×１０^４cells/wellとともに４日間、ＭＰＲＩ培地中で培養した。その際、ＢＭ−ＤＣｒｅｇもしくはＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡを２×１０^４cells/well加えた。培養後、エフェクターＴ細胞がどれだけ増殖したかを検討するため、フローサイトメーターにより、Ｔ細胞全体（紫色）のうち、どれだけがエフェクターＴ細胞（ＣＤ４，ＣＤ８陽性）で占められているかをカウントした。なお、制御性Ｔ細胞もＣＤ４陽性だが、Ｔ細胞全体に占める割合はごくわずかであるため無視できる。結果を図３に示す。その結果、ネガティブコントロールであるＢＭ−ＤＣｃｏｎとＴ細胞の２種混合培養と比較し、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡを加えた３種混合培養により、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞それぞれの割合が低下した。すなわちＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡはエフェクターＴ細胞の増殖を抑制した。この抑制能は、エフェクターＴ細胞増殖抑制能をもつことが既知であるＢＭ−ＤＣｒｅｇと同等であった。

【0050】

（ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡによる制御性Ｔ細胞の誘導能の検討）
ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡが寛容原性樹状細胞の機能である制御性Ｔ細胞の誘導能をもつかどうかについて検討した。ＦｏｘＰ３遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換したＢ６系統マウスから実施例４と同様の手法によりＴ細胞を採取、染色し、ＢＭ−ＤＣｃｏｎと混合培養した。その際、ＢＭ−ＤＣｒｅｇもしくはＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡを加えた。Ｔ細胞全体（紫色）のうち、ＧＦＰ陽性細胞がどれだけの割合存在するか検討した。結果を図４に示す。その結果、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡの添加により、ＢＭ−ＤＣｒｅｇ同様Ｔ細胞中のＧＦＰ陽性細胞の割合が増加した。すなわち、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡは制御性Ｔ細胞を誘導することが示唆された。

【0051】

ＦｏｘＰ３はフローサイトメーターに適した抗体が存在しないため、フローサイトメーターでＦｏｘＰ３の発現を確認する手段として、上記ノックインマウスを用いた。制御性Ｔ細胞への分化シグナルによりＦｏｘＰ３が発現しようとすると、代わってＧＦＰが発現する。紫のＴ細胞中のＧＦＰ陽性細胞の割合をカウントすることで、ＦｏｘＰ３陽性（となるはずであった）細胞の割合、すなわち誘導能をアッセイできる。また、図３や図５に示されているＢ６系統マウスもＧＦＰノックインマウスであるが、調べたいパラメータであるＣＤ４やＣＤ８には影響しないことが確かめられている。

【0052】

（エフェクターＴ細胞増殖能阻害効果の検討）
ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡを単体でＴ細胞と混合培養した場合、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡはエフェクターＴ細胞増殖能阻害効果においてＢＭ−ＤＣｒｅｇと似た挙動を示すか検討した。実施例４と同様の手法によりＢ６系統マウスからＴ細胞を採取・染色し、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡと混合培養した。培養後、フローサイトメーターにより、Ｔ細胞全体（紫に染色）のうち、どれだけがエフェクターＴ細胞で占められているかをカウントした。結果を図５に示す。その結果、ＢＭ−ＤＣｃｏｎとの２種混合培養時と同程度のエフェクターＴ細胞（ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性）の割合であった。一方、ＢＭ−ＤＣｒｅｇとＴ細胞の２種混合培養はＢＭ−ＤＣｃｏｎ、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡとの混合培養時と異なり、エフェクターＴ細胞の割合は低かった。すなわち、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡ単独ではエフェクターＴ細胞増殖能阻害効果はなく、むしろ増殖を促進するという成熟樹状細胞様の働きをもつ。このことより、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡはＢＭ−ＤＣｒｅｇと完全に同一な細胞ではないことが示唆された。

【0053】

（ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡ単体による制御性Ｔ細胞の誘導能の検討）
ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡを単体でＴ細胞と混合培養した場合、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡは制御性Ｔ細胞の誘導においてＢＭ−ＤＣｒｅｇと似た挙動を示すか検討した。実施例４と同様の手法によりＦｏｘＰ３遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換したＢ６系統マウスからＴ細胞を採取・染色し、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡと混合培養した。培養後、Ｔ細胞全体（紫に染色）のうち、ＧＦＰ陽性細胞がどれだけの割合存在するか検討した。結果を図６に示す。その結果、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡの添加により、ＢＭ−ＤＣｒｅｇ同様Ｔ細胞中のＧＦＰ陽性細胞の割合が増加した。すなわち、ＢＭ−ＤＣ_ＡＬＡは単独でも制御性Ｔ細胞を誘導することが示唆された。

【0054】

以上の実施例１〜４に示す結果から、インビトロにおいて、ＡＬＡとＳＦＣを用いて誘導したＢＭＤＣの細胞表面分子発現やＴ細胞増殖の抑制、Ｔｒｅｇの増加機能等ついて、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０を用いて誘導した制御性ＤＣと同様な結果を得ることができた。

【実施例5】

【0055】

［アトピーモデルマウスの作製］
マウスは１０週齢のオスＮＣ／Ｎｇａ系統を用いた。アレルゲンとして２，４，６−トリニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ）を使用し、アトピー症状を惹起した。Ｄａｙ０において胸部、腹部、背部を剃毛し、エタノール：アセトン（４：１）に溶かした２％のＴＮＣＢ、及び４％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１５０μｌ（胸部５０μｌ、腹部５０μｌ、背部５０μｌ）滴下した。ＳＤＳ投与は皮膚によるアレルゲンからのバリアを破壊するためである。その後、ｄａｙ４，１１，１８においてＳＤＳなしで、１％のＴＮＣＢのみを滴下した。

【0056】

［免疫寛容誘導剤の投与］
ＡＬＡ＋ＳＦＣは毎日ゾンデにて経口投与した。その際、濃度はＡＬＡ塩酸塩（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）、あるいはＡＬＡ塩酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１．５ｍｇ／ｋｇ）の二条件とした。

【0057】

［ＡＬＡ＋ＳＦＣの症状改善効果］
アトピー症状の評価系として、皮膚炎スコアリングと耳介の厚さを用いた。前者は視認による皮膚炎の症状の判定である。背中と両耳の皮膚の損傷を、紅斑／出血、浮腫、擦りむき／表皮のはがれ、かさぶた／乾燥の４つの基準でスコアリングしたのち、各症状のスコアの合算値を算出した。グレードは０（症状なし）、１（穏やか）、２（中程度）、３（深刻）に分かれる。ｄａｙ１１，１８，２５においてスコアリングを行った。結果を図７（左）に示す。後者について、屠殺したマウスの両耳を１０％の中性ホルマリンに２４時間、４℃浸漬し、固定した。次に組織をパラフィン固定し、厚さ４μｍでスライスした。切片をＨ＆Ｅ溶液で染色し、顕微鏡観察により厚さを計測した。こちらも同様にｄａｙ１１，１８，２５においてスコアリングを行った。結果を図７（右）に示す。また、ｄａｙ１８における各投与群のマウスの写真を図８として示す。

【0058】

図７及び８からわかるように、滅菌水投与群、ＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）投与群、ＡＬＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１．５ｍｇ／ｋｇ）投与群における皮膚炎をｄａｙ１１，１８，２５においてスコアリングした結果、ＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）投与群、及びＡＬＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１．５ｍｇ／ｋｇ）投与群は、滅菌水投与群と比較して顕著に改善が見られた。同様に耳介の厚さを計測した結果、ＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１５ｍｇ／ｋｇ）投与群、及びＡＬＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＦＣ（１１．５ｍｇ／ｋｇ）投与群は、滅菌水投与群と比較して顕著に改善が見られた。

【実施例6】

【0059】

［強皮症病態モデルの作製］
ドナーとしてＢ１０．Ｄ２メス（７−８週齢）野生型マウス、レシピエントとしてＲａｇ−２／Ｂａｌｂ／ｃメス（７−８週齢）免疫不全マウスを用いた。ドナーマウスから脾臓細胞を各群５×１０^７個、又は４×１０^７個ずつレシピエントへ注射（移植）することにより強皮症病態モデルマウスを作製した。レシピエントは免疫不全であるため、レシピエント側による拒絶反応は起こらず、ドナーより移植された脾臓細胞がレシピエント側の免疫系により除去されることもないが、ドナーから移植された脾臓細胞に含まれるリンパ球にとってレシピエントそのものが異物であるため、ドナー由来リンパ球がレシピエントの全身を攻撃する。この反応が呈する全身性炎症、組織線維症、広範な全身性硬化症等の症状はヒトの強皮症（硬皮症）に酷似しているため、強皮症病態モデルとして用いることができる。

【0060】

［免疫寛容誘導剤の投与］
ドナーの脾臓細胞移植直後から９週間にわたり、ＡＬＡ塩酸塩１００ｍｇ／ｋｇ＋ＳＦＣ１５７ｍｇ／ｋｇ（以下、「ＡＬＡ」と表記）を毎日一回、ゾンデを用いて投与した。

【実施例7】

【0061】

［ＡＬＡ投与による体重及び生存期間への影響］
強皮症発症による体重減少がＡＬＡにより緩和されるか、また生存期間が延びるか検討した。その結果、図９に示すように、ＡＬＡ投与により、体重減少の抑制傾向が観察された。また、ＡＬＡ投与により９週目までの生存率が高い傾向が見られた。そしてまた、各群における代表的な外見を図１０に示す。ＡＬＡ投与により脱毛が緩和されていることが観察できる。なお、対照（control）は、ドナーマウス由来の脾臓細胞を移植していない、Ｒａｇ−２／Ｂａｌｂ／ｃメス（７−８週齢）免疫不全マウスのデータである。以上のとおり、ＡＬＡ投与により、強皮症の症状緩和効果が見られた。

【実施例8】

【0062】

［ＡＬＡ投与による組織への影響（組織染色）］
強皮症の症状である線維化や免疫細胞の集積（炎症）がＡＬＡ投与により緩和されているかどうかを上記モデルマウス由来の組織染色により確認した。炎症による耳、皮膚、腎臓、肝臓、肺の様子を観察するため、各臓器の切片を作製し、Ｔ細胞の集積を確認するためのＨＥ染色、及びコラーゲンを有する結合組織を染めるマッソン（Masson）染色を行った。細胞移植前のナイーブ（Naive）、ＡＬＡ非投与６週目、ＡＬＡ投与６週目の３条件において、×４０、×１００、×２００、×４００の４つの倍率でＨＥ染色切片及びマッソン染色切片を観察し、ＡＬＡ投与により症状が緩和されているか確認した。

【0063】

［耳］
ＨＥ染色切片の観察結果を図１１に示す。その結果、ＨＥ染色切片ではＡＬＡ投与により所見の大きな違いは観察されなかった（中段と下段の比較）。同様に、マッソン染色切片の観察結果を図１２に示す。その結果、ＡＬＡ投与群はコラーゲン蓄積（濃く染色された部分の密度で示される）が非投与群に比べ抑制されていた（中段と下段の比較）。

【0064】

［皮膚］
皮膚の線維化は強皮症のもっとも代表的な症状の一つである。ＨＥ染色切片の観察結果を図１３に示す。その結果、ＨＥ染色切片ではＡＬＡ投与により所見の大きな違いは観察されなかった（中段と下段の比較）。同様に、マッソン染色切片の観察結果を図１４に示す。その結果、ＡＬＡ投与群はコラーゲン蓄積が非投与群に比べ抑制されていた（中段と下段の比較）。

【0065】

［腎臓・皮質周辺］
ＨＥ染色切片の観察結果を図１５に示す。その結果、ＨＥ染色切片ではＡＬＡ投与により所見の大きな違いは観察されなかった（中段と下段の比較）。同様に、マッソン染色切片の観察結果を図１６に示す。その結果、ＡＬＡ投与群はコラーゲン蓄積が非投与群に比べ抑制されていた（中段と下段の比較）。

【0066】

［腎臓・髄質周辺］
ＨＥ染色切片の観察結果を図１７に示す。その結果、ＨＥ染色切片ではＡＬＡ投与により所見の大きな違いは観察されなかった（中段と下段の比較）。同様に、マッソン染色切片の観察結果を図１８に示す。その結果、ＡＬＡ投与群はコラーゲン蓄積が非投与群に比べ抑制されていた（中段と下段の比較）。

【0067】

［肝臓］
ＨＥ染色切片の観察結果を図１９に示す。その結果、ＨＥ染色切片ではＡＬＡ非投与群では細胞の集積が見られたが、ＡＬＡ投与群では見られなかった（中段と下段の比較）。同様に、マッソン染色切片の観察結果を図２０に示す。その結果、ＡＬＡ投与により所見の大きな違いは観察されなかった（中段と下段の比較）。

【0068】

［肺］
ＨＥ染色切片の観察結果を図２１に示す。その結果、ＨＥ染色切片ではＡＬＡ投与により所見の大きな違いは観察されなかった（中段と下段の比較）。同様に、マッソン染色切片の観察結果を図２２に示す。その結果、ＡＬＡ投与により所見の大きな違いは観察されなかった（中段と下段の比較）。

【実施例9】

【0069】

［ＡＬＡ投与による組織への影響（遺伝子発現）］
強皮症の症状である線維化や炎症がＡＬＡ投与により抑制されているかどうかを上記モデルマウス由来の組織における各種マーカー遺伝子の発現をＡＬＡ投与３週間後、６週間後、及び９週間後にそれぞれ検出することにより確認した。皮膚、腎臓、脾臓組織からRNeasy mini kitにより抽出したｍＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲにより炎症、線維化等に関わる遺伝子の発現を調べた。対照としてはＢａｌｂ／ｃオス（７−８週齢）マウスを用いた。

【0070】

上記マーカー遺伝子として、ＨＯ−１（抗酸化タンパク質であり、ｒｅｇＤＣを誘導すると考えられる）遺伝子、ＴＧＦ−β（炎症抑制性サイトカイン）遺伝子、ＩＦＮ−γ（炎症促進、抑制の両義的なサイトカイン）遺伝子、Collagen-1（線維化マーカー）遺伝子、α−ＳＭＡ（線維化マーカー）遺伝子、ＩＬ−６（炎症性サイトカイン）遺伝子、オステオポンチン（ＯＰＮ）（炎症性サイトカイン）遺伝子、ＩＬ−２１（自己免疫疾患において多く産生されることが知られている）遺伝子、ＴＮＦ−α（炎症性サイトカイン）遺伝子、ＩＬ−１０（炎症抑制性サイトカイン）遺伝子、及びＦｏｘＰ３（制御性Ｔ細胞マーカー）の発現を調べた。

【0071】

［皮膚］
皮膚の線維化は強皮症のもっとも代表的な症状の一つである。皮膚における結果を図２３に示す。皮膚では、ＡＬＡ投与により線維化マーカーであるcollagen-1(図２３の右最上)、α−ＳＭＡ(図２３の右の上から３つ目）の顕著な低下が見られ、ＡＬＡ投与が強皮症の症状である線維化を緩和したことが示唆される。

【0072】

［脾臓］
脾臓における結果を図２４に示す。脾臓では、ＡＬＡ投与により制御性Ｔ細胞マーカーであるＦｏｘＰ３（図２４の右の上から３つ目）、制御性Ｔ細胞が産生する炎症抑制性サイトカインであるＩＬ−１０の上昇傾向（図２４の右の最下）が見られ、ＡＬＡによる制御性Ｔ細胞の活性化が示唆される。

【0073】

［腎臓］
腎臓における結果を図２５に示す。腎臓では、免疫寛容を誘導すると考えられ、ヘムにより誘導されるＨＯ−１の上昇（図２５の左最上）と、線維化マーカーであるCollagen-1の低下傾向（図２５の右の上から２つ目）、炎症性サイトカインであるＩＬ−６減少傾向、オステオポンチン（ＯＰＮ）の減少（図２５の上から３つ目）が見られ、ＡＬＡが炎症を抑え、線維化を予防していることが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0074】

本発明の制御性樹状細胞の誘導剤、アレルギー性疾患予防及び／又は治療剤、自己免疫疾患予防及び／又は治療剤等の免疫寛容誘導剤は、医薬・医療の分野で有利に使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】