特許 5907880 クラスタリングを用いて生物学的持続状態の存在を検出するためのシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5907880

(24)【登録日】2016年4月1日

(45)【発行日】2016年4月26日

(54)【発明の名称】クラスタリングを用いて生物学的持続状態の存在を検出するためのシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G06F 19/24 20110101AFI20160412BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160412BHJP

   G06F 17/30 20060101ALI20160412BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160412BHJP

【ＦＩ】

   G06F19/24

   C12Q1/68 AZNA

   G06F17/30 170F

   !C12N15/00 A

【請求項の数】32

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2012-539000(P2012-539000)

(86)(22)【出願日】2010年11月12日

(65)【公表番号】特表2013-510579(P2013-510579A)

(43)【公表日】2013年3月28日

(86)【国際出願番号】US2010056455

(87)【国際公開番号】WO2011060222

(87)【国際公開日】20110519

【審査請求日】2013年10月24日

(31)【優先権主張番号】61/261,147

(32)【優先日】2009年11月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510005889

【氏名又は名称】ベックマン コールター， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ル， ジュリュ

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ジフア

(72)【発明者】

【氏名】レイス， アントニオ アレバロ

(72)【発明者】

【氏名】グスタフソン， エリック アラン

(72)【発明者】

【氏名】ライリー， ジョン スティーブン

【審査官】 松野 広一

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５３１２５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００３０６３７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０１８０００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１２９４２８（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０６Ｆ １９／１０−１９／２８

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｇ０６Ｆ １７／３０

Ｃ１２Ｎ １５／０９

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するための方法であって、該方法は、
デジタルコンピュータに、少なくとも、複数の既知試料と関連する、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップであって、ここで、各既知試料が、該複数の第１の入力値中の第１の入力値、該複数の第２の入力値中の第２の入力値、および該複数の第３の入力値中の第３の入力値を包含するステップと、
該第３の遺伝子エレメントと関連する閾値を決定するステップと、
該閾値を用いて、該既知試料を、既知試料の第１のセットおよび既知試料の第２のセットへと区分するステップと、
既知試料の該第１のセットを、該第１の遺伝子エレメントおよび該第２の遺伝子エレメントにより定義される特徴空間においてクラスタリングするステップと、
既知試料の該第１のセットを用いて第１の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第１の境界空間が、ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップと、
既知試料の該第２のセットを用いて第２の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第２の境界空間が、該ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップを含み、
ここで、該第１の遺伝子エレメントがｍｅｃＡを含み、該第２の遺伝子エレメントがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含み、該第３の遺伝子エレメントがＯｒｆＸを含み、
該ある生物学的持続状態がＭＲＳＡ持続状態を含む、方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法であって、前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡを含む、方法。

【請求項3】

前記第１の境界空間および前記第２の境界空間を、それぞれ、第１の楕円および第２の楕円により定義する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値が、Ｃｔ値である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

入力するステップの前に、
前記既知試料を、該既知試料中の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
少なくとも、前記第１の遺伝子エレメント、前記第２の遺伝子エレメント、および前記第３の遺伝子エレメントを増幅し、該少なくとも、前記第１の遺伝子エレメント、前記第２の遺伝子エレメント、および前記第３の遺伝子エレメントの存在および量を検出するステップ
をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法を実装するための、プロセッサにより実行可能なコードを含む、媒体。

【請求項7】

請求項６に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体と、該コンピュータにより読み取り可能な媒体に接続されたプロセッサを含む、デジタルコンピュータ。

【請求項8】

請求項７に記載のデジタルコンピュータに接続された測定モジュールを含むシステム。

【請求項9】

保存するために形成されるメモリを含むデジタルコンピュータによって実行される、請求項１から５のいずれかに記載の方法により創出される解析モデルを用いる方法であって、
第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値が未知試料と関連し、ここで、該第１の入力値、該第２の入力値、および該第３の入力値が、該未知試料中の前記第１の遺伝子エレメント、前記第２の遺伝子エレメント、および前記第３の遺伝子エレメントと関連し、
該デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータを用いて、前記第１の境界空間または前記第２の境界空間を用いて、該未知試料を、前記ある生物学的持続状態と関連するものとして分類されることを特徴とし、
前記ある生物学的持続状態が、ＭＲＳＡ持続状態を含む、方法。

【請求項10】

ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別する、解析モデルを創出する方法であって、
デジタルコンピュータに、複数の既知試料と関連する、少なくとも、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップと、
該デジタルコンピュータを用いて、少なくとも該複数の第１の入力値、および第２の遺伝子エレメントと関連する少なくとも該第２の入力値を用いて、１つ以上の中間値を創出するステップと、
該デジタルコンピュータを用いて、該１つ以上の中間値、および該複数の第３の入力値を用いて、該ある生物学的持続状態についての境界空間を創出するステップであって、ここで、
該境界空間が、該ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別するステップを含み、
該第１の遺伝子エレメントがｍｅｃＡを含み、該第２の遺伝子エレメントがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を含み、該第３の遺伝子エレメントがＳＣＣｍｅｃを含み、
該ある生物学的持続状態がＭＲＳＡ持続状態を含む、方法。

【請求項11】

前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列がｆｅｍＡを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記境界空間を、楕円により定義する、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

費用関数を用いて前記楕円を最適化する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値が、Ｃｔ値である、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

入力するステップの前に、
前記試料を、該試料中の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
少なくとも、前記第１の遺伝子エレメント、前記第２の遺伝子エレメント、および前記第３の遺伝子エレメントを増幅し、その存在および量を検出するステップ
をさらに含む、請求項１０から１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

ＳＣＣｍｅｃがｏｒｆＸ接合部にある、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ接合部の検出は、ＳＣＣｍｅｃの存在を示す、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

請求項１０から１７のいずれか１項に記載の方法を実装するための、プロセッサにより実行可能なコードを含む、コンピュータにより読み取り可能な媒体。

【請求項19】

請求項１８に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体と、該コンピュータにより読み取り可能な媒体に接続されたプロセッサを含む、デジタルコンピュータ。

【請求項20】

請求項１９に記載のデジタルコンピュータに接続された測定モジュールを含むシステム。

【請求項21】

保存するために形成されるメモリを含むデジタルコンピュータによって実行される、請求項１０から１７のいずれかに記載の方法により創出される解析モデルを用いる方法であって、
第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値が未知試料と関連し、ここで、該第１の入力値、該第２の入力値、および該第３の入力値が、該未知試料中の前記第１の遺伝子エレメント、前記第２の遺伝子エレメント、および前記第３の遺伝子エレメントと関連し、
該未知試料を、前記境界空間を用いて、前記ある生物学的持続状態と関連するものとして分類されることを特徴とする、方法。

【請求項22】

前記第１の境界空間および前記第２の境界空間がいずれも、楕円の境界空間である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

前記第１の境界空間および前記第２の境界空間がいずれも、並進および原点周囲の角変位を経ている、請求項１から５のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記第１の境界空間および前記第２の境界空間がいずれも、ｍｅｃＡおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定量の関数として定義される、請求項２２から２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

費用関数を用いて前記第１の境界空間および前記第２の境界空間に最適なパラメータを見出す、請求項１から５のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

各中間値が、ｍｅｃＡおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列（ＳＡ）についての関数として定義され、該中間値が、式：
中間値＝ｍｅｃＡ×ｓｉｎ（−０．３）＋ＳＡ×ｃｏｓ（−０．３）を用いて定義される、ｍｅｃＡおよびＳＡの重みづけ線形結合である、請求項１０から１５のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するための方法であって、
該試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
該試料中の、少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出するステップと、
デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、該試料中のＭＲＳＡの存在を決定するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定量を入力として用いて、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；ｏｒｆＸの該測定量が閾値を下回る場合は、該判定アルゴリズムが、第１の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定し；ｏｒｆＸの該測定量が該閾値を上回る場合は、該判定アルゴリズムが、第２の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項28】

前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するための方法であって、
該試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
該試料中の少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列（ＳＡ）を増幅し、該少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列（ＳＡ）の存在および量を検出するステップと、
デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、該試料中のＭＲＳＡの存在を決定するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の測定量を入力として用いて、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；該判定アルゴリズムが、少なくとも該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列およびｍｅｃＡからの中間値を創出し；該判定アルゴリズムが、該中間値およびＳＣＣｍｅｃを用いて定義される境界空間をさらに用いてＭＲＳＡの該存在を決定するステップ
を含む方法。

【請求項30】

前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

ＳＣＣｍｅｃがｏｒｆＸ接合部にある、請求項２９〜３０のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ接合部の検出は、ＳＣＣｍｅｃの存在を示す、請求項２９〜３０のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この出願は、２００９年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／２６１，１４７号の本出願であり、かつ上記米国仮出願第６１／２６１，１４７号の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。上記出願は、その全容が、全ての目的について、参考として本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性菌株（ＭＲＳＡ）は、院内発生を含めた重大な帰結を伴う感染症に関与し、広範にわたる抗生剤に対して耐性を示し、このため、処置の選択肢を制限する。医療に随伴するＭＲＳＡは、すべてのペニシリンおよびセファロスポリンに対して交差耐性であることが予測可能であるだけでなく、一般的に用いられる他の複数の抗生剤に対してもまた耐性であることが典型的である。ＭＲＳＡ感染症の処置は一般に、通常は防御の最後の一線として用いられる、より高価で、多くはより毒性の強い抗生剤を必要とする。したがって、ＭＲＳＡの迅速な検出は、処置の方策および感染制御の方策のいずれに対しても臨床的に極めて重要である。

【0003】

ＭＲＳＡの検出は、ＭＲＳＡが、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＲ−ＣｏＮＳ）、および／またはメチシリン感受性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＳ−ＣｏＮＳ）を含め、他の複数の類縁細菌と共にしばしば共コロニー形成しうるという事実によりさらに複雑化する。

【0004】

臨床微生物検査室においてＭＲＳＡを検出するための従来の方法は、ＭＲＳＡをＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳから単離および区別するための最初のステップとして、試料から、その細菌を培養するステップを伴う。この手法は時間がかかり、結果が分かるまでに少なくとも２０〜２４時間を必要とする。

【0005】

メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出し、それをメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）から区別するための、多くの分子ベースの方法が公表されている。このような一方法は、ＭＲＳＡの２つの個別の領域である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓカセット染色体（ＳＣＣｍｅｃ；メチシリン耐性の原因である）のｍｅｃＡ遺伝子と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｓｐａ遺伝子を標的とする（特許文献１；非特許文献１）。この手法を用いるＭＲＳＡの明確な検出は、これもまたｍｅｃＡ遺伝子を保有してメチシリン耐性をもたらす、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＲ−ＣｏＮＳ）など、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ以外の菌株が共存することにより妨げられる（非特許文献２）。

【0006】

より近年の分子的手法では、ＳＣＣｍｅｃに対するプライマーおよびプローブ、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓゲノムの隣接領域を用いる（特許文献２；非特許文献３）。ＳＣＣｍｅｃは、ｍｅｃＡ遺伝子を保有し、ｏｒｆＸ遺伝子の３’端の特定の部位であるａｔｔＢｓｃｃ部位にこれを挿入する、移動性の遺伝子エレメントである。ＳＣＣｍｅｃの左側末端が、ａｔｔＢｓｃｃの、ｏｒｆＸを含まない側と隣接するのに対し、ＳＣＣｍｅｃの右側末端は、ａｔｔＢｓｃｃのｏｒｆＸ側と隣接する（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。この手法により、ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ接合部の検出から、ｍｅｃＡ遺伝子の存在が推測される。数個の異なる種類のＳＣＣｍｅｃについて記載されている通り、この手法は、複数のプライマーの使用を必要とする。この手法はまた、ｍｅｃＡ遺伝子を含有しないＳＣＣｍｅｃカセットの存在に起因する偽陽性結果（非特許文献７）およびそのアッセイが対象としない新規出現型のＳＣＣｍｅｃに起因する偽陰性結果（非特許文献８）をもたらす。

【0007】

別の手法は、異なるＳＣＣｍｅｃ型を通じて相同性が高い領域における１つのプライマーと、隣接するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡにおける１つのプライマーを用いている（Ｃｕｎｙら、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ、２００５年、１１巻：８３４〜８３７頁；欧州特許第１５２９８４７Ｂ１号）。この領域を包含するプライマーによりＭＳＳＡもまたプライミングされる可能性も高いので、この手法もまた、偽陽性をもたらす。

【0008】

最後に、特異的な抗体および磁気ビーズを用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを陽性選択する方法が記載されている（Ｆｒａｎｃｏｉｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年１月、２５４〜２６０頁；欧州特許第１，３７０，６９４Ｂ１号）。この手法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを富化するが、ＭＲＳＡを陽性同定し、ＣｏＮＳを検出する可能性を低減するために、３つのプライマー／プローブセットの使用を必要とする。この方法は、その核酸を回収するのに、遠心分離ステップと分離溶解ステップを必要とする。

【0009】

市販のＭＲＳＡアッセイは、ＳＣＣｍｅｃの右側末端における接合部およびｏｒｆＸを標的とする。５つの異なるＳＣＣｍｅｃ型および多数のＳＣＣｍｅｃ亜型が同定されており、新たなＳＣＣｍｅｃ亜型が出現する可能性は高い。加えて、ＭＲＳＡに由来するＭＳＳＡは、ｍｅｃＡ遺伝子を伴わずにＳＣＣｍｅｃ配列の一部を保持しうる可能性がある。したがって、ＳＣＣｍｅｃ右側末端のｏｒｆＸとの接合部を標的とするアッセイは、ＭＲＳＡに由来するＭＳＳＡによる偽陽性結果と、新規出現のＳＣＣｍｅｃ型／亜型を保有するＭＲＳＡによる偽陰性結果をもたらす可能性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許第５，７０２，８９５号明細書

【特許文献2】米国特許第６，１５６，５０７号明細書

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｓｉｎｓｉｍｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００５年９月、４５８５〜４５９１頁

【非特許文献2】Ｂｅｃｋｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６年１月、２２９〜２３１頁

【非特許文献3】Ｈｕｌｅｔｓｋｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００４年５月、１８７５〜１８８４頁

【非特許文献4】Ｉｔｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００１年、４５巻、１３２３〜１３３６頁

【非特許文献5】Ｉｔｏら、Ａｎｔｏｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００４年、４８巻、２６３７〜２６５１頁

【非特許文献6】Ｎｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００８年、１９０巻：１２７６〜１２８３頁

【非特許文献7】Ｆａｒｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年２月、７４３〜７４６頁

【非特許文献8】Ｈｅｕｓｓｅｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００７年１月、３９０〜３９３頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

このように、ＭＲＳＡを検出するための現行の方法は、労力を要し、時間がかかり、著しく正確というわけではない場合がある。したがって、ＭＲＳＡなどの生物学的実体を検出し、同時に、ＭＳＳＡおよび／またはＭＲ−ＣｏＮＳを含めた他の類縁細菌、または他の生物学的実体からこれを識別する、迅速で、使用が容易で、信頼のおける方法およびシステムへの必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の実施形態は、試料中にある生物学的持続状態（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｕｓ）が存在するかまたは存在しないかを決定するシステムおよび方法に関する。本発明の一部の実施形態は、加えて、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（ＭＲ−ＣｏＮＳ）、および／または他の細菌株も含有しうる試料中に、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を検出するステップを包含する方法を対象としうる。

【0014】

本発明の一実施形態は、デジタルコンピュータに、複数の試料と関連する、少なくとも、第１の遺伝子エレメント（例えば、ｍｅｃＡ）と関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメント（例えば、ｆｅｍＡ）と関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメント（例えば、ｏｒｆＸ）と関連する複数の第３の入力値を入力するステップを包含する（解析モデルを創出する（ｃｒｅａｔｉｎｇ））方法を対象とする。各試料は、複数の第１の入力値中の第１の入力値と、複数の第２の入力値中の第２の入力値と、複数の第３の入力値中の第３の入力値を包含する。該方法はまた、第３の遺伝子エレメントと関連する閾値を決定するステップ；該閾値を用いて、試料を、第１の試料セットおよび第２の試料セットへと区分するステップ；該第１の試料セットを、第１の遺伝子エレメントおよび第２の遺伝子エレメントにより定義される特徴空間においてクラスタリングするステップ；該第１の試料セットを用いて第１の境界空間を定義するステップ；ならびに該第２の試料セットを用いて第２の境界空間を定義するステップも包含する。第１の境界空間および第２の境界空間は、ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別する。

【0015】

本発明の別の実施形態は、ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別する解析モデルを創出する方法を対象とする。該方法は、デジタルコンピュータに、少なくとも、第１の遺伝子エレメント（例えば、ｍｅｃＡ）と関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメント（例えば、ｆｅｍＡ）と関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメント（例えば、ＳＣＣｍｅｃ）と関連する複数の第３の入力値を入力するステップを包含する。該方法はまた、デジタルコンピュータを用いて、少なくとも複数の第１の入力値、および第２の遺伝子エレメントと関連する少なくとも第２の入力値を用いて、１つ以上の中間値を創出するステップ、ならびにデジタルコンピュータを用いて、該１つ以上の中間値、および複数の第３の入力値を用いて、該生物学的持続状態についての境界空間を創出するステップも含む。境界空間は、該生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別する。

【0016】

本発明の他の実施形態は、解析モデルのほか、コンピュータにより読み取り可能な媒体（例えば、メモリチップおよびメモリディスクなど、一時的でない、コンピュータにより読み取り可能な媒体）、および該解析モデルを用いるシステムを使用するための方法に関する。

【0017】

これらの実施形態、ならびに他の実施形態については、本開示の後出においてより詳細に記載する。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
デジタルコンピュータに、少なくとも、複数の既知試料と関連する、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップであって、ここで、各既知試料が、該複数の第１の入力値中の第１の入力値、該複数の第２の入力値中の第２の入力値、および該複数の第３の入力値中の第３の入力値を包含するステップと、
該第３の遺伝子エレメントと関連する閾値を決定するステップと、
該閾値を用いて、該既知試料を、既知試料の第１のセットおよび既知試料の第２のセットへと区分するステップと、
既知試料の該第１のセットを、該第１の遺伝子エレメントおよび該第２の遺伝子エレメントにより定義される特徴空間においてクラスタリングするステップと、
既知試料の該第１のセットを用いて第１の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第１の境界空間が、ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップと、
既知試料の該第２のセットを用いて第２の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第２の境界空間が、該ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップ
を含む方法。
（項目２）
上記第１の遺伝子エレメントがｍｅｃＡを含み、上記第２の遺伝子エレメントがｆｅｍＡを含み、上記第３の遺伝子エレメントがＯｒｆＸを含み、上記ある生物学的持続状態がＭＲＳＡ持続状態を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間を、それぞれ、第１の楕円および第２の楕円により定義する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記第１の値、第２の値、および第３の値が、Ｃｔ値である、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
入力するステップの前に、
上記既知試料を、該既知試料中の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
少なくとも、上記第１の遺伝子エレメント、上記第２の遺伝子エレメント、および上記第３の遺伝子エレメントを増幅し、該少なくとも、上記第１の遺伝子エレメント、上記第２の遺伝子エレメント、および上記第３の遺伝子エレメントの存在および量を検出するステップ
をさらに含む、項目１から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、
デジタルコンピュータに、少なくとも、複数の既知試料と関連する、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップであって、ここで、各既知試料が、該複数の第１の入力値中の第１の入力値、該複数の第２の入力値中の第２の入力値、および該複数の第３の入力値中の第３の入力値を包含するステップと、
該第３の遺伝子エレメントと関連する閾値を決定するステップと、
該閾値を用いて、該既知試料を、既知試料の第１のセットおよび既知試料の第２のセットへと区分するステップと、
既知試料の該第１のセットを、該第１の遺伝子エレメントおよび該第２の遺伝子エレメントにより定義される特徴空間においてクラスタリングするステップと、
既知試料の該第１のセットを用いて第１の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第１の境界空間が、ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップと、
既知試料の該第２のセットを用いて第２の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第２の境界空間が、該ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップ
を含む方法を実装するための、プロセッサにより実行可能なコードを含む、媒体。
（項目７）
項目７に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体と、該コンピュータにより読み取り可能な媒体に接続されたプロセッサを含む、デジタルコンピュータ。
（項目８）
項目７に記載のデジタルコンピュータに接続された測定モジュールを含むシステム。
（項目９）
項目１から５のいずれかに記載の方法により創出される解析モデルを用いる方法であって、
上記デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータに、未知試料と関連する第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を入力するステップであって、ここで、該第１の入力値、該第２の入力値、および該第３の入力値が、該未知試料中の上記第１の遺伝子エレメント、上記第２の遺伝子エレメント、および上記第３の遺伝子エレメントと関連するステップと、
該デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータを用いて、上記第１の境界空間または上記第２の境界空間を用いて、該未知試料を、上記ある生物学的持続状態と関連するものとして分類するステップ
を含む方法。
（項目１０）
上記ある生物学的持続状態が、ＭＲＳＡ持続状態を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別する、解析モデルを創出する方法であって、
デジタルコンピュータに、少なくとも、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップと、
該デジタルコンピュータを用いて、少なくとも該複数の第１の入力値、および第２の遺伝子エレメントと関連する少なくとも該第２の入力値を用いて、１つ以上の中間値を創出するステップと、
該デジタルコンピュータを用いて、該１つ以上の中間値、および該複数の第３の入力値を用いて、該ある生物学的持続状態についての境界空間を創出するステップであって、ここで、
該境界空間が、該ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別するステップを含む方法。
（項目１２）
上記第１の遺伝子エレメントがｍｅｃＡを含み、上記第２の遺伝子エレメントがｆｅｍＡを含み、上記第３の遺伝子エレメントがＳＣＣｍｅｃを含み、上記ある生物学的持続状態がＭＲＳＡ持続状態を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記境界空間を、楕円により定義する、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
費用関数を用いて上記楕円を最適化する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記第１の値、第２の値、および第３の値が、Ｃｔ値である、項目１１から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
入力するステップの前に、
上記試料を、該試料中の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
少なくとも、上記第１の遺伝子エレメント、上記第２の遺伝子エレメント、および上記第３の遺伝子エレメントを増幅し、その存在および量を検出するステップ
をさらに含む、項目１１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
デジタルコンピュータに、少なくとも、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップと、
該デジタルコンピュータを用いて、少なくとも該複数の第１の入力値、および第２の遺伝子エレメントと関連する少なくとも該第２の入力値を用いて、１つ以上の中間値を創出するステップと、
該デジタルコンピュータを用いて、該１つ以上の中間値、および該複数の第３の入力値を用いて、該ある生物学的持続状態についての境界空間を創出するステップであって、ここで、
該境界空間が、該ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別するステップを含む方法を実装するための、プロセッサにより実行可能なコードを含む、コンピュータにより読み取り可能な媒体。
（項目１８）
項目１１に記載の、コンピュータにより読み取り可能な媒体と、該コンピュータにより読み取り可能な媒体に接続されたプロセッサを含む、デジタルコンピュータ。
（項目１９）
項目１８に記載のデジタルコンピュータに接続された測定モジュールを含むシステム。
（項目２０）
項目１１から１６のいずれかに記載の方法により創出される解析モデルを用いる方法であって、
上記デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータに、未知試料と関連する第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を入力するステップであって、ここで、該第１の入力値、該第２の入力値、および該第３の入力値が、該未知試料中の上記第１の遺伝子エレメント、上記第２の遺伝子エレメント、および上記第３の遺伝子エレメントと関連するステップと、
該未知試料を、上記境界空間を用いて、上記ある生物学的持続状態と関連するものとして分類するステップ
を含む方法。
（項目２１）
試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するための方法であって、
該試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
該試料中の、少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出するステップと、
デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、該試料中のＭＲＳＡの存在を決定するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量および測定量を入力として用いて、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；ｏｒｆＸの該検出量が閾値を下回る場合は、該判定アルゴリズムが、第１の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定し；ｏｒｆＸの該検出量が該閾値を上回る場合は、該判定アルゴリズムが、第２の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定するステップ
を含む方法。
（項目２２）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、楕円の境界空間である、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、並進および原点周囲の角変位を経ている、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、ｍｅｃＡおよび上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記測定量の関数として定義される、項目２１から２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
費用関数を用いて上記第１の境界空間および上記第２の境界空間に最適なパラメータを見出す、項目２１から２５のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
上記費用関数が、式：
費用＝ｃ_１×偽陰性数＋ｃ_２×偽陽性数
により定義される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間が、ニューラルネットワークを用いて定義される関数である、項目２１から２７のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間が、遺伝子アルゴリズムを用いて定義される関数である、項目２１から２７のいずれかに記載の方法。
（項目３０）
上記試料中の、少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記存在および上記量を、リアルタイムＰＣＲにより検出する、項目２１から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記量を、サイクル数で測定する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記閾値が、約４５サイクルである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するためのシステムであって、
該試料において、少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出することが可能な測定モジュールであって、ここで、該試料が、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置かれる、測定モジュールと、
該測定モジュールからの該検出量を保存するメモリと、
判定アルゴリズムの実行についての命令を有する、コンピュータにより読み取り可能なコードを含有する、コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量および測定量を入力として用いて、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；ｏｒｆＸの該検出量が閾値を下回る場合は、該判定アルゴリズムが、第１の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定し；該ｏｒｆＸの該検出量が上記閾値を上回る場合は、該判定アルゴリズムが、第２の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定する媒体と、
該試料中のＭＲＳＡの該存在を決定するために、該コンピュータにより読み取り可能な媒体上で、該コンピュータにより読み取り可能なコードを実行するプロセッサ
を含むシステム。
（項目３４）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目３３または３４に記載のシステム。
（項目３５）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、楕円の境界空間である、項目３３に記載のシステム。
（項目３６）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、並進および原点周囲の角変位を経ている、項目３５に記載のシステム。
（項目３７）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、ｍｅｃＡおよびｆｅｍＡの該測定量の関数として定義される、項目３３から３６のいずれかに記載のシステム。
（項目３８）
費用関数を用いて上記第１の境界空間および上記第２の境界空間に最適なパラメータを見出す、項目３３から３７のいずれかに記載のシステム。
（項目３９）
上記費用関数が、式：
費用＝ｃ_１×偽陰性数＋ｃ_２×偽陽性数
により定義される、項目３８に記載のシステム。
（項目４０）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間が、ニューラルネットワークを用いて定義される関数である、項目３３から３９のいずれかに記載のシステム。
（項目４１）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間が、遺伝子アルゴリズムを用いて定義される関数である、項目３３から３９のいずれかに記載のシステム。
（項目４２）
上記試料中の、少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記存在および上記量を、リアルタイムＰＣＲにより検出する、項目３３から４１のいずれかに記載のシステム。
（項目４３）
少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記量を、サイクル数で測定する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記閾値が、約４５サイクルである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、判定アルゴリズムのためのコードを含み、
ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いて、試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；ここで、該判定アルゴリズムが、ｏｒｆＸの該検出量が閾値を下回る場合は、第１の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定し；ここで、該判定アルゴリズムが、ｏｒｆＸの該検出量が該閾値を上回る場合は、第２の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定する、
媒体。
（項目４６）
試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するための方法であって、
該試料を、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップと、
該試料中の少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列（ＳＡ）を増幅し、該少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列（ＳＡ）の存在および量を検出するステップと、
デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行することにより、該試料中のＭＲＳＡの存在を決定するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量および測定量を入力として用いて、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；該判定アルゴリズムが、少なくとも該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列およびｍｅｃＡからの中間値を創出し；該判定アルゴリズムが、該中間値およびＳＣＣｍｅｃを用いて定義される境界空間をさらに用いてＭＲＳＡの該存在を決定するステップ
を含む方法。
（項目４７）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
上記中間値が、ｍｅｃＡおよびＳＡについての関数として定義され、該中間値が、式：
中間値＝ｍｅｃＡ×ｓｉｎ（−０．３）＋ＳＡ×ｃｏｓ（−０．３）
を用いて定義される、ｍｅｃＡおよびＳＡの重みづけ線形結合である、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４９）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、ｍｅｃＡおよび上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記測定量の関数として定義される、項目４６から４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
費用関数を用いて上記第１の境界空間および上記第２の境界空間に最適なパラメータを見出す、項目４６から４９のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
上記費用関数が、式：
費用＝ｃ_１×偽陰性数＋ｃ_２×偽陽性数
により定義される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間が、遺伝子アルゴリズムを用いて定義される関数である、項目４６から５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
上記試料中の、少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記存在および上記量を、リアルタイムＰＣＲにより検出する、項目４６から５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記量を、サイクル数で測定する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するためのシステムであって、
該試料において、少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列（ＳＡ）を増幅し、該少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列（ＳＡ）の存在および量を検出することが可能な測定モジュールであって、ここで、該試料が、該試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置かれる、測定モジュールと、
該測定モジュールからの該検出量を保存するメモリと、
判定アルゴリズムの実行についての命令を有する、コンピュータにより読み取り可能なコードを含有する、コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量および測定量を入力として用いて、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；該判定アルゴリズムが、少なくともｍｅｃＡおよび該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列からの中間値を創出し；該判定アルゴリズムが、該中間値およびＳＣＣｍｅｃを用いて定義される境界空間をさらに用いてＭＲＳＡの存在を決定する媒体と、
該試料中のＭＲＳＡの該存在を決定するために、該コンピュータにより読み取り可能な媒体上で、該コンピュータにより読み取り可能なコードを実行するプロセッサ
を含むシステム。
（項目５６）
上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである、項目５５に記載のシステム。
（項目５７）
上記中間値が、ｍｅｃＡおよびＳＡについての関数として定義され、該中間値が、式：
中間値＝ｍｅｃＡ×ｓｉｎ（−０．３）＋ＳＡ×ｃｏｓ（−０．３）
を用いて定義される、ｍｅｃＡおよびＳＡの重みづけ線形結合である、項目５５または５６に記載のシステム。
（項目５８）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間がいずれも、ｍｅｃＡおよび上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記測定量の関数として定義される、項目５５から５７のいずれかに記載のシステム。
（項目５９）
費用関数を用いて上記第１の境界空間および上記第２の境界空間に最適なパラメータを見出す、項目５５から５８のいずれかに記載のシステム。
（項目６０）
上記費用関数が、式：
費用＝ｃ_１×偽陰性数＋ｃ_２×偽陽性数
により定義される、項目５９に記載のシステム。
（項目６１）
上記第１の境界空間および上記第２の境界空間が、遺伝子アルゴリズムを用いて定義される関数である、項目５５から６０のいずれかに記載のシステム。
（項目６２）
上記試料中の、少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記存在および上記量を、リアルタイムＰＣＲにより検出する、項目５５から６１のいずれかに記載のシステム。
（項目６３）
少なくともｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の上記量を、サイクル数で測定する、項目６２に記載のシステム。
（項目６４）
コンピュータにより読み取り可能な媒体であって、判定アルゴリズムのためのコードを含み、
ここで、該判定アルゴリズムが、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いて、試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定し；ここで、該判定アルゴリズムが、少なくともｍｅｃＡおよび該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列からの中間値を創出し；ここで、該判定アルゴリズムが、該中間値およびＳＣＣｍｅｃを用いて定義される境界空間をさらに用いてＭＲＳＡの存在を決定する、媒体。
（項目６５）
未知試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するのに用いることが可能なモデルを創出する方法であって、
既知試料のセットを、該既知試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップであって、既知試料の該セット中の各試料について、ＭＲＳＡの存在が知られるステップと、
該既知試料において、少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくともｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出するステップと、
該既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の検出量および測定量を入力として用いるステップと、
該未知試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定するのに用いることが可能なモデルを創出するステップであって、ここで、該モデルを、該既知試料に対して実行される該判定アルゴリズムの出力から創出し；ｏｒｆＸの該検出量が閾値を下回る場合は、該モデルが、第１の境界空間を用いてＭＲＳＡの該存在を決定し；ｏｒｆＸの該検出量が該閾値を上回る場合は、該モデルが、第２の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定するステップを含む方法。
（項目６６）
未知試料中のメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の存在を決定するのに用いることが可能なモデルを創出する方法であって、
既知試料のセットを、該既知試料中に存在する任意の細菌の核酸を露出させる条件下に置くステップであって、ここで、既知試料の該セット中の各試料について、ＭＲＳＡの該存在が知られているステップと、
該既知試料において、少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列を増幅し、該少なくとも、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）特異的な標的遺伝子配列の存在および量を検出するステップと、
該既知試料中の各試料について、デジタルコンピュータ上で判定アルゴリズムを実行するステップであって、ここで、該判定アルゴリズムが、ｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、および該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列の該検出量および測定量を入力として用いるステップと、
該未知試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定するのに用いることが可能なモデルを創出するステップであって、該モデルが該既知試料に対して実行される判定アルゴリズムの出力から創出され、ここで、該モデルが、少なくとも該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列およびｍｅｃＡからの中間値を創出し；ここで、該判定アルゴリズムが、該中間値およびＳＣＣｍｅｃを用いて定義される境界空間をさらに用いてＭＲＳＡの該存在を決定するステップ
を含む方法。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、一実施形態により実行される、解析モデルを形成するためのステップを例示するフローチャートを示す。

【図2】図２は、一実施形態により、ｏｒｆＸの閾値を上回る二次元空間、およびｏｒｆＸの閾値を下回る二次元空間において、ｆｅｍＡとｍｅｃＡとの対比を例示する図を示す。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、一実施形態により、二次元空間において、ｆｅｍＡとｍｅｃＡとの対比を例示する図を示す。

【図4】図４は、一実施形態により実行される、解析モデルを用いるステップを例示するフローチャートである。

【図5】図５は、一実施形態により実行される、中間値を用いて解析モデルを形成するためのステップを例示するフローチャートである。

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、一実施形態により、二次元空間において、ｍｅｃＡとＳＣＣｍｅｃとの対比およびｆｅｍＡとＳＣＣｍｅｃとの対比を例示する図である。

【図7】図７は、一実施形態により、中間値を創出し、該中間値をＳＣＣｍｅｃと共に用いて境界空間を創出する方法を例示する図である。

【図8】図８は、一実施形態により、二次元空間において、中間値とＳＣＣｍｅｃとの対比を例示する図である。

【図9】図９は、一実施形態により、二次元空間において、中間値をＳＣＣｍｅｃと対比する関数としての境界空間を例示する図である。

【図10】図１０は、一実施形態により実行される、解析モデルを用いるためのステップを例示するフローチャートである。

【図11】図１１は、各種の実施形態を実行するのに用いうるシステムについてのブロック図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

各種の実施形態は、試料中のｍｅｃＡ、ＳＣＣｍｅｃ、ｏｒｆＸ、および／またはｆｅｍＡなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列など、遺伝子エレメントの測定量から該試料中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性菌株（ＭＲＳＡ）を同定するためのシステムおよび方法を開示する。本発明の一部の実施形態は、ｏｒｆＸの検出量が閾値を下回る場合は、第１の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定することにより、試料中のＭＲＳＡの存在を決定し、ｏｒｆＸの検出量が閾値を上回る場合は、第２の境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定することにより、試料中のＭＲＳＡの存在を決定する。他の実施形態は、少なくとも、ｍｅｃＡおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列から中間値を創出し、境界空間を用いてＭＲＳＡの存在を決定する。該境界空間は、中間値およびＳＣＣｍｅｃを用いて定義することができる。

【0020】

本開示で用いられるすべての科学用語および技術用語は、別段に指定しない限り、当技術分野において一般的に用いられる意味を有する。本開示で用いられる以下の語または語句は、意味が指定されている。

【0021】

本明細書で用いられる「試料」という用語は、最も広い意味で用いられ、生物学的起源の任意の種類の材料であり、これらは、例えば、任意の流体、組織、または細胞でありうる。例えば、試料は、生物学的流体、例えば、尿、血液、血清、血漿、鼻腔分泌物、脳脊髄液などでありうる。あるいは、試料は、培養細胞または培養組織の場合もあり、微生物の培養物の場合もあり、生物学的材料から生成されるかまたはこれらに由来する任意の画分または生成物の場合もある。必要に応じて、試料は、精製される場合もあり、部分精製される場合もあり、未精製の場合もあり、富化または増幅される場合もある。

【0022】

本明細書で用いられる「遺伝子エレメント」という用語は、本発明の方法における標的として有用な、対象のゲノムにおける配列を指す場合がある。一部の実施形態では、遺伝子エレメントが、例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓにおけるｏｒｆＸ、ｆｅｍＡ、またはｍｅｃＡなどのオープンリーディングフレームまたは遺伝子である。遺伝子エレメントはまた、ｍｅｃＡ遺伝子を含む場合もあり、含まない場合もある、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓカセット染色体であるＳＣＣｍｅｃなど、移動性の（ｍｏｂｉｌｅ）遺伝子エレメントでもありうる。

【0023】

本明細書で用いられる「入力値」とは、例えば、遺伝子エレメントと関連しうる、任意の適切な値でありうる。例えば、入力値は、各種の標的遺伝子と関連するＣｔ値でありうる。

【0024】

本明細書で用いられる「境界空間」とは、「境界関数」により定義される空間でありうる。「境界関数」とは、データが、ある生物学的持続状態と関連するか、またはある生物学的持続状態と関連しないかを決定するのに用いられる数学関数でありうる。境界関数は、手作業を介すること、ニューラルネットワーク、費用関数などの使用を介することを含め、任意の適切な様式で創出することができる。境界関数はまた、楕円、四角形、円などを含めた、任意の適切な形態または線により表わすこともできる。境界関数は、形態が規則的な場合もあり、不規則的な場合もある。

【0025】

本明細書で用いられる「ＳＣＣｍｅｃ」、「ＳＣＣｍｅｃ配列」、および「ＳＣＣｍｅｃカセット」という用語は、互換的に用いられ、Ｉｔｏら（２００１年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４５巻：１３２３〜１３３６頁）において記載されている通り、ｍｅｃＡ遺伝子を保有し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの種のゲノムへと挿入される、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓカセット染色体として公知の遺伝子エレメントを指す。一実施形態では、ＳＣＣｍｅｃが、ｏｒｆＸの接合部に位置する。

【0026】

本出願では、ＳＣＣｍｅｃ挿入部位を、「ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ」と称する。この挿入部位は、本明細書で「ｏｒｆＸ」と称する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子の３’端に位置する。ＳＣＣｍｅｃの挿入がなされる染色体の遺伝子座を、「ａｔｔＢｓｃｃ」と称する。本明細書では、挿入部位における特異的な配列を、「ｏｒｆＸ挿入部位配列（ｏｒｆＸ−ＩＳＳ）」または「ａｔｔＢｓｃｃコア領域」と称する。この配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓにおいて高度に保存的な配列であることが公知である（Ｉｔｏら、Ａｎｔｏｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００１年、４５巻、３２３〜１３３６頁； Ｎｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００８年、１９０巻：１２７６〜１２８３頁）。

【0027】

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域へと挿入した後では、ＳＣＣｍｅｃ左側末端の接合領域をＭＲＳＡ−ＬＥと称し、ＳＣＣｍｅｃ右側末端の接合領域をＭＲＳＡ−ＲＥと称する。左側末端の接合部では、ＳＣＣｍｅｃ配列が、ａｔｔＢｓｃｃのｏｒｆＸを含まない側と隣接する。右側末端の接合部では、ＳＣＣｍｅｃ配列が、ａｔｔＢｓｃｃのｏｒｆＸ側と隣接する。ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域は、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｔｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００１年、４５巻、１３２３〜１３３６頁； Ｉｔｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００４年、４８巻、２６３７〜２６５１頁； Ｎｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００８年、１９０巻：１２７６〜１２８３頁；および米国特許第６，１５６，５０７号において詳細に記載されている。ＳＣＣｍｅｃの挿入が存在しない場合は、このｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域に切れ目がなくなる。増幅法により、ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域が完全であると同定される場合は、これにより、ＳＣＣｍｅｃカセットが挿入されていないことが示される。しかし、該ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｃ領域が増幅されないからといって、ｍｅｃＡ遺伝子の存在が示されるわけではない。ＳＣＣｍｅｃカセットが挿入された後で、ｍｅｃＡ遺伝子が失われる可能性があることも公知である。したがって、ｍｅｃＡが存在しない場合でもなお、ＳＣＣｍｅｃカセットにより、ｏｒｆＸ−ＩＳＳ／ａｔｔＢｓｃｓ領域の増幅が阻止される可能性がある。

【0028】

「オリゴヌクレオチド」とは、併せて共有結合している２つ以上のヌクレオチドサブユニットを有する、ヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは一般に、約１０〜約１００ヌクレオチドである。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボースの場合もあり、デオキシリボースの場合もあり、ＯＭｅなど、これらの修飾誘導体の場合もある。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾結合（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）などの結合により接合される場合もあり、オリゴヌクレオチドの、その相補的標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを阻止しない、非ヌクレオチド部分により接合される場合もある。修飾結合には、標準的なホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、または中性ペプチド結合など、異なる結合で置換する修飾結合が含まれる。また、窒素塩基類似体も、本発明によるオリゴヌクレオチドの構成要素でありうる。「標的核酸」とは、標的核酸配列を含む核酸である。「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、または「標的配列」とは、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうる、特異的なデオキシリボヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列である。

【0029】

本明細書で用いられる「プローブ」という用語は、対象の標的核酸とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを指す。そのハイブリダイゼーションは、対象の標的核酸との相補的な塩基対合を介してプローブが結合する結果として生じる。当業者は、ハイブリダイゼーション条件の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に応じて、プローブが、該プローブ配列と完全に相補的であるわけではない標的配列と実質的に結合することが典型的であることを理解するはずである。プローブ（および、したがって、その標的）を検出、視覚化、測定、および／または定量しうるように、プローブを適切な標識またはレポーター部分と会合させることができる。

【0030】

本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、核酸合成をプライミングするのに用いられるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、相補的塩基対合によりその鋳型とハイブリダイズし、したがって、複製を開始するのに用いられる。ハイブリダイゼーションは、上記でプローブについて記載したのと同じ様式で生じる。ＰＣＲでは、２つのプライマー：センス鎖にハイブリダイズすることが典型的である「フォワードプライマー」と、アンチセンス鎖にハイブリダイズすることが典型的である「リバースプライマー」を用いる。

【0031】

本明細書で用いられる「ＰＣＲ」という用語は、生物（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）を用いることなく、ＤＮＡを酵素的に複製することにより、長い二本鎖ＤＮＡ分子内で短いＤＮＡ配列（通常、５０〜６００塩基）を指数関数的に増幅するための技法を指す（Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８７年、１５５巻：３３５〜５０頁）。本発明では、他のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増幅技法も用いることができ、これらは、当業者に周知である。これらの方法には、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写を介する増幅（ＴＭＡ）、分枝ＤＮＡ法（ｂＤＮＡ）、およびローリングサークル増幅技法（ＲＣＡＴ）が含まれる。

【0032】

本明細書で用いられる「リアルタイムＰＣＲ」という用語は、各増幅サイクル後に、増幅されたＤＮＡを、その反応においてそれが蓄積するにつれてリアルタイムで定量化する種類のＰＣＲを指す（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、６巻（１０号）：９８６〜９９４頁）。当業者には、リアルタイムＰＣＲを実施するための多数のプローブ化学（ｐｒｏｂｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が周知である。一般的に用いられる一方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号；同第５，４８７，９７２号；および同第５，８０４，３７５号を参照されたい）である。用いることが可能であり、市販品の購入が可能である、他のリアルタイムＰＣＲプローブ化学には、ＦＲＥＴプライマー、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（登録商標）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー（登録商標）、ＬＵＸプライマー（登録商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）、およびＵｌｔｉｍａｔｅ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）が含まれる。リアルタイムＰＣＲ技法の総説については、Ｂｕｓｔｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、３４巻：５９７〜６０１頁（２００５年）を参照されたい。

【0033】

本明細書で用いられる「多重ＰＣＲ」という用語は、単一の反応試験管内で、２つ以上の異なる標的の増幅を可能とする反応物中に、１つより多いセットのプライマーが包含される種類のＰＣＲを指す。「多重ＰＣＲ」という用語はまた、複数のプライマーおよびプローブを用いるが、１つの標的だけを増幅するＰＣＲも指す。一実施形態では、本発明の多重ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲである。

【0034】

本明細書で用いられる、ある「生物学的持続状態」とは、任意の供給源、例えば、患者に由来する試料の特定の生物学的状態（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｅ）に関しうる。大半の場合において、該生物学的持続状態は、試料が、特定の生物学的実体、例えば、標的の疾患生物または疾患と関連する患者細胞を含むかどうかに関する。例えば、１つの生物学的持続状態は、試料がＭＲＳＡ細菌を含むことでありうるのに対し、別の生物学的持続状態は、試料がＭＲＳＡ細菌を含まないことでありうる。他の例において、該生物学的持続状態は、試料が癌細胞を含むかどうかに関しうる。

【0035】

本発明の一実施形態は、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、または他の細菌を含有しうる試料においてＭＲＳＡを検出するためのアッセイに関する。本発明の実施形態は、複数標的の組合せを同時に増幅および検出するための多重ＰＣＲプロセスを用いうる。

【0036】

一実施形態によれば、標的ＤＮＡの初期量を、ＰＣＲ閾値サイクル数（Ｃｔ）で測定する。例えば、解析される反応について、規定のシグナル閾値を決定する。標的核酸のほか、基準核酸または標準核酸について、このシグナル閾値に達するのに必要とされるサイクル数（Ｃｔ）を決定する。標的分子の絶対コピー数または相対コピー数は、基準核酸と比較した標的核酸について得られるＣｔ値に基づき決定することができる。したがって、Ｃｔ値は、標的ＤＮＡの初期量に反比例する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｔ値の完全な議論については、Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、６巻（１０号）：９８６頁を参照されたい）。同定した方法のうちの１つにおいて増幅された遺伝子セットの所定量または所定数の表示に基づいて、特定の標的遺伝子の初期量を外挿することを可能とする、他の数学的手法を用いることができる。

【0037】

一実施形態では、本発明が、試料中のＭＲＳＡの存在を決定する方法であって、蛍光による検出に十分であり、該試料中の１つ以上のＭＲＳＡ特異的な標的配列の初期レベルを示すレベルの増幅産物を生成させるように、該試料をある時間にわたり、ある条件下でリアルタイムＰＣＲにかけるステップを含む方法を対象とする。

【0038】

別の実施形態では、増幅を、プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）のセットおよびプローブにより実施する。プローブは、その５’端において蛍光原レポーター分子で標識することができ、その３’端において消光分子で標識することができる。消光分子は、蛍光原レポーター分子からのシグナルの発光を阻止する。プローブは、フォワードプライマーがハイブリダイズする領域と、リバースプライマーがハイブリダイズする領域との間の標的配列領域にハイブリダイズする。プローブがハイブリダイズする鎖に沿ってポリメラーゼが移動すると、このポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性によりプローブの５’端が切断され、このため、消光部分の分離により、蛍光原シグナルの発光が可能となる。

【0039】

具体的な実施形態では、本発明のプローブが、蛍光レポーター（フルオロフォア）および蛍光性または非蛍光性の消光分子を含む、二重標識した蛍光原プローブを含みうる。本発明のフルオロフォアは、５’端、３’端、またはいずれかの端の内部を含めた任意の位置においてプローブに結合させることができる。本発明のある実施形態では、フルオロフォアおよび消光剤を、それぞれ、プローブの５’端および３’端に結合させる。フルオロフォアの例には、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃａｌｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ、ＣａｌＦｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ、Ｑｕａｓａｒ ６７０、Ｑｕａｓａｒ ７０５が含まれるがこれらに限定されない。消光剤の例には、ＴＡＭＡＲＡ、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅ消光剤であるＢＨＱ−１およびＢＨＱ−２が含まれるがこれらに限定されない。

【0040】

別の実施形態では、本発明は、３標的アッセイ（ｔｈｒｅｅ ｔａｒｇｅｔ ａｓｓａｙ）を用いて、ＭＲＳＡを検出し、これをＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、または他の細菌から識別する方法であって、ここで、そのアッセイに用いられる標的（遺伝子エレメントの例でありうる）にｍｅｃＡ遺伝子配列、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列、ＳＣＣｍｅｃ遺伝子配列、および／またはｏｒｆＸが含まれる方法を提供する。具体的な実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子が、ｆｅｍＡである。以下の記載では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列として、ｆｅｍＡに明示的に言及することが多いが、各種の実施形態ではまた、他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列も用いることができる。

【0041】

本発明の一部の実施形態は、少なくとも第１の境界空間および第２の境界空間を用いる解析モデルの形成のほか、このような解析モデルの使用も対象とする。本発明の他の実施形態は、少なくとも１つの中間値を用いて境界空間を形成する解析モデルの創出および使用を対象とする。さらに他の実施形態は、このような解析モデルを用いるための方法のほか、このような解析モデルを用いるシステムにも関する。これらの手法は、以下でさらに詳細に記載される。

【0042】

少なくとも２つの境界空間を用いる実施形態
図１は、本発明の実施形態により解析モデルを構築するのに用いうるステップを例示するフローチャートを示す。場合によっては、解析モデルを用いて、試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかを決定することができる。

【0043】

ステップ１０００では、選択した数の既知試料を、試料中の細菌の核酸を露出させる条件下に置く。一部の実施形態では、既知試料が、それが特定の生物学的持続状態と関連するかどうかが知られている試料である。例えば、既知試料は、それがＭＲＳＡと関連するかどうかが知られている試料でありうる。したがって、後の未知試料もまたＭＲＳＡを含有するかどうかを決定しうるモデルを構築するのに、既知試料を用いることができる。

【0044】

試料を、該試料中の核酸を露出させる条件下に置くための、多くの異なる方法が存在する。例えば、試料中の細胞は、周知の技法により溶解させることができる。次いで、例えば、試料の温度を上昇させて、核酸鎖を分離することにより、その核酸を変性させることができる。

【0045】

ステップ１０１０では、試料において、ｍｅｃＡ、ｏｒｆＸ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列など、少なくとも３つの標的の特徴（例えば、相対量もしくは絶対量、または発現量）を測定する。一実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的な標的遺伝子配列が、ｆｅｍＡである。試料においてこのような遺伝子エレメントの量を測定するための、多くの異なる方法が存在する。例えば、多重ＰＣＲプロセスを用いて、測定する各標的についてのＰＣＲ閾値サイクル数（Ｃｔ）値を測定する。

【0046】

少なくとも３つの標的についての特徴を測定した後には、これらの特徴と関連する値を、デジタルコンピュータへと入力することができる。以下には、例示的なデジタルコンピュータの詳細を示す。種々の入力値は、任意の適切な様式でデジタルコンピュータに入力することができる。一部の実施形態では、デジタルコンピュータにその値を、自動で（例えば、入力値を創出する、または入力値を創出するのに用いたデータを創出する、測定モジュールとのデータ接続を介して）入力することもでき、使用者が手作業で入力することもできる。

【0047】

一部の実施形態では、デジタルコンピュータに、少なくとも、第１の遺伝子エレメント（例えば、ｍｅｃＡなどの第１の標的）と関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメント（例えば、ｆｅｍＡなどの第２の標的）と関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメント（例えば、ｏｒｆＸなどの第３の標的）と関連する複数の第３の入力値を入力する。第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値は、複数の既知試料と関連する。各既知試料は、複数の第１の入力値中の第１の入力値、複数の第２の入力値中の第２の入力値、および複数の第３の入力値中の第３の入力値を包含する。第１の値、第２の値、および第３の値は、第１の遺伝子エレメント、第２の遺伝子エレメント、および第３の遺伝子エレメントと関連するＣｔ値でありうる。

【0048】

ステップ１０２０では、判定アルゴリズムを、既知試料の各々に由来する、測定された標的の各々に適用することができる。判定アルゴリズムは、任意の適切な命令の組合せを有しうる。一部の実施形態では、判定アルゴリズムが、図１のステップ１０３０、１０４０、１０５０、および１０６０のうちの１つ以上を、任意の適切な組合せで包含しうる。

【0049】

ステップ１０３０では、第３の遺伝子エレメント（例えば、ｏｒｆＸ）と関連する閾値を決定する。閾値は、任意の適切な様式で決定することができる。例えば、一部の実施形態では、閾値が、単純に、「４５」などの離散値でありうる。閾値は、デジタルコンピュータにあらかじめ入力し、該デジタルコンピュータ内のメモリにこれを保存することもでき、第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値をデジタルコンピュータに入力するのとほぼ同時に、使用者が入力することもできる。

【0050】

ステップ１０４０では、閾値を用いて、判定アルゴリズムにより、既知試料を、既知試料の第１のセットおよび既知試料の第２のセットへと区分する。例えば、判定アルゴリズムは、どの試料が閾値を上回り、どの試料が閾値を下回るかを決定することにより、既知試料の第１のセットを、既知試料の第２のセットから区分しうる。例示的に述べると、第３の遺伝子エレメントがｏｒｆＸであり、閾値が「４５」のＣｔ値である場合、既知試料の第１のセットは、ｏｒｆＸについてのＣｔ値が４５未満であることが可能であり、既知試料の第２のセットは、ｏｒｆＸについてのＣｔ値が４５以上でありうる。

【0051】

ステップ１０５０では、試料を分離した後で、第１の試料セット中の試料を、第１の遺伝子エレメントおよび第２の遺伝子エレメントにより定義される特徴空間においてクラスタリングする。第１の試料セットおよび第２の試料セットは、任意の適切な様式でクラスタリングすることができる。例えば、第１の試料セットは、第１の遺伝子エレメントおよび第２の遺伝子エレメントにより定義される二次元空間内にプロットすることができる。第２の試料セットも、第１の遺伝子エレメントおよび第２の遺伝子エレメントにより定義される二次元空間内にプロットすることができる。これを、例えば、ｏｒｆＸ＜４５およびｏｒｆＸ≧４５について、ｆｅｍＡをｍｅｃＡと対比する２つのプロットを示す図２において例示する。

【0052】

ステップ１０６０では、試料の第１のセットおよび第２のセットを用いて、それぞれ、第１の境界空間および第２の境界空間を定義する。第１の境界空間および第２の境界空間は、ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別する。図２では、第１の境界空間および第２の境界空間を、楕円として示す。

【0053】

第１の境界空間および第２の境界空間は、任意の適切な様式で決定することができ、任意の適切な形状を有しうる。例えば、一部の実施形態では、第１の境界空間および第２の境界空間を、楕円により定義することができる。他の実施形態では、境界空間を、四角形、多角形、平行六面体、または他の形状により定義することができる。このような境界空間は、ニューラルネットワークおよび他の最適化アルゴリズムにより決定および最適化することができる。第１の境界空間および第２の境界空間は、解析モデルの少なくとも一部を形成することが可能であり、これを用いて、ある生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別することができる。

【0054】

場合によっては、使用者の一助となるように、ＬＣＤスクリーンなどのディスプレイ上で、第１の境界空間および第２の境界空間を、第１の試料セットおよび第２の試料セットを含めた二次元プロットに重ねてグラフ表示することが望ましい場合がある。

【0055】

ここで、図１に示した方法を例示する具体的な実施形態について説明することができる。３標的「戦略Ａ」（３ ｔａｒｇｅｔ ”Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ａ”）のアルゴリズムでは、２９６の標本連続作業単位（ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｒｕｎ）を収集し、解析モデルの開発のために供した。戦略Ａの実装（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）では、第１の遺伝子エレメント、第２の遺伝子エレメント、および第３の遺伝子エレメントに対応する３つの標的には、ｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、およびｏｒｆＸが含まれた。

【0056】

任意の分類問題で、その適切な特徴を測定して、１つの事象クラスを別の事象クラスから識別する場合、データの類型化を可能とする固有の特徴空間が存在する。ＭＲＳＡの分類については、これがあてはまる。この適用を行うための日常的な解析を創出するために、図３Ａに示す通りに、特徴空間を観察した。図３Ａでは、陽性データおよび陰性データの両方を、ｆｅｍＡをｍｅｃＡと対比する二次元特徴空間内にプロットした。陽性データ点は、左下隅の対角線に沿ってクラスタリングされ、陰性データ点は、とりわけ上半分の空間および右下隅に、より無作為に広がる。

【0057】

このデータおよびさらなる確認データに基づき、陽性の特徴空間を包含する数学モデルを選択した。陽性事象についてのデータは、陽性クラスターと陰性クラスターとの間の境界を定式化するために選択された楕円に類似する。陽性データは通常、好ましい特徴空間内でガウス分布を形成するので、楕円の境界を理想的な選択と考えることができる（特徴空間の境界を表わすガウス分布の横断面が楕円であることに注意されたい）。これにより、図３Ｂの楕円モデルが正当化される。数学的には、楕円モデルの式が、

【0058】

【数1】

［式中、ａは半長軸であり、ｂは半短軸である］で与えられる。この場合、楕円は、原点のまわりを中心とする（ｃｅｎｔｅｒｅｄ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ）と推測される。ＭＲＳＡの検出を裏付けるためには、楕円モデルが、（ｘ_０，ｙ_０）により定義される並進、および原点の周りの角度θの角変位を裏付ける必要がある。

【0059】

したがって、その最も一般的な形式では、楕円を、

【0060】

【数2】

である］として、二次元特徴空間内で完全に特徴づけることができる。この一般化された楕円は、５つのパラメータ、ａ、ｂ、ｘ_０、ｙ_０、およびθのセットにより規定することができる。パラメータのそのセットを決定すれば、固有の楕円（または特徴空間）が定義される。

【0061】

最適の楕円パラメータのセットを得るためには、分類結果に基づき、費用関数を定義することができる。この種の適用で一般的に用いられる費用関数は、受信者動作特性曲線すなわちＲＯＣ曲線（ＲＯＣ曲線のより詳細については、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｒｅｃｅｉｖｅｒ＿ｏｐｅｒａｔｉｎｇ＿ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃを参照されたい）の曲線下面積である。ＲＯＣ曲線は、その適用についての感度対１−特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）のグラフプロットをもたらす。ＭＲＳＡについての適用では、偽陽性数と偽陰性数との組合せを、費用関数：
費用＝ｃ_１×偽陰性数＋ｃ_２×偽陽性数
として適用する［式中、重みづけ係数ｃ_１およびｃ_２は、特定の問題における選好を表わすように選択する］。

【0062】

特徴空間の数学モデル、および考案した費用関数の定義を与えたら、費用関数を最小化するように、特徴空間についてのモデルを最適化することができる。最小費用によるモデルの実現が、分類問題についての最適解である。例えば、ヒルクライミング法、アニーリングのシミュレーション、遺伝子アルゴリズムなど、用いうる複数の最適化手順が存在する。この適用では、遺伝子アルゴリズムを用いる。遺伝子アルゴリズムについてのより詳細な情報は、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｇｅｎｅｔｉｃ＿ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓにおいて見出すことができる。

【0063】

図２を参照したところ、二次元特徴空間でｆｅｍＡをｍｅｃＡと対比することにより測定された特徴が、このモデルにとって常に均質または理想的であるわけではないことが観察された。例えば、図２に示す通り、ｏｒｆＸが４５以上である場合は、陽性データ点が、「広がった（ｆａｔ）」クラスター（線で囲ったクラスター）を形成するが、ｏｒｆＸが４５未満である場合は、陽性データ点が、楕円により準拠した（ｉｓ ｍｏｒｅ ｉｎｌｉｎｅ ｗｉｔｈ）クラスターを形成する。結果として、ｏｒｆＸ＜４５およびｏｒｆＸ≧４５のそれぞれについて、２つの楕円モデルが確立される。このｏｒｆＸに依存する楕円モデルにより、ＭＲＳＡ陽性試料のデータが、本質的に三次元空間に分類される。

【0064】

次いで、図２で例示される解析モデルのグラフ表示を用いて、未知試料を、ＭＲＳＡなど、特定の生物学的持続状態と関連するものとして分類することができる。

【0065】

一般に、形成された解析モデルの使用は、デジタルコンピュータに、未知試料と関連する第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を入力するステップを包含しうる。デジタルコンピュータは、解析モデルを形成するのに用いられる同じデジタルコンピュータの場合もあり、異なるデジタルコンピュータ（例えば、１つのデジタルコンピュータ上で解析モデルを形成するが、これを保存するのは、それを用いる別のデジタルコンピュータ内である場合）の場合もある。第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値は、未知試料中の第１の遺伝子エレメント、第２の遺伝子エレメント、および第３の遺伝子エレメントと関連する。入力値を入力した後で、デジタルコンピュータにより、解析モデルを用いる第１の境界空間または第２の境界空間を用いて、未知試料を、その生物学的持続状態と関連するものとして分類する。

【0066】

図４は、一実施形態により、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうかを決定するのに用いうるステップを例示する。本明細書で用いられる未知試料とは、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかが知られていない試料を指す。図４のステップは、図１によるステップを用いて創出されるモデルなどのモデルを用いて、未知試料がＭＲＳＡを含有するかどうかを決定しうる。未知試料は、様々な測定された標的を有しうる。これらの測定値は、未知試料の測定された標的から創出される中間ベクターがモデルの境界関数に相対して存在するかどうかの分析によってＭＲＳＡの存在を検出するのに用いることができる。

【0067】

ステップ１１００では、未知試料を、該試料中の細菌の核酸を露出させる条件下に置く。図１のステップ１０００について上に記載した同じ技法を、ステップ１１００でもまた用いることができる。

【0068】

ステップ１１１０では、未知試料から、少なくとも３つの標的であるｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、およびｏｒｆＸ（または他の遺伝子エレメント）と関連する特徴を決定することができる。上記図１のステップ１０１０において用いた同じ技法を用いて、ステップ１１１０を達成することができる。該特徴は、解析モデルを形成するのに用いられる特徴と同じ特徴でありうる。例えば、Ｃｔ値を用いて解析モデルを形成する場合は、ステップ１１１０の３つの標的について、Ｃｔ値を決定することができる。

【0069】

ステップ１１２０では、解析モデルを、３つの標的と関連する入力値に適用することができる。解析モデルと関連するプロセスは、図４の少なくともステップ１１３０および１１４０を包含しうる。

【0070】

例えば、ステップ１１３０では、該方法により、ｏｒｆＸと関連する第３の入力値が、解析モデルにおける閾値（例えば、「４５」）を上回るか、または下回るかを決定する。

【0071】

ステップ１１４０では、未知試料と関連する第３の入力値が閾値（例えば、４５）を下回る場合は、あらかじめ形成した第１の境界空間を用いて、該試料が対象の生物学的持続状態（例えば、ＭＲＳＡ）と関連するかどうかを決定する。あるいは、未知試料と関連する第３の入力値が閾値（例えば、４５）を上回る場合は、あらかじめ形成した第２の境界空間を用いて、該試料が対象の生物学的持続状態（例えば、ＭＲＳＡ）と関連するかどうかを決定する。

【0072】

所望の場合は、さらなる規則を用いて、未知試料をさらに分類することができる。例えば、１つ、２つ、または３つ以上のさらなる標的（例えば、ＭＲ−ＣｏＮｓと関連する標的）をさらなるデータとして用いることができ、これを、未知試料を分類するのにさらに用いることができる。

【0073】

中間値を用いる実施形態
本発明の別の実施形態は、ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別する解析モデルを創出する方法を対象としうる。該方法では、少なくとも１つの中間値を用いる。このような実施形態は、図５に言及しながら説明することができる。

【0074】

ステップ５０００では、選択した数の既知試料を、該試料中の細菌の核酸を露出させる条件下に置く。ステップ５０００の詳細は、図１のステップ１０００について記載した詳細と同じ場合もあり、異なる場合もあるが、上の記載は繰返しを要さない。

【0075】

ステップ５０１０では、既知試料の各々について、ｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、およびＳＣＣｍｅｃなど、少なくとも３つの標的の特徴を測定する。ステップ５０１０の詳細は、図１のステップ１０１０について上に記載した詳細と同じ場合もあり、異なる場合もあるが、上記の説明は繰返しを要さない。しかし、この例では、ｏｒｆＸの代わりに、ＳＣＣｍｅｃを標的として同定することに注意されたい。

【0076】

入力値を決定した後では、それらをデジタルコンピュータに入力する。一部の実施形態では、デジタルコンピュータへの、少なくとも、第１の遺伝子エレメント（例えば、ｍｅｃＡなどの第１の標的）と関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメント（例えば、ｆｅｍＡなどの第２の標的）と関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメント（例えば、ＳＣＣｍｅｃなどの第３の標的）と関連する複数の第３の入力値を包含する。第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値は、任意の適切な時点において、任意の適切な順序で、デジタルコンピュータに入力することができる。

【0077】

ステップ５０２０では、既知試料の各々から測定された標的の各々に、判定アルゴリズムを適用することができる。この例における判定アルゴリズムは、図１について上に記載した判定アルゴリズムとは異なる。

【0078】

ステップ５０３０では、デジタルコンピュータを用いて、少なくとも複数の第１の入力値、および第２の遺伝子エレメントと関連する少なくとも第２の入力値を用いて、１つ以上の中間値を決定することができる。例えば、一部の実施形態では、第１の遺伝子エレメント（ｍｅｃＡ）および第２の遺伝子エレメント（ｆｅｍＡ）と関連する、第１の入力値および第２の入力値（例えば、第１のＣｔ値および第２のＣｔ値）を用いて、１つ以上の中間値を創出することができ、これを、第３の遺伝子エレメント（例えば、ＳＣＣｍｅｃ）と関連する第３の入力値と組み合わせることができる。

【0079】

ステップ５０４０に示す通り、１つ以上の中間値を創出した後では、デジタルコンピュータを用いて、該１つ以上の中間値、および複数の第３の入力値を用いて、該生物学的持続状態についての境界空間を創出する。該境界空間により、該生物学的持続状態を、他の生物学的持続状態から区別する。

【0080】

例示として、３標的「戦略Ｃ」のアルゴリズムでは、１９９の標本連続作業単位を収集し、アルゴリズムの開発に供した。戦略「Ｃ」の実装では、３つの標的が、ｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、およびＳＣＣｍｅｃであった。

【0081】

ｍｅｃＡをＳＣＣｍｅｃと対比する二次元特徴空間、およびｆｅｍＡをＳＣＣｍｅｃと対比する二次元特徴空間を、図６Ａおよび６Ｂに示す。陽性と陰性とが混じり合い、該二次元特徴空間のいずれにおいても識別できないグレーの領域（黒色の円で囲った領域）が存在することが観察される。

【0082】

グレーの領域を克服するために、新たなパラメータを用いて、事象を陽性または陰性として識別することができる。この新たなパラメータを、
新たなパラメータ＝ｍｅｃＡ×ｓｉｎ（−０．３）＋ｆｅｍＡ×ｃｏｓ（−０．３）
として確立した。この「新たなパラメータ」は中間値の例である。なぜなら、それは、第１の遺伝子エレメント（例えば、ｍｅｃＡ）と関連する第１の入力値、および第２の遺伝子エレメント（例えば、ｆｅｍＡ）と関連する第２の入力値に由来するからである。

【0083】

図７は、この新たなパラメータをどのようにして創出し、かつ、用いるかについて例示する。図７は、ｍｅｃＡ ８１０およびｆｅｍＡ ８２０と関連する値を組み合わせて、中間値Ｙ ８４０を形成しうることを示す。この中間値Ｙ ８４０およびＳＣＣｍｅｃ ８３０により二次元特徴空間を形成することができ、これを用いて、未知試料を、ＭＲＳＡと関連するものとして、またはＭＲＳＡとは関連しないものとして分類するための境界空間を定義することができる。

【0084】

図８に、新たなパラメータをＳＣＣｍｅｃと対比する特徴空間のプロットを示す。この例示では、グレーの領域が消滅し、ＳＣＣｍｅｃと併せて、新たなパラメータが、分類のためのより良好な特徴空間を構成する。

【0085】

「新たなパラメータ」およびＳＣＣｍｅｃを考慮して、楕円モデル（図９に示す）を確立し、陽性データ点と陰性データ点との境界を定義した。先に記載したのと同じ方法で、遺伝子アルゴリズムにより、楕円モデルを最適化することができる（例えば、上記のステップ１０６０における技法など、先に記載した境界形成法のうちのいずれかを、本発明の実施形態で用いることができる）。楕円の内側に位置するすべてのデータ点を、ＭＲＳＡ陽性とみなす。

【0086】

図１０は、一実施形態により、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうかを決定するのに用いうるステップを例示する。本明細書で用いられる未知試料とは、該試料中にＭＲＳＡが存在するかどうかが知られていない試料を指す。該方法は、図５によるステップを用いて創出されるモデルなどの解析モデルを用いて、未知試料が、ＭＲＳＡを含有するか（または別の生物学的持続状態と関連するか）どうかを決定しうる。未知試料中の各種の標的の特徴を測定して、第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を形成することができる。入力値および解析モデルを用いて、未知試料中のＭＲＳＡの存在を検出することが可能である。

【0087】

図１０に言及すると、ステップ６０００では、未知試料を、該試料中の細菌の核酸を露出させる条件下に置く。図１のステップ１０００において用いた同じ技法を、ステップ６０００でも用いることができる。

【0088】

ステップ６０１０では、少なくとも３つの標的、ｍｅｃＡ、およびＳＣＣｍｅｃの特徴を、未知試料から測定する。この未知試料について、第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を決定することができる。ステップ１０１０について上に記載した同じ技法を用いて、ステップ６０１０を達成することができる。

【0089】

ステップ６０２０では、解析モデル、ならびに第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を用いて、未知試料中に、特定の生物学的持続状態が存在するかどうか（例えば、ＭＲＳＡが存在するか、またはＭＲＳＡが存在しないか）を決定することができる。

【0090】

ステップ６０３０では、解析モデルを、第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値に適用するときに、該第１の入力値および第２の入力値を用いて、中間値を決定することができる。例えば、以下の式：
Ｙ＝新たなパラメータ＝ｍｅｃＡ×ｓｉｎ（−０．３）＋ｆｅｍＡ×ｃｏｓ（−０．３）
を用いれば、中間値を決定することができる。

【0091】

例示として、試料に、ｍｅｃＡ＝２８．４９、ｆｅｍＡ＝２７．９０、およびＳＣＣｍｅｃ＝２７．２６、Ｙ＝１８．２３４５が与えられる。

【0092】

該方法のステップ６０４０では、解析モデル内の境界関数を用いることにより、試料が、ＭＲＳＡについて陽性であるかどうかを決定する。例えば、上記の例では、Ｙ＝１８．２３４５およびＳＣＣｍｅｃ＝２７．２６という値を、図９の楕円境界関数に対して比較することができる。この例ならば、境界関数の内部に収まるので、該未知試料は、ＭＲＳＡ陽性として分類される。

【0093】

システム
図１１は、デジタルコンピュータ３００と、該デジタルコンピュータ３００に作動的に接続された（これには、電気的接続も含まれうる）測定モジュール３０１を含めたシステムを示す。

【0094】

この例では、デジタルコンピュータ３００が、併せて作動的に接続されたシステムバス３０４、１つ以上のディスクドライブ３０５、ＲＡＭ ３０６、およびプロセッサ３０７を含めた、各種の典型的なコンピュータの構成要素を包含しうる。また実施形態の正確な性質に依存して、他の構成要素も存在しうる。図１１はまた、ディスプレイ３０８、キーボード３０２、およびマウス３０３も示す。一部の実施形態ではまた、これらの構成要素および他の構成要素も、デジタルコンピュータの一部でありうる。

【0095】

システムはまた、試料（例えば、既知試料または未知試料）中の選択された標的の特徴を測定するのに用いる測定モジュール３０１も有しうる。この測定モジュールは、標的の反応を測定するのに選択される測定法に応じて、本発明の異なる実施形態間で変化しうる。例えば、一実施形態では、測定モジュールが、試料に対するＰＣＲ解析を実施することが可能であり、したがって、それはリアルタイムＰＣＲ装置でありうる。リアルタイムＰＣＲ装置は、市販されている。

【0096】

本発明の一実施形態では、試料を測定モジュール３０１に入れ、ここで、試料を処理し、試料から選択した標的の特徴（例えば、その量）を測定する。このデータ（例えば、先に記載した入力値）を、システムバス３０４を通ってデジタルコンピュータ３００へと移し、プロセッサ３０７を用いて、適切な判定アルゴリズムまたは解析モデルを、反応データへと適用することができる。命令により、プロセッサ３０７に、判定アルゴリズムまたは解析モデル（上に記載した）を実行させ、これを、ＲＡＭ ３０６またはディスクドライブ３０５など、コンピュータにより読み取り可能な媒体上で保存することができる。また、判定アルゴリズムおよび／または解析モデルを表わすデータも、この同じ媒体に保存することができる。次いで、判定アルゴリズムまたは解析モデルの適用から得られる出力を、ディスプレイ３０８または他の出力デバイス（例えば、プリンタ）上に表示することができる。例えば、先に記載した境界関数およびそれらに随伴するグラフを、ディスプレイ３０８または他の何らかの様式の出力に表示することができる。こうして、測定された試料からの情報を用いて、モデルを構築する一助とすることもでき、試料がＭＲＳＡを含有するかどうかを決定することもできる。

【0097】

上記で言及した通り、一部の実施形態では、コンピュータにより読み取り可能な媒体が、プロセッサにより実行しうる、解析モデルを形成する方法を実装するためのコードを保存または包含しうる。一実施形態では、該方法が、デジタルコンピュータに、少なくとも、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップであって、ここで、各既知試料が、該複数の第１の入力値中の第１の入力値と、該複数の第２の入力値中の第２の入力値と、該複数の第３の入力値中の第３の入力値を包含するステップと；該第３の遺伝子エレメントと関連する閾値を決定するステップと；該閾値を用いて、該既知試料を、既知試料の第１のセットおよび既知試料の第２のセットへと区分するステップと；既知試料の該第１のセットを、該第１の遺伝子エレメントおよび該第２の遺伝子エレメントにより定義される特徴空間においてクラスタリングするステップと；既知試料の該第１のセットを用いて第１の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第１の境界空間が、ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップと；既知試料の該第２のセットを用いて第２の境界空間を定義するステップであって、ここで、該第２の境界空間が、ある生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップを包含しうる。別の例では、該方法が、デジタルコンピュータに、少なくとも、第１の遺伝子エレメントと関連する複数の第１の入力値、第２の遺伝子エレメントと関連する複数の第２の入力値、および第３の遺伝子エレメントと関連する複数の第３の入力値を入力するステップと；該デジタルコンピュータを用いる、少なくとも該複数の第１の入力値、および第２の遺伝子エレメントと関連する少なくとも該第２の入力値を用いて、１つ以上の中間値を創出するステップと；該デジタルコンピュータを用いる、該１つ以上の中間値、および該複数の第３の入力値を用いて、該生物学的持続状態についての境界空間を創出するステップであって、ここで、該境界空間が該生物学的持続状態を他の生物学的持続状態から区別するステップを包含しうる。

【0098】

上記で言及した通り、一部の実施形態では、コンピュータにより読み取り可能な媒体が、該プロセッサにより実行しうる、解析モデルを用いるための方法を実装するためのコードを保存または包含しうる。該方法は、該デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータに、未知試料と関連する第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を入力するステップであって、ここで、該第１の入力値、該第２の入力値、および該第３の入力値が、該未知試料中の第１の遺伝子エレメント、第２の遺伝子エレメント、および第３の遺伝子エレメントと関連するステップと；該デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータを用いる、第１の境界空間または第２の境界空間を用いて、該未知試料を、該生物学的持続状態と関連するものとして分類するステップを包含しうる。別の実施形態では、該方法が、該デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータに、未知試料と関連する第１の入力値、第２の入力値、および第３の入力値を入力するステップであって、ここで、該第１の入力値、該第２の入力値、および該第３の入力値が、該未知試料中の該第１の遺伝子エレメント、該第２の遺伝子エレメント、および該第３の遺伝子エレメントと関連するステップと；該デジタルコンピュータまたは他のデジタルコンピュータを用いて、該第１の境界空間または該第２の境界空間を用いて、該未知試料を、該生物学的持続状態と関連するものとして分類するステップを包含しうる。

【実施例】

【0099】

複数種類の被験試料１９９例は、「ロングビーチデータコレクション」と表示された。このデータコレクションでは、以下の標的の組合せ：１）ｏｒｆｘ、ｍｅｃＡ、およびｆｅｍＡ；２）ｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、およびＳＣＣｍｅｃ；３）ｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、ＳＣＣｍｅｃ、およびＭＲ−Ｃｏｎｓについて調べた。このデータのために開発した判定アルゴリズムは、二次元の楕円による数学モデルに基づく。一例では、該モデルが、中間値を発生させる。ＭＲＳＡの分類結果は、該中間値による閾値形成を介して決定する。該数学モデルは、

【0100】

【数3】

［式中、Ｓは、中間値であり、ｘおよびｙは、このモデルに対する２つの入力である］として定式化される。Ｏｒｆｘ、ｆｅｍＡ、およびｍｅｃＡについてのデータコレクションでは、ｘおよびｙが、それぞれ、ｍｅｃＡおよびｆｅｍＡである。ＳＣＣｍｅｃ、ｆｅｍＡ、およびｍｅｃＡについてのデータコレクションでは、ｘおよびｙが、それぞれ、ＳＣＣｍｅｃおよびＹ＝ｆ（ｍｅｃＡ，ｆｅｍＡ）である。具体的に述べると、Ｙ＝ｆ（ｍｅｃＡ，ｆｅｍＡ）＝ｍｅｃＡ×ｓｉｎ（−０．３）＋ｆｅｍＡ×ｃｏｓ（−０．３）［式中、−０．３とは、ラジアン単位である］である。ｘ_０、ｙ_０、ａ、ｂ、およびθは、事前定義パラメータであり、これらは、所与の基準を伴う遺伝子アルゴリズムでこのモデルを練り上げることにより得られる。ｘ_０、ｙ_０、ａ、ｂ、およびθを与えれば、ｘおよびｙの各対によりＳが生成される。Ｓが小さいとは、（ｘ，ｙ）が（ｘ_０，ｙ_０）に近接することを意味し、この逆もまた成り立つ。分類を目的とする場合は、Ｓの閾値（例えば、Ｓ_０）を選択することが望ましい。試料が、Ｓ_０未満の中間値をもたらす場合は、この試料をＭＲＳＡ陽性とみなす。これらの判定アルゴリズムは、パラメータ処理した数学モデルに基づくが、これらを遺伝子アルゴリズムで練り上げて、最適の性能に到達させ、中間値による閾値形成を介して分類結果を生成させる。

【0101】

試料の調製
１９９例の鼻腔内スワブを回収し、スチュアート輸送培地内で保存する。スワブヘッドを取り外し、各スワブヘッドを、ｐＨ８．０の１０ｍＭトリスおよびｐＨ８．０の１ｍＭ ＥＤＴＡを伴う、トリスベースの試料緩衝液１２００μＬ、１ｍｍのジルコニア／シリカビーズ約１００ｍｇを伴う、２ｍｌの試料懸濁液用試験管へと移した。３０００ｒｐｍの速度で少なくとも１５秒間にわたり、該試料用試験管をボルテックスすることにより、該スワブヘッド上の細菌をふるい落とした。

【0102】

次いで、該スワブヘッドを該試料用試験管から無菌的に取り出し、１ｍｌのＴｒｙｐｉｃ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）および６．５％のＮａＣｌを伴う１５ｍｌの細菌培養用試験管へと移した。該接種された細菌用試験管を、３７℃のインキュベータへと移し、２００ｒｐｍの速度で振とうしながら一晩にわたりインキュベートした。

【0103】

次いで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよび／またはＭＲＳＡの存在または非存在を確認した。一晩にわたる培養ブロスを各々１０μＬずつ、ＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ ＭＲＳＡプレートおよびＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプレートへと画線した。次いで、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＶｉｒＮＡキットのプロトコールに記載される通り、各試験管からの、１２００μＬの試料溶液のうちの５００μＬずつを、ＤＮＡ単離手順にかけた。略述すると、プロセスコントロールとしてのＳ． ｆｅｌｉｓ細菌２００ＣＦＵでこの手順を開始した。各試験管に１０単位ずつのアクロモペプチダーゼ（Ａｃｈｒｏｍｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を添加し、十分に混合し、７０℃の水浴中で４分間にわたりインキュベートした。次いで、各試料に、１８８μＬの溶解用緩衝液、１．０μＬのＰｏｌｙＡ（６００μｇ／ｍｌ）、および１００μＬのプロテアーゼＫ（６．４ｍｇ／ｍｌ）を含有する、調製したての溶解用溶液２８９μＬを添加し、十分に混合した。次いで、各試料を７０℃で１分間にわたりインキュベートし、次いで、２分間にわたり冷却した。次いで、１０μＬの磁気ビーズ、および５７５μＬの１００％イソプロパノールを添加し、ボルテックスすることにより十分に混合した。その反応内容物を、室温で５分間にわたりインキュベートし、次いで、該試料用試験管を磁気スタンド上に６分間にわたり静置することにより、磁気ビーズを回収して、該試料溶液が澄明となるまで、該溶液から磁気ビーズを分離した。

【0104】

次に、吸引の間にビーズを除去しないように注意しながら、該試料から上清を吸引除去した。５００μＬの洗浄用緩衝液（３．３Ｍのチオシアン酸グアニジン、１．７％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１６７．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を該試料に添加し、１０秒間にわたりボルテックスし、混合した。次いで、その試験管を、磁石上で４分間にわたり（または澄明になるまで）インキュベートした。次いで、再度、該試料から上清を吸引除去した。次いで、調製したての７５％エタノール９００μＬを添加し、１０秒間にわたりボルテックスした。次いで、その試験管を、磁石上で、澄明になるまで４分間にわたりインキュベートした。次いで、再度、該試料から上清を吸引除去し、今一度、エタノールによる洗浄を繰り返した。次いで、該ビーズを、磁石上で、１５〜２５分間にわたり乾燥させた。該ビーズのリングが開裂し始めた場合に、該試料が溶出した。磁石からその試験管を取り去り、ヌクレアーゼ非含有水２５μＬを添加した。次いで、該試料をボルテックスして混合した。次いで、その試験管を、７０℃で５分間にわたりインキュベートした。その試験管を磁石上に戻し、１分間にわたりインキュベートした。次いで、上清を清潔な試験管へと移し、ＰＣＲによる増幅にかけた。

【0105】

ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブ、ＰＣＲサイクリング条件
Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘの表で列挙される試薬は、氷上で調製した。総反応回数に応じて、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮアーゼ非含有試験管に表示容量の試薬を一緒にして単純に添加することにより、十分なＭａｓｔｅｒ ｍｉｘを調製できた。その試験管をボルテックスして混合し、次いで、後の使用のために氷上に放置した。各溶出物２０μＬずつを、Ｍｘ３０００Ｐ ９６ウェルＰＣＲプレート（スカートなし）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、型番４０１３３３）（１つのウェルに１つの溶出物）へと添加した。３０μＬのＭａｓｔｅｒ ｍｉｘを、溶出物で満たされた各ウェルに添加し、次いで、８回以上にわたり上下に静かにピペッティングする（マルチチャネル型が有用であろう）ことにより、混合した。そのプレートを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）光学接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により密閉し、次いで、１１００×ｇで３分間にわたり遠心分離してから、ＰＣＲ装置に入れた。

【0106】

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ３００５Ｐ装置上でのＰＣＲサイクリング条件は、以下：３７℃で４分間（１回）；９５℃で１分間（１回）；９５℃で１５秒間→６２℃で１０秒間→５８℃で３０秒間（４０回）の通りに設定した。モニタリングされる標的を、以下の表１に表わす。

【0107】

【表1-1】

【0108】

【表1-2】

【0109】

【表1-3】

【0110】

以下の表は、ロングビーチデータコレクションにおける１９９例の試料を用いて発生した偽陽性データおよび偽陰性データ、本発明の実施形態（上記の）による解析モデルを用いて発生した偽陽性データおよび偽陰性データ、ならびに他の判定アルゴリズムを用いる解析モデルを用いて発生した偽陽性データおよび偽陰性データを示す。

【0111】

【表2】

上記最初の３つの解析モデル（１〜３）は、本発明の実施形態により作成したモデルであり、それは良好な結果を示す。３標的のクラスタリング、および上に記載した工程（例えば、図１の工程）を用いる、戦略Ａと称する第１の解析モデルは、１０例の偽陽性および２例の偽陰性をもたらした。戦略Ｃおよび４つの標的を用いる第２の解析モデルは、３例の偽陽性および２例の偽陰性をもたらした。戦略Ｃを用いる第３の解析モデルは、３例の偽陽性および４例の偽陰性をもたらした。戦略Ａおよび戦略Ｃと関連する方法は、上に記載した（例えば、図５における方法）。４標的戦略Ｃの例の場合は、ＭＲＣｏｎＳをさらなる標的として用い、ＭＲＳＡ試料を、非ＭＲＳＡ試料から区別した。

【0112】

残りのデータは、公表されている判定アルゴリズムにより処理したデータを示す。このようなアルゴリズムの詳細のうちの一部を以下に示す。

【0113】

４について：Ｘｐｅｒｔは、公知であり、市販されている検査である。

【0114】

５について：戦略Ｃによる１標的；ＳＣＣｍｅｃが標的である。ＳＣＣｍｅｃのＣｔ値が３２未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。ＳＣＣｍｅｃのＣｔ値が３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。

【0115】

６について：戦略Ｃによる２標的（ＳＣＣｍｅｃ、ｍｅｃＡ）：ＳＣＣｍｅｃおよびｍｅｃＡのいずれもが３２未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。ＳＣＣｍｅｃが３２より大きいか、またはｍｅｃＡが３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。

【0116】

７について：戦略Ｃ（ＳＣＣｍｅｃ、ｍｅｃＡ）によるＣｔの比較（±４ｃｔ）：ＳＣＣｍｅｃが３２より大きいか、またはｍｅｃＡが３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。ＳＣＣｍｅｃおよびｍｅｃＡのいずれのＣｔ値も３２未満であり、ＳＣＣｍｅｃとｍｅｃＡとの間のデルタＣｔが４未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。デルタＣｔが４より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。

【0117】

８について：戦略Ｃによる２標的（ＳＣＣｍｅｃ、ｆｅｍＡ）：ＳＣＣｍｅｃおよびｆｅｍＡのいずれもが３２未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。ＳＣＣｍｅｃが３２より大きいか、またはｆｅｍＡが３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。

【0118】

９について：戦略Ｃ（ＳＣＣｍｅｃ、ｆｅｍＡ）によるＣｔ比較：ＳＣＣｍｅｃが３２より大きいか、またはｆｅｍＡが３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。ＳＣＣｍｅｃおよびｆｅｍＡのいずれのＣｔ値も３２未満であり、ＳＣＣｍｅｃとｆｅｍＡとの間のデルタＣｔが４未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。デルタＣｔが４より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。

【0119】

１０について：戦略Ｃによる３標的（ＳＣＣｍｅｃ、ｍｅｃＡ、およびｆｅｍＡ）：ＳＣＣｍｅｃ、ｍｅｃＡ、およびｆｅｍＡが３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。ｍｅｃＡが３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。ＳＣＣｍｅｃが３２より大きければ、ＭＲＳＡが存在しない。ｍｅｃＡおよびｆｅｍＡのいずれもが３２未満であり、ＳＣＣｍｅｃが３２より大きく、ｍｅｃＡとｆｅｍＡとのデルタＣｔ値が４未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。

【0120】

１１について：戦略Ａによる２標的（ｆｅｍＡおよびｍｅｃＡ）：ｆｅｍＡおよびｍｅｃＡのいずれもが３２未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。他の場合は、ＭＲＳＡが存在しない。

【0121】

１２について：戦略Ａによる２標的（ｏｒｆＸが陰性（−ｖｅ））のＣｔ比較（±４ｃｔ）：ｆｅｍＡおよびｍｅｃＡのいずれもが３２未満であり、ｆｅｍＡとｍｅｃＡとの間のデルタＣｔが４未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。他の場合は、ＭＲＳＡが存在しない。

【0122】

１３について：戦略Ａによる３つの標的（ｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、ｏｒｆＸ）：）：ｆｅｍＡおよびｍｅｃＡのいずれもが３２未満であり、ｏｒｆＸが陰性であれば、ＭＲＳＡが存在する。他の場合は、ＭＲＳＡが存在しない。

【0123】

１４について：戦略Ａによる３つの標的（ｍｅｃＡ、ｆｅｍＡ、ｏｒｆＸ）のＣｔ比較（±４ｃｔ）：ｆｅｍＡおよびｍｅｃＡのいずれもが３２未満であり、ｏｒｆＸが陰性であり、ｍｅｃＡとｆｅｍＡとのデルタＣｔ値が４未満であれば、ＭＲＳＡが存在する。他の場合は、ＭＲＳＡが存在しない。

【0124】

本出願に記載されるソフトウェアコンポーネント、ステップ、または関数は、例えば、従来の技法またはオブジェクト指向の技法を用いる、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、またはＰｅｒｌなど、任意の適切なコンピュータ言語を用いる、１つ以上のプロセッサにより実行されるソフトウェアコードとして実装することができる。ソフトウェアコードは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）などのコンピュータにより読み取り可能な媒体、ハードドライブもしくはフロッピー（登録商標）ディスクなどの磁気媒体、またはＣＤ−ＲＯＭなどの光学媒体に、一連の命令またはコマンドとして保存することができる。任意のこのようなコンピュータにより読み取り可能な媒体はまた、単一のコンピュータ装置上または単一のコンピュータ装置内に常駐させることができるが、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ装置上または異なるコンピュータ装置内に存在させることもできる。

【0125】

本発明の一部の実施形態は、ソフトウェアもしくはハードウェアまたはこれら両方の組合せにおける制御論理の形態で実装することができる。この制御論理は、本発明の実施形態で開示される一連のステップを実施するように情報処理デバイスを方向づけるのに適合させた複数の命令として、情報保存媒体内に保存することができる。本明細書で示される開示および教示に基づき、当業者は、本発明を実装する他の方途および／または方法を理解する。

【0126】

特にそれに反することを意図しない限りにおいて、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、または「その、該（ｔｈｅ）」は、「１つ以上の」を意味することを意図する。

【0127】

上記の説明は、例示的なものであり、制限的なものではない。本開示を検討すれば、当業者には、本発明の多くの変化形が明らかとなる。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照することにより決定されるものではなく、それらの全範囲または同等物と共に、係属中の特許請求の範囲を参照することにより決定されるものとする。

【0128】

上記で言及したすべての特許、特許出願、刊行物、および説明は、すべての目的で、それらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。これらのいずれもが、先行技術としては容認されない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]