特許 5908900 バイオマスのミル粉砕改善のための無水アンモニア処理

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5908900

(24)【登録日】2016年4月1日

(45)【発行日】2016年4月26日

(54)【発明の名称】バイオマスのミル粉砕改善のための無水アンモニア処理

(51)【国際特許分類】

   C13K 1/02 20060101AFI20160412BHJP

   C12P 19/14 20060101ALI20160412BHJP

【ＦＩ】

   C13K1/02

   C12P19/14 A

【請求項の数】15

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2013-520853(P2013-520853)

(86)(22)【出願日】2011年7月21日

(65)【公表番号】特表2013-530726(P2013-530726A)

(43)【公表日】2013年8月1日

(86)【国際出願番号】US2011044775

(87)【国際公開番号】WO2012012594

(87)【国際公開日】20120126

【審査請求日】2014年7月4日

(31)【優先権主張番号】61/366,231

(32)【優先日】2010年7月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】390023674

【氏名又は名称】イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】カール・イー・カンプ

(72)【発明者】

【氏名】エレナ・ツィラコビッチ

(72)【発明者】

【氏名】ブルース・エー・ダイナー

(72)【発明者】

【氏名】ジャニーヌ・ファン

【審査官】 白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０５３７０９９９（ＵＳ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１０２６０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００４２２５９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／００５５２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０３７０７４３６（ＵＳ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５１７１５９２（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開昭５８−０７９００１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 TAYLOR，CORN-MILLING PRETREATMENT WITH ANHYDROUS AMMONIA，APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY，２００３年，V104，P141-148

【文献】 DALE，EXTRUSION PROCESSING FOR AMMONIA FIBER EXPLOSION(AFEX)，APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY，１９９９年，V77-79，P35-45

【文献】 CHUNDAWAT， ，BIOTECHNOLOGY & BIOENGINEERING，２００７年，V96，P219-231，EFFECT OF PARTICLE SIZE BASED SEPARATION OF MILLED CORN STOVER ON AFEX PRETREATMENT AND ENZYMATIC DIGESTIBILITY

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１３Ｂ ５／００−９９／００

Ｃ１３Ｋ １／００−１３／００

ＣｉＮｉｉ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）１５〜３０重量％の湿分を有するリグノセルロース系バイオマスを用意するステップと、
（ｂ）（ａ）のバイオマスを無水アンモニアと接触させることにより、アンモニア処理バイオマスを生産するステップと、
（ｃ）機械的破砕手段で機械的エネルギーを適用することにより、（ｂ）のアンモニア処理バイオマスを破砕して、容易に糖化可能な前処理バイオマスを生産するステップと
を含む、容易に糖化可能なバイオマスを生産する方法であって、
前記前処理バイオマスが、無定形セルロース成分を含み、
前記前処理バイオマス中の無定形セルロース成分の割合が、無水アンモニアと接触させずに（ｃ）と同じレベルの機械的エネルギーで破砕した前処理バイオマス中の無定形セルロース成分の割合と比較して高い、前記方法。

【請求項2】

前記ステップ（ｃ）の前記前処理バイオマスが、０．１ｍｍより小さい粒度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ステップ（ｃ）の機械的破砕に必要なエネルギーが、無水アンモニアと接触させていないリグノセルロース系バイオマスの機械的破砕に必要なエネルギーと比較して、４〜１０分の１である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

糖化の際、前記ステップ（ｃ）の前記前処理バイオマスが、無水アンモニアと接触させずに（ｃ）で破砕した前処理バイオマスと比較して、高い速度で発酵性糖を生産する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

アンモニア処理バイオマスが、アンモニア前処理後、実質的に乾燥している、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記機械的破砕手段が、パウンディング、摩砕、せん断、クラッシング、及びこれらの組合せの手段からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記機械的破砕手段が、アトリターミル粉砕、ハンマーミル粉砕、ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、振動ボールミル粉砕、振動ロッドミル粉砕、ジェットミル粉砕、ピンミル粉砕、タービンミル粉砕、空気分級ミル粉砕、ロールミル粉砕及び遊星ボールミル粉砕からなる群から選択される手段である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）が同時に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記破砕が、２日より短い期間にわたって行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記破砕が、６０分より短い期間にわたって行われる、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ステップ（ｂ）の無水アンモニアが、リグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対して２〜３０重量％の濃度である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

無水アンモニアが、リグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対して１０〜２５重量％の濃度である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ステップ（ｂ）のリグノセルロース系バイオマスを無水アンモニアと３０分〜１年の期間にわたり接触させておく、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ステップ（ｂ）のリグノセルロース系バイオマスを０℃〜２００℃の温度で無水アンモニアと接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

（ａ）のリグノセルロース系バイオマスが、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮、トウモロコシストーバー、イネ科牧草類、麦藁、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシバガス又はストーバー、ダイズストーバー、穀粒のミル粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木、灌木、野菜、果物、草花、動物肥料、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１０年７月２１日に提出された米国仮特許出願第６１／３６６２３１号の利益を請求するものである。尚、上記文献は、本明細書にその全文を参照により組み込むものとする。

【0002】

容易に糖化可能なリグノセルロース系バイオマスを生産する方法が提供される。具体的には、無水アンモニアを用いてバイオマスを前処理した後、ミル粉砕又はその他の機械的破砕手段に付す。無水アンモニア処理によって、容易に糖化可能な材料を取得するのに必要なミル粉砕のエネルギーが減少し、前処理及び糖化工程の全体速度が高められる。

【背景技術】

【0003】

リグノセルロース供給原料及び廃棄物、例えば、農業残渣、木材、林業廃棄物、製紙業からのスラッジ、ならびに一般廃棄物及び産業廃棄物などは、化学薬品、プラスチック類、燃料及び飼料の潜在的に豊富な再生可能供給原料を提供する。リグノセルロース供給原料及び廃棄物は、炭水化物ポリマー セルロース、及びヘミセルロース、さらにはリグニンを含有し、一般に、様々な化学的、機械的及び酵素的手段によって処理することにより、主としてヘキソース及びペントース糖を遊離するが、その後、これらの糖を有用な産物に発酵させることができる。

【0004】

前処理方法を用いて、糖化に用いられるセルロース分解酵素に、より容易に接近可能なリグノセルロース系バイオマスの炭水化物ポリマー、すなわち多糖類を製造する。多糖のセルロース分解酵素消化に対する大きな障害は、リグニンの存在であるが、リグニンは、酵素がその基質に接近するのを制限し、酵素が非生産的に結合する表面を形成する。さらに、セルロースミクロフィブリルの結晶性が、酵素の接近を制限し、糖化の妨げとなる。これらの課題を解決しようとする前処理として、蒸気爆砕、熱水、希酸、アンモニア繊維爆砕、アルカリ加水分解（アンモニアリサイクル浸出など）、酸化脱リグニン、オルガノソブ、及びオゾン化などが挙げられる。化学薬品、化学的回収、エネルギー入力、及び資本的設備のコストのために、多くの方法が商業的生産に見合わないものとなっている。

【0005】

少量の水性アンモニアと高い固形分濃度を用いたバイオマス前処理が、同一所有の特許文献１に開示されている。特許文献２は、バイオマスの処理を開示しており、この方法では、バイオマスを摩砕した後、液体若しくは気体の無水アンモニア、及び／又は液体若しくは気体の濃縮アンモニア：水混合物で、様々な湿分を含有させることにより、アンモニア：乾燥バイオマスの比が約０．２：１〜１．２：１で、かつ水：乾燥バイオマスの比が約０．２：１〜１．２：１である混合物を取得する。温度は、約５０℃〜１４０℃に維持し、容器からアンモニアを放出することにより圧力を急速に解放して、処理バイオマスを形成する。

【0006】

バイオマスを摩砕するミル粉砕は、非化学的前処理として用いられるか、又はオゾン分解と組み合わせて用いられている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第７，９３２，０６３号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２００８０００８７８３号明細書

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｋａｂｅｙａ ｅｔ ａｌ．．（１９９３） 四国工業技術試験所研究報告（Ｓｈｉｋｏｋｕ Ｋｏｇｙｏ Ｇｉｊｕｔｓｕ Ｓｈｉｋｅｎｓｈｏ Ｋｅｎｋｙｕ Ｈｏｋｏｋｕ）２４：４２−９０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

糖化のためのバイオマスを調製する別の効率的で、低コストのリグノセルロース系バイオマス前処理方法が依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、生体触媒による発酵に用いるための糖を生産する目的で、容易に糖化することができるようにバイオマスを調製するための方法を提供する。本方法は、バイオマスの機械的破砕及び微粉砕化を目的とする機械的エネルギーの適用前に、バイオマスへの無水アンモニアの適用を含む。意外なことに、無水アンモニアによる処理後に機械的破砕を行う順序には、微粉砕に必要な時間とエネルギーの減少という有益な効果があり、糖化の際に発酵性糖の生産速度を高め、従って、工程全体の速度が高められることが分かった。

【0011】

従って、本発明は、
ａ）リグノセルロース系バイオマスを用意するステップと、
ｂ）（ａ）のバイオマスを無水アンモニアと接触させることにより、アンモニア処理バイオマスを生産するステップと、
ｃ）機械的破砕手段で機械的エネルギーを適用することにより、（ｂ）のアンモニア処理バイオマスを破砕して、容易に糖化可能な前処理バイオマスを生産するステップと
を含む、容易に糖化可能なバイオマスを生産する方法であって、
前処理バイオマスが、無定形セルロース成分を含み、
前処理バイオマス中の無定形セルロース成分の割合が、無水アンモニアと接触させずに（ｃ）と同じレベルの機械的エネルギーで破砕した前処理バイオマス中の無定形セルロース成分の割合と比較して高い、方法を提供する。

【0012】

本発明の前処理バイオマスは、通常約０．１ｍｍより小さい粒度を有し、破砕前に無水アンモニアを用いた場合、バイオマスの破砕を実施するのに必要なエネルギーは、一般に４〜１０分の１となる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】様々な時間（０、２４、４８、７２時間）にわたり糖化したサンプル（１４％固形物負荷で）中のモノマーグルコース（Ｇ）及びキシロース（Ｘ）の理論収率（％）のグラフであって、（Ａ）には１ｍｍナイフミル粉砕した非処理のトウモロコシ穂軸について、また（Ｂ）には１ｍｍナイフミル粉砕した非処理の晩冬／早春収穫スイッチグラス（ｓｗｇ）について、直径１ｃｍイットリウム添加ＺｒＯ_２ビーズでバイオマスをミル粉砕した期間（０、１、２、３、６、１０日）について作成したグラフを示す。

【図1B】様々な時間（０、２４、４８、７２時間）にわたり糖化したサンプル（１４％固形物負荷で）中のモノマーグルコース（Ｇ）及びキシロース（Ｘ）の理論収率（％）のグラフであって、（Ａ）には１ｍｍナイフミル粉砕した非処理のトウモロコシ穂軸について、また（Ｂ）には１ｍｍナイフミル粉砕した非処理の晩冬／早春収穫スイッチグラス（ｓｗｇ）について、直径１ｃｍイットリウム添加ＺｒＯ_２ビーズでバイオマスをミル粉砕した期間（０、１、２、３、６、１０日）について作成したグラフを示す。

【図2A】様々な時間（０、２４、４８、７２、９６、１２０時間）にわたって糖化した、１ｍｍナイフミル粉砕した非処理の晩冬／早春収穫スイッチグラスサンプル（１４％固形物負荷）中のグルコース（Ｇ）（Ａ）及びキシロース（Ｘ）（Ｂ）の理論収率（％）のグラフであって、ビーズ２００ｇ：バイオマス５ｇの比で、０．２５”（０．６５３ｃｍ）ステンレス鋼ビーズでバイオマスをミル粉砕した時間（０、１、２、３、６、１０日）に対して作成したグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコースの、また（Ｂ）ではキシロースの合計可溶性糖（モノマー及びオリゴマー）収率である。

【図2B】様々な時間（０、２４、４８、７２、９６、１２０時間）にわたって糖化した、１ｍｍナイフミル粉砕した非処理の晩冬／早春収穫スイッチグラスサンプル（１４％固形物負荷）中のグルコース（Ｇ）（Ａ）及びキシロース（Ｘ）（Ｂ）の理論収率（％）のグラフであって、ビーズ２００ｇ：バイオマス５ｇの比で、０．２５”（０．６５３ｃｍ）ステンレス鋼ビーズでバイオマスをミル粉砕した時間（０、１、２、３、６、１０日）に対して作成したグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコースの、また（Ｂ）ではキシロースの合計可溶性糖（モノマー及びオリゴマー）収率である。

【図3A】バイオマスの粒子表面積（ｍ^２／ｇ）と比較した図２のスイッチグラスの糖化（１４％固形物負荷で）７２時間後のモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論収率（％）の、いずれもミル粉砕時間の関数としてのグラフを示す。

【図3B】バイオマスの粒子表面積（ｍ^２／ｇ）と比較した図２のスイッチグラスの糖化（１４％固形物負荷で）７２時間後のモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論収率（％）の、いずれもミル粉砕時間の関数としてのグラフを示す。

【図4A】バイオマスの無定形成分率（％）と比較した図２のスイッチグラスの糖化（１４％固形物負荷で）７２時間後のモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論収率（％）の、いずれもミル粉砕時間の関数としてのグラフを示す。

【図4B】バイオマスの無定形成分率（％）と比較した図２のスイッチグラスの糖化（１４％固形物負荷で）７２時間後のモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論収率（％）の、いずれもミル粉砕時間の関数としてのグラフを示す。

【図5A】１ｍｍナイフミル粉砕した非処理の秋収穫スイッチグラス（ＵＴ４）と、１０重量％無水アンモニアで１６０℃にて１時間処理した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラス（ＪＶ１９８）のモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。これらのサンプルは、図２と同様に様々な時間（０、１９、４３、６７時間）ミル粉砕した後、０、４、２４、４８、７２、又は９６時間にわたって糖化（１４％固形物負荷で）した。

【図5B】１ｍｍナイフミル粉砕した非処理の秋収穫スイッチグラス（ＵＴ４）と、１０重量％無水アンモニアで１６０℃にて１時間処理した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラス（ＪＶ１９８）のモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。これらのサンプルは、図２と同様に様々な時間（０、１９、４３、６７時間）ミル粉砕した後、０、４、２４、４８、７２、又は９６時間にわたって糖化（１４％固形物負荷で）した。

【図6】１）１ｍｍナイフミル粉砕した非処理の秋収穫スイッチグラス、２）１０重量％無水アンモニアで処理した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラス、及び３）２０重量％無水アンモニアで９日間処理した粗砕秋収穫スイッチグラスのモノマーグルコース（Ｇ）及びキシロース（Ｘ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。これらのサンプルは、図２と同様に様々な時間（０、１９、４３、６７時間）ミル粉砕した後、７２時間糖化（１４％固形物負荷で）した。

【図7A】１０重量％無水アンモニアで１６０℃にて１時間処理し、０．２５”（０．６３５ｃｍ）ステンレス鋼ビーズ（ビーズ４０ｌｂ：バイオマス５００ｇの比で）を用いて様々な時間（分）アトリターミル粉砕した後、７２時間糖化（１４％固形物負荷で）した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）を、処理サンプル中の無定形成分率（％）と比較したグラフを示す。

【図7B】１０重量％無水アンモニアで１６０℃にて１時間処理し、０．２５”（０．６３５ｃｍ）ステンレス鋼ビーズ（ビーズ４０ｌｂ：バイオマス５００ｇの比で）を用いて様々な時間（分）アトリターミル粉砕した後、７２時間糖化（１４％固形物負荷で）した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのモノマーグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）を、処理サンプル中の無定形成分率（％）と比較したグラフを示す。

【図8】１０重量％無水アンモニアで１６０℃にて１時間処理し、図７と同様に０．２５”（０．６３５ｃｍ）ステンレス鋼ビーズを用いて様々な時間（分）アトリターミル粉砕した後、７２時間糖化（１４％固形物負荷で）した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのモノマーグルコース（Ｇｌｕ）及びキシロース（Ｘｙｌ）の理論糖化収率（％）を、処理サンプルの粒度と比較したグラフを示す。

【図9A】２０重量％無水アンモニアで９日間室温（ＲＴ）にて処理し、様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで、ビーズ２００ｇ：バイオマス５ｇの割合で５時間ボールミル粉砕した後、１４％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスサンプルのグルコース（Ｇ）（Ａ）及びキシロース（Ｘ）（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図9B】２０重量％無水アンモニアで９日間室温（ＲＴ）にて処理し、様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで、ビーズ２００ｇ：バイオマス５ｇの割合で５時間ボールミル粉砕した後、１４％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスサンプルのグルコース（Ｇ）（Ａ）及びキシロース（Ｘ）（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図10A】１０重量％無水アンモニアで１時間１６０℃にて処理し、図９と同様に様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで５時間ボールミル粉砕した後、１４％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのグルコース（Ｇ）（Ａ）及びキシロース（Ｘ）（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図10B】１０重量％無水アンモニアで１時間１６０℃にて処理し、図９と同様に様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで５時間ボールミル粉砕した後、１４％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのグルコース（Ｇ）（Ａ）及びキシロース（Ｘ）（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図11A】２０重量％無水アンモニアで９日間室温にて前処理し、図９と同様に、様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで５時間ミル粉砕した後、２５％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図11B】２０重量％無水アンモニアで９日間室温にて前処理し、図９と同様に、様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで５時間ミル粉砕した後、２５％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図12A】１０重量％無水アンモニアで１時間１６０℃にて処理し、図９と同様に、様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで５時間ボールミル粉砕した後、２５％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図12B】１０重量％無水アンモニアで１時間１６０℃にて処理し、図９と同様に、様々なサイズ（０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ））のステンレス鋼ビーズで５時間ボールミル粉砕した後、２５％固形物負荷を用いて様々な時間（４、２４、４８、７２、１００、１２４時間）糖化した１ｍｍナイフミル粉砕秋収穫スイッチグラスのグルコース（Ａ）及びキシロース（Ｂ）の理論糖化収率（％）のグラフを示す。すべての棒は、各セットの最後の棒を除いてモノマー糖であり、最後の棒は、（Ａ）ではグルコース、また（Ｂ）ではキシロースの、糖化１２４時間後の合計可溶性糖収率（モノマー及びオリゴマー）である。

【図13】１０重量％無水アンモニアで１５０〜１６０℃にて１時間処理し、５分アトリターミル粉砕した後、２５％固形物負荷を用いて、様々な量の酵素で１２０時間糖化した、８％、１８％、又は２８％湿分含有の１ｍｍナイフミル粉砕スイッチグラスサンプル中の合計可溶性グルコース及びキシロースの理論収率（％）のグラフを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、糖化工程中に発酵性糖を生産するためのバイオマスを調製することを目的とするリグノセルロース系バイオマスの前処理に関する。バイオマスは、無水アンモニアによる事前処理、又は同時処理と共に、機械的破砕によって処理するが、無水アンモニア処理によって、容易に糖化可能なバイオマス産物を生産するのに必要なエネルギーの量が減少する。本明細書に開示するように処理したバイオマスから生産される糖は、所望の標的産物を生産するために、生体触媒を用いた発酵に使用する。

【0015】

本明細書及び特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語及び定義を用いるものとする。

【0016】

本明細書で用いる「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」、「有している」、「含有する」又は「含有している」、又はその他これらの変形は、非排他的な包含を意味するものとする。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、物品、又は装置は、必ずしもこれらの要素だけに限定されるわけではなく、明示的に挙げられていない他の要素、又はこうした組成物、混合物、工程、方法、物品、若しくは装置に固有の他の要素を含みうる。さらに、別途明示されていない限り、「又は」は、非排他的「又は」を指すのであって、排他的「又は」を指すのではない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれによっても満たされる、すなわち、Ａが真で（又は存在し）、Ｂは偽である（又は存在しない）、Ａが偽で（又は存在せず）、Ｂは真である（又は存在する）、ならびにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）。

【0017】

また、本発明の要素又は成分の前に置かれる不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、要素又は成分の例（すなわち、出現）の数に関して非限定的であるものとする。従って、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は少なくとも１つを含むと解釈すべきであり、単数形の要素又は成分も、その数が１であることが明らかに示されていない限り、複数も含む。

【0018】

本明細書で用いられる「発明」又は「本発明」という用語は、非限定的用語であり、特定の発明のいずれか１つの実施形態を指すのではなく、本明細書及び特許請求の範囲に記載されているすべての可能な実施形態を包含するものとする。

【0019】

本明細書で用いられるように、使用される本発明の成分又は反応体の量を加減する「約」と言う用語は、例えば、実際に濃縮物又は使用溶液（ｕｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調製するのに用いられる典型的測定手順及び液体取扱い手順により；これらの手順でのうっかりした誤りにより；組成物を調製するために、又は方法を実施するために使用した成分の製造、供給源、又は純度の相違などによって起こりうる数量的変動を指す。「約」と言う用語はまた、特定の初期混合物から得られた組成物について異なる平衡状態のために、相違する量も包含する。用語「約」によって変更される、されないにかかわらず、特許請求の範囲は、これら量の同等量を包含する。一実施形態では、「約」という用語は、記載される数値の１０％以内、好ましくは記載される数値の５％以内を意味する。

【0020】

「無水アンモニア」とは、乾燥して、水性媒体中にないアンモニアガスを意味する。

【0021】

温度に関して「室温」及び「周囲」は、温度に関して用いられる場合、約１５℃〜約２５℃の任意の温度を意味する。

【0022】

「発酵性糖」とは、標的産物を産生するために、発酵工程において微生物が炭素源として用いることができる単糖及びいくつかのオリゴ糖を主として含む糖分を指す。

【0023】

「モノマー糖」すなわち「単糖」は、単一のペントース又はヘキトース単位、例えば、グルコースから構成される。

【0024】

「リグノセルロース」とは、リグニンとセルロースの両方を含む材料を指す。リグノセルロース系材料は、ヘミセルロースも含みうる。

【0025】

「セルロース系材料」とは、セルロースを含む組成物を指す。

【0026】

「バイオマスの乾燥重量」とは、すべて又はほぼすべての水を除去したバイオマスの重量を指す。乾燥重量は、一般的に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （ＡＳＴＭ） Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅ１７５６−０１（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｓｏｌｉｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ）又はＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｃ．（ＴＡＰＰＩ） Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔ−４１２ ｏｍ−０２（Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｉｎ Ｐｕｌｐ，Ｐａｐｅｒ ａｎｄ Ｐａｐｅｒｂｏａｒｄ）に従って測定する。バイオマスの乾燥重量は、バイオマスの乾物含量と同義である。

【0027】

バイオマスに関して「実質的に乾燥した」とは、少なくとも約８５％の乾物含量、又は約１５％以下の湿分を有するバイオマスを指す。

【0028】

「バイオマス」及び「リグノセルロース系バイオマス」は、置換え可能に用いられ、任意のリグノセルロース系材料を指すが、このようなものとして、セルロース系及びヘミセルロース系材料、例えば、バイオエネルギー作物、農業残渣、一般廃棄物、産業廃棄物、庭塵芥、木材、林業廃棄物、及びこれらの組合せ、及び以下にさらに記載するものなどが含まれる。バイオマスは、多糖及びオリゴ糖を含む炭水化物分を有し、また、タンパク質及び／又は脂質などの別の成分も含みうる。

【0029】

「糖化」及び「糖化すること」とは、酸、塩基、又は加水分解酵素の作用による多糖からの発酵性糖の生産を指す。前処理バイオマスからの発酵性糖の生産は、セルロース分解及びヘミセルロース分解酵素の作用による酵素的糖化によって起こる。

【0030】

「多糖」とは、グリコシド結合によって結合された繰返し単位によって形成される任意のクラスの炭水化物、又はグリコシド結合によって連結された単糖の鎖から構成される複合炭水化物のどちらも包含する。多糖は、一般式Ｃ_ｘ（Ｈ_２Ｏ）_ｙを有する。

【0031】

本明細書で用いる「バイオマスを前処理すること」又は「バイオマス前処理」とは、天然のバイオマス又はプリプロセッシングしたバイオマスを化学的、物理的、又は生物学的作用、又はそれらの任意の組合せに付して、酵素糖化又は糖化前の他の加水分解の手段に対するバイオマスの感受性を高めることを指す。例えば、本明細書に記載する方法は、糖化のための加水分解酵素にバイオマスをより接近しやすくするのに寄与する前処理方法と言うことができる。

【0032】

本明細書で用いる「微粉砕された材料」とは、微粉化された材料を指し、その場合、粒度は０．１ｍｍより小さい。

【0033】

「機械的破砕手段」という用語は、微粉化をもたらすバイオマスの機械的粉砕のための技術を指す。典型的な機械的粉砕手段として、限定するものではないが、アトリターミル粉砕、ハンマーミル粉砕、ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、振動ボールミル粉砕、振動ロッドミル粉砕、ジェットミル粉砕、ピンミル粉砕、タービンミル粉砕、空気分級ミル粉砕、ロールミル粉砕及び遊星ボールミル粉砕が含まれる。

【0034】

「無定形成分」又は「無定形セルロース成分」という用語は、前処理バイオマスに関連して用いられる場合、主として、結晶度について広角Ｘ線回析測定によって決定されるバイオマスの非晶質セルロース画分を指す。

【0035】

本明細書で用いられる「粗砕された」とは、粒度が０．１ｍｍより大きい、粉砕された材料片又は粒子を指す。

【0036】

本明細書で用いられる「容易に糖化可能なバイオマス」とは、糖化において高い糖収率を生産するバイオマスを指す。糖化後少なくとも約７０％のグルコースの理論収率及び少なくとも約６０％のキシロースの理論収率、又はこれらを超える高い糖収率が、容易に糖化可能な前処理バイオマスを示している。

【0037】

「加水分解産物」とは、バイオマスに作用する加水分解反応（酵素的又は非酵素的のいずれか）の産物を含有するリグノセルロースと接触する液体を指し、この場合、モノマー糖及びオリゴマー糖である。

【0038】

「酵素コンソーシアム」又は「糖化酵素コンソーシアム」とは、微生物によって通常分泌される酵素の集合体であり、本発明の場合、１つ以上のセルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、リグニナーゼ及びフェルロイルエステラーゼを含む。

【0039】

本明細書で用いる「パウンディング」とは、力による衝撃を指す。

【0040】

「標的産物」という用語は、発酵において微生物生産宿主細胞により産生される任意の産物を指す。標的産物は、宿主細胞において遺伝子改変した酵素経路の結果であってもよいし、内生経路によって産生されるものであってもよい。典型的な標的産物としては、限定するものではないが、酸、アルコール、アルカン、アルケン、アロマティックス、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、及び医薬品などがある。

【0041】

リグノセルロース系バイオマス
本方法で用いられるバイオマスは、リグノセルロース系バイオマスであり、セルロース及びヘミセルロースのような多糖と、リグニンとを含有する。バイオマスの多糖は、グルカン及びキシランと呼ばれることもある。用いることができるバイオマスの種類として、限定するものではないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、一般廃棄物、産業廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭塵芥、木材及び林業廃棄物が含まれる。バイオマスの例として、限定するものではないが、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮、トウモロコシストーバー、イネ科牧草類、麦藁、大麦藁、エンバク藁、キャノーラ藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、ミスカンサス、索草、草ヨシ、古紙、サトウキビバガス、モロコシバガス又はストーバー、ダイズストーバー、穀粒のミル粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木及び灌木、野菜、果物、草花及び動物肥料などがある。バイオマスは、その他の作物残渣、林業廃棄物、例えば、アスペン材、他の硬木材、軟木材及びおがくず；ならびに使用後の古紙製品；ならびに繊維加工残渣、例えば、トウモロコシ繊維、ビートパルプ、パルプ工場繊維物及び廃棄物；さらにはその他の十分に豊富なリグノセルロース系材料も含みうる。

【0042】

本発明に特に有用なバイオマスとしては、比較的高い炭水化物含量を有し、比較的密度が高く、及び／又は回収、輸送、貯蔵及び／又は取扱いが比較的容易なバイオマスが含まれる。

【0043】

リグノセルロース系バイオマスは、単一の供給源由来のものでもよいし、バイオマスは、２つ以上の供給源由来の混合物を含んでもよく、例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシストーバーの混合物、又は茎若しくは幹と葉の混合物を含んでもよい。

【0044】

バイオマスは、その供給源から得られたものを直接用いてもよいし、何らかのプリプロセシングに付してもよく、例えば、機械的エネルギーをバイオマスに適用することによって、粒度又は湿分を低減することができる。得られる粒度が０．１ｍｍより大きい粗砕材料を生産する方法を用いて粉砕を実施してもよい。用いることができる方法としては、ナイフミル粉砕、クラッシング、シュレッディング、チョッピング、ディスクリリファイニング、及びハンマー粗砕が含まれる。このタイプの粉砕は、無水アンモニアを用いた処理前、処理中又は処理後に実施することができる。乾燥は、任意の常用手段により、例えば、乾燥オーブン、回転ドライヤー、フラッシュドライヤー、又は過熱蒸気ドライヤーを用いることにより実施してよい。さらに、以下に記載するように、約１５％より低い、好ましくは約７％〜１０％の所望のバイオマス湿分を達成する場合には、空気乾燥で十分となりうる。本方法で使用するために、バイオマスは、少なくとも約８５、９０又は９３重量％の乾物含量を有することが望ましい。

【0045】

バイオマス前処理
リグノセルロース系バイオマスは、通常、加水分解を目的として調製するために、糖化前に処理する。この前処理によって、糖化中の加水分解、すなわち糖の遊離が改善される。バイオマスの多糖からの糖遊離（主にグルコースおよびキシロース）は、物理的バリヤーと共に、糖化酵素の非生産的結合のための表面を形成するリグニンが存在するために困難である。さらに、セルロースミクロフィブリルの結晶性及び密な充填性も酵素の接近を制限する。

【0046】

糖化を改善するためのバイオマス前処理としてボールミル粉砕のみを用いて、酸性又は塩基性前処理化学薬品の使用を省くこともできる。しかし、ボールミル粉砕したバイオマスが糖化中に高い糖収率を生み出すためには、高エネルギー入力によるボールミル粉砕を施す必要がある。ボールミル粉砕が、糖化の際、高いモノマー糖収率を可能にするのには大きな機械的エネルギーが必要であるため、この前処理方法だけでは経済的ではない。例えば、ボールミル粉砕に用いられるエネルギーは、５日のミル粉砕後に、バイオマス試料に含まれるエネルギーを超える。

【0047】

本方法では、リグノセルロース系バイオマスを無水アンモニアと接触させた後、機械的破砕手段を用いた破砕に付すことにより、微粉砕材料を生産する。任意選択的に、機械的破砕と同時に、バイオマスを無水アンモニアと接触させてもよい。出願者らは、ボール又はアトリターミル粉砕を用いて、微粉砕材料を生産する前に、無水アンモニアでバイオマスを処理することにより、容易に糖化可能な前処理バイオマス産物を得るためのボールミル粉砕前処理に要する機械的エネルギー入力が大幅に削減されることをみいだした。容易に糖化可能なバイオマスは、糖化中に高い糖収率を生み出すバイオマスである。少なくとも約７０％のグルコースの理論収率及び少なくとも約６０％のキシロースの理論収率、又はこれらを超える高い糖収率が、容易に糖化可能なバイオマスを示すものである。

【0048】

無水アンモニア処理後に実施すると、糖化後に、無水アンモニア処理を行わずにミル粉砕したバイオマスの糖化から得られたものと同等量の糖を生産するために、微粉砕に必要な機械的エネルギーは、少なくとも約４分の１、さらには約６倍〜約１０分の１となりうる。機械的エネルギーの減少量は可変的で、様々な要因、例えば、バイオマスの種類、湿分、無水アンモニア処理の強度（濃度、温度、時間のような要因など）、及び機械的エネルギー適用方法の種類などに応じて変動する。機械的エネルギーの減少は、少なくとも約４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍又はそれ以上になりうる。

【0049】

一般に、バイオマスを破砕するのに必要な時間の量は、破砕工程を実施するのに要求されるエネルギーと相関しうる。例えば、秋に収穫したスイッチグラスは、トン当たり１８．５ギガジュール（ＧＪ／トン）のエネルギー容量を有することがわかっている。常用のボールミルを用いて本発明で実施される典型的ミル粉砕の実施では、９．２５ｘ１０^４ジュール（Ｊ）を含む約５グラムのバイオマスを使用する。このサンプルの場合、ミル粉砕を１０日かけて実施すると、約２．２ｘ１０^５Ｊ（粉砕材料に送り出されるエネルギー）が消費されることになる。従って、例えば、ミル粉砕を１９時間かけて行う場合には、１．７４ｘ１０^４Ｊが消費され、これは、バイオマスのエネルギー容量の１９％に相当する。同様に、ミル粉砕を５時間にわたり実施する場合には、４．５８ｘ１０^３Ｊ、すなわち、バイオマスのエネルギー容量の５％が消費される。また、アンモニア前処理の使用によって達成されるエネルギー減少の量も直接測定することができる。例えば、アトリターミルを用いて、ミル粉砕を行うことができる。このミルは、常用のボールミルの約６０倍の動力を送り出す。０．５ｋｇのバイオマスに対してアトリターミルを運転すると、モーターは、２．１４ＨＰ（１５９６Ｗ）をミルに送り出す。従って、５分間で、ミルは、バイオマスのエネルギー容量の５．１８％（１．５９６ｋＷｘ０．０８３３ｈ）／０．５ｋｇ＝０．２６６ｋＷ−ｈ／ｋｇ）を必要とする。

【0050】

バイオマスの機械的破砕は、結晶状態とは反対に、無定形状態のバイオマス中のセルロースの割合を高める。本明細書では、ミル粉砕時間が増加するに従い、バイオマスサンプル中の無定形成分の割合が高くなると共に、糖化による糖収率も上昇することが明らかにされた。本方法では、無水アンモニア処理を実施しない場合に必要になるエネルギーより低いエネルギーを用いて、バイオマス中の無定形セルロース成分の割合を高める。

【0051】

本方法では、リグノセルロース系バイオマスを無水アンモニアと接触させる。無水アンモニアとは、乾燥していて、かつ水性媒体中にないアンモニアガスを意味する。無水アンモニアは、バイオマスの乾燥重量に対して約２〜約３０重量％の濃度まで添加することができる。一実施形態では、無水アンモニアは、一般的に、バイオマスの乾燥重量に対して約１０〜約２５重量％である。バイオマスと無水アンモニアは、約０℃〜約２００℃の温度で維持することができる。必要とする前処理工程へのエネルギー入力が小さくなるため、室温〜約１６０℃の温度が望ましいこともある。無水アンモニア処理の時間は、約３０分〜約１０日、又は貯蔵状態で適用する場合にはこれより長く、１年以下でよい。より低い温度とより長い処理時間を組み合わせることもできる。また、より低い無水アンモニア濃度をより高い温度で用いてもよい。例えば、室温で２０％アンモニアにより９日、又は１６０℃で１０％アンモニアにより１時間バイオマスを処理すると、本明細書の実施例３で示すように、糖化においてほぼ同様の高い糖収率が得られた。キシロースの収率は、１６０℃での無水アンモニア処理による方がややよかった。当業者であれば、上記の範囲内で、使用した特定の系において本方法を用いて所望の結果をもたらすパラメーターの組合せを容易に決定することができるであろう。

【0052】

別の実施形態では、バイオマスを長期間、例えば、１年以下の間、貯蔵状態に維持しながらバイオマスと無水アンモニアとを接触させることができる。バイオマスは通常秋に収穫されうるが、これを貯蔵し、その一部を次の収穫までの期間にわたり用いることができる。貯蔵バイオマスを無水アンモニアと接触した状態に維持することにより、前述したように、バイオマスを処理して、要求されるミル粉砕時間を短縮することができると同時に、貯蔵中のバイオマスを保存する役割も果たすことができる。この実施形態では、一般的に、無水アンモニアによる処理は、自然温度で、すなわち温度を増減するエネルギーの入力なしで行われる。さらに、無水アンモニアの濃度は、概して、前述した低い範囲、例えば、バイオマスの乾燥重量に対して約２重量％〜１０重量％である。

【0053】

無水アンモニアの適用では、湿分が、無水アンモニア処理の利点を支持する範囲にあると同時に、機械的破砕のために湿分の低下を容易に可能にする範囲であることが好ましい。一実施形態では、無水アンモニア前処理の利点を最大限にすると同時に、アンモニア前処理後のアンモニアの蒸発分離時に、湿分を約１５％に、又は１５％以下に低下させるために、バイオマスの湿分は、約１５％〜約３０％、又は約１８％〜約２８％である。バイオマスが無水アンモニア処理前に乾燥しすぎていると、アンモニア前処理の効果が低下する可能性がある。無水アンモニア処理自体がバイオマスの乾燥に寄与する。バイオマスの長期貯蔵中に、湿分が低ければ、生分解が抑えられる。機械的破砕の前にバイオマス中の湿分をさらに減じるためには、バイオマスに接触させる前に無水アンモニアを加熱しても、無水アンモニアに過熱蒸気を同伴させてもよく、どちらもバイオマスを乾燥させることができる。

【0054】

バイオマスの微粉砕のための機械的エネルギーの適用前に、バイオマスは実質的に乾燥していることが好ましい。実質的に乾燥しているバイオマスは、約１５％以下の湿分を有する。約７％〜約１０％の湿分が、振動特殊ロッドミル（Ｋａｂｅｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｓｈｉｋｏｋｕ Ｋｏｇｙｏ Ｇｉｊｕｔｓｕ Ｓｈｉｋｅｎｓｈｏ Ｋｅｎｋｙｕ Ｈｏｋｏｋｕ ２４：４２−９０）による摩砕に最適であることがわかっており、本方法においても望ましい。乾燥は、本方法にかかるコストに有意に寄与するため、無水アンモニア処理を使用する利点は、無水アンモニア処理後、さらに乾燥する必要性が低減又は排除されることにある。

【0055】

しかし、無水アンモニア処理後に、さらに乾燥が所望される場合には、バイオマスを少なくとも約８０％の乾物含量に達するまで乾燥させてもよい。好ましくは、乾物含量は、以下に記載するように、機械的エネルギーの適用中、少なくとも約８５％、９０％、９３％、９６％、又はそれ以上である。乾燥は、任意の常用手段によって、例えば、乾燥オーブン、回転乾燥機、フラッシュ乾燥機、又は過熱蒸気乾燥機、又は空気乾燥を用いて実施してよい。

【0056】

本方法では、機械的エネルギーは、無水アンモニア処理したバイオマスに、又はバイオマスの無水アンモニア処理中に適用して、微粉砕無水アンモニア処理バイオマスを生産する。微粉砕材料は、バイオマスにパウンディング、クラッシング、せん断、又は摩砕などの力を加えるミル粉砕によって生産することができる。一般的には、上記の力の２種以上の組合せを、パウンディング、クラッシング、せん断、又は摩砕などのミル粉砕処理において適用する。バイオマスを機械的に破砕する任意の手段を本発明において用いることができ、そのような手段として、限定するものではないが、アトリターミル粉砕、ハンマーミル粉砕、ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、振動ボールミル粉砕、振動ロッドミル粉砕、ジェットミル粉砕、ピンミル粉砕、タービンミル粉砕、空気分級ミル粉砕、ロールミル粉砕及び遊星ボールミル粉砕がある。微粉砕に用いる場合には、ハンマーミル粉砕は、空気分級ミル粉砕の一成分であり、その際、より大きな粒子は、それらが指定粒径でミルから出るのに十分小さくなるまで、循環させてハンマーミルを繰り返し通過させる。

【0057】

常用のボールミル粉砕では、大きな回転シリンダーが、その内部に密に詰まった球体のボール（ビーズとも呼ばれる）を含んでおり、それらが、シリンダーの回転時に力で材料に衝撃を与える（すなわち、パウンディングする）ことにより材料を摩砕する。アリターミル粉砕では、固定シリンダー内の球体ビーズ（ボールとも呼ばれる）が、アームが直角に取り付けられた旋回軸によって撹拌される。ミル粉砕のためのビーズ、又はボールは、キュービックジルコニアビーズ又はステンレス鋼ビーズなどの任意の種類の密な球体ビーズであってよい。用いられるビーズのサイズは、それらが用いられる特定の装置、及び処理しようとする具体的バイオマスなどの条件（バイオマスの種類及び初期粒径、ならびにバイオマスに適用される具体的無水アンモニア処理を含む）に応じて変動しうる。ボールは、例えば、０．３１７５ｃｍ、０．４７１ｃｍ、０．５５６ｃｍ、０．６３５ｃｍ、０．７９４ｃｍ、０．９５３ｃｍ、又はそれ以上であってよい。直径が０．３１７５ｃｍより大きいボール又はビーズは、より効果的なミル粉砕を達成しうる。特定のバイオマス及び処理パラメーターのセットについて最も効果的なボールのサイズは、当業者によって容易に決定することができる。

【0058】

事前又は同時に行う無水アンモニア処理と共に、機械的破砕は、約数秒から約数日までの期間にわたって行うことができる。例えば、破砕は、約２日より短い時間、又は約１日より短い時間実施してもよい。さらに、約６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、又は１分以下の時間を用いてもよい。短い適用時間を用いて、エネルギーコストを削減することも可能であるが、糖化中に最大限の糖収率を達成することはできない。例えば、５又は１０分のミル粉砕時間では、商業的に許容可能なレベルの糖を生産することができるが、これより長いミル粉砕時間で達成されるものほど高くはない。ミル粉砕のエネルギーコストと糖収率のバランスを調節して、最大限の商業価値を支持することができる。

【0059】

機械的破砕手段は、バッチ法、又は連続法のいずれで適用してもよい。

【0060】

前処理バイオマス産物
本方法によって得られる前処理バイオマス産物は、容易に糖化が可能であり、これを糖化して発酵性糖を生産するが、これらの糖は、生体触媒による発酵に用いることによって、所望の標的産物を生産することができる。酵素糖化は、一般的に、セルロース及びヘミセルロースを分解するための酵素コンソーシアムを利用して、グルコース、キシロース、及びアラビノースなどの糖を含む加水分解産物を生産する。糖化酵素については、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）を参照されたい。

【0061】

少なくとも１つの酵素が用いられ、一般的には、１つ以上のグリコシダーゼを含む糖化酵素コンソーシアムを用いる。グリコシダーゼは、二糖、オリゴ糖、及び多糖のエーテル結合を加水分解するが、これは、一般群「加水分解酵素」（ＥＣ３．）の酵素分類ＥＣ ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ｗｉｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １（１９９３），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２（１９９４），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３（１９９５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４（１９９７）及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５［それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；及びＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０ １９９９］）にみいだされる。本方法に有用なグリコシダーゼは、それらが加水分解するバイオマス成分によって分類することができる。本方法に有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒロドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、及びデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）などが含まれる。さらに、バイオマスの他の成分からの多糖の遊離を助けるために、糖化酵素コンソーシアムに他の活性、例えば、ペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ ３．１．１．ｘ及び３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ １．１１．１．ｘ）、及びフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．７３）を追加すれば有用となりうる。当分野では、多糖加水分解酵素を産生する微生物が、往々にして、様々な基質特異性を有する数種の酵素又は１群の酵素によって触媒される活性（例えば、セルロース分解）を発揮することは公知である。従って、微生物由来の「セルラーゼ」は、１群の酵素を含むこともあり、そのすべてがセルロース分解活性に寄与しうる。市販の又は市販されていない酵素調製物（例えば、セルローラーゼ）は、この酵素を得るのに使用される精製計画に応じて多数の酵素を含む可能性がある。

【0062】

糖化酵素は、市販のものを得ることができ、例えば、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ｘｙｌａｎａｓｅ、Ａｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）がある。さらに、糖化酵素は、未精製であってもよく、細胞抽出物のタイプ又は全細胞溶解物として提供されうる。酵素は、多数の糖化酵素を発現するように改変された組換え微生物を用いて生産することもできる。

【0063】

本発明において特に価値があるのは、グリコシドヒドロラーゼ、例えば、ファミリーＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ４３、ＧＨ５５、ＧＨ１０、及びＧＨ１１である。ＧＨは、２つ以上の炭水化物同士、又は炭水化物と非炭水化物部分同士のグリコシド結合を加水分解する酵素群である。ＧＨのファミリーは、配列類似性に基づいて分類されており、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ（ＣＡＺｙ） ｄａｔａｂａｓｅ（Ｃａｎｔａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３３−２３８）で入手可能である。これらの酵素は、いくつかの基質に作用することができ、糖化工程に有効である。グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）酵素は、いくつかの周知の活性：β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；及びβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２３）を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）又はβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素は、以下の活性を有する：Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）；エンドアラビナナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９９）；及びガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．１４５）。グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．５５）又はエンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー１０（「ＧＨ１０」）については、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：２４０３−２４１２及びＬｏ Ｌｅｇｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５０９：３０３−３０８）に、より詳細に記載されており、また、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１（「ＧＨ１１」）については、Ｈａｋｏｕｖａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９６１７−２４に、より詳細に記載されている。

【0064】

発酵前に、例えば、蒸発により糖化混合物を濃縮させて、発酵性糖の濃度を高めてもよい。任意で、糖化産物中の液体をバッチ法又は連続法で固形物から分離してもよい。任意で、液体又は全糖化産物を発酵前に滅菌してもよい。発酵中に用いる生体触媒及び糖化中に用いるｐＨに応じて、ｐＨは発酵に適したものに調節することができる。

【0065】

糖化は、約数分〜約２００時間、一般的には約２４時間〜約７２時間の時間にわたって実施することができる。反応の時間は、酵素濃度及び具体的活性、ならびに用いられる基質及び環境条件、例えば、温度及びｐＨによって異なる。当業者であれば、特定の基質及び糖化酵素コンソーシアムと共に用いるべき温度、ｐＨ及び時間の最適な条件を容易に決定することができる。

【0066】

糖化は、単一バッチ、流加回分、又は連続工程で実施することができる。糖化はまた、１ステップ、又は複数のステップで実施することもできる。例えば、糖化に必要な様々な酵素が、様々なｐＨ又は温度最適値を呈示しうる。１つの温度及びｐＨで酵素を用いて、一次処理を実施した後、別の酵素を用いて、異なる温度及び／又はｐＨで二次又は三次（又はそれ以上の）処理を実施することができる。さらに、連続したステップで異なる酵素での処理を同じｐＨ及び／又は温度、又は異なるｐＨ及び温度で実施してもよく、例えば、より高いｐＨ及び温度で安定した、及びより活性のヘミセルロースを用いた後、より低いｐＨ及び温度で活性のセルラーゼを用いて行うことができる。

【0067】

糖化工程における固形分（％）は変動しうる。糖化に用いられる固形分（％）は、高濃度の発酵性糖を含む加水分解産物を得るために比較的高く維持するのが望ましい。一般的に、固形分は、約１０％〜６０％であり、約１０％〜２５％であるのがより一般的である。

【0068】

糖化後にバイオマスから得られる糖の可溶化度は、単糖及びオリゴ糖の遊離を測定することによりモニターすることができる。単糖及びオリゴ糖を測定する方法は、当分野では公知である。モノマー糖以外にも、可溶性オリゴマー糖が生産され、これは、発酵における生体触媒による使用のためにモノマーに転換することができる。

【0069】

発酵性糖を含有するバイオマス加水分解産物は、一般的に培地の一部（％）として発酵培地中に含まれており、生体触媒増殖及び産物生産のための炭素源の全部又は一部を提供する。発酵培地中の加水分解産物は、通常発酵培地の約４０％〜９０％である。発酵培地の４０％又は８０％として用いられる加水分解産物の例が、米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書の実施例９に記載されている（この文献は、本明細書に参照により組み込まれる）。加水分解産物中の発酵性糖濃度に応じて、追加の糖を培地に添加してもよい。例えば、約８０ｇ／Ｌのグルコースと約５０ｇ／Ｌのキシロースを含有する加水分解産物が、発酵培地の４０％の割合で含まれている場合には、追加のグルコース及びキシロースを所望の最終濃度まで添加することができる。当業者には公知のように、加水分解産物のほかにも、発酵培地は、産物生産のために用いようとする具体的生体触媒による増殖及び生産に必要な他の栄養素、塩類及び因子を含有してもよい。補足物には、例えば、酵母エキス、特異的アミノ酸、リン酸塩、窒素源、塩類、及び微量元素が含まれる。また、特定の生体触媒によって作られる特定の産物の生産に必要な成分も含まれてもよく、このようなものとして、例えば、酵素触媒反応に必要なプラスミド又は補因子を維持するための抗生物質がある。

【0070】

加水分解産物を調製する代わりに、これを発酵培地に添加した後、発酵を実施して、同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）方法を用いることにより、バイオマス加水分解産物発酵ブロスを生産することもできる。この方法では、生産用生体触媒によって糖が代謝されるため、糖はバイオマスから生産される。

【0071】

生体触媒発酵及び標的産物
発酵培地中の発酵性糖は、好適な生体触媒によって代謝されて、標的産物が生産される。発酵工程で糖を生体触媒と接触させるが、この工程では、生体触媒によって作られる標的産物が生産される条件下で生体触媒を増殖させる。使用中の特定の生体触媒に有用な条件に応じて、温度及び／又は頭隙ガスを発酵のために調節いてもよい。発酵は、好気的又は嫌気的のいずれでもよい。上記及びその他の条件（温度及びｐＨなど）は、用いる特定の生体触媒に応じて調節する。

【0072】

生体触媒によって産生される標的産物の例として、１，３−プロパンジオール、ブタノール（イソブタノール、２−ブタノール、及び１−ブタノール）、及びエタノールがある。米国特許第７５０４２５０号明細書には、１，３−プロパンジオールを生産する組換え微生物が開示されている。遺伝子改変酵母によるブタノールの生産は、例えば、米国特許出願公開第２００７００９２９５７ Ａ１号明細書に開示されている。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子改変株も、エタノール生産のための生体触媒として用いられている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，（２００２） Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６２６３−６２７２）。エタノールは、リグノセルロース系バイオマス加水分解産物発酵培地中で、遺伝子改変ザイモモナスによって生産されている（米国特許出願公開第２００７００３１９１８ Ａ１号明細書）。エタノールの生産が改善されたザイモモナス・モビリスの遺伝子改変株について、米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１ Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２４６８４６ Ａ１号明細書に記載されている。

【実施例】

【0073】

以下の略語を使用する、すなわち、
「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィー、「Ｃ」は摂氏度、「ｍ」はメートル、「ｍｍ」はミリメートル、「μｍ」マイクロメートル、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリミットル、「Ｌ」はリットル、「Ｎ」は正常、「ｍｉｎ」は分、「ｍＭ」はミリモル、「ｃｍ」はセンチメートル、「ｇ」はグラム、「ｍｇ」はミリグラム、「ｋｇ」はキログラム、「ｗｔ」は重量、「ｈ」又は「ｈｒ」は時間、「ｄ」は日、「ＲＴ」は室温、「ＤＭ」は乾物、「ＤＷＢ」はバイオマスの乾燥重量、「ＡＳＭＥ」はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ、「ｓ．ｓ」はステンレス鋼、「ｉｎ又は「”」はインチ、「ｒｐｍ」は回毎分、「ＯＤ」は光学濃度、「ｒ」は半径、「ｄ_５０」はサンプルの平均粒度である。

【0074】

一般的方法
バイオマスの特性決定
バイオマスの乾物含量を、１０５℃で動作するＤｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＩＲ−１２０ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、又は窒素放出しながら（約１２水銀柱インチに相当する）真空オーブン中において１０２℃で一晩加熱することにより、決定した。

【0075】

バイオマスの組成を当該技術分野で周知の標準的方法のいずれか１つ、例えば、ＡＳＴＭ Ｅ１７５８−０１ 「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｂｙ ＨＰＬＣ」によって測定する。

【0076】

アンモニア処理システム（Ｐ５Ｌ反応器）
反応器の上部に１．５”（３．８ｃｍ）玉弁（これはバイオマスを充填するために取り外すことができる）を含むように改変された５Ｌ水平式円筒形圧力容器（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ Ｄａｙ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＫＹ）から構成されるシステムを用いて、アンモニア処理実験を実施した。反応器は、頭隙にある２つのポート、底部の１．５”玉弁、各種サーモカップル、逃がし弁、圧力計、及び圧力変換器を備えている。反応器は、いわゆる「熱伝達」式インペラーを含み、これは、鉛直方向及び水平方向に固形分を混合するための４つの羽根を備えている。インペラーは、すべての実験について約４０ｒｐｍで回転させた。

【0077】

２ｌｂシリンダーの無水アンモニアを電子秤に載せ、シリンダーの減量分を測定して、反応器中の乾物当たりのアンモニアの目標量を得ることにより、無水アンモニアを計量してＰ５Ｌ反応器に導入する。

【0078】

上部フランジに連結するニードル弁を用いて、圧力フラッシュ（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｌａｓｈ）及び真空フラッシュ（ｖａｃｕｕｍ ｆｌａｓｈ）を制御した。フラッシュ蒸気（ｆｌａｓｈ ｖａｐｏｒｓ）は、構内冷水を用いた二重管式熱交換器を通過させた。次いで、蒸気／凝縮液を、ウェットアイス（ｗｅｔ ｉｃｅ）で被覆された２Ｌ円筒形容器内に回収した。圧力フラッシュ前に、２Ｌシリンダーから非凝縮物を排出した。続いて真空を破壊した後、凝縮液を回収した。次に、同じシステムを用いて、真空フラッシュ凝縮液を回収した。

【0079】

酵素供給源
Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ｘｙｌａｎａｓｅ、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００は、Ｄａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）製である。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（２８８０ Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製である。

【0080】

実施例１（比較）
単一前処理としてのトウモロコシ穂軸又はスイッチグラスのボールミル粉砕
糖化のためのトウモロコシ穂軸及び晩冬／早春収穫スイッチグラスリグノセルロース系バイオマスを調製するために、ボールミル粉砕を非化学的手段として試験した。５グラムのナイフミル粉砕（１ｍｍ篩を通過させた）穂軸（９４％ＤＭ）及びスイッチグラス（９４％ＤＭ）を各々、２２６ｇの１ｃｍサイズＹ_２Ｏ_３添加ＺｒＯ_２ビーズ（ｃｕｂｉｃ Ｚｉｒｃｏｎｉａ ｂｅａｄｓ；Ｎｏｒｓｔｏｎｅ；Ｗｙｎｃｏｔｅ，ＰＡ）を含む１２５ｍＬプラスチックボトルに入れた。ボトルを室温で１〜１０日にわたり毎分８３サイクルの速度で回転させた。アリコートを定間隔で採取し、酵素糖化に用いた。１４％固形分懸濁液の約３７０μＬの懸濁液を、Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰ：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ｘｙｌａｎａｓｅ：Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８を固形分１ｇ当たり６．６８：３．３４：１．６７ｍｇで含む５０ｍＭ ＮａＣｉｔｒａｔｅ中で、ｐＨ４．７〜４．８及び４７℃にて、２つの５ｍｍガラスビーズを含む６ｍＬガラス容器中で、回転式振盪機を２５０ｒｐｍで用いて糖化した。アリコートを定間隔で採取し、０．６ｍＬ／分の流量で移動相として０．０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４により６０℃でＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ）ランを用いて、ＨＰＬＣ分析に供した。様々な時間（０、２４、４８、７２時間）にわたり糖化すると共に、様々な時間（０、１、２、３、６、１０日）にわたってミル粉砕したサンプル中のグルコース及びキシロースの理論収率（％）を図１にトウモロコシ穂軸（Ａ）及びスイッチグラス（Ｂ）について示す。

【0081】

Ｙ_２Ｏ_３添加ＺｒＯ_２ビーズを用いたミル粉砕は、追加の化学前処理又はリグニン除去を施していないこれらの供給原料の糖化に大きな影響を与えた。穂軸及びスイッチグラスの収率のいずれについても、ミル粉砕の時間が増加するほど、グルコース及びキシロースの収率も増大した。３日のミル粉砕による収率は穂軸よりスイッチグラスの方が低かった。７２時間の糖化で、ミル粉砕６日後は、穂軸及びスイッチグラスのいずれについても、グルコースは約６５％に、キシロースは約４０％に達した。ミル粉砕１０日後、穂軸の収率はやや増加し、スイッチグラスの収率は、グルコース約７０％及びキシロース約４５％に達した。

【0082】

実施例２（比較）
糖化収率はボールミル粉砕後のスイッチグラスバイオマスの無定形構造と相関する
ステンレス鋼は、ＺｒＯ_２より高い密度（ぞれぞれ、７．７ｇ／ｃｍ^３及び６．０ｇ／ｃｍ^３）を有するため、ステンレス鋼ビーズを、代わりのミル粉砕物として使用した。

【0083】

５グラムのナイフミル粉砕（１ｍｍ篩を通過させた）晩冬／早春収穫スッチグラス（９１．３％ＤＭ）を、２００ｇのステンレス鋼１／４”（０．６３ｃｍ）ビーズを含む１２５ｍＬプラスチックボトルに入れた。１〜１０日のミル粉砕の間、これらのボトルを室温で毎分８３サイクルの速度で回転させた。アリコートを定間隔で採取し、酵素糖化、粒度決定、表面積測定及び結晶度についての広角Ｘ線回析に用いた。グルカン１ｇ当たり２５ｍｇのＡｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）と、キシラン１ｇ当たり１６．６ｍｇのヘミセルロース（Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄ）のカクテルとを用いて、１４％の固形物負荷で、ｐＨ４．９の５０ｍＭ ＮａＣｉｔｒａｔｅ中で、酵素糖化を実施した。約３７０μＬの懸濁液を、２つの５ｍｍガラスビーズを含む６ｍＬガラス容器中で、回転式振盪機を２５０ｒｐｍで用い、４７℃で糖化した。アリコートを定間隔で採取し、実施例１と同様にＨＰＬＣ分析に供した。

【0084】

図２は、様々なミル粉砕及び糖化時間で得られたモノマーグルコース及びモノマーキシロースの収率（それぞれ図２Ａ及びＢ）を示す。また、それぞれのミル粉砕時間について、糖化１２０時間後にろ過により不溶性バイオマスを除去し、次いで４％Ｈ_２ＳＯ_４の存在下にて１時間１２１℃に加熱した後、ＨＰＬＣ糖分析を実施することにより決定された合計可溶化糖（モノマーグルコース及びオリゴマーグルコースならびにモノマーキシロース及びオリゴマーキシロース）も示す。

【0085】

グルコース及びキシロースの収率は、ミル粉砕時間の増加と共に増大したが、これは、いずれの糖についても最初の６日間のミル粉砕についてのシグモイド様動力学を示している（それぞれ図３Ａ及びＢ）。シグモイド（Ｓ字）形状は、バイオマスがだんだんフラグメント化されるにつれ、バイオマスの破砕増大に要求されるエネルギーの低下を表していると思われる。粒子の表面積（図３Ａ及びＢ）を、Ｎ_２ガス吸着を用いて測定した。表面積は、０から３〜４日のミル粉砕で増加し、その後減少したが、これは、それ以上のミル粉砕で一部の構造要素が崩壊したためと考えられる。驚くことに、糖化収率は、ミル粉砕の初期段階を除いて、粒子表面積のあとをたどらないが、これは、糖化の速度及び収率を決定する要因が表面積以外にもあることを示している。もう１つの寄与要因は、セルロース結晶度の低下であろう。バイオマスの結晶度は、ミル粉砕時間の関数として広角ｘ線散乱を用いて評価し、グルコース及びキシロース収率と共にグラフ化した（それぞれ図４Ａ及びＢ）。結晶度データも表２に数値として示す。糖化収率は、バイオマス中の無定形成分率（％）に接近してこれをたどるが、これは、結晶度又は結晶度に関する要因（例えば、重合度）が、糖化酵素への多糖の接近性増大に寄与することを示している。

【0086】

図１及び２の比較から、ボールミル粉砕１０日後、糖化収率は、１ｃｍＹ_２Ｏ_３添加ＺｒＯ_２ビーズより１／４”ステンレス鋼ビーズを用いた方が高いことがわかる。

【0087】

スイッチグラスの鋼ボールミル粉砕は、酵素糖化を大きく加速し（４時間で得られた最終収率≧５０％）、グルコースは＞８０％、キシロースは約６０％という最終収率のモノマー糖を生産した。

【0088】

【表1】

【0089】

実施例３
無水アンモニア及びボールミル粉砕による処理の効果
秋に収穫したスイッチグラス（９２．５％ＤＭ）を非処理のまま（ＵＴ４ｕｎ）か、又はバイオマスの２０乾燥重量％の無水アンモニアで室温（ＲＴ）にて９日間処理するか、又はバイオマスの１０乾燥重量％の無水アンモニアで１６０℃にて１時間処理した（ＪＶ１９８）。１６０℃処理の場合、スイッチグラスを一般的方法に記載したＰ５Ｌ反応器に装入してから、反応器のジャケットを加熱した。無水アンモニアのシリンダーからアンモニアを添加した。

【0090】

ＲＴ処理バイオマスは、アンモニア処理後、１ｍｍ篩によりナイフミル粉砕したのに対し、１６０℃処理バイオマスは、１ｍｍ篩によりナイフミル粉砕した後、アンモニア処理に付した。アンモニアを蒸発分離させた後、実施例２に記載したように、１／４インチ（０．６３５ｃｍ）ステンレス鋼ビーズを用いて０、１９、４３及び６７時間サンプルをミル粉砕した。次に、実施例２に記載したのと同じ条件を用いて、バイオマスを糖化した。実施例１と同様に糖収率をアッセイした。

【0091】

様々な時間ボールミル粉砕を行うと共に、バイオマスの１０重量％の無水アンモニアで１６０℃にて１時間処理したサンプル（ＪＶ１９８）について、様々な時間糖化した後のグルコース及びキシロース収率を図５Ａ及びＢにそれぞれ示す。また、ボールミル粉砕したが、無水アンモニアで処理していない非処理対照（ＵＴ４ｕｎ）についての収率も示す。結果から、各ボールミル粉砕時点で、無水アンモニアとボールミル粉砕を組み合わせた方が、ミル粉砕単独の場合より高いグルコース及びキシロース収率が達成されたことがわかる。糖化収率の増加は、キシロースが特に高く、これは１９時間ミル粉砕したサンプルでは２倍以上増加した。

【0092】

バイオマスの２０重量％無水アンモニアで室温にて９日間処理したサンプルでも同様の結果が得られた。無水アンモニア処理と、ボールミル粉砕のみの（非処理）の両方の対照について７２時間糖化を実施して得られた結果を、ボールミル粉砕時間に対する理論モノマー糖化収率（％）の指数関数グラフとして図６に示す。表３に、図６の曲線の指数関数あてはめ（ｆｉｔｓ）から導いた増加時間の計算結果を示す。増加曲線を単一の指数関数にあてはめた。増加時間（τ）は、指数関数的増加の１／ｅ（ここで、ｅ＝緩和時間の２．７１８３，６３％）値まで到達するのにかかる時間である。結果から、いずれのアンモニア前処理についても、ミル粉砕時間による糖化収率の増加速度は、非処理サンプルより６〜１０倍速いことがわかる。

【0093】

【表2】

【0094】

実施例４
無水アンモニア処理し、かつアトリターミル粉砕したスイッチグラスの、粒度及び無定形成分についての糖化の比較
５００グラムのナイフミル粉砕（１ｍｍ篩を通過させた）秋収穫スイッチグラスを実施例５と同様に１６０℃で１時間無水アンモニア処理した。次いで、スイッチグラスのサンプルを、Ｕｎｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＳＤ−１ ａｔｔｒｉｔｏｒ ｍｉｌｌにより、４０ｌｂの１／４”ステンレス鋼ビーズを用いて５１６ｒｐｍで０〜６０分アトリターミル粉砕した。広角ｘ線散乱を用いて、各サンプルを結晶度分析に付した。表４は、サンプルの各々についての回析パターンから導かれた無定形成分率（％）と、ｄ_５０粒度（ミクロン）を示す。粒度は、ミル粉砕２０分後に最小値に達し、その後、非処理スイッチグラスの粒子表面積について早期に観測されたように、ミル粉砕時間と共に増大したが、無定形成分率（％）は増加し続けた。サンプルを実施例２と同様に糖化し、実施例１と同様に糖収率をアッセイした。図７Ａ及びＢは、無定形成分率（％）と、７２時間糖化後の理論収率（％）との比較を示す。グルコースについての糖化収率（図７Ａ）は、無水アンモニア前処理せずにミル粉砕したスイッチグラスについて既に見られた（実施例２）ように、無定形成分率（％）にかなり接近してこれをたどり、いずれの場合も緩いシグモイド形状を呈している。キシロース糖化収率（図７Ｂ）は、無定形成分率（％）より幾分指数関数的である。

【0095】

糖化収率は、初め、粒度の減少と共に収率が増加することから、初期には粒度との逆相関を示し（図８）、その後の段階では、粒度の増加と共に収率も増加し続けた。

【0096】

【表3】

【0097】

実施例５
無水アンモニアでの前処理及び５時間のボールミル粉砕を実施したバイオマスからの糖収率に対する、糖化工程でのミル粉砕ビーズのサイズ及び固形物負荷の作用
実施例３で用いたのと同じバッチから秋収穫スイッチグラスを、実施例３に記載したように、ＲＴ又は１６０℃にて無水アンモニアで処理した。処理済バイオマスを、以下のサイズ：１／８すなわち０．１２５”（０．３１７５ｃｍ）、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）、 ７／３２すなわち０．２１８８”（０．５５６ｃｍ）、１／４すなわち０．２５０”（０．６３５ｃｍ）、５／１６すなわち０．３１２５”（０．７９４ｃｍ）及び３／８すなわち０．３７５”（０．９５３ｃｍ）のステンレス鋼ビーズで５時間ボールミル粉砕した。５グラムのバイオマスを１２５ｍＬプラスチックボトルにおいて２００ｇのステンレス鋼ビーズで８３ｒｐｍにて５時間ミル粉砕した。ミル粉砕後、糖化中の固形物負荷が１４％（図９、１０）又は２５％（図１１、１２）のいずれかである以外は、サンプルを実施例２と同様に単一バッチ方式で糖化した。サンプルを実施例１と同様にグルコース及びキシロースについて分析した。さらに、１２４時間の糖化後、サンプルをろ過（０．２μｍ）して、固形分を除去し、ろ過物を４％Ｈ_２ＳＯ_４の存在下で、１２１℃で１時間加熱した。グルコースの対照サンプルを用いて、加熱中のいずれかの糖分解について補正し、合計可溶性糖含量を実施例２と同様に決定した。

【0098】

用いたミル粉砕条件下で、直径０．１８５５”〜０．２５０”（０．４７１ｃｍ〜０．６２３ｃｍ）のビーズが、１６０℃で無水アンモニア処理したスイッチグラスに最高収率をもたらしたのに対し、０．１８５５”（０．４７１ｃｍ）〜０．３７５”（０．９５３ｃｍ）ビーズは、ＲＴで無水アンモニア処理したスイッチグラスにやや有利に働いたようであった。

【0099】

一般に、収率は、２５％固形物負荷より１４％固形物負荷の方が高かった。一般に、１６０℃アンモニア処理スイッチグラスは、ＲＴ処理スイッチグラスよりやや高い収率を有した（特にキシロース）。糖化終了時の酸加水分解によって、有意な量の可溶性オリゴマー糖の存在が示されたが、これは、モノマーに転換される可能性があり、発酵に用いられる。

【0100】

実施例６
アトリターミル粉砕前の無水アンモニア処理の効果に対するバイオマス湿分の影響
１ｍｍナイフミル粉砕スイッチグラスのサンプルの湿分を８％（９２％ＤＭ）、１８％（８２％ＤＭ）、又は２８％（７２％ＤＭ）湿分に調節した後、サンプルを１０％無水アンモニア処理に１５０〜１６０℃で１時間付した。サンプルは、無水アンモニア処理の終了時にアンモニアの蒸発分離後、それぞれ約９８％、９７％及び９６％の乾物含量を有した。サンプルを実施例４のＵｎｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｔｔｒｉｔｏｒ ｍｉｌｌで、ほぼ５分間アトリターミル粉砕した。次に、グルカン＋キシラン１ｇ当たり７ｍｇ、１４ｍｇ及び２８ｍｇグルカナーゼ＋キシラナーゼの酵素負荷、２５％の固形物負荷で、４７℃で１２０時間サンプルを糖化した。合計可溶性グルコース及びシロース（モノマー及びオリボマーを含む）の収率を図１３に示す。７ｍｇ及び１４ｍｇの酵素負荷は、８％湿分とは対照的に、１８％湿分でアンモニア処理したサンプルについては、それぞれ１２％及び１１％の可溶化キシロース収率の絶対増加を示した。可溶化グルコース収率の絶対増加は、同じサンプルについて５．５％及び８％であった。１８％及び２８％湿分サンプルは、グルコース及びキシロースについて同様の糖化収率をもたらした。従って、無水アンモニア処理に付すのに少なくとも１８％の湿分を有することには極めて大きな利点がある。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】