特許 5908972 新規な抗原結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5908972

(24)【登録日】2016年4月1日

(45)【発行日】2016年4月26日

(54)【発明の名称】新規な抗原結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20160412BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160412BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160412BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160412BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20160412BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28

   C12N15/00 AZNA

   A61K39/395 M

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   !C12P21/08

【請求項の数】7

【全頁数】65

(21)【出願番号】特願2014-504022(P2014-504022)

(86)(22)【出願日】2012年4月6日

(65)【公表番号】特表2014-516250(P2014-516250A)

(43)【公表日】2014年7月10日

(86)【国際出願番号】US2012032519

(87)【国際公開番号】WO2012138997

(87)【国際公開日】20121011

【審査請求日】2014年4月7日

(31)【優先権主張番号】61/473,014

(32)【優先日】2011年4月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】グオ，エイミー

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１２６８３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−１４８２８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 European Journal of Cancer, Supplement (2009) Vol.7, No.3, p.6

【文献】 Biochemistry (2007) Vol.46, pp.1534-1544

【文献】 Biochemistry (1990) Vol.29, pp.9584-9591

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、および重鎖を含む抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質はＥＧＦＲのＥＧＦへの結合を低減させ、前記重鎖は配列番号１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有しおよび配列番号１のＣＤＲ１から３を含み、ならびに、前記抗原がＥＧＦＲである、前記抗原結合タンパク質。

【請求項2】

前記抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントであり、前記フラグメントは少なくとも１００のアミノ酸長である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項3】

前記抗原結合タンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはそれらのフラグメントであり、前記フラグメントは少なくとも１００のアミノ酸長である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項4】

前記抗体は、ヒト抗体である、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項5】

重鎖および軽鎖を含む抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質はＥＧＦＲのＥＧＦへの結合を低減させ、前記重鎖は配列番号１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有しおよび配列番号１のＣＤＲ１から３を含み、前記軽鎖は配列番号３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有しおよび配列番号３のＣＤＲ１から３を含み、ならびに、前記抗原がＥＧＦＲである前記抗原結合タンパク質。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。

【請求項7】

放射性同位体、放射性核種、毒素、治療剤、または化学療法剤をさらに含む、請求項６に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１１年４月７日に出願された、米国特許仮出願第６１／４７３，０１４号に基づいており、この利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

配列表への参照
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０１２年４月６日に作製され、サイズが１４ＫＢである、Ａ−１６２８−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔと題されるファイルとして提供される。電子形式での配列表の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

上皮成長因子受容体（「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ受容体」、または「ＥｒｂＢ１受容体」とも称される）は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼである。ＥｒｂＢ受容体ファミリーには、ＥｒｂＢ（ＥｒｂＢ１、またはＨｅｒ−１受容体としても既知）、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ−２受容体）、ＥｒｂＢ３（Ｈｅｒ−３ 受容体）、およびＥｒｂＢ４（Ｈｅｒ−４受容体）、ならびにこのファミリーの他のメンバーが含まれる。したがって、「ＥｒｂＢ１」、「ＥｒｂＢ１受容体」、「ＥｒｂＢ受容体」、「上皮成長因子受容体」、および「ＥＧＦＲ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：８８１−９１４（１９８７）に開示されるように、その天然に存在する突然変異体形態（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：４２０７−４２１１（１９９０）にあるような欠失突然変異体ＥＧＦＲ）を含む、ＥＧＦＲを指す。本明細書に使用される際、「ＥＧＦＲ」は、天然配列のＥＧＦＲまたはそのアミノ酸配列変異体であり得ることが理解されるであろう。

【0004】

ＥＧＦＲは、概して、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α等）、親油性膜貫通ドメイン、保存細胞内チロシンキナーゼドメイン、およびリン酸化可能な複数のチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインに結合することができる、細胞外ドメインを含む。

【0005】

ＥＧＦＲおよびそのリガンドである上皮成長因子（「ＥＧＦ」）は、細胞増殖、およびヒト固形腫瘍を含む、多くの種類の癌に関与している。例えば、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，７：３５９（１９８９）、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１：３３９−３４４（１９９０）、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ａｎｄ Ｄｅａｎ Ｉｎｔ’ｌ，Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４：２７７−２９６（１９９４）を参照されたい。これには、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、脳腫瘍、膀胱の癌、頭頸部癌、卵巣癌、および前立腺癌が含まれる。Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ａｎｄ Ｄｅａｎ，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４：２７７−２９６（１９９４）。

【0006】

多数の抗ＥＧＦＲ抗体が市販入手可能であるか、または現在臨床開発中である。このような抗体には、限定されないが、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、ザルツムマブ（ｚａｌａｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ、およびマツズマブが挙げられる。

【0007】

パニツムマブ（商標名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）の下に販売されている）は、米国、欧州、日本、および多数の他の世界各国で承認されている、ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。パニツムマブの核およびアミノ酸配列は既知であり、とりわけ、米国特許第６，２３５，８８３号および同第７，８０７，７９８号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．）に見出すことができる。これらの特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。パニツムマブの重鎖（γ）配列は、本明細書において配列番号１に記載される。パニツムマブの軽鎖（κ）配列は、本明細書において配列番号２に記載される。本明細書に使用される際、「ＡＭＧ ９５４」という用語は、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）を指す。

【0008】

ある特定のアミノ酸残基の異性化は、抗体に観察される現象である。例えば、Ｗａｋａｎｋａｒらは、２つの組み換えモノクローナル抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内のある特定のアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）が、このような異性化を起こしやすかったことを観察した。特に、これらの抗体におけるアスパラギン酸（Ａｓｐ）の異性化は、これらの抗体のイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）および環状イミド（Ａｓｕ）変異体の形成をもたらした。例えば、Ｗａｋａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７ Ｆｅｂ １３；４６（６）：１５３４−４４（Ｊａｎ．２００７）を参照されたい。これらの変異体の形成は、これらの抗体の結合親和性を低減させ、それによって、それらの有効性を低減させることがわかった。同文献。

【0009】

ある特定のアミノ酸の異性化が、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）に関して観察されている。この異性化は、有効性のある程度の損失、ならびに化学分解の可能性に関係するとみられ、したがって、望ましいものではない。したがって、この異性化を排除または低減することに強い要望が存在する。

【0010】

後でわかるように、本明細書に記載の突然変異体は、（ｉ）保持された有効性、もしくは（ｉｉ）改善された安定性、または（ｉｉｉ）その両方を有する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許第６，２３５，８８３号明細書

【特許文献2】米国特許第７，８０７，７９８号明細書

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：８８１−９１４（１９８７）

【非特許文献2】Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：４２０７−４２１１（１９９０）

【非特許文献3】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，７：３５９（１９８９）

【非特許文献4】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１：３３９−３４４（１９９０）

【非特許文献5】Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ａｎｄ Ｄｅａｎ Ｉｎｔ’ｌ，Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４：２７７−２９６（１９９４）

【非特許文献6】Ｗａｋａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７ Ｆｅｂ １３；４６（６）：１５３４−４４（Ｊａｎ．２００７）

【発明の概要】

【0013】

現在では、パニツムマブにおけるある特定の点突然変異が、パニツムマブにおける望ましくない異性化、および結果として起こる分解を軽減することが、予想外にもわかっている。例えば、Ｄ９２からＮ９２、およびＤ９２からＥ９２へと変化した軽鎖アミノ酸を有するパニツムマブ突然変異体は、パニツムマブよりも、保持された有効性および／または改善された安定性を示している。

【0014】

３７℃においてｐＨ５．８および５．０での加速安定性研究は、パニツムマブの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ３アスパラギン酸残基Ｄ９２が、異性化する傾向にあり、活性の損失をもたらすことを示している。一次配列を修飾することによってこの問題を排除することが可能であるかどうかを評価するために、各突然変異体において軽鎖（ＬＣ）のＣＤＲ３内に単一の点突然変異、Ｄ９２からＮ９２（「Ｎ」突然変異体）およびＤ９２からＥ９２（「Ｅ」突然変異体）を有する、２つの突然変異体を作製した。いずれの突然変異体も、細胞に基づく有効性アッセイによって測定される生物学的活性を保持した。さらに、安定性研究は、Ｄ９２からＥ９２の突然変異体が、加速条件下において、有効性を保持しながらも、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）よりも大幅に安定であったことを示した。Ｄ９２からＮ９２の突然変異体は、安定性には改善が観察されなかったが、同様に有効性を保持した。

【0015】

本発明は、したがって、配列番号３、および／または配列番号４、配列番号５、および／または配列番号６に見られるもの等、抗原結合タンパク質またはそのフラグメントに関する。本発明の抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントであってもよく、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、およびそれらのフラグメントを含むがこれらに限定されない。

【0016】

他の態様において、本発明は、配列番号３のＣＤＲ１〜３に及ぶ領域を含む、抗原結合タンパク質に関する。本発明はさらに、配列番号４のＣＤＲ１〜３に及ぶ領域を含む、抗原結合タンパク質に関する。

【0017】

本発明はまた、９２位に点突然変異を有し、前記点突然変異はグルタミン酸残基またはアスパラギンである、抗ＥＧＦＲ抗体に関する。

【0018】

本発明はさらに、９２位のアスパラギン酸残基を、グルタミン酸残基またはアスパラギン残基に変更することを含む、パニツムマブ等のＥＧＦＲ抗体の安定性を改善するための方法に関する。

【0019】

さらに、本発明は、ＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−αへのＥＧＦＲの結合（または他の相互作用）を低減させる能力を有する本明細書に記載の単離された抗原結合タンパク質に関する。本発明はまた、ＥＧＦＲについて、本明細書に記載の抗原結合タンパク質と競合する、単離された抗原結合タンパク質に関する。

【0020】

本発明はまた、配列番号３、４、５、または６のいずれかに記載される、抗原結合タンパク質またはその部分をコードする核酸分子に関する。核酸分子は、制御配列に操作可能に結合され得る。他の態様において、本発明は、この／これらの核酸分子を含むベクターに関し、さらにこれらのベクターを含む宿主細胞に関する。

【0021】

本発明はさらに、抗原結合タンパク質を作製する方法であって、前記抗原結合三泊質を分泌する宿主細胞から、前記抗原結合タンパク質を調製するステップを含む、方法に関する。

【0022】

他の態様において、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質（抗体等）と薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物に関する。

【0023】

本発明はまた、本明細書に記載の１つ以上の抗原結合タンパク質を含み、さらに放射性同位体、放射性核種、毒素、治療剤、または化学療法剤を含む、薬学的組成物に関する。

【0024】

さらに他の態様において、本発明は、癌を治療または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に記載の少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、方法に関する。本発明は、患者における上昇したＥＧＦおよびＥＧＦＲレベルのうち少なくとも１つと関連する症状を治療または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に記載の少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、方法に関する。本発明はまた、患者におけるＥＧＦＲのＥＧＦへの結合を阻害する方法であって、本明細書に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、方法に関する。

【0025】

いくつかの態様において、本発明は、配列番号３および／または配列番号４に記載の１つ以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ＥＧＦＲに結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。

【0026】

明瞭性のため、抗原結合タンパク質におけるＣＤＲは、下線で示され、番号順、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３で記載されることが理解されるであろう。

【0027】

いくつかの態様において、本発明は、本明細書に開示される抗原結合タンパク質のうちのいずれかによって結合されるエピトープに特異的に結合する、単離された抗原結合タンパク質を含む。

【0028】

本発明の他の態様は、当業者によって理解され、本明細書に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】６か月間、３７℃、ｐＨ５．８でのＬｙｓ−Ｃペプチドマップによって検出されたＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）のＤ９２異性化を示す。Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）を、ｐＨ５．８で６か月間、３７℃で、製剤緩衝液中でインキュベートした。試料を、Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングを使用して、参照標準物と比較した。異性化のレベルを、ペプチドＬｙｓ−Ｌ３（残基４６〜１０３）の修飾されたものと天然のものとの比率によって定量化した。「Ａ」は、ハイブリドーマ由来の分子を表し、「Ｂ」は、ＣＨＯ由来の分子を示す。

【図2】軽鎖（ＬＣ）Ｄ９２、ｉｓｏＤ９２、Ｅ９２、およびＮ９２の構造モデルを示す。

【図3】４週間、ｐＨ５．０、５０℃でのＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）の突然変異体の加速安定性データを示す。野生型Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（Ｄ９２）および２つの突然変異体（Ｅ９２、Ｎ９２）を、ｐＨ５．０、５０℃で、４週間、インキュベートした。トリプシンマッピングによる、ストレスを与えた試料と未処理材料との比較は、ペプチドＴｒｐ−Ｌ５が、次のように分布したことを示した。野生型分子は２つのＴｒｐ−Ｌ５ピーク（Ｄ９２およびｉｓｏＤ９２）、突然変異体Ｎ９２は３つのＴｒｐ−Ｌ５ピーク（Ｎ９２、Ｄ９２、およびｉｓｏＤ９２）、ならびに突然変異体Ｅ９２は１つのＴｒｐ−Ｌ５ピーク（Ｅ９２）。この結果は、とりわけ、突然変異体Ｅ９２が、これらの加速ストレス条件下において、安定であることを示す。

【図4】細胞に基づくアッセイにおけるＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）突然変異体の有効性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

ＥＧＦＲに結合する抗原結合タンパク質（抗体、およびその機能的結合フラグメント）を、本明細書に開示する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲに結合し、様々な方法でＥＧＦＲが機能することを阻止する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲが他の物質と相互作用する能力を遮断または低減させる。例えば、いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲがＥＧＦに結合するであろう可能性を阻止または低減させる方法で、ＥＧＦＲに結合する。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲに結合するが、ＥＧＦＲがＥＧＦと相互作用する能力を遮断しない場合がある。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体である。

【0031】

ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質は、結腸直腸、胸部、肺、頭頸部、卵巣、子宮頸部、前立腺、膵臓等を含むがこれらに限定されない、種々の癌の治療および／または予防に使用することができる。したがって、癌を有する対象を治療するための方法および組成物は、本明細書に記載される本発明の範囲内である。

【0032】

便宜上、以下の節は、概して、本明細書に使用される用語の種々の意味を概説する。この説明に続いて、抗原結合タンパク質に関する一般的な態様を記述し、続いて抗原結合タンパク質の種々の実施形態の特性を示す具体的な実施形態、およびどのようにそれらを展開することができるかを記述する。

【0033】

定義および実施形態
本明細書の記述は、単に例示および説明であり、特許請求される本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。本出願において、単数形の使用は、具体的に別段の記述がない限り、複数形を含む。本出願において、「または」の使用は、別段の記述がない限り「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる」等の他の形態の使用は、限定的ではない。さらに、「要素」または「構成要素」等の用語は、具体的に別段の記述がない限り、１つの単位を構成する要素および構成要素、ならびに１つを上回る副単位を構成する要素および構成要素の両方を包含する。さらに、「部分」という用語の使用は、ある部分の一部またはその全部分を含み得る。

【0034】

本明細書に使用される節の見出しは、単に編成の目的であり、記載される主題を限定するとみなされるべきものではない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むがこれらに限定されない、本出願に引用される全ての文書または文書の部分は、いかなる目的に対しても参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。本開示に従って利用される際、以下の用語は、別段の指定がない限り、次の意味を有すると理解されたい。

【0035】

「ＥＧＦＲ」という用語は、上皮成長因子受容体、そのフラグメント、ならびに関連ポリペプチドを指し、これには、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導変異体、置換変異体、欠失変異体、ならびに／またはＮ末端メチオニン、融合ポリペプチド、および種間相同体の付加を含む挿入変異体が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲポリペプチドには、限定されないが、シグナルペプチド配列残基、標的残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基、および／または融合タンパク質残基等の末端残基が挙げられる。ＥＧＦＲへの参照には、ヒトＥＧＦＲの変異体、イソ型、および種間相同体が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の抗体のＥＧＦＲ抗原への結合は、１つ以上のＥＧＦＲリガンド（複数可）のＥＧＦＲへの結合を阻害または遮断することによって、ＥＧＦＲを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の成長を阻害する。「ＥＧＦＲリガンド」という用語は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、へレグリン、βセルリン、およびエピレグリン（ＥＰＩ）を含むが、これらに限定されない、ＥＧＦＲの全ての（例えば、生理学的）リガンドを包含する。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体のＥＧＦＲ抗原への結合は、エフェクター細胞の食作用および／またはＥＧＦＲを発現する細胞の殺滅を媒介する。

【0036】

成熟ＥＧＦＲの細胞外部分（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ａｃｃ．＃Ｐ００５３３）は、６２１のアミノ酸、および４つの受容体ドメインから構成され、ドメインＩは残基１〜１６５、ドメインＩＩは残基１６６〜３１２、ドメインＩＩＩは残基３１３〜４８１、およびドメインＩＶは４８２〜６２１を包含する（Ｃｏｃｈｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８７，１４７−１５８）。ドメインＩおよびＩＩＩは、リガンドの高親和性結合部位の形成に寄与することが示唆されている。ドメインＩＩおよびＩＶは、タンパク質の折り畳みを安定化させ、可能なＥＧＦＲ二量体形成面を含有する、高システインのラミニン様領域である。

【0037】

バイオマーカー
ＫＲＡＳ遺伝子におけるある特定の突然変異が、抗体等のＥＧＦＲ阻害剤に対する非応答性の前兆であることが見出された。例えば、Ｆｒｅｅｍａｎらに対する米国特許第ＵＳ２００８／０２９３０５５号“ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ”を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、およびＴ２０Ｍを含むがこれらに限定されない、多数のこのようなＫＲＡＳ突然変異が識別されている。

【0038】

ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、およびＰＩＰ３を含む、さらなるバイオマーカーは、Ａｓｇｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ．，Ｄｅｃ．，９（５）：２７４−８１（２０１０）に記載される。別の可能性のあるバイオマーカーである、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数は、ＵＳ２００７／００８７３９４号およびＵＳ２００９／０２６９３４４号に記載され、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0039】

「突然変異体ＥＧＦＲポリヌクレオチド」、「突然変異体ＥＧＦＲオリゴヌクレオチド」、「突然変異体ＥＧＦＲ核酸」という用語は、互換的に使用され、Ｌ６８８Ｐ、Ｑ７０１Ｈ、Ｋ７４５Ｎ、Ｃ７８１Ｒ、アミノ酸７７１と７７２との間のヒスチジン挿入、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８２８ｓｔｏｐ、Ｑ８４９Ｒ、Ｆ９１０Ｌ、およびＶ９４８Ａから選択される、少なくとも１つのＥＧＦＲ突然変異を含む、ＥＧＦＲポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを指す。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｅｍａｎらに対するＵＳ２００７／００４８７５４号を参照されたい。

【0040】

「突然変異体Ｐｌ３Ｋポリヌクレオチド」、「突然変異体Ｐｌ３Ｋオリゴヌクレオチド」、および「突然変異体Ｐｌ３Ｋ核酸」という用語は、互換的に使用され、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、およびＨ１０４７Ｌから選択される少なくとも１つのＰｌ３Ｋ突然変異を含む、Ｐｌ３Ｋポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを指す。

【0041】

「突然変異体Ｂ−Ｒａｆポリヌクレオチド」、「突然変異体Ｂ−Ｒａｆオリゴヌクレオチド」、「突然変異体Ｂ−Ｒａｆ核酸」という用語は、互換的に使用され、少なくとも１つのＢ−Ｒａｆ突然変異を有するＢ−Ｒａｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。これらの突然変異は、ＵＳ２００９／００７５２６７号に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0042】

本明細書に使用される際、「癌」という用語は、ヒトの癌、および癌腫、肉腫、腺腫、リンパ腫、白血病等を指し、固形腫瘍およびリンパ系癌、腎臓、胸部、肺、腎臓、膀胱、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、胃、脳、頭頸部、皮膚、子宮、精巣、食道、および肝臓癌、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫、白血病、ならびに多発性骨髄腫を含むリンパ腫が含まれる。「泌尿生殖器癌」とは、腎臓、膀胱、尿路、尿道、前立腺、陰茎、睾丸、外陰、膣、子宮頸部、および卵巣の組織を含むがこれらに限定されない、尿路および生殖器組織のヒト癌を指す。

【0043】

「過剰発現する」、「過剰発現」、または「過剰発現される」という用語は、通常、癌細胞において、正常細胞と比較して、検出可能に高いレベルで、転写または翻訳された遺伝子を互換的に指す。過剰発現は、したがって、タンパク質およびＲＮＡの過剰発現（増加した転写、転写後のプロセシング、翻訳、翻訳後のプロセシング、改変された安定性、および改変されたタンパク質分解による）、ならびに変化したタンパク質輸送パターン（核局在化の増加）および例えば増加した基質の酵素加水分解にあるような機能活性の増大による局所過剰発現の両方を指す。過剰発現はまた、正常細胞または比較細胞（例えば、ＢＰＨ細胞）と比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上であり得る。

【0044】

「癌関連抗原」または「腫瘍特異的マーカー」または「腫瘍マーカー」という用語は、正常細胞と比較して、癌細胞に選択的に発現される分子（典型的にはタンパク質、炭水化物、または脂質）を互換的に指し、これは、薬理作用剤を癌細胞に選択的に標的化するのに有用である。マーカーまたは抗原は、細胞表面上または細胞内に発現し得る。しばしば、癌関連抗原は、正常細胞と比較して癌細胞では最小限の分解で、例えば、正常細胞と比較して２倍の発現、３倍の発現、またはそれ以上で、発現または安定化される、分子である。しばしば、癌関連抗原は、癌細胞において不適切に合成される分子、例えば、正常細胞に発現する分子と比較して、欠失、付加、または突然変異を含有する分子である。さらに、癌関連抗原は、癌細胞でのみ発現され得、正常細胞で合成または発現されることはない。例示的な細胞表面腫瘍マーカーには、乳癌についてはタンパク質ｃ−ｅｒｂＢ−２およびヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、前立腺癌についてはＰＳＭＡ、ならびに胸部、卵巣、および結腸直腸を含む多数の癌においては炭水化物ムチンが挙げられる。

【0045】

「アゴニスト」とは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（受容体等）に結合し、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性または発現の刺激、増加、活性化、促進、活性化の強化、感作、または上方調節を行う、薬剤を指す。

【0046】

「アンタゴニスト」とは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を阻害するか、または本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合して、部分的または全面的に、その活性の刺激の遮断、減少、阻止、活性化の遅延、不活性化、脱感作、または下方調節を行う、薬剤を指す。

【0047】

「有機小分子」は、約５０ダルトンを超えて約２５００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１００〜約１０００ダルトン、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの分子量を有する、天然または合成のいずれかの有機分子を指す。

【0048】

細胞毒性剤には、「細胞周期特異的」または「抗有糸分裂性」または「細胞骨格相互作用性」薬剤が含まれる。これらの用語は、互換的に、有糸分裂中の細胞を遮断する任意の薬理作用剤を指す。このような薬剤は、化学療法に有用である。一般的に、細胞周期特異的薬物は、細胞骨格タンパク質チューブリンに結合し、チューブリンがマイクロチューブリンに重合する能力を遮断し、その結果、分裂中期で細胞分裂を停止させる。例示的な細胞周期特異的薬物には、ビンカアルカロイド、タキサン、コルヒチン、およびポドフィロトキシンが挙げられる。例示的なビンカアルカロイドには、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。例示的なタキサンには、パクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられる。細胞骨格相互作用性薬物の別の例には、２メトキシエストラジオールが挙げられる。

【0049】

「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、この二本鎖ＲＮＡは、遺伝子または標的遺伝子の発現を、ｓｉＲＮＡが同じ遺伝子または標的遺伝子内に発現する場合、低減または阻害する能力を有する。「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」は、したがって、相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡの相補性部分は、典型的に、実質的または完全な同一性を有する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と実質的または完全な同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する、核酸を指す。典型的に、ｓｉＲＮＡは、長さが少なくとも約１５〜５０ヌクレオチドであり、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、長さが１５〜５０ヌクレオチドであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さが約１５〜５０塩基対、好ましくは約２０〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは長さが約２０〜２５または約２４〜２９ヌクレオチドであり、例えば、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである。

【0050】

所望の治療遺伝子のコードおよび制御配列を含有する好適なベクターの構築は、標準的な連結および制限技術を採用し、これらは当該技術分野で十分に理解されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照されたい）。単離プラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドを、開裂し、適合させ、所望される形態に再連結させる。

【0051】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係にある場合、「操作可能に結合」される。例えば、プレ配列または分裂リーダーに対するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに操作可能に結合され、プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能に結合される、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置される場合、コード配列に操作可能に結合される。一般的に、「操作可能に結合された」とは、結合されているＤＮＡ配列が、互いに近接しており、分泌リーダーの場合は、連続し、かつ読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にある。しかしながら、エンハンサーは、連続である必要はない。結合は、便宜的な制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の慣例に従って使用する。

【0052】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する「同一性」またはパーセント「同一性」という用語は、ＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを、以下に記載のデフォルトパラメータで使用して、または手動アライメントおよびさらには目視検査を通じて測定した際に（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等を参照されたい）、同じであるか、または特定の割合で同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する（すなわち、比較ウインドウまたは指定領域上での最大対応について比較およびアライメントした際、特定の領域上で約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性）、２つ以上の配列または部分配列を指す。このような配列は、結果として、「実質的に同一である」と称される。この定義はまた、試験配列の相補体を指すか、またはそれに適用することができる。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものを含む。本明細書に記載のように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を考慮し得る。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５のアミノ酸もしくはヌクレオチドの領域、またはより好ましくは、長さが５０〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチドの領域にわたって、存在する。

【0053】

配列比較については、典型的に、１つの配列が、参照配列として機能し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列の座標を指定し、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータが使用可能であり得るか、または代替的なパラメータを指定してもよい。配列比較アルゴリズムは、次いで、プログラムのパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0054】

「比較ウインドウ」は、配列を、２つの配列が最適にアライメントされた後に、同じ連続した位置番号の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通常約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される、連続した位置番号のうちのいずれか１つのセグメントへの参照を含む。比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動アライメントおよび目視検査によって（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、実行することができる。

【0055】

パーセント配列同一性および配列類似性を判定するのに好適な好ましいアルゴリズム例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載のパラメータで使用して、本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を判定する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、クエリ配列中の長さＷの短い文字列を識別することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を識別することを伴い、これは、データベース配列中の同じ長さの文字列とアライメントしたときに、何らかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、検索用文字列スコア閾値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（上記））。これらの初期検索用文字列の一致が、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための初期検索の元として機能する。文字列の一致は、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（１つのペアの一致残基に対するリワードスコア、常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。文字列一致の各方向への伸長は、累積アライメントスコアが、その最大達成値から数Ｘ減少した場合、累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基のアライメントの蓄積のためにゼロ以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合に、中断される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、文字列の長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、文字列の長さ３、期待値（Ｅ）１０を、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。

【0056】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、一本鎖および二本鎖両方のヌクレオチドポリマーを含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロスレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、およびホスホロアミダート等のヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。

【0057】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜６０塩基である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば、突然変異体遺伝子の構築に使用するために、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのための放射標識、蛍光標識、ハプテン、または抗原標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー、またはハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。

【0058】

「単離された核酸分子」とは、単離ポリヌクレオチドが天然に見られるポリヌクレオチドの全てまたは一部分と関連しないか、または天然には結合しないポリヌクレオチドに結合している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源、またはそれらの何らかの組み合わせのＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本開示の目的に対しては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないことを理解されたい。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大１０またはさらには最大２０の他のタンパク質またはその部分に対するコード配列を含み得るか、または引用された核酸配列のコード領域の発現を制御する操作可能に結合された調節配列を含み得る、および／またはベクター配列を含み得る。

【0059】

別段の指定がない限り、本明細書に記載のあらゆる一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は、転写方向と称され、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有し、５’から５’末端へのＲＮＡ転写であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有し、３’から３’末端へのＲＮＡ転写であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

【0060】

「制御配列」という用語は、それが連結されるコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼし得るポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子に対する１つまたは複数の認識部位、転写エンハンサー配列、および転写終結配列を含み得る。「制御配列」には、リーダー配列および／または融合パートナー配列が含まれ得る。

【0061】

「ベクター」とは、タンパク質コード情報を宿主細胞に移送するために使用される、任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、またはウイルス）を意味する。

【0062】

「発現ベクター」または「発現構築物」とは、宿主細胞の形質転換に好適なベクターを指し、それに操作可能に結合された１つ以上の非相同コード領域の発現を（宿主細胞とともに）指示および／または制御する核酸配列を含有する。発現構築物には、限定されないが、転写、翻訳に影響を及ぼすか、またはそれを制御する配列、およびイントロンが存在する場合には、それに操作可能に結合されるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列が含まれ得る。本発明に有用な発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに操作可能に結合される、少なくとも１つの発現制御配列を含有する。制御配列は、クローニングされたＤＮＡ配列の発現を制御および調節するために、ベクター内に挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば、３−ホスホグリセラートキナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、およびシミアンウイルスに由来するプロモーター、例えば、早期および後期プロモーターまたはＳＶ４０、ならびに原核生物または真核生物細胞、およびそれらのウイルスまたはそれらの組み合わせの遺伝子の発現を制御することが既知の他の配列である。

【0063】

本明細書に使用される際、「操作可能に結合された」とは、この用語が適用される構成要素が、好適な条件下において、それらがそれら特有の機能を実行することを可能にする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「操作可能に結合された」ベクター内の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合性のある条件下において達成されるように、そこに連結される。

【0064】

「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されているか、または形質転換することが可能であり、それによって、目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、親細胞の子孫が含まれ、目的の遺伝子が存在している限り、この子孫が、元の親細胞と同一の形態学または遺伝子構造であるかどうかにかかわらない。

【0065】

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性または外因性のＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜の中に導入されている場合、細胞は「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（上記）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ１３：１９７を参照されたい。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。

【0066】

「形質転換」という用語は、細胞の遺伝子特性における変化を指し、細胞は、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように修飾されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、トランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して、新しい遺伝物質を導入することにより、その天然の状態から遺伝子的に修飾されている場合、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の後に、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に統合することによって細胞のものと再結合し得るか、または複製されることなくエピソーム要素として一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製され得る。細胞は、形質転換ＤＮＡが、細胞分裂により複製される場合、「安定に形質転換」されていると考えられる。

【0067】

「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する巨大分子、すなわち、天然または非組み換えの細胞によって生成されるタンパク質を意味するか、あるいは、それは、遺伝子組み換えまたは組み換え細胞によって生成され、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然の配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、そこへの付加、および／もしくはその置換を有する分子を含む。この用語にはまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然のアミノ酸およびポリマーの化学的類似体である、アミノ酸ポリマーが含まれる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、具体的には、抗原結合タンパク質の１つ以上のアミノ酸からの欠失、そこへの付加、および／またはその置換を有する、ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質、抗体、または配列を包含する。「ポリペプチドフラグメント」という用語は、全長の天然タンパク質と比較した際に、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部欠失を有する、ポリペプチドを指す。このようなフラグメントはまた、天然のタンパク質と比較して修飾されたアミノ酸を含有する。ある特定の実施形態において、フラグメントは、約５〜５００のアミノ酸長である。例えば、フラグメントは、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０のアミノ酸長であってもよい。有用なポリペプチドフラグメントには、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的機能性フラグメントが含まれる。ＥＧＦＲ結合抗体の場合、有用なフラグメントには、限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の部分、または２つのＣＤＲを含む単なるその可変領域等が含まれる。

【0068】

参照される「単離されたタンパク質」という用語は、対象のタンパク質が、（１）それが通常一緒に見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないこと、（２）同じ源に由来する、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないこと、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されること、（４）それが天然で関連しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離していること、（５）それが天然には関連していないポリペプチドと操作可能に（共有結合または非共有結合の相互作用によって）関連していること、または（６）天然には発生しないことを意味する。典型的に、「単離されたタンパク質」は、所定の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他の合成起源のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせにより、このような単離タンパク質をコードすることができる。好ましくは、単離タンパク質は、実質的に、その治療的、診断的、予防的、研究的、または他の使用を妨げるであろう、その天然の環境に見られるタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物質を含まない。

【0069】

「アミノ酸」という用語は、天然または非天然のアミノ酸を指し、当該技術分野におけるその通常の意味を含む。

【0070】

ポリペプチドの「変異体」（例えば、抗原結合タンパク質、または抗体）には、１つ以上のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列に対して、アミノ酸配列に挿入、そこから欠失、および／またはそこに置換されている、アミノ酸配列が含まれる。変異体には、融合タンパク質が含まれる。

【0071】

用語「同一性」は、配列のアライメントおよび比較によって判定される、２つ以上のポリペプチド分子、または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「パーセント同一性」とは、比較される分子におけるアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基の割合を意味し、比較される分子のうち最少のものの寸法に基づいて計算される。これらの計算について、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理される。アライメントした核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用可能な方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３．に記載のものが含まれる。

【0072】

パーセント同一性を計算する際、比較されている配列は、典型的に、配列間に最大の一致が得られる方法でアライメントされる。パーセント同一性を判定するために使用可能なコンピュータプログラムの１つの例は、ＧＣＧプログラムパッケージであり、これには、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が含まれる。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを使用して、パーセント配列同一性を判定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアライメントする。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致についてアライメントされる（アルゴリズムによって判定される「一致範囲」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角の３倍として計算され、「平均対角」は、使用されている比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」とは、特定の比較マトリックスによる各完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは番号である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリックスを、アルゴリズムと併せて使用する。ある特定の実施形態において、標準的な比較マトリックス（例えば、ＰＡＭ２５０の比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２、ＢＬＯＳＵＭ ６２の比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）もまた、このアルゴリズムによって使用される。

【0073】

ＧＡＰプログラムを使用したポリペプチドまたはヌクレオチド配列についてのパーセント同一性の判定に採用可能なパラメータの例は、以下である。
・ アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３
・ 比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上記）のＢＬＯＳＵＭ ６２
・ ギャップペナルティ：１２（終了ギャップはペナルティなしで）
・ ギャップ長ペナルティ：４
・ 類似性の閾値：０

【0074】

２つのアミノ酸配列をアライメントするためのある特定のアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらす可能性があり、この短いアライメント領域は、２つの全長配列の間に有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択されたアライメント方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドのうち少なくとも５０または他の数の連続したアミノ酸に及ぶアライメントをもたらすことが所望される場合、調整することができる。

【0075】

本明細書に使用される際、２０の従来的な（例えば、天然に存在する）アミノ酸およびそれらの略称は、従来の慣用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄ．，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ＆Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたく、これは、いかなる目的についても参照により本明細書に組み込まれる。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α、α二置換アミノ酸等の非天然のアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来のアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドの好適な構成要素であり得る。非従来的なアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、δ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の同様のアミノ酸、ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書に使用されるポリペプチドの表記において、標準的な慣用および慣例に従い、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。

【0076】

同様に、別段の指定のない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は、転写方向と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、５’から５’末端へのＲＮＡ転写である、ＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、３’から３’末端へのＲＮＡ転写である、ＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

【0077】

保存的アミノ酸置換は、典型的に、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然のアミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転または反転形態が含まれる。

【0078】

天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類することができる。
・ 疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
・ 中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
・ 酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
・ 塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
・ 鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
・ 芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0079】

例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと、別のクラスからのメンバーの交換を伴い得る。このような置換残基を、例えば、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体、または分子の非相同領域に導入することができる。

【0080】

本抗原結合タンパク質（抗体等）を変化させる際、ある特定の実施形態によると、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。

【0081】

タンパク質に相互作用性生物学的機能を与えることにおける、疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当該技術分野で理解されている。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある特定のアミノ酸を、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換し、依然として類似の生物学的活性を保持することが可能であることが既知である。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際、ある特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある特定の実施形態では、±１以内のものが含まれ、ある特定の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。

【0082】

同様のアミノ酸の置換は、特に、それによって作製される生物学的機能タンパク質またはペプチドが、本事例にあるように、免疫学的実施形態での使用を目的とする場合、親水性を基準として効果的行うことができることもまた、当該技術分野で理解されている。ある特定の実施形態において、その隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。

【0083】

以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化させる際、ある特定の実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸置換が含まれ、ある特定の実施形態では、±１以内のものが含まれ、ある特定の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。さらに、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを識別することができる。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と称される。

【0084】

例示的なアミノ酸置換を、表１に記載する。

【0085】

【表1】

【0086】

「誘導体」という用語は、アミノ酸（または核酸）の挿入、欠失、または置換以外の化学修飾を含む、分子を指す。ある特定の実施形態において、誘導体は、限定されないが、ポリマー、脂質、または他の有機もしくは無機部分を含む、共有結合修飾を含む。ある特定の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、化学的に修飾されていない抗原結合タンパク質よりも優れた循環半減期を有し得る。ある特定の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、所望される細胞、組織、および／または器官に対する改善された標的能力を有し得る。いくつかの実施形態において、誘導抗原結合タンパク質は、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含む、１つ以上の水溶性ポリマーの付加を含むように、共有結合修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、および同第４，１７９，３３７号を参照されたい。ある特定の実施形態において、誘導抗原結合タンパク質は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物系ポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール、ならびにこのようなポリマーの混合物を含むがこれらに限定されない、１つ以上のポリマーを含む。

【0087】

ある特定の実施形態において、誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のサブユニットで共有結合修飾される。ある特定の実施形態において、１つ以上の水溶性ポリマーは、誘導体の１つ以上の特異的位置、例えば、アミノ末端で結合される。ある特定の実施形態において、１つ以上の水溶性ポリマーは、誘導体の１つ以上の側鎖に無作為に結合される。ある特定の実施形態において、ＰＥＧを使用して、抗原結合タンパク質の治療能力を改善する。ある特定の実施形態において、ＰＥＧを使用して、ヒト化抗体の治療能力を改善する。ある特定のこのような方法は、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号に説明され、これは、いかなる目的についても、参照により本明細書に組み込まれる。

【0088】

ペプチド類似体は、鋳型ペプチドのものに類似の特性を有する非ペプチド薬として、製薬業界で広く使用されている。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」または「ペプチド模倣物」と称される。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１５：２９（１９８６）、Ｖｅｂｅｒ＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２（１９８５）、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）、これらは、いかなる目的についても参照により本明細書に組み込まれる。このような化合物は、しばしば、コンピュータによる分子モデリングを活用して開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、類似の治療的または予防的効果を得ることができる。一般的に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体等のパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、当該技術分野で周知の方法によって、−−ＣＨ_２ＮＨ−−、−−ＣＨ_２Ｓ−−、−−ＣＨ_２−ＣＨ_２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シス＆トランス）、−−ＣＯＣＨ_２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−−、および−−ＣＨ_２ＳＯ−から選択される少なくとも１つの結合によって任意に置換された１つ以上のペプチド結合を有する。ある特定の実施形態において、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同じ種類のＤ−アミノ酸との系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いて、より安定なペプチドを生成することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む、拘束性ペプチドは、当該技術分野で既知の方法によって、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成する能力のある内部システイン残基を付加することによって、生成することができる（Ｒｉｚｏ＆Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３８７（１９９２）、いかなる目的についても参照により本明細書に組み込まれる）。

【0089】

例えば、ポリペプチド、核酸、宿主細胞等の生物学的物質に関連して本明細書全体を通じて使用される「天然に存在する」という用語は、天然に見られる物質、または天然に見られる物質の形態を指す。

【0090】

本明細書に使用される「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）は、指定された標的抗原に結合する任意のタンパク質を意味する。本出願において、指定された標的抗原は、ＥＧＦＲタンパク質、またはそのフラグメントもしくは領域である。「抗原結合タンパク質」には、限定されないが、抗体、および免疫学的機能性フラグメント等のその結合部分が含まれる。ペプチボディ（Ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）は、抗原結合タンパク質の別の例である。抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）抗原結合タンパク質の「免疫学的機能性フラグメント」（または単に「フラグメント」）は、本明細書に使用される際、全長鎖に存在するアミノ酸のうち少なくともいくつかを欠くが、依然として抗原に特異的に結合することが可能な抗体の部分（その部分がどのようにして得られたか、または合成されたかにかかわらない）を含む、抗原結合タンパク質の一種であり得る。このようなフラグメントは、それらが標的抗原に結合するという点で、生物学的に活性であり、所定のエピトープへの結合について、インタクトな抗体を含む他の抗原結合タンパク質と競合し得る。いくつかの実施形態において、フラグメントは、中和フラグメントである。いくつかの実施形態において、フラグメントは、ＥＧＦとＥＧＦＲとの間の相互作用の可能性を遮断または低減させ得る。一態様において、このようなフラグメントは、全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持することになり、いくつかの実施形態では、一本の重鎖および／もしくは軽鎖、またはその部分を含むことになる。これらの生物学的に活性なフラグメントは、組み換えＤＮＡ技術によって生成することができるか、またはインタクトな抗体を含む、抗原結合タンパク質の酵素的もしくは化学的開裂によって、生成することができる。免疫学的機能性免疫グロブリンフラグメントには、限定されないが、Ｆａｂ、ダイアボディ（同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎる、短いペプチドリンカーを介して結合される、軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体、および一本鎖抗体が含まれ、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、またはウサギを含む、あらゆる哺乳動物源から誘導され得る。本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能性部分、例えば、１つ以上のＣＤＲを、第２のタンパク質または小分子に共有結合させ、二機能特性を有するか、または長い血清半減期を有する、体内で特定の標的を対象とする治療剤を作製することができることが、さらに企図される。当業者には理解されるように、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含んでもよい。

【0091】

本明細書に記載されるある特定の抗原結合タンパク質は、抗体であるか、または抗体に由来する。ある特定の実施形態において、本抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、限定されないが、それぞれ、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で時に「抗体模倣体」と称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書で時に「抗体抱合体」と称される）、およびそれらのフラグメントを含む、抗体に基づく。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、結合活性体（ａｖｉｍｅｒ）（固く結合するペプチド）を含むか、またはそれから構成される。これらの抗原結合タンパク質を、本明細書にさらに記載する。

【0092】

「Ｆｃ」領域には、抗体のＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインを含む、２つの重鎖フラグメントが含まれる。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合またはＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって、結合される。

【0093】

「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖、ならびに１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

【0094】

「Ｆａｂ’フラグメント」は、１つの軽鎖、およびＶ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含有する１つの重鎖の一部分、ならびにさらにＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の領域を含み、そうして、鎖間ジスルフィド結合が、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖間に形成され、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成することができる。

【0095】

「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、２つの軽鎖、およびＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間の定常領域の一部分を含有する２つの重鎖を含有し、そうして、鎖間ジスルフィド結合が、２つの重鎖の間に形成される。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、したがって、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって結合される、２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。

【0096】

「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。

【0097】

「一本鎖抗体」は、重鎖および軽鎖の可変領域がフレキシブルリンカーによって結合されて、抗原結合領域を形成する、一本のポリペプチド鎖を形成している、Ｆｖ分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号、ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号に詳細に記載され、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0098】

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する、免疫学的機能性免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの事例において、２つ以上のＶ_Ｈ領域がペプチドリンカーで共有結合され、二価ドメイン抗体がもたらされる。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同じかまたは異なる抗原を標的とし得る。

【0099】

「二価抗原結合タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの事例において、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。二価抗原結合タンパク質および二価抗体は、本明細書に記載のように二特異性であり得る。「多特異性」または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、ある特定の実施形態において、典型的に、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。

【0100】

「多特異性抗原結合タンパク質」または「多特異性抗体」は、１つを上回る抗原またはエピトープを標的とするものである。

【0101】

「二特異性」、「二重特異性」、または「二機能性」抗原結合タンパク質または抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドの抗原結合タンパク質または抗体である。二特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多特異性抗原結合タンパク質抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含むが、これらに限定されない、種々の方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同じかまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る、２つの異なるエピトープに結合することになる。

【0102】

各個別の免疫グロブリン鎖は、典型的に、それぞれが、大体９０〜１１０のアミノ酸から構成され、特徴的な折り畳みパターンを有する、複数の「免疫グロブリンドメイン」から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。ヒトの場合、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは、４つの重鎖および４つの軽鎖を含有し、ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含有し、ＩｇＭアイソタイプは、５つの重鎖および５つの軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、典型的に、エフェクター機能に関与し得る１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存することになる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３として既知の３つのＣ領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのうち任意のものを有し得る。本発明のある特定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプのものである。

【0103】

抗原結合タンパク質は、解離定数（Ｋ_ｄ）が≦１０^−７Ｍである場合、その標的抗原に「特異的に結合」すると言われる。抗原結合タンパク質は、Ｋ_ｄが≦５×１０^−９Ｍである場合は「高い親和性」で、Ｋ_ｄが≦５×１０^−１０Ｍである場合は「非常に高い親和性」で、抗原に特異的に結合する。一実施形態において、本抗原結合タンパク質は、≦１０^−９ＭのＫ_ｄを有する。一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０^−５である。他の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、約１０^−９Ｍ〜１０^−１３ＭのＫ_ｄでヒトＥＧＦＲに結合し、さらに他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｋ_ｄ≦５×１０^−１０で結合するであろう。当業者には理解されるように、いくつかの実施形態において、抗原結合フラグメントのいずれかまたは全てが、ＥＧＦＲに特異的に結合し得る。

【0104】

抗原結合タンパク質は、１つの標的に対して、それが２つ目の標的に結合するよりも固く結合する場合、「選択的」である。

【0105】

「抗原結合領域」は、特定の抗原（例えば、パラトープ）に特異的に結合する、タンパク質またはタンパク質の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質に抗原に対するその特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する、抗原結合タンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、典型的に、１つ以上の相補性結合領域（ＣＤＲ）を含む。ある特定の抗原結合領域にはまた、１つ以上の「フレームワーク」領域が含まれる。「ＣＤＲ」は、抗原結合の特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適正な立体配座の維持を補助し、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進することができる。構造的に、フレームワーク領域は、抗体においてＣＤＲの間に位置し得る。

【0106】

ある特定の態様において、ＥＧＦＲ、例えば、ヒトＥＧＦＲに結合する組み換え抗原結合タンパク質を、提供する。この文脈において、「組み換え抗原結合タンパク質」とは、組み換え技術を使用して、すなわち、本明細書に記載される組み換え核酸の発現を通じて、作製されるタンパク質である。組み換えタンパク質の生成のための方法および技術は、当該技術分野で周知である。

【0107】

「抗体」という用語は、標的抗原への特異的結合について、インタクトな抗体と競合し得る任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンまたはそのフラグメントを指し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および二特異性抗体が含まれる。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。インタクトな抗体は、概して、少なくとも２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含むことになるが、いくつかの事例においては、重鎖のみを含み得る、ラクダに天然に存在する抗体のように、より少ない数の鎖を含む場合がある。抗体は、単一源にのみ由来し得るか、または「キメラ」であり得、すなわち、抗体の異なる部分が、以下にさらに記載されるように、２つの異なる抗体に由来してもよい。抗原結合タンパク質、抗体、または結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術、またはインタクトな抗体の酵素もしくはキメラ開裂によって、ハイブリドーマにおいて生成することができる。別段に示されない限り、「抗体」という用語には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、フラグメント、および突然変異タンパク質が含まれ、これらの例は以下に記載される。さらに、明確に除外されない限り、抗体には、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で、時に「抗体模倣体」と称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書で、時に「抗体抱合体」と称される）、およびそれらのそれぞれのフラグメントが含まれる。いくつかの実施形態において、この用語はまた、ペプチボディを包含する。

【0108】

天然に存在する抗体の構造単位は、典型的に四量体を含む。各このような四量体は、典型的に、２つの同一なポリペプチド鎖ペアで構成され、各ペアが、１つの全長「軽」鎖（ある特定の実施形態では、約２５ｋＤａ）および１つの全長「重」鎖（ある特定の実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的に抗原認識に関与する、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を、典型的に含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的に、エフェクター機能に関与し得る定常領域を定義する。ヒトの軽鎖は、典型的には、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、典型的に、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない複数のサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むがこれらに限定されない、サブクラスを有する。ＩｇＡは、同様に、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに細分化される。全長軽鎖および重鎖内で、典型的に、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖はまた、１０多いアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい（いかなる目的についても、参照によりその全体が組み込まれる）。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域が、典型的に、抗原結合部位を形成する。

【0109】

可変領域は、典型的に、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって結合される、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般構造を示す。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは、典型的に、フレームワーク領域によって一列に並べられており、これは、特異的エピトープへの結合を可能にすることができる。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、典型的に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、典型的に、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。

【0110】

本明細書に使用される「９２」の番号は、アミノ酸番号９２を指すことが理解されるであろう。アミノ酸番号９２は、この場合、Ｋａｂａｔの番号付けを使用しても、単にパニツムマブ抗体突然変異体のシグナルペプチド配列に従って直接数えても、同じであることが理解されるであろう。

【0111】

ある特定の実施形態において、抗体の重鎖は、抗体の軽鎖の非存在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態において、抗体の軽鎖は、抗体の重鎖の非存在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態において、抗体の結合領域は、抗体の軽鎖の非存在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態において、抗体の結合領域は、抗体の重鎖の非存在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態において、個々の可変領域は、他の可変領域の非存在下で、抗原に特異的に結合する。

【0112】

ある特定の実施形態において、ＣＤＲの明確な描写、および抗体の結合部位を含む残基の識別は、抗体の構造を解明すること、および／または抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって、達成される。ある特定の実施形態において、これは、Ｘ線結晶学等、当業者に既知の種々の技法のうちのいずれかによって達成することができる。ある特定の実施形態において、種々の分析方法を、ＣＤＲ領域の識別または概算に採用することができる。このような方法の例には、限定されないが、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、「ＡｂＭ」定義、および接触定義が挙げられる。

【0113】

Ｋａｂａｔの定義は、抗体における残基の番号付けの標準であり、典型的にＣＤＲ領域の識別に使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１４−８（２０００）を参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、Ｋａｂａｔの定義に類似であるが、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、ある特定の構造的ループ領域の位置を考慮する。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−１７（１９８６）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８３（１９８９）を参照されたい。「ＡｂＭ」の定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐによって作られた統合された一連のコンピュータプログラムを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：９２６８−９２７２（１９８９）；“ＡｂＭ^ＴＭ，Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄを参照されたい。ＡｂＭの定義は、“Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”ｉｎ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．，３：１９４−１９８（１９９９）に記載されるもの等、知識データベースと非経験的方法（ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｍｅｔｈｏｄｓ）の組み合わせを使用して、一次配列から抗体の三次構造をモデル化する。コンタクトの定義は、利用可能な複合結晶構造の分析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：７３２−４５（１９９６）を参照されたい。

【0114】

慣例により、重鎖におけるＣＤＲ領域は、典型的にＨ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端への方向で、順番に番号付けされる。軽鎖におけるＣＤＲ領域は、典型的に、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端への方向で、順番に番号付けされる。

【0115】

「軽鎖」という用語には、全長軽鎖および結合特異性をもたらすのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントが含まれる。全長軽鎖には、可変領域ドメインであるＶ_Ｌおよび定常領域ドメインであるＣ_Ｌが含まれる。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、κ鎖およびλ鎖が含まれる。

【0116】

本抗体またはそのフラグメントのＥＧＦＲに対する特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて判定することができる。抗原の抗体との解離に対する平衡定数（Ｋｄ）によって表される親和性は、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合力を測定する。結合活性は、抗体と、その抗原との間の結合力の尺度である。結合活性は、抗体上のエピトープとその抗原結合部位との間の親和性、および特定のエピトープに特異的な抗原結合部位の数を表す抗体の結合価の両方と関連する。抗体は、典型的に、１０^−５〜１０^−１１リットル／モルの解離定数（Ｋｄ）で結合する。１０^−４リットル／モルを上回る全てのＫｄは、概して、非特異的結合を示すと見なされる。Ｋｄの値が低いほど、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合力が強い。

【0117】

「重鎖」という用語には、全長重鎖および結合特異性をもたらすのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントが含まれる。全長重鎖には、可変領域ドメインであるＶ_Ｈ、ならびに３つの定常領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３が含まれる。Ｖ_Ｈドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈドメインは、Ｃ_Ｈ３が、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い状態で、カルボキシル末端に位置する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、およびＩｇＥを含む、いずれのアイソタイプのものであってもよい。

【0118】

二特異性または二機能性抗体は、典型的に、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有する、人工的なハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、限定されないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む、種々の方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。

【0119】

いくつかの哺乳動物種はまた、単一の重鎖のみを有する抗体を生成する。

【0120】

各個々の免疫グロブリン鎖は、典型的に、それぞれが、大体９０〜１１０のアミノ酸から構成され、特徴的な折り畳みパターンを有する、複数の「免疫グロブリンドメイン」から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。ヒトの場合、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは、４つの重鎖および４つの軽鎖を含有し、ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含有し、ＩｇＭアイソタイプは、５つの重鎖および５つの軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、典型的に、エフェクター機能に関与し得る１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存することになる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３として既知の３つのＣ領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのうちの任意のものを有し得る。本発明のある特定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプのものである。

【0121】

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の軽鎖および／または重鎖の一部分を指し、典型的に、重鎖におおよそアミノ末端１２０〜１３０のアミノ酸、および軽鎖には約１００〜１１０のアミノ末端アミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間であっても、アミノ酸配列が広く異なる。抗体の可変領域が、典型的に、特定の抗体のその標的に対する特異性を決定する。

【0122】

「中和抗原結合タンパク質」または「中和抗体」という用語は、それぞれ、リガンドに結合し、リガンドの結合パートナーへの結合を阻止または低減させる、抗原結合タンパク質または抗体を指す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接的に遮断すること、またはリガンドに結合し、間接的手段（リガンドにおける構造的もしくはエネルギー的変化）を通じてリガンドの結合能力を変化させることによって、行われ得る。いくつかの実施形態において、この用語はまた、それが結合したタンパク質が生物学的機能を実行することを阻止する、抗原結合タンパク質を指し得る。抗原結合タンパク質、例えば、抗体またはその免疫学的機能性フラグメントの結合および／または特異性を評価する際、抗体またはフラグメントは、過度の抗体が、（インビトロでの競合的結合アッセイで測定される）リガンドに結合される結合パートナーの数を、少なくとも約１〜２０、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、９７〜９８％、９８〜９９％、またはそれ以上低減させる場合、実質的に、リガンドのその結合パートナーへの結合を阻害することができる。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質の場合、このような中和分子は、ＥＧＦＲがＥＧＦに結合する能力を減少させることができる。いくつかの実施形態において、中和能力は、競合アッセイを介して特徴付けられる、および／または説明される。いくつかの実施形態において、中和能力は、ＩＣ_５０またはＥＣ_５０値に関して記載される。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、非中和抗原結合タンパク質であってもよい。

【0123】

「標的」という用語は、抗原結合タンパク質によって結合されることが可能な分子または分子の一部分を指す。ある特定の実施形態において、標的は、１つ以上のエピトープを有し得る。ある特定の実施形態において、標的は、抗原である。「抗原結合タンパク質」という語句における「抗原」の使用は、単に、抗原を含むタンパク質配列が、抗体によって結合され得ることを示す。この文脈において、タンパク質が外来性であること、または免疫応答を誘発する能力があることを必要とするものではない。

【0124】

同じエピトープについて競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）の関連で使用される際、「競合する」という用語は、試験されている抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能性フラグメント）が、共通の抗原（例えば、ＥＧＦＲまたはそのフラグメント）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を阻止または阻害（例えば、低減）する、アッセイによって判定される、抗原結合タンパク質間の競合を意味する。多数の種類の競合的結合アッセイを使用して、一方の抗原結合タンパク質が、もう一方と競合するかどうかを判定することができる、例えば、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照されたい）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２を参照されたい）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）。典型的に、このようなアッセイは、これらの非標識試験抗原結合タンパク質および標識参照抗原結合タンパク質のうちのいずれかを有する固体表面または細胞に結合した精製された抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面または細胞に結合された標識の量を判定することにより測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイにより識別される抗原結合タンパク質（競合する抗原結合タンパク質）には、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質、および立体障害が生じるのに十分に、参照抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに近位の隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれる。競合的結合を判定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書において実施例に提供される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それが、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を、少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、または７５％以上阻害（例えば、低減）することになる。いくつかの事例において、結合は、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、または９７％以上阻害される。

【0125】

「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能性フラグメントを含む）等の選択的な結合剤によって結合されることが可能な分子または分子の一部分を指す。いくつかの実施形態において、抗原を動物に使用して、その抗原に結合する能力のある抗体を生成することが可能である。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用する能力のある１つ以上のエピトープを有し得る。

【0126】

「エピトープ」という用語には、抗体等の抗原結合タンパク質によって、またはＴ細胞受容体に、結合することが可能な任意の決定基が含まれる。エピトープは、その抗原を標的とする抗原結合タンパク質によって結合される、抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合は、抗原結合タンパク質に直接接触する特異的アミノ酸を含む。より頻繁には、エピトープは、タンパク質上に存在するが、いくつかの事例においては、核酸等の他の種類の分子上に存在し得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホルホリル基、またはスルホニル基等、分子の化学的に活性な表面配置を含み得、特異的な３次元構造特性および／または特異的電荷特性を有し得る。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物中で、標的抗原上のエピトープを選択的に認識することになる。

【0127】

本明細書に使用される際、「実質的に純粋」とは、記載の分子種が、存在している優勢種である、すなわち、モル基準で、それが、同じ混合物中の他の個々の種よりも、豊富であることを意味する。ある特定の実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象の種が、存在する全巨大分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を構成する、組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、その組成物中に存在する全巨大分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を構成することになる。他の実施形態において、対象の種は、従来の検出方法では混入種を組成物中に検出することができず、そのため、組成物が単一の検出可能な巨大分子種からなる、本質的な均質性まで精製される。

【0128】

「薬剤」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的物質から得られた抽出物を指して本明細書に使用される。

【0129】

本明細書に使用される際、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射標識されたアミノ酸の組み込み、またはマーカーされたアビジン（例えば、光学もしくは比色分析方法によって検出することができる蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出されるビオチン部分のポリペプチドへの付加による、検出可能マーカーの組み込みを指す。ある特定の実施形態において、標識またはマーカーもまた、治療的であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が、当該技術分野で既知であり、使用可能である。ポリペプチドに対する標識の例には、次のものが含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。ある特定の実施形態において、標識は、種々の長さのスペーサーアームによって付加され、潜在的な立体障害を減少させる。

【0130】

「生物学的試料」という用語は、本明細書に使用される際、限定されないが、生物またはかつて生物であったものに由来する、任意の量の物質を含む。このような生物には、限定されないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が含まれる。このような物質には、限定されないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節、および皮膚が含まれる。

【0131】

本明細書に使用される「薬学的薬剤組成物」（または薬剤もしくは薬物）は、患者に適正に投与されると、所望の治療的効果を誘発する能力のある、化学化合物、組成物、薬剤、または薬物を指す。それは、必ずしも１種類を上回る成分を要するわけではない。

【0132】

「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、哺乳動物において治療的応答をもたらすように決定される、ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質の量を指す。このような治療有効量は、当業者によって容易に確定される。実際の用量および剤形は、治療目的に依存することになり、既知の技術を使用して当業者によって確定することができるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３）、およびＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。

【0133】

「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。

【0134】

「調節剤」という用語は、本明細書に使用される際、分子の活性または機能を変更または変化させる化合物である。例えば、調節剤は、分子のある特定の活性または機能の規模を、調節剤の非存在下で観察される活性または機能の規模と比較して、増加または減少させることができる。ある特定の実施形態において、調節剤は、分子の少なくとも１つの活性または機能の規模を減少させる、阻害剤である。分子のある特定の例示的な活性および機能には、限定されないが、結合親和性、酵素活性、およびシグナル変換が含まれる。ある特定の例示的な阻害剤には、限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物、または有機小分子が含まれる。ペプチボディは、例えば、米国特許第６，６６０，８４３号（対応するＰＣＴ出願第ＷＯ０１／８３５２５号）に記載される。

【0135】

「患者」および「対象」という用語は、互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物対象、ならびに障害が正式に診断されたもの、障害が正式に認識されていないもの、治療を受けているもの、障害が発症する危険性にあるもの等が含まれる。

【0136】

「治療する」および「治療」という用語には、治療的治療、予防的治療、および対象が障害を発症する危険性または他の危険因子を減少させる適用が含まれる。治療は、障害の完全な治癒を必要とするものではなく、症状または潜在的な危険因子を減少させる実施形態を包含する。

【0137】

「予防」という用語は、ある事象の可能性の１００％の排除を必要とするものではない。むしろ、事象の発生の可能性が、本化合物または方法の存在下で低減されていることを指す。

【0138】

標準的な技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織の培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、または当該技術分野で広く達成されるように、または本明細書に記載のように、実行することができる。前述の技術および手順は、概して、当該技術分野で周知の従来的な方法に従って、また、本明細書を通じて引用および記載される種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載のように、行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたく、これは、いかなる目的についても参照により本明細書に組み込まれる。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関して利用される、命名ならびにその実験室手順および技術は、当該技術分野で周知かつ広く使用されるものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、医薬品、剤形、および送達、ならびに患者の治療に使用することができる。

【0139】

ヒトＥＧＦＲを含む、ＥＧＦＲに結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を、本明細書に提供する。いくつかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のように、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質においては、ＣＤＲは、ＣＤＲ（複数を含む）の適正な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲを配置する、「フレームワーク」領域内に埋め込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲとＥＧＦとの間の相互作用を妨害、遮断、低減、または調節することができる。このような抗原結合タンパク質は、「中和」と称される。いくつかの実施形態において、中和抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲがＥＧＦに結合するのを阻止する位置および／または方法で、ＥＧＦＲに結合する。

【0140】

いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ媒介性活性（結合を含む）を阻害する能力がある。いくつかの実施形態において、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、とりわけ、ＥＧＦＲとＥＧＦの間の相互作用、およびＥＧＦＲによって媒介される他の生理学的作用を阻害する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲに対するヒト抗体、例えば、完全ヒト抗体である。

【0141】

いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲの触媒ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲの成熟形態に結合する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲのプロドメインに結合する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲの成熟形態に選択的に結合する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲがＥＧＦに結合できないか、またはそれほど効果的に結合できないような方法で、触媒ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのＣ末端には結合しない。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｎ末端には結合しない。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲタンパク質のＮまたはＣ末端には結合しない。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、本明細書に説明される抗体によって結合されるエピトープのうちのいずれか１つに結合する。いくつかの実施形態において、これは、本明細書に開示される抗体と他の抗体との間の競合アッセイによって判定することができる。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗体のうちの１つによって結合されるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲがＥＧＦと相互作用するのを阻止するように、ＥＧＦＲの特異的な立体配座状態に結合する。

【0142】

本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、種々の有用性を有する。抗原結合タンパク質のうちのいくつかは、例えば、特異的結合アッセイ、ＥＧＦＲ、特にヒトＥＧＦＲまたはそのリガンドの親和性精製、ならびにＥＧＦＲ活性の他のアンタゴニストを識別するためのスクリーニングアッセイにおいて、有用である。抗原結合タンパク質のうちのいくつかは、ＥＧＦＲのＥＧＦへの結合を阻害するか、またはＥＧＦＲ媒介性活性を阻害するのに有用である。

【0143】

本抗原結合タンパク質は、本明細書に説明される、種々の治療用途において使用可能である。例えば、いくつかの実施形態において、本ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質は、本明細書にさらに記載されるように、癌等、ＥＧＦおよび／またはＥＧＦＲと関連する疾患および病状の治療に有用である。

【0144】

いくつかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、１つ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造、および（ｂ）ポリペプチド構造に挿入および／または結合された１つ以上のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、種々の異なる形態をとることができる。例えば、それは、天然に存在する抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のフレームワークであるか、またはそれを含んでもよく、あるいは、事実上完全に合成であってもよい。種々のポリペプチド構造の例は、以下にさらに記載される。

【0145】

ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、限定されないが、それぞれ、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書でときに「抗体模倣体」と称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（本明細書で時に「抗体抱合体」と称される）、およびそれぞれの部分またはフラグメントを含む、抗体であるか、または抗体に由来するものである。いくつかの事例において、本抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、またはｓｃＦｖ等の一本鎖抗体分子）である。

【0146】

抗原結合タンパク質を治療用途に使用する実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲの１つ以上の生物学的活性を阻害、妨害、または調節することができる。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、および／または、実質的に、ヒトＥＧＦＲのＥＧＦへの結合を、（例えば、インビトロでの競合的結合アッセイで結合を測定することより）少なくとも約２０％〜４０％、４０〜６０％、６０〜８０％、８０〜８５％、またはそれ以上阻害する。本明細書に提供される抗原結合タンパク質のうちのいくつかは、抗体である。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２、１０^−１３Ｍ未満のＫ_ｄを有する（より固く結合する）。いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合の遮断に対するＩＣ_５０が、１μＭ未満、１０００ｎＭ〜１００ｎＭ、１００ｎＭ〜１０ｎＭ、１０ｎＭ〜１ｎＭ、１０００ｐＭ〜５００ｐＭ、５００ｐＭ〜２００ｐＭ、２００ｐＭ未満、２００ｐＭ〜１５０ｐＭ、２００ｐＭ〜１００ｐＭ、１００ｐＭ〜１０ｐＭ、１０ｐＭ〜１ｐＭである。

【0147】

いくつかの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲがＥＧＦと相互作用することを阻止するように、ＥＧＦＲの特異的な立体配座状態に結合する。

【0148】

ヒト化抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書に記載のように、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質は、ヒト化抗体および／またはその部分を含み得る。このような戦略の重要な実際の適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。

【0149】

ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、標的に対する親和性が、そのヒト化抗体が由来する別の種由来の抗体と、実質的に同じである。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい。

【0150】

ある特定の実施形態において、その免疫原性を低減させると同時に、抗原結合ドメインの本来の親和性を損なうことなく、修飾することが可能な抗体可変ドメインのアミノ酸を、識別する。例えば、米国特許第５，７６６，８８６号、および同５，８６９，６１９号を参照されたい。

【0151】

ある特定の実施形態において、当該技術分野で既知の方法による抗体の修飾は、典型的に、標的に対する結合親和性の増加を達成する、および／またはレシピエントにおける抗体の免疫原性を低減させるように設計される。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、その同種抗原に対する抗体の親和性を増加させるために、グリコシル化部位を排除するように修飾される。例えば、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１３６１−１３６７（１９９３）を参照されたい。ある特定の実施形態において、「再形成」、「ハイパーキメラ化」、または「ベニアリング／表面再構成」等の技術を使用して、ヒト化抗体が生成される。例えば、Ｖａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ，＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５（１９９８）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：８９５−９０４（１９９６）、および米国特許第６，０７２，０３５号を参照されたい。ある特定のこのような実施形態において、このような技術は、典型的に、外来性残基の数を低減させることによって、抗体の免疫原性を低減させるが、抗体の反復投与後の抗イディオタイプおよび抗アロタイプ応答を阻止するものではない。免疫原性を低減させるためのある特定の他の方法は、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６２（６）：３６６３−７１（１９９９）に記載される。

【0152】

ある特定の事例において、抗体をヒト化することは、抗原結合能力の損失をもたらす。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、「逆突然変異」される。ある特定のこのような実施形態において、ヒト化抗体は、ドナー抗体に見られるアミノ酸残基のうち１つ以上を含むように突然変異される。例えば、Ｓａｌｄａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：７０９−１９（１９９９）を参照されたい。

【0153】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体の軽鎖および重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、同じかまたは別の種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされ得る。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲにグラフトされ得る。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、ある特定の実施形態においては、複数のヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列に由来するＦＲを、アライメントしてコンセンサスアミノ酸配列を識別する。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体の軽鎖または重鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖に由来するＦＲで置き換えられる。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ内の希アミノ酸は、置き換えられないが、ＦＲアミノ酸の残りは置き換えられる。希アミノ酸は、通常はＦＲに見られない位置にある特異的アミノ酸である。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体からグラフトされた可変領域を、ＥＧＦＲに対する抗体の定常領域とは異なる定常領域とともに使用することができる。ある特定の実施形態において、グラフトされた可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲグラフティングは、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第６，０５４，２９７号、同第５，６９３，７６２号、同第５，８５９，２０５号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，５３０，１０１号、ならびにＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｗｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．，４３０：９２−９４（１９９８）に記載され、これらは、いかなる目的に対しても参照により本明細書に組み込まれる。

【0154】

ヒト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書に記載のように、ＥＧＦＲに結合する抗原結合タンパク質は、ヒト（すなわち、完全ヒト）抗体および／またはその部分を含み得る。ある特定の実施形態において、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、およびそれらを含むアミノ酸配列、特に可変領域に対応する配列が、提供される。ある特定の実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ１からＣＤＲ３に対応する配列が提供される。ある特定の実施形態によると、このような免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞系が提供される。ある特定の実施形態によると、このようなモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞系が提供される。ある特定の実施形態において、ヒトＥＧＦＲに対する精製されたヒトモノクローナル抗体が提供される。

【0155】

ヒトＩｇ遺伝子座の大型フラグメントを有するマウス抗体産生が欠損したマウス株は、このようなマウスがマウス抗体の非存在下でヒト抗体を生成するであろうことを期待して、操作することができる。大型ヒトＩｇフラグメントは、大きく変化する遺伝子多様性、ならびに抗体の産生および発現の適正な調節を保持することができる。抗体の多様化および選択についてのマウス機構、ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的耐性の欠如を活用することにより、これらのマウス株における再生されたヒト抗体のレパートリーは、ヒト抗原を含む、いずれの目的の抗原に対しても、高親和性の完全ヒト抗体をもたらし得る。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを、生成および選択することができる。ある特定の例示的方法は、ＷＯ９８／２４８９３号、米国特許第５，５４５，８０７号、ＥＰ５４６０７３号、およびＥＰ５４６０７３号に記載される。

【0156】

ある特定の実施形態において、ヒト以外の種に由来する定常領域を、ヒト可変領域（複数可）をともに使用することができる。

【0157】

酵母人工染色体（ＹＡＣ）にメガベース寸法のヒト遺伝子座をクローニングおよび再構築し、それらをマウスの生殖細胞系に導入する能力は、非常に大きいかまたは大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的要素を解明すること、ならびに有用なヒト疾患モデルを生成することへのアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト相当物と置換するこのような技術の有用性は、展開中のヒト遺伝子生成物の発現および調節、それらと他のシステムとの通信、ならびにそれらの疾患の発症および進行への関与についての見識を提供し得る。

【0158】

ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および／または定常領域を有する抗体に関連する問題のうちのいくつかを回避する。このようなマウスまたはラット由来のタンパク質の存在は、抗体の急速なクリアランスをもたらし得るか、または患者による抗体に対する免疫応答の生成をもたらし得る。マウスまたはラット由来の抗体の利用を回避するためには、齧歯動物、他の哺乳動物、または動物が、完全ヒト抗体を生成できるように、齧歯類、他の哺乳動物、または動物に機能性ヒト抗体遺伝子座を導入することによって、完全ヒト抗体を生成することができる。

【0159】

ヒト化抗体は、最初はヒトではない抗体のアミノ酸配列を含有することから開始するが、これらの非ヒト抗体のアミノ酸配列のうち少なくともいくつかが、ヒト抗体の配列と置き換えられている、抗体である。これは、抗体が、ヒトが有する遺伝子によってコードされる（またはコードされることが可能な）ヒト抗体とは対照的である。

【0160】

抗原結合タンパク質変異体
提供される他の抗体は、本明細書に記載の可変重鎖および可変軽鎖の組み合わせまたは一部分（ｓｕｂｐａｒｔ）により形成される、上に列挙された抗原結合タンパク質の変異体であり、それぞれがこれらの配列のアミノ酸配列（全配列または配列の一部分のいずれか、例えば、１つ以上のＣＤＲ）と、少なくとも５０％、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、９７〜９９％、または９９％を上回る同一性を有する、可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。いくつかの事例において、このような抗体は、少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含むが、一方で他の事例においては、変異体形態は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖（またはその一部分）を含有する。

【0161】

ある特定の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。

【0162】

いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に列挙される１つ以上ＣＤＲと、少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である、配列を含む。

【0163】

本発明を踏まえると、当業者は、周知の技術を使用して、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の好適な変異体を決定することができるであろう。ある特定の実施形態において、当業者は、活性に重要ではないと思われる領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく変更することができる、分子の好適な領域を識別することができる。ある特定の実施形態において、類似のポリペプチドにおいて保存される残基および分子の部分を識別することができる。ある特定の実施形態においては、生物学的活性または構造に重要であり得る範囲でさえも、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換の対象となり得る。

【0164】

さらに、当業者は、活性または構造に重要である、類似のポリペプチド内の残基を識別する、構造機能研究を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパク質において活性または構造に重要であるアミノ酸残基に対応するタンパク質内のアミノ酸残基の重要性を、予測することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができる。

【0165】

当業者はまた、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似の抗原結合タンパク質におけるその構造に関連して、分析することができる。このような情報を考慮して、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して、予測することができる。ある特定の実施形態において、当業者は、タンパク質の表面上にあることが予測されるアミノ酸残基に対しては、このような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得ることから、根本的な変更を加えないことを選択することができる。さらに、当業者は、各所望されるアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有する、試験変異体を生成することができる。変異体は、次いで、当業者に既知の活性アッセイを使用してスクリーニングすることができる。このような変異体を使用して、好適な変異体についての情報を収集することができる。例えば、特定のアミノ酸残基への変更が、破壊、望ましくない低減、または不適当な活性をもたらしたことを発見した場合、このような変更を有する変異体は、回避することができる。換言すると、このような日常的実験から収集された情報に基づいて、当業者は、単独または他の突然変異と組み合わせてのさらなる置換を避けるべきであるアミノ酸を、容易に判定することができる。

【0166】

多数の科学出版物が、二次構造の予測を取り上げている。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６、およびＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。さらに、コンピュータプログラムが、二次構造の予測を補助するために現在利用可能である。二次構造を予測するための１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を上回る配列同一性、または４０％を上回る類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。最近のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発展は、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の可能な折り畳み数を含む、二次構造の予測可能性の強化をもたらしている。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７）において、所定のポリペプチドまたはタンパク質における折り畳み数は限られていること、および臨界数の構造が解明された時点で、構造の予測は、劇的により正確になるであろうことが示唆されている。

【0167】

二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）、Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、および「進化的結合（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ（上記）（１９９９）、およびＢｒｅｎｎｅｒ（上記）（１９９７）を参照されたい）が含まれる。

【0168】

ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質変異体には、グリコシル化部位の数および／または種類が、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化変異体が含まれる。ある特定の実施形態において、タンパク質変異体は、元のタンパク質よりも、多いかまたは少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、Ｘとして示されるアミノ酸残基は、プロリンを除くいずれのアミノ酸残基であってもよい。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加が可能な新しい部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、既存のＮ結合型炭化水素鎖を除去することになる。さらに、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的に、天然に存在するもの）が排除され、１つ以上の新しいＮ結合型部位が作製される、Ｎ結合型炭化水素鎖の再配置もまた、提供される。さらなる好適な抗体変異体には、１つ以上のシステイン残基が、親アミノ酸配列比較して、削除されたかまたは別のアミノ酸（例えば、セリン）と置換された、システイン変異体が挙げられる。システイン変異体は、抗体を、不溶性封入体の単離後等に、生物学的に活性な立体配座に再び折り畳む必要がある場合に、有用であり得る。システイン変異体は、概して、天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、典型的に、不対システインからもたらされる相互作用を最小化するために偶数である。

【0169】

ある特定の実施形態によると、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解する傾向を低減させるもの、（２）酸化する傾向を低減させるもの、（３）タンパク質複合体の形成に対する親和性を変化させるもの、（４）結合親和性を変化させるもの、および／または（４）このようなポリペプチドに他の物理化学的または機能的特性を与えるか、もしくはそれを修正するものである。ある特定の実施形態によると、単一または複数のアミノ酸置換（ある特定の実施形態においては、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列（ある特定の実施形態において、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分）において行うことができる。ある特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的には、実質的に親配列の構造的特徴を変化させ得ない（例えば、アミノ酸の置き換えは、親配列に生じるヘリックスを切断するか、または親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を分裂させる傾向にあるべきではない）。当該技術分野で認識されているポリペプチド二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ＆Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：１０５（１９９１）に記載され、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

【0170】

いくつかの実施形態において、変異体は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の核酸配列の変異体である。当業者であれば、上述の説明が、抗原結合タンパク質変異体の識別、評価、および作製に、ならびにそれらのタンパク質変異体をコードし得る核酸配列にも使用可能であることを理解するであろう。

【0171】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブが、典型的に、核酸の複合混合物中で、その標的の部分配列とハイブリダイズするが、それ以外の配列とはハイブリダイズしないであろう条件を指す。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、異なる環境においては異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。一般的に、ストリンジェント条件は、定義されるイオン強度ｐＨにおいて、特定の配列に対する熱融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔ_ｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする、（定義されるイオン強度、ｐＨ、および核濃度下での）温度である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔ_ｍで、プローブの５０％は、平衡状態で占有される）。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加で達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性シグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、次の通りであり得る。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。

【0172】

ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸の複製物が、遺伝子コードによって許容される最大のコドン縮重を使用して作製される場合に、生じる。このような場合において、核酸は、典型的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣ１、１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃で１×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者であれば、代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、類似のストリンジェント性条件を提供できることを、容易に理解するであろう。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するためのさらなる指針は、例えば、多数の参考文献およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに提供される。ＰＣＲについては、約３６℃の温度が、低ストリンジェントな増幅には典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて、約３２℃〜４８℃で多様であり得る。高ストリンジェントなＰＣＲ増幅については、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェントなアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて、約５０℃〜約６５℃の範囲に及び得る。高および低の両方のストリンジェント増幅についての典型的な周期条件には、９０℃〜９５℃で３０秒〜２分間の変性期、および３０秒〜２分間続くアニーリング期、および約７２℃で１〜２分間の拡張期が含まれる。低および高ストリンジェントな増幅反応の手順および指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に提供される。

【0173】

抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の調製
ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質（抗体等）は、抗原（例えば、ＥＧＦＲ）での免疫化によって生成される。ある特定の実施形態において、抗体は、全長ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲの可溶性形態、触媒ドメイン単独、ＥＧＦＲの成熟形態、ＥＧＦＲのスプライス変異体形態、またはそれらのフラグメントでの免疫付与によって生成することができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、および／または組み換え抗体であってもよい。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を生成することが可能なトランスジェニック動物の免疫付与によって調製される、ヒト抗体である（例えば、ＰＣＴ公開出願第Ｗ０９３／１２２２７号を参照されたい）。

【0174】

ある特定の実施形態において、ある特定の戦略を採用して、抗体のその標的に対する親和性等、抗体特有の特性を操作することができる。このような戦略には、限定されないが、抗体をコードして抗体変異体を生成するポリヌクレオチド分子の部位特異的または無作為の突然変異生成を用いることが含まれる。ある特定の実施形態において、このような生成に続いて、所望の変化、例えば、増加または減少した親和性を示す、抗体変異体のスクリーニングが行われる。

【0175】

ある特定の実施形態において、突然変異生成戦略において標的とされるアミノ酸残基は、ＣＤＲ内のものである。ある特定の実施形態において、可変ドメインのフレームワーク領域内のアミノ酸が標的とされる。ある特定の実施形態において、このようなフレームワーク領域は、ある特定の抗体の標的結合特性に寄与することが示されている。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：３９５−４０２（１９９９）およびその中の参考文献を参照されたい。

【0176】

ある特定の実施形態において、より小さく、より効果的にスクリーニングされる、抗体変異体のライブラリは、無作為または部位特異的な突然変異生成を、体細胞親和性突然変異生成プロセスの際に突然変異する傾向にある領域に対応する部位である、ＣＤＲ内の超突然変異部位に制限することにより生成される。例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ＆Ｐａｓｔａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：５６８−５７２（１９９９）およびその中の参考文献を参照されたい。ある特定の実施形態において、ある特定の種類のＤＮＡ要素を使用して、ある特定の直接および逆反復、ある特定のコンセンサス配列、ある特定の二次構造、ならびにある特定の回文構造を含むがこれらに限定されない超突然変異部位を識別することができる。例えば、超突然変異部位を識別するために使用可能なこのようなＤＮＡ部位には、限定されないが、プリン（ＡまたはＧ）、続いてグアニン（Ｇ）、続いてピリミジン（ＣまたはＴ）、続いてアデノシンまたはチミジンのいずれか（ＡまたはＴ）を含む四塩基配列（すなわち、Ａ／Ｇ−Ｇ−Ｃ／Ｔ−Ａ／Ｔ）が含まれる。超突然変異部位を識別するために使用可能なＤＮＡ要素の別の例は、セリンコドン、Ａ−Ｇ−Ｃ／Ｔである。

【0177】

完全ヒト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の調製
ある特定の実施形態において、ファージディスプレイ方法を使用して、モノクローナル抗体を生成する。ある特定の実施形態において、このような技術により、完全ヒトモノクローナル抗体をもたらす。ある特定の実施形態において、一本鎖ＦａｂまたはＦｖ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、ファージ粒子の表面上に発現される。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）、米国特許第５，８８５，７９３号を参照されたい。ある特定の実施形態において、ファージを「スクリーニング」して、標的に対して親和性を有する抗体フラグメントを識別する。したがって、ある特定のこのようなプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上での抗体フラグメントレパートリーの提示、およびその後の標的へのそれらの結合によるファージの選択を通じて免疫選択を模倣する。ある特定のこのような手順において、高親和性の機能性中和抗体フラグメントを単離する。ある特定のこのような実施形態（以下にさらに詳細に説明される）において、ヒト抗体遺伝子の完全なレパートリーは、自然に再配列される末梢血リンパ球由来のヒトＶ遺伝子をクローニングすることによって作製される。例えば、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８７：８０９５−８０９９（１９９０）を参照されたい。

【0178】

ある特定の実施形態によると、本発明の抗体は、ヒト抗体生成ゲノムの実質的な部分を挿入したが、内因性マウス抗体の産生を欠損させた、トランスジェニックマウスの利用を通じて調製される。このようなマウスは、その結果、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を生成することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生が欠損している。この結果を達成するために利用される技術は、本明細書において、本明細書中に開示される、特許、出願、および参考文献に開示されている。ある特定の実施形態において、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９８／２４８９３号またはＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）に開示されるもの等の方法を採用することができ、これらは、いかなる目的についても参照により本明細書に組み込まれる。

【0179】

一般的に、ＥＧＦＲに特異的な完全ヒトモノクローナル抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、次のように生成することができる。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを、目的の抗原、例えば、ＥＧＦＲで免疫付与し、抗体を発現するマウス由来のリンパ細胞（Ｂ細胞等）を得る。このような回収された細胞を、骨髄性細胞系と融合して、不死ハイブリドーマ細胞系を調製し、このようなハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよび選択して、目的の抗原に特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞系を識別する。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞系の生成が、提供される。

【0180】

ある特定の実施形態において、完全ヒト抗体は、ヒト脾細胞（ＢまたはＴ細胞）を、インビトロで抗原に暴露し、次いで、暴露された細胞を、免疫不全マウス、例えば、ＳＣＩＤまたはｎｏｄ／ＳＣＩＤ中に再構成することによって、生成される。例えば、Ｂｒａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０５１−２０５８（１９９８）、Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６：１０３−１０６（２０００）を参照されたい。ある特定のこのようなアプローチにおいて、ヒト胎児組織のＳＣＩＤマウスへの生着（ＳＣＩＤ−ｈｕ）は、長期の造血およびヒトＴ細胞の発達をもたらす。例えば、ＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１５３２−１６３９（１９８８）、Ｉｆｖｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２４３−２４８（１９９６）を参照されたい。ある特定の事例において、このようなキメラマウスにおける体液性免疫応答は、動物におけるヒトＴ細胞の共発達に依存する。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８３：１２７１−１７９（１９９４）を参照されたい。ある特定のアプローチでは、ヒト末梢血リンパ球を、ＳＣＩＤマウスに移植する。例えば、Ｍｏｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：２５６−２５９（１９８８）を参照されたい。ある特定のこのような実施形態において、このような移植細胞を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ａ（ＳＥＡ）等のプライミング剤、または抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体のいずれかで処理すると、高レベルのＢ細胞生成が検出される。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：２２４−２３０（１９９５）、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８６：１９４６−１９５３（１９９５）を参照されたい。

【0181】

したがって、ある特定の実施形態において、完全ヒト抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現、またはハイブリドーマ細胞における発現によって、生成することができる。他の実施形態において、抗体は、本明細書に記載のファージディスプレイ技術を使用して生成することができる。

【0182】

本明細書に記載の抗体を、部分的には、本明細書に記載のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用を通じて調製した。このようなマウスは、その結果、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を生成することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生が欠損している。これを達成するために利用される技術は、本明細書において、背景技術の部分に開示される、特許、出願、および参考文献に開示されている。しかしながら、具体的には、マウスのトランスジェニック生成およびそれに由来する抗体の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、ならびに１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願第ＷＯ９８／２４８９３号、および２０００年１２月２１日に公開された同第ＷＯ００／７６３１０号に開示され、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）もまた参照されたく、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0183】

このような技術の使用を通じて、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が、生成されている。本質的には、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系のマウスに、目的の抗原（例えば、ＥＧＦＲ）で免疫付与し、リンパ性細胞（Ｂ細胞等）を、過剰に免疫付与したマウスから回収し、回収したリンパ球を、骨髄性細胞系と融合して、不死ハイブリドーマ細胞系を調製する。これらのハイブリドーマ細胞系を、スクリーニングおよび選択して、目的の抗原に特異的な抗体を生成したハイブリドーマ細胞系を識別する。ＥＧＦＲに特異的な抗体を生成する複数のハイブリドーマ細胞系の生成のための方法を、本明細書に提供する。さらに、このような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む、このような細胞系によって生成される抗体の特徴付けを提供する。

【0184】

ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株のマウスの生成は、さらに、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された同第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された同第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された同第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された同第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された同第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された同第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国公開第２００３／００９３８２０号、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、および同第５，９３９，５９８号、ならびに日本特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２号、同第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号、および同第３ ０６８ ５０７ Ｂ２号に記載および詳述される。１９９６年６月１２に付与公開された欧州特許第ＥＰ０ ４６３ １５１ Ｂ１号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願第ＷＯ９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願第ＷＯ９６／３４０９６号、１９９８年６月１１日に公開された同第ＷＯ９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日に公開された同第ＷＯ００／７６３１０号もまた、参照されたい。

【0185】

完全ヒトモノクローナル抗体（Ｍａｂ）技術の開発は、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現することに対する重要な出来事となっている。ヒトモノクローナル抗体は、マウスまたはヒト化抗体に内在する免疫原性およびアレルギー性応答を最小化させ、増加した有効性および／または安全性を示している。Ａｂｇｅｎｉｘ（現在はＡｍｇｅｎ Ｉｎｃ．の一部）によって開発されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）アプローチを含むがこれに限定されない、ヒトモノクローナル抗体を生成するための多数の技術が存在する。Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照されたい。Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）技術のさらなる変化形は、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）および米国特許出願第０８／７５９，６２０号に見出すことができ、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0186】

代替的なアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．を含み、ヒト化抗体の生成に、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを使用するものもある。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号、ならびに、いずれもＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対するものである米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，６２５，８２５号、１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された同第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された同第０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された同第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された同第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された同第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された同第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された同第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された同第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日に出願された同第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された同第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された同第０８／２０９，７４１号に記載され、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９２／２２６４５号、およびＷＯ９２／０３９１８号もまた参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒト抗体を生成するためのさらなる技術は、例えば、Ｍｅｄａｒｅｘ（登録商標）（現在ではＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（登録商標）の一部）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）（ＣＡＴ、現在ではＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（登録商標）の一部）によって、開発されてきた。

【0187】

上記の特許、出願、および参考文献のそれぞれの開示もまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0188】

本発明の好適な抗体、例えば、組み換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の調製、および本発明による使用については、当該技術分野で既知の多数の方法を使用することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．７７−９６ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、およびＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）を参照されたい）。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子を、ハイブリドーマからクローニングし、組み換えモノクローナル抗体の生成に使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリもまた、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製することができる。重鎖および軽鎖遺伝子生成物の無作為な組み合わせにより、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．（３^ｒｄ ｅｄ．１９９７）を参照されたい）。一本鎖抗体または組み換え抗体の生成のための技術（米国特許第４，９４６７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するように適合させてもよい。さらに、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物等の他の有機体を使用して、ヒト化抗体またはヒト抗体を発現することもできる（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８２６（１９９６）、およびＬｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい）。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマー性Ｆａｂフラグメントを識別することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）を参照されたい）。抗体はまた、二特異性、すなわち、２つの異なる抗原を認識することができるようにすることもできる（例えば、ＷＯ９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）、およびＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１：２１０（１９８６）を参照されたい）。抗体はまた、ヘテロ抱合体、例えば、２つの共有結合した抗体、または免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、ＷＯ９１／００３６０号、ＷＯ９２／２００３７３号、およびＥＰ０３０８９号を参照されたい）。

【0189】

非ヒト抗体をヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｉｎｇ）するための方法は、当該技術分野で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト源からそこに導入された、１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、移入残基と称され、これは、典型的に、移入可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび同僚らの方法（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい）に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列と置換することによって、行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少なく、非ヒト種の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されている、ヒト抗体である。

【0190】

代替的なアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含み、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用しているものもある。ミニ遺伝子座アプローチでは、外因性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座からの小片（個々の遺伝子座）を含めることにより、模倣される。したがって、１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子、１つ以上のＤ_Ｈ遺伝子、１つ以上のＪ_Ｈ遺伝子、μ定常領域、および通常は第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物に挿入するための構築物に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号、ならびにそれぞれ、Ｌｏｎｂｅｒｇ＆Ｋａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、および同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ＆Ｂｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号および同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、および同第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉ＆Ｄｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号、同第０７／５７５，９６２号、同第０７／８１０，２７９号、同第０７／８５３，４０８号、同第０７／９０４，０６８号、同第０７／９９０，８６０号、同第０８／０５３，１３１号、同第０８／０９６，７６２号、同第０８／１５５，３０１号、同第０８／１６１，７３９号、同第０８／１６５，６９９号、同第０８／２０９，７４１号に記載され、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１号、国際特許出願第ＷＯ９２／０３９１８号、同第ＷＯ９２／２２６４５号、同第ＷＯ９２／２２６４７号、同第ＷＯ９２／２２６７０号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／００５６９号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９６／１４４３６号、同第ＷＯ９７／１３８５２号、および同第ＷＯ９８／２４８８４号、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号もまた参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）もまた参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0191】

Ｋｉｒｉｎはまた、大きな染色体片または染色体全体が微小細胞の融合を通じて導入されている、マウス由来のヒト抗体の生成を例証した。欧州特許出願第７７３２８８号および同第８４３９６１号を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）との異種交配の結果であるＫＭ（商標）マウスが、生成されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖トランス遺伝子を有する（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，（２００２）４：９１−１０２）。

【0192】

ヒト抗体はまた、インビトロ法によりもたらすことができる。好適な例には、限定されないが、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（以前のＰｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）、リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイ等が挙げられる。

【0193】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖、ならびにＩｇＧ２重鎖を有する。抗体はまた、ＩｇＧ１を含む、他のヒトアイソタイプのものであってもよい。抗体は、典型的に、種々の技法により測定した場合に、約１０^−６〜約１０^−１３Ｍ以下のＫｄを有し、高い親和性を有した。

【0194】

一実施形態において、抗体は、「エフェクター」部分に抱合される。エフェクター部分は、放射標識または蛍光標識等の標識部分を含む、任意の数の分子であってもよく、または治療的部分であってもよい。

【0195】

本発明の抗体は、追加のアミノ酸残基に融合され得る。このようなアミノ酸残基は、おそらくは単離を促進するため、ペプチドタグであってもよい。抗体を特定の器官または組織に誘導するための他のアミノ酸残基もまた、企図される。

【0196】

本発明の別の態様において、抗ＥＧＦＲ抗体または抗体フラグメントは、抗腫瘍剤または検出可能なシグナル生成剤に、化学的または生合成的に結合され得る。以下に例示されるように、本発明の抗体は、ＥＧＦＲを有する細胞に結合すると、効率的に取り込まれる。抗体に結合される抗腫瘍剤は、抗体が結合されたか、または抗体が結合された細胞の環境において、腫瘍を破壊または損傷する、いずれの薬剤も含む。例えば、抗腫瘍剤は、化学療法剤または放射性同位体等の毒性剤である。好適な化学療法剤は、当業者に既知であり、アントラサイクリン（例えば、ダウノマイシンおよびドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン、およびカリチアマイシンが含まれる。化学療法剤は、従来の方法を使用して抗体に抱合される（例えば、Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ Ｓｅｉｌｅｒ，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８２：１９７−２１５（１９８８）を参照されたい）。

【0197】

検出可能なシグナル生成剤は、診断目的で、インビボおよびインビトロにおいて有用である。シグナル生成剤は、外部手段、通常は電磁放射の測定によって、検出することができる、測定可能なシグナルを生成する。ほとんどの場合、シグナル生成剤は、酵素または発色団であるか、または、蛍光、リン光、もしくは化学発光によって光を発する。発色団は、紫外または可視領域の光を吸収する染料を含み、酵素触媒反応の基質または分解生成物であってもよい。

【0198】

一態様において、抗体は、タンパク質の活性を調節する。このようなエフェクター部分には、限定されないが、抗腫瘍薬、毒素、放射性薬剤、サイトカイン、第２の抗体、または酵素が含まれる。さらに、本発明は、本発明の抗体が、プロドラッグを細胞毒性剤に変換する酵素に結合される、実施形態を提供する。

【0199】

免疫抱合体は、Ｎ−カドヘリン陽性細胞、特に、Ｎ−カドヘリンまたはＬｙ６タンパク質を発現する細胞に、エフェクター部分を標的化するために使用することができる。このような違いは、試験および対照試料をおおよそ同様に充填したゲルのバンドを見れば、容易に明らかとなり得る。細胞毒性剤の例には、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位体が挙げられる。好適な検出可能マーカーには、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素が含まれるが、これらに限定されない。

【0200】

上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、化学療法薬および／または放射線療法を、さらに施してもよい。いくつかの実施形態において、患者は、さらに、ホルモンアンタゴニスト療法を受ける。患者と抗体または抗体フラグメントとの接触は、患者に、抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、または皮内投与することによって行うことができる。いくつかの実施形態において、患者は、泌尿生殖器癌（例えば、膀胱癌、前立腺癌）を有する。上述のいくつかの実施形態において、患者は、前立腺癌を患い、任意で、さらに、患者ホルモンアブレーション療法を受ける。いくつかの実施形態において、接触は、癌または癌の転移に、抗体を直接投与することを含む。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリン（ａｒｂｒｉｎ）Ａ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、マイタンシノイド、およびグルココルチコイドリシンからなる群から選択され得る。

【0201】

さらに、本発明のモノクローナル抗体のいずれかの抗原結合領域を含む本発明の組み換えタンパク質は、癌の治療に使用することができる。このような状況において、組み換えタンパク質の抗原結合領域は、治療活性を有する第２のタンパク質の少なくとも機能的に活性な一部分に結合される。第２のタンパク質には、酵素、リンホカイン、オンコスタチン、または毒素が含まれるが、これらに限定されない。好適な毒素には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、リシン、アブリン、グルココルチコイド、および放射性同位体が含まれる。

【0202】

抗体を治療剤と抱合する技術は、周知である（例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい）。

【0203】

理解されるように、抗体は、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系に発現し得る。特定の抗体をコードする配列を使用して、好適な哺乳動物の宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（もしくはウイルスベクター）に封入すること、および宿主細胞にウイルス（もしくはベクター）を形質導入することを含む、いずれかの既知の方法によって、または、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる）に例証されるような、当該技術分野で既知のトランスフェクション手順によって、行うことできる。使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。非相同のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、電気穿孔法、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソームへの封入、およびＤＮＡの核への直接的な微量注入が含まれる。

【0204】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞は、当該技術分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および多数の他の細胞系を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系が含まれる。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有し、構造的ＥＧＦＲ結合特性を有する抗体を生成するかを判定することを通じて選択される。

【0205】

ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質（抗体等）は、おおよそ１ｎＭ未満、例えば、１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、１００ｐＭ〜１０ｐＭ、１０ｐＭ〜１ｐＭ、および／または１ｐＭ〜０．１ｐＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ＥＧＦＲに結合する。

【0206】

ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭアイソタイプのうち、少なくとも１つの免疫グロブリン分子を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖および／またはヒト重鎖を含む。ある特定の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭアイソタイプのものである。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、哺乳動物細胞での発現のために、クローニングされている。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭアイソタイプのいずれかの定常領域以外の定常領域を含む。

【0207】

ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖およびヒトＩｇＧ２重鎖を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖およびヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ重鎖を含む。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ２重鎖を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ重鎖を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ２アイソタイプの定常領域でもなくＩｇＧ４アイソタイプの定常領域でもない定常領域に連結される、抗体の可変領域を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、哺乳動物細胞での発現のために、クローニングされている。

【0208】

対照的に、ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体の機能的および／または化学的特徴における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートもしくはヘリカル構造としての、置換の範囲における分子の主鎖構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに対する効果が著しく異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の置換を選択することによって、達成することができる。

【0209】

例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に、影響がほとんどないか、または全くないように、天然のアミノ酸残基と非天然の残基との置換を伴い得る。さらに、ポリペプチド内の任意の天然残基はまた、「アラニンスキャニング突然変異生成」について前述のように、アラニンと置換することができる。

【0210】

所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、このような置換が所望される場合に、当業者によって判定することができる。ある特定の実施形態において、アミノ酸置換を使用して、ＥＧＦＲに対する抗体の重要な残基を識別するか、または本明細書に記載のようにＥＧＦＲに対する抗体の親和性を増加もしくは減少させることができる。

【0211】

ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系で発現し得る。ある特定の実施形態において、特定の抗体をコードする配列は、好適な哺乳動物の宿主細胞の形質転換に使用することができる。ある特定の実施形態によると、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（もしくはウイルスベクター）に封入すること、および宿主細胞にウイルス（もしくはベクター）を形質導入することを含む、いずれかの既知の方法によって、または、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる）に例証されるような、当該技術分野で既知のトランスフェクション手順によって、行うことできる。ある特定の実施形態において、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存し得る。非相同のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、電気穿孔法、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソームへの封入、およびＤＮＡの核への直接的な微量注入が含まれるが、これらに限定されない。

【0212】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞は、当該技術分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および多数の他の細胞系を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有し、構造的ＨＧＦ結合特性を有する抗体を生成するかを判定することを通じて、選択することができる。哺乳動物の宿主細胞のための適切な発現ベクターは、周知である。

【0213】

ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、１つ以上のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、種々の発現ベクター／宿主系のいずれかを利用して、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させることができる。このような系には、組み換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌等の微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）をトランスフェクトしたか、または細菌発現ベクターで形質転換した植物細胞系（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）；あるいは動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。

【0214】

ある特定の実施形態において、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含むポリペプチドは、酵母において組み換え発現される。ある特定のこのような実施形態では、市販入手可能な発現系、例えば、ピキア発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、製造業者の説明書に従って使用する。ある特定の実施形態において、このような系は、分泌を指示するために、プレプロα配列に頼る。ある特定の実施形態において、挿入物の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって行われる。

【0215】

ある特定の実施形態において、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含む、分泌されたポリペプチドは、酵母成長培地から精製される。ある特定の実施形態において、ポリペプチドを酵母成長培地から精製するために使用される方法は、細菌および哺乳動物の細胞上清からポリペプチドを精製するために使用されるものと同じである。

【0216】

ある特定の実施形態において、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含むポリペプチドをコードする核酸を、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の暴露ウイルス発現ベクターにクローニングする。ある特定の実施形態において、このようなベクターを、製造業者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用して、ｓＦ９タンパク質不含培地中でスポドプテラフルギペルダ細胞を感染させ、組み換えポリペプチドを生成することができる。ある特定の実施形態において、ポリペプチドを、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、このような培地から精製および濃縮する。

【0217】

ある特定の実施形態において、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含むポリペプチドを、昆虫系において発現させる。ポリペプチド発現のためのある特定の昆虫系は、当業者に周知である。１つのこのような系において、オートグラファカリフォルニアニュークレア多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、スポドプテラフルギペルダ細胞またはイラクサギンウワバの幼虫に、外来性遺伝子を発現させる。ある特定の実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸分子を、ウイルスの非必須遺伝子内、例えば、ポリヘドリン遺伝子内に挿入し、その遺伝子のプロモーターの制御下に置くことができる。ある特定の実施形態において、核酸分子挿入の成功は、非必須遺伝子を不活性にさせることになる。ある特定の実施形態において、この不活性化が、結果として、検出可能な特徴をもたらす。例えば、ポリヘドリン遺伝子の不活性化は、外被タンパク質を欠いたウイルスの生成をもたらす。

【0218】

ある特定の実施形態において、組み換えウイルスを使用して、スポドプテラフルギペルダ細胞またはイラクサギンウワバの幼虫を感染させることができる。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：５８４（１９８３）、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９１：３２２４−７（１９９４）を参照されたい。

【0219】

ある特定の実施形態において、細菌細胞において作製された１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含むポリペプチドは、細菌中の不溶性封入体として生成される。ある特定の実施形態において、このような封入体を含む宿主細胞を、遠心分離により収集し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて洗浄し、室温で１５分間、０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理する。ある特定の実施形態において、溶解物を、超音波処理により除去し、細胞残屑を、１２，０００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット状にする。ある特定の実施形態において、ポリペプチド含有ペレットを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁し、５０％グリセロール上に層を作り、６０００×ｇで３０分間遠心分離する。ある特定の実施形態において、このペレットを、Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含まない標準リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させてもよい。ある特定の実施形態において、ポリペプチドを、再懸濁させたペレットを変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分画することによって、さらに精製する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。ある特定の実施形態において、このようなゲルは、０．４Ｍ ＫＣｌ中に浸漬してタンパク質を可視化することができ、これを摘出し、ＳＤＳを含まないゲル泳動緩衝液中で電気溶出することができる。ある特定の実施形態によると、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、可溶性タンパク質として細菌において生成する。ある特定の実施形態において、このようなＧＳＴ融合タンパク質を、ＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して精製する。

【0220】

ある特定の実施形態において、ある特定のポリペプチド、例えば、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含むポリペプチドを、「再び折り畳む」ことが望ましい。ある特定の実施形態において、このようなポリペプチドを、本明細書に記載のある特定の組み換えシステムを使用して生成する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、所望の三次構造を形成する、および／またはジスルフィド結合を生成するために、「再び折り畳む」および／または酸化させる。ある特定の実施形態において、このような構造および／または結合は、ポリペプチドのある特定の生物学的活性に関連する。ある特定の実施形態において、再び折り畳むことは、当該技術分野で既知の多数の手順のいずれかを使用して達成される。例示的な方法には、可溶化ポリペプチド剤を、カオトロピック剤の存在下で、典型的に７を上回るｐＨに暴露することが含まれるが、これに限定されない。例示的なカオトロピック剤は、グアニジンである。ある特定の実施形態において、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤およびその還元剤の酸化形態を含有する。ある特定の実施形態において、還元剤およびその酸化形態は、ジスルフィド混合を発生させる、特定の酸化還元電位を生成するであろう比率で存在する。ある特定の実施形態において、このような混合は、システイン架橋の形成を可能にする。例示的な酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、共溶媒を使用して、再折り畳みの効率を高める。例示的な共溶媒には、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0221】

ある特定の実施形態において、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含むポリペプチドを、実質的に精製する。ある特定のタンパク質精製技術は、当業者に既知である。ある特定の実施形態において、タンパク質精製は、ポリペプチド画分を非ポリペプチド画分から粗分画することを伴う。ある特定の実施形態では、ポリペプチドを、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術を使用して精製する。例示的な精製方法には、硫酸アンモニウムでの沈降；ＰＥＧでの沈降；免疫沈降；熱変性に続いて遠心分離；親和性クロマトグラフィー（例えば、タンパク質−Ａ−セファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されないクロマトグラフィー；ゲル濾過；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ポリアクリルアミド電気泳動；ならびにこのような技術および他の技術の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ポリペプチドを、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、精製する。ある特定の実施形態において、精製ステップは変更することが可能であるか、またはある特定のステップを省略してもよく、依然として、実質的に精製されたポリペプチドの調製のための好適な方法をもたらす。

【0222】

ある特定の実施形態において、ポリペプチド調製物の精製の程度を、定量化する。精製の程度を定量化するためのある特定の方法は、当業者に既知である。ある特定の例示的な方法には、調製物の特異的結合活性を判定し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって調製物中のポリペプチドの量を評価することが含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を評価するためのある特定の例示的な方法は、調製物の結合活性を計算し、それを初期抽出物の結合活性と比較することを含む。ある特定の実施形態において、このような計算の結果は、「〜倍精製」として表される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実行される特定のアッセイに依存する。

【0223】

ある特定の実施形態において、１つ以上の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質自体を含むポリペプチドを、部分的に精製する。ある特定の実施形態において、部分的精製は、より少ない精製ステップ、または同じ一般精製スキームの異なる形態を利用することによって、達成することができる。例えば、ある特定の実施形態において、ＨＰＬＣ装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技法よりも、高い「倍精製」をもたらすことになる。ある特定の実施形態において、低い程度の精製をもたらす方法は、ポリペプチドの完全回収、またはポリペプチドの結合活性の維持に利点を有し得る。

【0224】

ある特定の事例において、ポリペプチドの電気泳動は、異なるＳＤＳ／ＰＡＧＥ条件では、しばしば著しく多様であり得る。例えば、Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７）を参照されたい。異なる電気泳動条件下では、精製または部分的に精製されたポリペプチドの見かけの分子量が異なる可能性がある。

【0225】

例示的なエピトープ
抗ＥＧＦＲ抗体が結合するエピトープが、説明されている。Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．，２６：１４５３６（２００８）、ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲエピトープに結合するか、またはＥＧＦＲ抗体エピトープに競合的に結合する抗原結合タンパク質が、有用である。

【0226】

ある特定の治療的使用および薬学的組成物
いくつかの実施形態において、１つを上回るＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を使用して、ＥＧＦＲ活性を調節する。

【0227】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、単独で投与する。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの他の治療剤の投与の前に投与する。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの他の治療剤の投与と同時に投与する。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの他の治療剤の投与に続いて、投与する。他の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの他の治療剤の投与の前に投与する。

【0228】

本発明の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、１つ以上の他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。組み合わせ療法の例については、例えば、米国特許第６，２１７，８６６号（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒら）（抗ＥＧＦＲ抗体と抗腫瘍剤との組み合わせ）、ＷＯ９９／６００２３号（Ｗａｋｓａｌら）（抗ＥＧＦＲ抗体と放射線との組み合わせ）を参照されたい。化学療法剤、放射線、またはそれらの組み合わせ等、任意の好適な抗腫瘍剤を使用することができる。抗腫瘍剤は、アルキル化剤または抗代謝剤であってもよい。アルキル化剤の例には、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンが挙げられるが、これらに限定されない。抗代謝剤の例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびパクリタキセル、ゲムシタビン、ならびにトポイソメラーゼ阻害剤であるイリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、およびトポテカン（トポイソメラーゼＩ）、およびエトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）（トポイソメラーゼＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。抗腫瘍剤が放射線である場合、放射線源は、治療されている患者に対して、外照（外照射療法−ＥＢＲＴ）または内照（小線源療法−ＢＴ）のいずれかであり得る。投与される抗腫瘍剤の用量は、例えば、薬剤の種類、治療される腫瘍の種類および重症度、ならびに薬剤の投与経路を含む、多数の因子に依存する。しかしながら、本発明は、いずれの特定の用量にも限定されないことが強調されるべきである。

【0229】

現在、当該技術分野で既知であるか、または検証中である抗腫瘍剤は、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤、挿入抗生剤、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物応答修飾物質、抗ホルモン、および抗血管新生剤を含む、種々のクラスに分類することができる。

【0230】

これらのクラスの中でも、本明細書に報告されたデータは、トポイソメラーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲに結合する抗体と組み合わせて使用する場合、特に効果的な抗腫瘍剤であることを示唆する。したがって、本発明の実施形態には、トポイソメラーゼ阻害剤を、ＥＧＦＲに結合する抗体と組み合わせて投与する方法が含まれる。この阻害剤は、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩの阻害剤であり得る。トポイソメラーゼＩ阻害剤には、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノ−カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、トポテカンが含まれる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤には、エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド（ＶＭ−２６）が含まれる。他の物質は、現在、トポイソメラーゼ阻害活性および抗腫瘍剤としての有効性に関して、検証中である。好ましい実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）である。組み合わせて使用される抗体は、ＥＧＦＲに結合し、以下の特性のうち少なくとも１つを有する、本発明の抗体である：（ｉ）ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害する、（ｉｉ）ＥＧＦによるＥＧＦＲの活性を中和する、（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ表面受容体を減少させる、および約１×１０^−１０Ｍ^−１以下のＫｄでＥＧＦＲに結合する。より好ましい実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせて使用される抗体は、上述のヒト抗体の特徴を有する。

【0231】

本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍成長または血管新生に関与する他の受容体を中和する抗体とともに、投与することができる。本発明の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体を、ＥＧＦＲに特異的に結合する受容体アンタゴニストと組み合わせて使用する。ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、そのリガンドのうち１つ以上の結合を遮断する、および／またはリガンドに誘発されるＥＧＦＲの活性化を中和する、抗原結合タンパク質が、特に好ましい。ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲのリガンドに結合し、ＥＧＦＲのそのリガンドへの結合を阻害する抗体であり得る。ＥＧＦＲのリガンドには、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、およびβセルリンが挙げられる。ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは、ＥＧＦＲに媒介される刺激をもたらす主要な内因性リガンドであると考えられるが、ＴＧＦ−αは、血管新生を促進することにおいて、より強力であることを示している。ＥＧＦＲアンタゴニストは、リガンドの結合を阻害すること可能もしくは不可能である、ＥＧＦＲの細胞外部分に外部から結合し得るか、チロシンキナーゼドメインに内部結合し得ることを理解されたい。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲアンタゴニストの例には、制限するものではなく、ＥＧＦＲに特異的な抗体（およびその機能的同等物）等の生体分子、およびＥＧＦＲの細胞質ドメイン上で直接機能する合成キナーゼ阻害剤等の小分子が挙げられる。

【0232】

このような受容体の別の例は、ＶＥＧＦＲである。本発明の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体を、ＶＥＧＦＲアンタゴニストと組み合わせて使用する。本発明の一実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体を、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１受容体に特異的に結合する受容体アンタゴニストと組み合わせて使用する。別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ受容体に特異的に結合する受容体アンタゴニストと組み合わせて使用する。ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインに結合し、それらのリガンドによる結合を遮断する（ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦによって最も強く刺激され、ＶＥＧＦＲ−１は、Ｐ１ＧＦによって最も強く刺激されるが、ＶＥＧＦによっても刺激される）、および／またはリガンドに誘発される誘発活性化を中和する、抗原結合タンパク質が、特に好ましい。例えば、ＩＭＣ−１１２１は、ＶＥＧＦＲ−２に結合し、それを中和するヒト抗体である（ＷＯ０３／０７５８４０号、Ｚｈｕ）。別の例は、ＭＡｂ６．１２であり、可溶性および細胞表面に発現するＶＥＧＦＲ−１に結合するｓｃＦｖである。ＳｃＦｖ６．１２は、マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ６．１２のＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインを含む。ＭＡｂ ６．１２を生成するハイブリドーマ細胞系は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの規定およびその規制（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）に基づいて、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３３４４として寄託されている。腫瘍形成に関与する成長因子受容体の他の例は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦＲ）の受容体である。

【0233】

さらなる代替的実施形態において、ＥＧＦＲ抗体は、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）等の１つ以上の好適なアジュバント、または、限定されないが、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチド等の他の免疫促進剤と組み合わせて投与することができる。例えば、Ｌａｒｒｉｖｅｅ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい。しかしながら、抗ＥＧＦＲ抗体単独の投与が、治療的に有効な方法において、腫瘍の進行を予防、阻害、または低減させるのに十分であることを理解されたい。

【0234】

組み合わせ療法において、抗ＥＧＦＲ抗体は、別の薬剤での治療を開始する前、最中、またはその後、ならびにこれらの組み合わせで、すなわち、抗腫瘍剤療法を開始する前および最中、前および後、最中および後、または前、最中、および後に、投与される。

【0235】

例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、放射線療法を開始する１〜３０日前、好ましくは３〜２０日前、より好ましくは５〜１２日前に投与され得る。本発明の好ましい実施形態において、化学療法は、抗体療法と同時、またはより好ましくは、それに続いて、施される。本発明の別の態様において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、１つ以上の抗腫瘍剤または抗血管新生剤と、化学的または生合成的に結合させてもよい。

【0236】

本発明は、さらに、標的またはレポーター分子が結合される、抗ＥＧＦＲ抗体を企図する。標的部分は、結合ペアの第１のメンバーである。抗腫瘍剤は、例えば、このようなペアの第２のメンバーと抱合され、それによって、抗ＥＧＦＲ抗体が結合される部位に向けられる。このような結合ペアの一般的な例は、アビジンとビオチンである。好ましい実施形態において、ビオチンを、抗ＥＧＦＲ抗体に抱合し、それによって、アビジンまたはストレプトアビジンに抱合された抗腫瘍剤または他の部分に対する標的を提供する。あるいは、ビオチンまたは別のこのような部分を、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体に結合させ、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンに抱合された診断システムにおいて、これをレポーターとして使用する。

【0237】

本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、予防または治療の目的で哺乳動物に使用される場合、薬学的に許容される担体を追加として含む、組成物の形態で投与されるであろうことが理解される。好適な薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの１つ以上、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容される担体は、保存可能期間または結合タンパク質の有効性を強化する、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤等、少量の補助物質をさらに含んでもよい。注射用組成物は、当該技術分野で周知のように、哺乳動物への投与後に、活性成分の迅速、持続、または遅延放出をもたらすように、製剤化することができる。

【0238】

本発明はまた、ヒト抗ＥＧＦＲ抗体の治療有効量を含む、腫瘍成長および／または血管新生を阻害するためのキットを含む。キットは、さらに、例えば、腫瘍形成または血管新生に関与する別の成長因子受容体（例えば、上述のＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＦＧＦＲ等）の任意の好適なアンタゴニストを含み得る。代替として、または追加として、本発明のキットは、抗腫瘍剤をさらに含んでもよい。本発明との関連で好適な抗腫瘍剤の例は、本明細書に記載されている。本発明のキットは、アジュバントをさらに含んでもよく、その例もまた、上述されている。

【0239】

さらに、当該技術分野で周知である調査または診断方法のためのインビボおよびインビトロでの本発明の抗体の使用が、本発明の範囲内に含まれる。診断方法には、本発明の抗体を含有するキットが含まれる。

【0240】

それに応じて、本発明の受容体抗体は、したがって、当該技術分野で周知の調査、診断、予防、または治療方法のために、インビボおよびインビトロで使用することができる。当然ながら、当業者によって本明細書に開示される本発明の原理に変更が加えられてもよいことが理解および想定され、このような修正は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。

【0241】

前述の抗体の有効量を、哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における腫瘍成長を治療する方法もまた、本発明によって提供される。ＥＧＦＲのシグナル伝達経路が、多種の癌の発達における原因要素であることは、広く例証されている。

【0242】

本発明において、任意の好適な方法または経路を使用して、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を投与し、さらに任意で抗腫瘍剤および／または他の受容体のアンタゴニストを共投与することができる。本発明によって利用される抗腫瘍剤のレジメンには、患者の腫瘍状態の治療に最適に好適であると見られる任意のレジメンが含まれる。異なる悪性腫瘍は、特異的抗腫瘍抗体および特異的抗腫瘍剤の使用を要し得、これは、患者毎に決定されることになる。投与の経路には、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が含まれる。投与されるアンタゴニストの用量は、例えば、アンタゴニストの種類、治療されている腫瘍の種類および重症度、ならびにアンタゴニストの投与経路を含む、多数の因子に依存する。しかしながら、本発明は、いずれの特定の投与方法または投与経路にも限定されないことを強調したい。

【0243】

本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、受容体に特異的に結合し、リガンド−毒素の取り込み後に毒性の致死量を送達する、抱合体として投与することができることに留意されたい。抗体−薬物／小分子抱合体は、互いに直接結合するか、またはリンカー、ペプチド、または非ペプチドを介して結合することができる。

【0244】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、特定の治療剤とともに使用して、種々の癌を治療する。ある特定の実施形態において、条件および所望の治療レベルを考慮して、２、３、またはそれ以上の薬剤を投与することができる。ある特定の実施形態において、このような薬剤は、同じ製剤に含めることによって、一緒に提供することができる。ある特定の実施形態において、このような薬剤は、別個に製剤化し、治療キットに含めることによって、一緒に提供することができる。ある特定の実施形態において、このような薬剤およびＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質は、別個に製剤化し、治療キットに含めることによって一緒に提供することができる。ある特定の実施形態において、このような薬剤は、別個に提供してもよい。ある特定の実施形態において、遺伝子療法により投与する場合、タンパク質剤および／またはＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子が、同じベクター内に含められてもよい。ある特定の実施形態において、タンパク質剤および／またはＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子が、同じプロモーター領域の制御下にあってもよい。ある特定の実施形態において、タンパク質剤および／またはＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子が、別個のベクター内にあってもよい。

【0245】

ある特定の実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントとともに含む、薬学的組成物を提供する。

【0246】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの炎症治療剤とともに使用することができる。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの免疫障害の治療剤とともに使用することができる。炎症および免疫障害の例示的な治療剤には、限定されないが、シクロオキシゲナーゼ１型（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害剤、３８ｋＤａマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子調節剤、炎症経路に関与する細胞内分子の小分子調節剤が含まれ、このような細胞内分子には、ｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、ＺＡＰ７０、およびｌｃｋが含まれるがこれらに限定されない。ある特定の例示的な炎症治療剤は、例えば、Ｃ．Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ＆Ｌ．Ｌ．Ｍｏｌｄａｗｅｒ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡに記載されている。

【0247】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つを上回って異なるＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を含むことになる。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つを上回ってＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を含むことになり、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質は、１つを上回るエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、種々の抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲへの結合について、互いに競合することはない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれも、薬学的組成物と一緒に合わせることができる。

【0248】

ある特定の実施形態において、許容される製剤材料は、好ましくは、採用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。いくつかの実施形態において、製剤材料（複数可）は、皮下および／または静脈内投与のためのものである。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸収、または浸透を、修正、維持、または保持するためのある特定の製剤材料を含有し得る。ある特定の実施形態において、好適な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン等）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸等）；増量剤（マンニトールもしくはグリシン）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、もしくヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリン等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等）；着色、香味、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウム等）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素等）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトール等）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）等）；安定性強化剤（スクロースもしくはソルビトール等）；等張性強化剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム等、マンニトール、ソルビトール等）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、ならびに／または薬学的アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈ Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５）。いくつかの実施形態において、製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭ ＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭ ＮａＣｌ；および／または１０ｍＭ ＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。

【0249】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質および／または治療用分子は、当該技術分野で既知の半減期延長ビヒクルに結合される。このようなビヒクルには、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、抗原結合タンパク質のグリコシル化）、およびデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号、現在では米国特許第６，６６０，８４３号、および公開済みのＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２５０４４号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。

【0250】

ある特定の実施形態において、最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与の経路、送達の形式、および所望される投与量に応じて、当業者によって決定されることになる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記）を参照されたい。ある特定の実施形態において、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。

【0251】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に水溶性または非水溶性のいずれかであり得る。例えば、ある特定の実施形態において、好適なビヒクルまたは担体は、注射については水であってもよく、非経口投与については、場合によっては組成物に一般的な他の材料が補充された生理食塩水または人工脳骨髄液であってもよい。いくつかの実施形態において、生理食塩水は、等張性リン酸緩衝生理食塩水を含む。ある特定の実施形態において、中性緩衝生理食塩水、または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的ビヒクルである。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これは、さらに、ソルビトールまたはその好適な代替物を含み得る。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで含む組成物は、所望される程度の純度を有する選択された組成物を、任意の製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記））と混合することによって、凍結乾燥した固形物または水溶液の形態で、保存用に調製することができる。さらに、ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで含む組成物は、スクロース等、適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。

【0252】

薬学的製剤、特に、本発明で使用するための抗体および免疫抱合体および阻害剤のものは、所望される程度の純度を有する抗体を、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、調製することができる。このような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）、保存剤、低分子量ポリペプチド；血清アルブミンもしくはゼラチン等のタンパク質、またはポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；ならびにアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤であり得る。抗体は、０．５〜２００ｍｇ／ｍｌ、または１０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化することができる。

【0253】

製剤はまた、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤、および抗ホルモン剤を含む、さらなる活性化合物を提供し得る。活性成分はまた、持続放出製剤として調製することもできる（例えば、固形疎水性ポリマー（例えば、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチドの半透過性マトリックス。抗体および免疫抱合体はまた、例えば、液滴形成技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に、封入することもできる。

【0254】

組成物は、治療的または予防的治療のために投与することができる。治療用途では、組成物を、「治療有効量」で、疾患（例えば、癌）を患う患者に投与する。この使用に有効な量は、疾患の重症度および患者の全体的な健康状態に依存することになる。組成物の単回または複数回投与は、患者に必要かつ耐容性である投与量および頻度に応じて、投与することができる。本発明の目的での「患者」または「対象」とは、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物を含む。したがって、本方法は、ヒトの治療法および獣医学的用途の両方に適用可能である。好ましい実施形態において、患者は、哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい実施形態では、患者は、ヒトである。他の既知の癌療法を、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明による使用のための組成物はまた、例えば、ＳＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサート等の他の癌治療剤に、細胞を標的化または感作するために使用することができる。

【0255】

ある特定の実施形態において、本薬学的組成物を、非経口送達のために選択することができる。ある特定の実施形態において、本組成物を、吸入、または経口等の消化管を通じた送達に選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。

【0256】

ある特定の実施形態において、製剤の構成成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。ある特定の実施形態において、緩衝液を使用して、生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８の範囲内のｐＨに組成物を維持する。

【0257】

ある特定の実施形態において、非経口投与が企図される場合、治療的組成物は、所望のＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、追加の治療剤ありまたはなしで、薬学的に許容されるビヒクル中に含む、発熱物質不含の非経口で許容される水溶液の形態であり得る。ある特定の実施形態において、非経口注射のためのビヒクルは、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで、滅菌の等張溶液として製剤化され適正に保存された、滅菌蒸留水である。ある特定の実施形態において、調製は、所望される分子を、生成物の制御放出または持続放出を提供することができ、蓄積注射を介して送達することができる、注射可能なマイクロスフェア、生体浸食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸等）、ビーズ、またはリポソーム等の薬剤と製剤化することを伴い得る。ある特定の実施形態において、ヒアルロン酸もまた使用可能であり、循環血液中での持続期間を促進する効果を有し得る。ある特定の実施形態において、埋め込み可能な送達装置を使用して、所望の分子を導入することができる。

【0258】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物を、吸入のために製剤化することができる。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで含む、吸入溶液は、エアロゾル送達のために噴射剤とともに製剤化されてもよい。ある特定の実施形態において、溶液は、噴霧することができる。肺内投与は、さらに、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に記載され、これは、化学修飾されたタンパク質の肺内送達について記載している。

【0259】

ある特定の実施形態において、製剤を、経口投与することが可能であることが企図される。ある特定の実施形態において、この形式で投与される、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで、錠剤およびカプセル等の固形剤形の構成に習慣的に使用される、担体ありまたはなしで、製剤化することができる。ある特定の実施形態において、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化され、全身前の分解が最小化される、胃腸管内の時点で、製剤の活性部分を放出するように設計することができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの追加の薬剤は、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質および／または任意の追加の治療剤の吸収を促進するために含まれ得る。ある特定の実施形態において、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤の崩壊剤、および結合剤もまた、採用可能である。

【0260】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質の有効量を、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中に含み得る。ある特定の実施形態において、滅菌水または別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解することによって、溶液を、単位用量形態に調製することができる。ある特定の実施形態において、好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸塩、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤、デンプン、ゼラチン、またはアカシア等の結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石等の潤滑剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0261】

追加の薬学的組成物は、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの追加の治療剤（複数可）ありまたはなしで持続または制御送達剤形に含む製剤を含み、当業者には明白であろう。ある特定の実施形態において、リポソーム担体、生体浸食性微粒子または多孔質ビーズ、および蓄積注射等、種々の他の持続または制御送達手段を構成するための技術はまた、当業者に既知である。例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたく、これは、薬学的組成物の送達のための多孔質ポリマーの制御放出について記載している。ある特定の実施形態において、持続放出性調製物は、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態で、半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国第３，７７３，９１９号およびＥＰ０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記））、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８号）を含み得る。ある特定の実施形態において、持続放出性組成物はまた、リポソームを含んでもよく、これは、当該技術分野で既知の複数の方法のいずれかによって調製することができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）、ＥＰ０３６，６７６号、ＥＰ０８８，０４６号、およびＥＰ１４３，９４９号を参照されたい。

【0262】

インビボでの投与に使用される薬学的組成物は、典型的に、滅菌である。ある特定の実施形態において、これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成することができる。ある特定の実施形態において、組成物が凍結乾燥されている場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに行うことができる。ある特定の実施形態において、非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保管することができる。ある特定の実施形態において、非経口組成物は、概して、滅菌のアクセスポートを有する容器、例えば、静脈注射溶液バッグ、または皮下注射針によって刺し通すことが可能な栓を有するバイアルに入れられる。

【0263】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物が製剤化された時点で、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または乾燥もしくは凍結乾燥させた粉末として、滅菌バイアル中に保管することができる。ある特定の実施形態において、このような製剤は、すぐに使用可能な形態、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保管することができる。

【0264】

ある特定の実施形態において、単回用量の投与単位を生成するために、キットが提供される。ある特定の実施形態において、キットは、乾燥したタンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。ある特定の実施形態において、単一および複数のチャンバを有する事前充填したシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが、含まれる。

【0265】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を、少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで含む、治療的に採用される薬学的組成物の有効量は、例えば、治療内容及び目的に依存することになる。当業者であれば、ある特定の実施形態による治療のための適切な投与量レベルが、したがって、部分的に、送達される分子、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質が少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで使用される適応症、投与の経路、ならびに患者の寸法（体重、体表または器官の寸法）および／または状態（年齢および全体的な健康）に応じて、多様であることを理解するであろう。ある特定の実施形態において、臨床医は、最適な治療効果を得るように、投与量の設定および投与経路の変更を行うことができる。ある特定の実施形態において、典型的な投与量は、上述の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲に及び得る。ある特定の実施形態において、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及び得る。

【0266】

ある特定の実施形態において、投与の頻度は、使用される製剤におけるＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質および／または任意の追加の治療剤の薬物動態パラメータを考慮することになる。ある特定の実施形態において、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで、組成物を投与することになる。ある特定の実施形態において、組成物は、したがって、単回用量として、または継時的に２回以上の用量（同量の所望の分子を含有してもよく、またはしなくてもよい）として、または埋め込み装置またはカテーテルを介した連続的注入として、投与することができる。適切な投与量のさらなる細分化は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に行われる業務の範囲内である。ある特定の実施形態において、適切な投与量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認することができる。

【0267】

ある特定の実施形態において、薬学的組成物の投与経路は、既知の方法に従ったもの、例えば、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路による注射を通じてのもの、持続放出システムまたは埋め込み装置によるものである。ある特定の実施形態において、本組成物は、ボーラス注入によって、連続的に注入によって、または埋め込み装置によって、投与することができる。

【0268】

ある特定の実施形態において、本組成物は、所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジ、または他の適切な物質への埋め込みを介して、局所的に投与することができる。ある特定の実施形態において、埋め込み装置を使用する場合、装置は、任意の好適な組織または器官に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、核酸、徐放性ボーラス、または連続的投与を介して行うことができる。

【0269】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで含む、薬学的組成物を、エキソビボ形式で使用することが望ましい場合がある。このような事例において、患者から取り出された細胞、組織、および／または器官を、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質を少なくとも１つの追加の治療剤ありまたはなしで含む薬学的組成物に暴露し、その後で、細胞、組織、および／または器官を、続けて、患者に埋め込んで戻す。

【0270】

ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合タンパク質および／または任意の追加の治療剤は、本明細書に記載の方法を使用して、ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作したある特定の細胞を埋め込むことによって送達することができる。ある特定の実施形態において、このような細胞は、動物またはヒトの細胞であってもよく、自己、非相同、または異種であり得る。ある特定の実施形態において、細胞を不死化することができる。ある特定の実施形態において、免疫学的応答の可能性を減少させるために、細胞を、カプセル封入して、周辺組織の浸潤を回避することができる。ある特定の実施形態において、カプセル封入の材料は、典型的に、タンパク質生成物（複数可）の放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を阻止する、生体適合性、半透過性ポリマー封入物または膜である。

【0271】

診断的適用
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲのレベルの変化と関連する疾患または障害をスクリーニング／診断するために、哺乳動物組織または細胞中のＥＧＦＲの検出のためのアッセイキットおよび／または方法において使用または提供される。キットは、ＥＧＦＲに結合する抗原結合タンパク質、ならびに抗原結合タンパク質のＥＧＦＲへの結合、および、存在する場合は、任意にＥＧＦＲタンパク質レベルを示すための方法を含む。抗原結合タンパク質の存在を示すための種々の方法が、使用可能である。例えば、フルオロフォア、他の分子プローブ、または酵素を、抗原結合タンパク質に結合させることができ、抗原結合タンパク質の存在を、種々の方法で観察することができる。このような障害のスクリーニング方法は、キットの使用を伴い得るか、または開示される抗原結合タンパク質のうちの１つの単純な使用、および抗原結合タンパク質が試料中のＥＧＦＲに結合するかどうかの判定を伴い得る。当業者には理解されるように、高いかまたは上昇したＥＧＦＲレベルは、試料中のＥＧＦＲに結合している抗原結合タンパク質の量がより多いことにつながるであろう。したがって、抗原結合タンパク質の結合の程度は、試料中にあるＥＧＦＲの量の判定に使用することができる。所定の量（例えば、ＥＧＦＲ関連障害を有しない人物が有するであろう量または範囲）を上回る量のＥＧＦＲを有する対象または試料は、ＥＧＦおよび／またはＥＧＦＲ媒介性障害を有するとして特徴づけることができる。

【0272】

関連するパニツムマブのアミノ酸および核酸配列、ならびにそれぞれの突然変異体を、表２に記載する。

【0273】

【表2】

【0274】

前述の明細書は、当業者が本発明を実践することを可能にするためには十分であるとみなされる。上述の説明および例は、本発明のある特定の好ましい実施形態について詳述し、発明者らによって企図された最良の形態を記載する。しかしながら、前述のものがどれほど詳しく記載されていようとも、本発明は、多数の方法によって実践することができ、本発明が、添付の特許請求の範囲およびその全ての均等物に従って解釈されるべきであることを理解されたい。

【0275】

行われた実験および得られた結果を含む、以下の実施例は、例示の目的でのみ提供され、本発明を限定するとして解釈されるものではない。

【実施例】

【0276】

実施例１
突然変異生成
パニツムマブ（配列番号１および２）の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、突然変異生成の出発物質として使用した。ＰＣＲのプライマーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（現Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）からのＱｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して、部位特異的突然変異生成を行うように設計した。製造業者の手順に従って、ＰＣＲ反応を、オリゴヌクレオチドを使用して構築し、それを使用して、ＸＬ−Ｇｏｌｄウルトラコンピテント細胞（ｕｌｔｒａ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を形質転換させた。これらの細胞を、次いで、ＴＩＭ選択的プレートに蒔いた。このプレートを、一晩３７℃で放置し、コロニーを形成させた。各構築物から２つのコロニーを採取し、ＴＩＭプレートで再ストリークした。各構築物の１つのコロニーを、次いで、マキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）用に構築した。マキシプレップに配列決定を行い、１００％一致した。Ｓａｌ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉでの消化をマキシプレップに行い、目的のフラグメントを選択した。２つの制限末端を、Ｓａｌ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉで消化させたｐＤＣ４１４に連結させた。新しい連結を、ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に形質転換させ、ＴＩＭ選択プレート上に蒔いた。プレートを、次に、３７℃で一晩放置し、コロニーを形成させた。複数のコロニーを、挿入について試験するために消化させた。各突然変異に対して１つのマキシプレップを作製した：ｐＤＣ４１４−ＡＭＧ９５４ Ａｓｐ９２−Ｇｌｕ、およびｐＤＣ４１４−ＡＭＧ９５４ Ａｓｐ９２−Ａｓｎ。マキシプレップに配列決定を行い、１００％一致した。メガプレップを、２９３（Ｅ）細胞を使用して一過的にトランスフェクトした。細胞を７日間培養し、その後で採取した。発現された抗体を、プロテインＡカラムおよび標準技術を使用して上清から精製した。

【0277】

エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃおよびトリプシンペプチドマップ
結果として得られた分子を、次いで、変性させて還元し、スルフヒドリルをアルキル化した。還元してアルキル化した分子を、ゲル濾過によって脱塩し、次いで、酵素的に脱グリコシル化した。還元してアルキル化し、脱グリコシル化した分子を、次いで、Ｌｙｓ−Ｃまたはトリプシンエンドプロテアーゼで消化させた。反応物に、反応停止処理を行い、結果として得られたフラグメントを、Ｌｙｓ−Ｃ消化にはポリマーカラム（Ｇｒａｃｅ−Ｖｙｄａｃ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を使用し、トリプシン消化にはＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、アセトニトリル／ＴＦＡ勾配中で逆相ＨＰＬＣによって分離した。ペプチド溶出を、ＵＶ検出によって監視した。Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップによって検出された、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）Ｄ９２異性化の結果を、図１に記載する。

【0278】

実施例２
構造モデル
Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）の構造を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）ソフトウェア（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用して分析した。異性化を、ＭＯＥ内で、必要な原子結合を切断および形成することによって、手作業でモデル化した。特異的突然変異を、ＭＯＥモデリングソフトウェアに組み込まれた突然変異能力を使用して、モデル化した。結果を、図２に記載する。

【0279】

実施例３
加速安定性研究
Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）の安定性研究を、５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウム中で、ｐＨ５．８で６か月間、３７℃で行った。異性化を加速させるために、突然変異体を、ｐＨ５．０で、１０ｍＭグルタミン酸、２．６％ｗ／ｖグリセロール中に緩衝液交換し、５０℃で４週間、昇温に供した。結果を図３に記載する。

【0280】

実施例４
バイオアッセイ
リン酸化バイオアッセイ。使用したリン酸化バイオアッセイは、ＥＧＦに誘導されたＥＧＦ受容体のチロシンリン酸化の検出に基づいたものであった。Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）は、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦ結合を阻害し、したがって、受容体のリン酸化を阻害する。細胞表面ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞を、固定量のＥＧＦおよび種々の量のＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）とともにマイクロタイタープレート中でインキュベートした。細胞を、溶解し、可溶性ＥＧＦ受容体を、抗ＥＧＦ受容体抗体でコーティングした第２のマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート上で捕捉した。リン酸化されたＥＧＦ受容体を、ＨＲＰと抱合された抗ホスホチロシン抗体、続いて発色性基質の添加を用いて検出した。色の展開を、次いで、吸光プレートリーダーを使用して測定した。相対的有効性を、平行線分析によって判定した。

【0281】

遺伝子発現バイオアッセイ。３２Ｄ ＭＲＥ−１／Ｓ＃１３細胞を、１０％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ ｍＩＬ−３、５００ｕｇ／ｍＬ Ｇ４１８、および７００ｕｇ／ｍＬハイグロマイシン−Ｂを含有する、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、懸濁培養物として成長させた。細胞のアッセイフラスコを、遠心分離およびリン酸緩衝食塩水での洗浄によって成長培地成分を排除して、使用のために調製した。細胞を、次いで、８Ｅ＋０５細胞／ｍＬで、アッセイ培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁させた。

【0282】

参照標準物、対照、および試験試料を、アッセイ培地中で４４０ｎｇ／ｍＬに希釈した。参照標準物、対照、試験試料の連続希釈物を、４４０〜８７ｎｇ／ｍＬの濃度範囲が得られるように調製した。これらの希釈物の調製に続いて、等体積の固定濃度のＴＧＦ−αを、各管に添加した。アッセイウェル中の最終濃度は、細胞の添加後、１１０〜２２ｎｇ／ｍＬのＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）であった。

【0283】

アッセイは、４つの９６ウェルプレートおよび部分的に無作為化した試料位置スキームを利用した。ＴＧＦ−αスパイクと混合した抗体の各連続希釈物２５μＬを、アッセイウェルに添加した。２５μＬのアッセイ培地を、細胞ブランクとして機能する、細胞のみのウェルに添加した。５０μＬのアッセイ培地を、培地ブランクとして機能する、培地のみのウェルに添加した。２５μＬのＴＧＦ−αスパイク対照を、バックグラウンドウェルに添加した（ＴＧＦ−αスパイク対照）。標準物、対照試料、試験試料、バックグラウンド、および細胞のみのウェル全てに、次いで、８Ｅ＋０５細胞／ｍＬで、２５μＬの３２Ｄ ＭＲＥ−１／Ｓ ＃１３細胞懸濁液を、受容させた。プレートを、次いで、３７℃／５％ＣＯ_２加湿インキュベーターで３．５±０．５時間インキュベートした。

【0284】

インキュベーション期間の後、プレートをインキュベーターから取り出し、１０〜２０分間、室温に冷却した。５０μＬのＳｔｅａｄｙＧｌｏ（登録商標）（細胞を溶解するための界面活性剤およびルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを含有する試薬混合液）を、各ウェルに添加した。アッセイプレートを、次いで、露光量を最小にするように被覆し、室温で３０〜１２０分間インキュベートした。発光シグナルを、次いで、照度計を使用して定量化した。試験試料の活性を、試験試料の応答と参照標準物で得られた応答とを比較することによって、判定した。

【0285】

データを、平行線分析を使用して分析した。制御されたスプレッドシートにより、９５％の信頼限界で、対照および各試験試料を参照標準物と比較して、相対的有効性を計算する。スプレッドシートにより、参照標準物と対照および試験試料との対比について、分散分析（ＡＮＯＶＡ）表を構築することによって、相対的有効性を計算した。３つの有効性判定が、１つの試料に対する３回の独立したアッセイから得られ、加重平均の結果を、制御されたスプレッドシートを使用して、ＵＳＰ＜１１１＞に従って計算した。

【0286】

結果を、図４に記載する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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