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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5915982
(24)【登録日】2016年4月15日
(45)【発行日】2016年5月11日
(54)【発明の名称】イミダゾール誘導体
(51)【国際特許分類】
C07D 487/04 20060101AFI20160422BHJP
A01N 43/90 20060101ALI20160422BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20160422BHJP
C12P 17/18 20060101ALI20160422BHJP
【ＦＩ】
C07D487/04 144
C07D487/04CSP
A01N43/90 106
A01P21/00
C12P17/18 B
【請求項の数】4
【全頁数】14
(21)【出願番号】特願2013-512379(P2013-512379)
(86)(22)【出願日】2012年4月24日
(86)【国際出願番号】JP2012060989
(87)【国際公開番号】WO2012147750
(87)【国際公開日】20121101
【審査請求日】2015年4月14日
(31)【優先権主張番号】特願2011-99456(P2011-99456)
(32)【優先日】2011年4月27日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2011-154981(P2011-154981)
(32)【優先日】2011年7月13日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2012-41711(P2012-41711)
(32)【優先日】2012年2月28日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】304023318
【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100108257
【弁理士】
【氏名又は名称】近藤 伊知良
(74)【代理人】
【識別番号】100124800
【弁理士】
【氏名又は名称】諏澤 勇司
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】河岸 洋和
(72)【発明者】
【氏名】崔 宰熏
【審査官】
谷尾 忍
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１１／０１０６９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２００９−００１５５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
George A. IVANOVICS et al，The Synthesis of 2-substituted derivatives of 5-amino-1-.beta.-D-ribofuranosylimidazole-4-carboxamide. Ring Opening Reactions of 2-Azapurine Nucleosides，J. Org. Chem.，１９７４年，vol.39, no.25，p.3651-3654
【文献】
Elliott SHAW et al，IMIDAZO-1,2,3-TRIAZINES AS SUBSTRATES AND INHIBITORS FOR XANTHINE OXIDASE，J. Biol. Chem.，１９５２年，vol.194，p.641-654
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｄ ４８７／０４
Ａ０１Ｎ ４３／９０
Ｃ１２Ｐ １７／１８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択される化合物：
（Ａ）３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン；
（Ｂ）３−メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン。
（Ａ）３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン；
（Ｂ）３−メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン。
【請求項2】
請求項１に記載の化合物を含む、植物生長調節剤。
【請求項3】
７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４（３Ｈ）−オンにキサンチンオキシダーゼを作用させて、３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンを得る、
３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンの製造方法。
３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンの製造方法。
【請求項4】
植物体を抽出して抽出物を調製する工程と、
前記抽出物から３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンを単離する工程と、を含む、
３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンの製造方法。
前記抽出物から３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンを単離する工程と、を含む、
３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イミダゾール誘導体に関する。【背景技術】
【0002】
植物の生長を調節する化合物として、例えば植物ホルモンが知られている。植物ホルモンは植物自体に由来するが、化合物として合成でき、農薬及び活力剤として役立てられている。このような植物の生長を調節する化合物として、特許文献１〜４には、イミダゾール誘導体が記載されている。例えば、特許文献４には、７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４（３Ｈ）−オン（別名：２−アザヒポキサンチン、以下場合により「ＡＨＸ」と称する）が記載されており、ＡＨＸが植物に対して生長促進又は生長抑制作用を示すことが記載されている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開昭６３−１０４９６５号公報
【特許文献2】特開昭６３−６８５７０号公報
【特許文献3】特開平４−２１０６８０号公報
【特許文献4】特許第４５６５０１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ＡＨＸのように植物の生長を調節でき、さらに、農薬又は活力剤として農業及び園芸に用いることのできる化合物が求められている。そこで本発明は、植物の生長を調節できる新たな化合物を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、ＡＨＸの研究の過程で、ＡＨＸと同様の植物生長調節作用を有するＡＨＸ代謝産物、すなわち、３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン（別名：２−アザ−８−オキソ−ヒポキサンチン、以下、場合により「ＡＯＨ」と称する）を発見した。また、ＡＯＨから３−メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン（以下、場合により「３−メチルＡＯＨ」）を合成し、３−メチルＡＯＨも植物生長調節作用を有することを発見した。すなわち、本発明は、下記（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択される化合物を提供する。（Ａ）３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン
（Ｂ）３−メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン
【0006】
また、本発明は、上記（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択される化合物を含む植物生長調節剤を提供する。本発明の化合物は、植物の生長を大幅に促進することができるため、該化合物を植物生長調節剤として有効に用いることができる。【0007】
また、本発明は、ＡＨＸにキサンチンオキシダーゼを作用させて、ＡＯＨを得る、ＡＯＨの製造方法を提供する。上記製造方法によれば、ＡＯＨを高収率で簡単に製造することが可能となる。【0008】
また、本発明は、植物体を抽出して抽出物を調製する工程と、抽出物からＡＯＨを単離する工程と、を含む、ＡＯＨの製造方法を提供する。上記製造方法によれば、酵素反応によらずＡＯＨを得ることができる。【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、植物の生長を調節できる化合物が提供される。【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、（Ａ）ＡＯＨ、すなわち、３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンを提供する。ＡＯＨは、下記式（Ｉ）で表される化合物である。【0012】
【化1】
【0013】
ＡＯＨは、ＡＨＸ、すなわち７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４（３Ｈ）−オンに、キサンチンオキシダーゼを作用させることにより、下記式（ＩＩ）の反応で得ることができる。【0014】
【化2】
【0015】
ＡＨＸからＡＯＨを製造するのに使用されるキサンチンオキシダーゼは、特に限定されず、例えば、バターミルク由来のキサンチンオキシダーゼを使用することができる。ＡＨＸにキサンチンオキシダーゼを作用させるには、例えば、ＡＨＸを反応溶媒に溶解させて反応溶液を作製し、該反応溶液にキサンチンオキシダーゼを添加すればよい。キサンチンオキシダーゼの添加量としては、特に限定されないが、例えば、ＡＨＸ１ｇに対して２０〜２００Ｕが好ましく、５０〜２００Ｕがより好ましく、１００〜２００Ｕがより好ましい。反応条件としては、特に限定されないが、例えば、キサンチンオキシダーゼの至適反応条件の範囲で作用させることができる。例えば、反応温度としては、２０〜３５℃が好ましく、２５〜３２℃がより好ましく、２８〜３０℃がさらに好ましい。また、例えば、反応時間としては、６〜５０時間が好ましく、２４〜５０時間がより好ましく、４８〜５０時間がさらに好ましい。また、反応溶媒としては、特に限定されないが、水又は緩衝液等の水系溶媒の反応溶媒が好ましく、緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝水、蒸留水等を使用することができる。また、反応溶液に反応活性化剤等の添加剤を加えてもよい。反応の終了後、反応溶液に対して適宜抽出、濃縮、精製、乾燥等の操作を行い、反応溶液から本発明のＡＯＨを得ることができる。【0016】
また、ＡＯＨは、植物体から製造することもできる。植物としては、ＡＯＨを産生する植物であれば特に限定されず、種子植物、シダ植物、又はコケ植物でもよく、種子植物としては裸子植物又は被子植物でもよく、被子植物としては単子葉植物でも双子葉植物でもよい。【0017】
このような植物として、具体的には、イネ科、ナス科、ツバキ科、キク科、バラ科、ユリ科等の植物を挙げることができる。これらの中でも、ＡＯＨの産生量が多い点から、イネ科又はナス科の植物であることが好ましい。前記イネ科植物としては、例えば、マダケ属、オオムギ属、コムギ属、イネ属、コヌカグサ属、シバ属、サトウキビ属、トウモロコシ属等を挙げることができ、この中でもイネ属が好ましく、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）であることがさらに好ましい。前記ナス科の植物としては、例えば、トマト属、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、チョウセンアサガオ属、ホオズキ属、ペチュニア属等を挙げることができ、この中でもトマト属が好ましく、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）であることがさらに好ましい。【0018】
ＡＯＨを産生する植物として、ＡＨＸを施用した植物を用いてもよい。植物にＡＨＸを施用すると、ＡＨＸ代謝産物としてＡＯＨが産生される。このＡＯＨを植物体から単離してもよい。ＡＨＸを植物に施用すれば、植物が通常産生するよりも多くのＡＯＨが植物から産生される。【0019】
植物体からＡＯＨを製造する方法としては、植物体を抽出して抽出物を調製する工程と、抽出物からＡＯＨを単離する工程と、を含む方法を用いることができる。植物体を抽出して抽出物を調製する方法は、特に限定されないが、例えば、ＡＯＨを含む植物体の植物器官を採取し、該植物器官を破砕し、破砕物をエタノール又はアセトン等の有機溶媒等で抽出して抽出物を調製する方法が挙げられる。抽出物からＡＯＨを単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、得られた抽出物に対して適宜濃縮、精製、乾燥等の操作を行い、本発明のＡＯＨを単離することができる。【0020】
ＡＯＨを含む植物器官としては、特に限定されず、植物体全体でもよく、根、茎、葉、花、生殖器官、種子のいずれでもよく、さらに、培養細胞でもよい。これらの中でも、ＡＯＨを多く含む点から、根であることが好ましい。【0021】
また、本発明は、（Ｂ）３−メチルＡＯＨ、すなわち、３−メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンを提供する。３−メチルＡＯＨは、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物である。【0022】
【化3】
【0023】
３−メチルＡＯＨは、ＡＯＨをメチル化することにより合成することができ、例えば、実施例に記載の方法により合成することができる。【0024】
ＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨによれば、植物の生長を調節することが可能となる。本発明における植物の生長には、植物細胞の通常の分化又は増殖を伴う現象であれば特に限定されず、植物体を構成する器官の伸張、拡大のみならず、種子からの発芽、花芽形成、種子形成なども含まれる。ＡＯＨ及び３−メチルＡＯＨは、対象となる植物の種類、ＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨの濃度及びＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨが接触する植物部位によって、植物の生長を促進又は抑制することができる。したがって、ＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨを含む植物生長調節剤を、対象植物と目的に応じて、植物の種々の器官の生長促進剤として又は生長抑制剤として用いることが可能である。【0025】
対象となる植物としては、ＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨにより生長調節作用を受ける植物であれば特に限定されず、種子植物、シダ植物、又はコケ植物でもよく、種子植物としては裸子植物又は被子植物でもよく、被子植物としては単子葉植物でも双子葉植物でもよい。【0026】
このような植物として、具体的には、イネ科、ナス科、ツバキ科、キク科、バラ科、ユリ科等の植物を挙げることができる。これらの中でも、ＡＯＨによる生長調節作用が著しい点から、イネ科の植物であることが好ましい。前記イネ科植物としては、例えば、マダケ属、オオムギ属、コムギ属、イネ属、コヌカグサ属、シバ属、サトウキビ属、トウモロコシ属等を挙げることができ、この中でもイネ属又はシバ属が好ましい。【0027】
対象となる植物器官としては、特に限定されず、根、茎、葉、花、生殖器官、種子のいずれでもよく、さらに、培養細胞でもよい。これらの中でも、ＡＯＨによる生長調節作用が著しい点から、根、茎、葉又は種子であることが好ましい。【0028】
植物に適用するＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨの濃度及び接触方法は、対象となる植物の種類、その器官及び目的等に応じて適宜調整可能である。例えば、対象植物をイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）とし、対象器官を茎とし、茎の長さを伸張させることを目的とする場合、通常の培養液にＡＯＨが５〜２０００μＭとなるように溶解した培養液で栽培することが好ましい。この場合、培養液中のＡＯＨの濃度は、より好ましくは１００〜１５００μＭであり、さらに好ましくは５００〜１０００μＭである。また、対象植物をイネとし、対象器官を根とし、根の長さを伸張させることを目的とする場合、通常の培養液にＡＯＨが５０〜２０００μＭとなるように溶解した培養液で栽培することが好ましい。この場合、培養液中のＡＯＨの濃度は、より好ましくは２５０〜１５００μＭであり、さらに好ましくは５００〜１０００μＭである。また、対象植物をイネとし、対象器官を種子とし、種子の大きさ又は数を増大させることにより、種子の収量を増大させることを目的とする場合、通常の培養液にＡＯＨが５〜１０００μＭとなるように溶解した培養液で栽培することが好ましい。また、同じようにイネの種子の収量を増大させることを目的とする場合、イネを土耕栽培して、ＡＯＨが５〜５００μＭとなるように溶解した培養液を施用することも好ましい。【0029】
また、３−メチルＡＯＨでは、例えば、対象植物をイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）とし、対象器官を根とし、根の長さを伸張させることを目的とする場合、通常の培養液に３−メチルＡＯＨが５０〜１０００μＭとなるように溶解した培養液で栽培することが好ましい。この場合、培養液中の３−メチルＡＯＨの濃度は、より好ましくは２００〜５００μＭである。【0030】
本発明のＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨを含む植物生長調節剤は、ＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨの他に、殺菌剤、防黴剤、殺虫剤、或いは、ＡＯＨ又は３−メチルＡＯＨ以外の植物生長調節作用を有する化合物を含有していてもよい。さらに、公知の製剤用添加剤を含有していてもよい。このような製剤用添加剤としては、特に限定されないが、例えば、賦形剤、乳化剤、湿潤剤を使用することができる。また、本発明の植物生長調節剤の剤型は特に限定されないが、例えば、乳剤、水和剤、水溶剤、液剤、粒剤、粉剤、マイクロカプセル、燻蒸剤、燻煙剤、エアゾール、フロアブル剤、ペースト剤、錠剤、塗布剤、微量散布用剤、油剤、複合肥料とすることができ、対象となる植物、その器官及び目的等に応じて、使用者が適宜選択することができる。このような剤型の植物生長調節剤は、公知の方法により製造することができる。【実施例】
【0031】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【0032】
（実施例１．シバのＡＨＸ代謝産物の検出）シバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）を、通常の寒天培地（１００ｍＬ）のコントロール区と、１ｍＭ ＡＨＸ（１００ｍＬ）を添加した寒天培地のＡＨＸ区とで、３０日間栽培した。ＡＨＸ区のシバは、コントロール区のシバと比較して明らかにシュートの伸長が促進されていた。栽培したシバのシュート及び根を採取し、エタノールで抽出し、シュートの抽出液と、根の抽出液を逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に供した。分析条件は、カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５カラム（サイズ４．６×２５０ｍｍ）、流速：０．５ｍＬ／分、移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸（Ａ液）中２％メタノール １２分；Ａ液中２−１００％メタノール １２０分；１００％メタノール ２０分；のグラジエント溶出、検出：ＵＶ２５４ｎｍの吸光度測定である。図１に、クロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを示す。ＡＨＸ区のシュート抽出液の溶出液からは、ＡＨＸのピークは検出されず、ＡＨＸ代謝産物のピークが検出された（図１（ｂ））。また、ＡＨＸ区の根抽出液の溶出液からは、ＡＨＸ及び上記ＡＨＸ代謝産物のピークが検出された（図１（ｄ））。根抽出液の溶出液には根中のＡＨＸ代謝産物以外に、培地中のＡＨＸが混入しているからだと考えられる。コントロール区のシュート及び根抽出液の溶出液からは、ＡＨＸのピークもＡＨＸ代謝産物のピークも検出されなかった（図１（ａ）及び（ｃ））。
【0033】
（実施例２．イネのＡＨＸ代謝産物の検出）イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）を、通常の培養液のコントロール区と、通常の培養液に０．２ｍＭとなるようにＡＨＸを添加した培養液のＡＨＸ区とで、１４日間栽培した。ＡＨＸ区のイネは、コントロール区のイネと比較して明らかにシュートの伸長が促進されていた。栽培したイネのシュート及び根を採取し、実施例１と同様に抽出し、逆相ＨＰＬＣで分析した。図２に、クロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを示す。ＡＨＸ区では、シュート抽出液の溶出液からも、根抽出液の溶出液からも、ＡＨＸのピークは検出されず、ＡＨＸ代謝産物のピークが検出された（図２（ｂ）及び（ｄ））。コントロール区のシュート及び根抽出液の溶出液からは、ＡＨＸのピークもＡＨＸ代謝産物のピークも検出されなかった（図２（ａ）及び（ｃ））。
【0034】
（実施例３．ＡＨＸ代謝産物の単離）イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）を、通常の培養液のコントロール区と、通常の培養液に１ｍＭとなるようにＡＨＸを添加した培養液のＡＨＸ区とで、２０日間栽培した。栽培したイネのシュート（３６０ｇ）を採取し、エタノールで抽出し、エタノール可溶画分を減圧濃縮し、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン不溶画分をエタノールで抽出し、エタノール可溶画分（９．８ｇ）を得た。エタノール可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（充填剤：ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ ３５０ｇ、カラムサイズ：４×６０ｃｍ）に供し，ジクロロメタン：メタノール＝９：１，７：３，５：５で順次溶出し八つの画分を得た。そのうち画分３（２８８ｍｇ）をＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−１５／３０カラム、サイズ：５０×５００ｍｍ、流速：２５ｍＬ／分、移動相：５％メタノール、検出：ＵＶ３１０ｎｍ）及びＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５カラム、サイズ：２０×２５０ｍｍ、流速：５ｍＬ／分、移動相：１０％メタノール、検出：ＵＶ３１０ｎｍ）にて順次精製し、最終的に１０．５ｍｇのＡＨＸ代謝産物を単離した。
【0035】
（実施例４．Ｘ線結晶構造解析による構造の決定）単離したＡＨＸ代謝産物について、以下のようにしてＸ線結晶構造解析をおこなった。ＳＰｒｉｎｇ−８（単結晶構造解析ビームラインＢＬ０２Ｂ１）を用いて単結晶Ｘ線回折測定を行った。測定条件は、波長：０．８２６０（４）Å、ビームサイズ：縦１４０×横１５９ｕｍ２、Ｐｈｏｔｏｎ Ｆｌｕｘ：１．８１×１０８ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ、Ｐｈｏｔｏｎ Ｆｌｕｘ Ｄｅｎｓｉｔｙ：８．１３×１０３ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ／ｕｍ２である。図３は、Ｘ線結晶構造解析により得られた、ＡＨＸ代謝産物の結晶構造を示す図である。Ｘ線結晶構造解析より、単離したＡＨＸ代謝産物が、式（Ｉ）の構造を有する３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］［１，２，３］トリアジン−４，６（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン（別名：２−アザ−８−オキソ−ヒポキサンチン、「ＡＯＨ」）であることが確認された。
【0036】
（実施例５．ＡＯＨの製造）以下のようにして、ＡＨＸにキサンチンオキシダーゼを作用させて、ＡＯＨを製造した。ＡＨＸ１３７ｍｇを、リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）１Ｌに溶かし、キサンチンオキシダーゼ（バターミルク由来、０．２８Ｕ／ｍｇ）２５ｍｇを添加し、３０℃で静置した。上記溶液に、２４時間後ごとに上記キサンチンオキシダーゼ２５ｍｇを３回添加した。最後の添加後，さらに２４時間静置した。すなわち総量では、ＡＨＸ１３７ｍｇにキサンチンオキシダーゼ１００ｍｇを９６時間作用させた。その結果、ＨＰＬＣ（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５カラム（サイズ４．６×２５０ｍｍ）、流速：０．５ｍＬ／分、移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸（Ａ液）中２％メタノール １２分；Ａ液中２−１００％メタノール １２０分；１００％メタノール ２０分；のグラジエント溶出、検出：ＵＶ２５４ｎｍの吸光度）の分析により、ＡＨＸがＡＯＨに完全に変換されたことが確認された。さらにＯＤＳゲルフラッシュクロマトグラフィー（充填剤：ＯＤＳｇｅｌ ３５０ｇ、カラムサイズ：４×６０ｃｍ、移動相：水、水／メタノール＝９：１）によって精製し、１２０ｍｇ（収率７８．４％）のＡＯＨを単離した。単離した物質がＡＯＨであることは、ＨＰＬＣの保持時間と吸収波長及び質量分析により確認した。
【0037】
（実施例６．イネに対するＡＯＨの影響）滅菌したイネ（日本晴れ）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の種子を、２８℃、３日間で発芽させた。コントロールの培養液、或いは、濃度の異なるＡＨＸ又はＡＯＨを添加した培養液を入れた試験管中で発芽種子を一つの試験管につき４粒ずつ、２８℃、１週間培養した。ＡＯＨは実施例５の方法で製造したものを用いた。コントロールの培養液の組成は、０．５ｍＭ ＮＨ４ＮＯ３、０．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣ１２、２３μＭ Ｆｅ−エチレンジアミン四酢酸（Ｆｅ−ＥＤＴＡ）、２５μＭ Ｈ３ＢＯ３、４．５μＭ ＭｎＳＯ４、０．１５μＭ ＣｕＳＯ４、０．３５μＭ ＺｎＳＯ４、０．０５μＭ Ｎａ２ＭｏＯ４である。ＡＨＸ又はＡＯＨ入りの培養液では、上記コントロールの培養液に、最終濃度が５０μＭ、２００μＭ、１０００μＭとなるように、ＡＨＸ又はＡＯＨが含有されている。２日に１回培養液を新しい培養液と交換した。培養後、シュートと根の長さを測定した。図４に測定したシュートと根の伸長を示す。ＡＯＨは、ＡＨＸと同じように、濃度依存的にシュート及び根の伸長を促進し、ＡＯＨがＡＨＸ代謝産物であることが確認された（図４中、「Ｃｏｎ」はコントロールを示す。「＊」はＰ値が＜０．０５、「＊＊」はＰ値が＜０．０１であることを示す。ｎ＝１１である。）。
【0038】
（実施例７．イネからのＡＯＨの単離）イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）を、イネ用の通常の培養液で２カ月間水耕栽培し、根（５２ｇ）を採取した。根をミキサーで破砕し、破砕物をエタノール及びアセトンで抽出し、濃縮乾固し、根の抽出物（３４０ｍｇ）を得た。この抽出物を溶媒（９５％アセトニトリル、０．０５％ギ酸）に溶かして１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で分析した。標品のＡＯＨは、ＬＣで保持時間２．５分にピークを有し、該保持時間においてフルマススペクトルから分子量１５２．０［Ｍ−Ｈ］−のピークが検出され、ＭＳ／ＭＳスペクトルから分子量９７のフラグメントイオンのピークが検出された。標品のＡＯＨと同様に、イネの根の抽出物は、ＬＣで保持時間２．５分にピークを有し、該保持時間においてフルマススペクトルから分子量１５２．０［Ｍ−Ｈ］−のピークが検出され、ＭＳ／ＭＳスペクトルから分子量９７のフラグメントイオンのピークが検出された。イネの根の抽出物から、標品のＡＯＨと同じ分子量ピークが検出されたことから、イネの根が内生のＡＯＨを含むことが確認された。図５に標品のＡＯＨの、（ａ）ＭＳ／ＭＳスペクトル及び（ｂ）フルマススペクトルを示す。また、図６にイネの根の抽出物の、（ａ）ＭＳ／ＭＳスペクトル及び（ｂ）フルマススペクトルを示す。ＡＯＨの検量線とピーク面積をもとに計算した、イネの根に含まれるＡＯＨの量は、採取したイネの根５２ｇあたり約２．５ｎｇであった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析の条件及び使用した装置は以下の通りである。
【0039】
＜ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析条件及び装置＞（ＬＣ部）
ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所）
カラム：ＰＣ ＨＩＬＩＣ（サイズ：２．０ｍｍ×１００ｍｍ、資生堂）
流速：０．２ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
（ＭＳ／ＭＳ部）
質量分析計：ＬＴＱ ＯＲＢＩＴＲＡＰ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（イオントラップ型、ネガティブモード、ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＰＩＣ）
【0040】
（実施例８．トマトからのＡＯＨの単離）トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）を、トマト用の通常の培養液で２カ月間水耕栽培し、根（１７ｇ）を採取した。根をミキサーで破砕し、破砕物をエタノール及びアセトンで抽出し、濃縮乾固し、ジクロロメタン可溶部を除き、根の抽出物（４．７ｍｇ）を得た。この抽出物を溶媒（９５％アセトニトリル、０．０５％ギ酸）に溶かして１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで実施例７と同様に分析した。分析条件及び分析に使用した装置は実施例７と同様である。その結果、標品のＡＯＨと同様に、トマトの根の抽出物は、ＬＣで保持時間２．５分にピークを有し、該保持時間においてフルマススペクトルから分子量１５２．０［Ｍ−Ｈ］−のピークが検出され、ＭＳ／ＭＳスペクトルから分子量９７のフラグメントイオンのピークが検出された。したがって、トマトの根も内生のＡＯＨを含むことが確認された。図７にトマトの根の抽出物の、（ａ）ＭＳ／ＭＳスペクトル及び（ｂ）フルマススペクトルを示す。ＡＯＨの検量線とピーク面積をもとに計算した、トマトの根に含まれるＡＯＨの量は、採取したトマトの根１７ｇあたり約０．１ｎｇ以下であり、イネよりも低かった。
【0041】
（実施例９．イネの土耕栽培におけるＡＯＨの影響（ポット栽培））２０１１年４月２９日、イネ（日本晴れ）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）を播種し、６月７日、成長した苗を１本ずつＮ（１４４０ｍｇ）、Ｐ２Ｏ５（１２ｍｇ）、Ｋ２Ｏ（７６０ｍｇ）、ＣａＯ（８０６ｍｇ）の肥料が含有された土（１／５０００ａのポット）に移植し、９月２４日まで温室（２８℃）で以下（１）〜（７）の７種類の栽培条件で土耕栽培した。水分の補給は、以下のように水道水又はＡＯＨを添加した水道水を毎週２Ｌ与えることにより行った。
栽培条件
（１）ポット栽培中、水道水を与えた。
（２）定植期に２週間（６月７日から６月２０日まで）、最終濃度が５０μＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。それ以外の期間は、水道水を与えた。
（３）分げつ期に２週間（７月４日から７月１７日まで）、最終濃度が５０μＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。それ以外の期間は、水道水を与えた。
（４）穂肥期に２週間（７月２５日から８月７日まで）、最終濃度が５０μＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。それ以外の期間は、水道水を与えた。
（５）実肥期に２週間（８月１５日から８月２８日まで）、最終濃度が５０μＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。それ以外の期間は、水道水を与えた。
（６）ポット栽培中、最終濃度が５μＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。
（７）ポット栽培中、最終濃度が５０μＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。
土耕栽培した玄米及び植物体を３０℃で１５日間乾燥し、玄米重量（株あたり及び玄米１００粒あたり）、穂長、桿長、穂数、分げつ数、地上部重量を測定した。表１に結果を示す。ＡＯＨを常時施用することで、穂数と地上部重量がコントロールよりも増加した。また、穂肥期以降にＡＯＨを施用することで、株あたりの玄米重量がコントロールよりも増加した（表１中、数値は、平均±標準偏差を示す。「増加率」はコントロールに対する増加率（％）を示す。「＊」はＰ値が＜０．０５であることを示す。サンプル（ポット）数＝６である。）。
【0042】
【表1】
【0043】
（実施例１０．イネの土耕栽培におけるＡＯＨの影響（圃場栽培））イネ（日本晴れ）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）を用い、以下のようにして圃場で栽培した。栽培条件として、（１）〜（５）の５区を設定した。
２０１１年４月２９日、イネ（日本晴れ）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）を苗箱に播種し、苗箱で育苗中の５月２４日から２週間、総量で１５Ｌの、水道水又はＡＯＨを添加した水道水を与えた。６月７日、成長した苗を１本ずつ圃場に移植した。栽植密度は、条間３０ｃｍ、株間１５ｃｍ（１区３×３．３ｍの３反復）とした。基肥として、６月７日に１区あたり５０Ｌの水道水又はＡＯＨを添加した水道水を与えた。栽培を継続し、穂肥として、７月２５日に１区あたり５０Ｌの水道水又はＡＯＨを添加した水道水を与えた。１０月１２日、植物体を収穫した。
栽培条件
（１）育苗中の培養液、基肥及び穂肥として、水道水を用いた。
（２）育苗中の培養液として、最終濃度が０．５ｍＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。基肥と穂肥としては、水道水を用いた。
（３）育苗中の培養液として、最終濃度が１．０ｍＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。基肥と穂肥としては、水道水を用いた。
（４）基肥として、最終濃度が０．５ｍＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。育苗中の培養液と穂肥としては、水道水を用いた。
（５）穂肥として、最終濃度が０．５ｍＭとなるようにＡＯＨを添加した水道水を与えた。育苗中の培養液と基肥としては、水道水を用いた。
玄米を乾燥し、植物体１０株あたりの玄米の全重、籾殻重、粗玄米重、精玄米重及び千粒重を測定した。表２に結果を示す。ＡＯＨを施用することで、玄米の全重、籾殻重、粗玄米重、精玄米重がコントロールよりも増加した（表２中、数値は、平均±標準偏差を示す。「増加率」はコントロールに対する増加率（％）を示す。「＊」はＰ値が＜０．０５であることを示す。）。
【0044】
【表2】
【0045】
（実施例１１．３−メチルＡＯＨの製造）以下の方法により、ＡＯＨから３−メチルＡＯＨを製造した。
ＡＯＨ１５３ｍｇを、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、無水）５ｍＬに５０℃で溶かし、ヨードメタン０．０７５ｍＬを添加し、４時間反応させた。分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、移動相ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール＝９：１）を用いて得た画分を更にＨＰＬＣ（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５カラム（サイズ２０×２５０ｍｍ、流速：５ｍＬ／分、移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸中１０％メタノール、検出：ＵＶ３１０ｎｍ）に供し、１０．２ｍｇ（収率６．１１％）の３−メチルＡＯＨを得た。
製造した物質が３−メチルＡＯＨであることは、以下のようにして、質量分析並びに１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲの測定結果により確認した。
質量分析計（ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて試料をポジティブモードで測定したところ、ｍ／ｚ１６８［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ１９０［Ｍ＋Ｎａ］＋を示した。
また、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲでは、試料は以下の値を示した。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）δ３．８８
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）δ３７．９、１１２．８、１４２．１、１４８．０、１５２．７
【0046】
（実施例１２．イネに対するＡＯＨ及び３−メチルＡＯＨの影響）滅菌したイネ（日本晴れ）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の種子を、２８℃、３日間で発芽させた。コントロールの培養液、０．２ｍＭのＡＯＨを添加した培養液、又は０．２ｍＭの３−メチルＡＯＨを添加した培養液を入れた試験管中で発芽種子を一つの試験管につき４粒ずつ、２８℃、１週間培養した。コントロールの培養液の組成は、０．５ｍＭ ＮＨ４ＮＯ３、０．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣ１２、２３μＭ Ｆｅ−エチレンジアミン四酢酸（Ｆｅ−ＥＤＴＡ）、２５μＭ Ｈ３ＢＯ３、４．５μＭ ＭｎＳＯ４、０．１５μＭ ＣｕＳＯ４、０．３５μＭ ＺｎＳＯ４、０．０５μＭ Ｎａ２ＭｏＯ４である。２日に１回培養液を新しい培養液と交換した。培養後、シュートと根の長さを測定した。図８に測定した根の伸長を示す。３−メチルＡＯＨはＡＯＨと同様、根において伸長活性を有することが確認された（図８中、「＊」はＰ値が＜０．０５、「＊＊」はＰ値が＜０．０１であることを示す。ｎ＝１６である。）。一方、シュートの伸長に対しては、３−メチルＡＯＨは影響を与えなかった。
【産業上の利用可能性】
【0047】
本発明のＡＯＨ及び３−メチルＡＯＨは植物生長調節作用があるため、植物生長調節剤として有効に使用することができる。このような植物生長調節剤は、農業及び園芸に幅広く適用できる。