特許 5916256 細胞培養のための合成組成物および被覆

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5916256

(24)【登録日】2016年4月15日

(45)【発行日】2016年5月11日

(54)【発明の名称】細胞培養のための合成組成物および被覆

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20160422BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20160422BHJP

   C12M 3/00 20060101ALN20160422BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/07

   C12N1/00 A

   !C12M3/00 A

【請求項の数】5

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2014-508877(P2014-508877)

(86)(22)【出願日】2011年5月5日

(65)【公表番号】特表2014-512835(P2014-512835A)

(43)【公表日】2014年5月29日

(86)【国際出願番号】IB2011001493

(87)【国際公開番号】WO2012150475

(87)【国際公開日】20121108

【審査請求日】2014年4月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】397068274

【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100073184

【弁理士】

【氏名又は名称】柳田 征史

(74)【代理人】

【識別番号】100090468

【弁理士】

【氏名又は名称】佐久間 剛

(72)【発明者】

【氏名】エンリィ，ダヴィ

(72)【発明者】

【氏名】エルヴィ，マルチャル

(72)【発明者】

【氏名】ペシュル，マリィレン デニス マドゥレン

(72)【発明者】

【氏名】ワレラク，コリン

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５１０６５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nat.Mater.,2010,9(9),p.768-78

【文献】 J.Biomed.Mater.Res.B Appl.Biomater.,2006,76(2),p.315-25

【文献】 Biointerphases,2010,5(3),p.FA132-42

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−５／２８

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

高分子細胞培養表面を形成するための組成物であって、
ポリマー主鎖、該主鎖にコンジュゲートした陽イオン部分、および該主鎖にコンジュゲートした架橋剤部分を含むプレポリマー、および
ポリマー主鎖および該主鎖にコンジュゲートした細胞接着ペプチドを含むペプチドポリマー、を含み、
前記陽イオン部分が、モノアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートモノマーまたはジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートモノマーである、組成物。

【請求項2】

前記ポリマー主鎖にコンジュゲートした前記陽イオン部分が、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）モノマーの前記プレポリマーへの重合から生じる、請求項１記載の組成物。

【請求項3】

前記プレポリマーが、該プレポリマーの前記ポリマー主鎖にコンジュゲートした親水性部分をさらに含む、請求項１または２記載の組成物。

【請求項4】

前記ポリマー主鎖にコンジュゲートした親水性部分が、モノマーの前記プレポリマーへの重合から生じ、該モノマーが、２−カルボキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、２−カルボキシエチルアクリルアミド、アクリルアミドグリコール酸、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、３−アクリロイルアミノ−１−プロパノール、Ｎ−アクリルアミド−エトキシエタノール、およびＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミドからなる群より選択される、請求項３記載の組成物。

【請求項5】

前記架橋剤部分がベンゾフェノン部分である、請求項１から４いずれか１項記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、細胞培養に関し、より詳しくは、合成の既知組成被覆または表面およびそのような被覆または表面を調製する方法に関する。

【0002】

配列リスト
本出願は配列リストを含む。その配列リストに含まれる情報がここに引用される。

【背景技術】

【0003】

疾病の治療のために人に導入してよい細胞である治療用細胞が開発されている。治療用細胞の例としては、三胚葉のいずれかに分化し、人体内で任意のタイプの成体細胞を生じる能力を有する、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの多能性(pluripotent)幹細胞が挙げられる。幹細胞のこの性質により、糖尿病、脊髄損傷、心臓病などの多数の重症の細胞変性疾患のための新たな治療法を開発するための可能性が提供される。しかしながら、そのようなｈＥＳＣに基づく治療法の開発にはまだ障害がある。

【0004】

治療用細胞培養物を開発し、制御する上で、細胞と組織の培養において適切な数の治療用細胞を得て維持すること、およびこれらの細胞が細胞培養中に望ましくない様式で変化しないことを確実にすることが重要である。例えば、ｈＥＳＣ細胞培養などの幹細胞培養では、典型的に、細胞銀行またはストックからの少数の細胞が播種され、次いで、所定の治療用途にとって分化が望ましくなるまで、未分化状態で増幅される。このことを行うために、ｈＥＳＣまたはその分化した細胞は、典型的に、支持細胞層、血清、またはニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBD Biosciences社から市販されているＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの、動物由来成分を含有する表面または培地の存在下で培養される。培養環境にこれらの動物由来成分が加わると、細胞が潜在的に有害なウイルスまたは他の病原菌に曝露され、これらは患者に移る可能性があり、またこれにより、ｈＥＳＣの一般培養と維持が損なわれ得る。その上、そのような生物学的製品は、バッチ間のばらつき、免疫応答および限られた貯蔵寿命を受けやすい。

【0005】

細菌、動物由来成分を含まない合成表面が、既知組成培地におけるｈＥＳＣなどの幹細胞の培養に成功し、動物由来成分の存在下での細胞の培養から生じる組織の多くに対処することが示されてきた。しかしながら、そのような合成表面は、高濃度の組換えポリペプチドにより製造されており、これらは製造するのが高価になり得る。その上、これらの合成表面は、細胞をそこから容易に除去できず、しばしば、細胞のすくいとりと組み合わされる、トリプシンなどのタンパク質分解酵素と一緒の長いインキュベーション時間を要する表面を提供することがある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

特に、本開示には、既知組成培地中で幹細胞の未分化増殖を支持できる合成被覆が記載される。様々な実施の形態において、ペプチドの濃度は、幹細胞の培養のために現在利用されている合成表面よりも低く、現在利用されている合成表面よりも穏やかな条件下で細胞が収穫される。この被覆は、架橋ポリマーを形成するためにアミン基を有する陽イオン架橋剤官能化プレポリマーと、官能化細胞結合ペプチドポリマーを架橋させることによって形成される。このペプチドポリマーとプレポリマーの比率を制御することによって、結果として得られる架橋ポリマー中の細胞結合ポリペプチドの濃度を調節することができる。細胞を表面から収穫する容易さも、ペプチドポリマーとプレポリマーの比率を調節することによって制御されるであろう。

【0007】

ここに記載された様々な実施の形態において、高分子細胞培養表面を形成するための組成物は、（ｉ）ポリマー主鎖、その主鎖にコンジュゲートした陽イオン部分、および主鎖にコンジュゲートした架橋剤部分を含むプレポリマー、および（ｉｉ）ポリマー主鎖およびその主鎖にコンジュゲートした細胞接着ペプチドを含むペプチドポリマーを含む。適切な量の細胞接着ペプチドおよび陽イオン部分を有する細胞培養のための架橋済み被覆は、前記プレポリマーとペプチドポリマーから形成できる。

【0008】

ここに記載された細胞培養物品、組成物、または方法の１つ以上の実施の形態は、従来の細胞培養物品、組成物、または被覆細胞培養物品を製造する方法に勝る１つ以上の利点を提供する。例えば、前記被覆は完全に合成のものであるので、バッチ間のばらつき、免疫応答、限られた貯蔵寿命、および潜在的に有害なウイルスまたは患者に移り得る他の病原菌への細胞の曝露の恐れを被らない。様々な実施の形態において、その被覆は、他の利用できるまたは提案された合成表面よりも低い濃度の細胞培養ペプチドを使用して調製される。このより低いペプチド濃度のために、トリプシンなどのプロテアーゼによる細胞の収穫が容易になるであろう。様々な実施の形態において、被覆プロセスは、簡単であり、被覆物品の高スループット生産を可能にする。例えば、被覆プロセスにはその場での重合が必要なく、架橋は空気中で行ってもよく、不活性ガスパージの費用のかかる複雑な工程が排除される。この単純な被覆プロセスのために、被覆組成物、またはその成分は、ほとんどどのような実験室の設定においても、末端ユーザによる被覆に使用するためのキットとして提供できる。これらと他の利点は、添付図面と共に読んだときに、以下の詳細な説明から容易に理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ここに提示された教示による成分１プレポリマーの一般的な実施の形態を示す説明図

【図2】ここに提示された実施の形態による成分１プレポリマーの一般的な実施の形態を生成するための反応スキームを示す説明図

【図3】ここに提示された実施の形態による成分プレポリマーのいくつかの特定の成分を示す説明図

【図4】ここに提示された教示による成分２ポリマーの一般的な実施の形態を示す説明図

【図5】ここに提示された実施の形態による成分２ポリマーの一般的な実施の形態を生成するための反応スキームを示す説明図

【図6】コンジュゲートされた細胞接着ポリペプチドを有するポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）を製造するための反応スキームの説明図

【図7】ここに提示された実施の形態によるプレポリマーおよびペプチドポリマーを架橋するための反応スキームの説明図

【図8】ここに提示された実施の形態による細胞培養物品の被覆表面の説明図

【図9】ここに提示された実施の形態による細胞培養物品を被覆する方法を説明する流れ図

【図10】被覆組成物を調製するために一緒にブレンドすべき成分（ｉ）および（ｉｉ）の式の例を示す反応スキーム

【図11】実施例３、６および７により調製されたプレートに関する、ＢＣＡにより定量化された固定化ペプチドの量（ピコモル／ｍｍ²）を示す棒グラフ

【図12】実施例５により調製されたプレートに関する、ＢＣＡにより定量化された固定化ペプチドの量（ピコモル／ｍｍ²）を示す棒グラフ

【図13】「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」被覆６ウェルプレート（ａ）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）６ウェルプレート（ｂ）、１０％のｐｈｏｔｏＨＥＭＡ＋９０％のＶＮ−ＰＥＧ−ＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１０ｍｇ／ｍｌ（ｃ）、および４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ（ｄ）上への接着から２４時間後のＥＳ−Ｄ３ ｍＥＳＣ形態を示す位相差顕微鏡画像

【図14】４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ（ａ）、および４０％のｐｈｏｔｏＨＥＭＡ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ（ｂ）上への接着から２４時間後のＥＳ−Ｄ３ ｍＥＳＣ形態を示す位相差顕微鏡画像

【図15】Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ基体（ａ）および４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ（ｂ）上のＭｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ（商標）培地中で増殖したｈＢＭ−ＭＳＣ形態、並びにトリプシン処理後の、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（登録商標）付着基体生物学的被覆（ｃ）および４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ（ｄ）からの細胞の遊離を示す位相差顕微鏡画像

【図16】トリプシン処理後の試験表面に接着したままである細胞の比率のＭＴＴ定量化を示すグラフ

【図17】ここに提示された教示により被覆されたＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（商標）容器のコロイド金染色を示す写真

【図18】ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」中で被覆された、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」付着基体生物学的被覆（ａ）および４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ（ｂ）上の「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ」培地中で増殖したｈＢＭ−ＭＳＣ形態を示す位相差顕微鏡画像

【図19】「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」中で被覆された、４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ上の「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ」培地中で増殖したｈＢＭ−ＭＳＣ細胞のクリスタルバイオレット染色を示す写真 図面は、必ずしも一定の縮尺で描かれていない。図面に使用した同様の数字は、同様の構成要素、工程などを称する。しかしながら、所定の図面におけるある構成要素を称するためにある数字を使用することは、同じ数字が付された別の図面の構成要素を制限することを意図していない。その上、構成要素を称するために異なる数字を使用することは、異なる数字の構成要素が同じまたは類似であり得ないことを示すことは意図されていない。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下の詳細な説明において、その一部を形成し、例として、デバイス、システムおよび方法のいくつかの特別な実施の形態が示されている、添付図面を参照する。他の実施の形態が考えられ、本開示の範囲または精神から逸脱せずに、作製されるであろうことが理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、制限を意味するものと解釈すべきではない。

【0011】

ここに使用した全ての科学用語と技術用語は、別記しない限り、当該技術分野に一般に使用されている意味を有する。ここに提供された定義は、ここに頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするものであり、本開示の範囲を制限することは意味しない。

【0012】

本明細書および付随の特許請求の範囲に使用されているように、単数形は、そうではないと明白に示されていない限り、複数の対象を有する実施の形態を包含する。本明細書および付随の特許請求の範囲に使用されているように、「または」という用語は、そうではないと明白に示されていない限り、「および／または」を含む意味で一般に使用される。

【0013】

ここに用いたように、「有する(have, having)」、「含む(include, including, comprise, comprising)」などの用語は、範囲を制限しない意味で使用されており、一般に、「含む(including)が、制限されない」ことを意味する。「から実質的になる」、「からなる」などの用語は、「含む(comprising)」などに包含されることが理解されよう。ここに用いたように、「から実質的になる」は、組成物、被覆、物品、方法などに関するように、その組成物、被覆、物品、方法などの成分が、列挙された成分およびその組成物、被覆、物品、方法などの基本的な特徴と新規の特徴に実質的に影響しない任意の他の成分に制限されることを意味する。

【0014】

ここに用いたように、「プレポリマー」は、例えば、架橋により、さらに別の重合を始めることができる、活性化可能な反応性基であってもよい反応性基を有するポリマーまたはオリゴマーを意味する。例えば、活性化可能な架橋剤基を有するポリマーは、その架橋剤基が活性化され、別のポリマーに架橋した場合、プレポリマーである。本開示の目的に関して、活性化可能な架橋剤基を有するプレポリマーが架橋する他のポリマーは、反応性基を有さない限り、プレポリマーとは考えられない。該他のポリマーが、例えば、プレポリマーの反応性基により誘発された非特異的プロトン吸着により、そのプレポリマーと架橋し、該他のポリマーの特異的な反応性基のために架橋したのではない場合、該他のポリマーは、本開示の目的のためのプレポリマーではない。

【0015】

ここに用いたように、「コンジュゲートした(conjugated)」は、モノマーまたはポリマーおよびポリペプチドまたは活性化可能な架橋剤基などの部分に関するように、ポリペプチドまたは活性化可能な架橋剤基が、ポリマーまたはモノマーに直接的または間接的（例えば、スペーサを介して）に共有結合していることを意味する。

【0016】

ここに用いたように、「モノマー」は、別のモノマーと重合できる化合物を意味する（「モノマー」が、他のモノマーと同じまたは異なる化合物であるか否かにかかわらず）。

【0017】

ここに用いたように、「（メタ）アクリレートモノマー」は、メタクリレートモノマーまたはアクリレートモノマーを意味する。ここに用いたように、「（メタ）アクリルアミドモノマー」は、メタクリルアミドモノマーまたはアクリルアミドモノマーを意味する。（メタ）アクリレートモノマーおよび（メタ）アクリルアミドモノマーは、少なくとも１つのエチレン性不飽和部分を有する。「ポリ（メタ）アクリレート」は、ここに用いたように、少なくとも１つの（メタ）アクリレートモノマーを含む１種類以上のモノマーから形成されたポリマーを意味する。「ポリ（メタ）アクリルアミド」は、ここに用いたように、少なくとも１つの（メタ）アクリルアミドモノマーを含む１種類以上のモノマーから形成されたポリマーを意味する。

【0018】

ここに用いたように、「陽イオン」モノマー、プレポリマー、ポリマー、もしくはその成分または単位は、ｐＨ７から７．７で、のような細胞培養条件下で正電荷を有するモノマー、プレポリマー、ポリマー、もしくはその成分または単位である。

【0019】

ポリペプチド配列は、ここでは、１文字のアミノ酸コードまたは３文字のアミノ酸コードにより称される。これらのコードは交換可能に使用してよい。

【0020】

ここに用いたように、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、化学合成されても、または組換え由来であってもよいが、動物源から完全なタンパク質として単離されない、アミノ酸の配列を意味する。本開示の目的に関して、ペプチドおよびポリペプチドは総タンパク質ではない。ペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質の断片であるアミノ酸配列を含んでよい。例えば、ペプチドおよびポリペプチドは、ＲＧＤなどの細胞接着配列として知られている配列を含んでもよい。ポリペプチドは、長さが３と３０の間のアミノ酸などの、任意の適切な長さのものであってよい。ポリペプチドは、それらが、例えば、エクソペプチダーゼにより分解されるのを防ぐために、アセチル化（例えば、Ａｃ−ＬｙｓＧｌｙＧｌｙ）またはアミド化（例えば、ＳｅｒＬｙｓＳｅｒ−ＮＨ₂）されていてもよい。これらの修飾は、ある配列が開示された場合に考えられることが理解されよう。

【0021】

本開示は、特に、細胞培養物品を被覆する方法であって、その物品を、陽イオン架橋剤官能化プレポリマー（「成分１」）および細胞結合ペプチド官能化ポリマー（「成分２」）を含有する組成物と接触させる工程、および被覆された物品を、そのプレポリマーとペプチドポリマーの架橋を生じさせる条件に曝露して、細胞付着表面を有する細胞培養物品を製造する工程を有してなる方法を記載する。

【0022】

Ｉ． 成分１：陽イオン架橋剤官能化プレポリマー
成分１は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした架橋剤部分およびポリマー主鎖にコンジュゲートした陽イオン部分を有するプレポリマーである。この陽イオン部分は、細胞培養ｐＨ、例えば、７から７．７で正に帯電している。この架橋剤部分は、例えば、ＵＶ光などの電磁放射線に曝露された際に、成分１のプレポリマーを、成分２のペプチド含有ポリマー、およびいくつかの実施の形態において、細胞培養物品の表面に架橋させることができる。成分１のプレポリマーは、少なくとも１つの陽イオンモノマーおよび少なくとも１つの架橋剤含有モノマーの重合によって調製されることが好ましい。あるいは、陽イオン基または光反応性基が、反応性基を含むポリマー主鎖にコンジュゲートされてもよい。

【0023】

様々な実施の形態において、成分１のプレポリマーは、親水性成分をさらに含む。例えば、図１を参照すると、説明のための成分１のプレポリマー１００が示されている。プレポリマー１００は、ポリマー主鎖１４０並びにこの主鎖１４０にコンジュゲートした架橋剤部分１１０、陽イオン部分１２０、および親水性部分１３０を有する。多くの実施の形態において、プレポリマー１００には架橋がないかまたは架橋が実質的にないが、架橋剤部分１１０のいくつかの偶発的な活性化のためにいくつかの架橋が生じるかもしれない。

【0024】

成分１のプレポリマー１００は、どのような適切なプロセスを使用して形成してもよい。例えば、図２を参照すると、プレポリマー１００は、架橋剤部分１１０にコンジュゲートした重合部分１４５（「架橋剤部分」１１５）、陽イオン部分１２０にコンジュゲートした重合部分１４５（「陽イオンモノマー」１２５）、および親水性部分１３０にコンジュゲートした重合部分１４５（「親水性モノマー」１３５）を含むモノマーの混合物の重合から形成してもよい。重合部分１４５は同じであっても異なってもよいことが理解されよう。

【0025】

実施の形態において、プレポリマーを形成するために使用される重合部分１４５は、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、マレイミド、フマレート(fumarate)、ビニルスルホンなどのエチレン性不飽和基を含有する。架橋剤部分１１０、陽イオン部分１２０、または親水性部分１３０は、どのような適切な重合部分にコンジュゲートされても、または公知のモノマーの一部であってもよい。重合部分にコンジュゲートするのではなく、架橋剤部分１１０、陽イオン部分１２０、または親水性部分１３０は、例えば、架橋剤官能基、陽イオン官能基、または親水性官能基を導入するために、架橋剤部分をポリマー鎖の側基に共有結合させることによって、既存のポリマーにコンジュゲートしてもよい。

【0026】

Ａ． 架橋剤部分
架橋剤モノマー１１５を形成するために、または既存のポリマーにコンジュゲートするために、どのような適切な架橋剤部分１１０を使用してもよい。架橋剤部分１１０は、光反応性部分または熱反応性部分であってもよい。例えば、架橋剤部分は、α，β不飽和ケトン光反応性部分であってよい。光反応性基は、光に曝露された際に、非常に反応性である種を形成する分子または部分である。光反応性基の例としては、アリールアジド、ジアザレン、ベータカルボニルジアゾおよびベンゾフェノン、アセトフェノン、およびその誘導体が挙げられる。反応性種としては、ニトレン、カルベンなどが挙げられる。反応性種は、一般に、共有結合を形成できる。例えば、実施の形態において、感光性部分は、ベンゾフェノン含有部分、置換アリールアジド含有部分、またはトリフルオロメチルアリールジアジリン含有部分である。

【0027】

実施の形態において、架橋剤モノマー１１５は、Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミドである。重合性ベンゾフェノンを有する他の適切な架橋剤モノマーとしては、２−アクリルオキシ−５−メチルベンゾフェノン、４’−ジメチルアミノ−２−アクリルオキシ−５−メチルベンゾフェノンおよび４’−ジメチルアミノ−２−（β−アクリルオキシエチル）オキシ−５−メチルベンゾフェノン、４−ベンゾフェノンメトキシメタクリレート、４−ビニル−４’−メトキシベンゾフェノン、２−メチル−４’−ビニルベンゾフェノンおよび４−ビニルベンゾフェノン、４−［（４−マレイミド）フェノキシ］ベンゾフェノン、４−［（４−マレイミド）チオフェニル］ベンゾフェノン、アクリル酸４−［３−（４−ベンゾイル−フェノキシ）−２−ヒドロキシプロポキシ］ブチルエステルが挙げられる。

【0028】

Ｂ． 陽イオン部分
陽イオンモノマー１２５を形成するために、または既存のポリマーにコンジュゲートするために、どのような適切な陽イオン部分１２０を使用してもよい。実施の形態において、陽イオン部分１２０は、第一級、第二級または第三級アミノ基などのアミン基を含む。陽イオン基は、親の第三級アミンの第四級化によって生成された第四級アミンであってもよい。様々な実施の形態において、陽イオン部分１２０は、一または二置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミン、もしくは一または二置換Ｃ１〜Ｃ４アルカノールアミンなどの、第三級アルキルアミンまたは第三級アルカノールアミンである。

【0029】

様々な実施の形態において、陽イオンモノマー１２５は、モノアルキルアミノアルキルまたはジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートである。使用してよいモノアルキルアミノアルキルまたはジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートの例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル−、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル−、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレートまたはＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノエチル（メタ）アクリレートが挙げられる。あるいは、これらのエステルモノマーの代わりに、グリシジル（メタ）アクリレートおよび第二級アルキルアミンまたはアルカノールアミンの対応する反応生成物を使用してもよい。様々な実施の形態において、陽イオンモノマー１２５は、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）である。

【0030】

Ｃ． 親水性部分
親水性モノマー１３５を形成するために、または既存のポリマーにコンジュゲートするために、どのような適切な親水性部分１３０を使用してもよい。親水性部分１３０またはモノマー１３５は、細胞培養ｐＨで負に帯電していても、細胞培養ｐＨで帯電していなくてもよい。多くの実施の形態において、親水性部分１３０またはモノマー１３５は細胞培養ｐＨで帯電していない。成分１のプレポリマー１００の電荷密度を調節するために、または結果として得られたポリマーにヒドロゲル挙動を与えるために、親水性部分１３０またはモノマー１３５を利用してもよい。

【0031】

様々な実施の形態において、親水性モノマー１３５は、式（Ｉ）：

【化1】

【0032】

の（メタ）アクリレートモノマーであり、式中、ＡはＨまたはメチルであり、ＢはＨ、Ｃｌ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルコールまたはヒドロキシル末端エーテル、もしくはカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換されたＣ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキルである。いくつかの実施の形態において、Ｂは、Ｃ１〜Ｃ４直鎖または分岐鎖アルコールである。いくつかの実施の形態において、Ｂは、カルボキシル基で置換された直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３である。例として、２−カルボキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレートなどを使用してよい。

【0033】

様々な実施の形態において、親水性モノマー１３５は、式（ＩＩ）：

【化2】

【0034】

の（メタ）アクリルアミドモノマーであり、式中、Ａは水素またはメチルであり、ＢはＨ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルコールまたはヒドロキシ末端エーテル、もしくはカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換されたＣ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキルである。いくつかの実施の形態において、Ｂはカルボキシル基で置換された直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３である。いくつかの実施の形態において、ＢはＣ１〜Ｃ４直鎖または分岐鎖アルコールである。例として、２−カルボキシエチルアクリルアミド、アクリルアミドグリコール酸、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、３−アクリロイルアミノ−１−プロパノール、Ｎ−アクリルアミド−エトキシエタノール、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミドなどを使用してよい。

【0035】

Ｄ． 成分１のプレポリマーの合成
上述したように、成分１のプレポリマー１００は、適切な部分をホモポリマーまたはコポリマーにコンジュゲートすること、またはモノマーにコンジュゲートした適切な部分を有するモノマーの混合物を重合することなどにより、どのような適切な様式で合成してもよい。

【0036】

好ましい実施の形態において、成分１のプレポリマー１００は、架橋剤モノマー１１５、陽イオンモノマー１２５および親水性モノマー１３５を含む混合物を重合させることによって、合成される。様々なモノマーのモル比は、必要に応じて変えてもよい。架橋剤モノマー１１５の濃度がより高いと、最終的に、成分２のペプチドポリマー（以下により詳しく論じる）との架橋が増加することが理解されよう。陽イオンモノマー１２５の濃度がより高いと、プレポリマー１００の電荷密度が増加することがさらに理解されよう。親水性モノマー１３５の濃度は、架橋密度と電荷密度を要望どおりに制御するために変えてもよく、ヒドロゲル特性をプレポリマー１００に与えるであろう。

【0037】

架橋剤モノマー１１５、陽イオンモノマー１２５および親水性モノマー１３５をどのような適切なモルパーセントで使用してもよい。実施の形態において、架橋剤モノマー１１５は、成分１のプレポリマー１００を形成するために使用されるモノマーの混合物の１％（モルパーセント）と２０％（モルパーセント）の間を構成する。例えば、架橋剤モノマー１１５は、成分１のプレポリマー１００を形成するために使用されるモノマーの混合物の１％と１０％の間を構成する。

【0038】

実施の形態において、陽イオンモノマー１２５は、成分１のプレポリマー１００を形成するために使用されるモノマーの混合物の１％（モルパーセント）と５０％（モルパーセント）の間を構成する。例えば、陽イオンモノマー１２５は、成分１のプレポリマー１００を形成するために使用されるモノマーの混合物の１０％と３０％の間を構成する。

【0039】

実施の形態において、親水性モノマー１３５は、成分１のプレポリマー１００を形成するために使用されるモノマーの混合物の９８％（モルパーセント）と３０％（モルパーセント）の間を構成する。例えば、親水性モノマー１３５は、成分１のプレポリマー１００を形成するために使用されるモノマーの混合物の８９％と６０％の間を構成する。

【0040】

適切な量の適切なモノマーが一旦選択されたら、重合反応によりポリマーを形成してよい。ポリマーを形成するモノマーに加えて、組成物は、界面活性剤、湿潤剤、光開始剤、熱開始剤、触媒、および活性化剤などの１種類以上の追加の化合物を含んでもよい。

【0041】

どのような適切な重合開始剤を使用してもよい。当業者には、そのモノマーに使用するのに適した開始剤、例えば、ラジカル開始剤またはカチオン開始剤を選択することが容易にできるであろう。様々な実施の形態において、連鎖重合を開始するためのフリーラジカルモノマーを生成するために、ＵＶ光が使用される。重合開始剤の例としては、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン、ニトロソ化合物、ハロゲン化アシル、ヒドラゾン、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール、クロロトリアジン、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル、ジケトン、フェノン、またはそれらの混合物が挙げられる。適切な市販の紫外線活性化光開始剤および可視光活性化光開始剤の例には、ニューヨーク州、タリタウン所在のCiba Specialty Chemicals社から市販されている、ＩＲＧＡＣＵＲＥ ６５１、ＩＲＧＡＣＵＲＥ １８４、ＩＲＧＡＣＵＲＥ ３６９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ ８１９、ＤＡＲＯＣＵＲ ４２６５およびＤＡＲＯＣＵＲ １１７３、並びにBASF社（ノースカロライナ州、シャーロット所在）から市販されているＬＵＣＩＲＩＮ ＴＰＯ−Ｌなどの商標名がある。

【0042】

光増感剤が適切な開始剤系に含まれてもよい。代表的な光増感剤は、カルボニル基または第三級アミノ基もしくはその両方を有する。カルボニル基を有する光増感剤としては、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９，１０−アントラキノン、および他の芳香族ケトンが挙げられる。第三級アミノ基を有する光増感剤としては、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチルエタノールアミン、および安息香酸ジメチルアミノエチルが挙げられる。市販の光増感剤としては、Biddle Sawyer Corp.からのＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＩＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＱＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＰＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＥＰＤが挙げられる。

【0043】

概して、光増感剤系または光開始剤系の量は、約０．０１から１０質量％まで様々であってよい。

【0044】

使用してよいカチオン開始剤の例としては、アリールスルホニウム塩などのオニウムカチオンの塩、並びにイオンアレーン系などの有機金属塩が挙げられる。

【0045】

使用してよいフリーラジカル開始剤の例としては、２，２’−アゾビス（ジメチル−バレロニトリル）、アゾビス（イソブチロニトリル）、アゾビス（シクロヘキサン−ニトリル）、アゾビス（メチル−ブチロニトリル）などのアゾタイプの開始剤、並びにベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、メチルエチルケトンペルオキシド、イソプロピルペルオキシカーボネート、２，５−ジメチル−２，５−ビス（２−エチルヘキサノイル−ペルオキシ）ヘキサン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド、ジクロロベンゾイルペルオキシド、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、重硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、重硫酸ナトリウムなどの組合せなどの過酸化物開始剤、およびそれらの混合物が挙げられる。もちろん、どのような他の適切なフリーラジカル開始剤を使用してもよい。開始剤の効果的な量は、一般に、反応混合物の０．１質量パーセントから約１０質量パーセントまたは約０．１質量パーセントから約８質量パーセントなどの、反応混合物の約０．１質量パーセントから約１５質量パーセントの範囲内にある。

【0046】

様々な実施の形態において、１種類以上のモノマーは、重合を行う前に、希釈される。

【0047】

重合反応から生じるプレポリマー１００は、どのような適切な分子量を有してもよい。様々な実施の形態において、そのプレポリマー１００は、１０，０００と２５０，０００ダルトンの間などの、１０，０００と１，０００，０００ダルトンの間の平均分子量（Ｍｗ）を有する。当業者には、結果として生じるポリマーの分子量を調節するために、開始剤の量、反応時間、反応温度などを変えてもよいことが理解されよう。

【0048】

（メタ）アクリレートモノマー、（メタ）アクリルアミドモノマー、または他の適切なモノマーは、当該技術分野に公知のように合成しても、Polysciences, Inc.、Sigma Aldrich, Inc.、およびSartomer, Inc.などの製造供給元から得てもよい。

【0049】

実施の形態において、成分１のプレポリマー１００は「Ｐｈｏｔｏ−ＤＭＡＥ」と称される。本開示の目的に関して、「Ｐｈｏｔｏ−ＤＭＡＥ」は、例えば、図３に示されるような、Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド、ＤＭＥＭＡおよびＨＥＭＡからなるモノマーの混合物の重合から形成されるプレポリマーであり、式中、１１７は架橋剤モノマー［Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド］から誘導され、１２７は陽イオンモノマー（ＤＭＥＭＡ）から誘導され、１３７は親水性モノマー（ＨＥＭＡ）から誘導される。

【0050】

ＩＩ． 成分２：ペプチド官能化ポリマー
成分２は、ポリマー主鎖にコンジュゲートしたポリペプチドを有するポリマーである。このポリペプチドは、どのような適切な様式でポリマーにコンジュゲートしてもよい。いくつかの実施の形態において、モノマーは、ポリペプチドを含むように誘導体化されており、それゆえ、ポリペプチドは、ポリマーが形成されているときにポリマーに取り込まれる。いくつかの実施の形態において、ポリペプチドは、ポリマーが形成された後にポリマーにグラフトされる。

【0051】

様々な実施の形態において、成分２のポリマーは、親水性成分をさらに含む。例えば、図４を参照して、説明のための成分２のポリマー２００が示されている。ポリマー２００は、ポリマー主鎖２４０並びにその主鎖にコンジュゲートした細胞結合ペプチド部分２１０および親水性部分２３０を有する。多くの実施の形態において、ポリマー２００は、架橋を含まないか、架橋を実質的に含まない。

【0052】

成分２のポリマー２００は、どのような適切なプロセスを使用して形成してもよい。例えば、図５を参照すると、ペプチド部分２１０にコンジュゲートした重合部分２４５（「ペプチドモノマー」２１５）および親水性部分２３０にコンジュゲートした重合部分２４５（「親水性モノマー」２３５）を含むモノマーの混合物の重合から形成してもよい。重合部分２４５は同じであっても異なってもよいことが理解されよう。重合部分２４５または親水性モノマー２３５は、成分１のプレポリマー１００に関して、重合部分１４５または親水性モノマー１３５について上述したようなものであってよい。

【0053】

ペプチドモノマー２１５の親水性モノマー２３５に対するどのような適切なモル比を使用してもよい。様々な実施の形態において、成分２のポリマー２００の形成に使用するためのモノマーの混合物は、ペプチドモノマー２１５および親水性モノマー２３５からなり、ここで、ペプチドモノマー２１５の親水性モノマー２３５に対するモル比は、０．０３対１と０．９対１との間、例えば、０．０６対１と０．２対１の間である。結果として得られるポリマー２００におけるペプチドの濃度を制御し、所望のヒドロゲル特性を結果として得られるポリマー２００に与えるために、親水性モノマー２３５の濃度を変えてもよいことが理解されよう。

【0054】

実施の形態において、ペプチドモノマー２１５のペプチドが、式１：
式１： Ｒ_m−Ｓ_p−Ｃ_ap
により記載される。

【0055】

実施の形態において、Ｒ_mは、外部エネルギー源の存在下で重合できる、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレートを含むα，β−不飽和基すなわちエチレン性不飽和基である、重合部分である。「ｍ」は、１以上の整数である。実施の形態において、官能化ペプチドは、光重合性部分または熱重合性部分であってよい重合部分Ｒ_mを有する。

【0056】

実施の形態において、Ｓ_pはスペーサである。実施の形態において、Ｓ_pは、例えば、式（Ｏ−ＣＨ₂ＣＨＲ’）_m2により表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）（式中、Ｒ’はＨまたはＣＨ₃であり、ｍ２は、０から１００または０から２０などの０から２００までの整数である）を含むポリアルキレンオキシドであってよい。このスペーサは、親水性スペーサ、例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であってよい。実施の形態において、スペーサはＰＥＯ₄である。実施の形態において、比較的短い鎖のポリアルキレンオキシドが望ましい。例えば、実施の形態において、Ｓ_pは、ＰＥＧ₂、ＰＥＧ₄、ＰＥＧ₆、ＰＥＧ₈、ＰＥＧ₁₀、ＰＥＧ₁₂、またはＰＰＧ₂、ＰＰＧ₄、ＰＰＧ₆、ＰＰＧ₈、ＰＰＧ₁₀、ＰＰＧ₁₂またはＰＰＧ₂₀であってよい。実施の形態において、スペーサは、２０以下の反復単位（すなわち、ＰＥＧ₄、ＰＥＧ₆、ＰＥＧ₈、ＰＥＧ₁₀、ＰＥＧ₁₂、ＰＥＧ₁₄、ＰＥＧ₁₆、ＰＥＧ₁₈またはＰＥＧ₂₀）を有するポリエチレンオキシドである。実施の形態において、Ｓ_pは、官能基を有するＰＰＧまたはＰＥＧである。例えば、そのＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは、マレイミド、チオール、アミン、シラン、アルデヒド、エポキシド、イソシアネート、アクリレートまたはカルボキシル基を有してよい。実施の形態において、ＰＥＧスペーサは、アミン官能基を有するＰＥＧである、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）である。追加の実施の形態において、そのＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは分岐していてよい。例えば、分岐ＰＥＧまたはＰＰＯは、Ｙ分岐または星形ＰＥＧまたはＰＰＧであってよい。実施の形態において、これらの分岐ＰＥＧまたはＰＰＯスペーサは、多数のペプチドを、１つの官能ペプチドを通じて基材にコンジュゲートさせられるであろう。

【0057】

細胞培養表面が一度形成されたら（以下により詳しく論じられている）、スペーサは、ペプチド（Ｃ_ap）を細胞培養表面から離して延ばし、そのペプチドを培養されている細胞に一層アクセス可能にし、細胞培養のための表面の効率を改善するように働くであろう。その上、親水性スペーサは、タンパク質を寄せ付けず、細胞またはタンパク質の官能化ペプチドへの非特異的吸収を防ぐように働くであろう。実施の形態において、細胞培養物品を調製する際のＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）などのスペーサを有する細胞接着ペプチドを使用すると、全体的に低い濃度の接着ペプチドを使用して、そのような物品を調製することが可能になる。

【0058】

実施の形態において、Ｓ_pはアミノ酸Ｘａａ_nであってよく、式中、Ｘａａは、独立して任意のアミノ酸であり、ｎは、０から３０まで、０から１０まで、０から６まで、または０から３までの整数である。例えば、実施の形態において、Ｓ_pはアミノ酸Ｘａａ_nであってよく、式中、ＸａａはＧであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳ_pはアミノ酸Ｘａａ_nであってよく、式中、ＸａａはＫであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳ_pはアミノ酸Ｘａａ_nであってよく、式中、ＸａａはＤであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳ_pはアミノ酸Ｘａａ_nであってよく、式中、ＸａａはＥであり、ｎ＝１から２０である。実施の形態において、スペーサＳ_pは、ＬｙｓＧｌｙＧｌｙまたはＬｙｓＴｙｒＧｌｙなどの３つのアミノ酸配列であってよい。実施の形態において、Ｘａａ_nは、一連の同じアミノ酸である。実施の形態において、スペーサＳ_pは、Ｘａａ_nとポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドとの組合せであってよい。Ｘａａ_nは、リシン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンアミノ酸などの親水性アミノ酸を含んでよい。実施の形態において、Ｘａａ_nは末端リシンまたはアルギニンを有してもよい。もしくは、実施の形態において、スペーサＳ_pは、任意の組合せで、ポリエチレンオキシドスペーサとアミノ酸スペーサとを含んでもよい。実施の形態において、Ｓ_pは、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸またはヘキサエチレンジアミンなどの疎水性スペーサであってよい。実施の形態において、Ｓ_pはメタクリル酸カルボキシエチルであってよい。

【0059】

重合部分は、ポリエチレンオキシドを通じて、リシンなどのアミノ酸の側鎖を通じて、またはアミノ酸のＮ末端で、スペーサＳ_pに結合してよい。アミノ酸Ｘａａ_nは、それ自体を分解から保護するために、アセチル化および／またはアミド化されてもよい。しかしながら、Ｘａａ_nがアセチル化されている場合、重合部分は、アミノ酸のＮ末端を通じてＸａａ_nに結合され得ない。例えば、メタクリル酸は、Ｓ_pがＸａａ_nであり、Ｘａａがリシンであり、ｎ＝１、およびＲ_mがメタクリル酸である場合、リシンアミノ酸の側鎖を通じて、リシンアミノ酸に結合されるであろう。

【0060】

実施の形態において、スペーサＳ_pはＸａａ_nであり、Ｘａａは末端のリシンを有する。実施の形態において、Ｘａａ_nは重合部分Ｒ_mに結合されていてよい。例えば、Ｘａａ_nは、（ＭＡＡ）ＬｙｓＧｌｙＧｌｙまたは（ＭＡＡ）ＬｙｓＴｙｒＧｌｙであってよく、式中、ＭＡＡは、末端のリシンアミノ酸の側鎖を通じてＸａａ_nに結合した重合部分であるメタクリル酸（ＭＡＡ）である。追加の実施の形態において、重合部分は、Ｎ末端がアセチル化されていなければ、Ｘａａ_nアミノ酸またはアミノ酸鎖のＮ末端に結合されていてよい。各官能化ペプチドは、少なくとも１つの重合部分を有し、複数有していてもよい。

【0061】

Ｃ_apは、細胞接着配列または細胞結合配列を有するペプチドまたはポリペプチドである。実施の形態において、細胞接着配列または細胞結合配列はＲＧＤである。

【0062】

実施の形態において、成分２のポリマー２００は、上述したように、ペプチドモノマー２１５の重合生成物から形成してもよい。追加の実施の形態において、成分２のポリマー２００は、親水性モノマー２３５などの追加のモノマーと、任意の形態で、例えば、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーとして、共重合されたペプチドモノマー２１５の重合生成物から形成してもよい。ポリマーを製造するために多数のモノマーを使用することにより、ポリマーが形成されるときに、ポリペプチドがポリマーに取り込まれるか否かにかかわらず、結果として得られるポリマーの性質を所望のように、より容易に調節することができる。その上、親水性モノマー２３５などの追加のモノマーを使用することにより、ペプチドの濃度を制御することができる。

【0063】

実施の形態において、これらの追加のモノマー（ペプチドモノマー２１５以外に）は、例えば、低級アルキル、すなわち、Ｃ₁からＣ₂₀アルキルを含む（メタ）アクリレートモノマー、（メタ）アクリレート、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸ｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチルまたは（メタ）アクリル酸ドデシルを含むエチレン性不飽和モノマーである。さらに、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボルニルおよび（メタ）アクリル酸ジシクロペンテニルなどの環式アルキルモノマー種を使用してもよい。メタクリル酸およびアクリル酸などの官能性モノマー、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピルおよび（メタ）アクリル酸ヒドロキシブチルなどの（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノプロピルおよび（メタ）アクリル酸ジエチルアミノプロピルなどの（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキル。（メタ）アクリレートにより、メタアクリレートまたは類似のアクリレートのいずれを使用してもよいことを意味する。実施の形態において、追加のモノマーは非イオン性であってよい。実施の形態において、追加のモノマーは親水性であってよい。

【0064】

図６は、成分２のポリマー２００の実施の形態であるポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ₄−ＶＮ）を製造するための反応スキームを示している。図６に示されるように、ペプチドモノマー２１５は、ＰＥＧ₄スペーサおよびメタクリル酸（ＭＡＡ）重合部分を有する。式１：Ｒ_m−Ｓ_p−Ｃ_apに戻ると、図６に示された実施の形態によれば、Ｒ_mはＭＡＡであり、Ｓ_pはＰＥＧ₄であり、Ｃ_apは、ＲＧＤ配列を含有する、ＶＮと付された表１に示された配列のいずれであってもよいビトロネクチン配列のＶＮである。図６に示されるように、ＭＡＡ−ＰＥＧ₄−ＶＮ官能化ペプチドは、熱開始剤であるエタノールの存在下、またはアルゴンまたはＮ₂雰囲気下における６８℃で、親水性エチレン性不飽和モノマー２３５、この場合にはＨＥＭＡと反応させられて、成分２のポリマー２００の実施の形態である、ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ₄−ＶＮを形成する（さらなる詳細は、以下の実施例に与えられている）。

【0065】

様々な実施の形態において、ポリペプチドは、既に形成されたポリマーにグラフトされる。ポリペプチドが、ポリマーのペンダント反応性基にコンジュゲートできるアミノ酸を含むことが好ましい。ポリマーがポリペプチドとの反応のために有することのある反応性基の例としては、マレイミド、グリシジル、イソシアネート、イソチオシアネート、活性化エステル、活性化カーボネート、無水物などが挙げられる。一例として、例えば、アミド結合の形成により、求核付加反応を可能にする官能基を有する任意の天然アミノ酸またはバイオミメティックアミノ酸が、適切な反応性基を有するポリペプチドにコンジュゲートする目的のために、ポリペプチドに含まれてもよい。リシン、ホモリシン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびジアミノブタン酸が、カルボキシル基などの、ポリマーの反応性基にコンジュゲーションするための適切な性質を有するアミノ酸の例である。その上、Ｎ末端アミンがキャッピングされていない場合、カルボキシル基にコンジュゲートするために、ポリペプチドのＮ末端アルファアミンを使用してもよい。様々な実施の形態において、前記ポリマーとコンジュゲートするポリペプチドのアミノ酸は、ポリペプチドのカルボキシル末端位置またはアミノ末端位置にある。

【0066】

ポリペプチドは、どのような適切な技法によりポリマーにコンジュゲートされてもよい。ポリペプチドは、アミノ末端のアミノ酸、カルボキシル末端のアミノ酸、または内部のアミノ酸によりポリマーにコンジュゲートされてもよい。適切な技法の１つには、当該技術分野に一般に知られているような、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応がある。ＥＤＣおよびＮＨＳまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）が、ポリマーの自由なカルボキシル基と反応して、アミン反応性ＮＨＳエステルを生成できる。ＥＤＣはポリマーのカルボキシル基と反応して、加水分解を受けやすいアミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を生成する。ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの付加は、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体をアミン反応性ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに転化することによって、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を安定化させて、二段階工程を可能にする。ポリマーの活性化後、次いで、ポリペプチドが加えられ、ポリペプチドの末端アミンがアミン反応性エステルと反応して、安定したアミド結合を形成し、それゆえ、ポリペプチドを膨潤性（メタ）アクリレート層にコンジュゲートすることができる。ポリペプチドをポリマーにコンジュゲートするために、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応が使用される場合、Ｎ末端アミノ酸は、リシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸などのアミン含有アミノ酸であることが好ましい。もちろん、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドロキシルなどの、許容されるどのような求核試薬を使用してもよい。

【0067】

ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応により、マイクロキャリアへのポリペプチドのゼロ長コンジュゲーションが生じる。末端アミンを有する、上述したものなどのスペーサ（Ｓ_p）をポリペプチドのＮ末端アミノ酸に加えてもよい。Ｎ末端アミノ酸にスペーサ（Ｓ_p）を加える場合、そのスペーサ（Ｓ_p）はＮ−ＰＧ−アミド−スペーサであることが好ましく、式中、ＰＧは、Ｆｍｏｃ基、ＢＯＣ基、ＣＢＺ基またはペプチド合成を受けやすい任意の他の基などの保護基である。

【0068】

ポリペプチドが、既に形成されたポリマーにコンジュゲートされるいくつかの実施の形態において、そのポリマーは、複数のエチレン性不飽和モノマーから形成された主鎖を有し、そのエチレン性不飽和モノマーの内の１つはカルボキシル官能基を有する。カルボキシル官能基は、必要以上の実験をせずに、適切な官能基がある、先に列記したエチレン性不飽和モノマーに組み込まれてもよいことが当業者には理解されよう。カルボキシル官能基を有するモノマーの一例はアクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＥＡ）であるが、多くの他のカルボキシル基含有モノマーを提供してもよい。実施の形態において、成分２のポリマー２００は、親水性モノマーであってもよい（例えば、先に論じたような）、カルボキシル基を有さない１種類以上のエチレン性不飽和モノマーから、およびカルボキシル基を有さない１種類以上のエチレン性不飽和モノマーから、形成される。このペプチドは、上述したように、カルボキシル官能基を通じてポリマー主鎖にコンジュゲートされてよい。

【0069】

ポリペプチドが、既に形成されたポリマーにコンジュゲートされる、または形成されているときにポリマーに取り込まれるか否かにかかわらず、ペプチドは、細胞接着ペプチドまたは細胞接着ポリペプチド（これらの用語は相互に交換可能である）（Ｃ_ap）である。細胞接着ポリペプチドは、例えば、インテグリン結合配列またはＲ−Ｇ−Ｄ配列であってよい、細胞結合配列または細胞接着配列を有する。実施の形態において、細胞接着ペプチドは、ビトロネクチン、ラミニン、骨シアロタンパク質、コラーゲン、またはフィブロネクチン中に見つかるアミノ酸の配列である。本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、化学的に合成されても、または組換え方法により製造されてもよいアミノ酸配列である。しかしながら、本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、完全なタンパク質ではなく、タンパク質の断片である。その上、ペプチドまたはポリペプチドは、動物源から単離されない。実施の形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、末端アミノ酸が、ポリペプチドの付着に適応するリシンまたはアルギニンであるという条件で、ｌが０から３までの整数であり、Ｘａａがどのようなアミノ酸であってもよい、ビトロネクチンペプチド配列である、Ｘａａ_lＰｒｏＧｌｎＶａｌＴｈｒＡｒｇＧｌｙＡｓｐＶａｌＰｈｅＴｈｒＭｅｔＰｒｏ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含んでよい。実施の形態において、前記ペプチドまたはポリペプチドは環式であってよい。例えば、ＲＧＤＹＫ（配列番号３３）は環式ｃ（ＲＧＤｙＫ）であってよい。

【0070】

実施の形態に使用してよいペプチドの例が表１に列挙されている。

【表1-1】

【表1-2】

【0071】

存在するまたは細胞培養表面からアクセスできるペプチドの量は、プレポリマーの組成、スペーサの長さ、およびポリペプチド自体の性質に応じて様々であり得ることが理解されよう。その上、培養中の異なる細胞は、プレポリマーの組成、並びに表面で利用できるペプチドの個性と量に対して異なって応答するであろう。特定の密度のペプチドが、例えば、既知組成培地中の未分化幹細胞などの特定の細胞タイプの付着および増殖をよりよく支持できるであろうが、異なるペプチド濃度で、他の細胞タイプがよりうまく増殖するかもしれないことが理解されよう。

【0072】

ポリペプチドは、環化されていても、環状部分を含んでもよい。環状ポリペプチドを形成するどのような適切な方法を使用してもよい。例えば、適切なアミノ酸側鎖の自由なアミノ基および適切なアミノ酸側鎖の自由なカルボキシル基を環化させることによって、アミド結合を形成してもよい。また、ペプチド配列における適切なアミノ酸側鎖の自由なスルフヒドリル基の間でジスルフィド結合を形成してもよい。環状ポリペプチド（またはその部分）を形成するために、どのような適切な技法を使用してもよい。一例として、例えば、国際公開第１９８９／００５１５０号パンフレットに記載されている方法を使用して、環状ポリペプチドを形成してもよい。ポリペプチドがカルボキシル末端とアミノ末端との間にアミド結合を有する、頭−尾結合環状ポリペプチドを使用してもよい。ジスルフィド結合の代わりは、例えば、Koide et al, 1993, Chem. Pharm. Bull. 41(3):502-6; Koide et al.,1993, Chem. Pharm. Bull. 41(9):1596-1600; またはBesse and Moroder, 1997, Journal of Peptide Science, vol. 3, 442-453に記載されているような、２つのセレノシステインを使用したジセレニド結合または混合セレニド／スルフィド結合であってもよい。

【0073】

ポリペプチドは、当該技術分野に公知のように合成しても（あるいは分子生物学技法により産生しても）、またはAmerican Peptide Company、CEM Corporation、またはGenScript Corporationなどの製造供給元から得てもよい。リンカーは、当該技術分野に公知のように合成しても、またはQuanta BioDesign, Ltd.から市販されている個別ポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ（登録商標））リンカーなどのように、製造供給元から得てもよい。

【0074】

ここに論じられたポリペプチドのいずれについても、具体的に特定されたアミノ酸または公知のアミノ酸を保存アミノ酸で置き換えてもよいことが理解されよう。「保存アミノ酸」は、ここに用いたように、第２のアミノ酸と機能的に類似のアミノ酸を称する。そのようなアミノ酸は、公知の技法により、ポリペプチドの構造または機能への妨害を最小にして、ポリペプチドにおいて互いに置き換えられてもよい。以下の５種類の基の各々は、互いに保存置換基であるアミノ酸を含有する：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。

【0075】

成分２のポリマー２００が、ポリマーが形成されているときにポリマーにポリペプチド２１０を取り込むことによって（例えば、図５に示されたようなペプチドモノマー２１５の使用により）形成されたか、またはポリマーが形成された後にポリマーにコンジュゲートされたかにかかわらず、成分２のポリマー２００のポリマー部分を形成するための１種類以上のモノマーは、適切なペプチド密度が達成され、適切なポリマー特徴（例えば、率(modulus)、膨潤性など）が達成されるように選択されるであろう。当業者には、所望の特徴を有するポリマーを調製するための適切なモノマーおよびモノマー比を選択することが容易にできるであろう。

【0076】

適切な量の適切なモノマーが一旦選択されたら、重合反応によりポリマーを形成してよい（例えば、成分１のプレポリマーに関して先に論じたように）。

【0077】

実施の形態において、成分２の官能化ペプチドポリマー２００は、１０，０００ダルトン超のＭｎ（典型的に２０，０００〜１００，０００）および３０，０００ダルトン超のＭｗ（典型的に５０，０００から３００，０００）を有する。

【0078】

ＩＩＩ． 被覆組成物
陽イオンの架橋剤官能化プレポリマー（「成分１」）およびペプチド官能化ポリマー（「成分２」）は、どのような適切な量および比で被覆組成物において組み合わされてもよい。

【0079】

きつ過ぎて細胞を容易に収穫できない結合を形成せずに、幹細胞を、成分１（陽イオン部分を含有する）のプレポリマーおよび成分２（ペプチドを含有する）のペプチドポリマーの架橋から生成される被覆に結合させられるように、細胞接着ポリペプチドの陽イオン部分に対する比が制御されるであろうことが分かった。第三級アミンなどの陽イオン部分を有する表面は、幹細胞の増殖を支持するのに適していないことが以前に示唆されてきた（例えば、Langer et al., “Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells,” Nature Materials, vol. 9, September 2010; および“Functional Polymer Hydrogel for Embryonic Stem Cell Support,” D. Horak , et al., published online August 3, 2005 in Wiley Interscienceを参照のこと）。したがって、幹細胞培養がここに記載された被覆により支持されていることは意外である。理論により拘束することを意図するものではないが、適切な量の細胞接着ペプチドを有することにより、細胞がここに記載された被覆表面に最初に付着し、その後、その細胞は、細胞外基質（ＥＣＭ）分子を分泌でき、これらの分子は、たいていは、正味の負電荷（タンパク質、ＧＡＧなど）を示し、正に帯電した表面に容易に吸着できると考えられる。しかしながら、非特異的な調節の細胞／基質相互作用、例えば、電荷相互作用も関与することは除外できない。

【0080】

細胞／基質相互作用が、細胞接着ペプチドと細胞の相互作用およびＥＣＭと細胞の相互作用の両方により媒介される場合、ここに記載された被覆から細胞を容易に収穫する能力は、以下のように説明されるであろう（本出願の発明者等は、その理論に拘束されることを意図していない）。細胞接着ポリペプチドの濃度を低く維持することによって、そのようなペプチドに対する細胞の特異的で強い結合が最小に維持される。さらに、ＥＣＭ分子は、典型的に、これらの効果の両方により、細胞の収穫の向上をもたらすことができる。細胞接着が、合成ペプチド／細胞受容体の相互作用に頼りすぎる場合、細胞の収穫が非効率になる。しかしながら、不十分な量しか合成ペプチドが存在しない場合、被覆は、幹細胞の培養を支持することができないであろう。

【0081】

成分１の成分２に対する比は、成分２により提供される細胞結合ペプチドの濃度を調節するために変えてもよい。様々な実施の形態において、被覆中の細胞結合ペプチドの濃度は、平方センチメートル当たり約１．５マイクログラムなどの、被覆により提供される細胞培養表面の平方センチメートル当たり５マイクログラム未満である。ポリペプチドのそのような濃度は、他の合成表面に使用されてきた量よりも実質的に小さく、ここに提示された教示により被覆された細胞培養物品の製造に関して、実質的なコスト削減をもたらし得る。最終的に被覆を生じるポリペプチドの量を調節するために、例えば、上述したように、成分２を形成するために使用される成分を変えることを（成分１の成分２に対する比を変えることに加え）使用してもよいことが理解されよう。

【0082】

第三級アミン部分などの陽イオン部分は、どのような適切な濃度で被覆組成物中に存在してもよい。ポリペプチドの濃度に関するように、陽イオン部分の濃度を制御するために、成分１の成分２に対する比を変えてもよい。最終的に被覆を生じる陽イオン部分の量を調節するために、例えば、上述したように、成分１を形成するために使用される成分を変えることを（成分１の成分２に対する比を変えることに加え）使用してもよいことが理解されよう。

【0083】

いくつかの実施の形態において、ブレンドまたは他の組成物中の成分１の質量パーセントは、３０から７０％、例えば、４０から６０％であり、成分２は、７０から３０％、例えば、４０から６０％の質量パーセントで存在する。もちろん、所望の量のポリペプチドおよび陽イオン部分を達成するために、プレポリマー自体の実際の組成に基づいて、成分１のプレポリマーと成分２のポリマーの相対比率を変えてもよい。

【0084】

いくつかの実施の形態において、成分１のプレポリマーと成分２のポリマーは、被覆プロセス（以下に記載されるような）に使用するために溶媒中に溶解される。どのような適切な溶媒を使用してもよい。いくつかの実施の形態において、溶媒はトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）である。

【0085】

いくつかの実施の形態において、細胞培養物品を被覆するための、適切な比の成分１のプレポリマーと成分２のポリマーを含有するブレンド溶液は、バイアルやアンプルなどの容器内にパッケージされ、末端ユーザが末端ユーザの実験室内で細胞培養物品を被覆できるように、その物品が設けられている。いくつかの実施の形態において、末端ユーザが、使用した細胞および培養条件で使用するための適切な組合せを選択できるように、各々が、異なる比の成分１と成分２、もしくは異なる成分１のプレポリマーまたは成分２のペプチドポリマーを含有する複数の容器が提供される。

【0086】

溶液中の成分１のプレポリマーおよび成分２のペプチドポリマーは、どのような適切な濃度で溶液中にあってもよい。様々な実施の形態において、成分１のプレポリマーおよび成分２のペプチドポリマーの総濃度は、５ｍｇ／ｍｌ以下または約１ｍｇ／ｍｌなどの、１０ｍｇ／ｍｌ以下である。

【0087】

ＩＶ． 被覆プロセス
成分１のプレポリマーおよび成分２のペプチドポリマーは、どのような適切な様式で細胞培養物品上に配置してもよい。一般に、先に記載したような、成分１のプレポリマーおよび成分２のペプチドポリマーを含有する溶液は、細胞培養物品の表面上に配置される。その溶液は、その物品の表面に吹き付けても、または物品の表面に注ぐなどしてもよい。いくつかの実施の形態において、その物品は、溶液に沈められ、そこから取り出される。

【0088】

その溶液が物品の表面上に一旦配置されたら、成分１のプレポリマーの架橋剤部分を活性化させるために、被覆物品を電磁放射線または他の適切な条件に施す。例えば、図７を参照すると、成分１のプレポリマー１００および成分２のペプチドポリマー２００の混合物を放射線Ｒ（または他の適切な条件）に施すと、成分１のプレポリマー１００の架橋剤部分１１０が活性化される。この架橋剤部分は、成分２のポリマー２００のポリマー主鎖２４０と架橋することができ、陽イオン部分１２０およびポリペプチド部分２１０を有する架橋ポリマー３００が生じ、このポリマー３００の被覆が、細胞培養、特に、幹細胞の培養に適したものとなる。図示されていないが、成分１のプレポリマー１００の架橋剤部分１１０と主鎖１４０との間の架橋も生じるかもしれないことが理解されよう。

【0089】

図８を参照すると、成分１と２、１００，２００の混合物が、細胞培養物品４００の表面４１０と接触したまま放射線に曝露されると、成分１のプレポリマーの架橋剤部分１１０が、物品４００の表面４１０と結合し、陽イオン部分１２０およびポリペプチド部分２１０を有する、共有結合した表面被覆３００が提供される。

【0090】

もちろん、被覆３００は、非共有相互作用によって物品４００の表面４１０に付着してもよい。ポリマー３００を基体に取り付ける非共有相互作用の例としては、化学吸着、水素結合、表面相互貫入、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、双極子間相互作用、機械的連結、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0091】

ポリマー被覆３００が、物品４００の表面４１０にどのように付着しているかにかかわらず、ポリマー３００が、３７℃での細胞培養培地の存在下などの、細胞培養条件中に剥離しないように付着することが好ましい。

【0092】

ここで図９を参照すると、細胞培養物品を被覆する方法の概要が提示されている。この方法は、成分１のプレポリマーおよび成分２のペプチドポリマーを溶液中で混合する工程（９００）、細胞培養物品の表面をこの溶液と接触させる工程（９１０）、溶媒を蒸発させる工程（９２０）、物品の表面と接触した混合物を放射線に曝露して、成分１のプレポリマーの架橋剤部分を活性化させる工程（９３０）、および洗浄して、未結合の材料を除去する工程（９４０）を含む。

【0093】

溶媒は、受動的な乾燥によって除去してもよい。あるいは、蒸発を促進させるために、熱または真空を印加してもよい。

【0094】

成分１のプレポリマーの架橋剤部分を活性化させるために、どのような適切な量またはタイプの電磁放射線を使用してもよい。例えば、ベンゾフェノン架橋剤部分を使用する場合、被覆された細胞培養物品をＵＶ光に曝露してよい。雰囲気下でＵＶ光が照射された被覆物品が良好な付着を示すことが分かった。一例として、０．６ｍ／分のベルト速度で、８０％の出力による「Ｄ」バルブを備えたフュージョンランプ(fusion lamp)が、いくつかの実施の形態において、十分であることが分かった。高エネルギーの低波長放射線によるポリペプチドの劣化を避けるために、３００ｎｍ未満の波長を遮蔽するフィルタを光源と被覆組成物との間に配置してもよい。ポリスチレン製ウェルプレートの場合、潜在的に有害な低波長放射線を遮断する有効なフィルタとして、蓋板または底板を都合よく使用することができる。

【0095】

ポリマーで被覆される細胞培養物品の表面は、どのような適切な材料から形成されてもよい。例えば、細胞培養物品の表面は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー、それらの任意の組合せ、またはある材料の別の材料上の被覆から形成されてもよい。そのような基礎材料としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラスなどのガラス材料；シリコン；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、酢酸ビニル・無水マレイン酸の共重合体、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ボルプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹枝状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマー；酢酸ビニル・無水マレイン酸の共重合体、スチレン・無水マレイン酸の共重合体、エチレン・アクリル酸の共重合体、またはこれらの誘導体などのコポリマーが挙げられる。

【0096】

基体がコロナ処理またはプラズマ処理された場合、良好な付着が生じることが分かった。真空または大気圧プラズマの例としては、一次と二次の両方のＲＦおよびマイクロ波プラズマ、誘電体バリア放電、および空気、酸素、窒素、アルゴン、二酸化炭素、亜酸化窒素、または水蒸気を含む分子または混合ガス中に生成されるコロナ放電が挙げられる。一例として、ＴＣＴポリスチレンまたは「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」処理ポリスチレン（コーニング社）などのプラズマ処理ポリスチレンが、付着ための良好な基体を提供する。

【0097】

ＶＩ． 細胞培養物品
ここに記載された被覆は、６，１２，９６，３８４および１５３６ウェルプレートなどのシングルおよびマルチウェルプレート、瓶、ペトリ皿、フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、区画および多区画培養スライドなどのスライド、試験管、カバースリップ、バッグ、膜、中空繊維、ビーズおよびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社）および発酵槽などの任意の適切な細胞培養物品の表面に結合させてもよい。

【0098】

ＶＩＩ． 合成高分子被覆上の細胞のインキュベーション
上述したような被覆を有する細胞培養物品に細胞を播種してよい。細胞はどのような細胞タイプのものであってもよい。例えば、細胞は、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、腸細胞、腎臓細胞、または他の臓器からの細胞、幹細胞、島細胞、血管細胞、白血球、癌細胞などの結合組織細胞であってよい。細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であってよいが、細菌、酵母、または植物細胞などの非哺乳類細胞であってもよい。

【0099】

数多くの実施の形態において、細胞は、当該技術分野で一般に理解されているように、連続的に分裂する（自己再生）能力を有し、多種多様な特殊な細胞に分化できる細胞を称する幹細胞である。いくつかの実施の形態において、幹細胞は、検体の臓器または組織から単離される多能性(multipotent)、全能性、または多能性(pluripotent)幹細胞である。そのような細胞は、完全に分化したまたは成熟した細胞タイプを生じることができる。幹細胞は、自己またはそうではない骨髄由来幹細胞、神経幹細胞、または胚性幹細胞であってよい。幹細胞はネスチン陽性であってよい。幹細胞は造血幹細胞であってよい。幹細胞は、上皮組織、脂肪組織、臍帯血液、肝臓、脳または他の臓器に由来する多分化能細胞であってよい。様々な実施の形態において、幹細胞は、未分化胚性幹細胞などの未分化幹細胞である。

【0100】

細胞を播種する前に、細胞を収穫し、細胞を表面に一旦播種したらその中で培養すべき増殖培地などの、適切な培地中に懸濁させてよい。例えば、細胞は、血清含有培地、ならし培地、または既知組成培地中に懸濁させ、培養してもよい。ここに用いたように、「既知組成培地」は、未知の組成の成分を含有しない細胞培養培地を意味する。既知組成培地は、様々な実施の形態において、未知の組成のタンパク質、加水分解物、またはペプチドを含有しない。いくつかの実施の形態において、ならし培地は、組換え成長ホルモンなどの、既知の組成のポリペプチドまたはタンパク質を含有する。既知組成培地の全成分は既知の化学構造を有するので、培養条件におけるばらつき、それゆえ、細胞応答を減少させ、再現性を増加させることができる。その上、汚染の可能性が減少する。さらに、拡大する能力が、少なくとも一部には、上述した要因のために、容易になる。既知組成培地は、胚性幹細胞の成長と増殖から特別に配合された完全無血清のフィーダーフリー培地（ＳＦＭ）である、ＳＴＥＭ ＰＲＯとしてInvitrogen（カリフォルニア州９２００８、カールズバッド、ＰＯ Ｂｏｘ６４８２、１６００ファラデーアベニュー、Invitrogen社）から、またヒト胚性幹細胞のためのｍＴｅＳＲ（商標）１維持培地として、STEMCELL Technologies, Inc.から市販されている。別の既知組成培地は、ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の培養のための、標準化された、異種成分を含まない無血清培地である、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ」培地である。「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ」培地は、STEMCELL Technologies, Inc.から市販されている。

【0101】

その中で細胞が合成ヒドロゲル層と共にインキュベーションされる培地に、１種類以上の成長因子または他の因子を加えてもよい。これらの因子は、細胞増殖、接着、自己再生、分化などを促進させるものであってよい。培地に加えてよいまたは含ませてよい因子の例としては、筋肉形成因子（ＭＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、アクチビンＡ（ＡＣＴ）、造血成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）、インターフェロン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ペプチド成長因子、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、形質転換成長因子−β１（ＴＧＦβ１）などの形質転換成長因子、およびコロニー刺激因子が挙げられる。

【0102】

細胞は、どのような適切な濃度で播種してもよい。典型的には、細胞は、基体１ｃｍ²当たり約１０，０００細胞／ｃｍ²から約５００，０００細胞／ｃｍ²の濃度で播種される。例えば、細胞は、基体１ｃｍ²当たり約５０，０００細胞／ｃｍ²から約１５０，０００細胞／ｃｍ²の濃度で播種してよい。しかしながら、これよりも高濃度および低濃度で難なく使用できる。インキュベーションの時間および、温度、ＣＯ₂レベルとＯ₂レベル、成長培地などの条件は、培養されている細胞の性質に応じて決まり、容易に変更することができる。細胞を前記表面上でインキュベーションする期間は、所望の細胞応答に応じて変わりうる。

【0103】

培養される細胞は、（ｉ）調査研究または治療用途の開発に使用するために、既知組成培地の合成表面上で培養される十分な量の未分化の幹細胞の入手、（ｉｉ）培養される細胞の調査研究、（ｉｉｉ）治療用途の開発、および（ｉｖ）治療目的を含む、どのような適切な目的に使用してもよい。

【0104】

本開示の態様の概要
第１の態様において、高分子細胞培養表面を形成するための組成物は、（ｉ）ポリマー主鎖、その主鎖にコンジュゲートした陽イオン部分、および主鎖にコンジュゲートした架橋剤部分を含むプレポリマー、および（ｉｉ）ポリマー主鎖およびその主鎖にコンジュゲートした細胞接着ペプチドを含むペプチドポリマーを含む。

【0105】

第２の態様は、陽イオン部分がアミン部分である、第１の態様の組成物である。

【0106】

第３の態様は、アミン部分が第三級アミンである、第２の態様の組成物である。

【0107】

第４の態様は、第三級アミンが、アルキルアミンまたはアルカノールアミンからなる群より選択される、第３の態様の組成物である。

【0108】

第５の態様は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした陽イオン部分が、モノアルキルアミノアルキルまたはジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレートモノマーのプレポリマーへの重合から生じる、第１の態様の組成物である。

【0109】

第６の態様は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした陽イオン部分が、モノマーの第１のプレポリマーへの重合から生じるものであり、そのモノマーが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレートおよびＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノエチル（メタ）アクリレートからなる群より選択される、第１の態様の組成物である。

【0110】

第７の態様は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした陽イオン部分が、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）モノマーのプレポリマーへの重合から生じる、第１の態様の組成物である。

【0111】

第８の態様は、プレポリマーが、プレポリマーのポリマー主鎖にコンジュゲートした親水性部分をさらに含む、最初の７つの態様いずれかの組成物である。

【0112】

第９の態様は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした親水性部分が、モノマーのプレポリマーへの重合から生じ、そのモノマーが、２−カルボキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、２−カルボキシエチルアクリルアミド、アクリルアミドグリコール酸、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、３−アクリロイルアミノ−１−プロパノール、Ｎ−アクリルアミド−エトキシエタノール、およびＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミドからなる群より選択される、第８の態様の組成物である。

【0113】

第１０の態様は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした親水性部分が、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）のプレポリマーへの重合から生じる、第８の態様の組成物である。

【0114】

第１１の態様は、架橋剤部分がベンゾフェノン部分である、最初の１０の態様いずれかの組成物である。

【0115】

第１２の態様は、細胞接着ペプチドがＲ−Ｇ−Ｄ配列を含む、最初の１１の態様いずれかの組成物である。

【0116】

第１３の態様は、細胞接着ペプチドが、ビトロネクチン、ラミニン、骨シアロタンパク質、コラーゲン、またはフィブロネクチン中に見つかるアミノ酸の配列である、最初の１１の態様いずれかの組成物である。

【0117】

第１４の態様は、細胞接着ペプチドが、ＫＧＧＧＱＫＣＩＶＱＴＴＳＷＳＱＣＳＫＳ（配列番号１）、ＧＧＧＱＫＣＩＶＱＴＴＳＷＳＱＣＳＫＳ（配列番号２）、ＫＹＧＬＡＬＥＲＫＤＨＳＧ（配列番号３）、ＹＧＬＡＬＥＲＫＤＨＳＧ（配列番号４）、ＫＧＧＳＩＮＮＮＲＷＨＳＩＹＩＴＲＦＧＮＭＧＳ（配列番号５）、ＧＳＩＮＮＮＲＷＨＳＩＹＩＴＲＦＧＮＭＧＳ（配列番号６）、ＫＧＧＴＷＹＫＩＡＦＱＲＮＲＫ（配列番号７）、ＧＧＴＷＹＫＩＡＦＱＲＮＲＫ（配列番号８）、ＫＧＧＴＳＩＫＩＲＧＴＹＳＥＲ（配列番号９）、ＧＧＴＳＩＫＩＲＧＴＹＳＥＲ（配列番号１０）、ＫＹＧＴＤＩＲＶＴＬＮＲＬＮＴＦ（配列番号１１）、ＹＧＴＤＩＲＶＴＬＮＲＬＮＴＦ（配列番号１２）、ＫＹＧＳＥＴＴＶＫＹＩＦＲＬＨＥ（配列番号１３）、ＹＧＳＥＴＴＶＫＹＩＦＲＬＨＥ（配列番号１４）、ＫＹＧＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ（配列番号１５）、ＹＧＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ（配列番号１６）、ＫＹＧＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号１７）、ＹＧＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（配列番号１８）、ＣＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号１９）、ＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号２０）、ＣＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＲＡＹ（配列番号２１）、ＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＲＡＹ（配列番号２２）、ＫＹＧＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２３）、ＹＧＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号２４）、ＫＧＧＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号２５）、ＧＧＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号２６）、ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号２７）、ＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号２８）、ＧＲＧＤＳＰＫ（配列番号２９）、ＫＧＧＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ（配列番号３０）、ＧＧＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ（配列番号３１）、Ｘａａ_lＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号３２）、ＲＧＤＹＫ（配列番号３３）、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸の配列を含む、最初の１１の態様いずれかの組成物である。

【0118】

第１５の態様は、細胞接着ポリペプチドが、式Ｒ_m−Ｓ_p−Ｃ_apのペプチドモノマーからのペプチドポリマーに取り込まれ、式中、Ｒが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドおよびフマレート、並びにそれらの組合せからなる群より選択される重合部分であり、ｍが１より大きい整数であり；Ｓ_pが、式（Ｏ−ＣＨ₂ＣＨＲ’）_m2を有するポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシド（式中、Ｒ’はＨまたはＣＨ₃であり、ｍ２が０から２０までの整数である）、またはＸａａ_n（式中、Ｘａａは、独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から３までの整数である）、もしくはそれらの組合せを含む随意的なスペーサ部分であり；Ｃ_apは、細胞接着配列を含むペプチドである、最初の１４の態様いずれかの組成物である。

【0119】

第１６の態様は、ペプチドポリマーが、ペプチドポリマーの主鎖にコンジュゲートした親水性部分をさらに含む、最初の１５の態様いずれかの組成物である。

【0120】

第１７の態様は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした親水性部分が、モノマーの第２のプレポリマーへの重合から生じ、そのモノマーが、２−カルボキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、２−カルボキシエチルアクリルアミド、アクリルアミドグリコール酸、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、３−アクリロイルアミノ−１−プロパノール、Ｎ−アクリルアミド−エトキシエタノール、およびＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミドからなる群より選択される、第１６の態様の組成物である。

【0121】

第１８の態様は、ポリマー主鎖にコンジュゲートした親水性部分が、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）のプレポリマーへの重合から生じる、第１６の態様の組成物である。

【0122】

第１９の態様は、ペプチドポリマーが、カルボキシル基を有するエチレン性不飽和モノマーの、カルボキシル基を有さないエチレン性不飽和モノマーとの重合生成物を含み、細胞接着ペプチドが、カルボキシル基によりプレポリマーにコンジュゲートされている、最初の１８の態様いずれかの組成物である。

【0123】

第２０の態様は、カルボキシル基を有さないエチレン性不飽和モノマーが親水性である、第１９の態様の組成物である。

【0124】

第２１の態様は、細胞培養物品を製造する方法であって、最初の２０の態様いずれかのプレポリマーおよびペプチドポリマーを基体に提供する工程、および基体上のプレポリマーおよびペプチドポリマーにエネルギー源を施して、プレポリマーおよびペプチドポリマーを互いと基体に架橋させる工程を有してなる方法である。

【0125】

第２２の態様は、第２１の態様の方法により製造された細胞培養物品である。

【0126】

第２３の態様は、ポリペプチドの濃度が、基体の表面１平方センチメートル当たり５マイクログラム未満である、第２２の態様の細胞培養物品である。

【0127】

以下において、先に論じた物品および方法の様々な実施の形態を記載する、非限定的実施例が提示される。

【実施例】

【0128】

実施例１： 成分（ｉ）：光反応性ヒドロゲル形成コポリマー（Ｐｈｏｔｏ−ＤＭＡＥ）の調製
工程ａ：塩化４−ベンゾイルベンゾイルの合成 手短に言えば、５グラムの４−ベンゾイル安息香酸を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、そこに塩化チオニル（１５ｍｌ）を加えた。結果として得られた懸濁液を加熱して、１時間に亘り還流し、この最中に全ての固体が溶解した。回転蒸発により、揮発性化合物を除去した。残留物をトルエン中に溶解させ、再び蒸発させた。塩化チオニルを全て除去するために、この操作を二回行った。粗製化合物は、石油エーテルからの再結晶化によりさらに精製できる（溶解度が１００ｍｌ当たり約１ｇであることに留意）。この生成物は白色粉末である、Ｍｐ．９５℃（Ｌｉｔ；：９８〜９９℃）。１Ｈ−ＮＭＲは文献データに対応する。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.20 (d, J = 7.5, 2H), 7.86 (d, J = 7.4, 2H), 7.78 (d, J = 7.4, 2H), 7.61 (d, J = 6.7, 1H), 7.49 (t, J = 7.4, 2H) ppm. 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 195.31, 167.85, 143.27, 136.36, 135.75, 133.34, 131.15, 130.09, 130.01, 128.59 ppm。＝Ｏ信号が１７０．４２ｐｐｍである炭素スペクトルに、加水分解が容易に見られることに留意。

【0129】

工程ｂ：Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミドの合成： ７３０ｍｇ（４．１ミリモル）のＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩を５０ｍｌの丸底フラスコ内の２５ｍｌのジクロロメタン中に溶解させた。１グラム（４．１ミリモル）の塩化４−ベンゾイルベンゾイルおよびフェノチアジン（１ｍｇ：重合開始剤として）を固体で加えた。トリエチルアミン（１．３ｍｌ、１０ミリモル）を加えながら、懸濁液を氷浴で冷却した。氷浴を取り外し、３時間に亘り撹拌した。有機相を０．１ＮのＨＣｌで二回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させた。残りの粗生成物を、溶媒として酢酸エチルを使用したフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．５）により精製した。収量は、５１０ｍｇ（３６％）の純粋な化合物であった。¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01 (d, J = 7.5, 2H), 7.86 (d, J = 7.4, 2H), 7.80 (d, J = 7.2, 2H), 7.62 (s, ¹H), 7.51 (d, J = 7.5, 2H), 5.81 (s, 1H), 5.39 (s, 1H), 3.49 ( 4H), 2.01 (s, 3H), 1.79 (s, 2H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 196.05, 169.53, 166.74, 139.93, 139.52, 137.63, 137.07, 132.79, 130.13, 130.06, 128.39, 127.00, 120.29, 35.98, 29.76, 18.68。

【0130】

工程ｃ：光反応性ヒドロゲル形成コポリマー（Ｐｈｏｔｏ−ＤＭＡＥ）の合成
図１０に与えられた反応にしたがって、Ｐｈｏｔｏ−ＤＭＡＥを調製した。手短に言えば、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＥＭＡ）、０．４２ｇ（２．６７ミリモル）および２−ヒドロキシエチルメタクリレート、０．９８３ｇ（７．５５ミリモル）を、撹拌子を備えた琥珀色のフラスコ内に秤量した２０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に加え、これに、Ｎ−（３−メタクリルアミドプロピル）−４−ベンゾイルベンズアミド、０．１７ｇ（０．４８ミリモル）を加え、この溶液中に溶解させた。溶解後、２，２’−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）、４０ｍｇ（０．２１ミリモル）を加え、溶解が完了するまで撹拌した。この溶液を１分間に亘りアルゴンのバブリングを使用して酸素を除去した。次いで、密封したフラスコを、撹拌しながら６８℃で２０時間に亘り加熱し、光から保護した。室温まで冷却した後、ポリマーを、２５０ｍｌの脱イオン水中の沈殿によって単離した。収集した粘着性ポリマーをエタノール中に溶解させ、ジイソプロピルエーテル中に沈殿させた。得られた固体をジイソプロピルエーテルで３回洗浄し、次いで、真空乾燥して、微細な白色生成物を得た。

【0131】

ＰｈｏｔｏＤＭＡＥポリマーの分子量は、屈折率検出器、光散乱検出器、光ダイオードアレイ検出器および粘度計検出器と接続されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。移動相は、トリフルオロエタノール＋トリフルオロ酢酸カリウムであった。平均Ｍｗは９０，９５０であり、Ｍｎは３５，０９０であり、ＰＤＩは２．５９であった。

【0132】

実施例２： 成分（ｉｉ）：ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）の合成
工程Ａ：（ＭＡＡ−ＰＥＧ₄−ＶＮ）の合成： ＶＮペプチド（ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ配列番号２７）は、以下のプロセスによって、合成されたものであり、カリフォルニア州、サニーベール所在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ社により提供された。

【0133】

ＭＡＡ−ＰＥＯ₄−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂（配列番号２７）： このペプチドは、Ｆｍｏｃ化学反応により１ミリモルのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ樹脂上で合成された。アミノ酸に使用した保護基は：ＡｓｐとＴｈｒについてはｔ−ブチル基、ＧｌｎについてはＴｈｒ基、ＡｒｇについてはＰｂｆ、ＬｙｓについてはＢｏｃであった。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸はＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入 したものであった；Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ₄−ＯＨは、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社から購入したものであった。カップリングおよび開裂(cleavage)のための試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入したものであった。溶媒はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入したものであった。ペプチド鎖は、Ｆｍｏｃ保護基の除去および保護されたアミノ酸のカップリングの繰返しによって、樹脂上に作製された。カップリング剤としてＨＢＴＵおよびＨＯＢｔが使用され、塩基としてＮＭＭが使用された。脱Ｆｍｏｃ試薬としてＤＭＦ中２０％のピペリジンが使用された。Ｆｍｏｃ保護基が除去された後、ＰＥＧ４のアミノ基にメタクリル酸（ＭＡＡ）がカップリングされた。最後のカップリング後、開裂および側鎖の保護基の除去のために、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ₂Ｏ（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）で処理された。粗製ペプチドが冷たいエーテルから沈殿され、濾過により収集された。粗製ペプチドが逆相ＨＰＬＣにより精製された；９０％超の純度で収集された分画がプールされ、凍結乾燥された。生成物は、９０％以上の純度でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ社により提供され、さらに精製せずに使用した。エタノールをこのプロセスに非反応性希釈剤として使用し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入したものであった。

【0134】

工程Ｂ：ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）の調製 撹拌子を備えた琥珀色のフラスコ内の７．５ｍｌのエタノールに、６０ｍｇ（０．４６ミリモル）のＨＥＭＡ、１００ｍｇ（０．０５ミリモル）のビトロネクチン−ＰＥＧ₄−メタクリレート（ＭＡＡ−ＰＥＧ₄−ＶＮ）を加えた。次いで、９ｍｇの２，２’−アゾビス−（２−メチルブチロニトリル）を加え、溶解が完了するまで、撹拌した。１分間に亘りアルゴンをパージしながら、この溶液から酸素を除去した。次いで、密封したフラスコを、混合しなから６８℃で２４時間に亘り加熱し、光から保護した。室温まで冷却した後、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ₄−ＶＮ）ポリマーを、酢酸エチル中に粗製反応媒質を注ぐことにより単離した。得られた白色固体をジイソプロピルエーテルで３回洗浄し、真空下で乾燥させた。下記に記載する被覆は、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ₄−ＶＮ）ポリマーを精製せずに作製したが、未反応のペプチドは、連続または不連続ダイアフィルトレーションプロセスなどのよく知られたプロセスによって、容易に除去できる。特に効率的な未反応ペプチドの除去は、例えば、５，０００ ＭＷＣＯ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｐｉｎ−Ｘ濃縮カラムを使用して、行うことができる。

【0135】

このポリマーは、数ヶ月に亘り４℃で貯蔵できる。

【0136】

分子量は、屈折率検出器、光散乱検出器、光ダイオードアレイ検出器および粘度計検出器と接続されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。移動相は、トリフルオロエタノール＋トリフルオロ酢酸カリウムであった。平均Ｍｗは８０，０００から１００，０００であり、Ｍｎは２５，０００から３３，０００であり、ＰＤＩは２．８であった。

【0137】

実施例３： ６ウェルプレートの被覆
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されているトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中１ｍｇ／ｍｌ総固形分で、成分（ｉ）としての４０質量％のＰｈｏｔｏ−ＤＭＡＥおよび成分（ｉｉ）としての６０質量％のポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮＰＥＧＭＡＡ）をブレンドすることによって、被覆配合物を調製した。

【0138】

組織培養処理済み（ＴＣＴ）ポリスチレン（ＰＳ）製６ウェルプレート（コーニング社）を使用した。ウェル当たり４０μｌを分配した（１／４インチ（約６．４ｍｍ）の孔のテンプレートの蓋を使用して手作業で）。この蓋をカバープレートと直ちに交換した。５から８分間で、適所にカバープレートを配置して、配合物を縁まで広がらせた。４０℃で１５分間に亘りカバープレートを濾紙と交換することによって、プレートを乾燥させた（または真空乾燥）。紫外線硬化を、「Ｄ」バルブ、８０％の出力、０．６ｍ／分のベルト速度、１回通過で行い、プレートは、粉塵による汚染を避けるために、蓋を適所に配置して逆さまにして曝露される（プレートの底面が、３００ｎｍ未満の波長の固有吸収のために、ペプチドを保護する紫外線フィルタの役割を果たす）。プレートを１時間に亘り１％質量／体積のＳＤＳで洗浄し、次いで、脱イオン水で４回濯ぎ、最後に、穏やかに窒素を流しながら乾燥させた。必要に応じて、プレートをエタノールまたは水中７０％ｖ／ｖのエタノールで洗浄した（消毒を確実にするために）。

【0139】

固定化されたペプチドの量をＢＣＡにより定量化した。結果が図１１に示されている。

【0140】

実施例４： 「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」容器の被覆
ＴＦＥ中１ｍｇ／ｍｌ総固形分で、成分（ｉ）としての４０質量％のＰｈｏｔｏ−ＤＭＡＥおよび成分（ｉｉ）としての６０質量％のポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮＰＥＧＭＡＡ）をブレンドすることによって、４０ｍｌの被覆組成物配合物を調製した。

【0141】

１０ｍｌの溶液を「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」一層容器内に分配した。広げた後、過剰の液体（約７ｍｌ）を注意深く吸引し、１５分間に亘り４０℃で、逆さまにして容器を乾燥させた。

【0142】

冷却後、容器を、Ｄバルブを備えた１２インチ（約３０ｃｍ）Ｆｕｓｉｏｎランプ（端と端を接して２つの６インチ（約１５ｃｍ）ランプを束ねることによって達成された幅）を使用して、約９，０００ｍＪ／ｃｍ²のＵＶ−Ａに曝露した。冷却後、容器を１時間に亘り５０ｍｌの１％質量／体積ＳＤＳ水溶液で洗浄し、次いで、脱イオン水で４回洗浄し、最後に乾燥させた。

【0143】

図１７は、コロイド金染色した（カリフォルニア州、ハーキュリーズ所在のＢｉｏ−Ｒａｄ社から市販されているコロイド金総タンパク質染色試薬(Colloidal Gold Total Protein Stain reagent)）「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」容器の画像であり、大型容器を、ここに記載した被覆で均一に被覆できることを示している。

【0144】

実施例５： 様々なレベルの紫外線硬化による６ウェルプレートの被覆
紫外線硬化を、０．６ｍ／分のベルト速度での０、１、２または３回追加、もしくは１．２ｍ／分のベルト速度での１回通過で行ったことを除いて、実施例３に記載されたように、６ウェルプレートを調製した。洗浄後、固定化されたペプチドをＢＣＡにより定量化した。その結果が図１２に示されており、この図は、明白な紫外線線量応答を示す。

【0145】

実施例６： 比較例１（２０１０年７月２８日に出願した国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２１６０号明細書（ＳＰ１０−２０５））
２０１０年７月２８日に出願した国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２１６０号明細書に記載されたように、トリフルオロエタノール中１０ｍｇ／ｍｌ総固形分で、成分（ｉ）としての１０質量％のＰｈｏｔｏ−ＨＭＡＥおよび成分（ｉｉ）としての９０質量％のポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮＰＥＧＭＡＡ）をブレンドすることによって、被覆配合物を調製した。６ウェルプレートを、上の実施例３に記載したようにこの溶液で調製した。

【0146】

固定化されたペプチドの量をＢＣＡにより定量化した。結果が図１１に示されている。

【0147】

これらの基体は、胚性幹細胞（図１３ｃおよび下記の実施例９における関連する議論を参照のこと）および間葉幹細胞の培養を適切に支持したが、細胞の収穫は、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」付着基体により達成されたものよりも効率的ではなかった（図１６および下記の実施例８における関連する議論を参照のこと）。ペプチドの消費は、１０ｍｇ／ｍｌ溶液のために多い（図１１参照）。

【0148】

実施例７： 比較例２
トリフルオロエタノール中１ｍｇ／ｍｌ総固形分で、成分（ｉ）としての４０質量％のＰｈｏｔｏ−ＨＭＡＥおよび成分（ｉｉ）としての６０質量％のポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮＰＥＧＭＡＡ）をブレンドすることによって、被覆配合物を調製した。６ウェルプレートを、上の実施例３に記載したようにこの溶液で調製した。固定化されたペプチドの量をＢＣＡにより定量化した。結果が図１１に示されている。

【0149】

この実施例から得られたデータは、Ｐｈｏｔｏ−ＨＥＭＡから調製されたブレンド（正に帯電した光反応性ヒドロゲル形成コポリマーではない）は、既知組成培地における胚性幹細胞の培養にとって１ｍｇ／ｍｌほど低い濃度で使用できないことを明白に示した（図１４ｂおよび下記の実施例９における関連する議論を参照のこと）。

【0150】

実施例８： ヒト間葉幹細胞の培養
ヒト骨髄間葉幹細胞（ｈＢＭ−ＭＳＣ）をＳｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＭＳＣ−００１Ｆ）を通じて得た。細胞を、製造業者の推奨にしたがって、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」基質（参照番号０５４２４）で被覆された培養プレート上において「ＭｅｓｅｎＣｌｕｔ−ＸＦ」培地（参照番号０５４２０）中で増殖させた。

【0151】

上の実施例３に記載したように調製した６ウェルプレート内の細胞接着および増殖アッセイについて、３０−７０Ｋ細胞／ウェルを「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ」培地内に播種し、対照の細胞が８０％コンフルエンシーに到達するまで、６〜８日間に亘り３７℃でインキュベーションした。各ウェル内の細胞数を、ＭＴＴアッセイを使用して測定した。

【0152】

トリプシン処理により細胞が遊離する可能性を、細胞を、１ｍＬの０．０５％トリプシン／０．２％ＥＤＴＡと共に５分間に亘りインキュベーションすることによって、第２のウェル内で評価した。次いで、トリプシンを血清含有培地（ＩＭＤＭ、１０％のＦＢＳ）で中和し、ウェルをＰＢＳで濯ぎ、このウェルに「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ」培地を加えた。細胞の遊離を位相差顕微鏡法により評価し、残りの細胞の数を、ＭＴＴアッセイを使用して測定した。残りの細胞の全細胞に対する比は、ＭＴＴ値を比較することによって、定量化できる。

【0153】

使用したプレートは、（ｉ）「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」被覆６ウェルプレート、（ｉｉ）「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」６ウェルプレート（コーニング社）、（ｉｉｉ）実施例６に記載されたような、１０％のＰｈｏｔｏＨＥＭＡ＋９０％のＶＮ−ＰＥＧ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１０ｍｇ／ｍｌ、（「１０／９０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ」）、（ｉｖ）実施例３に記載されたような、４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、（「４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ」）、および（ｖ）実施例８に記載されたような、４０％のＰｈｏｔｏＨＥＭＡ＋６０％のＶＮ−ＰＥＧ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１０ｍｇ／ｍｌ、（「４０／６０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ」）であった。

【0154】

図１５は、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」基体（ａ）および４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ（ｂ）上の「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ」培地中で培養したｈＢＭ−ＭＳＣ細胞の位相差顕微鏡画像、並びにトリプシン処理後の、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」基体（ｃ）および４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ（ｄ）上の「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ」培地中で培養したｈＢＭ−ＭＳＣ細胞の位相差顕微鏡画像を示している。（ｃ）および（ｄ）に提示された画像は、トリプシン処理後の細胞の遊離を示している。

【0155】

図１６は、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」、１０／９０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ、および４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ上の細胞培養物に関するトリプシン処理後の試験表面に付着したままである細胞の比率のＭＴＴ定量化を示すグラフである。図示されるように、細胞の遊離は、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」合成表面上および１０／９０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ上において不適格であるのに対し、４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡにより、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」付着基体生物学的被覆に相当する細胞の収穫がもたらされる。

【0156】

ｈＢＭ−ＭＳＣを、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」付着基体生物学的被覆または４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ（上の実施例４参照）で被覆された「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」培養容器内で培養した。図１８は、「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」中で被覆された、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」付着基体生物学的被覆（ａ）および４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ（ｂ）上の「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ」培地中で増殖したｈＢＭ−ＭＳＣの位相差顕微鏡画像を示している。図１８に提示された画像は、両方の基体上のｈＢＭ−ＭＳＣの類似の形態および被覆率を示している。

【0157】

図１９は、「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」「ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ」中で被覆された、４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ上の「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ」培地中で増殖したｈＢＭ−ＭＳＣ細胞のクリスタルバイオレット染色を示す写真である。この画像は、ここに記載された被覆を使用した場合、このタイプの容器中の間葉幹細胞の細胞接着と増殖の均一性を示す。

【0158】

実施例９： マウス胚性幹細胞の培養
ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１６３２）を、ＡＴＣＣにより推奨されるように、１５％のＦＢＳおよび０．１ｍＭのベータ−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。細胞を、コンフルエンシーに到達する前に、トリプシン処理し、希釈した。

【0159】

接着アッセイについて、ＥＳ−Ｄ３を、トリプシン処理により収集し、計数し、Ｄ−ＰＢＳ中で洗浄し、ＬＩＦを添加したｍＴｅＳＲ１合成培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内に再懸濁させた。次いで、ウェル当たり７．５×１０⁵の細胞を、２ｍＬのｍＴｅＳＲ１＋ＬＩＦ中において６ウェルプレートフォーマット内に播種し、３７℃でインキュベーションした。使用したプレートは、（ｉ）「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」被覆６ウェルプレート、（ｉｉ）「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」６ウェルプレート（コーニング社）、（ｉｉｉ）実施例６に記載されたような、１０％のＰｈｏｔｏＨＥＭＡ＋９０％のＶＮ−ＰＥＧ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１０ｍｇ／ｍｌ、（「１０／９０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ」）、（ｉｖ）実施例３に記載されたような、４０％のＰｈｏｔｏＤＭＡＥ＋６０％のＶＮＰＥＧＭＡＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、（「４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ」）、および（ｖ）実施例８に記載されたような、４０％のＰｈｏｔｏＨＥＭＡ＋６０％のＶＮ−ＰＥＧ−ｃｏ−ＨＥＭＡ、１０ｍｇ／ｍｌ、（「４０／６０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ」）であった。細胞形態を２４時間後に調べ、代表的な位相差顕微鏡写真を撮った。

【0160】

結果の写真のいくつかが、図１３に示されており、ここでは、（ａ）は「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」であり、（ｂ）は「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」であり、（ｃ）は１０／９０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡであり、（ｄ）は４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡである。これら基体の全ては、ＥＳ−Ｄ３細胞の培養を支持した。しかしながら、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」基体は、４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ基体のペプチド濃度の約１００倍のペプチド濃度を有したにもかかわらず、４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡ基体上で培養した細胞の形態は、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」上で培養した細胞よりも、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」上に培養した細胞の形態により厳密に似ていた。

【0161】

いくつかの追加の写真が、図１４に提示されており、ここでは、（ａ）は４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡであり、（ｂ）は４０／６０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡである。図示されるように、４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡはＥＳ−Ｄ３細胞の培養を支持したのに対し、４０／６０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡは支持しなかった。ペプチドの濃度は、４０／６０ＰｈｏｔｏＨＥＭＡ／ＶＮＰＥＧＭＭＡにおけるよりも、４０／６０ＰｈｏｔｏＤＭＡＥ／ＶＮＰＥＧＭＭＡにおけるほうが低いので、このことはいくぶん意外である。

【0162】

それゆえ、細胞培養のための合成組成物および被覆の実施の形態が開示されている。ここに記載された被覆、物品、組成物および方法は、開示された実施の形態以外の実施の形態により実施できることが、当業者により認識される。開示の実施の形態は、制限ではなく、説明の目的で提示される。

【符号の説明】

【0163】

１００ 成分１のプレポリマー
１１０，１１５ 架橋剤部分
１２０ 陽イオン部分
１２５ 陽イオンモノマー
１３０，２３０ 親水性部分
１３５，２３５ 親水性モノマー
１４０，２４０ ポリマー主鎖
１４５，２４５ 重合部分
２００ 成分２のポリマー
２１０ ペプチド結合部分
２１５ ペプチドモノマー
３００ 架橋ポリマー
４００ 細胞培養物品

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13a】

【図13b】

【図13c】

【図13d】

【図14a】

【図14b】

【図15a】

【図15b】

【図15c】

【図15d】

【図16】

【図17】

【図18a】

【図18b】

【図19】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]