特許 5920726 リゾホスファチジルグルコシドに結合する抗体および該抗体を含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5920726

(24)【登録日】2016年4月22日

(45)【発行日】2016年5月18日

(54)【発明の名称】リゾホスファチジルグルコシドに結合する抗体および該抗体を含む組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20160428BHJP

   C12N 15/02 20060101ALI20160428BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20160428BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160428BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20160428BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20160428BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18

   C12N15/00 CZNA

   C12P21/08

   A61K39/395 N

   A61P25/00

   A61P25/28

【請求項の数】7

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2012-523918(P2012-523918)

(86)(22)【出願日】2011年7月7日

(86)【国際出願番号】JP2011065597

(87)【国際公開番号】WO2012005328

(87)【国際公開日】20120112

【審査請求日】2014年7月3日

(31)【優先権主張番号】特願2010-155278(P2010-155278)

(32)【優先日】2010年7月7日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、文部科学省、埼玉県中小企業振興公社からの委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-939

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-940

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】特許業務法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】平林 義雄

(72)【発明者】

【氏名】上口 裕之

(72)【発明者】

【氏名】太田 邦史

(72)【発明者】

【氏名】中村 晃歩

【審査官】 川口 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０６９６０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Neuroscience Research，２００９年，Vol.65, Supplement 1，p.S17, #SY2-C1-3

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リゾホスファチジルグルコシドに結合し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する活性を有する抗体であり、配列番号：１から３に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１〜３として各々含む軽鎖可変領域と、配列番号：４から６に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１〜３として各々含む重鎖可変領域とを保持する抗体。

【請求項2】

配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する抗体。

【請求項3】

リゾホスファチジルグルコシドに結合し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する活性を有する抗体であり、配列番号：１１から１３に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１〜３として各々含む軽鎖可変領域と、配列番号：１４から１６に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１〜３として各々含む重鎖可変領域とを保持する抗体。

【請求項4】

配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する抗体。

【請求項5】

受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９３９またはＮＩＴＥ Ｐ−９４０で特定されるハイブリドーマが産生する抗体。

【請求項6】

神経傷害部位におけるリゾホスファチジルグルコシドに結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれかに記載の抗体を用いて、リゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索を伸長させるための方法（但し、ヒトを手術・治療する方法を除く）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リゾホスファチジルグルコシドに結合し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する活性を有する抗体、当該抗体を有効成分とする組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

神経が、その発生において、その軸索を標的組織に伸長する際に、軸索の先端はいわゆる成長円錐という動的構造をとる。成長円錐は周りのシグナル分子を検出し、拡散性または接触依存的な誘導キューに従って、その伸長方向を変化させており、その検出等には受容体や細胞内器官からなる複合システムが利用されている（非特許文献１）。今日までに同定された軸索誘導因子の大部分は、蛋白質およびその派生物であるが、脂質に基づくメカニズムについての研究から、脳内におけるシグナル伝達の役割を担う分子として、リゾフォスファチジン酸（非特許文献２、非特許文献３）、スフィンゴシン−１−リン酸（非特許文献４）およびエンドカンナビノイド（非特許文献５）の存在が明らかになっている。

【0003】

中枢神経と末梢神経とのインターフェイスとして、脊髄における正確な回路形成は神経発生において重要である。特に、後根神経節（ＤＲＧ）感覚求心性軸索と脊髄二次神経との接続が、決定的に重要なステップとなっている。ＤＲＧ感覚求心性神経には異なるサブタイプが存在し、脊髄内の様々な領域に投射されているが、それらは全て背外側白質の限られた領域である後根進入部（ＤＲＥＺ）を介して脊髄に入り、おそらくは誘導キューの方に向かって適切な標的部位にその軸索を伸長させていくに違いない。脊髄へ投射している求心性軸索を伴うＤＲＧ感覚神経は、ニューロトロフィン受容体の発現によって二つのグループに分けられる。すなわち、ＴｒｋＡ受容体を発現させ、その受容体のリガンドであるＮＧＦに依存的な神経細胞と、ＴｒｋＣ受容体を発現させ、その受容体のリガンドであるＮＴ−３に依存的な神経細胞である（非特許文献６）。また、主なＴｒｋＡ発現神経は侵害知覚性のものであり、その求心性軸索は後角表層において終結する。一方、ＴｒｋＣ発現神経の大部分は自己受容または機械受容性のものであり、腹部灰白質の深部に軸索を投射している（非特許文献７）。

【0004】

今日迄に、脊髄において初期ＤＲＧ求心性神経のパターン形成を制御する様々な分子機構が同定されている。例えば、ニワトリの脊髄においては、ａｘｏｎｉｎ／ＴＡＧ−１およびＦ１１は、各々、侵害知覚性および固有知覚性の求心性神経を正しく先導するのに必要である（非特許文献８）。また、マウスにおいては、背側一過性領域由来のネトリン−１は、間質側枝の灰白質に侵入するタイミングを制御するのに重要な役割を担っている（非特許文献９）。しかしながら、最も多くの研究はセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）に集中している。セマフォリン３Ａは鳥の初期発生におけるコラプシン（突起伸長抑制因子）として同定され（非特許文献１０）、脊髄における侵害知覚性および固有知覚性の求心性神経の異なるパターン形成に関わっている。すなわち、前者においては分泌性セマフォリン３Ａによって阻害または反発が生じるのに対し、後者においてはその反発（化学忌避）シグナルに無反応であることが明らかになっている（非特許文献１１〜１５）。このような２種類の神経群における化学反応性の違いは、セマフォリンシグナル受容体であるニューロピリン（ＮＲＰ−１）の動的な発現によって調節されている。すなわち、発生が進むにつれ、Ｓｅｍａ３Ａの発現領域は徐々に腹側脊髄に制限されてくると同時に、侵害知覚性神経においてＮＲＰ−１の発現が亢進してくる。そして、固有知覚性神経細胞においては対応するようにＮＲＰ−１の発現が減少してくる（非特許文献１５、非特許文献１６）。

【0005】

このように、セマフォリン３Ａについては様々な研究がなされ多くの知見が得られているが、その一方で、脊髄におけるセマフォリンシグナル伝達に非依存的な感覚神経誘導メカニズムの存在が、インビトロおよびインビボでの実験に基づき長い間示唆されてきた（非特許文献１７）。Ｓｅｍａ３Ａホモ欠損マウスまたは野生型マウスの背側脊髄から採取した組織片は、コラーゲンゲルを用いた共培養アッセイにおいてＤＲＧ軸索伸長に対して反発的な作用を示している（非特許文献１８）。また、インビボの場合、Ｓｅｍａ３Ａ欠損マウスにおいて、ＴｒｋＡ神経およびＴｒｋＣ神経の殆どは、腹側および背側の灰白質における個々の標的への正常な中枢性投射を示している（非特許文献１９〜２１）。さらに、Ｎｒｐ−１欠損マウスにおいては、胎生１２日目でその殆どが死んでしまうため、発生後期の灰白質における投射についてのインビボでの解析はできてはいないが、少なくとも発生初期における脊髄求心性投射は正常である（非特許文献２２）。しかしながら、Ｎｒｐ−１欠損マウスの腹側脊髄から採取した組織片の培養実験の結果では、インビトロでのＤＲＧ軸索に対する反発作用が確認されている（非特許文献１８）。また、Ｎｒｐ−１およびＮｒｐ−２のダブルノックアウトマウスは、その細胞が理論上では拡散性クラス３セマフォリンによるシグナル伝達に対して無反応であるが、血管系に欠陥が生じているため、かかる解析を行うことができるようになる前の胎生８日目で死んでしまう（非特許文献２３）。

【0006】

ＳｈａｒｍａおよびＦｒａｎｋ等が行ったニワトリにおける顕微鏡下手術においては、腹側脊髄とその反対側に位置する背側脊髄とを置き換える処置をニワトリに施し、インビトロで培養した際に、腹側脊髄を欠損させたニワトリ由来の試料においても固有知覚性および侵害知覚性の求心性神経細胞のステレオタイプなパターン形成が維持されていることから、広範囲な拡散性反発因子の腹側−背側における濃度勾配機構に対して異議を唱えている（非特許文献２４）。しかしながら、間質性側枝が灰白質内に伸長する前の、ＤＲＥＺ内のＤＲＧ求心性神経の初期のパターン形成において、Ｓｅｍａ３Ａシグナル伝達が役割を担っているということが、インビボにおいて明らかになっている。さらに、Ｇｕおよびその仲間らによる遺伝的なアプローチによって、生存可能なＮｒｐ−１変異マウスが作製され、ＤＲＧ求心性神経の後角への早熟な間質性伸長が示されている（非特許文献２５）。また、Ｂｒｏｎおよびその仲間らは、インオボエレクトロポレーションを用い、ニワトリ胚内の発生途上の脊髄において、ＮＲＰ−１に対してＳｉＲＮＡを作用させ、同様の結果を得ている。すなわち、ＤＲＧ軸索は後角に達する前、脊髄のＤＲＥＺに達した段階でその伸長を「一時停止」することが知られているが、ＮＲＰ−１をＳｉＲＮＡによりノックダウンすると、かかる「一時停止（待機期間）」が減少し、求心性神経は灰白質に時期尚早に侵入し、そのまま真っすぐ伸長して正中線まで到達するということが明らかになっている（非特許文献２６）。しかしながら、このような研究成果は、後期発生において提案されている分化メカニズムとは異なり、初期のパターン形成における障害がＴｒｋＡおよびＴｒｋＣ求心性神経の時期尚早な内側への伸長を生じさせていることを示唆するものである。また、Ｇｕとその仲間達によって作製された生存可能なノックアウトマウスの結果と比較して、前記ニワトリ胚の結果においては、不適切な伸長はより多く見られており、げっ歯類と鳥類との誘導メカニズムの基本的な相違であることが示されている。マウスにおいて、固有知覚性の求心性神経と侵害知覚性の求心性神経の内部への伸長は連続的なものであり、前者よりも２４時間以上も前に、後者の内部への伸長が生じる。一方、ニワトリにおいては同時に生じており、鳥類においては、発生のタイミングよりもむしろ誘導キューの方が、二種の求心性感覚神経間の領域を区別するのに重要であることが示唆される（非特許文献２７）。

【0007】

一方、膜糖脂質分子の１種であるホスファチジルグルコシド（ＰｔｄＧｌｃ）がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓで同定され（非特許文献２８）、さらに最近では哺乳動物の細胞において、同種の脂質が推定上の細胞内シグナル伝達物質として同定された（非特許文献２９、非特許文献３０）。続いて、ＰｔｄＧｌｃ特異的なモノクローナル抗体（ＤＩＭ２抗体）が作製され（非特許文献３１）、ＰｔｄＧｌｃがラットの皮質放射状グリア細胞のマーカーとして同定された（非特許文献３２）。ＰｔｄＧｌｃについては、皮質に加え、脊髄を含むＣＮＳ（中枢神経系）の大部分に局在していることも知られている（非特許文献３２）。さらに、リゾホスファチジルグルコシドはＰｔｄＧｌｃの加水分解産物であり、軸索伸長に対して強い反発的作用を示すことが報告されている（特許文献１）。当該反発作用を有する分子の活性を抑制しうる分子を開発できれば、神経障害疾患、神経変性疾患および神経傷害における神経回路の修復を促進することが可能となるが、そのような分子は、いまだ開発されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２００７／０６９６０３号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｊ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８，１９５９−６４（Ｄｅｃ６，２００２）．

【非特許文献2】Ｊ．Ｊ．Ｃｏｎｔｏｓ，Ｎ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｊ．Ａ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｋａｕｓｈａｌ，Ｊ．Ｃｈｕｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，１３３８４−９（Ｎｏｖ２１，２０００）．

【非特許文献3】Ｇ．Ｅｓｔｉｖｉｌｌ−Ｔｏｒｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ １８，９３８−５０（Ａｐｒ，２００８）．

【非特許文献4】Ｌ．Ｓｔｒｏｃｈｌｉｃ，Ａ．Ｄｗｉｖｅｄｙ，Ｆ．Ｐ．ｖａｎ Ｈｏｒｃｋ，Ｊ．Ｆａｌｋ，Ｃ．Ｅ．Ｈｏｌｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３５，３３３−４２（Ｊａｎ，２００８）．

【非特許文献5】Ｐ．Ｂｅｒｇｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６，１２１２−６（Ｍａｙ２５，２００７）．

【非特許文献6】Ｗ．Ｄ．Ｓｎｉｄｅｒ，Ｉ．Ｓｉｌｏｓ−Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ３５１，３９５−４０３（Ｍａｒ２９，１９９６）

【非特許文献7】Ｓ． Ｏｚａｋｉ，Ｗ．Ｄ．Ｓｎｉｄｅｒ，Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ３８０，２１５−２９（Ａｐｒ７，１９９７）．

【非特許文献8】Ｆ．Ｅ．Ｐｅｒｒｉｎ，Ｆ．Ｇ．Ｒａｔｈｊｅｎ，Ｅ．Ｔ．Ｓｔｏｅｃｋｌｉ，Ｎｅｕｒｏｎ ３０，７０７−２３（Ｊｕｎ，２００１）．

【非特許文献9】Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３３，１３７９−８７（Ａｐｒ，２００６）．

【非特許文献10】Ｙ．Ｌｕｏ，Ｄ．Ｒａｉｂｌｅ，Ｊ．Ａ．Ｒａｐｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５，２１７−２７（Ｏｃｔ２２，１９９３）．

【非特許文献11】Ｄ．Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｗ．Ｇｅｒｆｅｎ，Ｉ．Ｓｉｌｏｓ−Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｗ．Ｄ．Ｓｎｉｄｅｒ，Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ３６１，３２１−３３（Ｏｃｔ１６，１９９５）．

【非特許文献12】Ｅ．Ｋ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １４，９４９−５９（Ｍａｙ，１９９５）．

【非特許文献13】Ａ．Ｗ．Ｐｕｓｃｈｅｌ，Ｒ．Ｈ．Ａｄａｍｓ，Ｈ．Ｂｅｔｚ，Ｎｅｕｒｏｎ １４，９４１−８（Ｍａｙ，１９９５）．

【非特許文献14】Ｔ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｙ．Ｌｕｏ，Ｆ．Ｌｅｆｃｏｒｔ，Ｌ．Ｆ．Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ｊ．Ａ．Ｒａｐｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４，１３７７−８５（Ａｐｒ， １９９７）．

【非特許文献15】Ｓ．Ｙ．Ｆｕ，Ｋ．Ｓｈａｒｍａ，Ｙ．Ｌｕｏ，Ｊ．Ａ．Ｒａｐｅｒ，Ｅ．Ｆｒａｎｋ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ４５，２２７−３６（Ｄｅｃ，２０００）．

【非特許文献16】Ａ．Ｐｏｎｄ，Ｆ．Ｋ．Ｒｏｃｈｅ，Ｐ．Ｃ．Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ５１，４３−５３（Ａｐｒ，２００２）．

【非特許文献17】Ｔ．Ｍａｓｕｄａ，Ｔ．Ｓｈｉｇａ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ５１，３３７−４７（Ａｐｒ，２００５）．

【非特許文献18】Ｔ．Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５４，２８９−３０２（Ｆｅｂ１５，２００３）．

【非特許文献19】Ｏ．Ｂｅｈａｒ，Ｊ．Ａ．Ｇｏｌｄｅｎ，Ｈ．Ｍａｓｈｉｍｏ，Ｆ．Ｊ．Ｓｃｈｏｅｎ，Ｍ．Ｃ．Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３８３，５２５−８（Ｏｃｔ１０，１９９６）．

【非特許文献20】Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １９，５１９−３０（Ｓｅｐ，１９９７）．

【非特許文献21】Ｓ．Ｍ．Ｃａｔａｌａｎｏ，Ｅ．Ｋ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｃ．Ｊ．Ｓｈａｔｚ，Ａ．Ｃｈｅｄｏｔａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １１，１７３−８２（Ｊｕｌ，１９９８）．

【非特許文献22】Ｔ．Ｋｉｔｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １９，９９５−１００５（Ｎｏｖ，１９９７）．

【非特許文献23】Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，３６５７−６２（Ｍａｒ１９，２００２）．

【非特許文献24】Ｋ．Ｓｈａｒｍａ，Ｅ．Ｆｒａｎｋ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５，６３５−４３（Ｆｅｂ，１９９８）．

【非特許文献25】Ｃ．Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ５，４５−５７（Ｊｕｌ，２００３）．

【非特許文献26】Ｒ．Ｂｒｏｎ，Ｂ．Ｊ．Ｅｉｃｋｈｏｌｔ，Ｍ．Ｖｅｒｍｅｒｅｎ，Ｎ．Ｆｒａｇａｌｅ，Ｊ．Ｃｏｈｅｎ，Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３０，２９９−３０８（Ｊｕｎ，２００４）．

【非特許文献27】Ｂ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ，Ｈ．Ｒ．Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｅ．Ｆｒａｎｋ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ １３８，７２−６（Ａｐｒ１３，１９９２）

【非特許文献28】Ｓ．Ａ．Ｓｈｏｒｔ，Ｄ．Ｃ．Ｗｈｉｔｅ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １０４，１２６−３２ （Ｏｃｔ，１９７０）．

【非特許文献29】Ｙ．Ｎａｇａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４９７，１４１−７ （Ｍａｙ２５， ２００１）

【非特許文献30】Ｙ．Ｎａｇａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００，７４５４−９（Ｊｕｎ２４，２００３）

【非特許文献31】Ｙ．Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１１，１０６−１６（Ａｐｒ２０，２００６）．

【非特許文献32】Ｙ．Ｎａｇａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５，８７４２−５０（Ｊｕｌ２５，２００６）．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、リゾホスファチジルグルコシドの神経細胞の軸索伸長に対する反発的な作用を抑制しうる分子を提供することにある。さらなる本発明の目的は、このような分子を有効成分とする、リゾホスファチジルグルコシドの神経細胞の軸索伸長に対する反発的な作用を抑制する組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記課題を解決すべく、まず、ＰｔｄＧｌｃおよびその加水分解産物であるリゾホスファチジルグルコシド（Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ）の機能について詳細な解析を行った。その結果、（１）脊髄における初期の感覚求心性神経のパターン形成において、脂質であるＰｔｄＧｌｃおよびＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃが介在していること、（２）ＰｔｄＧｌｃは脊髄の発生に伴い、初期の神経上皮細胞、白質および背側正中線に動的に広く分散していくが、脊髄後根進入部においては脊髄発生の間全く存在していないこと、（３）インビトロの実験（単離された一神経細胞を用いた実験および３Ｄコラーゲンゲルマトリックスによる組織片培養実験）において、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃが、ＮＧＦの受容体であるＴｒｋＡを発現している神経細胞に特異的（ＮＧＦ依存的）な後根神経節（ＤＲＧ）感覚ニューロンの軸索誘導に対する化学反発物質（化学忌避物質）としての活性を有していること、（４）成体マウスまたはラットの中枢神経に傷害を加えると、その傷害部位においてＰｔｄＧｌｃの発現が亢進していること、を見出した。

【0012】

そこで、本発明者らは、次に、ＰｔｄＧｌｃの加水分解産物であるＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ（ＬＰＧ）に特異的なモノクローナル抗体を作製し、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃのＴｒｋＡを発現している神経細胞に対する反発作用に対する影響を検討した。その結果、作製した抗体が、インビボにおいて、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索投射における異常（例えば、脊髄灰白質内へのＤＲＧ軸索の異常な投射、あるいは、本来ならばＴｒｋＣを発現している神経細胞が優位に存在する背側白質内への、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索の異所的な展開）を生じさせることを見出した。

【0013】

これら知見から、本発明者らは、神経細胞の傷害によってＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃが軸索伸長の場に拡散し、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃがその後の軸索伸長の障害になり得ると考え、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの機能を抑制する抗体を利用することにより、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの反発作用を抑制することが可能であり、当該抗体が、神経障害疾患、神経変性疾患および神経傷害における神経回路の修復を促進するために用いることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0014】

本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）リゾホスファチジルグルコシドに結合し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する活性を有する抗体。
（２）配列番号：１から３に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４から６に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体。
（３）配列番号：７に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体。
（４）配列番号：１１から１３に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１４から１６に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体。
（５）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体。
（６）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９３９またはＮＩＴＥ Ｐ−９４０で特定されるハイブリドーマが産生する抗体。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体が結合するエピト―プに結合する抗体。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制するための組成物。
（９）医薬組成物である、（８）に記載の組成物。
（１０）神経障害疾患、神経変性疾患または神経傷害における神経回路の修復を促進するために用いられる、（９）に記載の組成物。
（１１） （１）〜（７）のいずれかに記載の抗体を用いて、リゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索を伸長させるための方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明により、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの神経細胞の軸索伸長に対する反発的な作用を抑制しうる抗体、および該抗体を有効成分とする、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの神経細胞の軸索伸長に対する反発的な作用を抑制する組成物が提供された。本発明の抗体や組成物によれば、脊髄および/または末梢神経の損傷を伴う神経障害疾患、神経変性疾患および神経傷害における神経回路の修復を促進することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ＤＲＧ−脊髄組織片共培養アッセイにおける評価基準を示す説明図である。

【図2】ＨＨ Ｓｔ．２６、２９、３２、３４、３５のニワトリ胚の脊髄を、抗ＴｒｋＡ抗体または抗ＴｒｋＣ抗体、および抗ＰｔｄＧｌｃ抗体を用いた同時免疫染色法で解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図3】ニワトリ胚の脊髄由来の組織片を、抗ＰｔｄＧｌｃ抗体を用いた免疫染色法で解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図4】ＤＲＧ−脊髄組織片共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ａは、ＮＧＦ添加培地中における背内側の脊髄組織片−ＤＲＧ共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｂは、ＮＧＦ添加培地中における背側の脊髄組織片−ＤＲＧ共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｃは、ＮＴ−３添加培地中における背内側の脊髄組織片−ＤＲＧ共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｄは、ＮＴ−３添加培地中における背側の脊髄組織片−ＤＲＧ共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図5】ＤＲＧ−脊髄組織片共培養アッセイの結果を示すグラフ図である。

【図6】ＨＨ Ｓｔ．３５のニワトリ胚由来のグリア細胞およびその培養上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで解析した結果を示す図である。Ａはトータルイオンクロマトグラムを示し、Ｂは分子量８９３．６のマスクロマトグラムを示し、Ｃは分子量５９９．３のマスクロマトグラムを示す。また、Ｂのマスクロマトグラムの中程のピークはＰｔｄＧｌｃを示し、Ｃのマスクロマトグラムの中程のピークは、左側（リテンションタイム（ＲＴ）：２６．８分）がＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃを示し、右側（ＲＴ：３２．０分）がＬｙｓｏ−ＰｔｄＩｎｓ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、リゾホスファチジルイノシトール）を示す。Ｄは、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃのピークをＭＳ／ＭＳ解析したフラグメンテーションプロファイルを示す。なお、Ｄのｍ／ｚ値 ２８３．３と４１９．３のピークは図７に示した構造に相当する。

【図7】Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの化学構造式並びに推定上のフラグメントイオンのｍ／ｚ値を示す概念図である。

【図8】ＨＨ Ｓｔ．３５のニワトリ胚由来のグリア細胞を、抗ｔｒａｎｓｉｔｉｎ抗体、抗ＰｔｄＧｌｃ抗体およびヘキスト３３２５８を用いた免疫染色法で解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図9】ＨＨ Ｓｔ．３５のニワトリ胚由来のグリア細胞を、抗ＧＦＡＰ抗体、抗ＰｔｄＧｌｃ抗体およびヘキスト３３２５８を用いた免疫染色法で解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図10】抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体の結合活性を表面プラズモン共鳴測定方法により分析した結果を示すグラフ図である。

【図11】抗体存在下における背内側の脊髄組織片−ＤＲＧ共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ａは、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体および抗ＮＲＰ−１抗体存在下における共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｂは、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体存在下における共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｃは、抗ＮＲＰ−１抗体存在下における共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｄは、コントロール抗体（ＩｇＭ）存在下における共培養アッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図12】抗体存在下における背内側の脊髄組織片−ＤＲＧ共培養アッセイの結果を示すグラフ図である。

【図13】成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ａは、ＬＰＧ濃度勾配存在下における、ＮＧＦ添加培地中のＤＲＧ由来神経細胞（ＴｒｋＡｎ）の成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｂは、ＬＰＧ濃度勾配存在下における、ＮＴ−３添加培地中のＤＲＧ由来神経細胞（ＴｒｋＣｎ）の成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｃは、ビークル（１％ｖ／ｖメタノール／ＰＢＳ）存在下における、ＮＧＦで処理されたＤＲＧ由来神経細胞の成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｄは、ＬＰＣ濃度勾配存在下における、ＮＧＦで処理されたＤＲＧ由来神経細胞の成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図14】成長円錐のターニングアッセイの結果を示すグラフ図である。

【図15】抗体存在下における成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ａは、ＬＰＧ濃度勾配存在下におけるＤＲＧ由来神経細胞の成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｂは、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体およびＬＰＧ濃度勾配存在下におけるＤＲＧ由来神経細胞の成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。Ｃは、コントロール抗体（ＩｇＭ）およびＬＰＧ濃度勾配存在下におけるＤＲＧ由来神経細胞の成長円錐のターニングアッセイの結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図16】抗体存在下における成長円錐のターニングアッセイの結果を示すグラフ図である。

【図17】抗体を注入したニワトリ胚（ＨＨ Ｓｔ．２８）の顕微鏡観察写真である。Ａは、コントロール抗体およびＤｉＩを注入したニワトリ胚脊髄の顕微鏡観察写真である。Ｂは、Ａに示した顕微鏡観察写真にＤＩＣイメージを重ね合わせた観察写真である。Ｃは、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体およびＤｉＩを注入したニワトリ胚脊髄における、背側白質内へのＴｒＫＡ軸索の異所的な展開を示す顕微鏡観察写真である。Ｄは、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体およびＤｉＩを注入したニワトリ胚脊髄における、脊髄灰白質内へのＤＲＧ軸索の異常な投射を示す顕微鏡観察写真である。

【図18】中枢神経を損傷した成体マウスの脳を抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を用いた免疫染色法により解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図19】図１８に示したマウスとは異なる、中枢神経を損傷した成体マウスの脳を抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を用いた免疫染色法により解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図20】図１８および１９に示したマウスとは異なる、中枢神経を損傷した成体マウスの脳を抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を用いた免疫染色法により解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【図21】中枢神経を損傷した成体ラットの脊髄を抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を用いた免疫染色法により解析した結果を示す顕微鏡観察写真である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、リゾホスファチジルグルコシドに結合し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する活性を有する抗体を提供する。

【0018】

本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、および／または回収された（即ち、単離された）抗体である。

【0019】

本発明における「ＰｔｄＧｌｃ」（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ホスファチジルグルコシド、ホスファチジル−β−グルコシド）は、下記の化学構造式を有する化合物である。

【0020】

【化1】

【0021】

また、本発明における「リゾホスファチジルグルコシド」はＰｔｄＧｌｃの加水分解産物であり、Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃまたはＬＰＧとも称され、下記の化学構造式を有する化合物である。

【0022】

【化2】

【0023】

さらに、「ＴｒｋＡ」（Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ Ａ、トロポミオシン関連キナーゼＡ）は神経成長因子（ＮＧＦ）の細胞膜受容体であり、ＮＴＲＫ１（ＮＥＵＲＯＴＲＯＰＨＩＣ ＴＹＲＯＳＩＮＥ ＫＩＮＡＳＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＴＹＰＥ １）とも称される蛋白質または遺伝子である。典型的には、ヒトのＴｒｋＡは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００２５２０．２（ＮＭ＿００２５２９．３）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスのＴｒｋＡは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０２８２９６．１（ＮＭ＿００１０３３１２４）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、ラットのＴｒｋＡは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０６７６００．１（ＮＭ＿０２１５８９．１）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、ニワトリのＴｒｋＡは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿９９０７０９．１（ＮＭ＿２０５３７８．１）で特定される蛋白質（遺伝子）である。しかしながら、蛋白質の配列、そしてそれをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明においては、このような天然の変異体も含まれる。

【0024】

本発明において「神経障害疾患、神経変性疾患」とは、脊髄および／または末梢神経の損傷を伴う疾患を意味し、例えば、外傷性神経傷害、外傷性神経変性疾患、脳梗塞性神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、筋萎縮性側索硬化症、老年痴呆、アルツハイマー症、パーキンソン病、嗅覚異常症、緑内障、網膜色素変性症、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞等が挙げられる。

【0025】

また、本発明において「神経傷害」とは、疾患等による内的要因ではなく、物理的圧迫、衝撃といった外的要因による脊髄および/または末梢神経の損傷を意味する。

【0026】

本発明において「ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する活性」には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける活性およびｉｎ ｖｉｖｏにおける活性の双方を含む意である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける当該活性は、例えば、実施例７に記載のインビトロ ターニングアッセイにより、被検抗体存在下で、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の伸長に対するＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの化学反発性を検出し、当該化学反発性を抑制する活性として評価することができる。また、ｉｎ ｖｉｖｏにおける当該活性は、例えば、実施例８に記載の通り、被検抗体を実験動物の胚内脊髄に注入し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索投射における異常（例えば、脊髄灰白質内へのＤＲＧ軸索の異常な投射、あるいは、本来ならばＴｒｋＣを発現している神経細胞が優位に存在する背側白質内への、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索の異所的な展開）を生じさせる活性として評価することができる。

【0027】

本発明には、本実施例に記載の抗体（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−９３９またはＮＩＴＥ Ｐ−９４０で特定されるハイブリドーマにより産生される抗体）が含まれる。

【0028】

本発明の抗体の好ましい態様は、これら抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそれらのアミノ酸配列変異体である。

【0029】

ＮＩＴＥ Ｐ−９４０で特定されるハイブリドーマにより産生される抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を保持する抗体およびれらのアミノ酸配列変異体は、具体的には、配列番号：１から３に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４から６に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体である。

【0030】

また、ＮＩＴＥ Ｐ−９３９で特定されるハイブリドーマにより産生される抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を保持する抗体およびれらのアミノ酸配列変異体は、具体的には、配列番号：１１から１３に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１４から１６に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体である。

【0031】

本発明の抗体の他の好ましい態様は、本実施例に記載の抗体の軽鎖可変領域と、重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそのアミノ酸配列変異体である。具体的には、配列番号：７に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体、ならびに、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体である。なお、配列番号：７に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：９に示し、配列番号：８に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：１０に示し、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：１９に示し、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：２０に示す。

【0032】

本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびこれら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。

【0033】

本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平７−１９４３８４号公報、特許３２３８０４９号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、特許２９１２６１８号、特許２８２８３４０号公報、特許３０６８５０７号公報、欧州特許２３９４００号公報、欧州特許１２５０２３号公報、国際公開９０／０７８６１号公報、国際公開９６／０２５７６号公報参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９２）、Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。

【0034】

本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、リゾホスファチジルグルコシドを特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。

【0035】

ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖および重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つまたはそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。

【0036】

「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識および結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域および２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。

【0037】

本発明の抗体には、望ましい活性（例えば、リゾホスファチジルグルコシドに結合する活性、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制する活性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加および／または挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。

【0038】

改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。

【0039】

また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数、位置、種類を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入または欠失などの公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、特許４３６８５３０号公報、特許４２９０４２３号公報、米国特許第５０４７３３５号公報、米国特許第５５１０２６１号公報、米国特許第５２７８２９９号公報、国際公開第９９／５４３４２号公報）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。

【0040】

本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（リゾホスファチジルグルコシド）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ＡＤＬｉｂ法によって作製することができる。

【0041】

ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（リゾホスファチジルグルコシド）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、リゾホスファチジルグルコシドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。リゾホスファチジルグルコシドに対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。

【0042】

組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体またはペプチドをコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。

【0043】

ＡＤＬｉｂ法は、トリコスタチンＡ処理により多様化したＤＴ４０細胞で構成されたニワトリＢ細胞由来のライブラリー（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ、ＡＤＬｉｂ、自律多様化ライブラリー）から、磁気ビーズに固定化したリゾホスファチジルグルコシドを抗原として用いて、該抗原に親和性を有する抗体を表面に提示したＢ細胞クローンを選別し、限界希釈後に増殖させ、かかるＢ細胞クローンの培養上清からモノクローナル抗体を取得する方法である（Ｓｅｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，７３１−７３５（２００５）およびＳｅｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１，１５０２−１５０６（２００６））。なお、本発明の抗体が認識するリゾホスファチジルグルコシドは、種間で保存されている糖脂質分子であるため、免疫寛容が働かないＡＤＬｉｂ法は、本発明の抗体を作製する方法として特に好適に用いることができる。

【0044】

本発明は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ＤＮＡを保持する宿主細胞、および該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供するものである。

【0045】

また、本発明の抗体は、後述の実施例に示す通り、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制することができる。従って、本発明は、本発明の抗体を用いて、リゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索を伸長させるための方法も提供することができる。

【0046】

本発明の軸索を伸長させるための方法としては、例えば、後述の実施例６及び７に示す通り、インビトロの実験系においては、ＴｒｋＡを発現している神経細胞とリゾホスファチジルグルコシドとの培養系（コラーゲンゲル等）に本発明の抗体を添加する方法が挙げられる。また、後述の実施例８に示す通り、インビボの実験系においては、ＴｒｋＡを発現している神経細胞が存在する組織や該細胞の軸索が伸長していく部位（または伸長していくであろうと想定され得る部位）にマイクロインジェクションや注射等によって本発明の抗体を注入する方法が挙げられる。さらに、次に記載する通り、添加又は投与（注入等）に適した組成物の態様を選択することによっても、好適にリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制し、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索を伸長させることができる。

【0047】

本発明は、また、本発明の抗体を有効成分とする、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制するための組成物を提供する。本発明の組成物は、生体内においてＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制するために用いられる医薬組成物や飲食品（動物用飼料を含む）の形態、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）でＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制するために用いられる試薬の形態であり得る。本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、例えば、神経障害疾患、神経変性疾患および神経傷害における神経回路の修復を促進するために用いることができる。本発明は、本発明の抗体を有効成分とする、神経障害疾患、神経変性疾患または神経傷害における神経回路の修復を促進するために用いる医薬組成物、および本発明の抗体の有効量を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、神経障害疾患、神経変性疾患または神経傷害における神経回路の修復を促進する方法をも提供するものである。本発明の組成物は、ヒト以外に、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む各種哺乳動物に適用することが可能である。

【0048】

本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。

【0049】

これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。

【0050】

本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、神経再生作用のある他の物質や神経回路の修復作用のある他の物質と併用してもよい。このような神経再生作用のある他の物質としては、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ｃＡＭＰ、α−インテグリン、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ ３、ＮＧＦ（Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＤＮＦ、Ｎｏｇｇｉｎ等の神経再生促進因子が挙げられ、さらに、神経回路の修復作用のある他の物質としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＮＧ２、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）、ＥｐｈＢ２、Ｓｌｉｔ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｒ、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ（セマフォリン３Ａ）、Ｎｏｇｏ−Ａ、ＭＡＧ等の軸索伸長反発因子に対するアンタゴニスト（例えば、抗体、低分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム等）が挙げられる。また、かかる併用としては、本発明の抗体と、神経再生作用のある他の物質および神経回路の修復作用のある他の物質の少なくとも１種以上とを含有してなる医薬組成物を単剤として投与してもよく、本発明の抗体と、神経再生作用のある他の物質および神経回路の修復作用のある他の物質の少なくとも１種以上とを別個に調製して、同時または間隔をおいて投与してもよい。本発明の抗体と、神経再生作用のある他の物質および神経回路の修復作用のある他の物質の少なくとも１種以上とを組み合わせる好適な成分比は適宜選択することができる。

【0051】

本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、神経の再生または神経回路の修復に有効な１種もしくは２種以上の成分を添加してもよい。また、神経の再生等以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。

【0052】

本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の組成物の投与量または摂取量は、一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0053】

本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、神経回路の修復に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。神経回路の修復に用いられる旨の表示においては、本発明の組成物を投与もしくは摂取することにより神経回路が修復される機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、ＴｒｋＡを発現している神経細胞の軸索伸長に対するリゾホスファチジルグルコシドの反発作用を抑制することに関する情報が挙げられる。また、神経再生に用いられる旨の表示においては、神経障害疾患、神経変性疾患または神経傷害の治療、あるいは予防のために用いられること、に関する情報を含むことができる。

【0054】

なお、本発明においては、本発明の抗体を投与して、神経障害疾患、神経変性疾患または神経傷害を治療する態様も考えられる。従って、本発明は、本発明の抗体を投与する、神経障害疾患、神経変性疾患または神経傷害を治療するための方法も提供することができる。 本発明の医薬組成物は、神経障害疾患、神経変性疾患または神経傷害の診断への応用も考えられる。

【0055】

本発明の抗体を診断薬として用いる場合あるいは研究目的のための試薬として用いる場合、本発明の抗体は、標識したものであってもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン／アビジンなどが挙げられる。本発明の抗体をこれら薬剤として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ（生理食塩を含むリン酸緩衝液）等で希釈した後、０．１％アジ化ナトリウム等を防腐剤として加えることができる。また、例えば、ラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものについて抗体価を求め、適当に希釈し、防腐剤を添加して用いることもできる。

【実施例】

【0056】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0057】

なお、本実施例の記載において、下記の用語は各々括弧内の用語を意味しているものである。
Ｅ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄａｙ、胎生 日目）、ＤＲＧ（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ、後根神経節）、ＤＲＥＺ（Ｄｏｒｓａｌ Ｒｏｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｚｏｎｅ、後根侵入部）、ＨＨ Ｓｔ．（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｇｅ、ハンバーガー‐ハミルトンステージ）、ＬＰＡ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ、リゾホスファチジン酸）、ＬＳＣＭ（Ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、共焦点レーザー顕微鏡）、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、リゾホスファチジルグルコシド）、ＬＰＣ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＬｙｓｏＰｔｄＣｈｏ、リゾホスファチジルコリン）、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、神経成長因子）、ＮＲＰ−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１、ニューロピリンー１）、ＮＴ−３（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３、ニューロピリン−３）、ＰｔｄＧｌｃ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ホスファチジル−β−Ｄ−グルコシド）、Ｓｅｍａ３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ、セマフォリン３Ａ）、ＴＬＣ（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、薄層クロマトグラフィー）、ＴｒｋＡ（Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ Ａ、トロポミオシン関連キナーゼＡ）、ＴｒｋＣ（Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ Ｃ、トロポミオシン関連キナーゼＣ）、ｖ／ｖ（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ、容量／容量）。

【0058】

また、実施例における実験並びに解析は下記の通りに行った。

【0059】

（実験動物）
レグホーン種の受精卵は地元の業者（井上養鶏場、相模原）から購入し、胚が適当な時期に発生するまで、ずっと揺孵卵器（強制通風、振とう可能）内で３８℃にて維持した。また、胚は正常なニワトリの発生のハンバーガー−ハミルトンシリーズに則して、ステージ分けした（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．８，４９−９２（１９５１）参照）。そして、全ての手法および実験は理研の動物保護ガイドラインを順守して行った。

【0060】

（モノクローナル抗体および組織標本）
抗ニワトリＴｒｋＡモノクローナル抗体（Ｏａｋｌｅｙ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７：４２６２−４２７４（１９９７）参照）または抗ＴｒｋＣモノクローナル抗体（Ｌｅｆｃｏｒｔ．Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１６（１１）３７０４−３７１３（１９９６）参照）、およびＤＩＭ−２１モノクローナル抗体（Ｇｒｅｉｍｅｌ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １６，７２１０−７（Ａｕｇ１，２００８）および非特許文献３１ 参照）を用いて、凍結切片の二重免疫蛍光染色を行った。ニワトリ胚は適当な時期に卵殻から分離し、断首した、得られた胴体は速やかに４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド／ＰＢＳに浸け、４℃で一晩かけて固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、かかる胚は３０％スクロース溶液（４℃）中に移し、溶液の底の方に沈むまで浸けた（通常、数時間以内に沈む）。そして、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社製）に胚を包埋した後、液体窒素に浸けて速やかに凍らせ、必要とするまで−８０℃で得られた凍結ブロックを保存した。また、ＨＭ５６０クライオスタット（Ｚｅｉｓｓ社製）にて腰仙部脊髄の部分を切断し、胴体を厚さ２５μｍの横断切片にして、必要とするまで−２０℃で保存した
（免疫染色）
前記横断切片（スライド）等を室温に戻し、組織切片にワックスバリアペン（大道産業社製）を用いて、撥水性サークルを施した。抗体の非特異的な結合を減らすため、切片を１０％ｖ／ｖ正常馬血清／ＰＢＳで１時間インキュベートした。血清によるブロッキング処理に次いで、１０％血清で希釈した一次抗体（ＤＩＭ２１の希釈率は１：５００であり、抗ＴｒｋＡまたは抗ＴｒｋＣの希釈率は１：１０００）を切片に添加して、４℃で一晩インキュベートした。そして、蛍光色素が結合された二次抗体で３時間インキュベートする前に、一次抗体で標識された切片をＰＢＳで３回洗浄した。なお、二次抗体は種特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４が結合された抗ＩｇＭまたはＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を血清で１：５００に希釈し使用した。二次抗体で切片を染色した後、二次抗体で染色された切片をＰＢＳで３回洗浄してマウントした後、かかる切片に結合している抗体標識を固定ステージ共焦点顕微鏡（オリンパス社製）をもって観察し、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ソフトウェアによって制御された浜松Ｏｒｃａカメラで撮影した。

【0061】

（脊髄内グリア初代培養と質量分析）
脊髄内グリア細胞を、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，１８７−９６（Ｎｏｖ，１９９１）およびＳ．Ｋｅｎｔｒｏｔｉ，Ａ．Ｖｅｒｎａｄａｋｉｓ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ４７，３２２−３１（Ｆｅｂ１，１９９７）に記載されている通りに単離し、培養した。すなわち、ＨＨ Ｓｔ．３５の胚の頭部を除去し、胴体を解剖した。腹部椎弓切除についで、脊髄を胚から単離した後に、さらに付着している膜および脊髄神経根を顕微鏡下手術用ハサミを用いて除去した。このように単離して得られた脊髄を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁し、プラスチックセルスクレイパーを用いて、７０μｍセルストレイナーに通した。Ｐｏｌｙ−Ｄ−リシンで一晩前処理した１０ｃｍ細胞培養用ディッシュに、得られた細胞懸濁液を播き、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中において、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。４８時間培養した後、不要物除去のため、かかる培養細胞を新しいリシンコートディッシュに播きなおし、１２０時間以上、先と同様の条件下で培地を２回交換しながら培養した。さらに、かかる細胞の一部は免疫染色解析のため、リシンコートされた３５ｍｍガラスカバースリップ上で培養した。また、質量分析にかけるため、培地交換時に培養上清を回収し、−８０℃で凍結保存した。そして、１６８時間培養した後、トリプシン処理を施して１０ｃｍディッシュから細胞を回収した。そして、ＰｔｄＧｌｃの発現およびグリアマーカーを免疫染色で解析するために、カバースリップ上で培養した細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで４℃、一晩処理して固定した。また、回収したグリア細胞の培養上清はメタノールで前処理されたＯＤＳカラム（ＯｒｏＳｅｐ Ｃ１８、６００ｍｇ、ＯＲＯＣＨＥＭ ＣＲＣ １８６００）に充填し、非吸着画分を純水にて洗い流した。そして、ＯＤＳカラムに吸着した物質をクロロホルム／メタノ―ル（ＣＨＣｌ_３／ＣＨ_３ＯＨ＝２：１（ｖ／ｖ））混合溶液を用いて溶出させた。そのＯＤＳカラムに吸着していた脂質を窒素ガス流入下で乾燥させ、４：１ ＣＨＣｌ_３／ＣＨ_３ＯＨに再溶解し、同じ混合溶液で平衡化したイアトロビーズカラム（三菱科学ヤトロン社製）に充填した後、ＣＨＣｌ_３／ＣＨ_３ＯＨ混合溶液（４：１、３：１、２：１、１：１、１：２）で段階的に、最後は１００％ ＣＨ_３ＯＨで溶出した。ＰｔｄＧｌｃはＣＨＣｌ_３／ＣＨ_３ＯＨ（２：１ および １：１）画分に溶出され、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃはＣＨＣｌ_３／ＣＨ_３ＯＨ（１：１ および １：２）画分に溶出された。また、グリア細胞由来のＰｔｄＧｌｃの解析を行うため、回収した細胞をハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、凍結乾燥した。脂質は２：１ ＣＨＣｌ_３／ＣＨ_３ＯＨ混合溶液およびＣＨＣｌ_３／ＣＨ_３ＯＨ／水混合溶液（５：８：３， ｖ／ｖ／ｖ）で抽出し、窒素ガス流入下で蒸発させ、ＰｔｄＧｌｃを前記と同様の方法にて上清としてイアトロビーズカラムにより抽出した。

【0062】

（脊髄内グリア初代培養細胞の免疫組織化学的解析）
１０％ 正常馬血清／ＰＢＳで１時間インキュベートし、血清によるブロッキング処理を施す前に、前記固定したグリア細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１０％血清で希釈された一次抗体 ＤＩＭ２１抗体（希釈率 １：５００）、ＥＡＰ−３抗体（抗トランスチン抗体、希釈率 １：２００）または抗ＧＦＡＰ抗体（希釈率 １：２００、カタログ番号：ＭＡＢ３０４２、ケミコン社製）を細胞に添加し、４℃で一晩インキュベートした後、室温下にてＰＢＳで３回洗浄した。そして、蛍光色素が結合された二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８結合ヤギ由来の抗マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａ ５９４結合ヤギ由来の抗マウスＩｇＭ）を１０％血清で１：２００に希釈したものを一次抗体で標識された細胞に添加し、室温下で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、グリア細胞の核をヘキスト３３５２８（ナカライテスク社製）の説明書に従って標識した。このように免疫染色された細胞をＭｏｗｉｏｌ ４−８８溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）にマウントし、４℃で保存した。固定ステージ共焦点顕微鏡（オリンパス社製）の４０倍油浸対物レンズを介して観察し、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ソフトウェアによって制御された浜松Ｏｒｃａカメラで撮影した。

【0063】

（成長円錐ターニングアッセイに用いるためのＤＲＧ神経細胞の調製）
Ｔ．Ｔｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １０，５８−６６（Ｊａｎ，２００７）に記載の方法に少々の改変を加え、単離したＤＲＧ感覚神経の初代培養を行った。すなわち、ＨＨ Ｓｔ．２９のニワトリ胚を卵殻から分離して断首し、胴体を氷冷したＰＢＳに移した。得られた胴体から内臓を鉗子にて除去し、椎弓切除により脊椎を露出させた。胸部または腰仙部の脊髄からＤＲＧを単離し、ｆｉｎｅ ｗａｔｃｈｍａｋｅｒ’ｓ鉗子でばらばらにし、氷上のＬ１５培地中に移した。解剖して得られたＤＲＧを３７℃で２０分間トリプシン処理した後、１００ｇで１分間遠心し、得られたペレットに最小量のＬ１５培地を添加して、手動で細胞を懸濁（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍａｎｕａｌ ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）した。細胞懸濁液を再度１００ｇで１分間遠心し、その上清を除去した。そして、Ｎ−２（インビトロゲン社製）と７５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ＧＩＢＣＯ社製）と、２５ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦまたは５０ｎｇ／ｍｌ ＮＴ−３（シグマアルドリッチ社製）とを添加したレイボヴィッチＬ１５培地にペレットを再懸濁し、細胞を９μｇ／ｃｍ^３マウス由来のラミニン（インビトロゲン社製）でプレコートしたガラスディッシュに一枚当たり１００００細胞数になるように播種した。かかるディッシュを成長円錐ターニングアッセイに用いる前の約２時間、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。

【0064】

（成長円錐のターニングアッセイ）
インビトロ成長円錐ターニングアッセイは少々の改変を施した、Ｍ．Ｌｏｈｏｆ，Ｍ．Ｑｕｉｌｌａｎ，Ｙ．Ｄａｎ，Ｍ．Ｍ．Ｐｏｏ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２，１２５３−６１（Ａｐｒ，１９９２）、Ｊ．Ｑ．Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．Ｍ．Ｐｏｏ，Ｊ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｒ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ４，２０５−１３（１９９６）およびＹ．Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５，８４３−８（Ｓｅｐ，２００２）に記載の方法に沿って行った。すなわち、リゾホスファチジルコリン（シグマアルドリッチ社製）または後述の方法により用意したＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃを、ビークル（１％（ｖ／ｖ）メタノール／ＰＢＳ）で１０μＭの濃度になるように希釈した。ターニングアッセイに用いる前に、リゾリン脂質またはコントロール溶液はｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｂａｔｈ（Ｉｗａｋｉ社製）を用いて１０分間超音波をかけ、そして温浴を用いて３７℃に維持した。ＮＧＦ（プロメガ社製）およびセマフォリン３Ａ／Ｆｃキメラ組み換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）は、各々化学誘因および化学反発のポジティブコントロールとして使用するために、使用する前にＰＢＳにて各々５０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。また、成長円錐ターニングアッセイに用いるピペットは下記の通りに調製した。ホウケイ酸キゃピラリーチューブ（１．０ｍｍ Ｏ．Ｄ．、ｓｔａｎｄａｒｄ ｗａｌｌ ｗｉｔｈ ｆｉｌａｍｅｎｔ、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）は、約１０μｍの大きさに開口された先細で長いピペットを作製するために、Ｆｌａｍｉｎｇ−Ｂｒｏｗｎ Ｐ−９７マイクロピペットピュラ―で引き延ばした。かかるマイクロピペットはマイクロフォージ（ＭＦ−９００、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ社製）を用いて使用する前にチェックした。ピペットはピペットホルダー（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に装着し、ディッシュとピペットとの角度がおよそ４５度になるように培養ディッシュ上方に設置した。かかるピペットを窒素ガスシリンダーと接続し、電気刺激器（日本光電社製）およびＰＶ８２０ Ｐｉｃｏｐｕｍｐ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）によってガス放出は制御した。なお、電気刺激器によって、ＰＶ８２０ Ｐｉｃｏｐｕｍｐは５００ｍｓ間隔で２０ｍｓ間ガス放出が持続されるように設定した。リゾリン脂質の濃度勾配を添加する前、実験に供する候補の成長円錐の写真を撮り、１０分間静置した。なお、成長円錐は、Ｍｅｔａｖｕｅソフトウェアによって制御されたＱｉｍａｇｉｎｇ Ｑｉｃａｍ ＣＣＤカメラで撮影した。その後、少なくとも１０μｍまっすぐ伸長した成長円錐を本アッセイに用いるものとして選択した。培養ディッシュの下方、軸索伸長方向に対して４５度、成長円錐から１００μｍ離れた位置にピペット先端をおいた。そして、電気刺激器のスイッチを入れ、薬剤の濃度勾配を添加した。実験終了後（ｔ＝４５分）、成長円錐の写真を撮り、Ｍｅｔａｖｕｅソフトウェアにより伸長方向の角度を計測した。なお、伸長しなかった成長円錐、崩壊した成長円錐、軸索が４５分の間に分岐した成長円錐は本実施例においては計測対象から外した。また、成長円錐のターニング角度を計測するため、薬剤添加１０分前の軸索成長円錐Ｃドメイン真中と添加時のそれとを通る直線を伸長の初期軌道とした。そして実験終了後に、かかる初期軌道とのずれをターニング角度として計測した。また、実験終了時（ｔ＝４５分）に、薬剤添加時（ｔ＝０）の軸索成長円錐Ｃドメイン真中と実験終了時（ｔ＝４５分）のそれとの距離を軸索伸長の長さとして計測した。

【0065】

（コラーゲンゲルを用いた組織片共培養アッセイ）
ＤＲＧ脊髄組織片共培養アッセイはＲ．Ｋｅｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １８，８８９−９７（Ｊｕｎ，１９９７）に記載の方法に沿って行った。すなわち、ＨＨ Ｓｔ．３５胚を卵殻から離し断首した。ＤＲＧおよび脊髄を胚から単離し、氷上のＬ１５培地中で使うまで維持した。直径約２５０μｍの脊髄と、背内側または背側のＤＲＧとを５００μｍ離してコラーゲンマトリックスに植え込み、Ｎ２、２０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦまたは５０ｎｇ／ｍｌ ＮＴ−３、７５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、３７℃５％ＣＯ_２下で４８時間培養した。４８時間培養後、かかる培養組織を４％ＰＦＡにて４℃で一晩かけて固定した。ＤＲＧ組織片からの軸索伸長を可視化するために、培養組織を抗βチューブリン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）で染色した。すなわち、ＰＢＳで２回洗浄後、抗体の非特異的結合を減らすために培養組織を２％正常馬血清／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｒｉｔｏｎで１時間インキュベートした。そして、培養組織を１時間、抗βチューブリンモノクローナル抗体（２％血清／ＰＢＳで１：５００に希釈）でインキュベートした。ＰＢＳでの１５分間洗浄を３回施した後、培養組織を２％血清で１：２００に希釈したＡｌｅｘａ５９４結合抗マウスＩｇＧ抗体（モレキュラープローブ社製）に３０分間インキュベートした。ＰＢＳでの１５分間洗浄を３回施した後、染色した培養組織を固定ステージ共焦点顕微鏡（オリンパス社製）で観察し、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ソフトウェアによって制御された浜松冷却ＣＣＤカメラによって画像を取り込んだ。化学反発性はＲ．Ｋｅｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １８，８８９−９７（Ｊｕｎ，１９９７）記載の方法により評価した。培養組織に関する免疫染色顕微鏡観察写真中の脊髄とＤＲＧとの間５００μｍを４分割（１２５μｍ）して、ＤＲＧ組織片から脊髄組織片への軸索伸長の長さを測定し、下記基準に則して０＿１０で評価した。
０：ＤＲＧ組織片から脊髄組織片への軸索伸長がなかった。
２：１または複数のＤＲＧ組織片からの軸索伸長が１／４（１２５μｍ）まで達していた。
４：軸索伸長が２／４（１２５μｍ−２５０μｍ）まで達していた。
６：軸索伸長が２５０μｍ−３７５μｍまで達していた。
８：軸索伸長が脊髄に接触するまで達していた。
１０：軸索伸長が脊髄に接触するまで達していただけでなく、脊髄の上または下を通り、脊髄組織片を越えて軸索が伸長した。（図１参照）
このように、化学反発性が最も強いものを０とし、最も弱いものを１０と評価し、全ての培養組織を０＿１０に分けて評価した。

【0066】

（胚内における脊髄へのマイクロインジェクションおよびＤｉＩイオントフォレシス）
Ｅ．Ｔ．Ｓｔｏｅｃｋｌｉ，Ｌ．Ｔ．Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ １４，１１６５−７９（Ｊｕｎ，１９９５）およびＦ．Ｅ．Ｐｅｒｒｉｎ，Ｆ．Ｇ．Ｒａｔｈｊｅｎ，Ｅ．Ｔ．Ｓｔｏｅｃｋｌｉ，Ｎｅｕｒｏｎ ３０，７０７−２３（Ｊｕｎ， ２００１）に記載の方法に少々の改変を加え、機能阻害性を有する特異的モノクローナル抗体を発生中の胚脊髄の中心管にマイクロインジェクションした。インキュベーション３日目（Ｅ３）に１８ｇａニードルを殻を通して、卵の平滑末端側に挿入し、２〜３ｍｌの卵白を抜き出した。そして、はさみで卵殻上部に４〜５ｃｍ^２の穴（窓）を開け、その穴をガラスカバースリップでシールし、溶融パラフィンワックスで固定した。そして、かかる穴をあけた卵を揺らすことなく、ＨＨ Ｓｔ．２３に達するまでインキュベートした（卵に穴をあけてから、約２４時間後に通常この発生段階に達する）。後述の抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃまたはコントロールＩｇＭを１ｍｇ／ｍｌずつ４回、８時間ごとに脊髄にインジェクションした。なお、抗体溶液には０．０５％ Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎを添加し、インジェクションの質および量を顕微鏡で速やかに評価できるようにした。また、見て分かる目印として、全てのインジェクションは後肢間の丁度真ん中にある脊髄に対して行われた。インジェクションする際に、孵卵器から実体解剖顕微鏡（ニコン社製）に卵を移し、カバースリップを外し、抗体をインジェクションした。インジェクション後はカバースリップを戻し、ワックスで再びシールし、孵卵器に卵を戻した。最後の抗体をインジェクションした後、約２４時間はＨＨ Ｓｔ．２８に達するまで孵卵器において胚を成育（回復）させた。かかる回復期間終了後、胚を卵殻から外し、断首し、４℃で４％ｖ／ｖ ＰＦＡ／ＰＢＳを用いて胴体を一晩固定した。そして、かかる固定検体をＰＢＳで洗浄し、１５％ゼラチン（シグマアルドリッチ社製）に包埋し、胴体をＬｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ ビブラトームを用いて切断し、厚さ２５０μｍの腰仙部脊髄の横断切片を得た。ＤＲＧ感覚求心性神経はイオントフォレシスにより導入した脂質親和性色素ＤｉＩ（１，１’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ、ＦａｓｔＤｉＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で標識した。ＤｉＩはエタノールとジメチル−ホルムアミドとの混合溶液（１：１）で５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、そしてガラス管微小電極（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に裏込めした。ＤｉＩを装填した電極に１００％エタノール ３μｌを、次いで２Ｍ 塩化リチウム ３μｌ裏込めし、１２Ｖ電源に接続した。そして、微小電極の先端の標的を背内側ＤＲＧにすることにより、ＴｒｋＡ神経を特異的に標識した。標識後、色素を拡散させるために組織切片は室温、暗下で２〜７日間保存した。かかる保存期間終了後、標識した切片をＬＳＣＭで観察した（ｚ ｓｅｒｉｅｓ ８−１２ 共焦点セクション、ステップサイズ：３μｍ）。すなわち、固定ステージ共焦点顕微鏡（オリンパス社製）の乾式対物レンズ（倍率：２０×または４０×）を介して標識した切片を観察し、Ｆｌｕｏｖｉｅｗソフトウェアによって制御された浜松Ｏｒｃａ ＣＣＤカメラで撮影した。

【0067】

（統計解析）
統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４プログラム（マッキントッシュ用、ｖｅｒ．４．０ｂ、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社製）を用いて行った。

【0068】

（実施例１）
脊髄におけるホスファチジル−β−Ｄ−グルコシド（ＰｔｄＧｌｃ）とＤＲＧ感覚神経性細胞との空間的および時間的関係を観察するため、抗ＴｒｋＡ抗体または抗ＴｒｋＣ抗体、およびＤＩＭ２１抗体を用いて、ＨＨ Ｓｔ．２６、２９、３２、３４、３５の胚（およそＥ５（胎生５日目）からＥ９（胎生９日目）の間の胚に相当する）の同時免疫染色（標識）を行った。得られた結果は図２に示す。なお図２中の白線はスケールバーであり、５００μｍの長さであることを示すものである。また図２中、マゼンタ色の蛍光を発している部分はＤＩＭ２１抗体で染色されている部位を示し、緑色の蛍光を発している部分は抗ＴｒｋＡ抗体（図２中左１列）または抗ＴｒｋＣ抗体（図２中右１列）で染色されている部位を示す。

【0069】

図２に示した結果から明らかなように、ＨＨ Ｓｔ．２６の胚脊髄において、ＤＩＭ２１の免疫反応性の強い部位は背側白質に、弱い部位は卵形ヒス束（Ｏｖａｌ ｂｕｎｄｌｅ ｏｆ Ｈｉｓ）のすぐ後方に位置する側白質に限られており、また、背側灰白質および背側正中線の前駆細胞（神経上皮細胞）において発現していることが点状染色パターンとして確認された。このステージにおいて、脊髄におけるＴｒｋＡ発現領域は卵形ヒス束に限られており、白質における背側および腹側のＤＩＭ２１抗原発現部位の境界となっていた。ＴｒｋＣも卵形ヒス束に発現しているが、ＰｔｄＧｌｃが豊富に存在する始原後索の白質にも局在していることが確認された。

【0070】

ＨＨ Ｓｔ．２９の胚脊髄において、ＰｔｄＧｌｃに対する免疫反応性は背側灰白質において減じているのに対し、始原後索においてはとても強く発現しており、ＤＲＥＺの腹側、側白質においては弱く発現していることが確認された。また、ＴｒｋＡ発現領域はＤＲＥＺに限られており、一方、ＴｒｋＣもこの領域においてとても強く発現しており、さらに背側白質、すなわち図２中矢頭（三角）で示されており、ＰｔｄＧｌｃが強く発現している部位においても強く発現していることが確認された。

【0071】

ＨＨ Ｓｔ．３２の胚脊髄において、ＰｔｄＧｌｃは背側白質に局在しており、また正中線の背内側の両側（図２中矢印が示している部位）、そしてそこから灰白質に向かって拡散しているようにＰｔｄＧｌｃが発現していることも確認された。さらに、ＰｔｄＧｌｃはこのステージにおいて、側および腹側の白質で強く発現しているも確認された。一方、ＴｒｋＡの発現領域はＤＲＥＺおよび後角の表層に限られていることが確認された。また、ＴｒｋＣの発現領域もＤＲＥＺおよび後角の表層であるが、それらに加え、背側白質においてもＴｒｋＣは発現していることが確認された。

【0072】

ＨＨ Ｓｔ．３４の胚脊髄においては、ＰｔｄＧｌｃは背内側および腹側の白質において強く発現しており、さらに背側正中線両側の灰白質においても強く発現していることが確認された。また、ＴｒｋＡの発現領域はＤＲＥＺおよび後角の表層に限られており、依然として、ＰｔｄＧｌｃ発現領域とは明確に区別されるものであるということが確認された。一方、ＴｒｋＣは、ＤＲＥＺおよび背内側白質において強く発現しており、かかる領域でＰｔｄＧｌｃと共在していることも確認された。

【0073】

ＨＨ Ｓｔ．３５の胚脊髄において、ＰｔｄＧｌｃは、始原後索を含む白質の腹側中央、中心管の背側にある灰白質中央部、並びに白質の腹側および背側の３領域において強く発現していることが確認された。一方、このステージにおけるＴｒｋＡの発現はＤＲＥＺおよび後角表層に限られており、ＰｔｄＧｌｃの発現領域に対して補完的な関係となっていることが確認された。また、ＴｒｋＣはＤＲＥＺおよび背内側白質において強く発現しており、いくつかの領域においてＰｔｄＧｌｃの発現と共在していること（図２中アスタリスクで示している部位）が確認された。また、灰白質中央部（前核において、ＴｒｋＣ発現の軸索側枝が運動核に向かって伸長している部位）においてもＴｒｋＣの発現が確認された。

【0074】

また、図には示さないが、ＰｔｄＧｌｃの発現はＨＨ Ｓｔ．３５後の胚脊髄においては急速に落ち込み、ＨＨ Ｓｔ．３８（およそＥ１２（胎生１２日目））までにはその発現を検出することができなくなることが確認された。

【0075】

このように、ＴｒｋＣおよびＰｔｄＧｌｃは脊髄の初期発生において共在している発現領域が存在するのに比べて、ＴｒｋＡとＰｔｄＧｌｃとの境界はどのステージにおいても明確に存在しており、この境界はＰｔｄＧｌｃまたはその派生物がシグナル分子として機能し、２種のＤＲＧ感覚神経（ＴｒｋＣ発現神経細胞およびＴｒｋＡ発現神経細胞）に異なる影響を与えている、すなわちＴｒｋＡ発現神経細胞特異的に化学反発性物質として作用していることを示唆している。

【0076】

（実施例２）
前述の、ＰｔｄＧｌｃまたはその派生物がＤＲＧ感覚神経に対するシグナル分子であり、特にＴｒｋＡ発現神経細胞に対して化学反発性物質として作用しているのではないのかということを実証するために、器官型脊髄／ＤＲＧ組織片培養アッセイを行った。直径約２５０μｍの後根神経節（ＤＲＧ）組織片を３−Ｄコラーゲンマトリックスにて、脊髄を切開して得た組織片と共に培養した。そして、共培養４８時間後のＤＲＧ軸索伸長を観察した。なお、本実施例においては、脊髄由来の組織片は切開して、背側（Ｄｏｒｓｏｌａｔｅｒａｌ、ＤＬ）または背内側（Ｄｏｒｓｏｍｅｄｉａｌ、ＤＭ）由来のもの、すなわち、ＰｔｄＧｌｃ含有量が少ない部位（ＤＬ）または多い部位（ＤＭ）に分けて使用した（図２および３参照）。得られた結果は図４および図５に示す。なお、図４中の白線はスケールバーであり、５００μｍの長さであることを示すものであり、図５中の括弧内の数値はアッセイしたＤＲＧ組織片数を示し、三つのアスタリスクが付されているカラムはＰ＜０．００１（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）であることを示す。

【0077】

図４および図５に示した結果から明らかなように、ＮＧＦを添加した培地中においてＤＲＧ軸索は放射状に伸長するが、背内側の脊髄由来の組織片によってその伸長は反発（退縮）させられた。しかし、背側の脊髄由来の組織片ではそのような影響は確認されなかった（図４中ＢおよびＤ、並びに図５参照）。ＮＴ−３を添加して培養したＤＲＧ軸索においては、背内側脊髄由来の組織片による反発作用は確認されなかった（図４中Ｃおよび図５参照）。

【0078】

従って、ＰｔｄＧｌｃまたはその拡散性派生物は、ＮＧＦ依存的な軸索伸長、すなわちＮＧＦの受容体であるＴｒｋＡ等が発現している神経細胞に対して特異的に化学反発性を発揮していることが明らかになった。また一方で、ＰｔｄＧｌｃ等は、ＮＴ−３依存的な軸索伸長、すなわちＮＴ−３の受容体であるＴｒｋＣ等が発現している神経細胞に対しては影響を与えないということも明らかになった。

【0079】

（実施例３）
実施例１において示されているように、ＰｔｄＧｌｃは白質内において広く発現している（図２参照）。従って、脊髄におけるＰｔｄＧｌｃの供給源は非神経細胞であることが予測される。そこで、かかる予測が妥当なものであるかどうかを確認するために、脊髄内グリアを質量分析により解析した。すなわち、ＨＨ Ｓｔ．３５の脊髄から増殖性のグリア細胞を単離し、７日間インビトロで培養し、培養終了後、グリア細胞およびその培養上清をナノ液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計（ｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で解析した。得られた結果は図６に示す。また、かかるグリア細胞培養を用いて質量分析の代わりに免疫染色を行った。得られた結果は図８および図９に示す。なお、図８中、緑色の蛍光を発している部分は抗ｔｒａｎｓｉｔｉｎ抗体で標識された領域であることを示し、白線はスケールバーであり、１０μｍの長さであることを示す。また、図９中、緑色の蛍光を発している部分は抗ＧＦＡＰ抗体で標識された領域を示す。さらに、図８および図９中において、青色の蛍光を発している部分はヘキスト３３２５８で染色された領域、すなわち細胞の核を示し、赤色の蛍光を発している部分は抗ＰｔｄＧｌｃ抗体で標識された領域であることを示す。

【0080】

図６に示した結果から明らかなように、グリア細胞およびその培養上清をナノ液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計（ｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて解析した結果、図７に示したＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃを特徴付ける推定上のフラグメントイオンのピーク（ｍ／ｚ２８３．３、ｍ／ｚ４１９．３）が確認され、グリア細胞はＰｔｄＧｌｃを産出しており、グリア細胞の培養上清にはリゾホスファチジルグルコシド（Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ）、すなわちｓｎ−２部位のアクリル鎖が加水分解されたＰｔｄＧｌｃが含まれていることが明らかになった。

【0081】

また、図８および９に示した結果から明らかなように、グリア細胞培養の半分はＤＩＭ２１抗体と抗ＧＦＡＰ抗体によって二重染色され、ＰｔｄＧｌｃおよび星状アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰが発現している培養細胞であることが確認された。そして、残り半分の培養細胞はＤＩＭ２１抗体およびＥＡＰ３抗体によって二重染色され、ｔｒａｎｓｉｔｉｎおよびＰｔｄＧｌｃを発現しているグリア細胞であることが確認された（なお、ＥＡＰ３抗体はｔｒａｎｓｉｔｉｎ特異的抗体であり、ｔｒａｎｓｉｔｉｎは、哺乳類において放射状グリア細胞および神経前駆細胞のマーカーとして知られているｎｅｓｔｉｎの鳥類におけるホモログである）。

【0082】

従って、かかる生化学的解析および二重免疫染色の結果から、脊髄内の放射状グリア細胞またはグリア系統の細胞がＰｔｄＧｌｃを含有していることは明らかであり、そしてグリア細胞はその細胞外環境に、水溶性派生物 Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃを産生または放出していることが示唆された。

【0083】

（実施例４）
次に、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃに特異的な抗体を作製した。すなわち、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ特異的モノクローナル抗体（抗血清）は、後述の方法に基づき単離または合成して得られたＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃを抗原として、株式会社カイオムバイオサイエンス（独立行政法人理化学研究所 遺伝ダイナミック研究ユニット）によって開発されたＡＤＬｉｂ（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ、自律多様化ライブラリー）システムを用いて作製した（Ｓｅｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，７３１−７３５（２００５）およびＳｅｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１，１５０２−１５０６（２００６） 参照）。

【0084】

＜Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの合成＞
抗原として用いたＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃは、単離または合成して得られたＰｔｄＧｌｃをホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を用いて加水分解することにより得た。すなわち、先ず、非特許文献３２の記載の通り、ラット胎児の脳から単離することによって、または、Ｇｒｅｉｍｅｌ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １６，７２１０−７（Ａｕｇ１，２００８）の記載の通り、化学合成することによって、ＰｔｄＧｌｃを得た。

【0085】

次に、５０〜１００ｎｍｏｌの前記単離または合成によって得られたＰｔｄＧｌｃ（Ｐ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｙ．Ｔｏｒｉｂａｒａ，Ｈ．Ｗａｒｎｅｒ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２８，１７５６−１７５８（Ｎｏｖ １９５６）に記載されているアスコルビン酸還元アッセイを用いて、リン含有量を推定した）を１０μｇ ハチ毒由来のＰＬＡ２（シグマアルドリッチ社製）により、２０μｌ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６、５０ｍＭ））中にて、３７℃で１時間かけ消化した。なお、かかる消化産物の構造はＴＬＣにより確認し、もし加水分解が不十分なようであれば、かかる消化産物に新しい酵素を添加して消化反応を繰り返した。消化反応の後に、反応産物は窒素ガス流入により乾燥させ、クロロホルム／メタノール混合溶液（４：１（ｖ／ｖ））に再溶解し、前記混合溶液で前もって平衡化させたイアトロビーズを充填したカラム（ベッド容量 約１ｍｌ）に添加した。クロロホルム／メタノール混合溶液で洗浄した後、５倍容量のクロロホルム／メタノール混合溶液（２：１、１：１、１：２）、そして純メタノールを段階的に加え、カラム吸着物を溶出した。各溶出画分を窒素ガス流入下で乾燥させ、ＴＬＣによってチェックした。ＰｔｄＧｌｃの殆どはクロロホルム／メタノール（２：１）画分に溶出されており、ＬｙｓｏＰｔｄＧｌｃはクロロホルム／メタノール１：１および２：１）画分から回収した。分画が不十分な場合は、ＬｙｓｏＰｔｄＧｌｃ含有画分を同じカラムをもって再処理した。回収したＬｙｓｏＰｔｄＧｌｃはリン含有量によって見積もり、約１ｎｍｏｌアリコートになるように１２×３２ｍｍガラススクリューバイアル（Ｗａｔｅｒｓ社製）に分注し、使用するまで−８０℃で保存した（なお、保存したＬｙｓｏＰｔｄＧｌｃは調製してから３週間以内に使用した）。

【0086】

（実施例５）
次に実施例４にて得られたＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ特異的な抗体の結合活性（結合の強さ、速さ、選択性）を表面プラズモン共鳴測定方法により分析した。すなわち、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）の所定のプロトコールに従い、先ずセンサーチップ（ＨＰＡ）をオクチルグルコシドにて洗浄した後、抗原リポソームをコーティングした。なお、このようにしてセンサーチップに固定した抗原として、ＬＰＧ、ＬＰＩ（リゾホスファチジルイノシトール）およびＳ−１−Ｐ（スフィンゴシン−１リン酸）を用いた。次に、抗原を固定化したセンサーチップに、実施例４にて得られたＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ特異的な抗体（１００μｇ／ｍｌ）を送液し、次いでＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝液（ＨＢＳ−Ｎ）を通した。そして、この過程におけるレスポンスの変化（センサーグラムの形：抗原と抗体との形成および抗原と抗体との解離）からカーブフィッティングにより結合速度定数（ｋ_ａ）と解離速度定数（ｋ_ｄ）とを算出し、さらにこれらの定数からアフィニティ（解離定数：Ｋ_Ｄ）を求めた。得られた結果（センサーグラム）については、図１０に示す。

【0087】

表面プラズモン共鳴測定方法によって、実施例４にて得られたＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ特異的な抗体を分析した結果、当該抗体はＬＰＧに対して最も強く反応し（Ｋ_Ｄ：１０^−８Ｍオーダー）、ＬＰＧと構造の似ている他のリゾ体（ＬＰＩ）に対する結合活性はその１０分の１程度であった。

【0088】

（実施例６）
次に実施例４にて得られたＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ特異的な抗血清の機能的阻害活性をコラーゲンゲル共培養アッセイを用いて調べた。しかしながら最初は、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を培養系に添加しても、背内側脊髄由来の組織片が発揮する化学反発性に対する僅かな抑制効果（統計的には有意でない程度の化学反発性の減少）しか確認されなかった。そこで、Ｓｅｍａ３Ａもニワトリ初期発生における背側脊髄において発現しているということから（非特許文献１５参照）、少数のＳｅｍａ３Ａ発現細胞またはなかなか消えないＳｅｍａ３Ａ蛋白質それ自体が背側脊髄由来の組織片に残存しており、前記アッセイ系に影響を与えている可能性があったため、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１を機能的に阻害する抗体（ＮＲＰ−１抗体、添加濃度：４μｇ／ｍｌ、ＡＦ５６６、Ｒ＆Ｄシステム社製）を培地中に添加して再度アッセイを行った。なお、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１はＳｅｍａ３Ａシグナル伝達における、Ｓｅｍａ３Ａをリガンドとする受容体である。得られた結果を図１１および図１２に示す。なお図１１中の白線は長さが５００μｍのスケールバーであることを示し、図１２中の括弧内の数値はアッセイした成長円錐数を示し、アスタリスク三つが付されているカラムはＰ＜０．００１（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）であることを示す。

【0089】

図１１および図１２に示した結果から明らかなように、Ｎｒｐ−１受容体の機能を阻害した状況下では、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ（ＬＰＧ）抗体（５μｇ／ｍｌ）は、背内側脊髄由来の組織片のＤＲＧ軸索伸長に対する化学反発作用を１／３以上減少させた（図１１中Ａおよび図１２参照）。なお、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ（ＬＰＧ）抗体または抗ＮＲＰ−１抗体のみの添加では統計的に化学反発活性に対する有意な影響は確認されなかった（図１１中ＢおよびＣ参照）。また、コントロールＡｂ（ＩｇＭ、Ｄｉａｃｌｏｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ社製）を同じ濃度で添加しても、背内側脊髄由来の組織片が発揮する化学反発性への影響は確認されなかった（図１１中Ｄ参照）。

【0090】

（実施例７）
次に、ＮＧＦ依存的神経細胞またはＮＴ−３依存的神経細胞の成長円錐に対するＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの化学反発性をインビトロ ターニングアッセイを用いて調べた。得られた結果を図１３および図１４に示す。また、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体存在下におけるＮＧＦ依存的神経細胞の成長円錐に対するＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの化学反発性をインビトロ ターニングアッセイを用いて調べた。得られた結果を図１５および図１６に示す。なお、図１３および図１５中の白線は長さが５μｍのスケールバーであることを示し、図１３および図１５中の数字はＬＰＧ等の濃度勾配を添加してからの時間（単位：分）を示し、図１３および図１５中の矢頭（三角）はＬＰＧ等の濃度勾配を添加した場所を示すものである。また、図１４および図１６中の括弧内の数値はアッセイした成長円錐数を示し、アスタリスク二つが付されているカラムはＰ＝０．００６３（１−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）であることを示す。

【0091】

図１３および図１４に示した結果から明らかなように、ＮＧＦ添加培地中において、ＨＨ Ｓｔ．２８ ニワトリＤＲＧ由来の神経細胞から伸長した軸索（ＴｒｋＡｎ（ＴｒｋＡ神経細胞）から伸長した軸索）は、化学反発性を有するＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの微視的な濃度勾配に対して特異的にその伸長方向を変えることが明らかになった（図１３中Ａ参照）。一方、ＮＧＦの代わりにＮＴ−３添加培地中において、神経細胞から伸長した軸索（ＴｒｋＣｎ（ＴｒｋＣ神経細胞）から伸長した軸索）は、その伸長方向（角度）の有意な変化は確認されなかった（図１３中Ｂ参照）。また、ビークル（１％ｖ／ｖメタノール含有ＰＢＳ）のみの添加またはＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）のみの濃度勾配では、ＮＧＦまたはＮＴ−３で処理された神経細胞（ＴｒｋＡｎまたはＴｒｋＣｎ）の軸索伸長に対する有意な影響は確認されなかった（図１３中ＣおよびＤ参照、なおＮＴ−３で処理された神経細胞については図示せず）。さらに、図１５および図１６に示した結果から明らかなように、ＮＧＦ添加培地中において、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの濃度勾配を生じさせる３０分前に培養槽内の濃度が５０μｇ／ｍｌになるように抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を添加した場合には、ＤＲＧ由来の神経細胞の伸長方向の変更を抑えることを確認した（図１５中Ｂ参照）。一方で、コントロールＩｇＭ抗体を前記と同じ濃度で添加してもＤＲＧ由来の神経細胞の伸長方向の変更に対する影響は確認されなかった（図１５中Ｃ参照）。

【0092】

しかしながら、かかる結果は、ターニングに対する化学反発性の発揮に必要な成長円錐の細胞内器官への抗体処理における物理的な影響によるという可能性も考え得るため、ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）が発揮する化学反発性に対する抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体の影響を調べた。なお、ＬＰＡは成長円錐ターニングアッセイによって化学反発性を発揮することが明らかになっている（Ｘ．Ｂ．Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５，３８−４５（Ｊａｎ，２００３）参照）。図１６に示した結果から明らかなように、５０μｇ／ｍｌの抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を培養系に添加したものの、成長円錐はＬＰＡの濃度勾配によって、その伸長方向（角度）を変化させており、ＬＰＡの強い化学反発性が確認された。

【0093】

従って、インビトロの一神経細胞を用いた実験系において、外因性Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃはＴｒｋＡ軸索特異的に化学反発性を発揮していることが明らかになった。

【0094】

（実施例８）
次に、インビトロの系で確認されたＴｒｋＡ神経細胞特異的な化学反発性をＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃが発揮することをインビボの系において確認した。すなわち、実験動物におけるＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃシグナル伝達を阻害するために、胚内脊髄に機能阻害性を有する抗体 抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を注入した。なお、実施例６および７に記載の通り、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体が機能阻害性を有する抗体であるということはコラーゲンゲル共培養およびインビトロ成長円錐ターニングアッセイの結果から明らかである。得られた結果は図１７および表１に示す。なお、図１７中点線で囲まれた部位は卵形ヒス束であることを示し、アスタリスクはＴｒｋＣ発現神経細胞が優位の存在している部位を示す。また、図１７中の「ＤＧＭ」は背側灰白質（Ｄｏｒｓａｌ Ｇｒｅｙ Ｍａｔｔｅｒ）を示している。

【0095】

【表1】

【0096】

図１７および表１に示した結果から明らかなように、ＨＨ Ｓｔ．２３〜２６のインビボにおけるＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃの機能阻害は、脊髄発生段階における感覚求心性神経の成長円錐のパターン形成に乱れを生じさせ、軸索投射における二つの異常が主に観察された。第一は、脊髄灰白質内へのＤＲＧ軸索の異常な投射であり（図１７中Ｄ参照）、第二は、背側白質内、本来ならばＴｒｋＣ神経細胞が優位に存在する領域へのＴｒｋＡ軸索の異所的な展開である（図１７中Ｃ参照）。脊髄における感覚求心性神経の異常なパターン形成が確認されたのは、機能阻害性を有する抗体が注入された胚２０体中１６体であり（８０％）、軸索の背側白質内への展開がはっきりと確認されたのは２体（１０％）であり、軸索の異常な後角灰白質内への投射は９体（４５％）で確認され、かかる主な二つの異常が共に確認された胚は５体（２５％）であった。一方、コントロール抗体を注入した胚１２体においては、１１体（９２％）において正常な軸索伸長等が確認され、一体のみにおいて、異常な軸索投射が確認された。

【0097】

従って、初期の発生過程における背側脊髄内において、正確な軸索投射および感覚求心性神経のパターン形成にとって、Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃが介するシグナル伝達は必須であることがインビボにおいても明らかとなった。また、本発明の抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体は、実施例５〜８の記載からも明らかなように、リゾホスファチジルグルコシドに対して非常に優れた特異性を示し、リゾホスファチジルグルコシドによる神経細胞の軸索伸長に対する反発（退縮）作用を阻害するという点において大変優れた抗体である。

【0098】

なお、抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体を産生するハイブリドーマ（ＡＤＬｉｂ♯７およびＡＤＬｉｂ♯１５）については、２０１０年４月２１日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ：ＮＩＴＥ Ｐａｔｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ）（郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した。寄託したクローンのクローン番号と付与された受託番号は、ＮＩＴＥ Ｐ−９３９およびＮＩＴＥ Ｐ−９４０である。

【0099】

（実施例９）
次に、傷害を加えられた成体動物の中枢神経系におけるＰｔｄＧｌｃの発現を調べた。すなわち、成体マウス（生後１ヶ月）の脳に小児用綿棒の先端部を突き刺すことによって傷害を加え、その１週間後にＤＩＭ２１抗体を用いた免疫染色を行い、かかる損傷部位におけるＰｔｄＧｌｃの発現の程度を調べた。得られた結果は図１８〜２０に示す。また、成体ラット（体重約２５０グラム）の脊髄にＭｕｌｔｉ Ｃｅｎｔｒｅ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｙの標準的な手法（Ｊ．Ａ．Ｇｒｕｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ ９，１２３−１２８，１９９２）によって硬膜外から傷害を加え、その２週間後にＤＩＭ２１抗体を用いた免疫染色を行い、かかる損傷部位におけるＰｔｄＧｌｃの発現の程度を調べた。なお、通常の成体マウスおよび成体ラットの中枢神経系においては、ＰｔｄＧｌｃの発現量は極めて少ないことは確認されている（非特許文献３２参照）。得られた結果は図２１に示す。

【0100】

図１８〜２１に示した結果から明らかなように、成体の中枢神経系の傷害を加えられた部位特異的にＰｔｄＧｌｃの発現は亢進していた。かかる亢進は前述の通り、その加水分解産物であるＬｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃによって、傷害部位における神経回路の修復（軸索伸長）を阻害している可能性が高いため、本発明の抗体（抗Ｌｙｓｏ−ＰｔｄＧｌｃ抗体）を成体の中枢神経における損傷部位に添加することにより、かかる部位における神経回路の修復を促進させる可能性が高いということは明らかである。

【産業上の利用可能性】

【0101】

本発明により、リゾホスファチジルグルコシドの神経細胞の軸索伸長に対する反発的な作用を抑制しうる抗体、および該抗体を有効成分とする、リゾホスファチジルグルコシドの神経細胞の軸索伸長に対する反発的な作用を抑制する組成物が提供された。本発明の抗体や組成物によれば、神経障害疾患、神経変性疾患および神経傷害における神経回路の修復を促進することが可能であるため、本発明は、医療分野などに大きく貢献しうるものである。

【受託番号】

【0102】

１．
（１）識別の表示：ＡＤＬｉｂ ♯７
（２）受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９３９
（３）受託日：２０１０年４月２１日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
２．
（１）識別の表示：ＡＤＬｉｂ ♯１５
（２）受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９４０
（３）受託日：２０１０年４月２１日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）

【配列表フリーテキスト】

【0103】

配列番号１
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 軽鎖可変領域 ＣＤＲ１
配列番号２
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 軽鎖可変領域 ＣＤＲ２
配列番号３
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 軽鎖可変領域 ＣＤＲ３
配列番号４
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 重鎖可変領域 ＣＤＲ１
配列番号５
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 重鎖可変領域 ＣＤＲ２
配列番号６
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 重鎖可変領域 ＣＤＲ３
配列番号７
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 軽鎖可変領域
配列番号８
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 重鎖可変領域
配列番号９
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 軽鎖可変領域 ｃＤＮＡ
配列番号１０
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃１５ 重鎖可変領域 ｃＤＮＡ
配列番号１１
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 軽鎖可変領域 ＣＤＲ１
配列番号１２
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 軽鎖可変領域 ＣＤＲ２
配列番号１３
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 軽鎖可変領域 ＣＤＲ３
配列番号１４
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 重鎖可変領域 ＣＤＲ１
配列番号１５
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 重鎖可変領域 ＣＤＲ２
配列番号１６
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 重鎖可変領域 ＣＤＲ３
配列番号１７
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 軽鎖可変領域
配列番号１８
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 重鎖可変領域
配列番号１９
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 軽鎖可変領域 ｃＤＮＡ
配列番号２０
＜２２３＞ 抗ＬＰＧ抗体＃７ 重鎖可変領域 ｃＤＮＡ

【図5】

【図6】

【図7】

【図14】

【図16】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図15】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]